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WO2023199929A1 - エクオールの製造方法 - Google Patents

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WO2023199929A1
WO2023199929A1 PCT/JP2023/014802 JP2023014802W WO2023199929A1 WO 2023199929 A1 WO2023199929 A1 WO 2023199929A1 JP 2023014802 W JP2023014802 W JP 2023014802W WO 2023199929 A1 WO2023199929 A1 WO 2023199929A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
equol
gas
less
microorganisms
medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2023/014802
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
英城 村田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Daicel Corp
Original Assignee
Daicel Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Daicel Corp filed Critical Daicel Corp
Priority to JP2023567011A priority Critical patent/JPWO2023199929A1/ja
Priority to US18/855,898 priority patent/US20250250597A1/en
Publication of WO2023199929A1 publication Critical patent/WO2023199929A1/ja
Priority to JP2024111381A priority patent/JP2024138434A/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing equol using a microorganism capable of producing equol.
  • Isoflavones which are abundant in leguminous plants such as soybeans and kudzu, are a class of polyphenols, and are flavonoids that have isoflavones as their basic skeleton. Recent research has shown that isoflavones have female hormone effects (estrogen) and antioxidant effects, and that ingesting isoflavones can lead to breast cancer, prostate cancer, osteoporosis, hypercholesterolemia, heart disease, menopausal symptoms, etc. It has been shown that it has a preventive effect.
  • Isoflavones exist, for example, in soybeans in the form of glycosides covalently bonded to sugars, such as daidzin, glycitin, and genistin, and in very small amounts in the form of aglycones. Only. Some of these glycosides are malonylated or acetylated. When these glycosides enter the human or animal body, they are converted into daidzein, glycitein, and genistein, respectively, by the action of digestive enzymes or ⁇ -glucosidase, an enzyme produced by intestinal bacteria. Become. Furthermore, it is known that daidzein is enzymatically converted to O-desmethylangolensin (O-DMA) or equol via dihydrodaidzein by the action of intestinal bacteria. It is being
  • Equol is known to have the highest estrogenic activity among these metabolites.
  • isoflavones there are individual differences in the metabolism of isoflavones, and as mentioned above, few people have intestinal bacteria that have the ability to ferment daidzein and produce equol, and the prevalence rate among Japanese people is approximately It has been revealed that this rate is 50%, and about 30% for Westerners. Therefore, there has been a problem in that people who do not have equol-producing bacteria cannot produce equol in their bodies even if they ingest leguminous foods such as soybeans.
  • Non-Patent Document 1 a mixture of four types of anaerobic microorganisms in a hydrogen gas phase
  • Non-Patent Document 1 a mixture of four types of anaerobic microorganisms in a hydrogen gas phase
  • Patent Document 5 Since this is a culture of anaerobic microorganisms, static culture is usually performed (Patent Document 5).
  • Patent Document 6 On the other hand, regarding a method in which equol can be produced more effectively and practically depending on fermentation conditions and fermentation methods, when the mass percent concentration of hydrogen gas in the gas phase in which fermentation is carried out is 40 to 100% (particularly 100%), There is a report that the production efficiency of equol is dramatically increased in case (Patent Document 6).
  • the hydrogen concentration range in which an explosion occurs is from a lower limit of hydrogen concentration of 4.1% to an upper limit of 74.2%.
  • the present invention was made in view of this situation, and its purpose is to provide a method for effectively producing equol using microorganisms at a lower hydrogen concentration that is safer than before. It's about doing.
  • the present inventor has obtained at least one type of equol raw material selected from the group consisting of daidzein glycosides, daidzein, and dihydrodaidzein by a microorganism that has the ability to assimilate the equol raw material and produce equol, and one type of equol containing hydrogen.
  • a microorganism that has the ability to assimilate the equol raw material and produce equol, and one type of equol containing hydrogen.
  • At least one type of equol raw material selected from the group consisting of daidzein glycosides, daidzein, and dihydrodaidzein is converted into one or more types of hydrogen-containing equol raw material by a microorganism that has the ability to assimilate the equol raw material and produce equol.
  • a method for producing equol comprising: fermenting in a gas phase consisting of gas; In the fermentation step, when a fermenter with a culture solution volume of 100 L or more is used, i) The fermenter is stirred with a stirring power of 0.1 kW/kL or more, preferably 0.2 kW/kL or more, more preferably 0.4 kW/kL or more, and/or ii) The gas is stirred with a pore diameter of 2 mm or less.
  • the above method characterized in that the introduction is carried out using a sparger, preferably with a pore diameter of 1 mm or less, more preferably 0.5 mm or less.
  • the hydrogen concentration of the gas is preferably 30% or less, preferably 10% or less, and more preferably 4% or less.
  • the present invention in the production of equol using microorganisms, it is possible to provide a method that can effectively produce equol at a lower hydrogen concentration that is safer than conventional methods.
  • the present invention makes it possible to realize an efficient method for producing equol using daidzein as a raw material using microorganisms, especially anaerobic microbial fermentation, at a low hydrogen concentration that is safe even on an industrial scale, and provides a technology for mass production of equol. can do.
  • the method of the present invention makes it possible to produce equol at low cost and in large quantities, making it possible to supply equol to more people. Equol is thought to be able to prevent breast cancer, prostate cancer, osteoporosis, hypercholesterolemia, heart disease, menopausal disorders, etc. by ingesting it as it is as food, drink, medicine, etc.
  • the present invention provides at least one type of equol raw material selected from the group consisting of daidzein glycosides, daidzein, and dihydrodaidzein, which is produced by one or more types of hydrogen-containing microorganisms having the ability to assimilate the equol raw material and produce equol.
  • a method for producing equol comprising: a step of fermenting in a gas phase consisting of a gas, the method comprising: In the fermentation step, using a fermenter with a culture solution volume of 100 L or more, i) The fermenter is stirred with a stirring power of 0.1 kW/kL or more, preferably 0.2 kW/kL or more, more preferably 0.4 kW/kL or more, and/or ii) The gas is stirred with a pore diameter of 2 mm or less. , preferably with a pore diameter of 1 mm or less, more preferably with a pore diameter of 0.5 mm or less.
  • the present invention provides a method for producing equol, which includes the above fermentation step.
  • the method of the present invention may include steps other than the fermentation step. Examples include, but are not limited to, a step of preparing an equol raw material, a step of recovering the obtained equol, and the like. Examples of processes other than the fermentation process include, but are not limited to, a sterilization process for sterilizing microorganisms used in fermentation.
  • At least one equol raw material selected from the group consisting of daidzein glycosides, daidzein, and dihydrodaidzein is used as a raw material.
  • the form of the equol raw material does not matter as long as it can literally be used as a raw material for equol.
  • the equol raw material may be in any form as long as it contains at least one selected from the group consisting of daidzein glycosides, daidzein, and dihydrodaidzein.
  • daidzein glycosides themselves, daidzein itself, or dihydrodaidzein itself, and products containing them, such as soybeans, soybean processed products, soybean hypocotyls, soybean hypocotyl processed products, such as soybean extracts, soybean embryos.
  • products containing them such as soybeans, soybean processed products, soybean hypocotyls, soybean hypocotyl processed products, such as soybean extracts, soybean embryos.
  • Examples include cox extract and purified soybean hypocotyl extract, and specifically, commercially available isoflavones may be used.
  • the method of the present invention uses microorganisms that have the ability to assimilate equol raw materials and produce equol.
  • the "ability to assimilate equol raw materials and produce equol” is sometimes simply referred to as "equol production ability" in this specification.
  • the equol-assimilating microorganism used in the method of the present invention is not particularly limited as long as it has the ability to produce equol from the above-mentioned equol raw material.
  • microorganisms include anaerobic microorganisms.
  • the anaerobic microorganism can, for example, produce equol at a temperature around 37°C (eg 30-42°C).
  • ethyl acetate For example, add ethyl acetate to the culture solution, stir vigorously, centrifuge, and remove the ethyl acetate layer. If necessary, the same operation can be performed on the same culture solution several times, and the ethyl acetate layers can be combined to obtain an equol extract.
  • This extract is concentrated to dryness using an evaporator under reduced pressure, and then dissolved in methanol. This can be filtered using a membrane such as a polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane to remove insoluble materials, and the resultant sample can be used as a high performance liquid chromatography measurement sample. Examples of conditions for high performance liquid chromatography include, but are not limited to, the following.
  • microorganisms having the ability to produce equol include, but are not limited to, microorganisms classified into the following genera. Genus Adlercreutzia Genus Bacteroides Genus Bifidobacterium Genus Clostridium Genus Eggerthella Genus Enterococcus Genus Enterorhabdus Genus Eubacterium Genus Finegoldia Genus Lactobacillus Genus Lactococcus Genus Paraeggerthella Genus Pediococcus Genus Proteus Genus Sharpea Genus Slackia Genus Streptococcus Genus Veillonella
  • microorganisms having the ability to produce equol include, but are not limited to, the following microorganisms.
  • Adlercreutzia equolifaciens subsp. celatus Adlercreutzia equolifaciens subsp. equolifaciens Bacteroides ovatus Bifidobacterium breve Bifidobacterium longum Clostridium sp. Eggerthella sp. Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Enterorhabdus mucosicola Eubacterium sp.
  • microorganisms classified in the family Eggerthellaceae for example, microorganisms classified in the family Eggerthellaceae, microorganisms classified in the family Bifidobacteriaceae, microorganisms classified in the family Clostridiaceae, and microorganisms classified in the family Clostridiaceae.
  • microorganisms classified in the family Coriobacteriaceae microorganisms classified in the family Enterococceae
  • microorganisms classified in the family Eubacteriaceae and microorganisms classified in the family Morganellaceae.
  • Microorganisms microorganisms classified in the family Peptoniphilaceae, microorganisms classified in the family Lactobacillaceae, microorganisms classified in the family Streptococceae, microorganisms classified in the family Veillonellaceae. Examples include classified microorganisms and related microorganisms.
  • Adlercreutzia Bacteroides, Bifidobacterium, Clostridium, Coriobacterium, Egasella, Enterococcus, Eubacterium, Finegordia, Lactobacillus, Lactococcus
  • the microorganisms are preferably classified into the genus Paraegacella, Pediococcus, Proteus, Sharpea, Thracia, Streptococcus, Veilonea, or related microorganisms thereof. More preferably, Adrecrautia aequorifaciens subsp. ceratus, Adrecrautia aequorifaciens subsp.
  • aequorifaciens Bacteroides obatus, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum , Clostridium sp., Egasella sp., Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterorhabdus mucosicola, Eubacterium sp., Finegordia magna, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus intestinalis, Lactobacillus - Mucosae, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sp., Lactococcus garubiae, Lactococcus sp., Paraegasera sp., Pediococcus pentosaceus, Proteus mirabilis, Sharpea azabu Preferred are Thracia ensis, Thracia aequor
  • any of the microorganisms described below or related bacteria having similar species properties to these microorganisms can be particularly cited as more preferable anaerobic microorganisms.
  • Adlercreutzia equolifaciens subsp. celatus DSM 18785 strain
  • Adlercreutzia equolifaciens subsp. equolifaciens DSM 19450 strain
  • anaerobic microorganism can be obtained from the depository institution indicated by its deposit number. Each accession number indicates that the anaerobic microorganism has been deposited with the following depositary institution.
  • FERM International Patent Organism Depositary http://unit.aist.go.jp/pod/ci/index.html
  • DSM German Collection of Microorganisms and Cell Cultures http://www.dsmz.de/ KCCM Korean Culture Center of Microorganisms
  • anaerobic microorganisms capable of producing equol are cultured under conditions suitable for producing equol.
  • conditions suitable for equol production refer to conditions that maintain the survival and activity of anaerobic microorganisms having equol production activity. More specifically, it means that gas phase conditions (anaerobic conditions) that allow the survival of anaerobic microorganisms are maintained, and nutrients are provided to support the activity and proliferation of the anaerobic microorganisms.
  • gas phase conditions anaerobic conditions
  • Various medium compositions suitable for the survival of anaerobic microorganisms are known.
  • an appropriate medium composition for the above-mentioned anaerobic microorganisms capable of producing equol for example, BHI medium manufactured by Difco, the medium used in Examples, etc. can be used, but the medium is not limited thereto.
  • a water-soluble organic substance can be added to the culture medium used in the present invention as a carbon source.
  • water-soluble organic substances include, but are not limited to, the following compounds.
  • Sugars such as sorbose, fructose, glucose
  • Alcohols such as methanol
  • Organic acids such as valeric acid, butyric acid, propionic acid, acetic acid, and formic acid, or salts thereof.
  • the concentration of organic matter added to the medium as a carbon source can be adjusted as appropriate to efficiently grow anaerobic microorganisms in the medium.
  • a nitrogen source can be added to the medium.
  • various nitrogen compounds that can be used in normal fermentation can be used as the nitrogen source.
  • Preferred inorganic nitrogen sources are ammonium salts and nitrates. More preferred inorganic nitrogen sources are ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium hydrogen phosphate, potassium nitrate and sodium nitrate.
  • preferred organic nitrogen sources include amino acids, yeast extract, peptones, meat extract, liver extract, and digested serum powder. More preferred organic nitrogen sources are arginine, cysteine, cystine, citrulline, lysine, yeast extract, and peptones.
  • organic or inorganic substances suitable for producing equol can also be added to the medium.
  • the growth and activity of anaerobic microorganisms can be enhanced in some cases by adding cofactors such as vitamins and inorganic compounds such as various salts to the culture medium.
  • cofactors such as vitamins and inorganic compounds such as various salts.
  • examples of microbial growth cofactors derived from inorganic compounds, vitamins, and animals and plants include the following.
  • the medium can be liquid, semi-solid, or solid.
  • a preferred medium form is a liquid medium.
  • the medium of the present invention can contain dextrins. If anaerobic microorganisms are cultured in a medium containing dextrins, a liquid containing equol and dextrins can be prepared without contacting the culture with dextrins again after culturing. Dextrins can be added to the medium before or during the cultivation of the microorganism.
  • the culture medium of the present invention can contain an antifoaming agent, preferably soybean oil, more preferably soybean oil containing vitamin E.
  • microorganisms particularly anaerobic microorganisms
  • a continuous fermentation system can also be used, which is capable of continuously supplying the medium and substrate gas, and is equipped with a mechanism for recovering the culture.
  • anaerobic microorganisms when using anaerobic microorganisms, it is preferable to prevent oxygen from entering the fermenter.
  • a commonly used fermenter can be used as is.
  • An anaerobic atmosphere can be created by replacing oxygen mixed into the fermenter with an inert gas such as nitrogen.
  • the method of the invention in particular the fermentation step of the method of the invention, is carried out in a gas phase consisting of one or more gases containing hydrogen.
  • the gas constituting the gas phase is not particularly limited as long as it is composed of one or more types of gas containing hydrogen, but preferably contains hydrogen and one or more types of gas other than hydrogen.
  • gases other than hydrogen include carbon dioxide, nitrogen, carbon monoxide, etc., but are not particularly limited.
  • the hydrogen concentration of the gas is preferably 30% or less, preferably 10% or less, and more preferably 4% or less.
  • the size of the fermenter is not particularly limited as long as it has a culture solution of 100 L or more.
  • the power of the stirrer is not particularly limited as long as it is 0.1 kW/kL or more.
  • the pore diameter of the sparger is not particularly limited.
  • the pore diameter of the sparger that supplies the gas is 2 mm or less, preferably 1 mm or less, more preferably 0.1 mm or less. It is preferably 5 mm or less.
  • the pore diameter of the sparger that supplies the gas is preferably 2 mm or less, preferably 1 mm or less, and more preferably 0.5 mm or less. Additionally, a draft tube can be installed if necessary.
  • the amount of aeration of the mixed gas constituting the gas phase into the fermenter is 0.001 to 2.0 V/V/M gas amount/liquid amount/min. .
  • the temperature of the fermenter is not particularly limited, but it is preferably a temperature at which the above-mentioned microorganisms can exhibit equol production ability, for example, 30°C to 40°C, preferably 33°C to 38°C. It is better.
  • microorganisms can be cultured under normal pressure, but when pressurized, the pressurizing conditions are not particularly limited as long as the microorganisms can grow.
  • Preferred pressurizing conditions include, but are not limited to, a range of 0.2 MPa or less.
  • the fermentation time can be appropriately set depending on the amount of equol produced and the remaining amount of isoflavones. Examples include, but are not limited to, 8 to 120 hours, preferably 12 to 72 hours, particularly preferably 16 to 60 hours.
  • the fermented culture obtained by the culture method of the present invention can be used in a solid form by heat drying, spray drying, or freeze drying, if necessary.
  • the heat drying process can be performed using, for example, a rotary drum dryer
  • the spray drying process can be performed using, for example, a spray dryer
  • the freeze drying process can be performed using a freeze dryer. Any drying method may be used as long as it is capable of drying liquids.
  • the dried fermentation culture may be subjected to pulverization treatment, if necessary.
  • Example 1 (Preculture 1) Dispense the medium with the composition shown in Table 1 and adjusted to pH 6.9 into 10 mL 18 mm test tubes for anaerobic microbial culture (manufactured by Sanshin Kogyo), replace the gas phase with nitrogen, and attach a butyl rubber stopper and a plastic cap. and sterilized at 121°C for 15 minutes.
  • This medium was inoculated with Adlercreutzia equolifaciens subsp. celatus DSM 18785 strain, and after replacing the gas phase with hydrogen gas passed through a sterile filter for at least 2 minutes,
  • a preculture solution 1 was prepared by performing shaking culture at 200 spm at 200° C. for 18 hours.
  • Preculture 2 15 L of a medium having the composition shown in Table 1 and adjusted to pH 6.9 was placed in a 30 L fermenter, heated at 121° C. for 15 minutes, and sterilized with high-pressure steam. This medium was inoculated with the above-mentioned preculture solution 1, gas replaced with a hydrogen/nitrogen mixed gas, and cultured at 37° C. for 18 hours to prepare preculture solution 2.
  • Example 2 From Example 1, it was confirmed that when the gas phase hydrogen concentration was 30% or less, the equol concentration was significantly improved by increasing the stirring power to 0.1 kW/kL or more. Furthermore, it was confirmed that when no stirring power was applied, the equol concentration was improved by setting the sparger hole diameter to 2 mm or less.
  • Example 2 (Preculture 1) Dispense the medium with the composition shown in Table 1 and adjusted to pH 6.9 into 10 mL 18 mm test tubes for anaerobic microbial culture (manufactured by Sanshin Kogyo), replace the gas phase with nitrogen, and attach a butyl rubber stopper and a plastic cap. and sterilized at 121°C for 15 minutes.
  • This medium was inoculated with Adlercreutzia equolifaciens subsp. celatus DSM 18785 strain, and after replacing the gas phase with hydrogen gas passed through a sterile filter for at least 2 minutes, A preculture solution 1 was prepared by performing shaking culture at 200 spm at 200° C. for 18 hours.
  • Preculture 2 15 L of a medium having the composition shown in Table 1 and adjusted to pH 6.9 was placed in a 30 L fermenter, heated at 121° C. for 15 minutes, and sterilized with high-pressure steam. This medium was inoculated with the above-mentioned preculture solution 1, gas replaced with a hydrogen/nitrogen mixed gas, and cultured at 37° C. for 18 hours to prepare preculture solution 2.
  • Preculture 3 100 L of a medium having the composition shown in Table 1 and adjusted to pH 6.9 was placed in a 200 L fermenter, heated at 121° C. for 15 minutes, and sterilized with high pressure steam. This medium was inoculated with the above-mentioned preculture solution 2, gas replaced with hydrogen/nitrogen mixed gas, and cultured at 37° C. for 18 hours to prepare preculture solution 3.
  • Example 3 (Preculture 1) Dispense the medium with the composition shown in Table 1 and adjusted to pH 6.9 into 10 mL 18 mm test tubes for anaerobic microbial culture (manufactured by Sanshin Kogyo), replace the gas phase with nitrogen, and attach a butyl rubber stopper and a plastic cap. and sterilized at 121°C for 15 minutes. Eggerthella sp. DC 3215 strain was inoculated into this medium, and after replacing the gas phase with hydrogen gas passed through a sterile filter for 2 minutes or more, culture was performed with shaking at 37°C and 200 spm for 36 hours. Preculture solution 1 was prepared.
  • Preculture 2 15 L of a medium having the composition shown in Table 1 and adjusted to pH 6.9 was placed in a 30 L fermenter, heated at 121° C. for 15 minutes, and sterilized with high-pressure steam. This medium was inoculated with the above-mentioned preculture solution 1, gas replaced with hydrogen/nitrogen mixed gas, and cultured at 37° C. for 36 hours to prepare preculture solution 2.
  • main culture Add 0.5 g/L of daidzein and 3 g/L of L-arginine to the composition shown in Table 1 and adjust the pH to 6.9. 100 L of the medium was placed in a 200 L fermenter, heated at 121°C for 15 minutes, and then heated under high pressure. Steam sterilized. This culture medium was inoculated with the above-mentioned preculture solution 2, and the gas was replaced with a nitrogen mixed gas having a hydrogen concentration of 4%, and the mixed gas was aerated with a sparger having a pore diameter of 3 mm, while stirring was performed using the respective motive power. Culture was performed at 37° C. for 72 hours, and the equol concentration in the main culture solution was analyzed by HPLC method.
  • Example 4 (Preculture 1) Dispense the medium with the composition shown in Table 1 and adjusted to pH 6.5 into 10 mL 18 mm test tubes for anaerobic microbial culture (manufactured by Sanshin Kogyo), replace the gas phase with nitrogen, and replace with a butyl rubber stopper and a plastic cap. and sterilized at 121°C for 15 minutes. Lactococcus sp. DCL strain was inoculated into this medium, and after replacing the gas phase with hydrogen gas passed through a sterile filter for 2 minutes or more, culture was performed with shaking at 37°C and 200 spm for 24 hours. Preculture solution 1 was prepared.
  • Preculture 2 15 L of a medium having the composition shown in Table 1 and adjusted to pH 6.5 was placed in a 30 L fermenter, heated at 121° C. for 15 minutes, and sterilized with high pressure steam. This medium was inoculated with the above-mentioned preculture solution 1, gas replaced with a hydrogen/nitrogen mixed gas, and cultured at 37° C. for 24 hours to prepare preculture solution 2.
  • main culture 100 L of a medium containing 50 g/L of powdered soybean hypocotyl, 3 g/L of L-arginine, and 2 g/L of soybean oil containing vitamin E and adjusted to pH 6.5 was placed in a 200 L fermenter, and heated at 121°C for 15 minutes. It was heated for a minute and sterilized using high-pressure steam.
  • This culture medium was inoculated with the above-mentioned preculture solution 2, and the gas was replaced with a nitrogen mixed gas having a hydrogen concentration of 4%, and the mixed gas was aerated with a sparger having a pore diameter of 3 mm, while stirring was performed using the respective motive power.
  • Culture was performed at 37° C. for 96 hours, and the equol concentration in the main culture solution was analyzed by HPLC method.

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Abstract

本発明は、微生物を利用したエクオールの製造において、従来よりも安全な低水素濃度で、効果的にエクオールを製造できる方法を提供する。本発明は、ダイゼイン配糖体、ダイゼイン及びジヒドロダイゼインからなる群から選ばれる少なくとも１種のエクオール原料を、該エクオール原料を資化してエクオールを産生する能力を有する微生物により、水素を含む１種類以上の気体からなる気相下で発酵させる工程；を有してエクオールを産生するエクオールの製造方法であって、該発酵工程において、培養液量１００Ｌ以上の発酵槽を用い、ｉ）該発酵槽で攪拌動力０．１ｋＷ／ｋＬ以上、好ましくは０．２ｋＷ／ｋＬ以上、より好ましくは０．４ｋＷ／ｋＬ以上で攪拌を行うか、及び／又はｉｉ）前記気体を孔径２ｍｍ以下、好ましくは孔径１ｍｍ以下、より好ましくは孔径０．５ｍｍ以下のスパージャーを用いることにより導入することを特徴とする上記方法を提供する。

Description

エクオールの製造方法
　本発明は、エクオール産生能を有する微生物によるエクオールの製造方法に関する。
　大豆、葛などのマメ科の植物に多く含まれているイソフラボン類はポリフェノールの分類のひとつであり、イソフラボンを基本骨格とするフラボノイドである。近年の調査により、イソフラボン類は女性ホルモン作用（エストロゲン）や抗酸化作用を有し、イソフラボン類を摂取することにより、乳癌、前立腺癌、骨粗しょう症、高コレステロール血症、心疾患、更年期障害などに対して予防効果があることが明らかとなっている。
　イソフラボン類は、たとえば大豆内では、糖と共有結合した配糖体の形、ダイジン(daidzin)、グリシチン（glycitin）、ゲニスチン(genistin)として存在しており、アグリコンの形ではごく少量存在しているのみである。これら配糖体はさらにマロニル化、アセチル化されているものも存在している。これらの配糖体は、ヒトや動物の体内に入ると消化酵素又は腸内細菌の産生する酵素であるβグルコシダーゼ等の働きにより、それぞれダイゼイン（daidzein）、グリシテイン（glycitein）、ゲニステイン（genistein）となる。さらに、ダイゼインは腸内細菌の働きにより、ジヒドロダイゼイン（dihydrodaidzein）を経て、O-デスメチルアンゴレンシン（O-desmethylangolensin：O-DMA）又はエクオール（equol）へと酵素的に変換されることが知られている。
　エクオールは、これらの代謝産物の中で最もエストロゲン活性が高いことが知られている。しかしながら、人間の場合、イソフラボンの代謝には個人差があり、上記のようにダイゼインを発酵させてエクオールを産生する能力を有する腸内細菌を保有する人は少なく、その保有率は日本人で約５割、欧米人で約３割程度であることが明らかとなっている。そのため、エクオール産生菌を保有しない人は、大豆等のマメ科食物を摂取してもエクオールを体内で産生することができないという問題点が存在していた。
　これらの課題を克服するために、乳酸菌等の嫌気性微生物を用いて体外的にエクオールを産生させる試みがなされている（特許文献１～４）。しかしながら、どのような発酵条件・発酵方法により、より効果的・実用的にエクオールが製造できるかについては、明らかとなっていなかった。たとえば、４種類の嫌気性微生物を水素気相下で混合培養し、エクオールの製造を試みた例（非特許文献１）が存在していたが、混合培養では実用的生産（工業化）には適さないものであった。
　嫌気性微生物の培養であるので、通常は、静置培養を行う（特許文献５）。一方、発酵条件・発酵方法により、より効果的・実用的にエクオールが製造できる方法について、発酵が行われる気相において水素ガスの質量パーセント濃度が４０～１００％である場合（特に１００％である場合）に、エクオールの製造効率が飛躍的に高まるという報告がある（特許文献６）。しかしながら、水素は、酸素共存下で、着火した場合、激しい爆発が生じる。空気との混合では、爆発が生じる水素濃度範囲は、水素濃度下限４．１パーセント、上限７４．２パーセントである。つまり、エクオールの製造効率が飛躍的に高まる水素濃度範囲では、製造設備から水素を含む気体が漏洩した場合、激しい爆発が生じる可能性を有する水素濃度である為、工業化時には、爆発防止対策を充分に施した非常に高価な生産設備が必要であった。
特開２００６－２０４２９６号公報。 特表２００６－５０４４０９号公報。 特開２００８－６１５８４号公報。 特開２０１０－１０４２４１号公報。 ＷＯ２００７／０６６６５５。 ＷＯ２０１２／０３３１５０。
Decroos, K. et al., Arch Microbiol., 183, 45-55 (2005)。
　本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、微生物を利用したエクオールの製造において、従来よりも安全な低水素濃度で、効果的にエクオールを製造できる方法を提供することにある。
　本発明者は、ダイゼイン配糖体、ダイゼイン及びジヒドロダイゼインからなる群から選ばれる少なくとも１種のエクオール原料を、該エクオール原料を資化してエクオールを産生する能力を有する微生物により、水素を含む１種類以上の気体からなる気相下で発酵させる工程において、培養液量１００Ｌ以上の発酵槽を用い、一定以上の攪拌動力、及び／又は一定スパージャーによる一定以上のガス供給速度条件を用いることにより、菌種に制限は無く、従来と比較して低い気相水素濃度で、効果的にエクオールが生成することを見出した。具体的には以下の発明を見出した。
　＜１＞　ダイゼイン配糖体、ダイゼイン及びジヒドロダイゼインからなる群から選ばれる少なくとも１種のエクオール原料を、該エクオール原料を資化してエクオールを産生する能力を有する微生物により、水素を含む１種類以上の気体からなる気相下で発酵させる工程；を有してエクオールを産生するエクオールの製造方法であって、
　前記発酵工程において、培養液量１００Ｌ以上の発酵槽を用いたときに、
　ｉ）該発酵槽で攪拌動力０．１ｋＷ／ｋＬ以上、好ましくは０．２ｋＷ／ｋＬ以上、より好ましくは０．４ｋＷ／ｋＬ以上で攪拌を行うか、及び／又は
　ｉｉ）前記気体を孔径２ｍｍ以下、好ましくは孔径１ｍｍ以下、より好ましくは孔径０．５ｍｍ以下のスパージャーを用いることにより導入する
ことを特徴とする、上記方法。
　＜２＞　上記＜１＞において、前記気体の水素濃度が、３０％以下、好ましくは１０％以下、より好ましくは４％以下であるのがよい。
　本発明により、微生物を利用したエクオールの製造において、従来よりも安全な低水素濃度で、効果的にエクオールを製造できる方法を提供することができる。
　特に、本発明により、工業化スケールでも安全な低水素濃度で、微生物、特に嫌気性微生物発酵を利用した、ダイゼインを原料とするエクオールの効率的な製造方法が実現でき、エクオールの大量製造技術を提供することができる。
　本発明の方法により、安価かつ大量にエクオールを製造することが可能となり、より多くの人々に、エクオールを供給することができるようになる。エクオールは、飲食品又は医薬品等としてそのまま摂取することにより、乳癌、前立腺癌、骨粗しょう症、高コレステロール血症、心疾患、更年期障害等を予防できるものと考えられる。
　本発明は、ダイゼイン配糖体、ダイゼイン及びジヒドロダイゼインからなる群から選ばれる少なくとも１種のエクオール原料を、該エクオール原料を資化してエクオールを産生する能力を有する微生物により、水素を含む１種類以上の気体からなる気相下で発酵させる工程；を有してエクオールを産生するエクオールの製造方法であって、
　前記発酵工程において、培養液量１００Ｌ以上の発酵槽を用い、
　ｉ）該発酵槽で攪拌動力０．１ｋＷ／ｋＬ以上、好ましくは０．２ｋＷ／ｋＬ以上、より好ましくは０．４ｋＷ／ｋＬ以上で攪拌を行うか、及び／又は
　ｉｉ）前記気体を孔径２ｍｍ以下、好ましくは孔径１ｍｍ以下、より好ましくは孔径０．５ｍｍ以下のスパージャーを用いることにより導入する
ことを特徴とする、上記方法を提供する。
　微生物、特に嫌気性微生物の代謝によってエクオールが製造されることは、学術的にはかねてより知られていたものの、工業スケールでも安全な低水素濃度で、エクオールを製造する嫌気性微生物の培養条件については、確立されていなかったため、本発明の方法は有用である。
　以下、本発明について詳細に説明する。
＜発酵工程＞
　本発明は、上記発酵工程を有するエクオールの製造方法を提供する。
　本発明の方法は、該発酵工程以外の工程を有してもよい。例えば、エクオール原料を調製する工程、得られたエクオールを回収する工程などを挙げることができるがこれらに限定されない。
　上記発酵工程以外の工程として、具体的には、発酵に使用した微生物を殺菌する殺菌工程を挙げることができるが、これに限定されない。
＜＜エクオール原料＞＞
　本発明の方法において、特に本発明の方法の発酵工程において、原料として、ダイゼイン配糖体、ダイゼイン及びジヒドロダイゼインからなる群から選ばれる少なくとも１種のエクオール原料を用いる。
　該エクオール原料は、文字通り、エクオールの原料として用いられるものであれば、その形態は問わない。
　エクオール原料は、ダイゼイン配糖体、ダイゼイン及びジヒドロダイゼインからなる群から選ばれる少なくとも１種を含んでいればよく、その形態は問わない。例えば、ダイゼイン配糖体そのもの、ダイゼインそのもの、又はジヒドロダイゼインそのものであっても、それらを含有するもの、例えば大豆、大豆加工物、大豆胚軸、大豆胚軸加工物、例えば大豆抽出物、大豆胚軸抽出物、大豆胚軸抽出物精製物が挙げられ、具体的には市販イソフラボンであってもよい。
＜＜微生物＞＞
　本発明の方法は、特に本発明の方法における発酵工程は、エクオール原料を資化してエクオールを産生する能力を有する微生物を用いる。なお、「エクオール原料を資化してエクオールを産生する能力」を、本明細書において、単に「エクオール産生能」という場合がある。
　本発明の方法において用いるエクオール資化する微生物は、上記エクオール原料からエクオールを産生する能力を有する微生物であれば、特に限定されない。
　微生物として、嫌気性微生物を挙げることができる。該嫌気性微生物は、例えば、３７℃付近（例えば３０～４２℃）の温度でエクオールを産生することができる。
　なお、エクオール産生能は、培養物中のダイゼイン、ジヒドロダイゼイン、エクオール等を定量することにより確認することができる。これらの定量は、当業者であれば、例えばＷＯ２０１２／０３３１５０、特開２０１２－１３５２１７、特開２０１２－１３５２１８、特開２０１２－１３５２１９等の記載に基づき行うことができる。これらの定量方法の一例を以下に示す。
　例えば、培養液に酢酸エチルを加えて、激しく攪拌した後遠心し、酢酸エチル層を取り出す。必要に応じて同培養液に同様の操作を数回行い、それら酢酸エチル層を合わせてエクオール抽出液を得ることができる。この抽出液をエバポレーターで減圧下に濃縮、乾固し、メタノールに溶解させる。これをポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜等の膜を使用して濾過し、不溶物を除去したものを高速液体クロマトグラフィー測定サンプルとすることができる。高速液体クロマトグラフィーの条件は例えば以下のものを例示することができるがこれに限定されない。
［高速液体クロマトグラフィー条件］
カラム：Phenomenox Luna ５ｕＣ１８、２．０ｍｍ×１５０ｍｍ（島津ジーエルシー）
移動相：水／メタノール［５５：４５，ｖ／ｖ］
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
保持時間：ジヒドロダイゼインが１３．８分、ダイゼインが１９．６分、グリシテインが２２．５分、エクオールが２５．６分、ゲニステインが３５．０分
　エクオール産生する能力を有する微生物として、以下の属に分類される微生物を挙げることができるがこれらに限定されない。
　アドレクラウチア(Adlercreutzia)属
　バクテロイデス(Bacteroides)属
　ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属
　クロストリジウム(Clostridium)属
　エガセラ(Eggerthella)属 
　エンテロコッカス(Enterococcus)属
　エンテロハブダス(Enterorhabdus)属
　ユーバクテリウム(Eubacterium)属
　フィネゴルディア(Finegoldia)属
　ラクトバチルス(Lactobacillus)属
　ラクトコッカス(Lactococcus)属
　パラエガセラ(Paraeggerthella)属 
　ペディオコッカス(Pediococcus)属
　プロテウス（Proteus）属
　シャーペア(Sharpea)属
　スラキア(Slackia)属
　ストレプトコッカス(Streptococcus)属
　ベイロネラ(Veillonella)属
　エクオールを産生する能力を有する微生物として、具体的には、以下の微生物を挙げることができるがこれらに限定されない。
　アドレクラウチア・エクオリファシエンス・サブスピーシズ・セラツス(Adlercreutzia equolifaciens subsp. celatus) 
　アドレクラウチア・エクオリファシエンス・サブスピーシズ・エクオリファシエンス(Adlercreutzia equolifaciens subsp. equolifaciens)
　バクテロイデス・オバツス(Bacteroides ovatus)
　ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)
　ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)
　クロストリジウム・エスピー(Clostridium sp.)
　エガセラ・エスピー(Eggerthella sp. )
　エンテロコッカス・フェカーリス(Enterococcus faecalis)
　エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)
　エンテロハブダス・ムコシコラ(Enterorhabdus mucosicola)
　ユーバクテリウム・エスピー(Eubacterium sp.)
　フィネゴルディア・マグナ(Finegoldia magna)
　ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum) 
　ラクトバチルス・ムコサエ(Lactobacillus mucosae)
　ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)
　ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)
　ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)
　ラクトバチルス・エスピー(Lactobacillus sp.)
　ラクトコッカス・ガルビエ(Lactococcus garvieae)
　ラクトコッカス・エスピー（Lactococcus sp.）
　パラエガセラ・エスピー(Paraeggerthella sp.)
　ペディオコッカス・ペントサセウス(Pediococcus pentosaceus)
　プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）
　シャーペア・アザブエンシス(Sharpea azabuensis)
　スラキア・エクオリファシエンス(Slackia equolifaciens)
　スラキア・イソフラボニコンバーテンス(Slackia isoflavoniconvertens)
　スラキア・エスピー(Slackia sp.) 
　ストレプトコッカス・コンステラタス(Streptococcus constellatus)
　ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)
　ベイロネア・エスピー(Veillonella sp.) 
　上記記載の微生物のうち、例えばエガセラ(Eggerthellaceae)科に分類される微生物、ビフィドバクテリアセアエ（Bifidobacteriaceae）科に分類される微生物、クロストリジアセアエ（Clostridiaceae）科に分類される微生物、コーリオバクテリアセアエ（Coriobacteriaceae）科に分類される微生物、エンテロコッカセアエ（Enterococcaceae）科に分類される微生物、ユーバクテリアセアエ（Eubacteriaceae）科に分類される微生物、モルガネラセアエ（Morganellaceae）科に分類される微生物、ペプトニフィラセアエ（Peptoniphilaceae）科に分類される微生物、ラクトバチラセアエ（Lactobacillaceae）科に分類される微生物、ストレプトコッカセアエ（Streptococcaceae）科に分類される微生物、ベイロネラセアエ（Veillonellaceae）科に分類される微生物、又はこれらの類縁微生物が挙げられる。好ましくは、アドレクラウチア（Adlercreutzia）属、バクテロイデス属、ビフィドバクテリウム属、クロストリジウム属、コリオバクテリウム属、エガセラ属、エンテロコッカス属、ユーバクテリウム属、フィネゴルディア属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、パラエガセラ属、ペディオコッカス属、プロテウス属、シャーペア属、スラキア属、ストレプトコッカス属、ベイロネア属、又はこれらの類縁微生物に分類される微生物であるのがよい。さらに好ましくは、アドレクラウチア・エクオリファシエンス・サブスピーシズ・セラツス、アドレクラウチア・エクオリファシエンス・サブスピーシズ・エクオリファシエンス、バクテロイデス・オバツス、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロングム、クロストリジウム・エスピー、エガセラ・エスピー、エンテロコッカス・フェカーリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロハブダス・ムコシコラ、ユーバクテリウム・エスピー、フィネゴルディア・マグナ、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・インテスティナリス、ラクトバチルス・ムコサエ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・エスピー、ラクトコッカス・ガルビエ、ラクトコッカス・エスピー、パラエガセラ・エスピー、ペディオコッカス・ペントサセウス、プロテウス・ミラビリス、シャーペア・アザブエンシス、スラキア・エクオリファシエンス、スラキア・イソフラボニコンバーテンス、スラキア・エスピー、ストレプトコッカス・コンステラタス、ストレプトコッカス・インターメディウス、ベイロネア・エスピーであるのがよい。
　上記記載の微生物のうち、特に以下に記載する微生物のいずれか又はこれらの菌と同様の種としての性質を有する類縁の菌をより好ましい嫌気性微生物として挙げることができる。
　アドレクラウチア・エクオリファシエンス・サブスピーシズ・セラツス（Adlercreutzia equolifaciens subsp. celatus）DSM 18785株
　アドレクラウチア・エクオリファシエンス・サブスピーシズ・エクオリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens subsp. equolifaciens）DSM 19450株
　バクテロイデス・オバツス（Bacteroides ovatus）E-23-15株
　ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidibacterium breve）ATCC 15700株
　ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）BB536株
　クロストリジウム・エスピー（Clostridium sp.）HGH136株
　エガセラ・エスピー（Eggerthella sp.）Julong 732株
　エガセラ・エスピー（Eggerthella sp.）YY7918株
　エガセラ・エスピー（Eggerthella sp.）D1株
　エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）INIA P333株
　エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）EPI1株
　エンテロハブダス・ムコシコラ（Enterohabdus mucosicola）Mt1B8株
　ユーバクテリウム・エスピー（Eubacterium sp.）D2株
　フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）EPI3株
　ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）DPPMA114株
　ラクトバチルス・インテスティナリス（Lactobacillus intestinalis）KTCT13676BP株
　ラクトバチルス・ムコサエ（Lactobacillus mucosae）EPI2株
　ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）JS1株
　ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）DPPMA24W株
　ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）DPPMASL33株
　ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）DPPMAAZ1株
　ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）INIA P540株
　ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）Niu-O16株
　ラクトコッカス・ガルビエ（Lactococcus garvieae）20-92株
　パラエガセラ・エスピー（Paraeggerthella sp.）SNR40-432株
　ペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）CS1株
　プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）LH-52株
　シャーペア・アザブエンシス（Sharpea azabuensis）ST18株
　スラキア・エクオリファシエンス（Slackia equolifaciens）DSM 24851株
　スラキア・イソフラボニコンバーテンス（Slackia isoflavoniconvertens）DSM 22006株
　スラキア・エスピー（Slackia sp.）FJK1株
　スラキア・エスピー（Slackia sp.）NATTS株
　スラキア・エスピー（Slackia sp.）YIT11861株
　スラキア・エスピー（Slackia sp.）TM-30株
　ストレプトコッカス・コンステラタス（Streptococcus constellatus）E-23-17株
　ストレプトコッカス・インターメディウス（Streptococcus intermedius）A6G-225株
　ベイロネア・エスピー（Veillonella sp.）EP株。
　なお、上記嫌気性微生物は、その寄託番号に示された寄託機関から入手することができる。各受託番号は、当該嫌気性微生物が、それぞれ次の寄託機関に寄託されていることを示す。
　FERM　特許生物寄託センター；International Patent Organism Depositary (IPOD)
　　　　　http://unit.aist.go.jp/pod/ci/index.html
　DSM　 German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)
　　　　　http://www.dsmz.de/
　KCCM　Korean Culture Center of Microorganisms
　本発明においては、エクオールの産生能を有する嫌気性微生物は、エクオールの生産に適した条件で培養される。本発明におけるエクオールの生産に適した条件とは、エクオールの生成活性を持つ嫌気性微生物の生存と活動が維持される条件をいう。より具体的には、嫌気性微生物の生存が可能な気相条件（嫌気性条件）が維持され、当該嫌気性微生物の活性と増殖を支持するための栄養素が与えられることを言う。嫌気性微生物の生存に適した種々の培地組成が公知である。したがって、先に示したエクオールの産生能を有する嫌気性微生物について、当業者は、適切な培地組成を選択することができる。たとえば、Difco社製のＢＨＩ培地や、実施例において用いた培地等を使用することができるがこれらに限定されない。
　本発明で用いられる培地には、水溶性の有機物を炭素源として加えることができる。水溶性の有機物として、以下の化合物を挙げることができるが、これらに限定されない。
　ソルボース、フラクトース、グルコース等の糖類；
　メタノール等のアルコール類；
　吉草酸、酪酸、プロピオン酸、酢酸、ギ酸等有機酸類、またはこれらの塩。
　炭素源としての培地に加える有機物の濃度は、効率的に培地中の嫌気性微生物を発育させるために適宜調節することができる。
　培地には、窒素源を加えることができる。本発明において、窒素源としては通常の発酵に用いうる各種の窒素化合物を用いることができる。好ましい無機窒素源は、アンモニウム塩、及び硝酸塩である。より好ましい無機窒素源は、硫安、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、リン酸水素アンモニウム、硝酸カリウム及び硝酸ソーダである。一方、好ましい有機窒素源はアミノ酸類、酵母エキス、ペプトン類、肉エキス、肝臓エキス、消化血清末等である。より好ましい有機窒素源はアルギニン、システイン、シスチン、シトルリン、リジン、酵母エキス、ペプトン類である。
　さらに、炭素源や窒素源に加えて、エクオールの製造に適した他の有機物あるいは無機物を培地に加えることもできる。たとえば、ビタミン等の補因子や各種の塩類等の無機化合物を培地に加えることによって、嫌気性微生物の増殖や活性を増強できる場合もある。たとえば無機化合物、ビタミン類、動植物由来の微生物増殖補助因子として以下のものを挙げることができる。
　無機化合物　　　　　　　　　　　ビタミン類
　リン酸二水素カリウム　　　　　　ビオチン
　硫酸マグネシウム　　　　　　　　葉酸
　硫酸マンガン　　　　　　　　　　ピリドキシン
　塩化ナトリウム　　　　　　　　　チアミン
　塩化コバルト　　　　　　　　　　リボフラビン
　塩化カルシウム　　　　　　　　　ニコチン酸
　硫酸亜鉛　　　　　　　　　　　　パントテン酸
　硫酸銅　　　　　　　　　　　　　ビタミンＢ１２
　明ばん　　　　　　　　　　　　　チオオクト酸
　モリブデン酸ソーダ　　　　　　　p-アミノ安息香酸
　塩化カリウム
　ホウ酸等
　塩化ニッケル
　タングステン酸ナトリウム
　セレン酸ナトリウム
　硫酸第一鉄アンモニウム
　これらの無機化合物やビタミン類、あるいは増殖補助因子を添加して培養液を製造する方法として、従来公知の手法を用いることができる。培地は、液体、半固体、あるいは固体とすることができる。本発明において、好ましい培地の形態は、液体培地である。
　本発明の培地は、デキストリン類を含むことができる。デキストリン類を含む培地で嫌気性微生物を培養すれば、培養後に改めて培養物にデキストリン類を接触させることなく、エクオールおよびデキストリン類を含む液を調製することができる。
　デキストリン類の培地への添加は、微生物の培養前および培養中に行うことができる。
　本発明の培地に、消泡剤　好ましくは大豆油、より好ましくはビタミンE入り大豆油を含むことができる。
　本願の方法において、微生物、特に嫌気性微生物は、公知の微生物の培養方法にしたがって培養することができる。工業的な製造には、培地や基質ガスを連続的に供給することができ、かつ培養物を回収するための機構を備えた連続培養システム (continuous fermentation system）を使用することもできる。
　本願の方法において、嫌気性微生物を用いる場合には、発酵槽内への酸素の混入を防ぐのがよい。発酵槽は、通常用いられる発酵槽がそのまま利用できる。発酵槽内に混入する酸素を、窒素等の不活性気体で置換することにより、嫌気的な雰囲気を作ることができる。
＜＜発酵工程での気相＞＞
　本発明の方法、特に本発明の方法の発酵工程は、水素を含む１種類以上の気体からなる気相下で行われる。気相を構成する気体は、水素を含む１種類以上の気体からなれば特に限定されないが、水素及び水素以外の１種以上の気体を有するのがよい。水素以外の気体として、二酸化炭素、窒素、一酸化炭素等を挙げることができるが、特に限定されない。
　水素は、前記気体の水素濃度が、３０％以下、好ましくは１０％以下、より好ましくは４％以下であるのがよい。
＜＜発酵槽、撹拌動力、スパージャーの孔径＞＞
　発酵槽の大きさは、培養液１００Ｌ以上であれば、特に制限されるものではない。
　発酵槽が、通気攪拌槽の場合、攪拌機の動力が、０．１ｋＷ／ｋＬ以上であれば、特に制限されるものではない。また、スパージャーを用いて前記気体を供給する場合、該スパージャーの孔径は、特に制限されるものではない。
　発酵槽が、通気攪拌槽の場合、攪拌機の動力が、０．１ｋＷ／ｋＬ未満であるならば、前記気体を供給するスパージャーの孔径は、２ｍｍ以下、好ましくは１ｍｍ以下、より好ましくは０．５ｍｍ以下であるのがよい。
　発酵槽が、攪拌機が無い気泡搭の場合、前記気体を供給するスパージャーの孔径は、２ｍｍ以下、好ましくは１ｍｍ以下、より好ましくは０．５ｍｍ以下であるのがよい。また、必要に応じて、ドラフトチューブを設置することもできる。
　また、効率よくエクオールを回収するためには、気相を構成する混合気体の発酵槽への通気量は０．００１～２．０Ｖ／Ｖ／Ｍガス量／液量／分であることが好ましい。
　本発明では、発酵槽の温度は特に制限されるものではないが、上記微生物がエクオール産生能を発揮できる温度であるのがよく、例えば３０℃～４０℃、好ましくは３３℃～３８℃であるのがよい。
　本発明において、微生物を培養する際は常圧で行うこともできるが、加圧する場合、加圧条件は、当該微生物が生育できる条件であれば特に限定されるものではない。好ましい加圧条件としては、０．２ＭＰａ以下の範囲を挙げることができるがこれに限定されない。
　発酵時間は、エクオールの生成量に応じて、また、イソフラボン類の残存量等に応じても適宜設定できる。例えば８～１２０時間、好ましくは１２～７２時間、特に好ましくは１６～６０時間を例示することができるがこれらに限定されない。
　本発明の培養方法により得られた発酵培養物は、必要に応じて加熱乾燥処理あるいは噴霧乾燥処理、凍結乾燥処理により固形状にして使用することができる。加熱乾燥処理は、例えば回転ドラム乾燥機を、噴霧乾燥処理は、例えばスプレー乾燥機を、凍結乾燥処理は凍結乾燥機を使用して行うことができる。乾燥方法は、液体を乾燥できる乾燥機ならば、どのような乾燥機でも良い。乾燥処理された発酵培養物は、必要に応じて粉砕化処理に供してもよい。
　本発明を以下、実施例に基づいて説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
（前培養１）
　表１に示した組成で、ｐＨ６．９に調整した培地を、１０ｍＬ嫌気性微生物培養用１８ｍｍ試験管（三紳工業製）に分注し、気相を窒素に置換しながらブチルゴム栓とプラスチックキャップをはめて１２１℃、１５分間滅菌した。この培地に、アドレクラウチア・エクオリファシエンス・サブスピーシズ・セラツス（Adlercreutzia equolifaciens subsp. celatus）ＤＳＭ　１８７８５株を植菌し、無菌フィルターを通した水素ガスで気相を２分間以上置換した後、３７℃、２００ｓｐｍで１８時間振盪培養を行い、前培養液１を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（前培養２）
　表１に示した組成で、ｐＨ６．９に調整した培地１５Ｌを容量３０Ｌの発酵槽に入れ、１２１℃、１５分間加熱し高圧蒸気滅菌した。この培地に、上記前培養液１を植菌し、水素／窒素混合ガスでガス置換し、３７℃、１８時間培養を行い、前培養液２を調製した。
（本培養）
　表１に示した組成にダイゼイン１ｇ／Ｌ、及びＬ－アルギニン３ｇ／Ｌを添加し、ｐＨ６．９に調整した培地１００Ｌを容量２００Ｌの発酵槽に入れ、１２１℃、１５分間加熱し高圧蒸気滅菌した。この培地に、上記前培養液２を植菌し、それぞれの水素／窒素比の混合ガスでガス置換し、それぞれの孔径のスパージャーにて混合ガスを通気ながら、それぞれの動力で攪拌を行った。３７℃、１８時間培養を行い、本培養液中のエクオール濃度をＨＰＬＣ法にて分析した。
　結果を表２に示す。実施例１より、気相水素濃度が、３０％以下では、攪拌動力０．１ｋＷ／ｋＬ以上にすることにて、エクオールの濃度が顕著に向上していることを確認した。また、攪拌動力を与えない場合では、スパージャー孔径を２ｍｍ以下にすることにて、エクオール濃度が向上することを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
〔実施例２〕
（前培養１）
　表１に示した組成で、ｐＨ６．９に調整した培地を、１０ｍＬ嫌気性微生物培養用１８ｍｍ試験管（三紳工業製）に分注し、気相を窒素に置換しながらブチルゴム栓とプラスチックキャップをはめて１２１℃、１５分間滅菌した。この培地に、アドレクラウチア・エクオリファシエンス・サブスピーシズ・セラツス（Adlercreutzia equolifaciens subsp. celatus）ＤＳＭ　１８７８５株を植菌し、無菌フィルターを通した水素ガスで気相を２分間以上置換した後、３７℃、２００ｓｐｍで１８時間振盪培養を行い、前培養液１を調製した。
（前培養２）
　表１に示した組成で、ｐＨ６．９に調整した培地１５Ｌを容量３０Ｌの発酵槽に入れ、１２１℃、１５分間加熱し高圧蒸気滅菌した。この培地に、上記前培養液１を植菌し、水素／窒素混合ガスでガス置換し、３７℃、１８時間培養を行い、前培養液２を調製した。
（前培養３）
　表１に示した組成で、ｐＨ６．９に調整した培地１００Ｌを容量２００Ｌの発酵槽に入れ、１２１℃、１５分間加熱し高圧蒸気滅菌した。この培地に、上記前培養液２を植菌し、水素／窒素混合ガスでガス置換し、３７℃、１８時間培養を行い、前培養液３を調製した。
（本培養）
　表１に示した組成にダイゼイン１ｇ／Ｌ、及びＬ－アルギニン３ｇ／Ｌを添加し、ｐＨ６．９に調整した培地２０００Ｌを容量４０００Ｌの発酵槽に入れ、１２１℃、１５分間加熱し高圧蒸気滅菌した。この培地に、上記前培養液３を植菌し、水素濃度４％の窒素混合ガスでガス置換し、孔径３ｍｍのスパージャーにて混合ガスを通気ながら、それぞれの動力で攪拌を行った。３７℃、１８時間培養を行い、本培養液中のエクオール濃度をＨＰＬＣ法にて分析した。
　結果を表３に示す。実施例２より、発酵槽の大きさを大きくしても、攪拌動力０．１ｋＷ／ｋＬ以上にすることにて、エクオールの濃度が顕著に向上していることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
〔実施例３〕
（前培養１）
　表１に示した組成で、ｐＨ６．９に調整した培地を、１０ｍＬ嫌気性微生物培養用１８ｍｍ試験管（三紳工業製）に分注し、気相を窒素に置換しながらブチルゴム栓とプラスチックキャップをはめて１２１℃、１５分間滅菌した。この培地に、エガセラ・エスピー（Eggerthella sp.）ＤＣ　３２１５株を植菌し、無菌フィルターを通した水素ガスで気相を２分間以上置換した後、３７℃、２００ｓｐｍで３６時間振盪培養を行い、前培養液１を調製した。
（前培養２）
　表１に示した組成で、ｐＨ６．９に調整した培地１５Ｌを容量３０Ｌの発酵槽に入れ、１２１℃、１５分間加熱し高圧蒸気滅菌した。この培地に、上記前培養液１を植菌し、水素／窒素混合ガスでガス置換し、３７℃、３６時間培養を行い、前培養液２を調製した。
（本培養）
　表１に示した組成にダイゼイン０．５ｇ／Ｌ、及びＬ－アルギニン３ｇ／Ｌを添加し、ｐＨ６．９に調整した培地１００Ｌを容量２００Ｌの発酵槽に入れ、１２１℃、１５分間加熱し高圧蒸気滅菌した。この培地に、上記前培養液２を植菌し、水素濃度４％の窒素混合ガスでガス置換し、孔径３ｍｍのスパージャーにて混合ガスを通気ながら、それぞれの動力で攪拌を行った。３７℃、７２時間培養を行い、本培養液中のエクオール濃度をＨＰＬＣ法にて分析した。
　結果を表４に示す。実施例３より、攪拌動力０．１ｋＷ／ｋＬ以上にすることにて、エクオールが生産されていることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
〔実施例４〕
（前培養１）
　表１に示した組成で、ｐＨ６．５に調整した培地を、１０ｍＬ嫌気性微生物培養用１８ｍｍ試験管（三紳工業製）に分注し、気相を窒素に置換しながらブチルゴム栓とプラスチックキャップをはめて１２１℃、１５分間滅菌した。この培地に、ラクトコッカス・エスピー（Lactococcus sp.）ＤＣＬ株を植菌し、無菌フィルターを通した水素ガスで気相を２分間以上置換した後、３７℃、２００ｓｐｍで２４時間振盪培養を行い、前培養液１を調製した。
（前培養２）
　表１に示した組成で、ｐＨ６．５に調整した培地１５Ｌを容量３０Ｌの発酵槽に入れ、１２１℃、１５分間加熱し高圧蒸気滅菌した。この培地に、上記前培養液１を植菌し、水素／窒素混合ガスでガス置換し、３７℃、２４時間培養を行い、前培養液２を調製した。
（本培養）
　粉末状大豆胚軸５０ｇ／Ｌ、及びＬ－アルギニン３ｇ／Ｌ、ビタミンＥ入り大豆油２ｇ／Ｌを添加し、ｐＨ６．５に調整した培地１００Ｌを容量２００Ｌの発酵槽に入れ、１２１℃、１５分間加熱し高圧蒸気滅菌した。この培地に、上記前培養液２を植菌し、水素濃度４％の窒素混合ガスでガス置換し、孔径３ｍｍのスパージャーにて混合ガスを通気ながら、それぞれの動力で攪拌を行った。３７℃、９６時間培養を行い、本培養液中のエクオール濃度をＨＰＬＣ法にて分析した。
　結果を表５に示す。実施例４より、攪拌動力０．１ｋＷ／ｋＬ以上にすることにて、エクオールが生産されていることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005

Claims (14)

  1. 　ダイゼイン配糖体、ダイゼイン及びジヒドロダイゼインからなる群から選ばれる少なくとも１種のエクオール原料を、該エクオール原料を資化してエクオールを産生する微生物により、水素を含む１種類以上の気体からなる気相下で発酵させる工程；を有してエクオールを産生するエクオールの製造方法であって、
    　前記発酵工程において、培養液量１００Ｌ以上の発酵槽を用い、
    　ｉ）該発酵槽で攪拌動力０．１ｋＷ／ｋＬ以上で攪拌を行うか、及び／又は
    　ｉｉ）前記気体を孔径２ｍｍ以下のスパージャーを用いることにより導入する
    ことを特徴とする、上記方法。
  2. 　前記攪拌動力が０．２ｋＷ／ｋＬ以上である請求項１に記載の方法。
  3. 　前記攪拌動力が０．４ｋＷ／ｋＬ以上である請求項１に記載の方法。
  4. 　前記スパージャーの孔径が１ｍｍ以下である請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 　前記スパージャーの孔径が０．５ｍｍ以下である請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  6. 　前記気体の水素濃度が３０％以下である請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　前記気体の水素濃度が１０％以下である請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　前記気体の水素濃度が４％以下である請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　前記気体の水素濃度が３０％以下である請求項４に記載の方法。
  10. 　前記気体の水素濃度が１０％以下である請求項４に記載の方法。
  11. 　前記気体の水素濃度が４％以下である請求項４に記載の方法。
  12. 　前記気体の水素濃度が３０％以下である請求項５に記載の方法。
  13. 　前記気体の水素濃度が１０％以下である請求項５に記載の方法。
  14. 　前記気体の水素濃度が４％以下である請求項５に記載の方法。
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