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WO2023106376A1 - コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、及び表皮角化細胞賦活剤 - Google Patents

コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、及び表皮角化細胞賦活剤 Download PDF

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WO2023106376A1
WO2023106376A1 PCT/JP2022/045317 JP2022045317W WO2023106376A1 WO 2023106376 A1 WO2023106376 A1 WO 2023106376A1 JP 2022045317 W JP2022045317 W JP 2022045317W WO 2023106376 A1 WO2023106376 A1 WO 2023106376A1
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WO
WIPO (PCT)
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lactic acid
fructobacillus
acid bacterium
culture
production promoter
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2022/045317
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
喜範 片倉
孝治 西川
秀聡 井戸垣
悠司 時本
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kyushu University NUC
Osaka Soda Co Ltd
Original Assignee
Kyushu University NUC
Osaka Soda Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to US18/717,863 priority patent/US20250325597A1/en
Priority to KR1020247019453A priority patent/KR20240121747A/ko
Priority to JP2023566367A priority patent/JPWO2023106376A1/ja
Priority to EP22904303.9A priority patent/EP4445894A4/en
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    • A61K31/7115—Nucleic acids or oligonucleotides having modified bases, i.e. other than adenine, guanine, cytosine, uracil or thymine

Definitions

  • the present invention relates to a collagen production promoter, a hyaluronic acid production promoter, and an epidermal keratinocyte activator.
  • Collagen is widely distributed in the body as a component of connective tissue, skin, bone, etc. Promotion of collagen production is considered to be effective in improving rough skin, sagging skin, wrinkles, wounds, etc., and in treating arthritis, tenosynovitis, and the like. Therefore, active ingredients that promote the production of collagen are being searched for.
  • Patent Document 1 discloses a collagen production promoter containing an extract of amla (Phyllanthus emblica), and Patent Document 2 discloses that a passion fruit seed extract is used as an active ingredient.
  • Collagen production promoters have been disclosed, and Patent Document 3 discloses a collagen production promoter characterized by comprising an essential oil obtained by steam distillation of Roman chamomile (Anthemis nobilis).
  • Hyaluronic acid is widely distributed in the body as a component of skin, synovial fluid, vitreous body, and ligaments. Promotion of hyaluronic acid production is considered to be effective for improving skin moisturizing effect, improving skin sagging, treating arthritis, treating corneal and conjunctival epithelial disorders, and maintaining the anterior chamber during cataract and corneal transplant surgery. Therefore, active ingredients that promote the production of hyaluronic acid are being searched for.
  • Patent Document 4 discloses a hyaluronic acid production promoter containing, as an active ingredient, a seaweed extract belonging to the Durvillea genus Durvillea family
  • Patent Document 5 discloses a hyaluronic acid production promoter containing eggshell membranes as an active ingredient. Acid production promoters have been disclosed
  • Patent Document 6 discloses a hyaluronic acid production promoter containing poultry legs or processed products thereof.
  • the skin is a tissue consisting of the epidermis and dermis, and serves as a barrier to protect the body from physical and/or chemical stress from the outside world.
  • the epidermis which is the outer layer of skin tissue, consists of a basal layer, a spinous layer, a granular layer, and a stratum corneum, and is mainly composed of epidermal keratinocytes.
  • Epidermal keratinocytes divided in the basal layer migrate to the upper layer through differentiation and maturation, reach the stratum corneum on the outer surface, and then fall off, repeating turnover to maintain the epidermis. Epidermal turnover is involved in skin barrier function, moisture retention, and the like.
  • epidermal keratinocyte activators are used for prevention and/or treatment of rough skin and/or dry skin.
  • Patent Document 7 describes epidermal keratinocyte proliferation containing an aqueous extract of honeysuckle flower of Lonicera genus Lonicera of the family Loniceraaceae and an aqueous extract of stigma of Crocus genus Saffron of the family Iridaceae. discloses an epidermal keratinocyte activator containing an extract of Camellia japonica leaves as an active ingredient.
  • the purpose of the present invention is to provide a new material that promotes the production of collagen and/or hyaluronic acid and activates epidermal keratinocytes.
  • the present inventor has newly discovered that a given lactic acid bacterium and/or a given lactic acid bacterium-derived component has an effect of promoting the production of collagen and hyaluronic acid and an effect of activating epidermal keratinocytes.
  • the present invention has been completed through further studies based on these findings.
  • Section 1 A collagen production promoter comprising a lactic acid bacterium belonging to the genus Fructobacillus, a culture of the lactic acid bacterium, a culture supernatant of the lactic acid bacterium, and/or an extract of the lactic acid bacterium.
  • Section 2. Item 2. The collagen production promoter according to Item 1, wherein the lactic acid bacterium is Fructobacillus fructosus.
  • Item 3. Item 3.
  • the collagen production promoter according to Item 1 or 2 wherein the lactic acid bacterium is Fructobacillus fructosus NBRC3516 strain.
  • Item 1 which contains nicotinamide adenine dinucleotide, may contain nicotinamide mononucleotide, and the content of said nicotinamide mononucleotide per 1 part by weight of said nicotinamide adenine dinucleotide is 5 parts by weight or less.
  • Collagen production promoter according to any one of 1 to 3.
  • Item 5. A hyaluronic acid production promoter comprising a lactic acid bacterium belonging to the genus Fructobacillus, a culture of the lactic acid bacterium, a culture supernatant of the lactic acid bacterium, and/or an extract of the lactic acid bacterium.
  • Item 6. Item 6.
  • Item 7. Item 7. The hyaluronic acid production promoter according to Item 5 or 6, wherein the lactic acid bacterium is Fructobacillus fructosus NBRC3516 strain.
  • Item 8. Item 5, which contains nicotinamide adenine dinucleotide, may contain nicotinamide mononucleotide, and the content of said nicotinamide mononucleotide per 1 part by weight of said nicotinamide adenine dinucleotide is 5 parts by weight or less. 8.
  • the hyaluronic acid production promoter according to any one of -7.
  • Item 9. An epidermal keratinocyte activator comprising a lactic acid bacterium belonging to the genus Fructobacillus, a culture of the lactic acid bacterium, a culture supernatant of the lactic acid bacterium, and/or an extract of the lactic acid bacterium.
  • Item 10. The epidermal keratinocyte activator according to Item 9, wherein the lactic acid bacterium is selected from the group consisting of Fructobacillus fructosus, Fructobacillus durionis, and Fructobacillus tropaeoil.
  • the lactic acid bacteria are Fructobacillus fructosus NBRC3516 strain, Fructobacillus durionis RD011727 strain, Fructobacillus tropaeoil RD012353 strain, and Fructobacillus tropaeoil RD012354 strain.
  • Item 11 The epidermal keratinocyte activator according to item 9 or 10, which is selected from the group consisting of: Item 12.
  • Item 9 which contains nicotinamide adenine dinucleotide, may contain nicotinamide mononucleotide, and the content of said nicotinamide mononucleotide per 1 part by weight of said nicotinamide adenine dinucleotide is 5 parts by weight or less.
  • the epidermal keratinocyte activator according to any one of -11.
  • Items 1 to 4. A food, drink, cosmetic or pharmaceutical comprising the collagen production promoter according to any one of Items 1 to 4.
  • Item 9. A food, drink, cosmetic or pharmaceutical comprising the hyaluronic acid production promoter according to any one of items 5 to 8.
  • a food, drink, cosmetic or pharmaceutical comprising the epidermal keratinocyte activator according to any one of Items 9 to 12.
  • Item 16. Containing a lactic acid bacterium belonging to the genus Fructobacillus, a culture of the lactic acid bacterium, a culture supernatant of the lactic acid bacterium, and / or an extract of the lactic acid bacterium, an agent for preventing or improving skin sagging and/or wrinkles, an agent for treating rough skin and/or wounds; a prophylactic or therapeutic agent for osteoporosis, arthritis and/or tenosynovitis; skin moisturizer, a therapeutic agent for corneal and conjunctival epithelial disorders, anterior chamber retention agent during ophthalmic surgery, Inhibitor of keratin hypertrophy, dull skin improver, an accelerator for skin regeneration, skin whitener, skin texture improving agent, or A remedy for acne and/or pimples.
  • Item 17 Use of a lactic acid bacterium belonging to the genus Fructobacillus, a culture of the lactic acid bacterium, a culture supernatant of the lactic acid bacterium, and/or an extract of the lactic acid bacterium for producing a collagen production promoter.
  • Item 18 Use of a lactic acid bacterium belonging to the genus Fructobacillus, a culture of the lactic acid bacterium, a culture supernatant of the lactic acid bacterium, and/or an extract of the lactic acid bacterium for producing a hyaluronic acid production promoter.
  • Item 19 Use of a lactic acid bacterium belonging to the genus Fructobacillus, a culture of the lactic acid bacterium, a culture supernatant of the lactic acid bacterium, and/or an extract of the lactic acid bacterium for producing a hyaluronic acid production promoter.
  • a lactic acid bacterium belonging to the genus Fructobacillus Use of a lactic acid bacterium belonging to the genus Fructobacillus, a culture of the lactic acid bacterium, a culture supernatant of the lactic acid bacterium, and/or an extract of the lactic acid bacterium for producing an epidermal keratinocyte activator.
  • Item 21 Use of a lactic acid bacterium belonging to the genus Fructobacillus, a culture of the lactic acid bacterium, a culture supernatant of the lactic acid bacterium, and/
  • said use is Prevention or improvement of skin sagging and/or wrinkles, treatment of rough skin and/or wounds; prevention or treatment of osteoporosis, arthritis and/or tenosynovitis; moisturizing the skin, treatment of corneal and conjunctival epithelial disorders, anterior chamber retention during ophthalmic surgery, Suppression of keratin hypertrophy, improvement of skin dullness, promotion of skin regeneration, skin whitening, improving skin texture, or Item 18.
  • An effective amount of a lactic acid bacterium belonging to the genus Fructobacillus, a culture of the lactic acid bacterium, a culture supernatant of the lactic acid bacterium, and/or an extract of the lactic acid bacterium is administered to a subject in need of promoting collagen production.
  • a method for promoting collagen production comprising: Item 23.
  • An effective amount of a lactic acid bacterium belonging to the genus Fructobacillus, a culture of the lactic acid bacterium, a culture supernatant of the lactic acid bacterium, and/or an extract of the lactic acid bacterium is administered to a subject in need of promoting hyaluronic acid production.
  • a method for promoting hyaluronic acid production comprising the step of Item 24.
  • An effective amount of a lactic acid bacterium belonging to the genus Fructobacillus, a culture of the lactic acid bacterium, a culture supernatant of the lactic acid bacterium, and/or an extract of the lactic acid bacterium is added to a subject in need of activation of epidermal keratinocytes.
  • a method for activating epidermal keratinocytes comprising the step of administering.
  • a novel material useful as an active ingredient of a collagen and/or hyaluronic acid production promoter and an epidermal keratinocyte activator is provided.
  • a lactic acid bacterium belonging to the genus Fructobacillus, a culture of the lactic acid bacterium, a culture supernatant of the lactic acid bacterium, and/or an extract of the lactic acid bacterium is a collagen production promoter, It is provided as an active ingredient of a hyaluronic acid production promoter and an activator of epidermal keratinocytes.
  • 1 shows the effects of test products (including sample A) on collagen production per cell (Test Example 1).
  • 1 shows the effects of test products (including sample A) on hyaluronic acid production per cell (Test Example 1).
  • the influence of the test article (including lactic acid bacteria extract A1) on collagen production per cell is shown (Test Example 2).
  • the influence of the test article (including lactic acid bacteria extract A1) on hyaluronic acid production per cell is shown (Test Example 2).
  • Fig. 3 shows the effects of test products (including sample B) on collagen production per cell (Test Example 3).
  • the influence of test articles (including sample B) on hyaluronic acid production per cell is shown (Test Example 3).
  • the influence of the test article (including lactic acid bacteria extract B1) on collagen production per cell is shown (Test Example 4).
  • the influence of test products (including lactic acid bacteria extract B1) on hyaluronic acid production per cell is shown (Test Example 4).
  • the collagen production promoter, hyaluronic acid production promoter and epidermal keratinocyte activator of the present invention are all lactic acid bacteria belonging to the genus Fructobacillus, cultures of the lactic acid bacteria, culture supernatants of the lactic acid bacteria, and/or containing the extract of the lactic acid bacteria as an active ingredient.
  • the collagen production promoter, hyaluronic acid production promoter, and epidermal keratinocyte activator are described in detail below.
  • Active ingredients of the collagen production promoter, hyaluronic acid production promoter, and epidermal keratinocyte activator of the present invention include lactic acid bacteria belonging to the genus Fructobacillus, cultures of the lactic acid bacteria, and culture supernatants of the lactic acid bacteria. and/or an extract of said lactic acid bacteria.
  • Lactic acid bacteria belonging to the genus Fructobacillus Lactic acid bacteria belonging to the genus Fructobacillus (hereinafter also referred to as "predetermined lactic acid bacteria") are microorganisms that produce nicotinamide mononucleotide (NMN) and/or nicotinamide adenine dinucleotide (NAD). .
  • the lactic acid bacterium belonging to the genus Fructobacillus is preferably a microorganism that produces at least NAD, more preferably a microorganism that produces both NMN and NAD.
  • lactic acid bacteria belonging to the genus Fructobacillus include Fructobacillus durionis, Fructobacillus tropaeoil, and Fructobacillus fructosus. Preferred are Fructobacillus tropae oil and Fructobacillus fructosus.
  • lactic acid bacteria belonging to the genus Fructobacillus include Fructobacillus durionis strain RD011727, Fructobacillus tropaeoil strain RD012353, Fructobacillus tropaeoil strain RD012354, Fructobacillus fru ctosus strain NBRC3516 and Fructobacillus durionis strain NBRC113239.
  • Fructobacillus durionis RD011727 strain was deposited at the National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary Center (NPMD) (Room 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan) on October 28, 2020 with the deposit number It has been internationally deposited as NITE BP-02764.
  • NPMD National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary Center
  • Fructobacillus tropaeoil RD012353 strain was deposited at the National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary Center (NPMD) (Room 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan) on October 28, 2020 with the deposit number It has been internationally deposited as NITE BP-02765.
  • NPMD National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary Center
  • Fructobacillus tropaeoil RD012354 strain was deposited at the National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary Center (NPMD) (Room 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan) on October 28, 2020 with the deposit number It has been internationally deposited as NITE BP-02766.
  • NPMD National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary Center
  • fructobacillus lactic acid bacteria may be used singly or in combination.
  • Fructobacillus fructosus more preferably Fructobacillus fructosus.
  • lactic acid bacteria of the genus Fructobacillus from the viewpoint of further effectively improving the activation effect of epidermal keratinocytes, Fructobacillus durionis, Fructobacillus tropae oil, and Fructobacillus fructosus, more preferably Fructobacillus tropaeoil and Fructobacillus fructosus, particularly preferably Fructobacillus tropaeoil Fructobacillus fructosus.
  • Fructobacillus lactic acid bacteria Fructobacillus durionis strain RD011727, Fructobacillus tropaeoil strain RD012353, and Fructobacillus tropaeoil strain RD01 are preferred from the viewpoint of more effectively improving the activation effect of epidermal keratinocytes.
  • Fructobacillus fructosus NBRC3516 strain more preferably Fructobacillus tropaeoil strain RD012353, Fructobacillus tropaeoil strain RD012354, and Fructobacillus fructosus NBRC 3516 strain, more preferably Fructobacillus tropaeoil strain RD012353 and Fructobacillus fructosus NBRC3516 strain, particularly preferably , Fructobacillus fructosus strain NBRC3516.
  • the form of the active ingredient is at least one of the predetermined lactic acid bacterium, the culture of the lactic acid bacterium, the culture supernatant of the lactic acid bacterium, and the extract of the lactic acid bacterium.
  • the active ingredient may be used in one of these forms alone, or may be used in combination of multiple forms.
  • Lactic acid bacteria When the active ingredient is in the form of a lactic acid bacterium, the active ingredient includes the cell components of the lactic acid bacterium and the products inherent or formerly inherent in the lactic acid bacterium. Lactic acid bacteria may be either viable or dead. In addition, in the case of dead bacteria, the cells may be crushed. In the case of disrupted bacteria, part of the bacterial cell components may be removed by means other than extraction. Furthermore, the lactic acid bacteria may be in the form of dried cell powder.
  • Lactic acid bacteria can be obtained by a production method that includes a step of culturing one or more of the above-mentioned predetermined lactic acid bacteria and a step of separating and recovering the cells.
  • Methods performed in the step of separating and recovering include solid-liquid separation and cell washing.
  • the manufacturing method can include other steps in addition to the steps described above. Other steps include a resting cell reaction step (which can be performed after the culturing step, preferably after the separating and recovering step), a drying step (which can be performed after the separating and recovering step or after the resting cell reaction). can be performed), a step of disrupting cells (which can be performed after a step of separating and recovering, a step of reacting resting cells, or a drying step), and the like.
  • Media that can be used in the culturing process include those used for expansion culture (pre-culture medium) and those used for production culture (main culture medium).
  • the main culture medium can be prepared based on the medium used as the pre-culture medium and further containing additives. Regarding the properties of the medium, it is preferably a liquid medium, but may be an agar medium.
  • the medium generally contains a nitrogen source, minerals, etc., in addition to the carbon source.
  • Carbon sources include carbohydrates and carbohydrate materials.
  • Carbohydrates include sugars (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides), polysaccharides, and sugar alcohols.
  • Carbohydrates include lactose, sucrose, glucose, starch, xylitol, dextrose and the like.
  • the carbohydrate material may be any organic composition containing carbohydrates, such as milk and its processed products (skimmed milk powder, whey, milk powder, condensed milk, etc.), soymilk and its processed products (soymilk hydrolyzate, etc.), Foods such as cereals, fruits and vegetables can be mentioned.
  • Milk includes that from any mammal such as cows, goats, sheep, buffaloes, camels, llamas, donkeys, yaks, horses, reindeer, and the like.
  • the sugar may be isolated or contained in sugar material.
  • fructose sucrose
  • sucrose may be in the form contained in fruits (sugar material).
  • One of these carbon sources may be used alone, or two or more of them may be used in combination. Among these carbon sources, glucose is preferred.
  • the concentration of the carbon source in the medium is not particularly limited, and may be appropriately set according to the type of medium and culture method. More preferably 1.5 to 2.5 w/w%.
  • any inorganic nitrogen source or organic nitrogen source can be used as the nitrogen source.
  • proteins such as yeast extract (brewer's yeast, etc.), meat extract, casein; protein hydrolysates such as peptone (protease peptone, etc.); peptides such as peptides; nitrogen salts and the like.
  • proteins such as yeast extract (brewer's yeast, etc.), meat extract, casein; protein hydrolysates such as peptone (protease peptone, etc.); peptides such as peptides; nitrogen salts and the like.
  • proteins such as yeast extract (brewer's yeast, etc.), meat extract, casein; protein hydrolysates such as peptone (protease peptone, etc.); peptides such as peptides; nitrogen salts and the like.
  • peptone protease peptone, etc.
  • peptides such as peptides
  • nitrogen salts and the like One of these nitrogen sources may be used alone, or two or more of them
  • the concentration of the nitrogen source in the medium is not particularly limited, and may be appropriately set according to the type of medium, culture method, etc.
  • concentration of the nitrogen source in the medium is not particularly limited, and may be appropriately set according to the type of medium, culture method, etc.
  • protein for example, 0.3 to 4 w/w%, preferably 0.5. ⁇ 3 w/w%, more preferably 1-2 w/w%; 0.5 to 1.5 w/w%; in the case of nitrogen-containing salts, for example 0.03 to 1.5 w/w%, preferably 0.05 to 1 w/w%, more preferably 0.1 to 0.5 w/w% is mentioned.
  • minerals include manganese (e.g., manganese salts such as manganese sulfate), zinc, iron, sodium (e.g., sodium salts such as sodium acetate), potassium (e.g., dipotassium hydrogen sulfate, dipotassium hydrogen phosphate, etc.). potassium salt), magnesium (e.g. magnesium salt such as magnesium sulfate), calcium, phosphorus (e.g. phosphate such as dipotassium hydrogen phosphate), sulfur (e.g. sulfuric acid such as manganese sulfate, potassium hydrogen sulfate, magnesium sulfate) salts), trace elements, and the like.
  • These minerals may be used individually by 1 type, and may be used in combination of multiple types. Among these minerals, manganese, sodium, magnesium and potassium are preferred.
  • the concentration of minerals in the medium is not particularly limited, and may be appropriately set according to the type of medium and culture method. .003 to 0.008 w/w%; for sodium salts, for example 0.05 to 1.5 w/w%, preferably 0.1 to 1 w/w%; for magnesium salts, for example 0.001-0.02 w/w%, preferably 0.005-0.015 w/w%; in the case of potassium salts, for example 0.05-1 w/w%, preferably 0.1-0.
  • phosphates for example 0.05 to 1 w/w%, preferably 0.1 to 0.5 w/w%; for sulfates, 0.001 to 0 0.04 w/w%, preferably 0.005-0.02 w/w%.
  • the medium contains vitamins (Vitamin B group, etc.), surfactants (nonionic surfactants (Tween, etc.), anionic surfactants (SDS, etc.), etc.), antibacterial agents (Triclosan, etc.). , antibiotics (monesin, etc.).
  • vitamins Volitamin B group, etc.
  • surfactants nonionic surfactants (Tween, etc.), anionic surfactants (SDS, etc.), etc.
  • antibacterial agents Triclosan, etc.
  • antibiotics monoesin, etc.
  • the concentration of other components in the medium is not particularly limited, and may be appropriately set according to the type of other components, the type of medium, the culture method, etc.
  • the concentration of the surfactant As, for example, 0.01 to 0.5 w/w%, preferably 0.05 to 0.3 w/w%.
  • the culture conditions are not particularly limited as long as they are conditions under which the fructobacillus lactic acid bacteria can grow.
  • the culture temperature may be the optimum temperature for the fructobacillus lactic acid bacteria to be cultured, for example, 26 to 40° C., preferably 27 to 38° C., more preferably 28 to 36° C., still more preferably 29 to 34° C. °C.
  • the culture time may be appropriately set according to the type of fructobacillus lactic acid bacteria to be actually cultured, for example, 4 to 48 hours, preferably 8 to 36 hours, more preferably 12 to 24 hours.
  • the above culture is performed as a production culture (main culture) for a certain period of time, and before that, a small amount (eg, 1/6 to 1/4 of the main culture medium in volume ratio)
  • An expansion culture (pre-culture) can be performed in the medium.
  • the culture conditions for the pre-culture may be appropriately set according to the type of fructobacillus lactic acid bacteria, and the above conditions can be adopted.
  • the culture obtained in the preculture can be inoculated into the main culture medium so that the OD660 is, for example, 0.01 to 0.04, preferably 0.01 to 0.03. can.
  • the culture solution can be solid-liquid separated by concentration dehydration, multi-disc dehydration, or the like, and the obtained cells can be washed.
  • the content ratio of nicotinamide mononucleotide in lactic acid bacteria can be increased.
  • any liquid can be used without particular limitation as long as the lactic acid bacteria belonging to the genus Fructobacillus can react with resting cells.
  • water, buffer solutions, organic solvents, and the like can be used.
  • the pH of the liquid used for resting cell reaction is, for example, 4.0 to 10.0, preferably 5.0 to 9.0, more preferably 5.5 to 7.5.
  • the buffer examples include acetate buffer, phosphate buffer, borate buffer, carbonate buffer, citrate buffer, Tris buffer, and HEPES buffer. etc.
  • buffers include KHC 8 H 4 O 4 --NaOH (pH 4.0), CH 3 COOH--CH 3 COONa (pH 4.0), MES-NaOH (pH 5.0), CH 3 COOH. -CH 3 COONa (pH 5.0), KH 2 PO 4 -K 2 HPO 4 (pH 6.0), MES-NaOH (pH 6.0), KH 2 PO 4 -K 2 HPO 4 (pH 7.0), PIPES- NaOH (pH 7.0), HEPES-NaOH (pH 8.0), H 3 BO 4 --NaOH (pH 8.0), CHES-NaOH (pH 9.0), H 3 BO 4 --NaOH (pH 9.0), H 2 CO 3 --NaHCO 3 (pH 10.0), CHES--NaOH (pH 10.0), etc., preferably CH 3 COOH--CH 3 COONa, KH 2 PO 4 --K 2 HPO 4 , H 3 BO 4 -- NaOH, more
  • organic solvent examples include aromatic compounds such as benzene and benzonitrile, ketones such as acetone, acetylacetone and methyl ethyl ketone, ethyl acetate, butyl acetate, ethyl butyrate, Fatty acid esters such as ethyl formate, ethers such as diethyl ether, dipropyl ether, dibutyl ether, tetrahydrofuran and 1,4-dioxane, halogenated hydrocarbons such as dichloromethane, chloroform and dichloroethane, 1,2-propanediol, 1,2-butanediol, 1,3-butanediol, 1,4-butanediol, 2,3-butanediol, 1,2-hexanediol, 1,6-hexanediol, 1,2-pentaned
  • aromatic compounds such as benzene and benzonit
  • the liquid used for the resting cell reaction is preferably water or a buffer solution.
  • the reaction temperature in the resting cell reaction is, for example, 21 to 37°C, preferably 24 to 28°C.
  • the reaction time is, for example, 0.1 to 24 hours, preferably 6 to 12 hours.
  • the resting cell reaction can be carried out by suspending lactic acid bacteria belonging to the genus Fructobacillus in the above liquid, and allowing the suspension to stand, stir or shake.
  • the pH of the culture solution containing lactic acid bacteria belonging to the genus Fructobacillus is 4.0 to 10.0, preferably 5.0 to 9.0, more preferably 5.0 to 9.0, without using the above liquid. may be adjusted in the range of 5.5 to 7.5.
  • the bacteria can be dried using a drying method such as freeze-drying, shelf-drying, or spray-drying.
  • the dry bacterial cells can be crushed by any method.
  • the crushed bacterial cells may be partially removed by a method other than extraction.
  • the active ingredient When the active ingredient is in the form of a lactic acid bacterium culture, the active ingredient contains medium components containing the lactic acid bacterium product together with the lactic acid bacterium.
  • the culture of lactic acid bacteria may be a culture produced using one of the above-mentioned predetermined lactic acid bacteria alone, or a culture produced using a combination of a plurality of types. It may be a mixture of a culture produced using one species alone and a culture produced using another species alone.
  • a part of the medium components used for culturing the lactic acid bacteria may be removed from the medium components contained in the culture.
  • the lactic acid bacteria contained in the culture may be either viable or dead. In the case of dead bacteria, the cells may be crushed. Moreover, when the cells are crushed, part of the components of the cells may be removed.
  • a culture of lactic acid bacteria can be obtained by a production method including a step of culturing one or more of the predetermined lactic acid bacteria described above.
  • the manufacturing method can include other steps in addition to the steps described above. Other steps may include removing part of the medium components, subjecting the lactic acid bacteria to resting cell reactions, and/or drying. The details of each step are as described above in “1-2-1. Lactic acid bacteria”.
  • the culture supernatant of lactic acid bacteria may be a culture supernatant produced by using one of the above-mentioned predetermined lactic acid bacteria alone, or a culture supernatant produced by using a combination of multiple kinds. It may be a mixture of a culture supernatant produced by using one kind alone and a culture supernatant produced by using another kind alone.
  • a part of the medium components used for culturing the lactic acid bacteria may be removed from the medium components contained in the culture supernatant.
  • the culture supernatant of lactic acid bacteria can be obtained by a production method that includes a step of culturing one or more of the predetermined lactic acid bacteria and a step of separating and recovering the culture supernatant.
  • the manufacturing method can include other steps in addition to the steps described above. Other steps may include removing part of the medium components, subjecting the lactic acid bacteria to resting cell reactions, and/or drying. The details of each step are as described above in “1-2-1. Lactic acid bacteria”.
  • the active ingredient is in the form of a lactic acid bacterium extract
  • the active ingredient is a multicomponent composition obtained by subjecting the lactic acid bacterium or culture of the lactic acid bacterium to an extraction treatment.
  • Extraction solvents used for preparing the extract include, for example, water; monohydric lower alcohols having 1 to 4 carbon atoms such as ethanol and isopropanol; polyhydric alcohols such as 1,3-butylene glycol, propylene glycol and glycerin; A polar solvent such as a mixed solution thereof may be mentioned, and from the viewpoint of further effectively improving the collagen production promoting effect, the hyaluronic acid production promoting effect, and/or the activation effect of epidermal keratinocytes, water is preferable.
  • the extract of lactic acid bacteria is a water extract of lactic acid bacteria.
  • the temperature condition during extraction is preferably room temperature (eg, 5 to 35°C, preferably 20 to 30°C).
  • a specific method for preparing the extract for example, a suspension containing the above lactic acid bacteria, a culture of lactic acid bacteria, or a pulverized product thereof in an extraction solvent is prepared, and the suspension is subjected to solid-liquid separation. A method of obtaining a liquid (extract liquid), or a method of obtaining a powder (extract powder) by drying the extract as necessary.
  • the lactic acid bacteria belonging to the genus Fructobacillus, the culture of the lactic acid bacteria, the culture supernatant of the lactic acid bacteria, and the extract of the lactic acid bacteria, which are the active ingredients used in the present invention, are all NMN produced by the lactic acid bacteria and / or NAD), but also other metabolites (other than NMN and NAD) produced by the lactic acid bacterium, and/or bacterial cell components. It is considered that the excellent effect of promoting collagen production, the effect of promoting hyaluronic acid production, and the effect of activating epidermal keratinocytes are achieved by the combination of these components.
  • the ratio with NMN is not particularly limited, and the ratio of NMN per 1 part by weight of NAD is, for example, 5 parts by weight or less.
  • the ratio of NMN per part by weight of NAD is preferably 3 parts by weight or less, more Preferably 2.3 parts by weight or less, more preferably 1.7 parts by weight or less, still more preferably 1 part by weight or less, still more preferably 0.5 parts by weight or less, particularly preferably 0.1 parts by weight or less, most preferably is 0.07 parts by weight or less.
  • the ratio of NMN to 1 part by weight of NAD is preferably 0.06 parts by weight or less when the lactic acid bacterium is Fructobacillus fructosus, and preferably 0.06 parts by weight when the lactic acid bacterium is Fructobacillus durionis. parts or less, more preferably 0.05 parts by weight or less, and when the lactic acid bacterium is Fructobacillus tropaeoil, preferably 0.06 parts by weight or less, more preferably 0.05 parts by weight or less, still more preferably 0.04 parts by weight part or less, more preferably 0.03 part by weight or less.
  • the ratio of NMN per mole of NAD is, for example, 10 moles or less. From the viewpoint of more effectively improving the effect of promoting collagen production, the effect of promoting hyaluronic acid production, and/or the effect of activating epidermal keratinocytes, the ratio of NMN per mole of NAD is preferably 6 mol or less, more preferably 4.6 mol or less, more preferably 3.4 mol or less, still more preferably 2 mol or less, even more preferably 1 mol or less, particularly preferably 0.2 mol or less, most preferably 0.14 mol or less. .
  • the ratio of NMN per mol of NAD is preferably 0.12 mol or less when the lactic acid bacterium is Fructobacillus fructosus, and preferably 0.12 mol when the lactic acid bacterium is Fructobacillus durionis. Below, it is more preferably 0.1 mol or less, and when the lactic acid bacterium is Fructobacillus tropaeoil, it is preferably 0.12 mol or less, more preferably 0.1 mol or less, even more preferably 0.08 mol or less, and still more preferably 0.08 mol or less. is 0.06 mol or less.
  • the ratio with NMN is not particularly limited. Part or more.
  • the ratio of NMN per 1 part by weight of NAD is preferably 0.02 parts by weight or more, more preferably 0.03 parts by weight or more, and still more preferably 0.04 parts by weight when the lactic acid bacterium is Fructobacillus fructosus. parts or more, more preferably 0.045 parts by weight or more, still more preferably 0.05 parts by weight or more, and when the lactic acid bacterium is Fructobacillus durionis, preferably 0.02 parts by weight or more, more preferably 0.03 parts by weight or more. 0.04 parts by weight or more, preferably 0.04 parts by weight or more.
  • the lactic acid bacterium is Fructobacillus tropaeoil, it is preferably 0.015 parts by weight or more, more preferably 0.018 parts by weight or more, and still more preferably 0.02 parts by weight. parts by weight or more, or 0.023 parts by weight or more.
  • the ratio of NMN to 1 mol of NAD is, for example, 0.01 mol or more, preferably 0.02 mol or more.
  • the ratio of NMN per 1 mol of NAD is preferably 0.04 mol or more, more preferably 0.06 mol or more, still more preferably 0.08 mol or more.
  • the amount of the active ingredient contained in each of the collagen production promoter, the hyaluronic acid production promoter, and the epidermal keratinocyte activator of the present invention is not particularly limited. Alternatively, it can be appropriately determined according to the activation effect of epidermal keratinocytes.
  • the content of the active ingredient contained in each of the collagen production promoter, hyaluronic acid production promoter, and epidermal keratinocyte activator of the present invention include, for example, the dry weight equivalent amount of fructobacillus lactic acid bacteria (that is, , When the active ingredient is lactic acid bacteria or a culture of lactic acid bacteria, it refers to the dry weight of the active ingredient, and when the active ingredient is the culture supernatant of lactic acid bacteria, the dry weight of the lactic acid bacteria used to obtain the culture supernatant. When the active ingredient is an extract, it refers to the dry weight of the lactic acid bacteria used to obtain the extract.), 0.00001 to 10% by weight, preferably 0.00001 to 1% by weight.
  • Another specific example of the content of active ingredients contained in each of the collagen production promoter, hyaluronic acid production promoter, and epidermal keratinocyte activator of the present invention is the total amount of NMN and NDA, for example, 0.05 ⁇ M or more. or 0.1 ⁇ M or more, preferably 0.15 ⁇ M or more, more preferably 0.4 ⁇ M or more, still more preferably 0.75 ⁇ M or more or 0.9 ⁇ M or more, still more preferably 1.5 ⁇ M or more or 1.7 ⁇ M or more, still more preferably is 3 ⁇ M or more or 3.5 ⁇ M or more.
  • the total amount of NMN and NDA contained in each of the collagen production promoter, hyaluronic acid production promoter, and epidermal keratinocyte activator of the present invention is not particularly limited in its upper limit, but is, for example, 10 ⁇ M or less, 8 ⁇ M or less. , 6 ⁇ M or less, 4 ⁇ M or less, or 2 ⁇ M or less.
  • the collagen production promoter, hyaluronic acid production promoter, and epidermal keratinocyte activator of the present invention may or may not contain other pharmacological components, if necessary, in addition to the above active ingredients. It doesn't have to be.
  • pharmacological components include anti-inflammatory agents, antioxidants, bactericidal agents, cooling agents, vitamins, mucopolysaccharides and the like.
  • the collagen production promoter, hyaluronic acid production promoter, and epidermal keratinocyte activator of the present invention contain bases and/or additives as necessary in order to obtain a desired formulation form. may or may not be included. Such bases and/or additives are not particularly limited as long as they are pharmaceutically acceptable.
  • Aqueous base Naturally derived oil (vegetable oil, animal oil, processed oil thereof), mineral oil, ester oil, fatty acid alkyl ester, fatty acid, fatty acid ester, oil base such as higher alcohol; Surfactant; Polyhydric alcohol (glycerin , propylene glycol, dipropylene glycol, 1,3-butylene glycol, etc.); cooling agents, preservatives, flavoring agents, coloring agents, thickeners, pH adjusters, humectants, stabilizers, antioxidants, Additives such as ultraviolet absorbers, chelating agents, adhesives, buffers, solubilizers, solubilizers, and preservatives are included.
  • the formulation form of the collagen production promoter, hyaluronic acid production promoter, and epidermal keratinocyte activator of the present invention is not particularly limited, and is liquid or semisolid (cream, gel, ointment, paste). , solid form (granules, fine granules, powders, tablets, capsules) and the like.
  • the collagen production promoter, hyaluronic acid production promoter, and epidermal keratinocyte activator of the present invention may be non-emulsified preparations such as aqueous preparations and oil-based preparations. Emulsified formulations such as aqueous emulsion formulations may also be used.
  • product categories of the collagen production promoter, hyaluronic acid production promoter, and epidermal keratinocyte activator of the present invention include foods and drinks, cosmetics, and pharmaceuticals.
  • Food and drink are not particularly limited, but for example, fermented milk (drink yogurt, etc.), lactic acid bacteria drinks, milk drinks (coffee milk, fruit milk, etc.), tea drinks (green tea, black tea, oolong tea, etc.), fruit and vegetable drinks (beverages containing fruit juices such as oranges, apples, grapes, etc., vegetable juices such as tomatoes, carrots, etc.), alcoholic beverages (beer, low-malt beer, wine, etc.), carbonated beverages, soft drinks, water-based beverages; and Examples include foods such as fermented milk (set type yogurt, soft yogurt, etc.), confectionery, instant foods, and processed foods such as seasonings.
  • Food and beverages also include functional foods.
  • Functional foods refer to foods that have a certain level of functionality for living organisms.
  • Foods with sex indications foods for special uses, nutritional supplements, health supplements, supplements (for example, tablets, coated tablets, sugar-coated tablets, capsules, liquid preparations, etc.), beauty foods (for example, diet foods), etc.
  • the functional food may be food for special uses such as food for sick people, powdered milk for pregnant and breastfeeding women, powdered milk for infants, food for the elderly, food for nursing care, and the like.
  • Cosmetics include topical preparations for skin and mucous membranes, more specifically, basic cosmetics such as lotion, milky lotion, cream, essence, gel, pack, sheet mask, and lip balm; Skin cleansing agents such as cosmetics, make-up removers (including cleansing agents), exfoliants, and body shampoos; body care cosmetics; make-up cosmetics such as foundation, face powder, lipstick, blush, eye shadow, eyeliner, mascara, and eyebrows; nail cosmetics such as manicures and nail removers; hair styling agents, shampoos, conditioners, and rinses , hair cosmetics such as hair restorers; oral cosmetics such as liquid toothpaste, toothpaste, mouthwash and mouthspray.
  • basic cosmetics such as lotion, milky lotion, cream, essence, gel, pack, sheet mask, and lip balm
  • Skin cleansing agents such as cosmetics, make-up removers (including cleansing agents), exfoliants, and body shampoos
  • body care cosmetics make-up cosmetics such as foundation, face powder, lipstick, blush, eye shadow, eyeliner, mascara, and eyebrow
  • Pharmaceuticals include oral agents and external agents (including quasi-drugs), including external agents for skin and external agents for mucous membranes.
  • Dosage forms for oral preparations include tablets, coated tablets, sugar-coated tablets, capsules, and liquid preparations. preparations, ointments, creams, gels, patches and the like.
  • the collagen production promoter, hyaluronic acid production promoter, and epidermal keratinocyte activator of the present invention are used for applications aimed at promoting collagen production, hyaluronic acid production, and epidermal keratinocyte activating effects, respectively. .
  • Applications for the purpose of promoting collagen production include applications that utilize the action of connecting cells, the action of maintaining the strength of blood vessels and/or muscles, and/or the action of forming skin, bones, and/or mucous membranes. More specifically, the conditions or symptoms of tissues (skin, bones, mucous membranes, etc.) that require improvement of these actions are used for prevention, improvement or treatment, prevention of sagging skin and / or wrinkles or amelioration; treatment of rough skin and/or wounds; prevention or treatment of osteoporosis, arthritis and/or tenosynovitis, and the like.
  • fructobacillus lactic acid bacteria, the culture of the lactic acid bacteria, the culture supernatant of the lactic acid bacteria, and/or the extract of the lactic acid bacteria are agents for preventing and improving skin sagging and/or wrinkles; rough skin and/or It can also be used as an active ingredient of a therapeutic agent for wounds; a prophylactic or therapeutic agent for osteoporosis, arthritis and/or tenosynovitis.
  • Uses for the purpose of promoting hyaluronic acid production include uses that utilize intercellular water retention, lubrication and buffering in vivo, and more specifically, tissue that requires improvement of these actions.
  • Moisturizing the skin which is the prevention, amelioration or treatment of a condition or symptom in (such as the skin, joints or ocular tissues); Prevention or amelioration of sagging skin; Prevention or treatment of arthritis; Treatment of corneal and conjunctival epithelial disorders; Anterior chamber retention during surgery (for example, cataract, corneal transplant, etc.) can be mentioned.
  • the fructobacillus lactic acid bacteria, the lactic acid bacterium culture, the lactic acid bacterium culture supernatant, and/or the lactic acid bacterium extract are used as skin moisturizing agents; agents for preventing or improving skin sagging; and preventing or treating arthritis.
  • Applications aimed at activating epidermal keratinocytes include applications utilizing proliferation of epidermal keratinocytes, that is, applications utilizing skin turnover promotion. prevention, amelioration, or treatment of skin symptoms caused by delayed turnover of keratinocytes, suppression of keratin hyperplasia; improvement of skin dullness caused by decreased activity of keratinocytes; promotion of skin regeneration; wound treatment skin roughness treatment; skin moisturizing; skin whitening; skin texture improvement; acne and/or pimples treatment; Therefore, the fructobacillus lactic acid bacteria, the culture of the lactic acid bacteria, the culture supernatant of the lactic acid bacteria, and/or the extract of the lactic acid bacteria are inhibitors of keratin hyperplasia; skin roughness remedy; skin moisturizing agent; skin whitening agent; skin texture improving agent; acne and/or pimples remedy agent.
  • the amount of the active ingredient is, for example, 0.01 to 200 mg/kg/day, preferably 0.1 It can be used internally in an amount of ⁇ 20 mg/kg/day, 1 to 5 times daily.
  • the amount of the active ingredient is, for example, 0.0001 to 0.2 mg/cm per application. 2 , preferably 0.001-0.02 mg/cm 2 , 1-5 times a day.
  • sample preparation (1) Culture of fructobacillus lactic acid bacteria (preparation of sample A) Fructobacillus fructosus NBRC3516 strain was inoculated into 30 ml of MRS medium (preculture medium) manufactured by Difco, and expanded culture was performed at 30° C. for 24 hours while stationary. The resulting culture solution was inoculated into 1 L of MRS medium (main culture medium) so that OD660 was 0.02, and cultured with stirring at pH 6.0 to 7.0 at 30° C. for 12 hours. The resulting culture solution was subjected to centrifugation to recover the cells. The recovered cells were washed with 1 L of 0.85 w/w % KCl aqueous solution. The washed cells were subjected to centrifugation again to recover the cells. After the collected cells were sterilized, they were freeze-dried to obtain lactic acid bacteria powder (Sample A).
  • NMN nicotinamide mononucleotide
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • lactic acid bacteria extract A1 Preparation of sample A extract 20 g of lactic acid bacteria powder (sample A) was finely ground in a mortar and suspended in 1 L of sterilized water to prepare a suspension. The suspension was stirred at room temperature (about 25° C.) for 1 hour, centrifuged (12,000 rpm ⁇ 10 min), and the supernatant was filtered through a 0.2 ⁇ m filter to obtain lactic acid bacteria extract A1.
  • NMN nicotinamide mononucleotide
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • Fructobacillus fructosus NBRC3516 strain was inoculated into 30 ml of MRS medium (preculture medium) manufactured by Difco, and expanded culture was performed at 30° C. for 24 hours while stationary.
  • the resulting culture solution was inoculated into 1 L of MRS medium (main culture medium) so that OD660 was 0.02, and cultured with stirring at pH 6.0 to 7.0 at 30° C. for 12 hours.
  • the resulting culture solution was subjected to centrifugation to recover the cells.
  • the recovered cells were washed with 1 L of 0.85 w/w % KCl aqueous solution.
  • the washed cells were subjected to centrifugation again to recover the cells.
  • the collected cells were suspended in 200 ml of deionized water and stirred at pH 6.0 to 7.0 at 25° C. for 8 hours to carry out resting cell reaction. After completion of resting cell reaction, cells were collected by centrifugation. The recovered cells were washed with 1 L of 0.85 w/w % KCl aqueous solution. The washed cells were subjected to centrifugation again to recover the cells. After the collected cells were sterilized, they were freeze-dried to obtain lactic acid bacteria powder (Sample B) that had undergone resting cell reaction.
  • NMN nicotinamide mononucleotide
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • lactic acid bacteria extract B1 Preparation of sample B extract 20 g of lactic acid bacteria powder (sample B) was suspended in 1 L of sterilized water to prepare a suspension. The suspension was stirred at room temperature (about 25° C.) for 1 hour, centrifuged (12,000 rpm ⁇ 10 min), and the supernatant was filtered through a 0.2 ⁇ m filter to obtain lactic acid bacteria extract B1.
  • NMN nicotinamide mononucleotide
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • lactic acid bacterium extracts (lactic acid bacterium extract C1, lactic acid bacterium extract D1, lactic acid bacterium extract E1) of other fructobacillus lactic acid bacteria
  • lactic acid bacteria Fructobacillus durionis RD011727 strain, Fructobacillus tropaeoil RD012353 strain, or Fructobacillus tropaeo il strain RD012354
  • a powder of each lactic acid bacterium was prepared in the same manner as in "(1) Preparation of powder of lactic acid bacteria of the genus Fructobacillus (Sample A)" except that the was used.
  • an extract was prepared in the same manner as in “(2) Preparation of lactic acid bacterium extract A1 (preparation of sample A extract)”. Specifically, the extract (lactic acid bacterium extract C1) is prepared from the powder of Fructobacillus durionis RD011727 strain, the extract (lactic acid bacterium extract D1) is prepared from the powder of Fructobacillus tropaeoil RD012353 strain, and Fructobacillus tropaeoil RD0123 is prepared. 54 strains of An extract thereof (lactic acid bacteria extract E1) was prepared from the powder.
  • NMN nicotinamide mononucleotide
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • the weight ratio of NMN to 1 part by weight of NAD in the lactic acid bacteria extract C1 was 0.0421 parts by weight.
  • the weight ratio of NMN to 1 part by weight of NAD in the lactic acid bacteria extract D1 was 0.0202 parts by weight.
  • the weight ratio of NMN to 1 part by weight of NAD in the lactic acid bacteria extract E1 was 0.0250 parts by weight.
  • MRS medium composition 2 w/w% glucose 1 w/w% protease peptone 1 w/w% beef extract 0.5 w/w% yeast extract 0.2 w/w% ammonium citrate 0.1 w/w% Tween80 0.5 w/w% sodium acetate 0.01 w/w% magnesium sulfate 0.005 w/w% manganese sulfate 0.2 w/w% dipotassium hydrogen phosphate
  • Collagen has the action of connecting cells, maintaining the strength of blood vessels and muscles, and forming the skin, bones and mucous membranes.
  • Hyaluronic acid has a water retention action between cells and a lubricating and buffering action in vivo.
  • dermal fibroblasts were used to verify the effect of lactic acid bacteria powder on the production of these components.
  • [4-1 Cell] Human neonatal-derived dermal fibroblast cell line NB1RGB cells (RIKEN BRC, Japan) were cultured using a CO 2 incubator (CO 2 concentration 5%, 37°C), and the resulting culture was used in this test example. .
  • EMEM Eagle's Minimal Essential Medium
  • Sample A was diluted with 0.5% FBS-containing EMEM to prepare three types of test articles with different concentrations (10 ⁇ g/mL, 25 ⁇ g/mL, and 500 ⁇ g/mL).
  • Table 1 shows the specific composition of the test product. In Table 1, the compositions of the test products are shown by the amount of NAD and the amount of NMN as final concentrations in the fibroblast culture medium. EMEM containing 0.5% FBS was used as a control.
  • NB1RGB cells were seeded in a 96-well plate at a density of 1.0 ⁇ 10 4 cells/well and cultured in a CO 2 incubator for 24 hours.
  • 200 ⁇ L of Phosphate buffer saline (PBS (-), Cat No. 198601, Nissui, Japan) was added to wells not used for the test to prevent drying during culture.
  • PBS (-) Phosphate buffer saline
  • the culture supernatant was dispensed into a new 96-well plate, and the amounts of collagen and hyaluronic acid in the culture supernatant were measured according to the ELISA method shown in 4-5-3 and 4-5-4 below. By doing so, the collagen and hyaluronic acid production-promoting action of the test product was evaluated. In addition, the number of viable cells in the 96-well plate from which the culture supernatant was removed was measured by the method shown in 4-5-2 below.
  • a direct ELISA method was used to evaluate the effect of the test product on the amount of type 1 collagen produced, which is said to give firmness and elasticity to the skin.
  • 100 ⁇ L collagen standard solution and culture supernatant dispensed according to “4-5-1 cell culture” were added per well to a high-adsorption 96-well plate, and allowed to stand overnight at 4°C.
  • PRL68700-50G, Proliant, USA in PBS was added and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • 3) After 1 hour, wash twice with 200 ⁇ L of wash buffer, add 100 ⁇ L of biotin-conjugated anti-collagen type I antibody (Cat No. 600-406-103, ROCKLAND, USA) solution, and leave at room temperature for 1 hour. placed.
  • 4) After 1 hour, the plate was washed four times with 200 ⁇ L of Wash buffer, 100 ⁇ L of Streptavidin-HRP (Cat No. CJ30H-1, Agilent Technologies, USA) solution was added, and left standing at room temperature for 30 minutes.
  • Streptavidin-HRP Cat No. CJ30H-1, Agilent Technologies, USA
  • Sandwich ELISA was used to evaluate the effect of test articles on the production of hyaluronic acid, which is said to trap water between collagen or elastin.
  • test Example 1 the same test as in Test Example 1 was conducted, except that the test item described in "4-3 Test Item" in Test Example 1 was changed to the following.
  • Table 2 shows the specific composition of the test product. In Table 2, the compositions of the test products are shown by the amount of NAD and the amount of NMN as final concentrations in the fibroblast culture medium. EMEM containing 0.5% FBS was used as a control.
  • FIG. 3 shows the average value and standard deviation of the collagen production rate (%) per cell of the test product when the collagen production rate per cell of the control is 100%.
  • FIG. 4 shows the average value and standard deviation of the hyaluronic acid production rate (%) per cell of the test product when the hyaluronic acid production rate per cell of the control is taken as 100%.
  • Example 3 Collagen and Hyaluronic Acid Production Promotion Effect of Lactic Acid Bacteria Powder (Sample B)
  • lactic acid bacteria powder sample B
  • the collagen production rate per cell number increased with a significant difference compared to the control, and compared to the control
  • the collagen production rate per cell number increased hyaluronic acid production rate increased with a significant difference. Therefore, it was suggested that the lactic acid bacteria powder (Sample B) enhanced fibroblast collagen production and hyaluronic acid production.
  • test Example 1 the same test as in Test Example 1 was conducted, except that the test item described in "4-3 Test Item" in Test Example 1 was changed to the following.
  • test product was prepared by diluting sample B to 50 ⁇ g/mL with EMEM containing 0.5% FBS.
  • Table 3 shows the specific composition of the test product. In Table 3, the compositions of the test products are shown by the amount of NAD and the amount of NMN as final concentrations in the fibroblast culture medium. EMEM containing 0.5% FBS was used as a control.
  • FIG. 5 shows the average value and standard deviation of the collagen production rate (%) per cell of the test product when the collagen production rate per cell of the control is 100%.
  • FIG. 6 shows the average value and standard deviation of the hyaluronic acid production rate (%) per cell of the test product when the hyaluronic acid production rate per cell of the control is taken as 100%.
  • test Example 1 the same test as in Test Example 1 was conducted, except that the test item described in "4-3 Test Item" in Test Example 1 was changed to the following.
  • the lactic acid bacteria extract B1 was diluted with the medium to prepare two test products with different concentrations (0.5% (v/v), 1% (v/v)).
  • Table 4 shows the specific composition of the test product. In Table 4, the compositions of the test products are shown by the amount of NAD and the amount of NMN as final concentrations in the fibroblast culture medium. Medium was used as a control.
  • Fig. 7 shows the average value and standard deviation of the collagen production rate (%) per cell of the test product when the collagen production rate per cell of the control is 100%.
  • FIG. 8 shows the average value and standard deviation of the hyaluronic acid production rate (%) per cell of the test product when the hyaluronic acid production rate per cell of the control is taken as 100%.
  • Epidermal turnover is involved in skin barrier function and water retention.
  • proliferation that is, activation
  • human epidermal keratinocytes were used to verify the effect of the lactic acid bacteria extract on cell activation.
  • lactic acid bacteria extract As a test product, human epidermal keratinocytes were cultured in a medium containing lactic acid bacteria extract, and the degree of cell proliferation, which represents cell activation, was measured by absorbance at 450 nm (OD450). Based on the obtained OD450, the cell activation effect of the lactic acid bacteria extract was evaluated.
  • a medium used in this test example was prepared by adding an additive (KGM-Gold Single Quots (Lonza)) to a KMG-Gold basal medium (Lonza) medium.
  • Test product A 1.0% (v/v) test product was prepared by diluting the lactic acid bacteria extract A1 with the medium. Medium was used as a control.
  • test configuration In calculating cell activation, 3 wells of a 96-well plate were used per treatment group. A test product group and a control group were prepared for testing. All operations related to the test, including test article preparation, were performed at room temperature unless otherwise specified.
  • [4-5 Test operation] [4-5-1 Cell culture] 1) PSVK1 cells were seeded in a 96-well plate at a density of 5.0 ⁇ 10 3 cells/well and cultured in a CO 2 incubator for 24 hours. In addition, 200 ⁇ L of PBS(-) was added to wells not used for the test in order to prevent drying during culture. 2) After 24 hours, the medium was removed, 100 ⁇ L of the test article and control were added to the 96-well plate, and cultured in a CO 2 incubator for 48 hours. 3) After 48 hours, the culture supernatant was removed, the number of cells in the 96-well plate was evaluated by the method shown in 4-5-2 below, and the human epidermal keratinocyte activating action of the test product was evaluated.
  • the human epidermal keratinocyte activation rate (%) was calculated by performing the same operations as in Test Example 5-1, except that the test product was changed to lactic acid bacteria extract C1. The results are shown in 5.
  • the human epidermal keratinocyte activation rate (%) was calculated by performing the same operations as in Test Example 5-1, except that the test product was changed to lactic acid bacteria extract D1. The results are shown in 5.
  • test Example 5-1 lactic acid bacteria extract E1
  • Test Example 5-1 the same operation as in Test Example 5-1 was performed to calculate the human epidermal keratinocyte activation rate (%). The results are shown in 5.

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Abstract

本発明は、コラーゲン及び／又はヒアルロン酸の産生を促進し、並びに／若しくは、ヒト表皮角化細胞を賦活する新たな素材を提供することを目的とする。フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清、及び／又は前記乳酸菌の抽出物は、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、及び表皮角化細胞賦活剤の有効成分として有用である。

Description

コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、及び表皮角化細胞賦活剤
　本発明は、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、及び表皮角化細胞賦活剤に関する。
　コラーゲンは、結合組織、皮膚、骨等の構成成分として生体に広く分布している。コラーゲンの産生促進は、皮膚の荒れ、たるみ、シワ、及び創傷等の改善、並びに、関節炎、及び腱鞘炎等の治療等に有効と考えられている。このため、コラーゲンの産生を促進する有効成分の探索がなされている。
　例えば、特許文献１には、アムラ（Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ ｅｍｂｌｉｃａ）の抽出物を含むコラーゲン産生促進剤が開示されており、特許文献２には、パッションフルーツの種子抽出物を有効成分とすることを特徴とするコラーゲン産生促進剤が開示されており、特許文献３には、ローマンカモミール（Ａｎｔｈｅｍｉｓ ｎｏｂｉｌｉｓ）を水蒸気蒸留して得られる精油からなることを特徴とするコラーゲン産生促進剤が開示されている。
　ヒアルロン酸は、皮膚、関節液、硝子体、靱帯の構成成分として生体に広く分布している。ヒアルロン酸の産生促進は、皮膚の保湿効果向上、皮膚のたるみ改善、関節炎の治療、角結膜上皮障害治療、及び白内障、角膜移植手術時における前房保持等に有効と考えられている。このため、ヒアルロン酸の産生を促進する有効成分の探索がなされている。
　例えば、特許文献４には、ダービリア科ダービリア属に属する海藻の抽出物を有効成分として含有するヒアルロン酸産生促進剤が開示されており、特許文献５には、卵殻膜を有効成分として含有するヒアルロン酸産生促進剤が開示されており、特許文献６には、家禽の脚部又はその処理物を含有するヒアルロン酸産生促進剤が開示されている。
　皮膚は、表皮と真皮からなる組織であり、外界からの物理的及び／又は化学的ストレスから身体を守るバリア機能を果たしている。皮膚組織のうち外側に存在する表皮は、基底層、有棘層、顆粒層、及び角層からなり、主に表皮角化細胞から構成されている。基底層で分裂した表皮角化細胞は、分化及び成熟を経て上層に移行し、外表面の角層まで達した後、脱落するターンオーバーを繰り返すことで、表皮を維持している。表皮のターンオーバーは、皮膚バリア機能及び水分量の保持等に関与している。したがって、老化及び／又は外部ストレスにより表皮角化細胞の増殖－角化－脱落のターンオーバーが滞ると、肌荒れ及び／又は乾燥肌等の原因となると考えられている。そのため、肌荒れ及び／又は乾燥肌の予防及び／又は治療に、表皮角化細胞賦活剤が用いられている。
　例えば、特許文献７には、スイカズラ科スイカズラ属スイカズラの花の水抽出物及びアヤメ科クロッカス属サフランの柱頭の水抽出物を含有する、表皮角化細胞増殖が記載されており、特許文献８には、ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）の葉の抽出物を有効成分として含有する表皮角化細胞賦活剤が開示されている。
特開２００８－１５６２８７号公報 特開２００９－１０２２９９号公報 特開２０１０－１８０１７９号公報 特開平９－１７６０３６号公報 特開２０１４－４０４０２号公報 国際公開第２０１６／１２９１７４号 特開２０１８－８３７９４号公報 特開２０１２－１０２０４９号公報
　本発明は、コラーゲン及び／又はヒアルロン酸の産生を促進、並びに表皮角化細胞を賦活する新たな素材を提供することを目的とする。
　本発明者は、所定の乳酸菌及び／又は所定の乳酸菌由来成分に、コラーゲン及びヒアルロン酸の産生を促進する作用、並びに表皮角化細胞を賦活する効果があることを新たに見出した。本発明は、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねることにより完成したものである。
　即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．　フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清、及び／又は前記乳酸菌の抽出物を含有する、コラーゲン産生促進剤。
項２．　前記乳酸菌がＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓである、項１に記載のコラーゲン産生促進剤。
項３．　前記乳酸菌がＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ　ＮＢＲＣ３５１６株である、項１又は２に記載のコラーゲン産生促進剤。
項４．　ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含み、ニコチンアミドモノヌクレオチドを含んでいてもよく、且つ、前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド１重量部当たりの前記ニコチンアミドモノヌクレオチドの含有量が５重量部以下である、項１～３のいずれかに記載のコラーゲン産生促進剤。
項５．　フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清、及び／又は前記乳酸菌の抽出物を含有する、ヒアルロン酸産生促進剤。
項６．　前記乳酸菌がＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓである、項５に記載のヒアルロン酸産生促進剤。
項７．　前記乳酸菌がＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ　ＮＢＲＣ３５１６株である、項５又は６に記載のヒアルロン酸産生促進剤。
項８．　ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含み、ニコチンアミドモノヌクレオチドを含んでいてもよく、且つ、前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド１重量部当たりの前記ニコチンアミドモノヌクレオチドの含有量が５重量部以下である、項５～７のいずれかに記載のヒアルロン酸産生促進剤。
項９．　フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清、及び／又は前記乳酸菌の抽出物を含有する、表皮角化細胞賦活剤。
項１０．　前記乳酸菌がＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌからなる群より選択される、項９に記載の表皮角化細胞賦活剤。
項１１．　前記乳酸菌がＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ　ＮＢＲＣ３５１６株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５４株からなる群より選択される、項９又は１０に記載の表皮角化細胞賦活剤。
項１２．　ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含み、ニコチンアミドモノヌクレオチドを含んでいてもよく、且つ、前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド１重量部当たりの前記ニコチンアミドモノヌクレオチドの含有量が５重量部以下である、項９～１１のいずれかに記載の表皮角化細胞賦活剤。
項１３．　項１～４のいずれかに記載のコラーゲン産生促進剤を含む、飲食品、化粧品又は医薬品。
項１４．　項５～８のいずれかに記載のヒアルロン酸産生促進剤を含む、飲食品、化粧品又は医薬品。
項１５．　項９～１２のいずれかに記載の表皮角化細胞賦活剤を含む、飲食品、化粧品又は医薬品。
項１６．　フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清、及び／又は前記乳酸菌の抽出物を含有する、
　　皮膚のたるみ及び／又はシワの予防又は改善剤、
　　皮膚の荒れ及び／又は創傷の治療剤、
　　骨粗しょう症、関節炎及び／又は腱鞘炎の予防又は治療剤、
　　皮膚の保湿剤、
　　角結膜上皮障害の治療剤、
　　眼科手術時の前房保持剤、
　　角質肥厚の抑制剤、
　　肌のくすみ改善剤、
　　皮膚の再生の促進剤、
　　肌の美白剤、
　　肌のキメ改善剤、若しくは、
　　ニキビ及び／又は吹き出物の改善剤。
項１７．　フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清、及び／又は前記乳酸菌の抽出物の、コラーゲン産生促進剤の製造のための使用。
項１８．　フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清、及び／又は前記乳酸菌の抽出物の、ヒアルロン酸産生促進剤の製造のための使用。
項１９．　フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清、及び／又は前記乳酸菌の抽出物の、表皮角化細胞賦活剤の製造のための使用。
項２０．　フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清、及び／又は前記乳酸菌の抽出物を含む組成物の、コラーゲン産生促進、ヒアルロン酸産生促進、又は表皮角化細胞賦活のための使用。
項２１．　前記使用が、
　　皮膚のたるみ及び／又はシワの予防又は改善、
　　皮膚の荒れ及び／又は創傷の治療、
　　骨粗しょう症、関節炎及び／又は腱鞘炎の予防又は治療、
　　皮膚の保湿、
　　角結膜上皮障害の治療、
　　眼科手術時の前房保持、
　　角質肥厚の抑制、
　　肌のくすみ改善、
　　皮膚の再生の促進、
　　肌の美白、
　　肌のキメ改善、若しくは、
　　ニキビ及び／又は吹き出物の改善
のための使用である、項１７に記載の使用。
項２２．　コラーゲン産生の促進を必要とする対象に、有効量の、フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清、及び／又は前記乳酸菌の抽出物を投与する工程を含む、コラーゲン産生促進方法。
項２３．　ヒアルロン酸産生の促進を必要とする対象に、有効量の、フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清、及び／又は前記乳酸菌の抽出物を投与する工程を含む、ヒアルロン酸産生促進方法。
項２４．　表皮角化細胞の賦活を必要とする対象に、有効量の、フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清、及び／又は前記乳酸菌の抽出物を投与する工程を含む、表皮角化細胞賦活方法。
　本発明によれば、コラーゲン及び／又はヒアルロン酸の産生促進剤、並びに表皮角化細胞の賦活剤の有効成分として有用な新規の素材が提供される。具体的には、本発明によれば、フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清、及び／又は前記乳酸菌の抽出物が、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤及び表皮角化細胞の賦活剤の有効成分として提供される。
細胞あたりのコラーゲン産生に対する被験品（サンプルＡを含む）の影響を示す（試験例１）。 細胞あたりのヒアルロン酸産生に対する被験品（サンプルＡを含む）の影響を示す（試験例１）。 細胞あたりのコラーゲン産生に対する被験品（乳酸菌抽出液Ａ１を含む）の影響を示す（試験例２）。 細胞あたりのヒアルロン酸産生に対する被験品（乳酸菌抽出液Ａ１を含む）の影響を示す（試験例２）。 細胞あたりのコラーゲン産生に対する被験品（サンプルＢを含む）の影響を示す（試験例３）。 細胞あたりのヒアルロン酸産生に対する被験品（サンプルＢを含む）の影響を示す（試験例３）。 細胞あたりのコラーゲン産生に対する被験品（乳酸菌抽出液Ｂ１を含む）の影響を示す（試験例４）。 細胞あたりのヒアルロン酸産生に対する被験品（乳酸菌抽出液Ｂ１を含む）の影響を示す（試験例４）。
　本発明のコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤及び表皮角化細胞の賦活剤は、いずれも、フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清、及び／又は前記乳酸菌の抽出物を、有効成分として含有することを特徴とする。以下、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、及び表皮角化細胞の賦活剤について詳述する。
［１．有効成分］
　本発明のコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、及び表皮角化細胞の賦活剤の有効成分は、フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清、及び／又は前記乳酸菌の抽出物である。
［１－１．フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌］
　フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌（以下において、「所定の乳酸菌」とも記載する。）は、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）及び／又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を産生する微生物である。また、フルクトバシラス属に属する乳酸菌は、好ましくは、少なくともＮＡＤを産生する微生物であり、より好ましくは、ＮＭＮ及びＮＡＤの両方を産生する微生物である。
　フルクトバシラス属に属する乳酸菌の具体的な例としては、フルコトバシラス・ドゥリオニス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ）、フルクトバシラス・トロパエオイル（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ）、及びフルクトバシラス・フルクトサス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ）が挙げられ、より好ましくは、フルクトバシラス・トロパエオイル（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ）、及びフルクトバシラス・フルクトサス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ）が挙げられる。
　フルクトバシラス属に属する乳酸菌の具体的な例としては、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５４株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ　ＮＢＲＣ３５１６株、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＮＢＲＣ１１３２３９株が挙げられる。
　Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株は、独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に、２０２０年１０月２８日付で寄託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２７６４として国際寄託されている。
　Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株は、独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に、２０２０年１０月２８日付で寄託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２７６５として国際寄託されている。
　Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５４株は、独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に、２０２０年１０月２８日付で寄託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２７６６として国際寄託されている。
　これらのフルクトバシラス属乳酸菌は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
　これらのフルクトバシラス属乳酸菌の中でも、コラーゲン産生促進効果及び／又はヒアルロン酸産生促進効果をより一層効果的に向上させる観点から、好ましくはフルクトバシラス・トロパエオイル（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ）、及びフルクトバシラス・フルクトサス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ）が挙げられ、より好ましくは、フルクトバシラス・フルクトサス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓである。
　これらのフルクトバシラス属乳酸菌の中でも、表皮角化細胞の賦活効果をより一層効果的に向上させる観点から、好ましくはフルコトバシラス・ドゥリオニス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ）、フルクトバシラス・トロパエオイル（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ）、及びフルクトバシラス・フルクトサス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ）が挙げられ、より好ましくは、フルクトバシラス・トロパエオイル（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ）、及びフルクトバシラス・フルクトサス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ）が挙げられ、特に好ましくは、フルクトバシラス・フルクトサス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ）が挙げられる。
　より具体的には、これらのフルクトバシラス属乳酸菌の中でも、表皮角化細胞の賦活効果をより一層効果的に向上させる観点から、好ましくはＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５４株、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓＮＢＲＣ３５１６株が挙げられ、より好ましくはＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５４株、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓＮＢＲＣ３５１６株が挙げられ、さらに好ましくは、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓＮＢＲＣ３５１６株が挙げられ、特に好ましくは、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓＮＢＲＣ３５１６株が挙げられる。
［１－２．有効成分の形態］
　有効成分の形態は、上記所定の乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清、及び前記乳酸菌の抽出物の、少なくともいずれかである。有効成分は、これらのいずれか１種の形態のものを単独で用いてもよいし、複数種の形態のものを組み合わせて用いてもよい。
［１－２－１．乳酸菌］
　有効成分が乳酸菌の形態である場合、当該有効成分は、当該乳酸菌の菌体成分及び当該乳酸菌に内在する又は内在していた産生物を含む。乳酸菌は、生菌及び死菌のいずれであってもよい。また、死菌の場合、菌体が破砕されていてもよい。また、破砕菌の場合、菌体成分の一部が抽出以外の手段で除去されていてもよい。さらに、乳酸菌は、乾燥された菌体粉末の形態であってもよい。
　乳酸菌は、上記の所定の乳酸菌の１種又は複数種を培養する工程、並びに菌体を分離回収する工程を含む製造方法により得ることができる。分離回収する工程で行われる方法は、固液分離及び菌体洗浄を含む。当該製造方法は、上記の工程以外に、他の工程を含むことができる。他の工程としては、休止菌体反応工程（培養する工程の後、好ましくは分離回収する工程の後に行うことができる。）、乾燥工程（分離回収する工程又は休止菌体反応の後に行うことができる。）、菌体破砕工程（分離回収する工程、休止菌体反応工程又は乾燥工程の後に行うことができる。）等が挙げられる。
　培養する工程で用いることができる培地としては、拡大培養に用いられるもの（前培養培地）、及び生産培養に用いられるもの（本培養培地）が挙げられる。本培養培地は、前培養培地として用いられる培地を基本として、更に添加物を含有させて調製することができる。培地の性状については、好ましくは液体培地であるが、寒天培地であってもよい。培地は、炭素源の他、一般的には窒素源、ミネラル等を含む。
　炭素源としては、糖質及び糖質材料が挙げられる。糖質としては、糖類（単糖、二糖、オリゴ糖）、多糖類、及び糖アルコールが挙げられる。糖質としては、乳糖、ショ糖、グルコース、デンプン、キシリトール、デキストロース等が挙げられる。糖質材料は、糖質を含む有機組成物であればよく、例えば、乳及びその加工品（脱脂粉乳、ホエイ、ミルクパウダー、練乳等）、豆乳及びその加工品（豆乳加水分解物等）、穀類、果実、野菜等の食品が挙げられる。乳としては、ウシ、ヤギ、ヒツジ、水牛、ラクダ、ラマ、ロバ、ヤク、ウマ、トナカイ等の任意の哺乳動物に由来するものが挙げられる。なお糖質は、単離されたものであってもよいし、糖質材料に含まれているものであってもよい。例えば、フルクトース（糖質）は、果実（糖質材料）に含まれる形態のものを用いてもよい。これらの炭素源は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。これらの炭素源の中でも、好ましくはグルコースが挙げられる。
　培地中の炭素源の濃度については特に限定されず、培地の種類や培養方式等に応じて適宜設定すればよいが、例えば０．５～４ｗ／ｗ％、好ましくは１～３ｗ／ｗ％、より好ましくは１．５～２．５ｗ／ｗ％が挙げられる。
　窒素源としては、任意の無機窒素源又は有機窒素源を使用することができる。例えば、酵母エキス（ビール酵母等）、肉エキス、カゼイン等のタンパク質；ペプトン（プロテアーゼペプトン等）等のタンパク質加水分解物、ペプチド等のペプチド類；アンモニウム塩（クエン酸アンモニウム等）、硝酸塩等の含窒素塩等が挙げられる。これらの窒素源は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
　培地中の窒素源の濃度については特に限定されず、培地の種類や培養方式等に応じて適宜設定すればよいが、タンパク質の場合、例えば０．３～４ｗ／ｗ％、好ましくは０．５～３ｗ／ｗ％、より好ましくは１～２ｗ／ｗ％が挙げられ；ペプチド類の場合、例えば０．１～２ｗ／ｗ％、好ましくは０．３～１．８ｗ／ｗ％、より好ましくは０．５～１．５ｗ／ｗ％が挙げられ；含窒素塩の場合、例えば０．０３～１．５ｗ／ｗ％、好ましくは０．０５～１ｗ／ｗ％、より好ましくは０．１～０．５ｗ／ｗ％が挙げられる。
　ミネラルとしては、例えば、マンガン（例えば、硫酸マンガン等のマンガン塩）、亜鉛、鉄、ナトリウム（例えば、酢酸ナトリウム等のナトリウム塩）、カリウム（例えば、硫酸水素二カリウム、リン酸水素二カリウム等のカリウム塩）、マグネシウム（例えば、硫酸マグネシウム等のマグネシウム塩）、カルシウム、リン（例えば、リン酸水素二カリウム等のリン酸塩）、硫黄（例えば、硫酸マンガン、硫酸水素カリウム、硫酸マグネシウム等の硫酸塩）、微量元素等が挙げられる。これらのミネラルは、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。これらのミネラルの中でも、好ましくは、マンガン、ナトリウム、マグネシウム、カリウムが挙げられる。
　培地中のミネラルの濃度については特に限定されず、培地の種類や培養方式等に応じて適宜設定すればよいが、マンガン塩の場合、例えば０．００１～０．０１ｗ／ｗ％、好ましくは０．００３～０．００８ｗ／ｗ％が挙げられ；ナトリウム塩の場合、例えば０．０５～１．５ｗ／ｗ％、好ましくは０．１～１ｗ／ｗ％が挙げられ；マグネシウム塩の場合、例えば０．００１～０．０２ｗ／ｗ％、好ましくは０．００５～０．０１５ｗ／ｗ％が挙げられ；カリウム塩の場合、例えば０．０５～１ｗ／ｗ％、好ましくは０．１～０．５ｗ／ｗ％が挙げられ；リン酸塩の場合、例えば０．０５～１ｗ／ｗ％、好ましくは０．１～０．５ｗ／ｗ％が挙げられ；硫酸塩の場合、０．００１～０．０４ｗ／ｗ％、好ましくは０．００５～０．０２ｗ／ｗ％が挙げられる。
　培地は、上記成分以外に、ビタミン（ビタミンＢ群など）、界面活性剤（非イオン性界面活剤（Ｔｗｅｅｎ等）、陰イオン性界面活性剤（ＳＤＳ等）等）、抗菌剤（トリクロサン等）、抗生物質（モネシン等）等の他の成分を含んでもよい。これらの他の成分は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。これらの他の成分の中でも、好ましくは界面活性剤、より好ましくは非イオン性界面活性剤が挙げられる。
　培地中の他の成分の濃度については特に限定されず、他の成分の種類、培地の種類、培養方式等に応じて適宜設定すればよいが、界面活性剤を含む場合、界面活性剤の濃度として、例えば０．０１～０．５ｗ／ｗ％、好ましくは０．０５～０．３ｗ／ｗ％が挙げられる。
　培養条件としては、フルクトバシラス属乳酸菌が生育できる条件下であれば特に限定されない。
　培養温度としては、培養対象となるフルクトバシラス属乳酸菌の至適温度であればよく、例えば２６～４０℃、好ましくは２７～３８℃、より好ましくは２８～３６℃、更に好ましくは２９～３４℃が挙げられる。培養時間としては、実際に培養するフルクトバシラス属乳酸菌の種類等に合せて適宜設定すればよく、例えば４～４８時間、好ましくは８～３６時間、より好ましくは１２～２４時間が挙げられる。
　培養中の操作については、培養中における培養液の攪拌の要否は問わない。また、具体的な培養手順の例については、上述の培養を一定時間生産培養（本培養）として行い、その前に、少量（例えば体積比で本培養培地の１／６～１／４）の培地で拡大培養を（前培養）行うことができる。前培養の培養条件は、フルクトバシラス属乳酸菌の種類などに合せて適宜設定すればよく、上述の条件を採用することができる。また、本培養においては、前培養で得られた培養物を、ＯＤ６６０が例えば０．０１～０．０４、好ましくは０．０１～０．０３となるように本培養培地に植菌することができる。
　分離回収工程においては、ろ紙を用いたろ過、遠心分離、デカンテーション、スクリュープレス、ローラープレス、ロータリードラムスクリーン、ベルトスクリーン、振動スクリーン、多重板振動フィルター、真空脱水、加圧脱水、ベルトプレス、遠心濃縮脱水、多重円板脱水等によって培養液の固液分離を行い、得られた菌体を洗浄することができる。
　休止菌体工程では、乳酸菌中のニコチンアミドモノヌクレオチド含有比率を増大させることができる。
　休止菌体反応工程で用いる液体としては、フルクトバシラス属に属する乳酸菌が休止菌体反応できるものであれば、特に制限なく用いることができる。例えば、水、緩衝液、有機溶剤等を用いることができる。
　休止菌体反応に用いる液体のｐＨとしては、例えば、４．０～１０．０、好ましくはｐＨ５．０～９．０、より好ましく５．５～７．５が挙げられる。
　休止菌体反応に用いる液体が緩衝液である場合、緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ衝液等が挙げられる。
　緩衝液のより具体的な例としては、ＫＨＣ8Ｈ4Ｏ4－ＮａＯＨ (ｐＨ４．０)、ＣＨ3ＣＯＯＨ－ＣＨ3ＣＯＯＮａ（ｐＨ４.０）、ＭＥＳ－ＮａＯＨ (ｐＨ５．０)、ＣＨ3ＣＯＯＨ－ＣＨ3ＣＯＯＮａ（ｐＨ５.０）、ＫＨ2ＰＯ4－Ｋ2ＨＰＯ４（ｐＨ６．０）、ＭＥＳ－ＮａＯＨ(ｐＨ６．０)、 ＫＨ2ＰＯ4－Ｋ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．０）、ＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ (ｐＨ７．０) 、ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ(ｐＨ８．０)、Ｈ3ＢＯ4－ＮａＯＨ（ｐＨ８.０）、ＣＨＥＳ－ＮａＯＨ(ｐＨ９．０)、Ｈ3ＢＯ4－ＮａＯＨ（ｐＨ９.０）、Ｈ2ＣＯ3－ＮａＨＣＯ3（ｐＨ１０.０）、ＣＨＥＳ－ＮａＯＨ(ｐＨ１０．０)等が挙げられ、好ましくはＣＨ3ＣＯＯＨ－ＣＨ3ＣＯＯＮａ、ＫＨ2ＰＯ4－Ｋ2ＨＰＯ4、Ｈ3ＢＯ4－ＮａＯＨ、より好ましくはＫＨ2ＰＯ4－Ｋ2ＨＰＯ4が挙げられる。
　休止菌体反応に用いる液体が有機溶剤である場合、有機溶剤としては、例えば、ベンゼン、ベンゾニトリル等の芳香族化合物、アセトン、アセチルアセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、酢酸エチル、酢酸ブチル、酪酸エチル、蟻酸エチル等の脂肪酸エステル類、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジブチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、１，２－プロパンジオール、１，２－ブタンジオール、１，３－ブタンジオール、１，４－ブタンジオール、２，３－ブタンジオール、１，２－ヘキサンジオール、１，６－ヘキサンジオール、１，２－ペンタンジオール、１，５－ペンタンジオール、２－メチル－２，４－ペンタンジオール、３－メチル－１，５－ペンタンジオール等のジオール類、炭素数１～７の直鎖又は分岐アルキルを有するアルコール、シクロヘキサノール、３－メトキシ－３－メチル－１－ブタノール、３－メトキシ－１－ブタノール等のアルコール類等が挙げられる。
　休止菌体反応に用いる液体としては、上記の液体の中でも、好ましくは水、緩衝液が挙げられる。
　休止菌体反応における反応温度としては、例えば２１～３７℃、好ましくは２４～２８℃が挙げられる。反応時間としては、例えば０．１～２４時間、好ましくは６～１２時間が挙げられる。
　休止菌体反応は、フルクトバシラス属に属する乳酸菌を上記の液体に懸濁し、静置、攪拌または振盪することで行うことができる。
　また、休止菌体反応は、上記の液体を用いることなく、フルクトバシラス属に属する乳酸菌を含む培養液のｐＨを４．０～１０．０、好ましくはｐＨ５．０～９．０、より好ましくは５．５～７．５の範囲に調整することにより行ってもよい。
　乾燥工程では、凍結乾燥、棚乾燥、スプレードライ等の工程の乾燥方法を用いて菌体を乾燥させることができる。
　菌体破砕工程では、乾燥菌体を、任意の方法で破砕することができる。菌体破砕工程では、破砕された菌体は、抽出以外の方法によって菌体成分の一部を除去してもよい。
［１－２－２．乳酸菌の培養物］
　有効成分が乳酸菌の培養物の形態である場合、当該有効成分は、乳酸菌とともに、当該乳酸菌の産生物を含む培地成分を含む。乳酸菌の培養物は、上記の所定の乳酸菌の１種を単独で用いて製造した培養物であってもよいし、複数種を組み合わせて用いて製造した培養物であってもよいし、ある１種を単独で用いて製造した培養物と他の１種を単独で用いて製造した培養物との混合物であってもよい。
　培養物に含まれる培地成分は、当該乳酸菌の培養に用いた培地成分の一部が除去されていてもよい。また、培養物に含まれる乳酸菌は、生菌及び死菌のいずれであってもよい。また、死菌の場合、菌体は破砕されていてもよい。また、菌体が破砕されている場合、菌体成分の一部が除去されていてもよい。
　乳酸菌の培養物は、上記の所定の乳酸菌の１種又は複数種を培養する工程を含む製造方法により得ることができる。当該製造方法は、上記の工程以外に、他の工程を含むことができる。他の工程としては、培地成分の一部を除去する工程、乳酸菌を休止菌体反応に供する工程、及び／又は、乾燥工程を含んでもよい。それぞれの工程の詳細は、上記「１－２－１．乳酸菌」で述べた通りである。
［１－２－３．乳酸菌の培養上清］
　有効成分が乳酸菌の培養上清の形態である場合、当該有効成分は、当該乳酸菌の産生物を含む培地成分を含む。乳酸菌の培養上清は、上記の所定の乳酸菌の１種を単独で用いて製造した培養上清であってもよいし、複数種を組み合わせて用いて製造した培養上清でもあってよいし、ある１種を単独で用いて製造した培養上清と他の１種を単独で用いて製造した培養上清との混合物であってもよい。
　培養上清に含まれる培地成分は、当該乳酸菌の培養に用いた培地成分の一部が除去されていてもよい。
　乳酸菌の培養上清は、上記の所定の乳酸菌の１種又は複数種を培養する工程、並びに培養上清を分離回収する工程を含む製造方法により得ることができる。当該製造方法は、上記の工程以外に、他の工程を含むことができる。他の工程としては、培地成分の一部を除去する工程、乳酸菌を休止菌体反応に供する工程、及び／又は、乾燥工程を含んでもよい。それぞれの工程の詳細は、上記「１－２－１．乳酸菌」で述べた通りである。
［１－２－４．乳酸菌の抽出物］
　有効成分が乳酸菌の抽出物の形態である場合、当該有効成分は、上記乳酸菌又は乳酸菌の培養物を抽出処理に供して得られる多成分系の組成物である。当該抽出物の調製に用いられる抽出溶媒としては、例えば、水；エタノール、イソプロパノール等の炭素数１～４の１価低級アルコール；１，３－ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール；これらの混合液等の極性溶媒が挙げられ、コラーゲン産生促進効果、ヒアルロン酸産生促進効果、及び／又は表皮角化細胞の賦活効果をより一層効果的に向上させる観点から、好ましくは水が挙げられる。つまり、好ましい形態において、乳酸菌の抽出物は、乳酸菌の水エキスである。また、抽出時の温度条件としては、室温（例えば、５～３５℃、好ましくは２０～３０℃）であることが好ましい。抽出物の具体的な調製方法としては、例えば、記乳酸菌又は乳酸菌の培養物若しくはそれらの粉砕物を抽出溶媒中に含む懸濁液を調製し、当該懸濁液を固液分離することで抽出液（エキス液）を得る方法、又は必要に応じて当該抽出液を乾燥させることで粉末（エキス末）を得る方法が挙げられる。
［１－３．有効成分に含まれる成分］
　本発明で用いられる有効成分であるフルクトバシラス属に属する乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清、及び前記乳酸菌の抽出物は、いずれも、当該乳酸菌が産生したＮＭＮ及び／又はＮＡＤ）だけでなく、当該乳酸菌が産生した（ＮＭＮ、ＮＡＤ以外の）他の代謝物、及び／又は菌体成分等も含む。本発明による優れたコラーゲン産生促進効果、ヒアルロン酸産生促進効果、及び表皮角化細胞の賦活効果は、これらの成分が相まって奏されると考えられる。
　本発明で用いられる有効成分が少なくともＮＡＤを含み、ＮＭＮを含んでよい場合、ＮＭＮとの比率としては特に限定されず、ＮＡＤ１重量部当たりのＮＭＮの比率として、例えば５重量部以下が挙げられる。コラーゲン産生促進効果、ヒアルロン酸産生促進効果、及び／又は表皮角化細胞の賦活効果をより一層効果的に向上させる観点から、ＮＡＤ１重量部当たりのＮＭＮの比率として、好ましくは３重量部以下、より好ましくは２．３重量部以下、さらに好ましくは１．７重量部以下、一層好ましくは１重量部以下、より一層好ましくは０．５重量部以下、特に好ましくは０．１重量部以下、最も好ましくは０．０７重量部以下が挙げられる。さらに好ましい形態において、ＮＡＤ１重量部当たりのＮＭＮの比率としては、乳酸菌がＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓである場合、好ましくは０．０６重量部以下が挙げられ、乳酸菌がＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓである場合、好ましくは０．０６重量部以下、より好ましくは０．０５重量部以下が挙げられ、乳酸菌がＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌである場合、好ましくは０．０６重量部以下、より好ましくは０．０５重量部以下、さらに好ましくは０．０４重量部以下、一層好ましくは０．０３重量部以下が挙げられる。
　また、ＮＡＤ１モル当たりのＮＭＮの比率としては、例えば１０モル以下が挙げられる。コラーゲン産生促進効果、ヒアルロン酸産生促進効果、及び／又は表皮角化細胞の賦活効果をより一層効果的に向上させる観点から、ＮＡＤ１モル当たりのＮＭＮの比率として、好ましくは６モル以下、より好ましくは４．６モル以下、さらに好ましくは３．４モル以下、一層好ましくは２モル以下、より一層好ましくは１モル以下、特に好ましくは０．２モル以下、最も好ましくは０．１４モル以下が挙げられる。さらに好ましい形態において、ＮＡＤ１モル当たりのＮＭＮの比率の比率としては、乳酸菌がＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓである場合、好ましくは０．１２モル以下が挙げられ、乳酸菌がＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓである場合、好ましくは０．１２モル以下、より好ましくは０．１モル以下が挙げられ、乳酸菌がＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌである場合、好ましくは０．１２モル以下、より好ましくは０．１モル以下、さらに好ましくは０．０８モル以下、一層好ましくは０．０６モル以下が挙げられる。
　本発明で用いられる有効成分がＮＭＮ及びＮＡＤを含む場合、ＮＭＮとの比率としては特に限定されず、ＮＡＤ１重量部当たりのＮＭＮの比率として、例えば０．００５重量部以上、好ましくは０．０１重量部以上が挙げられる。さらに好ましい形態において、ＮＡＤ１重量部当たりのＮＭＮの比率としては、乳酸菌がＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓである場合、好ましくは０．０２重量部以上、より好ましくは０．０３重量部以上、さらに好ましくは０．０４重量部以上、一層好ましくは０．０４５重量部以上、より一層好ましくは０．０５重量部以上が挙げられ、乳酸菌がＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓである場合、好ましくは０．０２重量部以上、より好ましくは０．０３重量部以上、さらに好ましくは０．０４重量部以上が挙げられ、乳酸菌がＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌである場合、好ましくは０．０１５重量部以上、より好ましくは０．０１８重量部以上、さらに好ましくは０．０２重量部以上又は０．０２３重量部以上が挙げられる。
　また、ＮＡＤ１モル当たりのＮＭＮの比率としては、例えば０．０１モル以上、好ましくは０．０２モル以上が挙げられる。さらに好ましい形態において、ＮＡＤ１モル当たりのＮＭＮの比率としては、乳酸菌がＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓである場合、好ましくは０．０４モル以上、より好ましくは０．０６モル以上、さらに好ましくは０．０８モル以上、一層好ましくは０．０９モル以上、より一層好ましくは０．１モル以上が挙げられ、乳酸菌がＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓである場合、好ましくは０．０４モル以上、より好ましくは０．０６モル以上、さらに好ましくは０．０８モル以上が挙げられ、乳酸菌がＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌである場合、好ましくは０．０３モル以上、より好ましくは０．０３５モル以上、さらに好ましくは０．０４モル以上又は０．０４６モル以上が挙げられる。
［１－４．有効成分の含有量］
　本発明のコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、及び表皮角化細胞賦活剤それぞれに含まれる有効成分の量としては特に限定されず、付与すべきコラーゲン産生促進効果、ヒアルロン酸産生促進効果、又は表皮角化細胞の賦活効果に応じて適宜決定することができる。
　本発明のコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、及び表皮角化細胞賦活剤それぞれに含まれる有効成分の含有量の具体例としては、例えば、フルクトバシラス属乳酸菌の乾燥重量換算量（つまり、有効成分が、乳酸菌、乳酸菌の培養物である場合は、有効成分の乾燥重量を指し、有効成分が乳酸菌の培養上清である場合は、培養上清の取得に用いた乳酸菌の乾燥重量を指し、有効成分が抽出物である場合は、抽出物の取得に用いた乳酸菌の乾燥重量を指す。）で、０．００００１～１０重量％、好ましくは０．００００１～１重量％が挙げられる。
　本発明のコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、及び表皮角化細胞賦活剤それぞれに含まれる有効成分の含有量の別の具体例としては、ＮＭＮ及びＮＤＡの総量で、例えば０．０５μＭ以上又は０．１μＭ以上、好ましくは０．１５μＭ以上、より好ましくは０．４μＭ以上、さらに好ましくは０．７５μＭ以上又は０．９μＭ以上、一層好ましくは１．５μＭ以上又は１．７μＭ以上、より一層好ましくは３μＭ以上又は３．５μＭ以上が挙げられる。本発明のコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、及び表皮角化細胞賦活剤それぞれに含まれるＮＭＮ及びＮＤＡの総量は、その上限において特に限定されるものではないが、例えば１０μＭ以下、８μＭ以下、６μＭ以下、４μＭ以下、又は２μＭ以下が挙げられる。
［２．他の成分］
　本発明のコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、及び表皮角化細胞賦活剤は、上記の有効成分以外に、必要に応じて、他の薬理成分を含有していてもよいし、含有していなくてもよい。このような薬理成分としては、例えば、抗炎症剤、抗酸化剤、殺菌剤、清涼化剤、ビタミン類、ムコ多糖類等が挙げられる。
　また、本発明のコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、及び表皮角化細胞賦活剤は、所望の製剤形態にするために、必要に応じて、基剤及び／又は添加剤が含まれていてもよいし、含有していなくてもよい。このような基剤及び／又は添加剤については、薬学的に許容されることを限度として特に制限されないが、例えば、水、炭素数１～４の１価低級アルコール（エタノール、イソプロパノール等）等の水性基剤；天然由来油（植物油、動物油、それらの加工油）、鉱物油、エステル油、脂肪酸アルキルエステル、脂肪酸、脂肪酸エステル、高級アルコール等の油性基剤；界面活性剤；多価アルコール（グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール等）；清涼化剤、防腐剤、着香剤、着色剤、粘稠剤、ｐＨ調整剤、湿潤剤、安定化剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、キレート剤、粘着剤、緩衝剤、溶解補助剤、可溶化剤、保存剤等の添加剤が挙げられる。
［３．製剤形態及び製品分類］
　本発明のコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、及び表皮角化細胞賦活剤の製剤形態については、特に制限されず、液状、半固形状（クリーム状、ゲル状、軟膏状、ペースト状）、固形状（顆粒剤、細粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤）等のいずれであってもよい。また、本発明のコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、及び表皮角化細胞賦活剤は、水性製剤、油性製剤等の非乳化製剤であってもよく、また水中油型乳化製剤、油中水型乳化製剤等の乳化製剤であってもよい。
　また、本発明のコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、及び表皮角化細胞賦活剤の製品分類としては、飲食品、化粧品、医薬品が挙げられる。
　飲食品としては特に限定されないが、例えば、発酵乳（ドリンクヨーグルト等）、乳酸菌飲料、乳飲料（コーヒー牛乳、フルーツ牛乳等）、茶系飲料（緑茶、紅茶及び烏龍茶等）、果物・野菜系飲料（オレンジ、りんご、ぶどう等の果汁、トマト、ニンジン等の野菜汁を含む飲料）、アルコール性飲料（ビール、発泡酒、ワイン等）、炭酸飲料、清涼飲料、水ベースの飲料等の飲料；及び発酵乳（セットタイプヨーグルト、ソフトヨーグルト等）、菓子、インスタント食品、調味料等の加工食品等の食品が挙げられる。
　また、飲食品としては、機能性食品も挙げられる。機能性食品は、生体に対して一定の機能性を有する食品を意味し、例えば、特定保健用食品（条件付きトクホ［特定保健用食品］を含む）及び栄養機能食品等の保健機能食品、機能性表示食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康補助食品、サプリメント（例えば、錠剤、被覆錠、糖衣錠、カプセル及び液剤等の各種剤形のもの）及び美容食品（例えばダイエット食品）等が挙げられる。更に、機能性食品は、病者用食品、妊産婦・授乳婦用粉乳、乳児用調製粉乳、高齢者用食品、介護用食品等の特別用途食品であってもよい。
　化粧品としては、皮膚外用剤及び粘膜外用剤を含む外用剤が挙げられ、より具体的には、化粧水、乳液、クリーム、エッセンス、ゲル、パック、シートマスク、リップクリーム等の基礎化粧料；洗顔料、メイク落とし（クレンジング剤を含む）、角質除去剤、ボディーシャンプーなどの皮膚洗浄料；サンスクリーン剤、ボディー用ジェル、ボディー用マッサージ剤、抑汗剤、防臭剤、除毛剤、入浴剤等のボディーケア化粧料；ファンデーション、おしろい、口紅、頬紅、アイシャドー、アイライナー、マスカラ、眉墨等のメークアップ化粧料；マネキュア、ネイルリムーバー等の爪用化粧料；ヘアスタイリング剤、シャンプー、コンディショナー、リンス、育毛剤等の毛髪化粧料；液体歯磨、練歯磨、洗口液、マウススプレー等の口腔用化粧料等が挙げられる。
　医薬品としては、経口剤、並びに、皮膚外用剤及び粘膜外用剤を含む外用剤（医薬部外品を含む）が挙げられる。経口剤の剤形としては、錠剤、被覆錠、糖衣錠、カプセル及び液剤等が挙げられ、外用剤の剤型としては、液剤（ローション剤、スプレー剤、エアゾール剤、及び乳液剤を含む）、フォーム剤、軟膏剤、クリーム剤、ジェル剤、貼付剤等が挙げられる。
　これらの製品分類の中でも、コラーゲン産生促進効果、ヒアルロン酸産生促進効果、及び表皮角化細胞の賦活効果をより一層高める観点から、好ましくは外用剤が挙げられ、より好ましくは皮膚外用剤が挙げられる。
［４．用途］
　本発明のコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、及び表皮角化細胞賦活剤は、それぞれ、コラーゲン産生促進、ヒアルロン酸産生促進、及び表皮角化細胞の賦活効果を目的とした用途に用いられる。
　コラーゲン産生促進を目的とした用途としては、細胞と細胞をつなぐ作用、血管及び／又は筋肉の強度を保つ作用、並びに／若しくは、皮膚、骨、及び／又は粘膜を形成する作用を利用する用途が挙げられ、より具体的には、これらの作用の向上を要する組織（皮膚、骨、粘膜等）の状態又は症状の、予防、改善又は治療用途である、皮膚のたるみ及び／又はシワの予防又は改善；皮膚の荒れ及び／又は創傷の治療；骨粗しょう症、関節炎及び／又は腱鞘炎等の予防又は治療等が挙げられる。従って、フルクトバシラス属乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清、及び／又は前記乳酸菌の抽出物は、皮膚のたるみ及び／又はシワの予防及び改善剤；皮膚の荒れ及び／又は創傷の治療剤；骨粗しょう症、関節炎及び／又は腱鞘炎等の予防又は治療剤の有効成分として用いることもできる。
　ヒアルロン酸産生促進を目的とした用途としては、細胞間の水分保持作用、並びに生体内での潤滑及び緩衝作用を利用する用途が挙げられ、より具体的には、これらの作用の向上を要する組織（皮膚、関節、又は眼組織等）における状態又は症状の、予防、改善又は治療である、皮膚の保湿；皮膚のたるみの予防又は改善；関節炎の予防又は治療；角結膜上皮障害の治療；眼科手術（例えば白内障、角膜移植手等）時の前房保持等が挙げられる。従って、フルクトバシラス属乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清、及び／又は前記乳酸菌の抽出物は、皮膚の保湿剤；皮膚のたるみの予防又は改善剤；関節炎の予防又は治療剤；角結膜上皮障害の治療剤；眼科手術（例えば白内障、角膜移植手等）時の前房保持剤の有効成分として用いることもできる。
　表皮角化細胞の賦活効果を目的とした用途としては、表皮角化細胞の増殖作用を利用する用途、つまり皮膚のターンオーバーの促進作用を利用する用途が挙げられ、より具体的には、表皮のターンオーバーの遅滞がもたらす皮膚症状の予防、改善又は治療である、角質肥厚の抑制；角化細胞の活性が低下することに起因する肌のくすみの改善；皮膚の再生の促進；創傷の治療；皮膚の荒れ治療；皮膚保湿；肌美白；肌のキメ改善；ニキビ及び／又は吹き出物の治療等が挙げられる。従って、フルクトバシラス属乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清、及び／又は前記乳酸菌の抽出物は、角質肥厚の抑制剤；肌のくすみ改善剤；皮膚の再生促進剤；創傷の治療剤；皮膚の荒れ治療剤；皮膚の保湿剤；肌の美白剤；肌のキメ改善剤；ニキビ及び／又は吹き出物治療剤の治療剤の有効成分として用いることもできる。
［５．用量］
　本発明のコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、及び表皮角化細胞賦活剤が内用される場合、有効成分量が、例えば、０．０１～２００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．１～２０ｍｇ／ｋｇ／日となる量で、１日に１～５回、内用することができる。
　本発明のコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、及び表皮角化細胞賦活剤が外用される場合、有効成分量が、例えば、１回当たりの塗布量で０．０００１～０．２ｍｇ／ｃｍ2、好ましくは０．００１～０．０２ｍｇ／ｃｍ2となる量で、１日に１～５回外用することができる。
　以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［サンプルの調製］
（１）フルクトバシラス属乳酸菌の培養（サンプルＡの調製）
　Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ　ＮＢＲＣ３５１６株を、Ｄｉｆｃｏ社製のＭＲＳ培地（前培養培地）３０ｍｌに植菌し、３０℃で２４時間、静置で拡大培養した。得られた培養液をＯＤ６６０が０.０２となるように、ＭＲＳ培地（本培養培地）１Ｌに植菌し、３０℃で１２時間、ｐＨ６．０～７．０で攪拌培養した。
　得られた培養液を遠心分離に供して菌体を回収した。回収した菌体を１Ｌの０.８５ｗ／ｗ％ＫＣｌ水溶液で洗浄した。洗浄した菌体を再度遠心分離に供し、菌体を回収した。回収した菌体を殺菌後、凍結乾燥を行い、乳酸菌粉末（サンプルＡ）を得た。
　後述するＨＰＬＣ分析条件を用い、回収した菌体中のニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）生産量を測定した。測定の結果、ＮＡＤ１重量部当たりのＮＭＮの重量比率は０．０５５重量部であった。
（２）乳酸菌抽出液Ａ１の調製（サンプルＡの抽出液の調製）
　乳酸菌粉末(サンプルＡ)２０ｇを乳鉢で細かくすりつぶし、滅菌水１Ｌに懸濁し、懸濁液を調製した。懸濁液を室温（約２５℃）で１時間撹拌し、遠心分離（１２,０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ）後、上清を０.２μｍのフィルターでろ過し、乳酸菌抽出液Ａ１を得た。
　後述するＨＰＬＣ分析条件を用い、得られた乳酸菌抽出液Ａ１中のニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）生産量を測定した。測定の結果、ＮＡＤ１重量部当たりのＮＭＮの重量比率は０．０５４重量部であった。
（３）フルクトバシラス属乳酸菌の培養及び休止菌体反応（サンプルＢの調製）
　Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ　ＮＢＲＣ３５１６株を、Ｄｉｆｃｏ社製のＭＲＳ培地（前培養培地）３０ｍｌに植菌し、３０℃で２４時間、静置で拡大培養した。得られた培養液をＯＤ６６０が０.０２となるように、ＭＲＳ培地（本培養培地）１Ｌに植菌し、３０℃で１２時間、ｐＨ６．０～７．０で攪拌培養した。
　得られた培養液を遠心分離に供して菌体を回収した。回収した菌体を１Ｌの０.８５ｗ／ｗ％ＫＣｌ水溶液で洗浄した。洗浄した菌体を再度遠心分離に供し、菌体を回収した。回収した菌体を２００ｍｌのイオン交換水に懸濁し、ｐＨ６．０～７．０で２５℃で８時間攪拌し、休止菌体反応を実施した。休止菌体反応終了後、遠心分離に供して菌体を回収した。回収した菌体を１Ｌの０.８５ｗ／ｗ％ＫＣｌ水溶液で洗浄した。洗浄した菌体を再度遠心分離に供し、菌体を回収した。回収した菌体を殺菌後、凍結乾燥を行い、休止菌体反応を経た乳酸菌粉末（サンプルＢ）を得た。
　後述するＨＰＬＣ分析条件を用い、回収した菌体中のニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）生産量を測定した。測定の結果、ＮＡＤ１重量部当たりのＮＭＮの重量比率は１．５５重量部であった。
（４）乳酸菌抽出液Ｂ１の調製（サンプルＢの抽出液の調製）
　乳酸菌粉末（サンプルＢ）２０ｇを滅菌水１Ｌに懸濁し、懸濁液を調製した。懸濁液を室温（約２５℃）で１時間撹拌し、遠心分離（１２,０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ）し上清を０.２μｍのフィルターでろ過し、乳酸菌抽出液Ｂ１を得た。
　後述するＨＰＬＣ分析条件を用い、得られた乳酸菌抽出液Ｂ１中のニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）生産量を測定した。測定の結果、ＮＡＤ１重量部当たりのＮＭＮの重量比率は０．８６重量部であった。
（５）他のフルクトバシラス属乳酸菌の乳酸菌抽出液（乳酸菌抽出液Ｃ１、乳酸菌抽出液Ｄ１、乳酸菌抽出液Ｅ１）の調製
　乳酸菌として、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株、またはＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５４株を用いた以外は、上記「（１）フルクトバシラス属乳酸菌の粉末（サンプルＡ）の調製」と同じ方法で、各乳酸菌の粉末を調製した。得られた各乳酸菌の粉末を用い、上記「（２）乳酸菌抽出液Ａ１の調製（サンプルＡの抽出液の調製）」と同様の方法で抽出液を調製した。具体的には、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株の粉末からその抽出液（乳酸菌抽出液Ｃ１）を調製し、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株の粉末からその抽出液（乳酸菌抽出液Ｄ１）を調製し、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５４株の粉末からその抽出液（乳酸菌抽出液Ｅ１）を調製した。
　後述するＨＰＬＣ分析条件を用い、乳酸菌抽出液Ｃ１、乳酸菌抽出液Ｄ１、及び乳酸菌抽出液Ｅ１それぞれに含まれるニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）生産量を測定した。測定の結果、乳酸菌抽出液Ｃ１中のＮＡＤ１重量部当たりのＮＭＮの重量比率は０．０４２１重量部であった。乳酸菌抽出液Ｄ１中のＮＡＤ１重量部当たりのＮＭＮの重量比率は０．０２０２重量部であった。乳酸菌抽出液Ｅ１中のＮＡＤ１重量部当たりのＮＭＮの重量比率は０．０２５０重量部であった。
（ＭＲＳ培地組成）
　２ｗ／ｗ％　グルコース
　１ｗ／ｗ％　プロテアーゼペプトン
　１ｗ／ｗ％　牛肉エキス
　０．５ｗ／ｗ％　酵母エキス
　０．２ｗ／ｗ％　クエン酸アンモニウム
　０．１ｗ／ｗ％　Ｔｗｅｅｎ８０
　０．５ｗ／ｗ％　酢酸ナトリウム
　０．０１ｗ／ｗ％　硫酸マグネシウム
　０．００５ｗ／ｗ％　硫酸マンガン
　０．２ｗ／ｗ％　リン酸水素二カリウム
（ＨＰＬＣ分析条件）ＮＭＮの測定方法
　カラム：ＤａｉｓｏＰａｋ　ＳＰ-１００-５-ＯＤＳ-Ｐ（４.６×１５０ｍｍ）×２本
　カラム温度：２５℃
　溶離液    ：７５ｍＭ リン酸アンモニウム水溶液（ｐＨ６.０）
　流速      ：０.６ｍｌ/ｍｉｎ
　検出器    ：ＵＶ検出器（２６０ｎｍ）
　検出時間  ：１４．５分
（ＨＰＬＣ分析条件）ＮＡＤの測定方法
カラム：ＤＡＩＳＯＰＡＫ ＳＰ-１００-５－ＯＤＳ－Ｐ（４．６×２５０ｍｍ)×２本
カラム温度:２５℃
溶離液　　：７５ｍＭ　リン酸アンモニウム水溶液(ｐＨ６．０):メタノール=９５：５(ｗ：ｗ)
流速　　　：０．７ｍＬ/ｍｉｎ
検出器　　：ＵＶ検出器(２６０ｎｍ)
検出時間　：３３分
［試験例１：乳酸菌粉末（サンプルＡ）のコラーゲン及びヒアルロン酸の産生促進効果］
［1   要約］
　本試験例では、乳酸菌粉末（サンプルＡ）をヒト真皮線維芽細胞に添加すると、対照と比較し、細胞数あたりのコラーゲン産生率が有意差をもって増加し、且つ、対照と比較し、細胞数あたりのヒアルロン酸産生率が有意差をもって増加した。従って、乳酸菌粉末（サンプルＡ）が線維芽細胞のコラーゲン産生及びヒアルロン酸産生を高めたことが示唆された。
［2   試験目的］
　コラーゲンには、細胞と細胞をつなぐ作用、血管及び筋肉の強度を保つ作用、並びに、皮膚、骨、及び粘膜を形成する作用がある。ヒアルロン酸には、細胞間の水分保持作用、並びに生体内での潤滑及び緩衝作用がある。本試験例では、真皮線維芽細胞を用い、これら成分の産生に対する乳酸菌粉末の効果を検証した。
［3   試験概要］
　乳酸菌粉末を被験品として用い、乳酸菌粉末を加えた培地中で真皮線維芽細胞を培養し、培養上清のコラーゲン及びヒアルロン酸量をEnzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA)法で測定した。得られた測定値に基づいて、乳酸菌粉末によるコラーゲン及びヒアルロン酸産生促進作用を評価した。
［4   材料と試験方法］
［4-1  細胞］
　CO2インキュベータ（CO2濃度 5%、37℃）を用いて、ヒト新生児由来の真皮線維芽細胞株NB1RGB細胞 (RIKEN BRC, Japan) を培養し、得られた培養物を本試験例に用いた。
［4-2  培地］
　10.0% (v/v) Fetal Bovine Serum FBS, Cat No. SH30071.03, Hyclone, UK) 及び1.0% (v/v) 抗真菌剤 (Antibiotic- Antimycotic 100X, Cat No. 15240-062, Invitrogen, USA) を含むEagle's Minimal Essential Medium (EMEM, Cat No. 051-07615, Wako, Japan) を用いた。
［4-3  被験品］
　0.5%FBS含有EMEMを用いてサンプルＡを希釈し、濃度が異なる３種類 (10 μg/mL, 25 μg/mL, 500 μg/mL)の被験品を調製した。被験品の具体的な組成は表１の通りである。表１では、被験品の組成を、線維芽細胞の培養液中における最終濃度としてのＮＡＤ量及びＮＭＮ量で示した。対照には0.5%FBS含有EMEMを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［4-4  試験構成］
　生細胞数、コラーゲン産生量及びヒアルロン酸産生量の算出において、1つの処理群につき96ウェルプレートの3ウェルを用いた。生細胞数の算出においては、96ウェルプレートCat No. 3595（Corning, USA）を用い、コラーゲン産生量及びヒアルロン酸産生量の算出においては、96ウェルプレートCat No. 3855（Thermo scientific, USA）を用いた。また、1プレートにつき、被験品群及び対照群をそれぞれ1群ずつ設けた。被験品調製を含め、試験に関わる操作は別途記載のない限り室温で行った。
［4-5  試験操作］
［4-5-1  細胞培養］
1)　96ウェルプレートに1.0×104 cells/wellの密度でNB1RGB細胞を播種し、CO2インキュベータ内で24時間培養した。また、培養時の乾燥を防ぐため、試験に用いないウェルにPhosphate buffer saline (PBS (-), Cat No. 198601, Nissui, Japan）を200 μL加えた。
2)　24時間後、培地を除去し、96ウェルプレートに100 μLの被験品及び対照を添加し、CO2インキュベータ内で48時間培養した。
3)　48時間後、培養上清を新しい96ウェルプレートに分注し、後述4-5-3及び4-5-4に示すELISA法に従い、培養上清中のコラーゲン量及びヒアルロン酸量を測定することで、被験品のコラーゲン及びヒアルロン酸産生促進作用を評価した。また、培養上清を除去した96ウェルプレートの生細胞数を後述4-5-2に示す方法により測定した。
［4-5-2  生細胞数の測定］
1)  培地を除去した96ウェルプレートの各ウェルを、37℃に加温したPBS (-) 200 μLで静かに1回洗浄した。
2)  0.5 mg/mL 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, CAS No. 298-93-1, Sigma-Aldrich, USA) 溶液を、1ウェルあたり200 μL加え、CO2インキュベータ内で2時間培養した。
3)  培養終了後、MTT溶液を除去し、200 μLのPBS (-)で洗浄した。生成された不溶性のホルマザンを可溶化するため、0.04 N塩酸 (CAS No. 7647-01-0, Kanto Chemical, Japan) を含む2-プロパノール (CAS No. 67-63-0, Kanto Chemical, Japan) を200 μL加え、遮光下で1時間室温静置した。
4)  96ウェルプレートを270 rpmで10秒間振盪し、ウェル内の色素を均一に分散した後、マイクロプレートリーダー (SPARKR  10M, TECAN, Switzerland) を用いて570 nmの吸光度 (OD570) を測定した。
［4-5-3  コラーゲン産生促進作用評価］
　肌にハリ及び弾力を与えると言われている1型コラーゲンの産生量に対する被験品の効果を、直接ELISA法で評価した。
1)  高吸着型96ウェルプレートに、1ウェルあたり、100 μLコラーゲン標準液及び「4-5-1  細胞培養」で分注した培養上清を添加し、4℃で一晩静置した。
2)  0.05％ Tween20 in PBS (-) (Wash buffer, Tween20: Cas No. 9005-64-5, Sigma-Aldrich, USA) 200 μLによりマイクロプレートを2回洗浄し、200 μLの1% Bovine Serum Albumin (BSA, Cat No. PRL68700-50G, Proliant, USA) in PBS を加え、1時間室温静置した。
3)  1時間後、200 μLのWash bufferにて2回洗浄し、100 μLのBiotin結合抗コラーゲンＩ型抗体 (Cat No. 600-406-103, ROCKLAND, USA) 溶液を加え、1時間室温静置した。
4)  1時間後、200 μLのWash bufferにて4回洗浄し、100 μLのStreptavidin-HRP (Cat No. CJ30H-1, Agilent Technologies, USA) 溶液を加え、30分間室温静置した。
5)  30分後、200 μLのWash bufferにて4回、200 μLの超純水 (CAS No. 7732-18-5, Wako, Japan) にて1回洗浄した。
6)  2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS, Cat No. 5110-0010, KPL, USA) を、1ウェルあたり100 μL加え、5分間室温静置した。
7)  96ウェルプレートを270 rpmで30秒間振とうし、ウェル内の色素を均一にした後、マイクロプレートリーダーを用いて405 nmの吸光度 (OD405) を測定した。
8)  対照及び被験品のOD405を「4-5-2  生細胞数の測定」で測定したOD570で除した値を、細胞あたりのコラーゲン産生率として算出した。対照群の細胞あたりのコラーゲン産生率を100%として被験品の細胞あたりのコラーゲン産生率（％）を算出した。
［4-5-4  ヒアルロン酸産生促進作用評価］
　コラーゲン又はエラスチンの間で水分を抱え込むと言われているヒアルロン酸の産生量に対する被験品の効果を、サンドイッチELISAで評価した。
1)  100 μLの5 μg/mL Hyaluronan binding protein (HABP, Cat No. BC40, Hokudo, Japan) 溶液を高吸着型96ウェルプレートに加え、24時間4℃で静置した。
2)  HABP溶液を除去し、200 μLの0.05% Tween20 in 1.5 M Nacl溶液　(Wash buffer, USA NaCl: Cas No. 7647-14-5, Wako, Japan) で3回洗浄した。
3)  100 μLの5％ BSA溶液を加え、4℃で一晩静置した。
4)  BSA溶液を除去し、200 μLのWash bufferで2回洗浄後、プレートを乾燥させた。
5)  96ウェルプレートに、0.5 M NaCl、0.02％ Tween20及び1％ BSA含有PBS (-) で100倍希釈した培養上清を、1ウェルあたり100 μL添加し、2時間室温静置した。
6)  2時間後、200 μLのWash bufferにて4回洗浄し、100 μLのビオチン標識HABP (Cat No. BC41, Hokudo, Japan) 溶液を加え、30分間室温静置した。
7)  30分後、200 μLのWash bufferにて4回、200 μLの超純水で1回洗浄し、100 μLのStreptavidin-HRP溶液を加え、30分間室温静置した。
8)  30分後、200 μLのWash bufferにて4回、200 μLの超純水で1回洗浄し、ABTSを1ウェルあたり100 μL加え、10分間室温静置した。
9)  96ウェルプレートを270 rpmで30秒間振とうし、ウェル内の色素を均一にした後、マイクロプレートリーダーを用いて405nmの吸光度 (OD405) を測定した。
10)  対照及び被験品のOD405を「4-5-2  生細胞数の測定」で測定したOD570で除した値を、細胞あたりのヒアルロン酸産生率として算出した。対照群の細胞あたりのヒアルロン酸産生率を100%として被験品の細胞あたりのヒアルロン酸産生率（％）を算出した。
［6    試験結果］
［6-1  １型コラーゲン産生促進作用評価］
　被験品の細胞あたりのコラーゲン産生率（％）の平均値及び標準偏差を、図１に示した。
［6-2  ヒアルロン酸産生促進作用評価］
　被験品の細胞あたりのヒアルロン酸産生率（％）の平均値及び標準偏差を、図２に示した。
［試験例２：乳酸菌抽出液Ａ１のコラーゲン及びヒアルロン酸の産生促進効果］
　本試験例では、乳酸菌抽出液Ａ１をヒト真皮線維芽細胞に添加すると、対照と比較して細胞あたりのコラーゲン産生率が有意に増加し；対照と比較して細胞あたりのヒアルロン酸産生率が有意に増加した。従って、乳酸菌抽出液Ａ１が線維芽細胞のコラーゲン産生及びヒアルロン酸産生を高めたことが示唆された。
　本試験例では、被験品を、試験例１の「4-3 被験品」に記載したものから以下のものに変更したことを除いて、試験例１と同様の試験を行った。
　0.5%FBS含有EMEMを用いて乳酸菌抽出液Ａ１を希釈し、濃度が異なる３種類(0.25 %(v/v), 0.5 %(v/v), 1%(v/v))の被験品を調製した。被験品の具体的な組成は表２の通りである。表２では、被験品の組成を、線維芽細胞の培養液中における最終濃度としてのＮＡＤ量及びＮＭＮ量で示した。対照には0.5%FBS含有EMEMを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　対照の細胞あたりのコラーゲン産生率を100%とした時の被験品の細胞あたりのコラーゲン産生率（％）の平均値及び標準偏差を、図３に示した。また、対照の細胞あたりのヒアルロン酸産生率を100%とした時の被験品の細胞あたりのヒアルロン酸産生率（％）の平均値及び標準偏差を、図４に示した。
［試験例３：乳酸菌粉末（サンプルＢ）のコラーゲン及びヒアルロン酸の産生促進効果］
　本試験例では、乳酸菌粉末（サンプルＢ）をヒト真皮線維芽細胞に添加すると、対照と比較し、細胞数あたりのコラーゲン産生率が有意差をもって増加し、且つ、対照と比較し、細胞数あたりのヒアルロン酸産生率が有意差をもって増加した。従って、乳酸菌粉末（サンプルＢ）が線維芽細胞のコラーゲン産生及びヒアルロン酸産生を高めたことが示唆された。
　本試験例では、被験品を、試験例１の「4-3 被験品」に記載したものから以下のものに変更したことを除いて、試験例１と同様の試験を行った。
　0.5%FBS含有EMEMによってサンプルＢを50 μg/mLに希釈し、被験品を調製した。被験品の具体的な組成は表３の通りである。表３では、被験品の組成を、線維芽細胞の培養液中における最終濃度としてのＮＡＤ量及びＮＭＮ量で示した。対照には0.5%FBS含有EMEMを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　対照の細胞あたりのコラーゲン産生率を100%とした時の被験品の細胞あたりのコラーゲン産生率（％）の平均値及び標準偏差を、図５に示した。また、対照の細胞あたりのヒアルロン酸産生率を100%とした時の被験品の細胞あたりのヒアルロン酸産生率（％）の平均値及び標準偏差を、図６に示した。
［試験例４：乳酸菌抽出液Ｂ１のコラーゲン及びヒアルロン酸の産生促進効果］
　本試験例では、乳酸菌抽出液Ｂ１をヒト真皮線維芽細胞に添加すると、対照と比較して細胞あたりのコラーゲン産生率が有意に増加し；対照と比較してヒアルロン酸産生率が有意に増加し；対照と比較して細胞あたりのヒアルロン酸産生率が有意に増加した。従って、乳酸菌抽出液Ｂ１が線維芽細胞のコラーゲン産生及びヒアルロン酸産生を高めたことが示唆された。
　本試験例では、被験品を、試験例１の「4-3 被験品」に記載したものから以下のものに変更したことを除いて、試験例１と同様の試験を行った。
　培地を用いて乳酸菌抽出液Ｂ１を希釈し、濃度が異なる２種類(0.5 %(v/v), 1%(v/v))の被験品を調製した。被験品の具体的な組成は表４の通りである。表４では、被験品の組成を、線維芽細胞の培養液中における最終濃度としてのＮＡＤ量及びＮＭＮ量で示した。対照には培地を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　対照の細胞あたりのコラーゲン産生率を100%とした時の被験品の細胞あたりのコラーゲン産生率（％）の平均値及び標準偏差を、図７に示した。また、対照の細胞あたりのヒアルロン酸産生率を100%とした時の被験品の細胞あたりのヒアルロン酸産生率（％）の平均値及び標準偏差を、図８に示した。
［試験例５：乳酸菌抽出液のヒト表皮角化細胞賦活効果］
［試験例５－１：乳酸菌抽出液Ａ１のヒト表皮角化細胞賦活効果］
［1   要約］
　本試験例では、乳酸菌抽出液Ａ１をヒト表皮角化細胞に添加すると、対照と比較し、細胞増殖率を高めたことが示唆された。
［2   試験目的］
　表皮のターンオーバーは皮膚バリヤ機能及び水分量の保持に関与している。皮膚のターンオーバーの周期は、表皮角化細胞の増殖（つまり賦活）が律速段階となる。本試験例では、ヒト表皮角化細胞を用い、細胞賦活に対する乳酸菌抽出液の効果を検証した。
［3   試験概要］
　乳酸菌抽出液を被験品として用い、乳酸菌抽出液を加えた培地中でヒト表皮角化細胞を培養し、細胞賦活を表す細胞増殖の程度を450 nmの吸光度(OD450)で測定した。得られたOD450に基づいて、乳酸菌抽出液による細胞賦活作用を評価した。
［4   材料と試験方法］
［4-1  細胞］
　CO2インキュベータ（CO2濃度 5%、37℃）を用いて、ヒト表皮角化細胞ＰＳＶＫ１（JCRB Cell Bank. JCRB1093　細胞樹立者：Yasumoto,S）を培養し、本試験例に用いた。
［4-2  培地］
　ＫＭＧ-Ｇｏｌｄ基本培地（ロンザ）培地に添加剤（KGM-Gold Single Quots（ロンザ））を添加することで、本試験例に用いる培地を調製した。
［4-3  被験品］
　培地により乳酸菌抽出液Ａ１を希釈して1.0%(v/v)の被験品を調製した。対照には培地を用いた。
［4-4  試験構成］
　細胞賦活の算出において、1つの処理群につき96ウェルプレートの3ウェルを用いた。被験品群、対照群をそれぞれ1群ずつ設けて試験した。被験品調製を含め、試験に関わる操作は別途記載のない限り室温で行った。
［4-5  試験操作］
［4-5-1  細胞培養］
1)　96ウェルプレートに5.0×103 cells/wellの密度でＰＳＶＫ１細胞を播種し、CO2インキュベータ内で24時間培養した。また、培養時の乾燥を防ぐため、試験に用いないウェルにPBS(-) を200 μL加えた。
2)　24時間後、培地を除去し96ウェルプレートに100 μLの被験品および対照を添加し、CO2インキュベータ内で48時間培養した。
3)　48時間後、培養上清を除去し、96ウェルプレートの細胞数を後述の4-5-2に示す方法により評価し、被験品のヒト表皮角化細胞賦活作用を評価した。
［4-5-2  ヒト表皮角化細胞賦活作用評価］
1)　培地を除去した96ウェルプレートの各ウェルを、37℃に加温したPBS (-) 200 μLで静かに1回洗浄した。
2)　96ウェルプレートに100 μLの培地を添加し、CCK-8溶液(Cell Counting Kit-8,Dojindo, Japan) を1ウェルあたり10 μL加え、CO2インキュベータ内で3時間呈色反応を行った。
3)　反応終了後、マイクロプレートリーダー (Infinite(R) 200 PRO, TECAN, Switzerland) を用いて、450 nmの吸光度 (OD450) を測定した。OD450の測定値が高いほど、細胞数が多いことを表す。
4)　対照群におけるOD450を100%とした場合の被験品添加群におけるOD450の相対値を、被験品のヒト表皮角化細胞の細胞増殖率、つまり、ヒト表皮角化細胞賦活率（％）として算出した。結果を５に示す。
［試験例５－２：乳酸菌抽出液Ｃ１のヒト表皮角化細胞賦活効果］
　本試験例では、乳酸菌抽出液Ｃ１をヒト表皮角化細胞に添加すると、対照と比較し、細胞増殖率を高めたことが示唆された。
　具体的には、被験品を乳酸菌抽出液Ｃ１に変更したことを除いて、試験例５－１と同様の操作を行い、ヒト表皮角化細胞賦活率（％）を算出した。結果を５に示す。
［試験例５－３：乳酸菌抽出液Ｄ１のヒト表皮角化細胞賦活効果］
　本試験例では、乳酸菌抽出液Ｄ１をヒト表皮角化細胞に添加すると、対照と比較し、細胞増殖率を高めたことが示唆された。
　具体的には、被験品を乳酸菌抽出液Ｄ１に変更したことを除いて、試験例５－１と同様の操作を行い、ヒト表皮角化細胞賦活率（％）を算出した。結果を５に示す。
［試験例５－４：乳酸菌抽出液Ｅ１のヒト表皮角化細胞賦活効果］
　本試験例では、乳酸菌抽出液Ｅ１をヒト表皮角化細胞に添加すると、対照と比較し、細胞増殖率を高めたことが示唆された。
　具体的には、被験品を乳酸菌抽出液Ｅ１に変更したことを除いて、試験例５－１と同様の操作を行い、ヒト表皮角化細胞賦活率（％）を算出した。結果を５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005

Claims (16)

  1. 　フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清、及び／又は前記乳酸菌の抽出物を含有する、コラーゲン産生促進剤。
  2. 　前記乳酸菌がＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓである、請求項１に記載のコラーゲン産生促進剤。
  3. 　前記乳酸菌がＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ　ＮＢＲＣ３５１６株である、請求項１に記載のコラーゲン産生促進剤。
  4. 　ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含み、ニコチンアミドモノヌクレオチドを含んでいてもよく、且つ、前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド１重量部当たりの前記ニコチンアミドモノヌクレオチドの含有量が５重量部以下である、請求項１に記載のコラーゲン産生促進剤。
  5. 　フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清、及び／又は前記乳酸菌の抽出物を含有する、ヒアルロン酸産生促進剤。
  6. 　前記乳酸菌がＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓである、請求項５に記載のヒアルロン酸産生促進剤。
  7. 　前記乳酸菌がＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ　ＮＢＲＣ３５１６株である、請求項５に記載のヒアルロン酸産生促進剤。
  8. 　ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含み、ニコチンアミドモノヌクレオチドを含んでいてもよく、且つ、前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド１重量部当たりの前記ニコチンアミドモノヌクレオチドの含有量が５重量部以下である、請求項５に記載のヒアルロン酸産生促進剤。
  9. 　フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清、及び／又は前記乳酸菌の抽出物を有する、表皮角化細胞賦活剤。
  10. 　前記乳酸菌がＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌからなる群より選択される、請求項９に記載の表皮角化細胞賦活剤。
  11. 　前記乳酸菌がＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ　ＮＢＲＣ３５１６株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５４株からなる群より選択される、請求項９に記載の表皮角化細胞賦活剤。
  12. 　ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含み、ニコチンアミドモノヌクレオチドを含んでいてもよく、且つ、前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド１重量部当たりの前記ニコチンアミドモノヌクレオチドの含有量が５重量部以下である、請求項９に記載の表皮角化細胞賦活剤。
  13. 　請求項１に記載のコラーゲン産生促進剤を含む、飲食品、化粧品又は医薬品。
  14. 　請求項５に記載のヒアルロン酸産生促進剤を含む、飲食品、化粧品又は医薬品。
  15. 　請求項９に記載の表皮角化細胞賦活剤を含む、飲食品、化粧品又は医薬品。
  16. 　フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の培養上清、及び／又は前記乳酸菌の抽出物を含有する、
    　　皮膚のたるみ及び／又はシワの予防又は改善剤、
    　　皮膚の荒れ及び／又は創傷の治療剤、
    　　骨粗しょう症、関節炎及び／又は腱鞘炎の予防又は治療剤、
    　　皮膚の保湿剤、
    　　角結膜上皮障害の治療剤、
    　　眼科手術時の前房保持剤、
    　　角質肥厚の抑制剤、
    　　肌のくすみ改善剤、
    　　皮膚の再生の促進剤、
    　　肌の美白剤、
    　　肌のキメ改善剤、若しくは、
    　　ニキビ及び／又は吹き出物の改善剤。
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