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WO2023100486A1 - 分析方法 - Google Patents

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WO2023100486A1
WO2023100486A1 PCT/JP2022/038105 JP2022038105W WO2023100486A1 WO 2023100486 A1 WO2023100486 A1 WO 2023100486A1 JP 2022038105 W JP2022038105 W JP 2022038105W WO 2023100486 A1 WO2023100486 A1 WO 2023100486A1
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WO
WIPO (PCT)
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nucleic acid
analysis method
target substance
substance
acid region
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2022/038105
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English (en)
French (fr)
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明 糠塚
徹平 酒井
真菜 浅野
渓 早川
和久 中川
舞 新本
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Denso Corp
Original Assignee
Denso Corp
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Publication date
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Priority to JP2023564773A priority patent/JPWO2023100486A1/ja
Priority to EP22900920.4A priority patent/EP4442837A4/en
Publication of WO2023100486A1 publication Critical patent/WO2023100486A1/ja
Priority to US18/677,250 priority patent/US20240301476A1/en
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/84—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving inorganic compounds or pH
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers

Definitions

  • This disclosure relates to analysis methods.
  • Patent Document 1 discloses a method of analyzing a target substance using a fusion.
  • a fusion comprises a binding agent and a label.
  • a binding substance has an activity to bind to a target substance.
  • a label produces an observable phenomenon.
  • a sample containing the target substance is mixed with the fusion. Next, fusions that have not bound to the target substance are removed. Next, a phenomenon in which a fusion bound to the target substance is generated is detected.
  • a fusion is obtained by fusing a binding substance and a label. Fusions have the following problems.
  • the formation of the fusion may impair the original function of the binding substance or the original function of the label.
  • the fusion since the fusion is equipped with a label, the size of the fusion is larger than the size of the binding substance. Therefore, the fusion may not bind to the target substance due to interference from substances existing in the vicinity of the target substance.
  • One aspect of the present disclosure provides an analytical method capable of detecting a target substance without using a fusion with a label.
  • One of the disclosures is a method of analyzing a target substance.
  • a binding substance containing a nucleic acid region composed of nucleic acid and having activity to bind to the target substance is mixed with a sample containing the target substance.
  • the bound substance not bound to the target substance is removed.
  • the nucleic acid region is amplified.
  • a phenomenon caused by amplifying the nucleic acid region is detected.
  • the target substance can be detected without using a fusion with a label.
  • FIG. 2 is an explanatory diagram showing the structures of a nucleic acid aptamer and a single-stranded circular DNA.
  • FIG. 3 is an explanatory diagram showing the configuration of a binding substance and a single-stranded circular DNA. It is explanatory drawing showing the analysis method of a target substance.
  • 4 is a graph showing changes over time in fluorescence intensity in mixed liquids X and Y.
  • FIG. 4 is a graph showing changes over time in fluorescence intensity in mixed liquid Z.
  • FIG. 4 is a graph showing the amount of DNA amplification expressed by the amount of pH decrease and the change in fluorescence intensity in mixed solution Z.
  • FIG. It is a flowchart showing the process of the analysis method of a target substance.
  • binding substance 1 The binding substance 1 has the activity of binding to the target substance 33 .
  • the target substance 33 is a substance to be analyzed.
  • the target substance 33 is, for example, protein, sugar, lipid, nucleic acid, or low-molecular-weight compound.
  • the binding substance 1 comprises a nucleic acid region 3 consisting of nucleic acids.
  • binding substance 1 examples include nucleic acid preparation 1A.
  • Nucleic acid preparation 1A includes, for example, nucleic acid aptamer 1A-1 shown in FIG.
  • Nucleic acid preparation 1A and nucleic acid aptamer 1A-1 correspond to nucleic acid region 3.
  • nucleic acid aptamers 1A-1 examples include DNA aptamers, RNA aptamers, and the like. Nucleic acid aptamer 1A-1 can be chemically synthesized, for example, by an in vitro process. The number of bases of nucleic acid aptamer 1A-1 is, for example, 10 or more and 100 or less.
  • Nucleic acid aptamer 1A-1 may be, for example, a product in which multiple nucleic acid units are linked.
  • the number of bases in each unit is preferably 10 or more and 100 or less. When the number of bases in each unit is 100 or less, even if the target substance 33 is close to another nucleic acid aptamer 1A-1 or another substance, the nucleic acid aptamer 1A-1 is It is less susceptible to interference from other substances, and easily binds to the target substance 33 .
  • the sequence of the nucleic acid aptamer 1A-1 may be a DNA sequence, an RNA sequence, or a mixed sequence of DNA and RNA.
  • the nucleic acid aptamer 1A-1 may further contain modified nucleic acids or nucleic acid analogs as long as they do not impair the activity of binding to the target substance 33, hybridization properties, and elongation properties.
  • the 3′ terminal region 9 of the nucleic acid aptamer 1A-1 shown in FIG. 1 contains a base sequence complementary to part of the template nucleic acid 21.
  • the 3' terminal region 9 is a region on the 3' terminal side of the nucleic acid aptamer 1A-1.
  • the 3'-end region 9 preferably contains a base sequence of 10 or more and 30 or less bases.
  • the nucleotide sequence of the 3'-terminal region 9 is not particularly limited.
  • the GC content in the 3'-terminal region 9 is preferably 30% or more and 70% or less.
  • the binding substance 1 is, for example, a binding substance 1B in which the nucleic acid region 3 and the non-nucleic acid preparation 5 are artificially linked, as shown in FIG.
  • non-nucleic acid preparations 5 include protein preparations.
  • Protein formulations include, for example, high-molecular-weight protein formulations and low-molecular-weight protein formulations.
  • macromolecular protein preparations include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, and the like.
  • small protein preparations include fragment antibodies, single-chain antibodies, diabodies, nanobodies, VHHs, peptide aptamers, and the like.
  • the number of amino acids that make up the low-molecular-weight protein preparation is, for example, 5 or more and 200 or less. When the number of amino acids is 200 or less, even if the target substance 33 is close to other low-molecular-weight protein preparations or other substances, the low-molecular-weight protein preparations are subject to interference from other low-molecular-weight protein preparations or other substances. It is less likely to be subjected to
  • a low-molecular-weight protein formulation may be, for example, a combination of multiple units consisting of amino acids.
  • the number of amino acids in each unit is preferably 5 or more and 200 or less. When the number of amino acids in each unit is 200 or less, even if the target substance 33 is close to other substances, the low-molecular-weight protein preparation is less susceptible to interference from other substances and easily binds to the target substance 33. .
  • the number of amino acids that constitute the macromolecular protein formulation is, for example, 200 or more.
  • the sequence of the nucleic acid region 3 may be a DNA sequence, an RNA sequence, or a mixed sequence of DNA and RNA.
  • the nucleic acid region 3 may further contain modified nucleic acids or nucleic acid analogues, as long as the activity of the binding substance 1B to bind to the target substance 33, hybridization properties, and elongation properties are not impaired.
  • the number of bases and sequence of the nucleic acid region 3 are not particularly limited.
  • the number of bases in the nucleic acid region 3 is preferably 15 or more and 40 or less.
  • the 3′ terminal region 19 of the nucleic acid region 3 shown in FIG. 2 contains a base sequence complementary to part of the template nucleic acid 21 .
  • the 3' terminal region 19 is a region of the nucleic acid region 3 on the 3' terminal side.
  • the 3' terminal region 19 preferably contains a base sequence with 10 or more and 30 or less bases.
  • the nucleotide sequence of the 3' terminal region 19 is not particularly limited.
  • the GC content in the 3'-terminal region 19 is preferably 30% or more and 70% or less.
  • the 5' end of the nucleic acid region 3 is chemically modified with a chemical substituent 11 for artificial linkage with the non-nucleic acid preparation 5, for example.
  • Examples of chemical substituents 11 or 13 include primary amines, azides, alkynes, dibenzocyclooctynes, bicyclononines, 2-propynyls, 2'-O-propargyls, thiols, biotins, avidins, streptavidins, neutravidins, Examples include N-hydroxysuccinimide and maleimide.
  • the template nucleic acid 21 contains a base sequence complementary to the 3′ terminal region 9 of the nucleic acid aptamer 1A-1 shown in FIG. 1 or the 3′ terminal region 19 of the nucleic acid region 3 shown in FIG.
  • the template nucleic acid 21 and the nucleic acid aptamer 1A-1 hybridize by forming base pairs 61 to form a complex 63.
  • template nucleic acid 21 and nucleic acid region 3 hybridize by forming base pairs 61 to form complex 63 .
  • the total number of bases in the template nucleic acid 21 is preferably 50 or more and 100 or less.
  • Examples of the template nucleic acid 21 include a single-stranded circular nucleic acid 21A.
  • the single-stranded circular nucleic acid 21A includes, for example, the single-stranded circular DNA 21A-1 shown in FIGS.
  • a single-stranded circular DNA 21A-1 is obtained by circularizing a single-stranded linear DNA. Circularization of single-stranded linear DNA can be performed using, for example, DNA ligase such as CircLigase (Lucigen), CircLigase II (Lucigen), T4 DNA Ligase (NEB and other companies).
  • Method for Analyzing Target Substance 33 The method for analyzing the target substance 33 can be carried out, for example, according to the following procedure. As shown in STEP 1 of FIG. 3, a sample 31 is prepared. A sample 31 contains a target substance 33 and a conjugate-forming reaction solution 35 . The target substance 33 is present in the conjugate-forming reaction solution 35 .
  • Binding substance 1 is, for example, nucleic acid aptamer 1A-1 shown in FIG. 1 or binding substance 1B shown in FIG.
  • the target substance 33 and the binding substance 1 coexist in the conjugate-forming reaction solution 35 .
  • At least part of the binding substance 1 and the target substance 33 are bound to form a binding body 65 .
  • binding substances 1 those binding substances 1 that are not bound to the target substance 33 are removed.
  • conjugate-forming reaction solution 35 is also removed.
  • a nucleic acid amplification reaction liquid 39 is added instead of the conjugate formation reaction liquid 35 .
  • the nucleic acid amplification reaction liquid 39 contains known components of the strand displacement DNA synthase, the template nucleic acid 21 and the nucleic acid amplification reaction liquid 39 .
  • Strand-displacement-type DNA synthetases include, for example, phi29 polymerase, Vent DNA polymerase, Bst DNA polymerase, and the like. Strand-displacing DNA synthetase corresponds to nucleic acid amplification enzyme.
  • the composition of the nucleic acid amplification reaction solution 39 can be appropriately adjusted according to the phenomenon to be detected.
  • the phenomenon is a phenomenon caused by amplifying the 3'-terminal region 9 shown in FIG. 1 or the 3'-terminal region 19 shown in FIG.
  • the molar concentration and pH of the buffer in the nucleic acid amplification reaction solution 39 can be adjusted. After adding the nucleic acid amplification reaction solution 39 , the target substance 33 and the binding substance 1 bound to the target substance 33 are present in the nucleic acid amplification reaction solution 39 .
  • nucleic acid amplification occurs due to the action of the nucleic acid amplification enzyme. Nucleic acid amplification is to amplify the 3'-end region 9 shown in FIG. 1 or the 3'-end region 19 shown in FIG.
  • nucleic acid amplification by rolling circle amplification occurs due to the action of strand-displacement-type DNA synthetase.
  • Nucleic acid amplification by rolling circle amplification can be performed isothermally.
  • phi29 polymerase is used as the strand-displacing DNA synthetase
  • Nucleic acid amplification produces amplified nucleic acid 43 .
  • the nucleic acid amplification reaction solution 39 When amplifying a nucleic acid region by rolling circle amplification, the nucleic acid amplification reaction solution 39 preferably contains Tris buffer at a final concentration of 0 mM or more and 10 mM or less.
  • the pH of the nucleic acid amplification reaction solution 39 is preferably 7.0 or more and 9.0 or less.
  • Isothermal nucleic acid amplification is preferred as nucleic acid amplification.
  • isothermal nucleic acid amplification in addition to the rolling circle amplification method, loop-mediated isothermal amplification (LAMP), whole genome amplification (WGA), multiple displacement amplification (MDA) ), Nicking Endonuclease Amplification Reaction (NEAR), and the like.
  • LAMP loop-mediated isothermal amplification
  • WGA whole genome amplification
  • MDA multiple displacement amplification
  • NEAR Nicking Endonuclease Amplification Reaction
  • Isothermal nucleic acid amplification does not require temperature cycles such as heating and cooling, and the reaction proceeds at a constant temperature. be.
  • the nucleic acid amplification reaction liquid 39 contains, for example, a nucleic acid detection reagent.
  • Nucleic acid detection reagents include, for example, SYBR Green I and SYBR Green II.
  • nucleic acid amplification reaction liquid 39 is excited by light of a specific wavelength and emits fluorescence when nucleic acid amplification occurs. Fluorescence corresponds to the phenomenon caused by amplifying nucleic acid regions. The intensity of fluorescence increases as the amount of binding substance 1 bound to target substance 33 increases. The fluorescence intensity increases as the amount of the target substance 33 contained in the sample 31 increases.
  • the intensity of fluorescence at a specific wavelength increases in parallel with nucleic acid amplification.
  • Fluorescence of a specific wavelength corresponds to a phenomenon caused by amplifying the nucleic acid region 3 .
  • the intensity of the fluorescence at the specific wavelength is higher as the amount of the binding substance 1 bound to the target substance 33 increases.
  • the intensity of the fluorescence at the specific wavelength increases as the amount of the target substance 33 contained in the sample 31 increases.
  • nucleic acid amplification reaction solution 39 nucleotides are incorporated into the amplified nucleic acid 43 as the nucleic acid is amplified, and hydrogen ions are generated.
  • the amount of hydrogen ions produced increases with the amount of incorporated nucleotides. Since hydrogen ions are generated, the pH of the nucleic acid amplification reaction liquid 39 is lowered.
  • the production of hydrogen ions and the decrease in pH correspond to phenomena caused by amplifying nucleic acid regions.
  • the amount of decrease in pH increases as the amount of binding substance 1 bound to target substance 33 increases.
  • the amount of decrease in pH increases as the amount of target substance 33 contained in sample 31 increases.
  • nucleotides are incorporated into the amplified nucleic acid 43 as the nucleic acid is amplified, and pyrophosphate is generated.
  • an enzyme group that catalyzes a reaction cascade driven by pyrophosphate is contained in the nucleic acid amplification reaction solution 39
  • the reaction cascade driven by the generated pyrophosphate causes light emission and a change in redox potential.
  • Generation of pyrophosphate, light emission, and redox potential change correspond to phenomena caused by amplification of the nucleic acid region.
  • the degree of light emission and oxidation-reduction potential change increases as the amount of binding substance 1 bound to target substance 33 increases.
  • the degree of light emission and oxidation-reduction potential change increases as the amount of the target substance 33 contained in the sample 31 increases.
  • the phenomenon caused by nucleic acid amplification is a change in redox potential
  • the phenomenon caused by nucleic acid amplification can be detected using a potential measuring instrument. If the phenomenon caused by nucleic acid amplification is the production, consumption, or absorption of hydrogen ions, a pH meter can be used to detect the phenomenon caused by nucleic acid amplification.
  • a phenomenon caused by nucleic acid amplification can be detected by the measuring instrument 51 shown in STEP 3 of FIG.
  • the measuring instrument 51 is, for example, a light receiving device, a pH measuring instrument, an electric potential measuring instrument, or the like.
  • the binding substance 1 does not have to be labeled. That is, according to the analysis method of the present disclosure, the target substance 33 can be detected without using a fusion with a label. Therefore, according to the analysis method of the present disclosure, it is possible to reduce the production cost and the time required for production of the binding substance 1 .
  • nucleic acid preparation 1A such as DNA aptamer or RNA aptamer
  • the base sequence of nucleic acid preparation 1A can be used as a template or primer portion for nucleic acid amplification without modifying the base sequence as it is. Available. Therefore, the nucleic acid preparation 1A can have both the function of the binding substance 1 and the function of causing the phenomenon.
  • Binding substance 1 does not have a label. Therefore, the original function of the binding substance 1 is less likely to be lost.
  • the original function of the binding substance 1 is the activity of binding to the target substance 33 .
  • Binding substance 1 does not have a label. Therefore, the size of the binding substance 1 is small. As a result, when the binding substance 1 approaches one target substance 33, it is less susceptible to interference from other binding substances 1. FIG. Therefore, the binding substance 1 can bind to, for example, each of the plurality of target substances 33 forming the complex. As a result, the analysis sensitivity of the target substance 33 can be improved by using the analysis method of the present disclosure.
  • a phenomenon associated with nucleic acid amplification can be detected by amplifying the nucleic acid region following the formation of the conjugate 65 between the target substance 33 and the binding substance 1 . Therefore, the concentration of the target substance 33 in the sample 31 can be measured.
  • the hydrogen ion concentration in the nucleic acid amplification reaction liquid 39 changes.
  • a change in hydrogen ion concentration occurring in the nucleic acid amplification reaction solution 39 can be measured using a pH measuring device. In that case, the target substance 33 can be detected based on the measurement result of the pH measuring device.
  • the concentration of pyrophosphate in the nucleic acid amplification reaction liquid 39 changes.
  • a reaction cascade driven by the generated pyrophosphate causes a redox potential change.
  • changes in the concentration of pyrophosphate occurring in the nucleic acid amplification reaction solution 39 can be measured based on changes in the amount of emitted light and changes in the redox potential.
  • the target substance 33 can be detected based on changes in the amount of emitted light and changes in the oxidation-reduction potential.
  • (1H) In the analysis method of the present disclosure, for example, by using an intercalator-type luminescent dye or a minor groove-type luminescent dye that adsorbs to the amplified nucleic acid 43, coloring, luminescence, or fluorescence generated in the nucleic acid amplification reaction solution 39 is can be measured.
  • the target substance 33 can be detected based on measurement results of color development, luminescence, or fluorescence generated in the nucleic acid amplification reaction solution 39 .
  • the concentration of the target substance 33 can be quantitatively analyzed by an immunological technique.
  • nucleic acid amplification is performed isothermally.
  • the reaction proceeds at a constant temperature.
  • nucleic acid amplification is performed isothermally, it is easier to apply the analysis method of the present disclosure to a simple detection method, compared to the case of polymerase chain reaction, which requires temperature cycles such as raising and lowering the temperature.
  • Example (5-1) Production of DNA Aptamer A DNA aptamer having the DNA sequence of SEQ ID NO: 1 was produced. The DNA aptamer corresponds to Nucleic Acid Aptamer 1A-1 and to Binding Agent 1. The DNA aptamer of this example was a partially modified DNA aptamer described in Anal. Chem. 2020, 92, 9895-9900.
  • the DNA sequence of SEQ ID NO: 1 contains the DNA sequence of SEQ ID NO: 2. According to Anal. Chem. 2020, 92, 9895-9900, the DNA sequence of SEQ ID NO: 2 is intended for the RBD region (hereinafter referred to as the RBD region) in the spike glycoprotein of the novel coronavirus SARS-CoV-2. It was identified as a DNA aptamer designated Substance 33.
  • the DNA sequence of SEQ ID NO: 1 contains the DNA sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the DNA sequence of SEQ ID NO: 3 corresponds to 3' terminal region 9.
  • the 3' terminal region 9 is a region added to complement the single-stranded circular DNA 21A-1.
  • the DNA aptamer of this example was dissolved in a phosphate buffer to prepare a DNA aptamer solution.
  • the final concentration of DNA aptamer in the DNA aptamer solution was 10 ⁇ M.
  • the phosphate buffer contained 0.05% (v/v) of the surfactant Tween 20.
  • the phosphate buffer contained 137 mM NaCl, 8.1 mM Na2HPO4 , 2.7 mM KCl, and 1.47 mM KH2PO4 .
  • the above phosphate buffer is hereinafter referred to as 1xPBS/T.
  • (5-2) Production of single-stranded circular DNA A single-stranded DNA was prepared. The 5' end of the single-stranded DNA was phosphorylated. The phosphorylation-modified single-stranded DNA had the DNA sequence of SEQ ID NO:4.
  • the phosphorylation-modified single-stranded DNA was circularized by the action of CircLigase II to produce single-stranded circular DNA 21A-1.
  • the single-stranded circular DNA 21A-1 contained the DNA sequence of SEQ ID NO:5.
  • the DNA sequence of SEQ ID NO:5 is the same sequence as the second primer sequence used in rolling circle amplification. (5-3) First Verification Whether or not rolling circle amplification proceeds using DNA aptamers was verified.
  • mixed liquid X was produced.
  • Mixture X contained phi29 DNA polymerase (NEB, M0269) and SYBR Green I (TaKaRa, 5761A).
  • the mixture X contains 10xphi29 buffer (final concentration 1x), dNTP mix (final concentration 0.2 mM), BSA (final concentration 0.1 mg/mL), and SYBR Green I (TaKaRa, 5761A) (final concentration 1 ⁇ ), ROX dye (final concentration 1 ⁇ ), phi29 DNA polymerase (final concentration 0.05 U/ ⁇ L), and the single-stranded circular DNA prepared in (3-2) (final concentration 100 nM ), the second primer (final concentration 1 ⁇ M), the DNA aptamer prepared in (3-1) (final concentration 10 nM), and pure water.
  • the volume of the mixed liquid X was 20 ⁇ L.
  • mixed liquid Y was manufactured.
  • Mixture Y basically had the same composition as Mixture X, but contained no DNA aptamer and contained pure water instead.
  • each of the mixtures X and Y was incubated at 37°C for 3 hours. During the incubation, SYBR Green I fluorescence kinetics was measured in real time.
  • Fig. 4 shows the measurement results.
  • mixed liquid X an increase in fluorescence intensity over time was confirmed.
  • mixed liquid Y no increase in fluorescence intensity was confirmed.
  • the above measurement results show the following.
  • the DNA aptamer produced in (5-1) above had the activity of forming a complex 63 by hybridizing with the single-stranded circular DNA 21A-1 by forming a base pair 61. Starting from the formed complex 63, rolling circle amplification occurred and DNA was amplified.
  • (5-4) Second Verification It was verified whether or not rolling circle amplification would lower the pH of the mixed solution Z, which will be described later.
  • Mixture Z was prepared.
  • the composition of Mixture Z was essentially the same as Mixture X, but instead of the 10x phi29 buffer, it contained 2x master mix.
  • the 2x master mix contained Tris (2 mM final concentration), MgCl2 (20 mM final concentration), ( NH4 ) 2SO4 ( 20 mM final concentration), and DTT (8 mM final concentration).
  • the six 2x mastermixes differed only in pH.
  • the pH of the six 2x mastermixes was 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 10.0, respectively.
  • the pH measurement method was titration with NaOH.
  • Mixed liquid Z also had six types depending on the type of 2x master mix to be blended.
  • each of the six mixtures Z was incubated at 37°C for 3 hours. During the incubation, SYBR Green I fluorescence kinetics was measured in real time.
  • Fig. 5 shows the measurement results.
  • the increase in fluorescence intensity over time was highest when the pH of the 2x master mix blended in the mixture Z was 7.0, followed by 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 10 .0 was the highest.
  • Fig. 6 shows the amount of decrease in pH.
  • the decrease in pH was the highest when the pH of the 2x master mix blended in the mixed liquid Z was 7.0, followed by 7.5, 8.5, 9.0, and 8.0 in that order.
  • the above measurement results show the following.
  • the DNA aptamer had the activity of forming a complex 63 by hybridizing with the single-stranded circular DNA 21A-1 by forming a base pair 61. Starting from the formed complex 63, rolling circle amplification occurred and DNA was amplified. Hydrogen ions were generated along with the incorporation of nucleotides that occurred during DNA amplification, and the pH of the mixed solution Z was lowered.
  • (5-5) Implementation of Analysis Method Spike S1-His Recombinant Protein (Sinobiological Co., product number 40591-V08H) (hereinafter referred to as S1) was used as the target substance 33.
  • S1 is a protein containing an RBD region in its amino acid sequence.
  • the DNA aptamer produced in (5-1) above has binding activity to S1.
  • S1 was dissolved in 0.1 M carbonate buffer to prepare an S1 solution.
  • the pH of 0.1 M carbonate buffer was adjusted to 9.6. There were two final concentrations of S1 in the S1 solution, 5 ⁇ g/mL and 1 ⁇ g/mL.
  • ⁇ -amylase (Lee Biosolutions product number 120-17) was dissolved in 0.1 M carbonate buffer to prepare an ⁇ -amylase solution.
  • the final concentration of ⁇ -amylase in the ⁇ -amylase solution was 5 ⁇ g/mL.
  • the DNA aptamer produced in (5-1) above does not have ⁇ -amylase-binding activity.
  • the analysis method was implemented according to the procedure shown in Figure 7. In the analysis method, it was verified whether or not the pH of the reaction solution was lowered by the rolling circle amplification driven after the binding of the DNA aptamer and the target substance.
  • a solution containing the target substance was dropped into the ELISA well of a 96-well plate H type for ELISA (Sumitomo Bakelite Co., Ltd., product number MS-8896F) and allowed to stand overnight at 4°C.
  • the solution containing the target substance was the S1 solution or the ⁇ -amylase solution.
  • the target substance was S1 or ⁇ -amylase.
  • the target substance adhered to the ELISA wells.
  • the ELISA wells to which the target substance had adhered were washed with 200 ⁇ L of 1 ⁇ PBS/T. Washing was performed three times.
  • bovine serum-derived albumin (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., product number 013-15104) was dissolved in 1x PBS/T to produce a BSA solution.
  • Bovine serum-derived albumin is hereinafter referred to as BSA.
  • the concentration of BSA in the BSA solution was 3% (w/v).
  • 200 ⁇ L of BSA solution was added dropwise to the ELISA well to which the target substance had adhered, and the well was allowed to stand at room temperature for 2 hours. At this time, blocking was performed. Blocked ELISA wells were washed with 200 ⁇ L of 1 ⁇ PBS/T. Washing was performed three times.
  • the target substance was S1
  • the pH of the reaction solution decreased due to the rolling circle amplification driven after the binding of the DNA aptamer and the target substance. Therefore, S1 could be detected by detecting the phenomenon of pH drop.
  • the target substance was ⁇ -amylase
  • the pH of the reaction solution did not decrease.
  • a plurality of functions possessed by one component in the above embodiment may be realized by a plurality of components, or a function possessed by one component may be realized by a plurality of components. . Also, a plurality of functions possessed by a plurality of components may be realized by a single component, or a function realized by a plurality of components may be realized by a single component. Also, part of the configuration of the above embodiment may be omitted. Moreover, at least part of the configuration of the above embodiment may be added or replaced with respect to the configuration of the other above embodiment.
  • [Item 2] The analysis method according to item 1, After removing the binding substance that does not bind to the target substance, template nucleic acids (21, 21A, 21A-1) containing a sequence complementary to the 3′-side sequence of the nucleic acid region are combined with the binding substance. forming a body (63); Starting from the complex, amplifying the nucleic acid region by the action of a nucleic acid amplification enzyme; Analysis method. [Item 3] The analysis method according to item 2, Amplifying the nucleic acid region by rolling circle amplification, The template nucleic acid is a single-stranded circular nucleic acid (21A), Analysis method.
  • the analysis method according to any one of items 1 to 3 The phenomenon is at least one of generation of hydrogen ions accompanying nucleotide incorporation by amplification of the nucleic acid region and pyrophosphate accompanying nucleotide incorporation by amplification of the nucleic acid region. Analysis method.
  • the analysis method according to any one of items 1 to 4 When the phenomenon is the generation of pyrophosphate, the oxidation-reduction potential change caused by the reaction cascade driven by the generated pyrophosphate is detected using a potential measuring device (51), If the phenomenon is the production, consumption, or absorption of hydrogen ions, the pH meter (51) is used to detect the phenomenon. Analysis method.
  • [Item 6] The analysis method according to any one of items 1 to 5, Amplifying the nucleic acid region by an isothermal nucleic acid amplification method in which the reaction proceeds at a constant temperature without requiring a temperature cycle; Analysis method.
  • [Item 7] The analysis method according to any one of items 1 to 6, Amplifying the nucleic acid region by rolling circle amplification, The reaction solution for amplifying the nucleic acid region contains Tris buffer at a final concentration of 0 mM or more and 10 mM or less, pH of the reaction solution is 7.0 or more and 9.0 or less, detecting the phenomenon using a pH meter (51); Analysis method.
  • [Item 8] The analysis method according to any one of items 1 to 7, The target substance is a protein, sugar, lipid, nucleic acid, or low-molecular-weight compound, Analysis method.

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Abstract

本開示の分析方法では、核酸から成る核酸領域（１）を含み、目的物質（３３）と結合する活性を有する結合物質（１）と、前記目的物質を含む試料（３１）とを混合する。前記目的物質と結合していない前記結合物質を除去する。前記核酸領域を増幅する。前記核酸領域を増幅することで生じる現象を検出する。例えば、前記核酸領域の３'側配列に相補的な配列を含む鋳型核酸（２１、２１Ａ、２１Ａ－１）と、前記結合物質との複合体（６３）を形成する。前記複合体を起点とし、核酸増幅酵素の作用によって前記核酸領域を増幅する。

Description

分析方法 関連出願の相互参照
　本国際出願は、２０２１年１２月２日に日本国特許庁に出願された日本国特許出願第２０２１－１９６１８６号に基づく優先権を主張するものであり、日本国特許出願第２０２１－１９６１８６号の全内容を本国際出願に参照により援用する。
　本開示は分析方法に関する。
　特許文献１に、融合体を用いた目的物質の分析方法が開示されている。融合体は、結合物質及び標識物を備える。結合物質は、目的物質と結合する活性を有する。標識物は、観測可能な現象を生じる。
　目的物質の分析方法では、目的物質を含む試料と、融合体とを混合する。次に、目的物質と結合していない融合体を除去する。次に、目的物質と結合した融合体が生じる現象を検出する。
特開２０１９－３３７５０号公報
　融合体は、結合物質と標識物とを融合させることで得られる。融合体には以下の問題がある。
　融合体を製造するためには、結合物質と標識物とを混合し、然るべき条件下で融合させ、融合体を形成せずに残った結合物質単体及び標識物単体を除去する等の工程が必要になる。そのため、融合体の製造には、コストと時間がかかる。また、得られた融合体のロット間で、収量及び純度がばらつくことがある。
　また、融合体の形成により、結合物質の本来の機能が損なわれたり、標識物の本来の機能が損なわれたりすることがある。
　また、融合体は標識物を備えているため、融合体のサイズは結合物質のサイズより大きい。そのため、融合体は、目的物質の近傍に存在する物質からの干渉を受け、目的物質に結合できないことがある。
　本開示の１つでは、標識物を備えた融合体を使用しなくても目的物質を検出できる分析方法を提供する。
　本開示の１つは、目的物質の分析方法である。分析方法では、核酸から成る核酸領域を含み、前記目的物質と結合する活性を有する結合物質と、前記目的物質を含む試料とを混合する。前記目的物質と結合していない前記結合物質を除去する。前記核酸領域を増幅する。前記核酸領域を増幅することで生じる現象を検出する。
　本開示の１つである分析方法によれば、標識物を備えた融合体を使用しなくても目的物質を検出できる。
核酸アプタマーと一本鎖環状ＤＮＡとの構成を表す説明図である。 結合物質と一本鎖環状ＤＮＡとの構成を表す説明図である。 目的物質の分析方法を表す説明図である。 混合液Ｘ、Ｙにおける蛍光強度の経時的な変化を表すグラフである。 混合液Ｚにおける蛍光強度の経時的な変化を表すグラフである。 混合液ＺにおけるｐＨの低下量及び蛍光強度の変化により表現されるＤＮＡ増幅量を表すグラフである。 目的物質の分析方法の工程を表すフローチャートである。
　本開示の例示的な実施形態について図面を参照しながら説明する。
　１．結合物質１
　結合物質１は、目的物質３３と結合する活性を有する。目的物質３３とは、分析の対象となる物質である。目的物質３３は、例えば、タンパク質、糖、脂質、核酸、又は低分子化合物である。結合物質１は、核酸から成る核酸領域３を備える。
　結合物質１として、例えば、核酸製剤１Ａが挙げられる。核酸製剤１Ａとして、例えば、図１に示す核酸アプタマー１Ａ－１が挙げられる。核酸製剤１Ａ及び核酸アプタマー１Ａ－１は核酸領域３に対応する。
　核酸アプタマー１Ａ－１として、例えば、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー等が挙げられる。核酸アプタマー１Ａ－１は、例えば、インビトロプロセスにより化学的に合成できる。核酸アプタマー１Ａ－１の塩基数は、例えば、１０以上１００以下である。
　核酸アプタマー１Ａ－１は、例えば、核酸から成る単位が複数連結したものであってもよい。各単位の塩基数は、１０以上１００以下であることが好ましい。各単位の塩基数が１００以下である場合、目的物質３３が他の核酸アプタマー１Ａ－１や他の物質に接近していても、核酸アプタマー１Ａ－１は、他の核酸アプタマー１Ａ－１や他の物質からの干渉を受け難く、目的物質３３に結合し易い。
　核酸アプタマー１Ａ－１の配列は、ＤＮＡ配列であってもよいし、ＲＮＡ配列であってもよいし、ＤＮＡとＲＮＡとの混合配列であってもよい。
　核酸アプタマー１Ａ－１は、目的物質３３と結合する活性、ハイブリダイズ特性、及び伸長特性を損なわない限り、修飾核酸や核酸アナログをさらに含んでいてもよい。図１に示す核酸アプタマー１Ａ－１の３’末端領域９は、鋳型核酸２１の一部に相補的な塩基配列を含む。３’末端領域９とは、核酸アプタマー１Ａ－１のうち、３’末端の側にある領域である。３’末端領域９は、塩基数が１０以上３０以下の塩基配列を含むことが好ましい。３’末端領域９の塩基配列は特に限定されない。３’末端領域９におけるＧＣ含量は３０％以上７０％以下であることが好ましい。
　結合物質１は、例えば、図２に示すように、核酸領域３と、非核酸製剤５とを人工的に連結した結合物質１Ｂである。
　非核酸製剤５として、例えば、タンパク質製剤等が挙げられる。タンパク質製剤として、例えば、高分子タンパク質製剤、低分子タンパク質製剤が挙げられる。高分子タンパク質製剤として、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等が挙げられる。低分子タンパク質製剤として、例えば、フラグメント抗体、一本鎖抗体、ディアボディ（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）、ＶＨＨ、ペプチドアプタマー等が挙げられる。
　低分子タンパク質製剤を構成するアミノ酸の数は、例えば、５以上２００以下である。アミノ酸の数が２００以下である場合、目的物質３３が他の低分子タンパク質製剤や他の物質に接近していても、低分子タンパク質製剤は、他の低分子タンパク質製剤や他の物質からの干渉を受け難く、目的物質３３に結合し易い。
　低分子タンパク質製剤は、例えば、アミノ酸から成る単位が複数連結したものであってもよい。各単位におけるアミノ酸の数は、５以上２００以下であることが好ましい。各単位におけるアミノ酸の数が２００以下である場合、目的物質３３が他の物質に接近していても、低分子タンパク質製剤は、他の物質からの干渉を受け難く、目的物質３３に結合し易い。高分子タンパク質製剤を構成するアミノ酸の数は、例えば、２００以上である。
　核酸領域３の配列は、ＤＮＡ配列であってもよいし、ＲＮＡ配列であってもよいし、ＤＮＡとＲＮＡとの混合配列であってもよい。核酸領域３は、結合物質１Ｂが目的物質３３と結合する活性、ハイブリダイズ特性、及び伸長特性を損なわない限り、修飾核酸や核酸アナログをさらに含んでいてもよい。
　核酸領域３の塩基数及び配列は特に制限されない。核酸領域３の塩基数は１５以上４０以下であることが好ましい。図２に示す核酸領域３の３’末端領域１９は、鋳型核酸２１の一部に相補的な塩基配列を含む。３’末端領域１９とは、核酸領域３のうち、３’末端の側にある領域である。
　３’末端領域１９は、塩基数が１０以上３０以下の塩基配列を含むことが好ましい。３’末端領域１９の塩基配列は特に限定されない。３’末端領域１９におけるＧＣ含量は３０％以上７０％以下であることが好ましい。
　図２に示すように、核酸領域３の５’末端は、例えば、非核酸製剤５との人工的な連結のために、化学置換基１１で化学修飾される。
　非核酸製剤５と核酸領域３とを人工的に連結する方法として、例えば、非核酸製剤５の化学置換基１３と核酸領域３の化学置換基１１とを化学結合させる方法が挙げられる。
　化学置換基１１、又は化学置換基１３として、例えば、一級アミン、アジド、アルキン、ジベンゾシクロオクチン、ビシクロノニン、2-プロピニル、2´-O-プロパルギル、チオール、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、N-ヒドロキシスクシンイミド、マレイミド等が挙げられる。
　２．鋳型核酸２１について
　鋳型核酸２１は、図１に示す核酸アプタマー１Ａ－１の３’末端領域９、又は、図２に示す核酸領域３の３’末端領域１９に相補的な塩基配列を含む。
　例えば、図１に示すように、鋳型核酸２１と核酸アプタマー１Ａ－１とは、塩基対６１を形成することによりハイブリダイゼーションし、複合体６３を形成する。例えば、図２に示すように、鋳型核酸２１と核酸領域３とは、塩基対６１を形成することによりハイブリダイゼーションし、複合体６３を形成する。鋳型核酸２１における全塩基数は、５０以上１００以下であることが好ましい。
　鋳型核酸２１として、例えば、一本鎖環状核酸２１Ａが挙げられる。一本鎖環状核酸２１Ａとして、例えば、図１及び図２に示す一本鎖環状ＤＮＡ２１Ａ－１が挙げられる。一本鎖環状ＤＮＡ２１Ａ－１は、一本鎖直鎖ＤＮＡを環状化することによって得られる。一本鎖直鎖ＤＮＡの環状化は、例えば、CircLigase（Ｌｕｃｉｇｅｎ社）、CircLigase II（Ｌｕｃｉｇｅｎ社）、Ｔ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ　（ＮＥＢ社、その他各社）等のＤＮＡリガーゼを用いて行うことができる。
　３．目的物質３３の分析方法
　目的物質３３の分析方法は、例えば、以下の手順で実施することができる。図３のＳＴＥＰ１に示すように、試料３１を用意する。試料３１は、目的物質３３と、結合体形成用反応液３５とを含む。目的物質３３は、結合体形成用反応液３５の中に存在する。
　次に、図３のＳＴＥＰ２に示すように、試料３１と結合物質１とを混合する。結合物質１は、例えば、図１に示す核酸アプタマー１Ａ－１、又は、図２に示す結合物質１Ｂである。その結果、結合体形成用反応液３５の中で、目的物質３３と結合物質１とが共存する。結合物質１の少なくとも一部と、目的物質３３とが結合し、結合体６５が形成される。
　次に、結合物質１のうち、目的物質３３と結合していない結合物質１を除去する。また、結合体形成用反応液３５も除去する。
　次に、図３のＳＴＥＰ３に示すように、結合体形成用反応液３５に代えて、核酸増幅用反応液３９を加える。核酸増幅用反応液３９は、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、鋳型核酸２１、及び、核酸増幅用反応液３９における公知の成分を含む。鎖置換型ＤＮＡ合成酵素として、例えば、ｐｈｉ２９　ポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、Ｖｅｎｔ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ、Ｂｓｔ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ等が挙げられる。鎖置換型ＤＮＡ合成酵素は、核酸増幅酵素に対応する。
　核酸増幅用反応液３９の組成は、検出したい現象等に応じて適宜調整することができる。現象とは、図１に示す３’末端領域９、又は図２に示す３’末端領域１９を増幅することで生じる現象である。例えば、核酸増幅用反応液３９における緩衝液のモル濃度やｐＨを調整することができる。核酸増幅用反応液３９を加えた後は、目的物質３３と、目的物質３３に結合した結合物質１とは、核酸増幅用反応液３９の中に存在する。
　鋳型核酸２１に含まれる相補配列の作用により、結合物質１と鋳型核酸２１との塩基対６１が形成され、複合体６３が形成される。複合体６３を起点とし、核酸増幅酵素の作用によって、核酸増幅が起こる。核酸増幅とは、結合物質１に含まれる、図１に示す３’末端領域９、又は図２に示す３’末端領域１９を増幅することである。
　鋳型核酸２１が一本鎖環状ＤＮＡ２１Ａ－１である場合、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素の作用により、ローリングサークル増幅（Rolling circle amplification；ＲＣＡ）による核酸増幅が起こる。
　ローリングサークル増幅による核酸増幅は、等温下で行うことができる。鎖置換型ＤＮＡ合成酵素としてｐｈｉ２９　ポリメラーゼが使用される場合、３０℃以上４０℃以下の一定温度で、核酸増幅の反応を進行させることが好ましい。核酸増幅により、増幅核酸４３が生じる。
　ローリングサークル増幅により核酸領域を増幅する場合、核酸増幅用反応液３９は、トリス緩衝液を０ｍＭ以上１０ｍＭ以下の終濃度で含むことが好ましい。また、ローリングサークル増幅により核酸領域を増幅する場合、核酸増幅用反応液３９のｐＨは７．０以上９．０以下であることが好ましい。核酸増幅用反応液３９の組成及びｐＨを上記のとおりにした場合、核酸増幅用反応液３９におけるｐＨの変化を容易に検出することができる。
　核酸増幅として、等温核酸増幅が好ましい。等温核酸増幅として、ローリングサークル増幅法に加えて、ループ介在等温増幅法（Loop-mediated isothermal amplification；ＬＡＭＰ）、全ゲノム増幅法（Whole Genome Amplification；ＷＧＡ）、多置換増幅法（Multiple Displacement Amplification；ＭＤＡ）、ニッキング酵素増幅法（Nicking Endonuclease Amplification Reaction；ＮＥＡＲ）等が挙げられる。
　等温核酸増幅は、昇温、降温等の温度サイクルを必要とせず、一定温度で反応が進行するため、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase chain reaction；ＰＣＲ）と比べて、簡易検出法への応用が容易である。
　核酸増幅用反応液３９は、例えば、核酸検出試薬を含む。核酸検出試薬として、例えば、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＩＩ等が挙げられる。核酸増幅用反応液３９が核酸検出試薬を含む場合、核酸増幅が生じたとき、核酸増幅用反応液３９は、特定の波長の光により励起され、蛍光を発する。蛍光は、核酸領域を増幅することで生じる現象に対応する。蛍光の強度は、目的物質３３と結合している結合物質１の量が多いほど、高い。蛍光の強度は、試料３１に含まれる目的物質３３の量が多いほど、高い。
　例えば、インターカレーター型発光色素、マイナーグルーブ型発光色素を使用することで、核酸増幅と並行し、特定波長の蛍光の強度が増加する。特定波長の蛍光は、核酸領域３を増幅することで生じる現象に対応する。特定波長の蛍光の強度は、目的物質３３と結合している結合物質１の量が多いほど、高い。特定波長の蛍光の強度は、試料３１に含まれる目的物質３３の量が多いほど、高い。
　核酸増幅用反応液３９では、核酸増幅に伴ってヌクレオチドが増幅核酸４３に取り込まれ、水素イオンが生成する。水素イオンの生成量は、取り込まれるヌクレオチドの量に応じて多くなる。水素イオンが生成するため、核酸増幅用反応液３９のｐＨが低下する。水素イオンの生成、及びｐＨの低下は、核酸領域を増幅することで生じる現象に対応する。ｐＨの低下量は、目的物質３３と結合している結合物質１の量が多いほど、大きい。ｐＨの低下量は、試料３１に含まれる目的物質３３の量が多いほど、大きい。
　核酸増幅用反応液３９では、核酸増幅に伴ってヌクレオチドが増幅核酸４３に取り込まれ、ピロリン酸が生成する。ピロリン酸が駆動する反応カスケードを触媒する酵素群が核酸増幅用反応液３９に含まれる場合、生成したピロリン酸が駆動する反応カスケードにより、発光や酸化還元電位変化が生じる。ピロリン酸の生成、発光や酸化還元電位変化は、核酸領域を増幅することで生じる現象に対応する。発光や酸化還元電位変化の程度は、目的物質３３と結合している結合物質１の量が多いほど、大きい。発光や酸化還元電位変化の程度は、試料３１に含まれる目的物質３３の量が多いほど、大きい。
　核酸増幅により生じる現象が酸化還元電位の変化である場合、電位計測機を用いて、核酸増幅により生じる現象を検出することができる。核酸増幅により生じる現象が水素イオンの生産、消費、又は吸収である場合、ｐＨ計測機を用いて、核酸増幅により生じる現象を検出することができる。
　核酸増幅により生じる現象を、図３のＳＴＥＰ３に示す計測器５１により検出することができる。計測器５１は、例えば、受光デバイス、ｐＨ計測機、電位計測機等である。
　４．分析方法が奏する効果
　（１Ａ）結合物質１は、標識物を備えていなくてもよい。すなわち、本開示の分析方法によれば、標識物を備えた融合体を使用しなくても目的物質３３を検出できる。そのため、本開示の分析方法によれば、結合物質１の製造コスト及び製造に要する時間を低減できる。
　（１Ｂ）ＤＮＡアプタマーやＲＮＡアプタマー等の核酸製剤１Ａを結合物質１として使用する場合は、核酸製剤１Ａの塩基配列を、そのままの状態で改変することなく、核酸増幅のための鋳型又はプライマー部として利用できる。そのため、核酸製剤１Ａは、結合物質１としての機能と、現象を生じさせる機能とを兼ね備えることができる。
　（１Ｃ）結合物質１は、標識物を備えていない。そのため、結合物質１の本来の機能が喪失し難い。結合物質１の本来の機能とは、目的物質３３と結合する活性である。
　（１Ｄ）結合物質１は、標識物を備えていない。そのため、結合物質１のサイズが小さい。その結果、結合物質１が１つの目的物質３３に近づくとき、他の結合物質１からの干渉を受けにくい。そのため、結合物質１は、例えば、複合体を形成している複数の目的物質３３のそれぞれに結合することができる。その結果、本開示の分析方法を用いれば、目的物質３３の分析感度を向上させることができる。
　（１Ｅ）本開示の分析方法によれば、目的物質３３と結合物質１との結合体６５の形成に引き続いて核酸領域を増幅することで核酸増幅に伴う現象を検出できる。そのため、試料３１中の目的物質３３の濃度を計測することができる。
　（１Ｆ）本開示の分析方法では、例えば、核酸増幅の結果、核酸増幅用反応液３９中の水素イオン濃度が変化する。本開示の分析方法では、例えば、核酸増幅用反応液３９に生じる水素イオン濃度の変化を、ｐＨ計測機を用いて計測することができる。その場合、ｐＨ計測機の計測結果に基づき、目的物質３３を検出することができる。
　（１Ｇ）本開示の分析方法では、例えば、核酸増幅の結果、核酸増幅用反応液３９中のピロリン酸濃度が変化する。生成したピロリン酸が駆動する反応カスケードにより酸化還元電位変化が生じる。本開示の分析方法では、例えば、核酸増幅用反応液３９に生じるピロリン酸濃度の変化を、発光量変化や酸化還元電位変化に基づき計測することができる。その場合、発光量変化や酸化還元電位変化に基づき、目的物質３３を検出することができる。
　（１Ｈ）本開示の分析方法では、例えば、増幅核酸４３に吸着するインターカレーター型発光色素又はマイナーグルーブ型発光色素を使用することで、核酸増幅用反応液３９に生じる発色、発光、又は蛍光を計測することができる。本開示の分析方法では、例えば、核酸増幅用反応液３９に生じる発色、発光、又は蛍光の計測結果に基づき、目的物質３３を検出することができる。
　（１Ｉ）本開示の分析方法では、例えば、目的物質３３と結合した結合物質１のみが核酸増幅の対象となる。その場合、目的物質３３の濃度が高い程、核酸増幅用反応液３９に生じる発色強度、発光強度、蛍光強度、酸化還元電位変化量、又はｐＨ変化量が著しくなる。よって、本開示の分析方法によれば、免疫手法的に目的物質３３の濃度を定量分析することができる。
　（１Ｊ）本開示の分析方法では、例えば、核酸増幅を等温で行う。核酸増幅を等温で行う場合、一定温度で反応が進行する。核酸増幅を等温で行う場合は、昇温、降温等の温度サイクルを必要とするポリメラーゼ連鎖反応を行う場合に比べて、本開示の分析方法を簡易検出法へ応用することが容易である。
　５．実施例
（５－１）ＤＮＡアプタマーの製造
　配列番号１のＤＮＡ配列を有するＤＮＡアプタマーを製造した。ＤＮＡアプタマーは核酸アプタマー１Ａ－１に対応し、結合物質１に対応する。本実施例のＤＮＡアプタマーは、Anal. Chem. 2020, 92, 9895－9900に記載のＤＮＡアプタマーを一部改変したものであった。
　配列番号１のＤＮＡ配列は、配列番号２のＤＮＡ配列を含む。Anal. Chem. 2020, 92, 9895－9900の記載によれば、配列番号２のＤＮＡ配列は、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ-２のスパイク糖タンパク質におけるＲＢＤ領域（以下ではＲＢＤ領域とする）を目的物質３３とするＤＮＡアプタマーとして同定されたものである。
　配列番号１のＤＮＡ配列は、配列番号３のＤＮＡ配列を含む。配列番号３のＤＮＡ配列は、３’末端領域９に対応する。３’末端領域９は、一本鎖環状ＤＮＡ２１Ａ－１と相補させるために付与された領域である。
  本実施例のＤＮＡアプタマーをリン酸緩衝液に溶解し、ＤＮＡアプタマー溶液を製造した。ＤＮＡアプタマー溶液におけるＤＮＡアプタマーの終濃度は１０μＭであった。リン酸緩衝液は、界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％（ｖ／ｖ）含んでいた。リン酸緩衝液は、１３７ｍＭのＮａＣｌと、８．１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４と、２．７ｍＭのＫＣｌと、１．４７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４とを含んでいた。上記のリン酸緩衝液を以下では１ｘＰＢＳ／Ｔとする。
（５－２）一本鎖環状ＤＮＡの製造
　一本鎖ＤＮＡを用意した。一本鎖ＤＮＡの５‘末端をリン酸化修飾した。リン酸化修飾された一本鎖ＤＮＡは、配列番号４のＤＮＡ配列を有していた。
　リン酸化修飾された一本鎖ＤＮＡを、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＩＩの作用により環状化し、一本鎖環状ＤＮＡ２１Ａ－１を製造した。
　次に、環状化せずに残存した一本鎖ＤＮＡを、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｉで処理することにより分解し、一本鎖環状ＤＮＡ２１Ａ－１を精製抽出した。なお、一本鎖環状ＤＮＡ２１Ａ－１は、配列番号５のＤＮＡ配列を含んでいた。配列番号５のＤＮＡ配列は、ローリングサークル増幅で使用する第二のプライマー配列と等しい配列である。
（５－３）第１の検証
　ＤＮＡアプタマーを用いてローリングサークル増幅が進行するか否かを検証した。まず、混合液Ｘを製造した。混合液Ｘは、ｐｈｉ２９　ＤＮＡ　ポリメラーゼ（ＮＥＢ社、Ｍ０２６９）、及びＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ（ＴａＫａＲａ，５７６１Ａ）を含んでいた。混合液Ｘは、より詳しくは、１０ｘｐｈｉ２９　バッファー（ｂｕｆｆｅｒ）（終濃度１ｘ）と、ｄＮＴＰ　ｍｉｘ（終濃度０．２ｍＭ）と、ＢＳＡ（終濃度０．１ｍｇ／ｍＬ）と、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ（ＴａＫａＲａ，５７６１Ａ）（終濃度１ｘ）と、ＲＯＸ　dye （終濃度１ｘ）と、ｐｈｉ２９　ＤＮＡ　ポリメラーゼ（終濃度０．０５Ｕ／μＬ）と、前記（３－２）で製造した一本鎖環状ＤＮＡ（終濃度１００ｎＭ）と、第二のプライマー（終濃度１μＭ）と、前記（３－１）で製造したＤＮＡアプタマー（終濃度１０ｎＭ）と、純水とを含んでいた。混合液Ｘの体積は２０μＬであった。
　また、混合液Ｙを製造した。混合液Ｙは、基本的には混合液Ｘと同様の組成を有していたが、ＤＮＡアプタマーを含まず、代わりに純水を含んでいた。
　次に、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社）を用い、混合液Ｘ、Ｙをそれぞれ、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート中は、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉの蛍光カイネティクスをリアルタイム計測した。
　測定結果を図４に示す。混合液Ｘでは、蛍光強度の経時的な上昇が確認された。一方、混合液Ｙでは、蛍光強度の上昇が確認されなかった。
　上記の測定結果は、以下のことを示す。前記（５－１）で製造したＤＮＡアプタマーは、一本鎖環状ＤＮＡ２１Ａ－１と塩基対６１を形成することによりハイブリダイゼーションして複合体６３を形成する活性を有していた。また、形成された複合体６３を起点とし、ローリングサークル増幅が起き、ＤＮＡが増幅した。
（５－４）第２の検証
　ローリングサークル増幅によって、後述する混合液ＺのｐＨが低下するか否かを検証した。混合液Ｚを製造した。混合液Ｚの組成は、基本的には混合液Ｘと同一であったが、１０ｘｐｈｉ２９　バッファーの代わりに、２ｘマスターミックスを含んでいた。２ｘマスターミックスは、トリス（終濃度２ｍＭ）と、ＭｇＣｌ２（終濃度２０ｍＭ）と、（ＮＨ４）２ＳＯ４（終濃度２０ｍＭ）と、ＤＴＴ（終濃度８ｍＭ）とを含んでいた。
　２ｘマスターミックスには６種類があった。６種類の２ｘマスターミックスはｐＨのみにおいて異なっていた。６種類の２ｘマスターミックスのｐＨは、それぞれ、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、１０．０であった。ｐＨの測定方法は、ＮａＯＨによる滴定であった。混合液Ｚにも、配合する２ｘマスターミックスの種類の違いにより、６種類が存在した。
　次に、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社）を用い、６種類の混合液Ｚを、それぞれ３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート中は、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉの蛍光カイネティクスをリアルタイム計測した。
　測定結果を図５に示す。蛍光強度の経時的な上昇は、混合液Ｚに配合した２ｘマスターミックスのｐＨが７．０である場合に最も高く、次いで、７．５、８．０、８．５、９．０、１０．０の順で高かった。
　さらに、３７℃で３時間インキュベートした後の混合液ＺのｐＨを計測した。ｐＨの計測には、コンパクトｐＨメータ ＬＡＱＵＡｔｗｉｎ（堀場製作所、製品番号ｐＨ－３３Ｂ）を使用した。インキュベートする前の混合液ＺのｐＨから、インキュベートした後の混合液ＺのｐＨを差し引いた値をｐＨの低下量とした。
　ｐＨの低下量を図６に示す。ｐＨの低下量は、混合液Ｚに配合した２ｘマスターミックスのｐＨが７．０の場合に最も高く、次いで、７．５、８．５、９．０、８．０の順で高かった。
　上記の測定結果は、以下のことを示す。ＤＮＡアプタマーは、一本鎖環状ＤＮＡ２１Ａ－１と塩基対６１を形成することでハイブリダイゼーションして複合体６３を形成する活性を有していた。また、形成された複合体６３を起点とし、ローリングサークル増幅が起き、ＤＮＡが増幅した。ＤＮＡの増幅で起こるヌクレオチドの取り込みに伴い、水素イオンが生成し、混合液ＺのｐＨを低下させた。
（５－５）分析方法の実施
　目的物質３３として、Ｓｐｉｋｅ　Ｓ１－Ｈｉｓ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、製品番号４０５９１－Ｖ０８Ｈ）（以下、Ｓ１とする）を使用した。Ｓ１は、アミノ酸配列中にＲＢＤ領域を含むタンパク質である。前記（５－１）で製造したＤＮＡアプタマーは、Ｓ１に対し結合活性を有する。
　Ｓ１を０．１Ｍ炭酸緩衝液に溶解し、Ｓ１溶液を製造した。０．１Ｍ炭酸緩衝液のｐＨは９．６に調整されていた。Ｓ１溶液におけるＳ１の終濃度は、５μｇ／ｍＬと、１μｇ／ｍＬとの２種類であった。
　また、α－アミラーゼ（Ｌｅｅ　Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製品番号１２０－１７）を０．１Ｍ炭酸緩衝液に溶解し、α－アミラーゼ溶液を製造した。α－アミラーゼ溶液におけるα－アミラーゼの終濃度は５μｇ／ｍＬであった。前記（５－１）で製造したＤＮＡアプタマーは、α－アミラーゼに対し結合活性を有さない。
　次に、図７に示す手順で分析方法を実施した。分析方法において、ＤＮＡアプタマーと目的物質との結合後に駆動されるローリングサークル増幅により、反応液のｐＨが低下するか否かを検証した。
　まず、Ｓ１１において、ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートＨタイプ（住友ベークライト社、製品番号ＭＳ－８８９６Ｆ）のＥＬＩＳＡウェルに、目的物質を含む溶液を１００μＬ滴下して、４℃で一晩静置した。目的物質を含む溶液とは、Ｓ１溶液又はα－アミラーゼ溶液であった。目的物質とは、Ｓ１又はα－アミラーゼであった。このとき、目的物質はＥＬＩＳＡウェルに固着した。次に、目的物質が固着したＥＬＩＳＡウェルを、２００μＬの１ｘＰＢＳ／Ｔで洗浄した。洗浄は３回行った。
　次に、Ｓ１２において、ウシ血清由来アルブミン（富士フイルム和光純薬社、製品番号０１３－１５１０４）を、１ｘＰＢＳ／Ｔで溶解し、ＢＳＡ溶液を製造した。ウシ血清由来アルブミンを、以下ではＢＳＡとする。ＢＳＡ溶液におけるＢＳＡの濃度は３％（ｗ／ｖ）であった。目的物質が固着したＥＬＩＳＡウェルに、２００μＬのＢＳＡ溶液を滴下し、常温で２時間静置した。このとき、ブロッキングが行われた。ブロッキングが行われたＥＬＩＳＡウェルを、２００μＬの１ｘＰＢＳ／Ｔで洗浄した。洗浄は３回行った。
　次に、Ｓ１３において、前記（５－１）で製造したＤＮＡアプタマー溶液を、ブロッキングが行われたＥＬＩＳＡウェルに５０μＬ滴下し、常温で１時間静置した。このとき、Ｓ１４において、ＤＮＡアプタマーの一部と、Ｓ１とが結合し、結合体６５が形成された。
　次に、Ｓ１５において、ＥＬＩＳＡウェルを、２００μＬの１ｘＰＢＳ／Ｔで洗浄した。洗浄は３回行った。このとき、目的物質と結合していないＤＮＡアプタマーが除去された。
　次に、Ｓ１６において、ローリングサークル増幅のために、混合液Ｚのうち、配合した２ｘマスターミックスのｐＨが７．０であるものをＥＬＩＳＡウェルに滴下した。次に、Ｓ１７において、滴下した混合液Ｚを、３７℃で３時間インキュベートした。
　次に、Ｓ１８において、インキュベート後の混合液ＺのｐＨを計測した。ｐＨの計測には、コンパクトｐＨメータ ＬＡＱＵＡｔｗｉｎ（堀場製作所、製品番号ｐＨ－３３Ｂ）を使用した。ｐＨの測定結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　目的物質がＳ１である場合は、ＤＮＡアプタマーと目的物質との結合後に駆動されるローリングサークル増幅により、反応液のｐＨが低下した。よって、ｐＨの低下という現象を検出することで、Ｓ１を検出できた。一方、目的物質がα－アミラーゼである場合は、反応液のｐＨが低下しなかった。
　６．他の実施形態
　以上、本開示の実施形態について説明したが、本開示は上述の実施形態に限定されることなく、種々変形して実施することができる。
　（１）上記実施形態における１つの構成要素が有する複数の機能を、複数の構成要素によって実現したり、１つの構成要素が有する１つの機能を、複数の構成要素によって実現したりしてもよい。また、複数の構成要素が有する複数の機能を、１つの構成要素によって実現したり、複数の構成要素によって実現される１つの機能を、１つの構成要素によって実現したりしてもよい。また、上記実施形態の構成の一部を省略してもよい。また、上記実施形態の構成の少なくとも一部を、他の上記実施形態の構成に対して付加又は置換してもよい。
　（２）上述した分析方法の他、結合物質、結合物質の製造方法等、種々の形態で本開示を実現することもできる。
［本明細書が開示する技術思想］
［項目１］
　核酸から成る核酸領域（１Ａ、１Ａ－１、３）を含み、目的物質（３３）と結合する活性を有する結合物質（１、１Ａ、１Ａ－１、１Ｂ）と、前記目的物質を含む試料（３１）とを混合し、
　前記目的物質と結合していない前記結合物質を除去し、
　前記核酸領域を増幅し、
　前記核酸領域を増幅することで生じる現象を検出する、
　分析方法。
［項目２］
　項目１に記載の分析方法であって、
　前記目的物質と結合していない前記結合物質を除去した後、前記核酸領域の３’側配列に相補的な配列を含む鋳型核酸（２１、２１Ａ、２１Ａ－１）と、前記結合物質との複合体（６３）を形成し、
　前記複合体を起点とし、核酸増幅酵素の作用によって前記核酸領域を増幅する、
　分析方法。
［項目３］
　項目２に記載の分析方法であって、
　ローリングサークル増幅法により前記核酸領域を増幅し、
　前記鋳型核酸は一本鎖環状核酸（２１Ａ）である、
　分析方法。
［項目４］
　項目１～３のいずれか１項に記載の分析方法であって、
　前記現象は、前記核酸領域の増幅によるヌクレオチド取り込みに伴う水素イオンの生成、及び、前記核酸領域の増幅によるヌクレオチド取り込みに伴うピロリン酸のうちの少なくとも１つである、
　分析方法。
［項目５］
　項目１～４のいずれか１項に記載の分析方法であって、
　前記現象がピロリン酸の生成である場合、生成したピロリン酸が駆動する反応カスケードにより生じる酸化還元電位変化を、電位計測機（５１）を用いて検出し、
　前記現象が水素イオンの生産、消費、又は吸収である場合、ｐＨ計測機（５１）を用いて前記現象を検出する、
　分析方法。
［項目６］
　項目１～５のいずれか１項に記載の分析方法であって、
　温度サイクルを必要とせず、一定温度で反応が進行する等温核酸増幅法により前記核酸領域を増幅する、
　分析方法。
［項目７］
　項目１～６のいずれか１項に記載の分析方法であって、
　ローリングサークル増幅法により前記核酸領域を増幅し、
　前記核酸領域を増幅するときの反応液は、トリス緩衝液を０ｍＭ以上１０ｍＭ以下の終濃度で含み、
　前記反応液のｐＨは７．０以上９．０以下であり、
　ｐＨ計測機（５１）を用いて前記現象を検出する、
　分析方法。
［項目８］
　項目１～７のいずれか１項に記載の分析方法であって、
　前記目的物質は、タンパク質、糖、脂質、核酸、又は低分子化合物である、
　分析方法。

Claims (8)

  1. 核酸から成る核酸領域（１Ａ、１Ａ－１、３）を含み、目的物質（３３）と結合する活性を有する結合物質（１、１Ａ、１Ａ－１、１Ｂ）と、前記目的物質を含む試料（３１）とを混合し、
    　前記目的物質と結合していない前記結合物質を除去し、
    　前記核酸領域を増幅し、
    　前記核酸領域を増幅することで生じる現象を検出する、
    　分析方法。
  2. 　請求項１に記載の分析方法であって、
    　前記目的物質と結合していない前記結合物質を除去した後、前記核酸領域の３’側配列に相補的な配列を含む鋳型核酸（２１、２１Ａ、２１Ａ－１）と、前記結合物質との複合体（６３）を形成し、
    　前記複合体を起点とし、核酸増幅酵素の作用によって前記核酸領域を増幅する、
    　分析方法。
  3. 　請求項２に記載の分析方法であって、
    　ローリングサークル増幅法により前記核酸領域を増幅し、
    　前記鋳型核酸は一本鎖環状核酸（２１Ａ）である、
    　分析方法。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の分析方法であって、
    　前記現象は、前記核酸領域の増幅によるヌクレオチド取り込みに伴う水素イオンの生成、及び、前記核酸領域の増幅によるヌクレオチド取り込みに伴うピロリン酸のうちの少なくとも１つである、
    　分析方法。
  5. 　請求項１又は２に記載の分析方法であって、
    　前記現象がピロリン酸の生成である場合、生成したピロリン酸が駆動する反応カスケードにより生じる酸化還元電位変化を、電位計測機（５１）を用いて検出し、
    　前記現象が水素イオンの生産、消費、又は吸収である場合、ｐＨ計測機（５１）を用いて前記現象を検出する、
    　分析方法。
  6. 　請求項１又は２に記載の分析方法であって、
    　温度サイクルを必要とせず、一定温度で反応が進行する等温核酸増幅法により前記核酸領域を増幅する、
    　分析方法。
  7. 　請求項１又は２に記載の分析方法であって、
    　ローリングサークル増幅法により前記核酸領域を増幅し、
    　前記核酸領域を増幅するときの反応液は、トリス緩衝液を０ｍＭ以上１０ｍＭ以下の終濃度で含み、
    　前記反応液のｐＨは７．０以上９．０以下であり、
    　ｐＨ計測機（５１）を用いて前記現象を検出する、
    　分析方法。
  8. 　請求項１又は２に記載の分析方法であって、
    　前記目的物質は、タンパク質、糖、脂質、核酸、又は低分子化合物である、
    　分析方法。
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