[go: up one dir, main page]

WO2023120530A1 - 相同組換えを利用したゲノム編集細胞の製造方法 - Google Patents

相同組換えを利用したゲノム編集細胞の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2023120530A1
WO2023120530A1 PCT/JP2022/046917 JP2022046917W WO2023120530A1 WO 2023120530 A1 WO2023120530 A1 WO 2023120530A1 JP 2022046917 W JP2022046917 W JP 2022046917W WO 2023120530 A1 WO2023120530 A1 WO 2023120530A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
site
gene
specific
chromosome
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2022/046917
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
慎一郎 中田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Osaka NUC
Original Assignee
Osaka University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Osaka University NUC filed Critical Osaka University NUC
Priority to EP22911232.1A priority Critical patent/EP4455282A4/en
Priority to JP2023569464A priority patent/JPWO2023120530A1/ja
Priority to US18/723,213 priority patent/US20250059570A1/en
Priority to CN202280085079.5A priority patent/CN118475693A/zh
Publication of WO2023120530A1 publication Critical patent/WO2023120530A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/34—Allele or polymorphism specific uses

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing genome-edited cells using homologous recombination, and mainly to a method for producing cells in which heterozygous mutations have been replaced with normal sequences by homologous recombination between homologous chromosomes.
  • TALENs the genome editing technology of the previous generation, is a fusion protein between a DNA-targeting TALE protein and a DNA-cleaving nuclease (mainly FokI), but similar to the CRISPR-Cas system, the target on the genome Generates a double-strand break in the DNA at the site.
  • this DNA double-strand break enables gene knock-in by homologous recombination between the genome and the donor DNA.
  • unintended mutations are more likely to occur at the target site than knock-in using a repair template.
  • the present inventors have further developed this method into a combination of single nicks in the SNGD method, in which the target genome is nicked at one site and the donor plasmid containing the repair template is nicked at one site.
  • This method into a combination of single nicks in the SNGD method, in which the target genome is nicked at one site and the donor plasmid containing the repair template is nicked at one site.
  • Patent Document 1 a target gene and donor plasma
  • the purpose of the present invention is to further improve the efficiency and specificity of genome editing in genome editing methods that utilize recombination between homologous chromosomes.
  • allele A a genetic mutation present in one of the homologous chromosomes
  • allele B when allele B is used as a donor and allele A is used as a recipient, the mutation of allele A is repaired to a normal sequence.
  • allele A when allele A is used as a donor and allele B is used as a recipient, mutation can be introduced into the normal sequence of allele B.
  • nicks are generated at multiple locations in the DNA region near the nucleotide to be edited on the recipient chromosome, and on the donor chromosome, the recipient chromosome is nicked. It is characterized by specifically inducing recombination between homologous chromosomes at the target site by generating a nick in at least one of the sites corresponding to the sites where .
  • the present inventors have made intensive studies to further improve the efficiency and specificity of genome editing in the method described in Patent Document 2.
  • Lig4 gene, PARP1 gene, XRCC1 gene, MSH2 It was found that the efficiency of genome editing can be remarkably improved by suppressing the function of the gene or the SMARCAL1 gene.
  • the present inventors nicked at one location in the DNA region near the mutation site of allele A, and nicked at one location in allele B that is different from the location at which allele A is nicked.
  • it is possible to significantly suppress the occurrence of unintended long-chain DNA deletions and improve the specificity of genome editing. have completed the present invention.
  • a method for producing genome-edited cells comprising: A combination of site-specific nickases that cause single-strand breaks in the DNA region near the specific site is introduced into cells having different bases between homologous chromosomes at a specific site of the homologous chromosome, and one of the homologous chromosomes is used as a recipient.
  • the cell is a cell in which the function of a gene selected from the group consisting of Lig4 gene, PARP1 gene, XRCC1 gene, MSH2 gene, and SMARCAL1 gene is suppressed,
  • the site-specific nickase combination causes single-strand breaks at multiple locations in the DNA region near the specific site in the recipient chromosome, and single-strand breaks in the recipient chromosome in the donor chromosome A method of making a single strand break at one point corresponding to the point to be cut.
  • a kit for use in the method according to any one of (1) to (3) In cells having different bases between homologous chromosomes at a specific site of homologous chromosomes, a combination of site-specific nickases that cause single-strand breaks in the DNA region near the specific site,
  • the cell is a cell in which the function of a gene selected from the group consisting of Lig4 gene, PARP1 gene, XRCC1 gene, MSH2 gene, and SMARCAL1 gene is suppressed,
  • the site-specific nickase combination causes single-strand breaks at multiple locations in the DNA region near the specific site in the recipient chromosome, and single-strand breaks in the recipient chromosome in the donor chromosome Kit for single-strand break at one point corresponding to the point to be cut.
  • a method for producing genome-edited cells comprising: A combination of site-specific nickases that cause single-strand breaks in the DNA region near the specific site is introduced into cells having different bases between homologous chromosomes at a specific site of the homologous chromosome, and one of the homologous chromosomes is used as a recipient. and inducing homologous recombination with the other as a donor to replace the recipient base at the specific site with the donor base, The combination of site-specific nickases causes a single-strand break in the DNA region near the specific site in the recipient chromosome, and a single-strand break in the recipient chromosome in the donor chromosome.
  • a kit for use in the method according to any one of (5) to (7) In cells having different bases between homologous chromosomes at a specific site of homologous chromosomes, a combination of site-specific nickases that cause single-strand breaks in the DNA region near the specific site, The combination of site-specific nickases causes a single-strand break in the DNA region near the specific site in the recipient chromosome, and a single-strand break in the recipient chromosome in the donor chromosome.
  • FIG. 2 is a diagram showing the principle of the genome editing method of the present invention using homologous recombination between homologous chromosomes (in the drawing, an example of a pattern in which single-strand breaks are made at two sites in allele A and one site in allele B is shown. Indicated).
  • FIG. 10 is a diagram showing an example of a pattern (nick pattern 1) in which single-strand breaks are made at two sites in allele A and one site in allele B.
  • Allele B nicks + strands (a, c, e, g), ⁇ strands (b, d, f, h).
  • FIG. 2B is a continuation of FIG. 2A; The position of one nick in allele A differs from FIG. 2A.
  • Two nicks of allele A both +strands (i,m), one +strand and one ⁇ strand (j,k,n,o), both ⁇ strands (l,p).
  • Allele B nick + strand (i, k, m, o), ⁇ strand (j, l, n, p).
  • FIG. 10 is a diagram showing an example of a pattern (nick pattern 2) in which allele A and allele B are single-strand-cut one by one.
  • Allele A nicks + strands (a, b, e, f), ⁇ strands (c, d, g, h).
  • Allele B nicks + strands (a, c, e, g), ⁇ strands (b, d, f, h).
  • FIG. 3B is a continuation of FIG. 3A; The position of the nick in allele A is different from that in FIG. 3A.
  • Allele A nick +strands (i,j,m,n), ⁇ strands (k,l,o,p).
  • Allele B nick + strand (i, k, m, o), ⁇ strand (j, l, n, p).
  • TSCER2 cells allele A with a loss-of-function frameshift due to a 1-bp insertion into exon 4 of the thymidine kinase 1 gene (c.231_232insC) and a 31-bp insertion on intron 4, a loss-of-function dot on exon 5. It contains allele B with a mutation (c.326G>A) and a 1 bp insertion on exon 7 (c.640 — 641insG) that does not affect function.
  • TK6261 cells allele A with a loss-of-function frameshift due to a 1-bp insertion into exon 4 of the thymidine kinase 1 gene (c.231_232insC) and a loss-of-function due to an 8-bp deletion on exon 5 (c.309_316del8).
  • FIG. 7 is a schematic diagram of a genome editing method performed on the cells shown in FIG. 6.
  • FIG. 4 shows genome editing efficiency in knockout cells. When the genome editing efficiency in the parent strain TSCER2 was set to 1, the relative genome editing efficiency in each knockout cell was calculated. Genome editing efficiency was assessed by restoration of thymidine kinase. ***: p ⁇ 0.0001, **: p ⁇ 0.01, *: p ⁇ 0.05, ns: no significant difference.
  • FIG. 4 shows genome editing efficiency in knockout cells. When the genome editing efficiency in the parent strain TSCER2 was set to 1, the relative genome editing efficiency in each knockout cell was calculated. Genome editing efficiency was assessed by restoration of thymidine kinase. ***: p ⁇ 0.0001, **: p ⁇ 0.01, *: p ⁇ 0.05, ns: no significant difference.
  • FIG. 2 is a diagram showing the relationship between the pattern of nicks introduced into each allele and the efficiency of gene correction by homologous interchromosomal recombination.
  • [a] and [c] in allele A indicate mutant sequences.
  • [b] and [d] in allele B indicate the wild-type sequence.
  • FIG. 2 is a diagram showing the relationship between the pattern of nicks introduced into each allele and the efficiency of gene correction by homologous interchromosomal recombination. Experiments were performed at target sites different from those in FIG. (a) to (c): Nick patterns in the thymidine kinase 1 gene of the donor chromosome for homologous recombination. (d): Shows each allele in the gene-corrected cells. (e) Graph showing the percentage of cells in which the gene was corrected and TK activity was restored. [a] in allele A indicates the mutant sequence and [c] indicates the SNV sequence. [b] and [d] in allele B indicate the wild-type sequence. FIG.
  • FIG. 2 is a diagram showing the relationship between the pattern of nicks introduced into each allele and the frequency of long-chain DNA deletions in homologous chromosomes.
  • Genome-edited cells were used in the experiment of FIG. (a) to (c): Nick patterns in the thymidine kinase 1 gene of the donor chromosome for homologous recombination.
  • FIG. [a] in allele A indicates the mutant sequence and [c] indicates the SNV sequence.
  • [b] and [d] in allele B indicate the wild-type sequence.
  • the method for producing genome-edited cells in the present invention utilizes homologous recombination between homologous chromosomes induced by site-specific nickase-induced single-strand breakage to replace bases that differ between homologous chromosomes with any
  • the principle is to unify to bases.
  • a combination of site-specific nickase that causes single-strand breaks in the DNA region near the specific site is introduced into cells having different bases between homologous chromosomes at a specific site of the homologous chromosome, and the homologous chromosome One of them is a recipient and the other is a donor, and homologous recombination is induced to replace the recipient's base with the donor's base at the specific site.
  • the "specific site on the homologous chromosome” is the target site for genome editing on the homologous chromosome.
  • the “nucleotide that differs between homologous chromosomes” at the site may be one nucleotide or multiple nucleotides (nucleotide sequence). Moreover, it may be a mutation or a polymorphism. Mutations include, for example, substitutions, deletions, insertions, or combinations thereof, and polymorphisms include, for example, single nucleotide polymorphisms and microsatellite polymorphisms.
  • the base may exist in the gene coding region or in the gene noncoding region.
  • chromosomes with mutations or polymorphisms at specific sites can be used as recipients or donors in homologous recombination. That is, by genome editing in the present invention, bases at specific sites of two chromosomes that constitute homologous chromosomes can both be normal sequences, and both can be specific mutation sequences or polymorphic sequences. can.
  • heterozygous HLA can be homozygous HLA.
  • Target diseases include, for example, diseases that develop due to autosomal heterozygous mutations that take autosomal dominant inheritance (e.g., OAS1 abnormality in congenital immunodeficiency, severe congenital neutropenia due to ELANE mutation, chronic mucocutaneous candidiasis, etc.), triplet repeat diseases with autosomal dominant inheritance (e.g., Huntington's disease, spinocerebellar ataxia, tonic muscular dystrophy, etc.), genetic diseases with autosomal recessive inheritance (e.g., ADA deficiency) etc.), and diseases with X-linked inheritance in women (eg, factor VIII/factor IX deficiency hemophilia, etc.).
  • diseases that develop due to autosomal heterozygous mutations that take autosomal dominant inheritance e.g., OAS1 abnormality in congenital immunodeficiency, severe congenital neutropenia due to ELANE mutation, chronic mucocutaneous candidiasis, etc.
  • pyogenes for example, mutation of the 10th amino acid (aspartic acid) from the N-terminus to alanine (D10A: Mutation in RuvC domain) , mutation of the 840th amino acid (histidine) from the N-terminus to alanine (H840A: mutation within the HNH domain), mutation of the 863rd amino acid (asparagine) from the N-terminus to alanine (N863A: mutation within the HNH domain) , mutation of the 762nd amino acid (glutamic acid) from the N-terminus to alanine (E762A: mutation within the RuvCII domain), mutation of the 986th amino acid (aspartic acid) from the N-terminus to alanine (D986A: mutation within the RuvCIII domain ).
  • Cas9 proteins from various sources are known (eg, WO2014/131833), and their nickase forms can be used.
  • amino acid sequence and nucleotide sequence of the Cas9 protein are published databases, for example, are registered in GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) (e.g., accession number: Q99ZW2.1, etc. ), which can be used in the present invention.
  • Cas proteins other than Cas9 such as Cpf1 (Cas12a), Cas12b, CasX (Cas12e), Cas14, etc. can also be used.
  • Mutations in the nickase-type Cpf1 protein include, for example, mutation of the 1226th amino acid (arginine) from the N-terminus to alanine (R1226A: mutation within the Nuc domain) in AsCpf1 (Cas12).
  • the amino acid sequence of Cpf1 is registered in a public database such as GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) (eg, accession numbers: WP_021736722, WP_035635841, etc.).
  • GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov
  • accession numbers: WP_021736722, WP_035635841, etc. As a protein that constitutes the CRISPR-Cas system, one to which a nuclear localization signal has been added may be used.
  • the nickase-type Cas protein binds to the guide RNA to form a complex, is targeted by the target DNA sequence, and single-strand breaks the DNA.
  • the guide RNA includes crRNA and tracrRNA, but in the CRISPR-Cpf1 system, for example, tracrRNA is not required.
  • the guide RNA in the CRISPR-Cas9 system may be a single-molecule guide RNA containing crRNA and tracrRNA, or a bimolecular guide RNA consisting of a crRNA fragment and a tracrRNA fragment.
  • a crRNA contains a base sequence complementary to the target DNA sequence.
  • the target DNA sequence is usually a base sequence consisting of 12 to 50 bases, preferably 17 to 30 bases, more preferably 17 to 25 bases, and is selected from the region adjacent to the PAM (proto-spacer adjacent motif) sequence. preferably.
  • PAM proto-spacer adjacent motif
  • site-specific cleavage of DNA occurs at locations dictated by both the base-pairing complementarity between the crRNA and the target DNA sequence and the PAMs present adjacent thereto.
  • crRNA further contains a nucleotide sequence on the 3' side that can interact (hybridize) with a tracrRNA fragment.
  • tracrRNA contains a nucleotide sequence on the 5' side that can interact (hybridize) with a portion of the nucleotide sequence of crRNA.
  • CrRNA/tracrRNA single molecule or two molecules
  • PAM differs depending on the type and origin of the Cas protein. Typical PAM sequences are, for example, S . In the Cas9 protein (type II) from S. pyogenes, it is “5'-NGG"; In the Cas9 protein (I-A1 type) derived from solfataricus, it is “5'-CCN”. In the Cas9 protein (I-A2 type) derived from solfataricus, it is "5'-TCN", and H. In the Cas9 protein from walsbyl (type IB), it is "5'-TTC"; In the Cas9 protein (IE type) derived from E. coli, it is "5'-AWG".
  • meningitidis it is "5'-NNNNGATT.”
  • Cas9 protein from denticola it is "5'-NAAAC”.
  • Cpf1 it is typically '5'-TTN' or '5'-TTTN'.
  • PAM recognition by modifying the protein (for example, introducing mutation) (Benjamin, P. et al., Nature 523, 481-485 (2015), Hirano, S. et al., Molecular Cell 61, 886-894 (2016)).
  • site-specific nickases other than the CRISPR-Cas system can also be used.
  • site-specific nickases include, for example, artificial nucleases fused with enzymes having nickase activity.
  • Artificial nucleases that can be used include, for example, TALE (transcription activator-like effector), ZF (zinc finger), and PPR (pentatriceptide repeat).
  • Enzymes that can exhibit nickase activity by fusion with these artificial nucleases include, for example, TevI (Nat Commun. 2013; 4: 1762. doi: 10.1038/ncomms2782).
  • DNA-binding domains constructed by linking modules (peptides) that recognize specific bases (or specific base sequences), and are fused to the DNA-binding domains.
  • a nickase causes a single-strand break in the DNA.
  • a suitable spacer peptide may be introduced between the DNA-binding domain and the nickase in the artificial nuclease.
  • single-strand breaks are made at multiple locations in the DNA region near the above-mentioned specific site (bases that differ between homologous chromosomes), and in the donor chromosome, the recipe A combination of site-specific nickases that produce a single-strand break at a site corresponding to the single-strand break in the ent chromosome is utilized. Examples of specific single-strand break modes are shown in FIGS. 2A and 2B.
  • a single-strand break is made at one location in the DNA region near the specific site, and in the donor chromosome, a single strand is broken in the recipient chromosome.
  • a combination of site-specific nickases that make single-strand breaks at a site different from that corresponding to the site being cut is utilized. Examples of specific single-strand break modes are shown in FIGS. 3A and 3B.
  • the "neighboring DNA region” is usually a region within 100,000 bases (for example, within 10,000 bases, within 5,000 bases, within 2,000 bases, within 1,000 bases, and within 600 bases) from a specific site.
  • the distance between nicks to be introduced is usually 100 bases or more (eg, 200 bases or more, 300 bases or more, 500 bases or more, 700 bases or more, 1000 bases or more, 1500 bases or more).
  • One of the nicks introduced into the chromosome is preferably immediately adjacent to the specific site.
  • the term “closest” is usually within 100 base positions, more preferably within 50 base positions (for example, within 40 bases, within 30 bases, within 20 bases, within 10 bases).
  • specific sites may be present in the neighboring DNA region of one specific site.
  • the "plurality of neighboring DNA regions" in the first aspect may exist on the same DNA strand or on different DNA strands.
  • the site-specific nickase that binds to the target DNA sequence of the recipient chromosome may be designed to also bind to the corresponding DNA sequence.
  • the target DNA sequence of the recipient chromosome and the corresponding DNA sequence of the donor chromosome are typically identical DNA sequences.
  • the recipient's chromosome when only the recipient's chromosome is single-strand cut at the corresponding location of the donor's chromosome and the recipient's chromosome, it binds to the target DNA sequence of the recipient's chromosome.
  • Some of the site-specific nickase combinations that do not bind to the corresponding DNA sequences of the donor chromosome can be designed.
  • the target DNA sequence of the recipient chromosome and the corresponding DNA sequence of the donor chromosome are typically different DNA sequences.
  • one of the combination of site-specific nickases that binds to the target DNA sequence of the donor chromosome when only the donor chromosome is single-strand-broken at corresponding locations in the donor chromosome and the recipient chromosome The part may be designed so that it does not bind to the corresponding DNA sequence of the recipient chromosome.
  • the target DNA sequence of the donor chromosome and the corresponding DNA sequence of the recipient chromosome are typically different DNA sequences.
  • a guide RNA may be designed to have specificity.
  • the DNA-binding domain may be designed to have binding specificity to a target DNA sequence on one chromosome.
  • the above combination of site-specific nickases is introduced into cells.
  • the "site-specific nickase" introduced into the cell is, in the case of the CRISPR-Cas system, for example, even in the form of a combination of guide RNA and Cas protein, and messenger RNA translated into guide RNA and Cas protein. or a combination of vectors expressing them.
  • the guide RNA may be modified (such as chemical modification) to suppress degradation.
  • an artificial nuclease fused with an enzyme having nickase activity for example, it may be in the form of a protein, messenger RNA translated into the protein, or in the form of a vector expressing the protein.
  • operably linked means that the DNA is expressably linked to the regulatory element.
  • regulatory elements include promoters, enhancers, internal ribosome entry sites (IRES), and other expression control elements such as transcription termination signals, such as polyadenylation signals and polyU sequences.
  • Regulatory elements may be those that direct DNA expression only in specific cells, tissues, or organs, depending on the purpose, for example, those that direct constitutive expression of DNA in a variety of host cells. may be In addition, it may be one that directs the expression of DNA only at a specific time, or one that directs the expression of an artificially inducible DNA.
  • promoters examples include pol III promoters (e.g., U6 and H1 promoters), pol II promoters (e.g., retroviral Rous sarcoma virus (RSV) LTR promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, SV40 promoter, dihydrofolate reductase promoter, ⁇ -actin promoter, phosphoglycerol kinase (PGK) promoter, and EF1 ⁇ promoter), pol I promoter, or combinations thereof.
  • RSV Rous sarcoma virus
  • CMV cytomegalovirus
  • SV40 promoter cytomegalovirus
  • dihydrofolate reductase promoter promoter
  • ⁇ -actin promoter phosphoglycerol kinase (PGK) promoter
  • PGK phosphoglycerol kinase
  • EF1 ⁇ promoter EF1 ⁇ promoter
  • the "cells" to be targeted for genome editing in the present invention are not particularly limited as long as they have homologous chromosomes, and various eukaryotic cells can be targeted.
  • Eukaryotic cells include, for example, animal cells, plant cells, algal cells, and fungal cells.
  • Animal cells include, for example, mammalian cells, as well as fish, bird, reptile, amphibian, and insect cells.
  • Animal cells include, for example, cells that make up an individual animal, cells that make up an organ or tissue extracted from an animal, and cultured cells derived from animal tissue. Specifically, for example, embryonic cells of embryos at each stage (e.g., 1-cell stage embryo, 2-cell stage embryo, 4-cell stage embryo, 8-cell stage embryo, 16-cell stage embryo, morula stage embryo, etc.); induction Stem cells such as pluripotent stem (iPS) cells, embryonic stem (ES) cells, hematopoietic stem cells; fibroblasts, hematopoietic cells, neurons, muscle cells, bone cells, hepatocytes, pancreatic cells, brain cells, kidney cells, etc.
  • iPS pluripotent stem
  • ES embryonic stem
  • fibroblasts hematopoietic stem cells
  • neurons e.g., muscle cells, bone cells, hepatocytes, pancreatic cells, brain cells, kidney cells, etc.
  • a fertilized oocyte ie, a fertilized egg
  • the fertilized egg is a pronuclear stage embryo.
  • Cryopreserved oocytes can be used after thawing before fertilization.
  • the term "mammal” is a concept that includes both human and non-human mammals.
  • non-human mammals include artiodactyls such as bovines, wild boars, pigs, sheep and goats, peri-hoofed animals such as horses, rodents such as mice, rats, guinea pigs, hamsters and squirrels, and lagomorphs such as rabbits. , dogs, cats, and meats such as ferrets.
  • the non-human mammals described above may be domestic animals or companion animals (pet animals), or may be wild animals.
  • Plant cells include, for example, cells of grains, oil crops, fodder crops, fruits, and vegetables.
  • the term “plant cell” includes, for example, cells that constitute an individual plant, cells that constitute an organ or tissue separated from a plant, cultured cells derived from a plant tissue, and the like.
  • Plant organs and tissues include, for example, leaves, stems, shoot apexes (growing points), roots, tubers, tuberous roots, seeds, and callus. Examples of plants include rice, corn, bananas, peanuts, sunflowers, tomatoes, rape, tobacco, wheat, barley, potatoes, soybeans, cotton, carnations, and the like.
  • the base sequence of a typical human-derived Lig4 gene and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene are in the database (Accession numbers: NM_002312, NM_206937, NM_001098268, NP_002303, NP_996820, NP_001091738), the base of the human-derived PARP1 gene
  • the sequence and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene are available in the database (Accession numbers: NM_001618, NP_001609)
  • the nucleotide sequence of the human-derived XRCC1 gene and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene are available in the database (Accession number : NM_006297, NP_006288)
  • the nucleotide sequence of the human-derived MSH2 gene and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene are in the database (accession number: NM_000251 or NM_001258281, NP_000242,
  • the mechanism of "suppression of gene function" in the present invention may be suppression of the activity of a translation product (protein) of a gene or suppression of gene expression. Suppression of the activity of the translation product (protein) of a gene can be performed, for example, by introducing mutation (deletion, substitution, insertion, etc.) into the gene or treatment with an inhibitor.
  • Mutations can be introduced into genes, for example, using genome editing systems.
  • genome editing systems include site-specific artificial nucleases such as CRISPR-Cas (eg, CRISPR-Cas9), TALENs, and ZFNs.
  • CRISPR-Cas eg, CRISPR-Cas9
  • TALENs TALENs
  • ZFNs ZFNs.
  • a gene is cleaved at a target site by the action of the genome editing system, and mutation (deletion, insertion, etc. of a base) is introduced into the gene via the DNA repair mechanism of the cell.
  • mutation deletion, insertion, etc. of a base
  • the deletion may be a deletion of the entire gene or a partial deletion.
  • inhibitor treatment examples include, but are not limited to, treatment with SCR7, which is a Lig4 inhibitor, and treatment with Olaparib, Veliparib, Niraparib, or Talazoparib, which are PARP inhibitors.
  • “Suppression of gene function” can also be performed by suppressing the expression of the gene. Suppression of gene expression may be suppression of translation or suppression of transcription of a gene. Suppression of gene translation can be achieved, for example, using double-stranded RNA (dsRNA) that binds to the transcript of the gene. Examples of double-stranded RNA include siRNA, shRNA (short haipin RNA), miRNA and the like. Gene transcription can be suppressed, for example, by introducing a mutation into the expression control region of the gene. The above-described genome editing system targeting the expression control region can be used to introduce the mutation.
  • dsRNA double-stranded RNA
  • siRNA siRNA
  • shRNA short haipin RNA
  • miRNA miRNA
  • Whether or not gene expression is suppressed can be determined at the translation level, for example, by an immunoassay using an antibody that binds to the translation product, and at the transcription level, for example, RT-PCR or Northern blotting. According to the law, each can be evaluated.
  • Introduction of a site-specific nickase or a molecule that suppresses gene function into cells can be performed, for example, by electroporation, microinjection, DEAE-dextran method, lipofection method, nanoparticle-mediated transfection method, virus-mediated nucleic acid delivery method. It can be carried out by a known method such as.
  • a combination of site-specific nickases causes single-strand breaks in the recipient and donor chromosomes. This induces homologous recombination between homologous chromosomes, replacing the target base in the recipient with the corresponding base in the donor with high efficiency and specificity.
  • kits for use in the method of the present invention comprising the combination of the site-specific nickases.
  • kits may further comprise one or more additional reagents such as dilution buffers, reconstitution solutions, wash buffers, nucleic acid transfer reagents, protein transfer reagents, control reagents. (eg, control guide RNA).
  • additional reagents such as dilution buffers, reconstitution solutions, wash buffers, nucleic acid transfer reagents, protein transfer reagents, control reagents. (eg, control guide RNA).
  • the kit may contain instructions for carrying out the methods of the invention.
  • TSCER2 cells which are TK6 cell-derived lymphoblastoid cells, have allele A with a loss-of-function frameshift due to a 1-bp insertion (c.231_232insC) into exon 4 of the thymidine kinase 1 gene, and a 31-bp insertion on intron 4, exon Allele B with a loss-of-function point mutation on exon 5 (c.326G>A) and a 1 bp insertion on exon 7 (c.640 — 641insG) that has no effect on function is included.
  • a 1-bp insertion c.231_232insC
  • exon Allele B with a loss-of-function point mutation on exon 5 (c.326G>A) and a 1 bp insertion on exon 7 (c.640 — 641insG) that has no effect on function is included.
  • TSCER2 Cell-Derived Knockout Cells These are TSCER2 cells in which the following genes have been knocked out by the gene targeting method. p53 ⁇ / ⁇ , Lig4 ⁇ / ⁇ , PARP1 ⁇ / ⁇ PARP2 ⁇ /+ , XRCC1 ⁇ / ⁇ , MSH2 ⁇ / ⁇ , MLH1 ⁇ / ⁇ , MLH3 ⁇ / ⁇ , XPA ⁇ / ⁇ , MUS81 ⁇ / ⁇ , or MARCAL1 -/- . Knockout cells for each gene are registered in the TK6 Mutants Consortium (https://www.nihs.go.jp/dgm/tk6.html).
  • TK6261 cells which are TK6 cell-derived lymphoblastoid cells, have allele A with a loss-of-function frameshift due to a 1-bp insertion into exon 4 of the thymidine kinase 1 gene (c.231_232insC) and an 8-bp deletion on exon 5 (c. .309_316del8) and allele B with a 1 bp insertion on exon 7 (c.640_641insG) that does not affect function.
  • TK6261 EGFP cell A strain in which the EGFP gene was knocked into the Rosa26 region of TK6261 cells.
  • Cas9D10A nickase mRNA CleanCap Cas9 Nickase mRNA 5 moU)-(L-7207) (TriLink BioTechnologies) was used at 1.0 mg/mL.
  • sgTKex4_20s CGTCTCGGAGCAGGCAGGCG (GGG)/SEQ ID NO: 1 sgS14: TCCCACCGAAGGCCACACGC (CGG)/SEQ ID NO: 2 sgS11: TCAATCATATCACTCTTAGC (TGG)/SEQ ID NO: 3 sgS12: GGAGCTGTCCATGAGACCCA (GGG)/SEQ ID NO: 4 sgTKex5_mut4s: CTCGCAGAACTCCAGGGAAC (TGG) / SEQ ID NO: 5 sgTKex5_WT4s: ACTCCACGATGTCAGGGAAC (TGG)/SEQ ID NO: 6 sgTKex5_41s: AGCCACAATTACGGTCTTCC (CGG)/SEQ ID NO: 7 sgTKex7_105s: CCCCTGGCTTTCCTGGCACT(GGG)/SEQ ID NO: 7 sgTKex7_105s: CCCCT
  • TKex7mt_121s TGGCAGCCACGGCTTCCCCC (TGG)/SEQ ID NO: 10 (7) Electroporator Invitrogen Neon Transfection System, Neon Transfection System 10 ⁇ L Kit (Thermo Fisher Scientific).
  • Basal medium A medium supplemented with 5% horse serum (Invitrogen) and 200 ⁇ g/ml Sodium Pyruvate (Nacalai) in RPMI1640 medium (Nacalai).
  • CHAT medium A medium in which 10 ⁇ M 2-deoxycytidine [Sigma], 200 ⁇ M hypoxanthine [Sigma], 100 nM aminoopterin [Sigma], and 17.5 ⁇ M thymidine [Sigma] were added to the basal medium.
  • PCR primers In PCR designed so that the target sequences of sgRNA “TKex5_mut4s”, sgRNA “TKex7_105s”, and sgRNA “TKex7_mut121s” are included in the PCR product (total length of about 1.9 kbp), the primer set L-TKex57 was used. used. L-TKex57 Forward: AAGCCCCTCACGTCTCAATAACC/SEQ ID NO: 11 L-TKex57 Reverse: GCTTTAAGCAGACCAGTGGGTA/SEQ ID NO:12.
  • TK6261EGFP cells were electroporated with two types of sgRNA (sgTKex4_20s and sgS14) and Cas9D10A mRNA (Fig. 5 ). Four days after electroporation, TK6261EGFP cells as standard cells and TSCER2 cells or TSCER2 cell-derived knockout cells as test cells were mixed at a 1:1 cell number ratio and a portion was incubated in basal medium for 8 days.
  • Sections were cultured in CHAT medium for 4 days and in basal medium for 4 days. After culturing, the ratio of EGFP-positive cells and negative cells was measured by flow cytometry. In addition, it has already been demonstrated that exon 4 of the TK1 gene becomes a wild-type homozygote in cells grown in CHAT medium after electroporation of Cas9D10A mRNA with sgTKex4_20s and sgS14. Proliferation-ability in CHAT medium index (PCI) was calculated from the ratio of EGFP-positive cell rate after selection in CHAT medium to EGFP-positive cell rate in basal medium (Table 1).
  • PCI Proliferation-ability in CHAT medium index
  • Fig. 6 shows the relative PCI in each knockout cell when the PCI in TSCER2 is set to 1. Knockout of Lig4, PARP1, MSH2, and SMARCAL1 increased genome editing efficiency.
  • sgTKex4_20s and sgS11 were introduced into TK6261EGFP cells together with Cas9D10A nickase mRNA by electroporation.
  • TK6261EGFP cells and TK6261 cells were mixed at a cell number ratio of 1:1 and cultured partly in basal medium for 8 days, partly in CHAT medium for 4 days, and basal medium for 4 days. bottom. After culturing, the ratio of EGFP-positive cells and negative cells was measured by flow cytometry. Proliferation in CHAT medium index (PCI) was calculated from the EGFP-positive cell rate after selection in CHAT medium and the ratio of EGFP-positive cells in the basal medium. As a result, the percentage of cells in which the gene was modified and the TK activity was restored as in (d) or (e) is calculated.
  • PCI CHAT medium index
  • TK activity is remarkably more efficient than when allele A is nicked in tandem (sgTKex4_20s + sgTKex5_WT4s: (b)). Recovery was observed (Fig. 7).
  • allele A is tandemly nicked, and one nick is generated in allele B (sgTKex4_20s + sgTKex5_41s: (a))
  • the same nicks are generated in both homologous chromosomes one by one (c) Efficient recovery of TK activity was observed (Fig. 7).
  • Experiment 2 sgRNA specifically targeting allele A with wild type sequence in exon 7 (sgTKex7_WT121s) or sgRNA targeting both allele A and allele B in exon 7 (sgTKex7_105s) and allele with mutated sequence in exon 5 sgRNA (sgTKex5_mut4s) specifically targeting B and electroporated into TK6261 cells together with Cas9D10A nickase mRNA.
  • sgTKex4_20s and sgS12 were introduced into TK6261EGFP cells together with Cas9D10A nickase mRNA by electroporation.
  • TK6261EGFP cells and TK6261 cells were mixed at a cell number ratio of 1:1 and cultured partly in basal medium for 8 days, partly in CHAT medium for 4 days and subsequently in normal medium for 4 days. bottom. After culturing, the ratio of EGFP-positive cells and negative cells was measured by flow cytometry. Proliferation in CHAT medium index (PCI) was calculated from the EGFP-positive cell rate after selection in CHAT medium and the ratio of EGFP-positive cells in the basal medium. As a result, the percentage of cells in which the gene was corrected and the TK activity was restored was calculated as in (d).
  • PCI CHAT medium index
  • PCR was performed using KOD FX Neo (TOYOBO) using the DNA extracted from a single cell-derived clone as a template.
  • the PCR product was subjected to electrophoresis in a 0.9% TAE gel, the gel was stained with Ultra Safe Dye, visualized with a blue LED light, and photographed with a digital camera.
  • a base that differs between homologous chromosomes is replaced with any base by utilizing homologous recombination between homologous chromosomes induced by single-strand breakage by a site-specific nickase. Unification is possible.
  • the present invention which does not use exogenous donor DNA, can greatly contribute to gene therapy, especially for diseases caused by heterozygous mutations, due to its high safety.
  • SEQ ID NOS: 1-10 target sequences of sgRNA
  • SEQ ID NOS: 11-12 primer sequences

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

標的部位に異なる塩基を有する相同染色体間での組換えを利用するゲノム編集法において、（１）Ｌｉｇ４遺伝子、ＰＡＲＰ１遺伝子、ＸＲＣＣ１遺伝子、ＭＳＨ２遺伝子、及びＳＭＡＲＣＡＬ１遺伝子からなる群より選択される遺伝子の機能が抑制された細胞を利用する方法、又は（２）当該レシピエントの染色体においては、標的部位の近傍ＤＮＡ領域の１箇所で一本鎖切断し、ドナーの染色体においては、レシピエントの染色体において一本鎖切断される箇所に対応する箇所と異なる１箇所で一本鎖切断する方法。

Description

相同組換えを利用したゲノム編集細胞の製造方法
　本発明は、相同組換えを利用したゲノム編集細胞の製造方法に関し、主として、相同染色体間の相同組換えにより、ヘテロ変異が正常配列に置換された細胞の製造方法に関する。
　ＴＡＬＥＮｓやＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系などのプログラム可能なヌクレアーゼの登場により、現在、ゲノム編集技術は、急速な広まりを見せている。Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡと複合体を形成し、この複合体が、ガイドＲＮＡと相補的な配列を持つゲノム上の標的部位に結合して、ＤＮＡ二本鎖の両方を切断する。一世代前のゲノム編集技術であるＴＡＬＥＮｓは、ＤＮＡを標的化するＴＡＬＥタンパク質とＤＮＡを切断するヌクレアーゼ（主として、ＦｏｋＩ）との融合タンパク質であるが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系と同様に、ゲノム上の標的部位でＤＮＡの二本鎖切断を生じさせる。このＤＮＡの二本鎖切断は、細胞外から、修復鋳型となるドナーＤＮＡを導入した場合には、ゲノムとドナーＤＮＡとの間の相同組換えにより、遺伝子ノックインを行うことができる。しかしながら、ゲノム編集系による二本鎖切断を利用する場合、標的部位では、修復鋳型によるノックインよりも、目的外の変異が生じやすく、また、標的配列と類似性の高いＤＮＡ配列（オフターゲット）においてもゲノム変異を生じさせてしまうという問題がある。
　そこで、本発明者らは、Ｃａｓ９の２つのヌクレアーゼ部位のうち一方を失活させたニッカーゼ型Ｃａｓ９を用い、ＤＮＡの一本鎖切断によって相同組換えを誘導することにより、従来のＤＮＡの二本鎖切断による手法と比較して、非相同末端結合による目的外の変異の発生を抑制しうる手法を開発した。その一つは、ニッカーゼを用い、標的とするゲノムに２箇所、修復鋳型を含むドナープラスミドに１箇所のニックを入れることによる、タンデムニック法を利用したゲノム編集法である（非特許文献１、特許文献１）。また、本発明者らは、この方法をさらに発展させ、標的とするゲノムに１箇所のニックを入れ、修復鋳型を含むドナープラスミドに１箇所のニックを入れるＳＮＧＤ法（ａ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｉｎｇｌｅ　ｎｉｃｋｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔａｒｇｅｔ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｄｏｎｏｒ　ｐｌａｓｍｉｄ）も開発した（特許文献１）。
　さらに、本発明者らは、ニッカーゼを利用した相同組換えによるゲノム編集法の応用として、外来のドナーＤＮＡに代えて、細胞に元々存在する相同染色体を修復鋳型として利用する方法を開発した（特許文献２）。この方法によれば、修復鋳型として用いるドナーＤＮＡのゲノムへのランダムな組み込みという問題を回避することができるため、特に医療応用において、その安全性を向上させることができる。
特開２０１８－１１５２５号 国際公開２０２０／１００３６１号
Ｎａｋａｊｉｍａ　Ｋ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．　２８，　２２３－２３０，　２０１８
　本発明は、相同染色体間での組換えを利用するゲノム編集法において、ゲノム編集の効率及び特異性をさらに向上させることを目的とする。
　細胞内の染色体にヘテロ接合体変異あるいは複合ヘテロ接合体変異が存在する場合、相同染色体の一方（これを「アレルＡ」と称する）に存在する遺伝子変異は、相同染色体の他方（これを「アレルＢ」と称する）には存在しない。ここで、仮に、アレルＡとアレルＢとの間で相同組換えを誘導することができれば、アレルＢをドナーとし、アレルＡをレシピエントとした場合は、アレルＡの変異を正常配列に修復することができ、逆に、アレルＡをドナーとし、アレルＢをレシピエントとした場合は、アレルＢの正常配列に変異を導入することが可能である。
　特許文献２に記載の方法においては、レシピエントとなる染色体上の編集対象とするヌクレオチドの近傍ＤＮＡ領域の複数箇所にニックを生じさせ、かつ、ドナーとなる染色体上では、レシピエントの染色体においてニックを生させる箇所に対応する箇所の少なくとも１箇所にニックを生じさせることにより、標的部位における相同染色体間での組換えを特異的に誘導することを特徴としている。
　本発明者らは、特許文献２に記載の方法におけるゲノム編集の効率と特異性をさらに向上させるべく鋭意検討を行った結果、ゲノム編集を行う細胞において、Ｌｉｇ４遺伝子、ＰＡＲＰ１遺伝子、ＸＲＣＣ１遺伝子、ＭＳＨ２遺伝子、又はＳＭＡＲＣＡＬ１遺伝子の機能を抑制することにより、ゲノム編集の効率を顕著に向上させることが可能であることを見出した。さらに、本発明者らは、アレルＡの変異部位の近傍ＤＮＡ領域の１箇所においてニックを生じさせ、かつ、アレルＢにおいては、アレルＡでニックを生じさせる箇所とは異なる箇所の１箇所でニックを生じさせるという特許文献２と異なるニックの態様を採用することにより、目的外の長鎖ＤＮＡ欠失の発生を顕著に抑制し、ゲノム編集の特異性を向上させることが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　従って、本発明は、以下の態様を含む。
　（１）ゲノム編集された細胞を製造する方法であって、
　相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞に、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを導入し、当該相同染色体の一方をレシピエントとし、他方をドナーとした相同組換えを誘導して、当該特定の部位におけるレシピエントの塩基をドナーの塩基に置換することを含み、
　当該細胞が、Ｌｉｇ４遺伝子、ＰＡＲＰ１遺伝子、ＸＲＣＣ１遺伝子、ＭＳＨ２遺伝子、及びＳＭＡＲＣＡＬ１遺伝子からなる群より選択される遺伝子の機能が抑制された細胞であり、
　当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、当該レシピエントの染色体においては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、当該ドナーの染色体においては、レシピエントの染色体において一本鎖切断される箇所に対応する１箇所で一本鎖切断する方法。
　（２）置換されるレシピエントの塩基が変異塩基であり、ドナーの塩基が正常塩基である、（１）に記載の方法。
　（３）部位特異的ニッカーゼがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、（１）又は（２）に記載の方法。
　（４）（１）から（３）のいずれかに記載の方法に用いるためのキットであって、
　相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞において、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを含み、
　当該細胞が、Ｌｉｇ４遺伝子、ＰＡＲＰ１遺伝子、ＸＲＣＣ１遺伝子、ＭＳＨ２遺伝子、及びＳＭＡＲＣＡＬ１遺伝子からなる群より選択される遺伝子の機能が抑制された細胞であり、
　当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、当該レシピエントの染色体においては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、当該ドナーの染色体においては、レシピエントの染色体において一本鎖切断される箇所に対応する１箇所で一本鎖切断するキット。
　（５）ゲノム編集された細胞を製造する方法であって、
　相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞に、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを導入し、当該相同染色体の一方をレシピエントとし、他方をドナーとした相同組換えを誘導して、当該特定の部位におけるレシピエントの塩基をドナーの塩基に置換することを含み、
　当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、当該レシピエントの染色体においては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の１箇所で一本鎖切断し、当該ドナーの染色体においては、レシピエントの染色体において一本鎖切断される箇所に対応する箇所と異なる１箇所で一本鎖切断する方法。
　（６）置換されるレシピエントの塩基が変異塩基であり、ドナーの塩基が正常塩基である、（５）に記載の方法。
　（７）部位特異的ニッカーゼがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、（５）又は（６）に記載の方法。
　（８）（５）から（７）のいずれかに記載の方法に用いるためのキットであって、
　相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞において、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを含み、
　当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、当該レシピエントの染色体においては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の１箇所で一本鎖切断し、当該ドナーの染色体においては、レシピエントの染色体において一本鎖切断される箇所に対応する箇所と異なる１箇所で一本鎖切断するキット。
　本発明により、相同染色体間の相同組換えを利用して、高効率かつ特異的にゲノム編集を行うことが可能となった。本発明では、相同組換えに外来のドナーＤＮＡを利用せず、ドナーＤＮＡのランダムインテグレーションという問題も生じないことから、遺伝子治療などの医療応用を行った場合でも、高い安全性でゲノム編集を行うことができる。
相同染色体間の相同組換えを利用した本発明のゲノム編集方法の原理を示す図である（図面では、アレルＡに２箇所、かつ、アレルＢに１箇所で一本鎖切断するパターンの一例を示した）。 アレルＡに２箇所、かつ、アレルＢに１箇所で一本鎖切断するパターン（ニックパターン１）の例を示す図である。アレルＡの２つのニック：ともに＋鎖（ａ、ｅ）、１つが＋鎖で他の１つが－鎖（ｂ、ｃ、ｆ、ｇ）、ともに－鎖（ｄ、ｈ）。アレルＢのニック：＋鎖（ａ、ｃ、ｅ、ｇ）、－鎖（ｂ、ｄ、ｆ、ｈ）。 図２Ａの続きの図である。図２Ａとは、アレルＡにおける１つのニックの位置が異なる。アレルＡの２つのニック：ともに＋鎖（ｉ、ｍ）、１つが＋鎖で他の１つが－鎖（ｊ、ｋ、ｎ、ｏ）、ともに－鎖（ｌ、ｐ）。アレルＢのニック：＋鎖（ｉ、ｋ、ｍ、ｏ）、－鎖（ｊ、ｌ、ｎ、ｐ）。 アレルＡとアレルＢに１箇所づつ一本鎖切断するパターン（ニックパターン２）の例を示す図である。アレルＡのニック：＋鎖（ａ、ｂ、ｅ、ｆ）、－鎖（ｃ、ｄ、ｇ、ｈ）。アレルＢのニック：＋鎖（ａ、ｃ、ｅ、ｇ）、－鎖（ｂ、ｄ、ｆ、ｈ）。 図３Ａの続きの図である。図３Ａとは、アレルＡにおけるニックの位置が異なる。アレルＡのニック：＋鎖（ｉ、ｊ、ｍ、ｎ）、－鎖（ｋ、ｌ、ｏ、ｐ）。アレルＢのニック：＋鎖（ｉ、ｋ、ｍ、ｏ）、－鎖（ｊ、ｌ、ｎ、ｐ）。 ＴＳＣＥＴ２細胞及びＴＫ６２６１細胞におけるチミジンキナーゼ遺伝子の模式図を示す。（ａ）ＴＳＣＥＲ２細胞：チミジンキナーゼ１遺伝子のエクソン４への１ｂｐ挿入（ｃ．２３１＿２３２ｉｎｓＣ）による機能喪失型フレームシフトを持つアレルＡと、イントロン４上の３１ｂｐ挿入、エクソン５上の機能喪失型の点変異（ｃ．３２６Ｇ＞Ａ）、及び機能に影響を与えないエクソン７上の１ｂｐ挿入（ｃ．６４０＿６４１ｉｎｓＧ）を持つアレルＢを含む。（ｂ）ＴＫ６２６１細胞：チミジンキナーゼ１遺伝子のエクソン４への１ｂｐ挿入（ｃ．２３１＿２３２ｉｎｓＣ）による機能喪失型フレームシフトを持つアレルＡと、エクソン５上の８ｂｐ欠失（ｃ．３０９＿３１６ｄｅｌ８）による機能喪失型フレームシフト及び機能に影響を与えないエクソン７上の１ｂｐ挿入（ｃ．６４０＿６４１ｉｎｓＧ）を持つアレルＢを含む。 図６に記載の細胞に対して実施したゲノム編集法の模式図である。ｓｇＴＫｅｘ４＿２０ｓによりアレルＡに特異的なニックをチミジンキナーゼ遺伝子のコード鎖に発生させ、ｓｇＳ１４によりアレルＡとアレルＢの両方のコード鎖にニックを発生させると、アレルＡ上の変異がアレルＢ上の野生型配列に置換される。 ノックアウト細胞におけるゲノム編集効率を示す図である。親株であるＴＳＣＥＲ２におけるゲノム編集効率を１としたときの、各ノックアウト細胞における相対的なゲノム編集効率を算出した。ゲノム編集効率は、チミジンキナーゼの回復により評価した。＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、＊＊：ｐ＜０．０１、＊：ｐ＜０．０５、ｎｓ：有意差なし。 各アリルに導入されるニックのパターンと相同染色体間組換えによる遺伝子修正効率の関係を示す図である。（ａ）～（ｃ）：相同組換えのドナーとした染色体のチミジンキナーゼ１遺伝子におけるニックのパターンを示す。（ｄ）及び（ｅ）：遺伝子が修正された細胞における各アレルを示す。（ｆ）：遺伝子が修正されＴＫ活性を回復した細胞の割合を示すグラフである。アレルＡにおける［ａ］及び［ｃ］は変異型配列を示す。アレルＢにおける[ｂ]及び［ｄ］は野生型配列を示す。 各アリルに導入されるニックのパターンと相同染色体間組換えによる遺伝子修正効率の関係を示す図である。図７とは、異なる標的部位で実験を行った。（ａ）～（ｃ）：相同組換えのドナーとした染色体のチミジンキナーゼ１遺伝子におけるニックのパターンを示す。（ｄ）：遺伝子が修正された細胞における各アレルを示す。（ｅ）遺伝子が修正されＴＫ活性を回復した細胞の割合を示すグラフである。アレルＡにおける［ａ］は変異型配列を示し、［ｃ］はＳＮＶ配列を示す。アレルＢにおける［ｂ］及び［ｄ］は野生型配列を示す。 各アリルに導入されるニックのパターンと相同染色体における長鎖ＤＮＡ欠失の頻度の関係を示す図である。図８の実験においてゲノム編集処理を行った細胞を用いた。（ａ）～（ｃ）：相同組換えのドナーとした染色体のチミジンキナーゼ１遺伝子におけるニックのパターンを示す。（ｄ）：アレルＢにおける長鎖ＤＮＡ欠失が生じた細胞における各アレルを示す。（ｅ）：アレルＢにおいて長鎖ＤＮＡ欠失が生じた細胞の割合を示すグラフである。アレルＡにおける［ａ］は変異型配列を示し、［ｃ］はＳＮＶ配列を示す。アレルＢにおける［ｂ］及び［ｄ］は野生型配列を示す。
　本発明におけるゲノム編集された細胞を製造する方法は、部位特異的ニッカーゼによる一本鎖切断により誘導された相同染色体間の相同組換えを利用して、相同染色体間で異なる塩基を、いずれかの塩基に統一することを原理とする。
　具体的には、相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞に、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを導入し、当該相同染色体の一方をレシピエントとし、他方をドナーとした相同組換えを誘導して、当該特定の部位におけるレシピエントの塩基をドナーの塩基に置換する。
　本発明において「相同染色体の特定の部位」とは、相同染色体におけるゲノム編集の標的部位である。当該部位における「相同染色体間で異なる塩基」は、一つの塩基であっても、複数の塩基（塩基配列）であってもよい。また、変異であっても、多型であってもよい。変異としては、例えば、置換、欠失、挿入、又はこれらの組み合わせが挙げられ、多型には、例えば、一塩基多型やマイクロサテライト多型が挙げられる。また、当該塩基は、遺伝子コード領域に存在してもよく、遺伝子非コード領域に存在してもよい。
　本発明においては、相同染色体のうち、特定部位に変異や多型を持つ染色体を、相同組換えにおけるレシピエントとすることも、ドナーとすることもできる。すなわち、本発明におけるゲノム編集により、相同染色体を構成する２つの染色体の特定部位の塩基を、双方とも正常配列にすることもでき、また、双方とも特定の変異配列や多型配列にすることもできる。例えば、ＨＬＡにおいては、ヘテロ接合体のＨＬＡをホモ接合体ＨＬＡにすることもできる。
　医療上の有用性の観点からの典型的な本発明の利用態様は、ヘテロ接合体変異に起因するヒトの疾患を治療又は予防するために、ヒト細胞における当該変異を正常配列へと修復することである。ここで「ヘテロ接合体変異に起因する疾患」としては、当該ヘテロ変異により直接的に生じる疾患（優性遺伝疾患）の他、２種の異なる変異の組み合わせ（複合ヘテロ接合体）により生じる疾患（劣性遺伝疾患）も含む意である。対象疾患としては、例えば、常染色体優性遺伝形式をとる常染色体ヘテロ接合体変異により発症する疾患（例えば、先天性免疫不全症におけるＯＡＳ１異常症、ＥＬＡＮＥ変異による重症先天性好中球減少症、慢性皮膚粘膜カンジダ症など）や常染色体優性遺伝形式をとるトリプレットリピート病（例えば、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、強直性筋ジストロフィーなど）、常染色体劣性遺伝形式をとる遺伝性疾患（例えば、ＡＤＡ欠損症など）、及び女性でＸ連鎖性遺伝形式で発症する疾患（例えば、第ＶＩＩＩ因子・第ＩＸ因子欠損の血友病など）が挙げられるが、これらに制限されない。
　本発明に用いる「部位特異的ニッカーゼ」としては、ゲノム上の部位特異的にＤＮＡを一本鎖切断できるものであれば制限はないが、ニッカーゼ型Ｃａｓタンパク質を構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が好ましい。Ｃａｓタンパク質は、通常、標的鎖の切断に関与するドメイン（ＲｕｖＣドメイン）及び非標的鎖の切断に関与するドメイン（ＨＮＨドメイン）を含むが、ニッカーゼ型Ｃａｓタンパク質は、典型的には、これら２つのドメインのいずれかのドメインの変異により、その切断活性が喪失している。このような変異としては、ｓｐＣａｓ９タンパク質（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質）の場合には、例えば、Ｎ末端から１０番目のアミノ酸（アスパラギン酸）のアラニンへの変異（Ｄ１０Ａ：ＲｕｖＣドメイン内の変異）、Ｎ末端から８４０番目のアミノ酸（ヒスチジン）のアラニンへの変異（Ｈ８４０Ａ：ＨＮＨドメイン内の変異）、Ｎ末端から８６３番目のアミノ酸（アスパラギン）のアラニンへの変異（Ｎ８６３Ａ：ＨＮＨドメイン内の変異）、Ｎ末端から７６２番目のアミノ酸（グルタミン酸）のアラニンへの変異（Ｅ７６２Ａ：ＲｕｖＣＩＩドメイン内の変異）、Ｎ末端から９８６番目のアミノ酸（アスパラギン酸）のアラニンへの変異（Ｄ９８６Ａ：ＲｕｖＣＩＩＩドメイン内の変異）が挙げられる。その他、種々の由来のＣａｓ９タンパク質が公知であり（例えば、ＷＯ２０１４／１３１８３３）、それらのニッカーゼ型を利用することができる。なお、Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列及び塩基配列は公開されたデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に登録されており（例えば、アクセッション番号：Ｑ９９ＺＷ２．１等）、本発明においてはこれらを利用することができる。
　また、本発明においては、Ｃａｓ９以外のＣａｓタンパク質、例えば、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）、Ｃａｓ１２ｂ、ＣａｓＸ（Ｃａｓ１２ｅ）、Ｃａｓ１４などを利用することもできる。ニッカーゼ型Ｃｐｆ１タンパク質における変異としては、例えば、ＡｓＣｐｆ１（Ｃａｓ１２）では、Ｎ末端から１２２６番目のアミノ酸（アルギニン）のアラニンへの変異（Ｒ１２２６Ａ：Ｎｕｃドメイン内の変異）が挙げられる。Ｃｐｆ１のアミノ酸配列は公開されたデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に登録されている（例えば、アクセッション番号：ＷＰ＿０２１７３６７２２、ＷＰ＿０３５６３５８４１など）。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を構成するタンパク質としては、核移行シグナルを付加したものを用いてもよい。
　ニッカーゼ型Ｃａｓタンパク質を構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系においては、ニッカーゼ型Ｃａｓタンパク質がガイドＲＮＡと結合して複合体を形成し、標的ＤＮＡ配列に標的化されてＤＮＡを一本鎖切断する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系においては、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むが、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１系においては、ｔｒａｃｒＲＮＡは不要である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系におけるガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む一分子ガイドＲＮＡでも、ｃｒＲＮＡ断片とｔｒａｃｒＲＮＡ断片とからなる二分子ガイドＲＮＡであってもよい。
　ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列に対して相補的な塩基配列を含む。標的ＤＮＡ配列は、通常、１２～５０塩基、好ましくは、１７～３０塩基、より好ましくは１７～２５塩基からなる塩基配列であり、ＰＡＭ（ｐｒｏｔｏ－ｓｐａｃｅｒ　ａｄｊａｃｅｎｔ　ｍｏｔｉｆ）配列と隣接する領域より選択されることが好ましい。典型的には、ＤＮＡの部位特異的切断は、ｃｒＲＮＡと標的ＤＮＡ配列の間の塩基対形成の相補性と、それに隣接して存在するＰＡＭの両方によって決定される位置で生じる。
　多くのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系においては、ｃｒＲＮＡは、さらに、ｔｒａｃｒＲＮＡ断片と相互作用（ハイブリダイズ）が可能な塩基配列を３’側に含む。一方、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの一部の塩基配列と相互作用（ハイブリダイズ）が可能な塩基配列を５’側に含む。これら塩基配列の相互作用によりｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（一分子又は二分子）が二重鎖ＲＮＡを形成し、形成された二重鎖ＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と相互作用する。
　ＰＡＭは、Ｃａｓタンパク質の種類や由来により異なる。典型的なＰＡＭ配列は、例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質（ＩＩ型）では、「５′－ＮＧＧ」であり、Ｓ．ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ－Ａ１型）では、「５′－ＣＣＮ」であり、Ｓ．ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ－Ａ２型）では、「５′－ＴＣＮ」であり、Ｈ．ｗａｌｓｂｙｌ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ－Ｂ型）では、「５′－ＴＴＣ」であり、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ－Ｅ型）では、「５′－ＡＷＧ」であり、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ－Ｆ型）では、「５′－ＣＣ」であり、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ－Ｆ型）では、「５′－ＣＣ」であり、Ｓ．Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（ＩＩ－Ａ型）では、「５′－ＮＮＡＧＡＡ」であり、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ由来のＣａｓ９タンパク質（ＩＩ－Ａ型）では、「５′－ＮＧＧ」であり、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質では、「５′－ＮＧＲＲＴ」又は「５′－ＮＧＲＲＮ」であり、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質では、「５′－ＮＮＮＮＧＡＴＴ」であり、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ由来のＣａｓ９タンパク質では、「５′－ＮＡＡＡＡＣ」である。Ｃｐｆ１では、典型的には、「５’－ＴＴＮ」又は「５’－ＴＴＴＮ」である。なお、タンパク質を改変すること（例えば、変異の導入）により、ＰＡＭ認識を改変することも可能である（Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ　５２３，４８１－４８５（２０１５）、Ｈｉｒａｎｏ，Ｓ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｅｌｌ　６１，　８８６－８９４（２０１６））。
　本発明においては、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系以外の部位特異的ニッカーゼを利用することもできる。このような部位特異的ニッカーゼとしては、例えば、ニッカーゼ活性を持つ酵素と融合された人工ヌクレアーゼが挙げられる。人工ヌクレアーゼとしては、例えば、ＴＡＬＥ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ）、ＺＦ（ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ）、ＰＰＲ（ｐｅｎｔａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ　ｒｅｐｅａｔ）を利用することができる。これら人工ヌクレアーゼとの融合により、ニッカーゼ活性を発揮し得る酵素としては、例えば、ＴｅｖＩが挙げられる（Ｎａｔ　Ｃｏｍｍｕｎ．　２０１３；４：１７６２．　ｄｏｉ：　１０．１０３８／　ｎｃｏｍｍｓ２７８２）。これら人工ヌクレアーゼは、特定の塩基（あるいは特定の塩基配列）を認識するモジュール（ペプチド）を連結することにより構築されたＤＮＡ結合ドメインにより、標的ＤＮＡ配列に標的化され、当該ＤＮＡ結合ドメインに融合されたニッカーゼにより、ＤＮＡを一本鎖切断する。人工ヌクレアーゼにおけるＤＮＡ結合ドメインとニッカーゼの間には、適当なスペーサーペプチドが導入されていてもよい。
　本発明の第一の態様においては、レシピエントの染色体においては、上記特定の部位（相同染色体間で異なる塩基）の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、ドナーの染色体においては、レシピエントの染色体において一本鎖切断される箇所に対応する箇所の１箇所で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを利用する。具体的な一本鎖切断の態様の例を図２Ａ及び図２Ｂに示す。
　本発明の第二の態様においては、レシピエントの染色体においては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の１箇所で一本鎖切断し、当該ドナーの染色体においては、レシピエントの染色体において一本鎖切断される箇所に対応する箇所と異なる１箇所で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを利用する。具体的な一本鎖切断の態様の例を図３Ａ及び図３Ｂに示す。
　ここで「近傍ＤＮＡ領域」とは、特定の部位から、通常、１０００００塩基以内（例えば、１００００塩基以内、５０００塩基以内、２０００塩基以内、1０００塩基以内、６００塩基以内）の領域である。また、導入されるニック間の距離は、通常、１００塩基以上（例えば、２００塩基以上、３００塩基以上、５００以上、７００塩基以上、１０００塩基以上、１５００塩基以上）である。染色体に導入するニックのうち一つは、当該特定の部位の直近であることが好ましい。ここで「直近」とは、通常、１００塩基位内、より好ましくは５０塩基以内（例えば、４０塩基以内、３０塩基以内、２０塩基以内、１０塩基以内）である。１つの特定の部位の近傍ＤＮＡ領域には、他の特定の部位（相同染色体間で異なる塩基）が存在していてもよい。また、第一の態様における「近傍ＤＮＡ領域の複数箇所」は、同一のＤＮＡ鎖上に存在しても、異なるＤＮＡ鎖上に存在してもよい。
　第一の態様において、ドナーの染色体とレシピエントの染色体の対応する箇所を同時に一本鎖切断する場合には、レシピエントの染色体の標的ＤＮＡ配列に結合する部位特異的ニッカーゼが、ドナーの染色体の対応ＤＮＡ配列にも結合するように設計すればよい。この場合、レシピエントの染色体の標的ＤＮＡ配列とドナーの染色体の対応ＤＮＡ配列は、典型的には、同一のＤＮＡ配列である。
　一方、第一の態様及び第二の態様において、ドナーの染色体とレシピエントの染色体の対応する箇所でレシピエントの染色体のみ一本鎖切断する場合には、レシピエントの染色体の標的ＤＮＡ配列に結合する部位特異的ニッカーゼの組み合わせの一部を、ドナーの染色体の対応ＤＮＡ配列には結合しないように設計すればよい。この場合、レシピエントの染色体の標的ＤＮＡ配列とドナーの染色体の対応ＤＮＡ配列は、典型的には、異なるＤＮＡ配列である。例えば、相同染色体間で異なる塩基を含むように、部位特異的ニッカーゼの標的ＤＮＡ配列を設定すれば、レシピエントの染色体の標的ＤＮＡ配列とドナーの染色体の対応ＤＮＡ配列は、異なるＤＮＡ配列となる。
　第二の態様において、ドナーの染色体とレシピエントの染色体の対応する箇所でドナーの染色体のみ一本鎖切断する場合には、ドナーの染色体の標的ＤＮＡ配列に結合する部位特異的ニッカーゼの組み合わせの一部を、レシピエントの染色体の対応ＤＮＡ配列には結合しないように設計すればよい。この場合、ドナーの染色体の標的ＤＮＡ配列とレシピエントの染色体の対応ＤＮＡ配列は、典型的には、異なるＤＮＡ配列である。
　ドナーの染色体とレシピエントの染色体の対応する箇所で一方の染色体のみ一本鎖切断する場合において、部位特異的ニッカーゼとしてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を利用する場合には、一方の染色体の標的ＤＮＡ配列に結合特異性を持つようにガイドＲＮＡを設計すればよい。また、部位特異的ニッカーゼがニッカーゼ活性を持つ酵素と融合された人工ヌクレアーゼの場合には、一方の染色体の標的ＤＮＡ配列に結合特異性を持つようにＤＮＡ結合ドメインを設計すればよい。この態様においては、部位特異的ニッカーゼの設計上、一本鎖切断される部位は、上記特定の部位（相同染色体間で異なる塩基）から、通常、約１００塩基位内、より好ましくは５０塩基以内（例えば、４０塩基以内、３０塩基以内、２０塩基以内、１０塩基以内）である。
　本発明の第一の態様において、レシピエントの染色体における複数箇所の一本鎖切断が異なるＤＮＡ鎖上で行われる場合には、一本鎖切断の距離が近すぎると二本鎖切断が生じうる。従って、異なるＤＮＡ鎖上にある一本鎖切断箇所の距離は、通常、１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上であり、かつ、通常、２０００塩基以内、好ましくは１０００塩基以内、さらに好ましくは５００塩基以内である。
　本発明においては、上記部位特異的ニッカーゼの組み合わせを細胞に導入する。細胞に導入される「部位特異的ニッカーゼ」は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の場合には、例えば、ガイドＲＮＡとＣａｓタンパク質の組み合わせの形態であっても、ガイドＲＮＡとＣａｓタンパク質に翻訳されるメッセンジャーＲＮＡとの組み合わせの形態であっても、それらを発現するベクターの組み合わせであってもよい。ガイドＲＮＡは、分解を抑制するための修飾（化学修飾など）が行われていてもよい。ニッカーゼ活性を持つ酵素と融合された人工ヌクレアーゼである場合には、例えば、タンパク質の形態であっても、当該タンパク質に翻訳されるメッセンジャーＲＮＡであっても、当該タンパク質を発現するベクターの形態であってもよい。
　発現ベクターの形態を採用する場合には、発現させるべきＤＮＡに作動的に結合している１つ以上の調節エレメントを含む。ここで、「作動可能に結合している」とは、調節エレメントに上記ＤＮＡが発現可能に結合していることを意味する。「調節エレメント」としては、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御エレメント（例えば、転写終結シグナル、例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリＵ配列）が挙げられる。調節エレメントとしては、目的に応じて、例えば、多様な宿主細胞中でのＤＮＡの構成的発現を指向するものであっても、特定の細胞、組織、あるいは器官でのみＤＮＡの発現を指向するものであってもよい。また、特定の時期にのみＤＮＡの発現を指向するものであっても、人為的に誘導可能なＤＮＡの発現を指向するものであってもよい。プロモーターとしては、例えば、ｐｏｌＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６及びＨ１プロモーター）、ｐｏｌＩＩプロモーター（例えば、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーター）、ｐｏｌＩプロモーター、又はそれらの組合せが挙げられる。当業者であれば、導入する細胞の種類などに応じて、適切な発現ベクターを選択することができる。
　本発明におけるゲノム編集の対象となる「細胞」としては、相同染色体を有する限り、特に制限はなく、様々な真核細胞を対象とすることができる。
　「真核細胞」としては、例えば、動物細胞、植物細胞、藻細胞、真菌細胞が挙げられる。また動物細胞としては、例えば、哺乳動物細胞の他、魚類、鳥類、爬虫類、両生類、昆虫類の細胞が挙げられる。
　「動物細胞」には、例えば、動物の個体を構成している細胞、動物から摘出された器官・組織を構成する細胞、動物の組織に由来する培養細胞などが含まれる。具体的には、例えば、各段階の胚の胚細胞（例えば、１細胞期胚、２細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚、１６細胞期胚、桑実期胚など）；誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、造血幹細胞などの幹細胞；線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、脳細胞、腎細胞などの体細胞などが挙げられる。ゲノム編集動物の作成には、受精後の卵母細胞、すなわち受精卵を用いることができる。特に好ましくは、受精卵は前核期胚のものである。受精前の卵母細胞には、凍結保存されたものを解凍して用いることができる。
　本発明において「哺乳動物」とは、ヒト及び非ヒト哺乳動物を包含する概念である。非ヒト哺乳動物の例としては、ウシ、イノシシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの偶蹄類、ウマなどの奇蹄類、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、リスなどの齧歯類、ウサギなどのウサギ目、イヌ、ネコ、フェレットなどの食肉類などが挙げられる。上記の非ヒト哺乳動物は、家畜又はコンパニオンアニマル（愛玩動物）であってもよく、野生動物であってもよい。
　「植物細胞」としては、例えば、穀物類、油料作物、飼料作物、果物、野菜類の細胞が挙げられる。「植物細胞」には、例えば、植物の個体を構成している細胞、植物から分離した器官や組織を構成する細胞、植物の組織に由来する培養細胞などが含まれる。植物の器官や組織としては、例えば、葉、茎、茎頂（生長点）、根、塊茎、塊根、種子、カルスなどが挙げられる。植物の例としては、イネ、トウモロコシ、バナナ、ピーナツ、ヒマワリ、トマト、アブラナ、タバコ、コムギ、オオムギ、ジャガイモ、ダイズ、ワタ、カーネーションなどが挙げられる。
　本発明の方法の第一の態様においては、Ｌｉｇ４遺伝子、ＰＡＲＰ１遺伝子、ＸＲＣＣ１遺伝子、ＭＳＨ２遺伝子、及びＳＭＡＲＣＡＬ１遺伝子からなる群より選択される遺伝子の機能が抑制された細胞を用いることが好ましい。典型的なヒト由来のＬｉｇ４遺伝子の塩基配列及び当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、データベース（アクセッション番号：ＮＭ＿００２３１２、ＮＭ＿２０６９３７、ＮＭ＿００１０９８２６８、ＮＰ＿００２３０３、ＮＰ＿９９６８２０、ＮＰ＿００１０９１７３８）に、ヒト由来のＰＡＲＰ１遺伝子の塩基配列及び当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、データベース（アクセッション番号：ＮＭ＿００１６１８、ＮＰ＿００１６０９）に、ヒト由来のＸＲＣＣ１遺伝子の塩基配列及び当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、データベース（アクセッション番号：ＮＭ＿００６２９７、ＮＰ＿００６２８８）に、ヒト由来のＭＳＨ２遺伝子の塩基配列及び当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、データベース（アクセッション番号：ＮＭ＿０００２５１もしくはＮＭ＿００１２５８２８１、ＮＰ＿０００２４２、ＮＰ＿００１２４５２１０）に、ヒト由来のＳＭＡＲＣＡＬ１遺伝子の塩基配列及び当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、データベース（アクセッション番号：ＮＭ＿０１４１４０、ＮＭ＿００１１２７２０７、ＮＰ＿０５４８５９、ＮＰ＿００１１２０６７９）に、それぞれ開示されている。
　本発明における「遺伝子の機能の抑制」は、その機序が、遺伝子の翻訳産物（タンパク質）の活性の抑制であっても、遺伝子の発現の抑制であってもよい。遺伝子の翻訳産物（タンパク質）の活性の抑制は、例えば、当該遺伝子への変異（欠失、置換、挿入など）の導入や阻害剤処理により行うことができる。
　遺伝子への変異の導入は、例えば、ゲノム編集系を利用して行うことができる。ゲノム編集系としては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）、ＴＡＬＥＮｓ、ＺＦＮｓなどの部位特異的人工ヌクレアーゼなどが挙げられる。ゲノム編集系の作用により標的部位で遺伝子が切断され、細胞のＤＮＡ修復機構を介して、遺伝子に変異（塩基の欠失、挿入など）が導入される。変異の導入により遺伝子を欠損させる場合、欠損は、遺伝子全体の欠損であっても、部分的な欠損であってもよい。
　阻害剤処理としては、例えば、Ｌｉｇ４阻害剤であるＳＣＲ７による処理、ＰＡＲＰ阻害剤であるＯｌａｐａｒｉｂ、Ｖｅｌｉｐａｒｉｂ、Ｎｉｒａｐａｒｉｂ、またはＴａｌａｚｏｐａｒｉｂによる処理などが挙げられるが、これらに制限されない。
　「遺伝子の機能の抑制」は、また、当該遺伝子の発現の抑制によって行うこともできる。遺伝子の発現の抑制は、遺伝子の翻訳の抑制であっても、転写の抑制であってもよい。遺伝子の翻訳の抑制は、例えば、遺伝子の転写産物に結合する二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を利用して行うことができる。二重鎖ＲＮＡとしては、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｐｉｎ　ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡなどが挙げられる。遺伝子の転写の抑制は、例えば、遺伝子の発現制御領域への変異の導入によって行うことができる。変異の導入には、当該発現制御領域を標的化する上記のゲノム編集系を利用することができる。遺伝子の発現が抑制されたか否かは、翻訳レベルであれば、例えば、翻訳産物に結合する抗体を利用した免疫学的測定法により、転写レベルであれば、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ法やノーザンブロッティング法により、それぞれ評価することができる。
　遺伝子の機能を抑制するための分子は、当該分子自体を細胞に導入してもよく、また、当該分子が核酸の場合には、細胞内で発現させるために、当該分子をコードするＤＮＡ（典型的には、当該ＤＮＡが挿入されたベクター）を細胞に導入してもよい。
　部位特異的ニッカーゼや遺伝子の機能を抑制する分子の細胞への導入は、例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン法、リポフェクション法、ナノ粒子媒介性トランスフェクション法、ウイルス媒介性核酸送達法などの公知の方法で行うことができる。
　細胞への導入後、部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、レシピエント及びドナーの染色体を一本鎖切断する。これにより相同染色体間での相同組換えが誘導され、高効率かつ特異的に、レシピエントの標的塩基がドナーにおける対応する塩基に置換される。
　また、本発明は、上記本発明の方法に用いるためのキットであって、上記部位特異的ニッカーゼの組み合わせを含むキットを提供する。当該のキットは、一つ又は複数の追加の試薬をさらに含む場合があり、追加の試薬としては、例えば、希釈緩衝液、再構成溶液、洗浄緩衝液、核酸導入試薬、タンパク質導入試薬、対照試薬（例えば、対照のガイドＲＮＡ）が挙げられるが、これらに制限されない。当該キットは、本発明の方法を実施するための使用説明書を含んでいてもよい。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　［材料と方法］
　Ａ．材料
　（１）ＴＳＣＥＲ２細胞（図４ａ）
　ＴＫ６細胞由来リンパ芽球細胞であるＴＳＣＥＲ２細胞には、チミジンキナーゼ１遺伝子のエクソン４への１ｂｐ挿入（ｃ．２３１＿２３２ｉｎｓＣ）による機能喪失型フレームシフトを持つアレルＡと、イントロン４上の３１ｂｐ挿入、エクソン５上の機能喪失型の点変異（ｃ．３２６Ｇ＞Ａ）、及び機能に影響を与えないエクソン７上の１ｂｐ挿入（ｃ．６４０＿６４１ｉｎｓＧ）を持つアレルＢが含まれる。
　（２）ＴＳＣＥＲ２細胞由来ノックアウト細胞
　ジーンターゲティング法によりＴＳＣＥＲ２細胞において、以下の各遺伝子をノックアウトした細胞である。ｐ５３－／－、Ｌｉｇ４－／－、ＰＡＲＰ１－／－ＰＡＲＰ２－／＋、ＸＲＣＣ１－／－、ＭＳＨ２－／－、ＭＬＨ１－／－、ＭＬＨ３－／－、ＸＰＡ－／－、ＭＵＳ８１－／－、又はＭＡＲＣＡＬ１－／－。各遺伝子のノックアウト細胞は、ＴＫ６　Ｍｕｔａｎｔｓ　Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｉｈｓ．ｇｏ．ｊｐ／ｄｇｍ／ｔｋ６．ｈｔｍｌ）に登録されている。
　（３）ＴＫ６２６１細胞（図４ｂ）
　ＴＫ６細胞由来リンパ芽球細胞であるＴＫ６２６１細胞には、チミジンキナーゼ１遺伝子のエクソン４への１ｂｐ挿入（ｃ．２３１＿２３２ｉｎｓＣ）による機能喪失型フレームシフトを持つアレルＡとエクソン５上の８ｂｐ欠失（ｃ．３０９＿３１６ｄｅｌ８）による機能喪失型フレームシフト及び機能に影響を与えないエクソン７上の１ｂｐ挿入（ｃ．６４０＿６４１ｉｎｓＧ）を持つアレルＢが含まれる。
　（４）ＴＫ６２６１ＥＧＦＰ細胞
　ＴＫ６２６１細胞のＲｏｓａ２６領域にＥＧＦＰ遺伝子をノックインした株である。
　（５）Ｃａｓ９Ｄ１０ＡニッカーゼｍＲＮＡ
　ＣｌｅａｎＣａｐ　Ｃａｓ９　Ｎｉｃｋａｓｅ　ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）－（Ｌ－７２０７）（ＴｒｉＬｉｎｋ　ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１．０ｍｇ／ｍＬで使用した。
　（６）ｓｇＲＮＡの標的配列（（）内はＰＡＭ配列）
ｓｇＴＫｅｘ４＿２０ｓ：ＣＧＴＣＴＣＧＧＡＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＧ（ＧＧＧ）／配列番号：１
ｓｇＳ１４：ＴＣＣＣＡＣＣＧＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＧＣ（ＣＧＧ）／配列番号：２
ｓｇＳ１１：ＴＣＡＡＴＣＡＴＡＴＣＡＣＴＣＴＴＡＧＣ（ＴＧＧ）／配列番号：３
ｓｇＳ１２：ＧＧＡＧＣＴＧＴＣＣＡＴＧＡＧＡＣＣＣＡ（ＧＧＧ）／配列番号：４
ｓｇＴＫｅｘ５＿ｍｕｔ４ｓ：ＣＴＣＧＣＡＧＡＡＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＣ（ＴＧＧ）／配列番号：５
ｓｇＴＫｅｘ５＿ＷＴ４ｓ：ＡＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣ（ＴＧＧ）／配列番号：６
ｓｇＴＫｅｘ５＿４１ｓ：ＡＧＣＣＡＣＡＡＴＴＡＣＧＧＴＣＴＴＣＣ（ＣＧＧ）／配列番号：７
ｓｇＴＫｅｘ７＿１０５ｓ：ＣＣＣＣＴＧＧＣＴＴＴＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（ＧＧＧ）／配列番号：８
ｓｇＴＫｅｘ７＿ＷＴ１２１ｓ：ＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＧＧＣＴＴＣＣＣＣ（ＴＧＧ）／配列番号：９。
ＴＫｅｘ７ｍｔ＿１２１ｓ：ＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＧＧＣＴＴＣＣＣＣＣ（ＴＧＧ）／配列番号１０
　（７）エレクトロポレーター
　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｎｅｏｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ、Ｎｅｏｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　１０μＬ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
　（８）基本培地
　５％ウマ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び２００μｇ／ｍｌ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｎａｃａｌａｉ）がＲＰＭＩ１６４０培地（Ｎａｃａｌａｉ）中に加えられた培地。
　（９）ＣＨＡＴ培地
　１０μＭ　２－ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］、２００μＭ　ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］，１００ｎＭ　ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ［Ｓｉｇｍａ］、及び１７．５μＭ　ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］が基本培地中に加えられた培地。
　（１０）　ＰＣＲ　プライマー
　ｓｇＲＮＡ「ＴＫｅｘ５＿ｍｕｔ４ｓ」、ｓｇＲＮＡ「ＴＫｅｘ７＿１０５ｓ」、及びｓｇＲＮＡ「ＴＫｅｘ７＿ｍｕｔ１２１ｓ」の標的配列がＰＣＲ産物（全長約１．９ｋｂｐ）に含まれるようにデザインしたＰＣＲにおいては、プライマーセットＬ－ＴＫｅｘ５７を使用した。
Ｌ－ＴＫｅｘ５７　Ｆｏｒｗａｒｄ：　ＡＡＧＣＣＣＴＣＡＣＧＴＣＴＣＡＡＴＡＡＣＣ／配列番号：１１
Ｌ－ＴＫｅｘ５７　Ｒｅｖｅｒｓｅ：　ＧＣＴＴＴＡＡＧＣＡＧＡＣＣＡＧＴＧＧＧＴＡ／配列番号：１２。
　Ｂ．方法
　１．０ｍｇ／ｍＬ　Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ　ｍＲＮＡを０．９μＬ、１００ｎｍｏｌ／ｍＬのｓｇＲＮＡ２種類をそれぞれ０．４５μＬ、及びＮｅｏｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｒバッファーを２．２μＬ混合して調製した合計４μＬの混合液に対し、７０ｘ１０４の細胞を含むＲバッファーを１０μＬ混合した。このうち１０μＬに対し、Ｎｅｏｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍを用い、Ｖｏｌｔａｇｅ　１５００Ｖ、Ｗｉｄｔｈ　１０ｍｓ、Ｐｕｌｓｅ　３ｐｕｌｓｅｓの条件でエレクトロポレーションを実施した。
　［実施例］
　Ａ．特定の遺伝子のノックアウトがゲノム編集効率に与える影響の検証
　ＴＳＣＥＲ２細胞、ＴＳＣＥＲ２細胞由来ｐ５３－／－、Ｌｉｇ４－／－、ＰＡＲＰ１－／－ＰＡＲＰ２－／＋、ＸＲＣＣ１－／－、ＭＳＨ２－／－、ＭＬＨ１－／－、ＭＬＨ３－／－、ＸＰＡ－／－、ＭＵＳ８１－／－、ＳＭＡＲＣＡＬ１－／－細胞、ＴＫ６２６１ＥＧＦＰ細胞に対し、ｓｇＲＮＡ２種類（ｓｇＴＫｅｘ４＿２０ｓとｓｇＳ１４）及びＣａｓ９Ｄ１０Ａ　ｍＲＮＡのエレクトロポレーションを実施した（図５）。エレクトロポレーションから４日後、標準細胞としてのＴＫ６２６１ＥＧＦＰ細胞と、テスト細胞としてのＴＳＣＥＲ２細胞もしくはＴＳＣＥＲ２細胞由来ノックアウト細胞とを１：１の細胞数比で混合し、一部は基本培地で８日間、一部はＣＨＡＴ培地中で４日間、さらに基本培地で４日間培養した。培養後、フローサイトメトリーにより、ＥＧＦＰ陽性細胞と陰性細胞の割合を測定した。なお、ｓｇＴＫｅｘ４＿２０ｓ及びｓｇＳ１４をＣａｓ９Ｄ１０Ａ　ｍＲＮＡのエレクトロポレーション実施後にＣＨＡＴ培地で増殖する細胞では、ＴＫ１遺伝子のエクソン４が野生型のホモ接合体となることはすでに実証済みである。ＣＨＡＴ培地での選抜後のＥＧＦＰ陽性細胞率と基本培地中のＥＧＦＰ陽性細胞率の比から、ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ－ａｂｉｌｉｔｙ　ｉｎ　ＣＨＡＴ　ｍｅｄｉｕｍ　ｉｎｄｅｘ（ＰＣＩ）を算出した（表１）。
　ＰＣＩ＝ｘ１・ｙ２／（ｘ２・ｙ１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ＴＳＣＥＲ２におけるＰＣＩを１とした場合の各ノックアウト細胞における相対的ＰＣＩを図６に示した。Ｌｉｇ４、ＰＡＲＰ１、ＭＳＨ２、ＳＭＡＲＣＡＬ１のノックアウトによりゲノム編集効率の上昇が認められた。
　なお、ＰＣＩの算出方法の詳細は、以下の通りである。
　基本培地中の細胞中ｘ１（％）を占める標準細胞（ＥＧＦＰ陽性細胞）のうちａ（％）で遺伝子修正が成功しており、基本培地中の細胞中ｘ２（％）を占めるテスト細胞（ＥＧＦＰ陰性）のうちｂ（％）で遺伝子修正が成功しているとすると、以下の式が成立する。
　ｘ１・ａ：ｘ２・ｂ＝ｙ１：ｙ２
　ｘ２・ｙ１・ｂ＝ｘ１・ｙ２・ａ
　ＰＣＩは標準細胞における遺伝子修正率に対するテスト細胞における遺伝子修正率の比（ｂ／ａ）であり、以下の式が成立する。
　ＰＣＩ＝ｂ／ａ＝ｘ１・ｙ２／（ｘ２・ｙ１）
　Ｂ．相同染色体の一本鎖切断のパターンがゲノム編集の効率及び特異性に与える影響
（１）各アリルに導入されるニックのパターンと相同染色体間組換えによる遺伝子修正効率の関係
　（ｉ）実験１
　ＴＫ６２６１細胞のエクソン５における８ｂｐ欠失に特異的でアレルＢを標的とするｓｇＲＮＡ（ｓｇＴＫｅｘ５＿ｍｕｔ４ｓ）、このｓｇＲＮＡと同じＰＡＭ配列を用いるがアレルＡを特異的に標的とするｓｇＲＮＡ（ｓｇＴＫｅｘ５＿ＷＴ４ｓ）、アレルＡ及びアレルＢをともに標的とするｓｇＲＮＡ（ｓｇＴＫｅｘ５＿４１ｓ）を、それぞれｓｇＴＫｅｘ４＿２０ｓと組み合わせ、Ｃａｓ９Ｄ１０ＡニッカーゼｍＲＮＡとともにＴＫ６２６１細胞にエレクロトポレーション法で導入した。
　ＴＫ６２６１ＥＧＦＰ細胞には、ｓｇＴＫｅｘ４＿２０ｓとｓｇＳ１１の組み合わせをＣａｓ９Ｄ１０ＡニッカーゼｍＲＮＡとともにエレクロトポレーション法により導入した。
　エレクトロポレーションから４日後、ＴＫ６２６１ＥＧＦＰ細胞とＴＫ６２６１細胞とを１：１の細胞数比で混合し、一部は基本培地で８日間、一部はＣＨＡＴ培地で４日間、さらに基本培地で４日間培養した。培養後、フローサイトメトリーにより、ＥＧＦＰ陽性細胞と陰性細胞の割合を測定した。ＣＨＡＴ培地でのセレクション後のＥＧＦＰ陽性細胞率と基本培地中のＥＧＦＰ陽性細胞の比から、ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ＣＨＡＴ　ｍｅｄｉｕｍ　ｉｎｄｅｘ（ＰＣＩ）を算出した。これにより、（ｄ）又は（ｅ）のように遺伝子が修正されＴＫ活性を回復した細胞の割合が算出される。
　両相同染色体に１カ所ずつニックを発生させた場合（ｓｇＴＫｅｘ４＿２０ｓ＋ｓｇＴＫｅｘ５＿ｍｕｔ４ｓ：（ｃ））は、アレルＡのみにタンデムにニックを発生させた場合（ｓｇＴＫｅｘ４＿２０ｓ＋ｓｇＴＫｅｘ５＿ＷＴ４ｓ：（ｂ））よりも著しく高効率でＴＫ活性の回復が認められた（図７）。また、アレルＡにタンデムにニック、かつ、アレルＢに１つのニックを発生させた場合（ｓｇＴＫｅｘ４＿２０ｓ＋ｓｇＴＫｅｘ５＿４１ｓ：（ａ））は、両相同染色体に１カ所ずつニックを発生させた場合（ｃ）と同等の効率でＴＫ活性の回復が認められた（図７）。
　（ｉｉ）実験２
　エクソン７の野生型配列を持つアレルＡを特異的に標的とするｓｇＲＮＡ（ｓｇＴＫｅｘ７＿ＷＴ１２１ｓ）又はエクソン７においてアレルＡとアレルＢの両方を標的とするｓｇＲＮＡ（ｓｇＴＫｅｘ７＿１０５ｓ）とエクソン５の変異型配列をもつアレルＢを特異的に標的とするｓｇＲＮＡ（ｓｇＴＫｅｘ５＿ｍｕｔ４ｓ）とを組み合わせ、Ｃａｓ９Ｄ１０ＡニッカーゼｍＲＮＡとともにＴＫ６２６１細胞にエレクロトポレーション法で導入した。
　ＴＫ６２６１ＥＧＦＰ細胞には、ｓｇＴＫｅｘ４＿２０ｓとｓｇＳ１２の組み合わせをＣａｓ９Ｄ１０ＡニッカーゼｍＲＮＡとともにエレクロトポレーション法により導入した。
　エレクトロポレーションから４日後、ＴＫ６２６１ＥＧＦＰ細胞とＴＫ６２６１細胞とを１：１の細胞数比で混合し、一部は基本培地で８日間、一部はＣＨＡＴ培地で４日間そして引き続きノーマル培地で４日間培養した。培養後、フローサイトメトリーにより、ＥＧＦＰ陽性細胞と陰性細胞の割合を測定した。ＣＨＡＴ培地でのセレクション後のＥＧＦＰ陽性細胞率と基本培地中のＥＧＦＰ陽性細胞の比から、ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ＣＨＡＴ　ｍｅｄｉｕｍ　ｉｎｄｅｘ（ＰＣＩ）を算出した。これにより、（ｄ）のように遺伝子が修正されＴＫ活性を回復した細胞の割合が算出される。
　アレルＡとアレルＢにそれぞれ１つずつニックを発生させた場合（ｓｇＴＫｅｘ５＿ｍｕｔ４ｓ＋ｓｇＴＫｅｘ７＿ＷＴ１２１ｓ：（ｃ））には、アレルＢのみにタンデムにニックを発せさせた場合（ｓｇＴＫｅｘ５＿ｍｕｔ４ｓ＋ｓｇＴＫｅｘ７＿ｍｕｔ１２１ｓ：（ｂ））よりも顕著に高効率にゲノム編集が行われ、アレルＢ上にタンデムにニック、かつ、アリルＡに１つニックを発生させた場合（ｓｇＴＫｅｘ５＿ｍｕｔ４ｓ＋ｓｇＴＫｅｘ７＿１０５ｓ：（ａ））の半分程度のゲノム編集効率が維持された（図８）。
　（２）各アリルに導入されるニックのパターンと相同染色体における長鎖ＤＮＡ欠失の頻度の関係
　上記（１）の実験２において各ゲノム編集系の導入後に計８日間の培養を行った細胞を対象とし、ＦＡＣＳ　ＡｒｉａＩＩＩ（ＢＤ）を用い、１ウェルあたり２００μＬの基本培地を分注した９６ウェルプレートに１細胞／ウェルとなるようにソーティングを行った。約１週間の培養後、増殖した１細胞由来クローンを９４クローン採取し、簡易ＤＮＡ抽出キットＶｅｒｓｉｏｎ２（カネカ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
　１細胞由来クローンから抽出したＤＮＡを鋳型として、ＫＯＤ　ＦＸ　Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物は０．９％　ＴＡＥゲル中で電気泳動を行い、ゲルをＵｌｔｒａ　Ｓａｆｅ　Ｄｙｅで染色後、青色ＬＥＤライトで可視化し、デジタルカメラで撮影した。アレルＢ上にタンデムにニック、かつ、アリルＡに１つニックを発生させた場合（ｓｇＴＫｅｘ５＿ｍｕｔ４ｓ＋ｓｇＴＫｅｘ７＿１０５ｓ：出願済み特許の手法：（ａ））では５００ｂｐ以上の大規模欠失（図中の（ｄ））が０．７１±０．６１％で発生したが、アレルＡとアレルＢにそれぞれ１つずつニックを発生させた場合（ｓｇＴＫｅｘ５＿ｍｕｔ４ｓ＋ｓｇＴＫｅｘ７＿ＷＴ１２１ｓ：（ｃ））は０％であった（全く発生しなかった）（図９）。
　以上説明したように、本発明によれば、部位特異的ニッカーゼによる一本鎖切断により誘導された相同染色体間の相同組換えを利用して、相同染色体間で異なる塩基を、いずれかの塩基に統一することが可能である。外来のドナーＤＮＡを用いない本発明は、その安全性の高さから、特に、ヘテロ変異に起因する疾患の遺伝子治療に大きく貢献し得る。
配列番号：１～１０：ｓｇＲＮＡの標的配列
配列番号：１１～１２：プライマー配列

Claims (8)

  1. 　ゲノム編集された細胞を製造する方法であって、
    　相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞に、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを導入し、当該相同染色体の一方をレシピエントとし、他方をドナーとした相同組換えを誘導して、当該特定の部位におけるレシピエントの塩基をドナーの塩基に置換することを含み、
    　当該細胞が、Ｌｉｇ４遺伝子、ＰＡＲＰ１遺伝子、ＸＲＣＣ１遺伝子、ＭＳＨ２遺伝子、及びＳＭＡＲＣＡＬ１遺伝子からなる群より選択される遺伝子の機能が抑制された細胞であり、
    　当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、当該レシピエントの染色体においては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、当該ドナーの染色体においては、レシピエントの染色体において一本鎖切断される箇所に対応する１箇所で一本鎖切断する方法。
  2. 　置換されるレシピエントの塩基が変異塩基であり、ドナーの塩基が正常塩基である、請求項１に記載の方法。
  3. 　部位特異的ニッカーゼがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　請求項１から３のいずれかに記載の方法に用いるためのキットであって、
    　相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞において、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを含み、
    　当該細胞が、Ｌｉｇ４遺伝子、ＰＡＲＰ１遺伝子、ＸＲＣＣ１遺伝子、ＭＳＨ２遺伝子、及びＳＭＡＲＣＡＬ１遺伝子からなる群より選択される遺伝子の機能が抑制された細胞であり、
    　当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、当該レシピエントの染色体においては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、当該ドナーの染色体においては、レシピエントの染色体において一本鎖切断される箇所に対応する１箇所で一本鎖切断するキット。
  5. 　ゲノム編集された細胞を製造する方法であって、
    　相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞に、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを導入し、当該相同染色体の一方をレシピエントとし、他方をドナーとした相同組換えを誘導して、当該特定の部位におけるレシピエントの塩基をドナーの塩基に置換することを含み、
    　当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、当該レシピエントの染色体においては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の１箇所で一本鎖切断し、当該ドナーの染色体においては、レシピエントの染色体において一本鎖切断される箇所に対応する箇所と異なる１箇所で一本鎖切断する方法。
  6. 　置換されるレシピエントの塩基が変異塩基であり、ドナーの塩基が正常塩基である、請求項５に記載の方法。
  7. 　部位特異的ニッカーゼがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、請求項５又は６に記載の方法。
  8. 　請求項５から７のいずれかに記載の方法に用いるためのキットであって、
    　相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞において、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを含み、
    　当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、当該レシピエントの染色体においては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の１箇所で一本鎖切断し、当該ドナーの染色体においては、レシピエントの染色体において一本鎖切断される箇所に対応する箇所と異なる１箇所で一本鎖切断するキット。
PCT/JP2022/046917 2021-12-24 2022-12-20 相同組換えを利用したゲノム編集細胞の製造方法 Ceased WO2023120530A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP22911232.1A EP4455282A4 (en) 2021-12-24 2022-12-20 METHOD FOR PRODUCING CELLS WITH MODIFIED GENOME BY HOMOLOGOUS RECOMBINATION
JP2023569464A JPWO2023120530A1 (ja) 2021-12-24 2022-12-20
US18/723,213 US20250059570A1 (en) 2021-12-24 2022-12-20 Method for producing genome-edited cells utilizing homologous recombination
CN202280085079.5A CN118475693A (zh) 2021-12-24 2022-12-20 利用了同源重组的基因组编辑细胞的制造方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021-210431 2021-12-24
JP2021210431 2021-12-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023120530A1 true WO2023120530A1 (ja) 2023-06-29

Family

ID=86902532

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2022/046917 Ceased WO2023120530A1 (ja) 2021-12-24 2022-12-20 相同組換えを利用したゲノム編集細胞の製造方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20250059570A1 (ja)
EP (1) EP4455282A4 (ja)
JP (1) JPWO2023120530A1 (ja)
CN (1) CN118475693A (ja)
WO (1) WO2023120530A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024204215A1 (ja) * 2023-03-28 2024-10-03 国立大学法人大阪大学 相同染色体の一方のＣｏｌ７ａ遺伝子に特異的なＤＮＡ欠失を有する細胞を製造する方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014131833A1 (en) 2013-02-27 2014-09-04 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum Für Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) Gene editing in the oocyte by cas9 nucleases
JP2018011525A (ja) 2016-07-19 2018-01-25 国立大学法人大阪大学 ゲノム編集方法
JP2019521139A (ja) * 2016-07-13 2019-07-25 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッドＶｅｒｔｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ゲノム編集効率を高めるための方法、組成物及びキット
WO2020100361A1 (ja) 2018-11-16 2020-05-22 国立大学法人大阪大学 ゲノム編集された細胞を製造する方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017201476A1 (en) * 2016-05-20 2017-11-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for breaking immunological tolerance using multiple guide rnas

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014131833A1 (en) 2013-02-27 2014-09-04 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum Für Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) Gene editing in the oocyte by cas9 nucleases
JP2019521139A (ja) * 2016-07-13 2019-07-25 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッドＶｅｒｔｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ゲノム編集効率を高めるための方法、組成物及びキット
JP2018011525A (ja) 2016-07-19 2018-01-25 国立大学法人大阪大学 ゲノム編集方法
WO2020100361A1 (ja) 2018-11-16 2020-05-22 国立大学法人大阪大学 ゲノム編集された細胞を製造する方法

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"GenBank", Database accession no. WP_035635841
BENJAMIN, P ET AL., NATURE, vol. 523, 2015, pages 481 - 485
HIRANO, S ET AL., MOLECULAR CELL, vol. 61, 2016, pages 886 - 894
NAKAJIMA K ET AL., GENOME RES, vol. 28, 2018, pages 223 - 230
NAKAJIMA KAZUHIRO, ZHOU YUE, TOMITA AKIKO, HIRADE YOSHIHIRO, GURUMURTHY CHANNABASAVAIAH B., NAKADA SHINICHIRO: "Precise and efficient nucleotide substitution near genomic nick via noncanonical homology-directed repair", GENOME RESEARCH, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS, US, vol. 28, no. 2, 1 February 2018 (2018-02-01), US , pages 223 - 230, XP055876206, ISSN: 1088-9051, DOI: 10.1101/gr.226027.117 *
NAT COMMUN, vol. 4, 2013, pages 1762
See also references of EP4455282A4

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024204215A1 (ja) * 2023-03-28 2024-10-03 国立大学法人大阪大学 相同染色体の一方のＣｏｌ７ａ遺伝子に特異的なＤＮＡ欠失を有する細胞を製造する方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP4455282A4 (en) 2025-10-01
JPWO2023120530A1 (ja) 2023-06-29
US20250059570A1 (en) 2025-02-20
CN118475693A (zh) 2024-08-09
EP4455282A1 (en) 2024-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20190335725A1 (en) Genetically sterile animals
EP3039145B1 (en) Efficient non-meiotic allele introgression
KR20150105475A (ko) 유각의 가축
CN111647627A (zh) 多重基因编辑
US20170079251A1 (en) Genetically modified animals having increased heat tolerance
JP2018531003A6 (ja) 向上した耐暑性を有する遺伝子改変動物
US20200399661A1 (en) Materials and methods for preventing transmission of a particular chromosome
WO2023120530A1 (ja) 相同組換えを利用したゲノム編集細胞の製造方法
JP7426101B2 (ja) ゲノム編集された細胞を製造する方法
WO2020198541A1 (en) Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv) resistant swine
US20230167443A1 (en) Optimised Methods for Cleavage of Target Sequences
EP4410975A1 (en) Method for producing cells having dna deletion specific to one of homologous chromosomes
CN116406383A (zh) FokI核酸酶结构域的突变体
WO2024204215A1 (ja) 相同染色体の一方のＣｏｌ７ａ遺伝子に特異的なＤＮＡ欠失を有する細胞を製造する方法
KR20190023602A (ko) 생식조절인자의 유전적 조작 및 이의 용도
KR20190038449A (ko) Klotho 유전자 넉아웃 질환모델 동물 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22911232

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2023569464

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 18723213

Country of ref document: US

Ref document number: 202280085079.5

Country of ref document: CN

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022911232

Country of ref document: EP

Effective date: 20240724