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WO2023190941A1 - 培養由来成分を含まない角膜内皮細胞製剤及びその製造法 - Google Patents

培養由来成分を含まない角膜内皮細胞製剤及びその製造法 Download PDF

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WO2023190941A1
WO2023190941A1 PCT/JP2023/013321 JP2023013321W WO2023190941A1 WO 2023190941 A1 WO2023190941 A1 WO 2023190941A1 JP 2023013321 W JP2023013321 W JP 2023013321W WO 2023190941 A1 WO2023190941 A1 WO 2023190941A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
corneal endothelial
cells
cell
solution
washing
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2023/013321
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
範子 小泉
直毅 奥村
靖史 松岡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Doshisha Co Ltd
Actualeyes Inc
Original Assignee
Doshisha Co Ltd
Actualeyes Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to EP23780949.6A priority patent/EP4501337A1/en
Priority to JP2024512830A priority patent/JPWO2023190941A1/ja
Priority to KR1020247035611A priority patent/KR20240168398A/ko
Priority to US18/852,996 priority patent/US20250230406A1/en
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
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    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P27/02—Ophthalmic agents
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    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins

Definitions

  • the present disclosure relates to a method for cleaning corneal endothelial cells, a method for producing a corneal endothelial cell preparation, and a corneal endothelial cell preparation produced by such a method.
  • corneal endothelial cells When corneal endothelial cells are damaged, the cornea becomes cloudy, resulting in severe visual impairment due to bullous keratopathy.
  • the only treatment for bullous keratopathy is corneal transplantation, but there are problems such as a shortage of donors and rejection, and the development of new regenerative medicine treatments is desired.
  • the present inventors have established a treatment method for regenerating corneal endothelium by growing corneal endothelial cells isolated from donor corneas in the presence of a ROCK inhibitor and injecting the cells into many patients.
  • it is necessary to collect cells from the culture vessel and remove fetal bovine serum, etc. added during culture but conventional methods prevent cells from being damaged during washing. Only about 50% of the cells could be recovered due to damage or adhesion to the container.
  • the present inventors investigated in detail the method of adding stabilizing components during cell washing, and added an appropriate amount of clinically usable protein components, such as human serum albumin, to efficiently stabilize cells without reducing the cell recovery rate. I found a way to clean it.
  • a method for producing a corneal endothelial cell preparation comprising: A step of washing corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells with a solution containing about 0.01% to about 10% by weight of protein, and mixing the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells with a composition for formulation. into a corneal endothelial cell preparation, the protein being selected from the group consisting of human serum albumin, casein, lactoferrin, ovalbumin, and combinations thereof.
  • the washing step comprises suspending the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells in the solution to provide a suspension of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells, and centrifuging the suspension.
  • the method according to the above item which comprises collecting the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells.
  • the loss rate of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells in the washing step is 20% or less.
  • (Item 9) A method according to any of the preceding items, wherein the solution comprises about 1% to about 5% human serum albumin by weight.
  • (Item 10) A method according to any of the preceding items, wherein the solution comprises about 1% to about 3% human serum albumin by weight.
  • (Item 11) A method according to any of the preceding items, wherein the solution comprises about 2% by weight human serum albumin.
  • (Item 12) A method according to any of the preceding items, wherein the solution is a culture medium, a buffer or an intraocular perfusate, or comprises one or more components of a culture medium, a buffer or an intraocular perfusate. .
  • the culture medium or intraocular irrigation fluid may be Opti-MEM®, DMEM, MEM, RPMI1640, Ham's F-12, PBS, HEPES, Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), physiological saline, oxyglutathione.
  • the components of the culture medium include calcium, magnesium, potassium, sodium, phosphate, bicarbonate, vitamins, essential amino acids, or combinations thereof.
  • the formulation composition is or comprises one or more components of a cell preservation solution, culture medium, buffer, or intraocular irrigation solution. , the method described in any one of the above items.
  • the cell preservation solution is CryoStor(R) CS2, CryoStor(R) CS5, BunBunker(R), or CellBunker(R).
  • a method of washing corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells comprising: suspending corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells in a solution containing about 0.01% to about 10% by weight protein to provide a suspension of corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells; and collecting said corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells by centrifuging said protein, said protein being selected from the group consisting of human serum albumin, casein, lactoferrin, ovalbumin, and combinations thereof.
  • (Item 19A) The method according to any one of the preceding items, wherein the washing removes impurities from the corneal endothelial cell preparation.
  • (Item 19B) The method according to any one of the above items, wherein the loss rate of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells due to the washing is 20% or less.
  • (Item 19C) The method according to any one of the above items, wherein the loss rate of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells due to the washing is 15% or less.
  • (Item 19D) The method according to any one of the above items, wherein the loss rate of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells due to the washing is 10% or less.
  • the protein is human serum albumin.
  • (Item 19F) A method according to any of the preceding items, wherein the solution comprises from about 0.5% to about 10% human serum albumin by weight.
  • (Item 19G) A method according to any of the preceding items, wherein the solution comprises about 1% to about 5% human serum albumin by weight.
  • (Item 19H) A method according to any of the preceding items, wherein the solution comprises about 1% to about 3% human serum albumin by weight.
  • the culture medium or intraocular irrigation fluid may be Opti-MEM®, DMEM, MEM, RPMI1640, Ham's F-12, PBS, HEPES, Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), physiological saline, oxyglutathione.
  • the components of the culture medium include calcium, magnesium, potassium, sodium, phosphate, bicarbonate, vitamins, essential amino acids, or combinations thereof.
  • a cell wash solution for corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells comprising from about 0.01% to about 10% by weight of protein, the protein being from human serum albumin, casein, lactoferrin, ovalbumin and combinations thereof.
  • the washing of the corneal endothelial cells comprises suspending the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells in the cell washing solution to provide a suspension of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells, and The cell washing solution according to any one of the above items, which is carried out by centrifuging to collect the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells.
  • (Item 23) The cell washing solution according to any one of the above items, wherein the loss rate of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells due to the washing is 20% or less.
  • (Item 24) The cell washing solution according to any one of the above items, wherein the loss rate of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells due to the washing is 15% or less.
  • (Item 25) The cell washing solution according to any one of the above items, wherein the loss rate of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells due to the washing is 10% or less.
  • (Item 26) Cell washing solution according to any one of the above items, wherein the protein is human serum albumin.
  • a cell washing solution according to any one of the preceding items comprising from about 0.5% to about 10% by weight human serum albumin.
  • Cell washing solution according to any one of the preceding items comprising from about 1% to about 5% by weight human serum albumin.
  • Cell washing solution according to any of the preceding items comprising from about 1% to about 3% by weight human serum albumin.
  • Cell washing solution according to any of the preceding items comprising about 2% by weight of human serum albumin.
  • Cell washing solution according to any of the preceding items wherein the solution is a culture medium or a buffer, or contains one or more components of a culture medium or a buffer.
  • the above culture medium is Opti-MEM (registered trademark), DMEM, MEM, RPMI1640, Ham's F-12, PBS, HEPES, Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), physiological saline, oxyglutathione solution.
  • Cell washing solution according to any one of the items.
  • Cell washing solution according to any of the preceding items, wherein the components of the culture medium include calcium, magnesium, potassium, sodium, phosphate, bicarbonate, vitamins, essential amino acids, or combinations thereof.
  • (Item 34) Cell washing solution according to any of the preceding items, wherein the components of the culture medium further include transferrin, insulin, hypoxanthine, thymidine, sodium bicarbonate, sodium pyruvate, L-glutamic acid, or combinations thereof.
  • (Item 35) A composition comprising from about 0.01% to about 10% by weight of protein for producing a corneal endothelial cell preparation in suspension, the protein comprising: human serum albumin, casein, lactoferrin, ovalbumin and A composition selected from the group consisting of combinations thereof.
  • the composition is brought into contact with the cultured corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells, the corneal endothelial cells are washed, and the washing of the corneal endothelial cells is performed by contacting the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells with the composition.
  • the above method is carried out by suspending the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells to provide a suspension of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells, and centrifuging the suspension to collect the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells.
  • a composition according to any one of the items.
  • (Item 35B) The composition according to any one of the preceding items, wherein the washing removes impurities from the corneal endothelial cell preparation.
  • (Item 35C) The composition according to any one of the above items, wherein the loss rate of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells due to the washing is 20% or less.
  • (Item 35D) The composition according to any one of the above items, wherein the loss rate of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells due to the washing is 15% or less.
  • (Item 35E) The composition according to any one of the above items, wherein the loss rate of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells due to the washing is 10% or less.
  • (Item 35F) The composition according to any one of the above items, wherein the protein is human serum albumin.
  • (Item 35G) A composition according to any one of the preceding items, comprising from about 0.5% to about 10% by weight human serum albumin.
  • (Item 35H) A composition according to any of the preceding items, comprising from about 1% to about 5% by weight human serum albumin.
  • (Item 35I) A composition according to any of the preceding items, comprising from about 1% to about 3% by weight human serum albumin.
  • compositions according to any of the preceding items comprising about 2% by weight of human serum albumin.
  • the composition is or comprises one or more components of a culture medium, a buffer or an intraocular irrigant. Composition.
  • the culture medium or intraocular irrigation fluid may be Opti-MEM®, DMEM, MEM, RPMI1640, Ham's F-12, PBS, HEPES, Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), physiological saline, oxyglutathione.
  • the composition according to any one of the above items which is a liquid.
  • (Item A1) Use of a protein in cell washing of corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells, wherein the protein is used in a cell washing solution in which the protein is present at about 0.01% to about 10% by weight, wherein the protein is present in human serum Use selected from the group consisting of albumin, casein, lactoferrin, ovalbumin and combinations thereof.
  • the washing of the corneal endothelial cells comprises suspending the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells in the cell washing solution to provide a suspension of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells, and The use according to any one of the above items, which is carried out by centrifuging to collect the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells. (Item A3) The use according to any of the preceding items, wherein said washing removes impurities from said corneal endothelial cell preparation.
  • (Item A4) The use according to any one of the above items, wherein the loss rate of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells due to the washing is 20% or less.
  • (Item A5) The use according to any one of the above items, wherein the loss rate of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells due to the washing is 15% or less.
  • (Item A6) The use according to any one of the above items, wherein the loss rate of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells due to the washing is 10% or less.
  • (Item A7) Use according to any of the above items, wherein said protein is human serum albumin.
  • the cell washing solution comprises from about 0.5% to about 10% by weight human serum albumin.
  • the cell washing solution comprises from about 1% to about 5% human serum albumin by weight.
  • the cell washing solution comprises from about 1% to about 3% by weight human serum albumin.
  • the cell washing solution comprises about 2% by weight human serum albumin.
  • the above culture medium is Opti-MEM (registered trademark), DMEM, MEM, RPMI1640, Ham's F-12, PBS, HEPES, Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), physiological saline, oxyglutathione solution. Uses as described in any one of the sections.
  • the components of the culture medium include calcium, magnesium, potassium, sodium, phosphate, bicarbonate, vitamins, essential amino acids, or combinations thereof.
  • the components of the culture medium further include transferrin, insulin, hypoxanthine, thymidine, sodium bicarbonate, sodium pyruvate, L-glutamic acid, or combinations thereof.
  • the protein is used in a composition in which the protein is present at about 0.01% to about 10% by weight, wherein the protein is human serum albumin, human serum albumin, Use selected from the group consisting of casein, lactoferrin, ovalbumin and combinations thereof.
  • the composition is brought into contact with the cultured corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells, the corneal endothelial cells are washed, and the washing of the corneal endothelial cells is performed by contacting the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells with the composition.
  • the above method is carried out by suspending the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells to provide a suspension of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells, and centrifuging the suspension to collect the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells. Uses as described in any one of the sections.
  • the composition is or comprises one or more components of a culture medium, a buffer or an intraocular irrigant. use.
  • the culture medium or intraocular irrigation fluid may be Opti-MEM®, DMEM, MEM, RPMI1640, Ham's F-12, PBS, HEPES, Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), physiological saline, oxyglutathione.
  • HBSS Hanks' Balanced Salt Solution
  • (Item B1) A protein for cell washing of corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells, wherein the protein is used in a cell washing solution in which the protein is present at about 0.01% to about 10% by weight, wherein the protein is present in human serum A protein selected from the group consisting of albumin, casein, lactoferrin, ovalbumin and combinations thereof.
  • the washing of the corneal endothelial cells comprises suspending the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells in the cell washing solution to provide a suspension of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells, and The protein according to any one of the above items, which is carried out by centrifuging to collect the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells.
  • (Item B4) The protein according to any one of the above items, wherein the loss rate of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells due to the washing is 20% or less.
  • (Item B5) The protein according to any one of the above items, wherein the loss rate of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells due to the washing is 15% or less.
  • (Item B6) The protein according to any one of the above items, wherein the loss rate of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells due to the washing is 10% or less.
  • (Item B7) The protein according to any one of the above items, wherein the protein is human serum albumin.
  • (Item B8) A protein according to any one of the preceding items, wherein the cell washing solution comprises from about 0.5% to about 10% human serum albumin by weight.
  • (Item B9) A protein according to any one of the preceding items, wherein the cell washing solution comprises from about 1% to about 5% human serum albumin by weight.
  • (Item B10) A protein according to any one of the preceding items, wherein the cell washing solution comprises from about 1% to about 3% human serum albumin by weight.
  • (Item B12) Protein according to any one of the above items, wherein the solution is a culture medium or a buffer, or comprises one or more components of a culture medium or a buffer.
  • the above culture medium is Opti-MEM (registered trademark), DMEM, MEM, RPMI1640, Ham's F-12, PBS, HEPES, Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), physiological saline, oxyglutathione solution. Protein according to any one of the items.
  • (Item B14) Protein according to any of the preceding items, wherein the components of the culture medium include calcium, magnesium, potassium, sodium, phosphate, bicarbonate, vitamins, essential amino acids, or combinations thereof.
  • the composition is brought into contact with the cultured corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells, the corneal endothelial cells are washed, and the washing of the corneal endothelial cells is performed by contacting the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells with the composition.
  • the above method is carried out by suspending the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells to provide a suspension of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells, and centrifuging the suspension to collect the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells. Protein according to any one of the items.
  • (Item B18) The protein according to any one of the above items, wherein the washing removes impurities from the corneal endothelial cell preparation.
  • (Item B19) The protein according to any one of the above items, wherein the loss rate of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells due to the washing is 20% or less.
  • (Item B20) The protein according to any one of the above items, wherein the loss rate of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells due to the washing is 15% or less.
  • (Item B21) The protein according to any one of the above items, wherein the loss rate of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells due to the washing is 10% or less.
  • the protein is human serum albumin.
  • (Item B23) A protein according to any one of the preceding items, wherein the composition comprises from about 0.5% to about 10% by weight human serum albumin.
  • (Item B24) A protein according to any one of the preceding items, wherein the composition comprises about 1% to about 5% human serum albumin by weight.
  • (Item B25) A protein according to any one of the preceding items, wherein the composition comprises from about 1% to about 3% by weight human serum albumin.
  • the composition is or comprises one or more components of a culture medium, a buffer or an intraocular irrigant. protein.
  • the culture medium or intraocular irrigation fluid may be Opti-MEM®, DMEM, MEM, RPMI1640, Ham's F-12, PBS, HEPES, Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), physiological saline, oxyglutathione.
  • the protein according to any one of the above items, which is a liquid.
  • a corneal endothelial cell preparation comprising: A step of washing corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells with a solution containing about 0.01% to about 10% by weight of protein, and mixing the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells with a composition for formulation.
  • a corneal endothelial cell preparation, wherein the protein is selected from the group consisting of human serum albumin, casein, lactoferrin, ovalbumin, and combinations thereof.
  • the washing step comprises suspending the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells in the solution to provide a suspension of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells, and centrifuging the suspension.
  • the corneal endothelial cell preparation according to the above item which comprises collecting the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells.
  • (Item C4) The corneal endothelial cell preparation according to any one of the above items, wherein the loss rate of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells in the washing step is 20% or less.
  • (Item C5) The corneal endothelial cell preparation according to any one of the above items, wherein the loss rate of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells in the washing step is 15% or less.
  • (Item C6) The corneal endothelial cell preparation according to any one of the above items, wherein the loss rate of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells in the washing step is 10% or less.
  • (Item C7) The corneal endothelial cell preparation according to any one of the above items, wherein the protein is human serum albumin.
  • (Item C8) A corneal endothelial cell preparation according to any of the preceding items, wherein the solution comprises from about 0.5% to about 10% human serum albumin by weight.
  • (Item C9) A corneal endothelial cell preparation according to any of the preceding items, wherein the solution comprises about 1% to about 5% human serum albumin by weight.
  • (Item C10) A corneal endothelial cell preparation according to any of the preceding items, wherein the solution comprises from about 1% to about 3% by weight human serum albumin.
  • the culture medium or intraocular irrigation fluid may be Opti-MEM®, DMEM, MEM, RPMI1640, Ham's F-12, PBS, HEPES, Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), physiological saline, oxyglutathione.
  • the corneal endothelial cell preparation according to any one of the above items which is a liquid or OpeGuard.
  • (Item C14) Corneal endothelial cell preparation according to any of the preceding items, wherein the components of the culture medium include calcium, magnesium, potassium, sodium, phosphate, bicarbonate, vitamins, essential amino acids, or combinations thereof.
  • (Item C15) Corneal endothelial cell preparation according to any one of the above items, wherein the components of the culture medium further include transferrin, insulin, hypoxanthine, thymidine, sodium bicarbonate, sodium pyruvate, L-glutamic acid, or a combination thereof. .
  • the formulation composition is or comprises one or more components of a cell preservation solution, culture medium, buffer, or intraocular irrigation solution. , the corneal endothelial cell preparation according to any one of the above items.
  • the cell preservation solution is CryoStor (registered trademark) CS2, CryoStor (registered trademark) CS5, Bun Bunker (registered trademark), or Cell Bunker (registered trademark). formulation.
  • the components of the cell preservation solution include DMSO, glycerin, polyethylene glycol, or a combination thereof.
  • the present disclosure provides a cell preparation in which xenogeneic components such as fetal bovine serum are removed by washing with a protein that can be administered to the human body during the preparation of a cell preparation in regenerative medicine.
  • xenogeneic components such as fetal bovine serum
  • a protein that can be administered to the human body by adding a protein that can be administered to the human body to a cell washing solution, it is possible to reduce loss during cell collection that occurs during cell washing.
  • FIG. 1 shows an overview of Examples 1 to 4.
  • FIG. 2 shows a graph of the loss rate due to the addition of casein to the cell washing solution using an immortalized corneal endothelial cell line (iHCEC). Error bars indicate mean ⁇ SD. Statistically significant differences are based on Dunnett-t test (v
  • FIG. 6 shows an overview of Example 5.
  • FIG. 8 shows a representative photograph of the results of Example 7.
  • cornea endothelial cells is used in the usual meaning used in the field.
  • the cornea is one of the layered tissues that make up the eye, is transparent, and is located closest to the outside world. In humans, the cornea is said to be made up of five layers, starting from the outside (body surface): corneal epithelium, Bowman's membrane, lamina intestinal, Descemet's membrane (corneal endothelial basement membrane), and corneal endothelium.
  • parts other than the epithelium and endothelium may be collectively referred to as the "corneal stroma", and are also referred to as such herein.
  • HCEC human corneal endothelial cells
  • HCEC human corneal endothelial cells
  • corneal endothelial-like cells refer to cells differentiated from stem cells, for example, iPS cells, etc., and which have substantially the same functions as corneal endothelial cells.
  • Methods for differentiating stem cells, such as embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), etc., into corneal endothelial-like cells are well known in the art (McCabe et al., PLoS One. 2015 Dec 21;10(12):e0145266; Ali et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2018 May 1;59(6):2437-2444).
  • iPS cells are seeded on 35 mm Matrigel-coated plates (Corning) at a 1:12 dilution (80% confluent plates) on day 0 using cell dissociation buffer (Life Technologies). (divide into 12 plates). iPS cells are grown in medium (mTeSR1; STEMCELL Technologies Inc.) for 4 days. On the fourth day, mTeSR1 medium was mixed with 80% DMEM-F12 (Life Technologies), 20% KSR (Life Technologies), 1% non-essential amino acids (Life Technologies), 1 mM L-glutamine (STEMCELL).
  • Smad inhibitor medium was mixed with 80% DMEM-F12 (Life Technologies), 20% KSR (Life Technologies), 1% non-essential amino acids (Life Technologies), 1 mM L-glutamine (STEMCELL).
  • Corneal endothelial cells and “corneal endothelial-like cells” may contain a magnetic material (for example, iron).
  • a magnetic material for example, iron
  • corneal endothelial cells containing a magnetic substance when they are injected into the anterior chamber, they can be attracted to the inside of the cornea (for example, Descemet's membrane) by magnetic force and promote adhesion (Patel et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2009 May; 50 (5): 2123-31; Mimura et al., Exp Eye Res. 2003 June; 76 (6): 745-51; and Mimura et al., Exp Eye Res. 2005 Feb; 80(2) :149-57).
  • the term "magnetic material” refers to a material that is magnetized by a magnetic field, and includes, for example, iron, cobalt, nickel, and ferrite.
  • corneal endothelial cell preparation refers to a preparation containing corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells, in a form suitable for use or in a form ready for use.
  • Preparation immediately before use refers to preparing a formulation suitable for use by adding the drug or diluting it with a solvent immediately before administration.
  • cleaning refers to removing impurities from the corneal endothelial cell preparation.
  • impurities for corneal endothelial cell preparations include xenogeneic components added during cell culture (e.g., fetal bovine serum), components undesirable for administration to humans, such as antibiotics that may be added to the culture medium ( gentamicin, etc.), enzyme inhibitors (eg, p38 MAPK inhibitors such as SB203580), waste products and cytokines released by cells into the culture medium (eg, IL-6, IL-8, etc.).
  • loss rate refers to the percentage of cells lost after washing with the cell washing solution of the present disclosure. It is calculated as a percentage of the number of cells after washing, with the number of cells before washing being taken as 100%.
  • the present disclosure provides a method for producing a corneal endothelial cell preparation, the method comprising: washing corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells with a solution containing a human-administrable protein; Provided is a method comprising the step of mixing endothelial cells or corneal endothelial-like cells with a formulation composition to obtain a corneal endothelial cell preparation.
  • the human administrable protein can be selected from the group consisting of human serum albumin, casein, lactoferrin, ovalbumin, and combinations thereof.
  • human administrable proteins may be present in solution at about 0.01% to about 10% by weight.
  • the present disclosure provides a method of producing a corneal endothelial cell preparation, the method comprising preparing corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells in a solution comprising about 0.01% to about 10% protein by weight. washing, and mixing the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells with a formulation composition to obtain a corneal endothelial cell preparation, the protein being human serum albumin, casein, lactoferrin, ovo. albumin, and combinations thereof.
  • the present disclosure provides a method of washing corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells, the method comprising suspending the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells in a solution containing a human-administrable protein.
  • a method is provided that includes providing a suspension of corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells, and centrifuging the suspension to collect the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells.
  • the human administrable protein can be selected from the group consisting of human serum albumin, casein, lactoferrin, ovalbumin, and combinations thereof.
  • human administrable proteins may be present in solution at about 0.01% to about 10% by weight.
  • the present disclosure provides a method of washing corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells, the method comprising washing corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells with a solution comprising about 0.01% to about 10% protein by weight. suspending endothelial-like cells to provide a corneal endothelial cell or a suspension of corneal endothelial-like cells, and centrifuging the suspension to collect the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells,
  • the protein is selected from the group consisting of human serum albumin, casein, lactoferrin, ovalbumin, and combinations thereof.
  • washing may be done once or multiple times, preferably twice. In order to reduce losses due to washing, washing is preferably carried out a maximum of five times.
  • the cell concentration when suspending the cells with the cell wash solution is at least about 0.5 x 104 cells/mL, at least about 1.0 x 104 cells/mL, at least about 0.5 x 10 cells/mL. 5 ⁇ 10 5 cells/mL, at least about 1.0 ⁇ 10 6 cells/mL, at least about 0.5 ⁇ 10 7 cells/mL, at least about 1.0 ⁇ 10 7 cells/mL.
  • Preferred cell concentrations are from about 1.0 ⁇ 10 6 cells/mL to about 1.0 ⁇ 10 7 cells/mL, and can be up to about 0.5 ⁇ 10 8 cells/mL.
  • the cells of the present disclosure cause less cell loss during washing and have extremely reduced impurities, so they can be used without being re-cultured after washing. This is particularly advantageous in clinical use.
  • the cells of the present disclosure can be suspended in an intended use suspension without being recultured after washing.
  • the cells of the present disclosure are cells for clinical use (eg, for cell infusion therapy) and can be washed, suspended, and administered without being recultured.
  • the step of washing comprises suspending the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells in the solution to provide a suspension of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells, and
  • the method may include centrifuging the turbid material to collect the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells.
  • the washing step may remove impurities to the corneal endothelial cell preparation.
  • Impurities for corneal endothelial cell preparations include any xenogeneic components (e.g., fetal bovine serum), any antibiotics (such as gentamicin), any enzyme inhibitors (e.g., p38 MAPK inhibitors such as SB203580, etc.), These include, but are not limited to, any waste products or any cytokines (eg, IL-6, IL-8, etc.) that are released into the culture medium. In some embodiments, washing may remove at least one of fetal bovine serum, gentamicin, p38 MAPK inhibitor, IL-6, and IL-8.
  • xenogeneic components e.g., fetal bovine serum
  • any antibiotics such as gentamicin
  • any enzyme inhibitors e.g., p38 MAPK inhibitors such as SB203580, etc.
  • washing may remove at least one of fetal bovine serum, gentamicin, p38 MAPK inhibitor, IL-6, and IL
  • the method of the present disclosure can reduce the loss rate of corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells during washing.
  • the loss rate of corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells in the washing step may be 20% or less, preferably 15% or less, and more preferably 10% or less.
  • the protein included in the washing solution can be human serum albumin.
  • the amount of human serum albumin included in the cleaning solution is about 0.5% to about 10% by weight, preferably about 1% to about 5% by weight, more preferably about It can be from 1% to about 3% by weight, most preferably about 2% by weight.
  • the protein included in the washing solution can be casein.
  • the amount of casein included in the cleaning solution is about 0.01% to about 1% by weight, preferably about 0.03% to about 0.3% by weight, more preferably about It can be 0.1% by weight.
  • the protein included in the washing solution can be lactoferrin.
  • the amount of lactoferrin included in the cleaning solution is from about 0.5% to about 5% by weight, preferably from about 1% to about 4%, more preferably from about 2% to about 4% by weight. It may be about 3% by weight, most preferably about 3% by weight.
  • the protein included in the washing solution can be ovalbumin.
  • the amount of ovalbumin included in the cleaning solution is from about 0.01% to about 1%, preferably from about 0.03% to about 0.5%, more preferably from about 0.03% to about 0.5% by weight. It may be about 0.03% to about 0.3% by weight, more preferably about 0.03% to about 0.1% by weight, most preferably about 0.03% by weight.
  • the solution used in the methods of the present disclosure may be a culture medium or buffer, or may include one or more components of a culture medium or buffer.
  • culture media, buffers, or intraocular irrigation fluids include Opti-MEM (registered trademark), Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), minimal essential medium (MEM), RPMI1640, Ham's F-12, PBS, and HEPES. , Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), physiological saline, and oxyglutathione solution.
  • the components of the culture medium may include calcium, magnesium, potassium, sodium, phosphate, bicarbonate, vitamins, essential amino acids, or combinations thereof.
  • the components of the culture medium include transferrin, insulin, hypoxanthine, thymidine, sodium bicarbonate, sodium pyruvate, L-glutamic acid, or combinations thereof in addition to the culture medium or components of the culture medium described above. But it's okay.
  • Buffers include, but are not limited to, acetate buffer, phosphate buffer, citrate buffer, HEPES buffer, Tris buffer, ammonium chloride buffer, and phosphate buffered saline.
  • the pH may be adjusted from about 6.0 to about 8.0, preferably from about 6.2 to about 7.7.
  • the buffer may be a phosphate buffer.
  • Intraocular irrigation fluids include, but are not limited to, oxyglutathione or Opegard.
  • the formulated composition may be a cell preservation solution, a culture medium, a buffer, or an intraocular irrigation solution; It may contain one or more components.
  • Cell preservation solutions include, but are not limited to, CryoStor® CS2, CryoStor® CS5, BunBunker®, and CellBunker®.
  • Certain embodiments may include dimethyl sulfoxide (DMSO), glycerin, polyethylene glycol, or combinations thereof.
  • DMSO, glycerin, polyethylene glycol, or a combination thereof may be added to the culture medium to serve as a cell preservation solution.
  • the amount of DMSO included in the cell preservation solution is about 1 to about 10% by weight, preferably about 1 to about 5%, more preferably about 1 to about 3%, most preferably It can be about 2% by weight.
  • the amount of glycerin included in the cell preservation solution is from about 1 to about 20% by weight, preferably from about 5 to about 15%, more preferably from about 7 to about 13%, and most preferably It can be about 10% by weight.
  • the amount of polyethylene glycol included in the cell preservation solution is about 1 to about 20% by weight, preferably about 5 to about 15%, more preferably about 7 to about 13%, most preferably can be about 10% by weight.
  • the present disclosure provides a cell washing solution for corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells comprising from about 0.01% to about 10% by weight of protein, wherein the protein is human serum albumin, casein, lactoferrin. , ovalbumin, and combinations thereof.
  • the present disclosure provides a composition comprising from about 0.01% to about 10% by weight protein for producing a corneal endothelial cell preparation in suspension, wherein the protein is Compositions are provided that are selected from the group consisting of albumin, casein, lactoferrin, ovalbumin, and combinations thereof.
  • washing the corneal endothelial cells comprises suspending the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells in a cell washing solution to provide a suspension of the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells, and suspending the corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells. It can be performed by centrifuging the material to collect corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells. This washing may remove impurities to the corneal endothelial cell preparation.
  • the embodiments of the loss rate of corneal endothelial cells or corneal endothelial-like cells, amount of protein, culture medium, and buffer are as described above.
  • Example 1 Reduction of loss rate by adding casein to cell washing solution
  • iHCEC immortalized corneal endothelial cell line
  • Corneal endothelial cells were mechanically peeled off along with the basement membrane from a research cornea purchased from the Seattle Eye Bank, and the basement membrane was dissolved using collagenase to recover the corneal endothelial cells, followed by primary culture.
  • the medium was Opti-MEM I Reduced-Serum Medium, Liquid (INVITROGEN catalog number: 31985-070), 8% FBS (BIOWEST, catalog number: S1820-500), and 200 mg/ml CaCl 2.2H 2 O ( SIGMA catalog number :C7902-500G), 0.08% chondroitin sulfate (SIGMA catalog number: C9819-5G), 20 ⁇ g/ml ascorbic acid (SIGMA catalog number: A4544-25G), 50 ⁇ g/ml gentamicin (INVITROGEN catalog number: 15710-064) and 5 ng/ml EGF (INVITROGEN catalog number: PHG0311) for 3T3 feeder cells was used as the basal medium.
  • SB431542 (1 ⁇ mol/l) and SB203580 (4-(4-fluorophenyl)-2-(4-methylsulfonylphenyl)-5(4-pyridyl)imidazole ⁇ 4-[4-(4-fluorophenyl) Phenyl)-2-(4-methylsulfinylphenyl)-1H-imidazol-5-yl]pyridine) (1 ⁇ mol/l) (also referred to herein as "SB203580+SB431542+3T3 conditioned medium").
  • the SV40 large T antigen and hTERT gene of the cultured corneal endothelial cells were amplified by PCR and introduced into a lentiviral vector (pLenti6.3_V5-TOPO; Life Technologies Inc.). Thereafter, the lentiviral vector was transfected with three helper plasmids (pLP1, pLP2, pLP/VSVG; Life Technologies Inc.) using transfection reagents (Fugene HD; Promega Corp., Madison, WI) to 293T cells (RCB2202; en Bioresource Center, Ibaraki, Japan).
  • iHCEC were obtained by transfection and immortalization. iHCECs were maintained in culture using DMEM + 10% FBS.
  • the purpose of washing in this step is to remove the culture medium while the cells remain adhered to the bottom of the culture vessel. This is done because if protein components such as fetal bovine serum remain in the culture solution, the cell detachment effect of Trypsin in the next step will be weakened. Since the cells are firmly adhered to the culture substrate in their cultured state, no cell loss occurs.
  • the cell concentration in the suspension was 0.5 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 7 cells/mL, although it varied from experiment to experiment. 5.
  • the number of viable cells was counted by trypan blue staining. 6. Centrifuged at 300G x 5 min. 7. The supernatant was removed and suspended in 10 mL of cell washing solution. 8. Centrifuged at 300G x 5 min. 9. Repeat steps 7-8 again. 10. The supernatant was removed, suspended in DMEM, and the number of viable cells was counted again by trypan blue staining. The cell loss rate was calculated from the number of viable cells counted in 10, with the number of living cells counted in 11.5 being taken as 100%.
  • Example 1 An overview of Example 1 is shown in FIG. 1.
  • FIG. 2 is a graph showing the loss rate when the fetal bovine serum washing step was performed using cell washing solutions with different concentrations of casein added.
  • the recovery rate of cells after washing was significantly improved in the 0.03%, 0.1%, and 0.3% added groups. In particular, by adding 0.1% casein, almost all cells (97.9%) could be recovered.
  • Example 2 Reduction of loss rate by adding lactoferrin to cell washing solution
  • material ⁇ Immortalized human corneal endothelial cells (iHCEC) ⁇ 150mm dish (Corning 430599) ⁇ Dulbecco's Modified Eagle Medium: DMEM (Nacalai tesque 08456-36) ⁇ 0.5g/L-Trypsin-0.53mmol/L-EDTA Solution, with Phenol Red (Nacalai tesque 32778-34) ⁇ Lactoferrin, derived from milk (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Trypsin-EDTA was added and incubated at 37° C. (5% CO 2 ) for 3 min. 4. After 3 minutes, the cells were suspended in 10 mL of cell washing solution and collected in a 50 ml centrifuge tube. The cell concentration in the suspension was 0.5 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 7 cells/mL, although it varied from experiment to experiment. 5. The number of viable cells was counted by trypan blue staining. 6. Centrifuged at 300G x 5 min. 7. The supernatant was removed and suspended in 10 mL of cell washing solution. 8. Centrifuged at 300G x 5 min. 9. Repeat steps 7-8 again. 10.
  • the supernatant was removed, suspended in DMEM, and the number of viable cells was counted again by trypan blue staining.
  • the loss rate was calculated from the number of living cells counted at 10, with the number of living cells counted at 11.5 being taken as 100%.
  • Example 2 An overview of Example 2 is shown in FIG.
  • FIG. 3 is a graph showing the loss rate when the fetal bovine serum washing step was performed using cell washing solutions with varying concentrations of lactoferrin. It was confirmed that the recovery rate was improved in the 1%, 2%, 3%, and 4% added groups compared to the 0% group to which lactoferrin was not added.
  • Example 3 Reduction of loss rate by adding ovalbumin to cell washing solution
  • material ⁇ Immortalized human corneal endothelial cells (iHCEC) ⁇ 150mm dish (Corning 430599) ⁇ Dulbecco's Modified Eagle Medium: DMEM (Nacalai tesque 08456-36) ⁇ 0.5g/L-Trypsin-0.53mmol/L-EDTA Solution, with Phenol Red (Nacalai tesque 32778-34) ⁇ Albumin, derived from eggs (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the supernatant was removed, suspended in DMEM, and the number of viable cells was counted again by trypan blue staining.
  • the loss rate was calculated from the number of living cells counted in 11, with the number of living cells counted in 12.6 being taken as 100%.
  • Example 3 An overview of Example 3 is shown in FIG. 1.
  • FIG. 4 is a graph showing the loss rate when the fetal bovine serum washing step was performed using cell washing solutions with varying concentrations of ovalbumin added. It was confirmed that the recovery rate was improved in the 0.01%, 0.03%, 0.1%, and 0.3% added groups compared to the 0% group to which ovalbumin was not added.
  • Example 4 Reduction of loss rate by adding human serum albumin to cell washing solution
  • material ⁇ Immortalized human corneal endothelial cells (iHCEC) ⁇ 150mm dish (Corning 430599) ⁇ OptiMEMTM -I (Invitrogen 21585-070) ⁇ Tryple TM Select Enzyme (10x) (Thermo Fisher Scientific A12177-01) ⁇ Red Cross Albumin 25% Intravenous Injection 12.5g/50mL (Japan Blood Products Organization) ⁇ 1 x Phosphatase-Buffered Saline (-): 1 x PBS (-) (Nissui pharma 05913) ⁇ Centrifuge tube 50mL (Corning 430829) ⁇ 0.5% trypan blue staining solution (Nakarai tesque 29853-34) (Method) 1.
  • Cell washing solutions with various human serum albumin concentrations were prepared by adding human serum albumin to OptiMEM.
  • the number of viable cells was counted by trypan blue staining. 6. Centrifuged at 300G x 5 min. 7. The supernatant was removed and suspended in 10 mL of cell washing solution. 8. Centrifuged at 300G x 5 min. 9. Repeat steps 7-8 again. 10. The supernatant was removed, suspended in DMEM, and the number of viable cells was counted again by trypan blue staining. The loss rate was calculated from the number of living cells counted at 10, with the number of living cells counted at 11.5 being taken as 100%.
  • Example 4 An overview of Example 4 is shown in FIG. 1.
  • FIG. 5 is a graph showing the cell recovery rate when a fetal bovine serum washing step was performed using cell washing solutions with varying concentrations of human serum albumin. It was confirmed that the recovery rate was improved in the 0.4%, 0.5%, 1%, 2%, and 5% added groups compared to the 0% group to which human serum albumin was not added.
  • Example 5 Reducing the loss rate of non-immortalized corneal endothelial cells for clinical use by adding human serum albumin to the cell washing solution
  • Culture method for human corneal endothelial cells Corneal endothelial cells were collected from human corneal tissue and subjected to primary culture and subculture. First, 0.4 w/v% trypan blue solution for cell staining (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 207-17081) was added to the center of the donor cornea for staining.
  • the trypan blue staining solution was washed away using OptiMEM TM -I (Invitrogen, 31985-088) containing gentamicin (Invitrogen, 15710-064) at a final concentration of 50 ⁇ g/mL.
  • the cornea was observed using a microscope and monitor installed in a clean bench, and Descemet's membrane stained with trypan blue was peeled off from the cornea using forceps.
  • the detached Descemet's membrane was transferred to a 12-well plate containing collagenase (Amano Enzyme Co., Ltd. 639-44651) and incubated at 37°C (5% CO 2 ) for 16 hours.
  • Descemet's membrane was transferred to a 15 mL centrifuge tube and centrifuged at 300 G for 3 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed, OptiMEM containing gentamicin at a final concentration of 50 ⁇ g/mL was added, and the mixture was centrifuged again at 300 G for 3 minutes. This operation was repeated twice. After centrifugation, the supernatant was removed, and the pellet was resuspended using a medium supplemented with Y-27632 (WAKO, 259-00613) at a final concentration of 10 ⁇ M.
  • Y-27632 WAKO, 259-00613
  • the resuspended cell suspension was seeded into 6-well plates coated with laminin E8 fragment (iMatrix-511; Nippi Co., Ltd., 892012). After 24 hours, the medium was replaced with one that did not contain Y-27632, and thereafter, the medium was replaced every two days and cultured for 10 days.
  • laminin E8 fragment iMatrix-511; Nippi Co., Ltd., 892012
  • OptiMEM TM -I was supplemented with 8% fetal bovine serum (FBS) (Thermo Fisher Scientific, GVJ0081), 50 ⁇ g/mL gentamicin, 200 mg/L calcium chloride (Otsuka Pharmaceutical 873215), and 0.08% sodium chondroitin sulfate C (WAKO, 032-14613), 5 ng/mL epidermal growth factor (EGF; invitrogen, PHG0311), 20 ⁇ g/mL ascorbic acid (nipro 21F01), and 10 ⁇ M SB203580 (Cayman Chemical, 13067) were used.
  • FBS fetal bovine serum
  • Human corneal endothelial cells after 2.4 passages were used. The medium was removed from the T25 flask during cultivation, OptiMEM TM -I previously warmed to 37°C was added, and the flask was washed. This operation was repeated twice. 3. After removing OptiMEM, Tryple TM Select Enzyme (10 ⁇ ) was added and incubated at 37° C. (5% CO 2 ) for 20 min. 4. After 20 minutes, the cells were suspended in 10 mL of cell washing solution and collected into a 15 mL stemful. The cell concentration in the suspension was approximately 9 ⁇ 10 6 cells/mL. 5. The number of viable cells was counted by trypan blue staining. 6. Centrifuged at 300G x 5 min. 7.
  • the supernatant was removed and suspended in 10 mL of cell washing solution.
  • the cell concentration in the suspension was 0.5 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 7 cells/mL, although it varied from experiment to experiment. 8. Centrifuged at 300G x 5 min. 9. Repeat steps 7-8 again. 10.
  • the supernatant was removed, suspended in OptiMEM, and the number of viable cells was counted again by trypan blue staining. The loss rate was calculated from the number of living cells counted at 10, with the number of living cells counted at 11.5 being taken as 100%.
  • Example 5 An overview of Example 5 is shown in FIG.
  • FIG. 7 is a graph showing the loss rate when a fetal bovine serum washing step was performed using cell washing solutions with varying concentrations of human serum albumin.
  • the normal washing method using the 0% group to which no human serum albumin was added about 20% of the cells were lost during washing, and the number of recovered cells was 82.5%. It was confirmed that the recovery rate was improved in the 2% and 5% added groups compared to the 0% group to which human serum albumin was not added. In particular, by adding 2% human serum albumin to the cell washing solution, almost all cells could be recovered without loss.
  • Example 6-1 Manufacturing example 1 of corneal endothelial cell preparation
  • This example shows an example of manufacturing a corneal endothelial cell preparation (cryopreservation preparation).
  • Example 6-2 Manufacturing example 2 of corneal endothelial cell preparation
  • This example shows an example of manufacturing a corneal endothelial cell preparation (cryopreservation preparation).
  • Method - Add 5 mL of TrypLE TM Select Enzyme (10x) (warmed at 37°C) to a 75 cm 2 flask for Corning adherent cell culture, and incubate in an incubator at 37°C for 20 minutes. - Collect the entire cell suspension from the Corning adherent cell culture 75 cm 2 flask using an autopipettor and place it in a 50 mL centrifuge tube (liquid volume: 15 mL). - Add 10 mL of 2% HSA + CTS TM Opti-MEM TM I Medium (37°C) to a Corning adherent cell culture 75 cm 2 flask to suspend corneal endothelial cells. This is done twice (liquid volume: 35 mL).
  • Example 7 Example of use of corneal endothelial cell preparation
  • This example shows an example of the use of a corneal endothelial cell preparation.
  • material ⁇ Japanese white rabbit ⁇ Corneal endothelial cell freezing preparation prepared in Example 6-2
  • Rabbit lens removal surgery was performed 7 to 14 days before cell transfer. - On the day of cell transfer, rabbit corneal endothelium was removed over a diameter of 8 mm using a scraper.
  • a corneal endothelial cell preparation (8.0 x 10 5 HCEC + 0.3 mL CS2 + 100 ⁇ M Y-) that had been rapidly thawed in a 37°C water bath was added. 27632) was aspirated with a 27-gauge nanoneedle syringe, and 300 ⁇ L of corneal endothelial preparation was transferred into the anterior chamber.
  • the rabbit's face (eye surface) was kept facing downward for 3 hours to allow the corneal endothelial cells to settle on the corneal endothelium.
  • Rabbits were euthanized 5 days after transfer, and immunohistological examination was performed.
  • fetal bovine serum which is a xenogeneic component.
  • a cell preparation washed with a protein that can be administered to the human body can be used for cell transplantation, etc., and therefore can be used in fields such as pharmaceuticals.

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Abstract

本開示は、角膜内皮細胞の洗浄方法および角膜内皮細胞製剤の製造方法を提供する。一態様において、本開示は、角膜内皮細胞製剤を製造する方法であって、該方法が、約０．０１重量％～約１０重量％のタンパク質を含む溶液で角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を洗浄する工程、および該角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞と、製剤化用組成物とを混合して、角膜内皮細胞製剤とする工程を含み、該タンパク質が、ヒト血清アルブミン、カゼイン、ラクトフェリン、オボアルブミン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、方法を提供する。

Description

培養由来成分を含まない角膜内皮細胞製剤及びその製造法
　本開示は、角膜内皮細胞の洗浄方法および角膜内皮細胞製剤の製造方法、およびそのような方法によって製造された角膜内皮細胞製剤に関する。
　角膜内皮細胞が障害されると角膜が混濁し、水疱性角膜症による重症の視力障害をきたす。水疱性角膜症に対する唯一の治療法は角膜移植であるが、ドナー不足や拒絶反応などの問題があり、新しい再生医学的治療の開発が望まれている。本発明者らは、ドナー角膜より分離した角膜内皮細胞をＲＯＣＫ阻害剤の添加のもとに増殖させ、多くの患者にその細胞を注入することで角膜内皮を再生する治療法を確立した。一方で、細胞を患者に安全に投与するためには培養器から細胞を回収し、培養の際に添加された牛胎児血清等を除去する必要があるが、従来法では洗浄時に細胞が障害を受けたり、容器に付着することで５０％前後の細胞しか回収出来なかった。
　本発明者らは細胞洗浄時に安定化成分を添加する方法を詳細に検討し、ヒト血清アルブミンなどの臨床使用できるタンパク質成分を適量添加することで細胞の回収率を落とすことなく細胞を効率的に洗浄できる方法を見出した。
　本開示は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
　角膜内皮細胞製剤を製造する方法であって、該方法が、
　約０．０１重量％～約１０重量％のタンパク質を含む溶液で角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を洗浄する工程、および
　該角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞と、製剤化用組成物とを混合して、角膜内皮細胞製剤とする工程
を含み、該タンパク質が、ヒト血清アルブミン、カゼイン、ラクトフェリン、オボアルブミン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
（項目２）
　前記洗浄する工程が、前記溶液で前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を懸濁して前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞の懸濁物を提供すること、および該懸濁物を遠心分離して前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を回収することを含む、上記項目に記載の方法。
（項目３）
　前記洗浄により、前記角膜内皮細胞製剤に対する不純物が取り除かれる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目４）
　前記洗浄工程における前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、２０％以下である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
　前記洗浄工程における前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、１５％以下である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
　前記洗浄工程における前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、１０％以下である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
　前記タンパク質が、ヒト血清アルブミンである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
　前記溶液が、約０．５重量％～約１０重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
　前記溶液が、約１重量％～約５重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
　前記溶液が、約１重量％～約３重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
　前記溶液が、約２重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
　前記溶液が、培養培地、緩衝液または眼内灌流液であるか、あるいは培養培地、緩衝液または眼内灌流液の１つまたは複数の成分を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
　前記培養培地または眼内灌流液が、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｈａｎｋｓ’　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）、生理食塩液、オキシグルタチオン液またはオペガードである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
　前記培養培地の成分が、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、リン酸塩、重炭酸塩、ビタミン、必須アミノ酸、またはそれらの組み合わせを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
　前記培養培地の成分が、トランスフェリン、インシュリン、ヒポキサンチン、チミジン、重炭酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン酸、またはそれらの組み合わせをさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
　前記製剤化用組成物が、細胞保存液、培養培地、緩衝液または眼内灌流液であるか、あるいは細胞保存液、培養培地、緩衝液または眼内灌流液の１つまたは複数の成分を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
　前記細胞保存液が、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５、バンバンカー（登録商標）、またはセルバンカー（登録商標）である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
　前記細胞保存液の成分が、ＤＭＳＯ、グリセリン、ポリエチレングリコール、またはそれらの組み合わせを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
　角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を洗浄する方法であって、該方法が、
　約０．０１重量％～約１０重量％のタンパク質を含む溶液で角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を懸濁して角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞の懸濁物を提供する工程、および
　該懸濁物を遠心分離して該角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を回収する工程
を含み、該タンパク質が、ヒト血清アルブミン、カゼイン、ラクトフェリン、オボアルブミン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
（項目１９Ａ）
　前記洗浄により、前記角膜内皮細胞製剤に対する不純物が取り除かれる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９Ｂ）
　前記洗浄による前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、２０％以下である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９Ｃ）
　前記洗浄による前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、１５％以下である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９Ｄ）
　前記洗浄による前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、１０％以下である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９Ｅ）
　前記タンパク質が、ヒト血清アルブミンである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９Ｆ）
　前記溶液が、約０．５重量％～約１０重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９Ｇ）
　前記溶液が、約１重量％～約５重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９Ｈ）
　前記溶液が、約１重量％～約３重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９Ｉ）
　前記溶液が、約２重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９Ｊ）
　前記溶液が、培養培地、緩衝液または眼内灌流液であるか、あるいは培養培地、緩衝液または眼内灌流液の１つまたは複数の成分を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９Ｋ）
　前記培養培地または眼内灌流液が、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｈａｎｋｓ’　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）、生理食塩液、オキシグルタチオン液またはオペガードである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９Ｌ）
　前記培養培地の成分が、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、リン酸塩、重炭酸塩、ビタミン、必須アミノ酸、またはそれらの組み合わせを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
　約０．０１重量％～約１０重量％のタンパク質を含む角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞の細胞洗浄溶液であって、該タンパク質が、ヒト血清アルブミン、カゼイン、ラクトフェリン、オボアルブミンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、細胞洗浄溶液。
（項目２１）
　前記角膜内皮細胞の洗浄が、前記細胞洗浄溶液で前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を懸濁して前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞の懸濁物を提供すること、および該懸濁物を遠心分離して前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を回収することによって実施される、上記項目のいずれか一項に記載の細胞洗浄溶液。
（項目２２）
　前記洗浄により、前記角膜内皮細胞製剤に対する不純物が取り除かれる、上記項目のいずれか一項に記載の細胞洗浄溶液。
（項目２３）
　前記洗浄による前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、２０％以下である、上記項目のいずれか一項に記載の細胞洗浄溶液。
（項目２４）
　前記洗浄による前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、１５％以下である、上記項目のいずれか一項に記載の細胞洗浄溶液。
（項目２５）
　前記洗浄による前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、１０％以下である、上記項目のいずれか一項に記載の細胞洗浄溶液。
（項目２６）
　前記タンパク質が、ヒト血清アルブミンである、上記項目のいずれか一項に記載の細胞洗浄溶液。
（項目２７）
　約０．５重量％～約１０重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の細胞洗浄溶液。
（項目２８）
　約１重量％～約５重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の細胞洗浄溶液。
（項目２９）
　約１重量％～約３重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の細胞洗浄溶液。
（項目３０）
　約２重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の細胞洗浄溶液。
（項目３１）
　前記溶液が、培養培地または緩衝液であるか、あるいは培養培地または緩衝液の１つまたは複数の成分を含む、上記項目のいずれか一項に記載の細胞洗浄溶液。
（項目３２）
　前記培養培地が、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｈａｎｋｓ’　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）、生理食塩液、オキシグルタチオン液である、上記項目のいずれか一項に記載の細胞洗浄溶液。
（項目３３）
　前記培養培地の成分が、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、リン酸塩、重炭酸塩、ビタミン、必須アミノ酸、またはそれらの組み合わせを含む、上記項目のいずれか一項に記載の細胞洗浄溶液。
（項目３４）
　前記培養培地の成分が、トランスフェリン、インシュリン、ヒポキサンチン、チミジン、重炭酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン酸、またはそれらの組み合わせをさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の細胞洗浄溶液。
（項目３５）
　懸濁状態の角膜内皮細胞製剤を製造するための、約０．０１重量％～約１０重量％のタンパク質を含む組成物であって、該タンパク質が、ヒト血清アルブミン、カゼイン、ラクトフェリン、オボアルブミンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、組成物。
（項目３５Ａ）
　前記組成物が、培養後の角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞と接触させられ、角膜内皮細胞が洗浄され、前記角膜内皮細胞の洗浄が、前記組成物で前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を懸濁して前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞の懸濁物を提供すること、および該懸濁物を遠心分離して前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を回収することによって実施される、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３５Ｂ）
　前記洗浄により、前記角膜内皮細胞製剤に対する不純物が取り除かれる、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３５Ｃ）
　前記洗浄による前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、２０％以下である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３５Ｄ）
　前記洗浄による前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、１５％以下である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３５Ｅ）
　前記洗浄による前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、１０％以下である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３５Ｆ）
　前記タンパク質が、ヒト血清アルブミンである、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３５Ｇ）
　約０．５重量％～約１０重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３５Ｈ）
　約１重量％～約５重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３５Ｉ）
　約１重量％～約３重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３５Ｊ）
　約２重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３５Ｋ）
　前記組成物が、培養培地、緩衝液または眼内灌流液であるか、あるいは培養培地、緩衝液または眼内灌流液の１つまたは複数の成分を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３５Ｌ）
　前記培養培地または眼内灌流液が、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｈａｎｋｓ’　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）、生理食塩液、オキシグルタチオン液である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３５Ｍ）
　前記培養培地の成分が、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、リン酸塩、重炭酸塩、ビタミン、必須アミノ酸、またはそれらの組み合わせを含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３５Ｎ）
　前記培養培地の成分が、トランスフェリン、インシュリン、ヒポキサンチン、チミジン、重炭酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン酸、またはそれらの組み合わせをさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ａ１）
　角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞の細胞洗浄におけるタンパク質の使用であって、該タンパク質が、約０．０１重量％～約１０重量％で存在する細胞洗浄溶液において使用され、該タンパク質が、ヒト血清アルブミン、カゼイン、ラクトフェリン、オボアルブミンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、使用。
（項目Ａ２）
　前記角膜内皮細胞の洗浄が、前記細胞洗浄溶液で前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を懸濁して前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞の懸濁物を提供すること、および該懸濁物を遠心分離して前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を回収することによって実施される、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ａ３）
　前記洗浄により、前記角膜内皮細胞製剤に対する不純物が取り除かれる、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ａ４）
　前記洗浄による前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、２０％以下である、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ａ５）
　前記洗浄による前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、１５％以下である、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ａ６）
　前記洗浄による前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、１０％以下である、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ａ７）
　前記タンパク質が、ヒト血清アルブミンである、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ａ８）
　該細胞洗浄溶液が、約０．５重量％～約１０重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ａ９）
　該細胞洗浄溶液が、約１重量％～約５重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ａ１０）
　該細胞洗浄溶液が、約１重量％～約３重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ａ１１）
　該細胞洗浄溶液が、約２重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ａ１２）
　前記溶液が、培養培地または緩衝液であるか、あるいは培養培地または緩衝液の１つまたは複数の成分を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ａ１３）
　前記培養培地が、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｈａｎｋｓ’　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）、生理食塩液、オキシグルタチオン液である、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ａ１４）
　前記培養培地の成分が、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、リン酸塩、重炭酸塩、ビタミン、必須アミノ酸、またはそれらの組み合わせを含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ａ１５）
　前記培養培地の成分が、トランスフェリン、インシュリン、ヒポキサンチン、チミジン、重炭酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン酸、またはそれらの組み合わせをさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ａ１６）
　懸濁状態の角膜内皮細胞製剤の製造におけるタンパク質の使用であって、該タンパク質が、約０．０１重量％～約１０重量％で存在する組成物において使用され、該タンパク質が、ヒト血清アルブミン、カゼイン、ラクトフェリン、オボアルブミンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、使用。
（項目Ａ１７）
　前記組成物が、培養後の角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞と接触させられ、角膜内皮細胞が洗浄され、前記角膜内皮細胞の洗浄が、前記組成物で前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を懸濁して前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞の懸濁物を提供すること、および該懸濁物を遠心分離して前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を回収することによって実施される、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ａ１８）
　前記洗浄により、前記角膜内皮細胞製剤に対する不純物が取り除かれる、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ａ１９）
　前記洗浄による前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、２０％以下である、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ａ２０）
　前記洗浄による前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、１５％以下である、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ａ２１）
　前記洗浄による前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、１０％以下である、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ａ２２）
　前記タンパク質が、ヒト血清アルブミンである、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ａ２３）
　該組成物が、約０．５重量％～約１０重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ａ２４）
　該組成物が、約１重量％～約５重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ａ２５）
　該組成物が、約１重量％～約３重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ａ２６）
　該組成物が、約２重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ａ２７）
　前記組成物が、培養培地、緩衝液または眼内灌流液であるか、あるいは培養培地、緩衝液または眼内灌流液の１つまたは複数の成分を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ａ２８）
　前記培養培地または眼内灌流液が、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｈａｎｋｓ’　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）、生理食塩液、オキシグルタチオン液である、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ａ２９）
　前記培養培地の成分が、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、リン酸塩、重炭酸塩、ビタミン、必須アミノ酸、またはそれらの組み合わせを含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ａ３０）
　前記培養培地の成分が、トランスフェリン、インシュリン、ヒポキサンチン、チミジン、重炭酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン酸、またはそれらの組み合わせをさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ１）
　角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞の細胞洗浄のためのタンパク質であって、該タンパク質が、約０．０１重量％～約１０重量％で存在する細胞洗浄溶液において使用され、該タンパク質が、ヒト血清アルブミン、カゼイン、ラクトフェリン、オボアルブミンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、タンパク質。
（項目Ｂ２）
　前記角膜内皮細胞の洗浄が、前記細胞洗浄溶液で前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を懸濁して前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞の懸濁物を提供すること、および該懸濁物を遠心分離して前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を回収することによって実施される、上記項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目Ｂ３）
　前記洗浄により、前記角膜内皮細胞製剤に対する不純物が取り除かれる、上記項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目Ｂ４）
　前記洗浄による前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、２０％以下である、上記項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目Ｂ５）
　前記洗浄による前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、１５％以下である、上記項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目Ｂ６）
　前記洗浄による前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、１０％以下である、上記項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目Ｂ７）
　前記タンパク質が、ヒト血清アルブミンである、上記項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目Ｂ８）
　該細胞洗浄溶液が、約０．５重量％～約１０重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目Ｂ９）
　該細胞洗浄溶液が、約１重量％～約５重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目Ｂ１０）
　該細胞洗浄溶液が、約１重量％～約３重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目Ｂ１１）
　該細胞洗浄溶液が、約２重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目Ｂ１２）
　前記溶液が、培養培地または緩衝液であるか、あるいは培養培地または緩衝液の１つまたは複数の成分を含む、上記項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目Ｂ１３）
　前記培養培地が、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｈａｎｋｓ’　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）、生理食塩液、オキシグルタチオン液である、上記項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目Ｂ１４）
　前記培養培地の成分が、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、リン酸塩、重炭酸塩、ビタミン、必須アミノ酸、またはそれらの組み合わせを含む、上記項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目Ｂ１５）
　前記培養培地の成分が、トランスフェリン、インシュリン、ヒポキサンチン、チミジン、重炭酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン酸、またはそれらの組み合わせをさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目Ｂ１６）
　懸濁状態の角膜内皮細胞製剤の製造のためのタンパク質であって、該タンパク質が、約０．０１重量％～約１０重量％で存在する組成物において使用され、該タンパク質が、ヒト血清アルブミン、カゼイン、ラクトフェリン、オボアルブミンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、タンパク質。
（項目Ｂ１７）
　前記組成物が、培養後の角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞と接触させられ、角膜内皮細胞が洗浄され、前記角膜内皮細胞の洗浄が、前記組成物で前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を懸濁して前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞の懸濁物を提供すること、および該懸濁物を遠心分離して前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を回収することによって実施される、上記項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目Ｂ１８）
　前記洗浄により、前記角膜内皮細胞製剤に対する不純物が取り除かれる、上記項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目Ｂ１９）
　前記洗浄による前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、２０％以下である、上記項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目Ｂ２０）
　前記洗浄による前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、１５％以下である、上記項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目Ｂ２１）
　前記洗浄による前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、１０％以下である、上記項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目Ｂ２２）
　前記タンパク質が、ヒト血清アルブミンである、上記項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目Ｂ２３）
　該組成物が、約０．５重量％～約１０重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目Ｂ２４）
　該組成物が、約１重量％～約５重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目Ｂ２５）
　該組成物が、約１重量％～約３重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目Ｂ２６）
　該組成物が、約２重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目Ｂ２７）
　前記組成物が、培養培地、緩衝液または眼内灌流液であるか、あるいは培養培地、緩衝液または眼内灌流液の１つまたは複数の成分を含む、上記項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目Ｂ２８）
　前記培養培地または眼内灌流液が、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｈａｎｋｓ’　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）、生理食塩液、オキシグルタチオン液である、上記項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目Ｂ２９）
　前記培養培地の成分が、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、リン酸塩、重炭酸塩、ビタミン、必須アミノ酸、またはそれらの組み合わせを含む、上記項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目Ｂ３０）
　前記培養培地の成分が、トランスフェリン、インシュリン、ヒポキサンチン、チミジン、重炭酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン酸、またはそれらの組み合わせをさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目Ｃ１）
　角膜内皮細胞製剤であって、該角膜内皮細胞製剤が、
　約０．０１重量％～約１０重量％のタンパク質を含む溶液で角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を洗浄する工程、および
　該角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞と、製剤化用組成物とを混合して、角膜内皮細胞製剤とする工程
によって製造され、該タンパク質が、ヒト血清アルブミン、カゼイン、ラクトフェリン、オボアルブミン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、角膜内皮細胞製剤。
（項目Ｃ２）
　前記洗浄する工程が、前記溶液で前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を懸濁して前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞の懸濁物を提供すること、および該懸濁物を遠心分離して前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を回収することを含む、上記項目に記載の角膜内皮細胞製剤。
（項目Ｃ３）
　前記洗浄により、前記角膜内皮細胞製剤に対する不純物が取り除かれる、上記項目のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞製剤。
（項目Ｃ４）
　前記洗浄工程における前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、２０％以下である、上記項目のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞製剤。
（項目Ｃ５）
　前記洗浄工程における前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、１５％以下である、上記項目のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞製剤。
（項目Ｃ６）
　前記洗浄工程における前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、１０％以下である、上記項目のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞製剤。
（項目Ｃ７）
　前記タンパク質が、ヒト血清アルブミンである、上記項目のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞製剤。
（項目Ｃ８）
　前記溶液が、約０．５重量％～約１０重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞製剤。
（項目Ｃ９）
　前記溶液が、約１重量％～約５重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞製剤。
（項目Ｃ１０）
　前記溶液が、約１重量％～約３重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞製剤。
（項目Ｃ１１）
　前記溶液が、約２重量％のヒト血清アルブミンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞製剤。
（項目Ｃ１２）
　前記溶液が、培養培地、緩衝液または眼内灌流液であるか、あるいは培養培地、緩衝液または眼内灌流液の１つまたは複数の成分を含む、上記項目のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞製剤。
（項目Ｃ１３）
　前記培養培地または眼内灌流液が、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｈａｎｋｓ’　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）、生理食塩液、オキシグルタチオン液またはオペガードである、上記項目のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞製剤。
（項目Ｃ１４）
　前記培養培地の成分が、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、リン酸塩、重炭酸塩、ビタミン、必須アミノ酸、またはそれらの組み合わせを含む、上記項目のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞製剤。
（項目Ｃ１５）
　前記培養培地の成分が、トランスフェリン、インシュリン、ヒポキサンチン、チミジン、重炭酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン酸、またはそれらの組み合わせをさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞製剤。
（項目Ｃ１６）
　前記製剤化用組成物が、細胞保存液、培養培地、緩衝液または眼内灌流液であるか、あるいは細胞保存液、培養培地、緩衝液または眼内灌流液の１つまたは複数の成分を含む、上記項目のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞製剤。
（項目Ｃ１７）
　前記細胞保存液が、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５、バンバンカー（登録商標）、またはセルバンカー（登録商標）である、上記項目のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞製剤。
（項目Ｃ１８）
　前記細胞保存液の成分が、ＤＭＳＯ、グリセリン、ポリエチレングリコール、またはそれらの組み合わせを含む、上記項目のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞製剤。
　本発明において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供されうることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
　本開示により、再生医療における細胞製剤の調製時に、人体に投与可能なタンパク質を用いて洗浄することで、ウシ胎児血清などの異種由来成分を取り除いた細胞製剤を提供される。本発明により、人体に投与可能なタンパク質を細胞洗浄液に添加することで、細胞洗浄時に生じる細胞回収時の喪失を低減化することができる。
図１は、実施例１～４の概要を示す。 図２は、不死化角膜内皮細胞株（ｉＨＣＥＣ）を使用した、カゼインの細胞洗浄溶液への添加によるロス率のグラフを示す。エラーバーは平均±ＳＤを示す。統計学的有意差はＤｕｎｎｅｔｔ－ｔ検定（ｖｓ０％）に基づく（ｎ＝３，＊＊ｐ＜０．０１，＊ｐ＜０．０５）。 図３は、不死化角膜内皮細胞株（ｉＨＣＥＣ）を使用した、ラクトフェリンの細胞洗浄溶液への添加によるロス率のグラフを示す。エラーバーは平均±ＳＤを示す。統計学的有意差はＤｕｎｎｅｔｔ－ｔ検定（ｖｓ０％）に基づく（ｎ＝３，＊＊ｐ＜０．０１，＊ｐ＜０．０５）。 図４は、不死化角膜内皮細胞株（ｉＨＣＥＣ）を使用した、オボアルブミンの細胞洗浄溶液への添加によるロス率のグラフを示す。エラーバーは平均±ＳＤを示す。統計学的有意差はＤｕｎｎｅｔｔ－ｔ検定（ｖｓ０％）に基づく（ｎ＝３，＊＊ｐ＜０．０１，＊ｐ＜０．０５）。 図５は、不死化角膜内皮細胞株（ｉＨＣＥＣ）を使用した、ヒト血清アルブミンの細胞洗浄溶液への添加によるロス率のグラフを示す。エラーバーは平均±ＳＤを示す。統計学的有意差はＤｕｎｎｅｔｔ－ｔ検定（ｖｓ０％）に基づく（ｎ＝３，＊＊ｐ＜０．０１，＊ｐ＜０．０５）。 図６は、実施例５の概要を示す。 図７は、４回継代後のヒト角膜内皮細胞を使用した、ヒト血清アルブミンの細胞洗浄溶液への添加によるロス率のグラフを示す。エラーバーは平均±ＳＤを示す。統計学的有意差はＤｕｎｎｅｔｔ－ｔ検定（ｖｓ０％）に基づく（ｎ＝３，＊＊ｐ＜０．０１）。 図８は、実施例７の結果の代表的な写真を示す。
　以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。本明細書において、「約」とは、後に続く値の±１０％を意味する。
　（定義）
　本明細書において、「角膜内皮細胞」とは当該分野で用いられる通常の意味で用いられる。角膜とは、眼を構成する層状の組織の一つであり透明であり、最も外界に近い部分に位置する。角膜は、ヒトでは外側（体表面）から順に５層でできているとされ、外側から角膜上皮、ボーマン膜、固有層、デスメ膜（角膜内皮基底膜）、および角膜内皮で構成される。特に、特定しない限り、上皮および内皮以外の部分は「角膜実質」とまとめて称することがあり、本明細書でもそのように称する。本明細書において「ＨＣＥＣ」（ｈｕｍａｎ　ｃｏｒｎｅａｌ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ）とは、ヒト角膜内皮細胞の略称である。
　本明細書において、「角膜内皮様細胞」とは、幹細胞から分化した細胞、例えばｉＰＳ細胞等から分化した細胞であって、角膜内皮細胞と実質的な同一の機能を有する細胞を指す。幹細胞、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等から角膜内皮様細胞へと分化させる方法は、当該分野で周知である（ＭｃＣａｂｅ　ｅｔ　ａｌ．，　ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．　２０１５　Ｄｅｃ　２１；１０（１２）：ｅ０１４５２６６；　Ａｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｎｖｅｓｔ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　Ｖｉｓ　Ｓｃｉ．　２０１８　Ｍａｙ　１；５９（６）：２４３７－２４４４）。典型的な例において、簡潔には、細胞解離バッファー（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、０日目に１：１２希釈でｉＰＳ細胞を３５ｍｍマトリゲルコーティングプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種する（８０％コンフルエントプレートを１２個のプレートに分ける）。ｉＰＳ細胞を４日間培地（ｍＴｅＳＲ１；ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．）中で増殖させる。４日目に、ｍＴｅＳＲ１培地を、８０％ＤＭＥＭ－Ｆ１２（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２０％ＫＳＲ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１ｍＭ　Ｌ－グルタミン（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｉｎｃ．）、０．１ｍＭ　β－メルカプトエタノール（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）、および８ｎｇ／ｍＬ　βＦＧＦ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）の基本培地中に、５００ｎｇ／ｍＬヒト組換えＮｏｇｇｉｎ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）および１０μＭのＳＢ４３１５４２（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を含むＳｍａｄ阻害剤培地で置換する。６日目に、Ｓｍａｄ阻害剤培地を、８０％ＤＭＥＭ－Ｆ１２（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２０％ＫＳＲ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１ｍＭ　Ｌ－グルタミン（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｉｎｃ．）、０．１ｍＭ　β－メルカプトエタノール（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）、および８ｎｇ／ｍＬ　βＦＧＦ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）の基本培地中に、０．１×　Ｂ２７サプリメント（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０ｎｇ／ｍＬ組換えヒト血小板由来増殖因子－ＢＢ（ＰＤＧＦ－ＢＢ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ　Ｈｉｌｌ，ＮＪ，ＵＳＡ）および１０ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＤｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質－２（ＤＫＫ－２；Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む角膜培地で置換する。７日目に、分化中のＣＥＣを、新しいマトリゲールコーティングプレート（３５ｍｍ）に移し、さらに１３日間角膜培地中で増殖させる。分化したＣＥＣを２０日目に回収する。上記例は典型的な例であって、当業者は、当該分野で周知の他の方法（Ｆｕｋｕｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．　２０１４　Ｄｅｃ　２；９（１２）：ｅ１１２２９１；　Ｈａｙａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ．　２０１６　Ｍａｒ　１７；５３１（７５９４）：３７６－８０）も使用し得る。また、当業者であれば、当該分野で周知の方法の条件を適宜調節して、角膜内皮様細胞を作製することができる。
　「角膜内皮細胞」および「角膜内皮様細胞」は、磁性体（例えば、鉄）を含んでいてもよい。例えば、磁性物質を含む角膜内皮細胞を前房内に注入した場合、磁力により角膜の内側（例えば、デスメ膜）に引き付け接着を促すことが可能である（Ｐａｔｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｎｖｅｓｔ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　Ｖｉｓ　Ｓｃｉ．　２００９　Ｍａｙ；５０（５）：２１２３－３１；Ｍｉｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｘｐ　Ｅｙｅ　Ｒｅｓ．　２００３　Ｊｕｎ；７６（６）：７４５－５１；およびＭｉｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｘｐ　Ｅｙｅ　Ｒｅｓ．　２００５　Ｆｅｂ；８０（２）：１４９－５７）。「磁性体」とは、磁場により磁化される物質を指し、例えば、鉄、コバルト、ニッケル、フェライトなどが挙げられる。
　本明細書において、「角膜内皮細胞製剤」とは、角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を含む製剤であって、使用に適した形態、または用時調製の形態の製剤を指す。「用時調製」とは、投与する直前に、薬剤を追加することにより、または溶媒で希釈することによって使用に適した製剤を調製することをいう。
　本明細書において、「洗浄」とは、角膜内皮細胞製剤に対する不純物を取り除くことを指す。「角膜内皮細胞製剤に対する不純物」とは、細胞培養の際に添加される異種由来成分（例えば、ウシ胎仔血清）、ヒトへの投与に好ましくない成分、例えば、培養培地に添加され得る抗生物質（ゲンタマイシンなど）、酵素阻害剤（例えば、ＳＢ２０３５８０などのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤）、細胞が培地中に放出する老廃物やサイトカイン類（例えば、ＩＬ－６、ＩＬ－８等）を指す。
　本明細書において、「ロス率」とは、本開示の細胞洗浄溶液での洗浄後に喪失する細胞の割合を指す。洗浄前の細胞数を１００％として、洗浄後の細胞数の割合として計算される。
　（好ましい実施形態）
　以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。これらの実施形態について、当業者は適宜、任意の実施形態を組み合わせ得る。
　（角膜内皮細胞製剤を製造する方法および角膜内皮細胞の洗浄方法）
　一態様において、本開示は、角膜内皮細胞製剤を製造する方法であって、該方法が、ヒトに投与可能なタンパク質を含む溶液で角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を洗浄する工程、および該角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞と、製剤化用組成物とを混合して、角膜内皮細胞製剤とする工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、ヒトに投与可能なタンパク質は、ヒト血清アルブミン、カゼイン、ラクトフェリン、オボアルブミン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態において、ヒトに投与可能なタンパク質は、約０．０１重量％～約１０重量％で溶液中に含み得る。
　一態様において、本開示は、角膜内皮細胞製剤を製造する方法であって、該方法が、約０．０１重量％～約１０重量％のタンパク質を含む溶液で角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を洗浄する工程、および該角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞と、製剤化用組成物とを混合して、角膜内皮細胞製剤とする工程を含み、該タンパク質が、ヒト血清アルブミン、カゼイン、ラクトフェリン、オボアルブミン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、方法を提供する。
　一態様において、本開示は、角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を洗浄する方法であって、該方法が、ヒトに投与可能なタンパク質を含む溶液で角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を懸濁して角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞の懸濁物を提供する工程、および該懸濁物を遠心分離して該角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を回収する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、ヒトに投与可能なタンパク質は、ヒト血清アルブミン、カゼイン、ラクトフェリン、オボアルブミン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態において、ヒトに投与可能なタンパク質は、約０．０１重量％～約１０重量％で溶液中に含み得る。
　一態様において、本開示は、角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を洗浄する方法であって、該方法が、約０．０１重量％～約１０重量％のタンパク質を含む溶液で角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を懸濁して角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞の懸濁物を提供する工程、および該懸濁物を遠心分離して該角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を回収する工程を含み、該タンパク質が、ヒト血清アルブミン、カゼイン、ラクトフェリン、オボアルブミン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、方法を提供する。
　いくつかの実施形態において、洗浄は、１回であっても複数回であってもよく、好ましくは２回である。洗浄によるロスを低減するために、洗浄は最大で５回であるのが好ましい。
　いくつかの実施形態において、細胞洗浄溶液により細胞を懸濁する際の細胞濃度は、少なくとも約０．５×１０４個／ｍＬ、少なくとも約１．０×１０４個／ｍＬ、少なくとも約０．５×１０５個／ｍＬ、少なくとも約１．０×１０６個／ｍＬ、少なくとも約０．５×１０７個／ｍＬ、少なくとも約１．０×１０７個／ｍＬであり得る。好ましい細胞濃度は、約１．０×１０６個／ｍＬ～約１．０×１０７個／ｍＬであり、最大で約０．５×１０８個／ｍＬであり得る。
　本開示の細胞は、洗浄における細胞のロスが少なく、不純物が極めて低減化されていることから、洗浄後、再培養されることなく使用され得る。これは臨床使用において特に有利である。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、洗浄後、再培養されることなく使用目的に応じた懸濁液で懸濁され得る。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は臨床用（例えば、細胞注入療法用）の細胞であり、洗浄後、再培養されることなく懸濁され、投与され得る。
　いくつかの実施形態において、前記洗浄する工程は、前記溶液で前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を懸濁して前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞の懸濁物を提供すること、および該懸濁物を遠心分離して前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を回収することを含み得る。洗浄する工程により、角膜内皮細胞製剤に対する不純物が取り除かれ得る。角膜内皮細胞製剤に対する不純物としては、任意の異種由来成分（例えば、ウシ胎仔血清）、任意の抗生物質（ゲンタマイシンなど）、任意の酵素阻害剤（例えば、ＳＢ２０３５８０などのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤等）、細胞が培地中に放出する任意の老廃物または任意のサイトカイン類（例えば、ＩＬ－６、ＩＬ－８等）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、洗浄により、ウシ胎仔血清、ゲンタマイシン、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤、ＩＬ－６、およびＩＬ－８のうちの少なくとも１つが取り除かれ得る。
　本開示の方法は、洗浄における角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率を低減することができる。いくつかの実施形態において、洗浄工程における角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率は、２０％以下であり、好ましくは１５％以下であり、より好ましくは１０％以下であり得る。
　いくつかの実施形態において、洗浄用の溶液に含まれるタンパク質はヒト血清アルブミンであり得る。特定の実施形態において、洗浄用の溶液に含まれるヒト血清アルブミンの量は、約０．５重量％～約１０重量％であり、好ましくは約１重量％～約５重量％、より好ましくは約１重量％～約３重量％、最も好ましくは約２重量％であり得る。
　いくつかの実施形態において、洗浄用の溶液に含まれるタンパク質はカゼインであり得る。特定の実施形態において、洗浄用の溶液に含まれるカゼインの量は、約０．０１重量％～約１重量％、好ましくは約０．０３重量％～約０．３重量％、より好ましくは約０．１重量％であり得る。
　いくつかの実施形態において、洗浄用の溶液に含まれるタンパク質はラクトフェリンであり得る。特定の実施形態において、洗浄用の溶液に含まれるラクトフェリンの量は、約０．５重量％～約５重量％、好ましくは約１重量％～約４重量％、より好ましくは約２重量％～約３重量％、最も好ましくは約３重量％であり得る。
　いくつかの実施形態において、洗浄用の溶液に含まれるタンパク質はオボアルブミンであり得る。特定の実施形態において、洗浄用の溶液に含まれるオボアルブミンの量は、約０．０１重量％～約１重量％、好ましくは約０．０３重量％～約０．５重量％、より好ましくは約０．０３重量％～約０．３重量％、さらに好ましくは約０．０３重量％～約０．１重量％、最も好ましくは約０．０３重量％であり得る。
　いくつかの実施形態において、本開示の方法において使用される溶液は、培養培地または緩衝液であってもよいし、あるいは培養培地または緩衝液の１つまたは複数の成分を含んでもよい。培養培地、緩衝液または眼内灌流液としては、例えば、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｈａｎｋｓ’　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）、生理食塩液、およびオキシグルタチオン液から挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、培養培地の成分は、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、リン酸塩、重炭酸塩、ビタミン、必須アミノ酸、またはそれらの組み合わせを含み得る。さらなる実施形態において、培養培地の成分は、トランスフェリン、インシュリン、ヒポキサンチン、チミジン、重炭酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン酸、またはそれらの組み合わせを、上記培養培地または培養培地の成分に加えて含んでも良い。
　緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、塩化アンモニウム緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ｐＨは、約６．０～約８．０、好ましくは、約６．２～約７．７に調整され得る。好ましい実施形態において、緩衝液はリン酸緩衝液であり得る。
　眼内灌流液としては、オキシグルタチオンまたはオペガードなどが挙げられるが、これらに限定されない。
　いくつかの実施形態において、製剤化用組成物は、細胞保存液、培養培地、緩衝液または眼内灌流液であってもよく、細胞保存液、培養培地、緩衝液または眼内灌流液の１つまたは複数の成分を含んでもよい。細胞保存液としては、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５、バンバンカー（登録商標）、およびセルバンカー（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセリン、ポリエチレングリコール、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。いくつかの実施形態において、上記培養培地にＤＭＳＯ、グリセリン、ポリエチレングリコール、またはそれらの組み合わせを加えて細胞保存液としてもよい。
　特定の実施形態において、細胞保存液に含まれるＤＭＳＯの量は、約１～約１０重量％、好ましくは、約１～約５重量％、より好ましくは約１～約３重量％、最も好ましくは約２重量％であり得る。
　特定の実施形態において、細胞保存液に含まれるグリセリンの量は、約１～約２０重量％、好ましくは、約５～約１５重量％、より好ましくは約７～約１３重量％、最も好ましくは約１０重量％であり得る。
　特定の実施形態において、細胞保存液に含まれるポリエチレングリコールの量は、約１～約２０重量％、好ましくは、約５～約１５重量％、より好ましくは約７～約１３重量％、最も好ましくは約１０重量％であり得る。
　（角膜内皮細胞洗浄溶液および製剤製造用組成物）
　一態様において、本開示は、約０．０１重量％～約１０重量％のタンパク質を含む角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞の細胞洗浄溶液であって、該タンパク質が、ヒト血清アルブミン、カゼイン、ラクトフェリン、オボアルブミンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、細胞洗浄溶液を提供する。
　別の態様において、本開示は、懸濁状態の角膜内皮細胞製剤を製造するための、約０．０１重量％～約１０重量％のタンパク質を含む組成物であって、該タンパク質が、ヒト血清アルブミン、カゼイン、ラクトフェリン、オボアルブミンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、組成物を提供する。
　いくつかの実施形態において、角膜内皮細胞の洗浄は、細胞洗浄溶液で角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を懸濁して角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞の懸濁物を提供すること、および懸濁物を遠心分離して角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を回収することによって実施され得る。この洗浄により、角膜内皮細胞製剤に対する不純物が取り除かれ得る。
　角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率、タンパク質の量、培養培地、緩衝液の実施形態は、上記のとおりである。
　以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
　以下、実施例に基づいて本開示をより具体的に説明する。本実施例において用いられる各種試薬は、具体的に示したもののほか、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＢＡＳＦジャパン株式会社などから入手されるものも用いることができることが理解される。
　（実施例１：カゼインの細胞洗浄溶液への添加によるロス率の低減）
　（調製例：不死化角膜内皮細胞株（ｉＨＣＥＣ）の作製）
　本実施例では、健常ドナー由来の研究用ドナー角膜から不死化角膜内皮細胞株（ｉＨＣＥＣ）を作製した。
　（培養方法）
　シアトルアイバンクから購入した研究用角膜より角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離し、コラゲナーゼを用いて基底膜を溶解し角膜内皮細胞を回収後、初代培養を行った。培地はＯｐｔｉ－ＭＥＭ　Ｉ　Ｒｅｄｕｃｅｄ－Ｓｅｒｕｍ　Ｍｅｄｉｕｍ，　Ｌｉｑｕｉｄ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ　カタログ番号：３１９８５－０７０）に、８％ＦＢＳ（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０－５００）、２００ｍｇ／ｍｌ　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（ＳＩＧＭＡ　カタログ番号：Ｃ７９０２－５００Ｇ）、０．０８％　コンドロイチン硫酸（ＳＩＧＭＡ　カタログ番号：Ｃ９８１９－５Ｇ）、２０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ　カタログ番号：Ａ４５４４－２５Ｇ）、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ　カタログ番号：１５７１０－０６４）および５ｎｇ／ｍｌ　ＥＧＦ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ　カタログ番号：ＰＨＧ０３１１）を加えた３Ｔ３フィーダー細胞用の馴化させたものを基本培地として用いた。また、基本培地にＳＢ４３１５４２（１μｍｏｌ／ｌ）およびＳＢ２０３５８０（４－（４－フルオロフェニル）－２－（４－メチルスルホニルフェニル）－５（４－ピリジル）イミダゾール＜４－［４－（４－フルオロフェニル）－２－（４－メチルスルフィニルフェニル）－１Ｈ－イミダゾール－５－イル］ピリジン）（１μｍｏｌ／ｌ）を添加したもの（本明細書では「ＳＢ２０３５８０＋ＳＢ４３１５４２＋３Ｔ３馴化培地」ともいう）で培養した。培養した角膜内皮細胞はＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴ遺伝子をＰＣＲにより増幅して、レンチウイルスベクター（ｐＬｅｎｔｉ６．３＿Ｖ５－ＴＯＰＯ；　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ）に導入した。その後、レンチウイルスベクターを３種類のヘルパープラスミド（ｐＬＰ１、ｐＬＰ２、ｐＬＰ／ＶＳＶＧ；　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．）とともにトランスフェクション試薬（Ｆｕｇｅｎｅ　ＨＤ；　Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐ．，　Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩ）を用いて２９３Ｔ　細胞　（ＲＣＢ２２０２；　Ｒｉｋｅｎ　Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｃｅｎｔｅｒ，　Ｉｂａｒａｋｉ，　Ｊａｐａｎ）に感染させた。４８時間の感染後にウイルスを含む培養上清を回収して、５μｇ／ｍｌのポリブレンを用いて、培養した健常ドナー由来の角膜内皮細胞の培養液に添加して、ＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴ遺伝子を導入し不死化することでｉＨＣＥＣを得た。ｉＨＣＥＣはＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳにより維持培養を行った。
　（材料）
・不死化ヒト角膜内皮細胞（ｉＨＣＥＣ）
・１５０ｍｍ　ｄｉｓｈ　（Ｃｏｒｎｉｎｇ　４３０５９９）
・ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ（Ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ　０８４５６－３６）
・０．５ｇ／Ｌ－Ｔｒｙｐｓｉｎ－０．５３ｍｍｏｌ／Ｌ－ＥＤＴＡ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｗｉｔｈ　Ｐｈｅｎｏｌ　Ｒｅｄ　　（Ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ　３２７７８－３４）
・カゼイン、乳由来　（富士フィルム和光純薬株式会社　０３０－０１５０５）
・１×Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ（－）：１×ＰＢＳ（－）　（Ｎｉｓｓｕｉ　ｐｈａｒｍａ　０５９１３）
・遠沈管５０ｍＬ　（Ｃｏｒｎｉｎｇ　４３０８２９）
・０．５％トリパンブルー染色液　（Ｎａｋａｒａｉ　ｔｅｓｑｕｅ　２９８５３－３４）
　（方法）
１．ＤＭＥＭにカゼインを添加することで各カゼイン濃度の細胞洗浄溶液を作製した。
２．不死化ヒト角膜内皮細胞を使用した。培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいた１×ＰＢＳ（－）を添加し、洗浄した。この作業を２回繰り返した。この工程における洗浄は、細胞が培養容器底面に接着した状態のまま培養液を除去するためのものである。培養液中の牛胎児血清などのタンパク質成分が残っていると次の工程でのＴｒｙｐｓｉｎによる細胞剥離効果が弱まるために行うものである。細胞は培養された状態のままで強固に培養基底面に接着しているため、細胞のロスは生じない。以下の実施例でも同様である。
３．１×ＰＢＳ（－）除去後、０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡを添加し、３７℃（５％ＣＯ２）で３ｍｉｎインキュベートした。
４．３分後、細胞洗浄溶液１０ｍＬで懸濁し、５０ｍｌ遠沈管に回収した。懸濁液における細胞濃度は、実験ごとに異なるが０．５×１０７～１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。
５．生細胞数をトリパンブルー染色によりカウントした。
６．３００Ｇ×５ｍｉｎ遠心した。
７．上清を除去し、細胞洗浄溶液１０ｍＬで懸濁した。
８．３００Ｇ×５ｍｉｎ遠心した。
９．７－８を再び繰り返した。
１０．上清を除去し、ＤＭＥＭで懸濁し、生細胞数をトリパンブルー染色により再度カウントした。
１１．５でカウントした生細胞数を１００％として、１０でカウントした生細胞数から細胞のロス率を算出した。
　実施例１の概要を図１に示す。
　（結果）
　図２は、カゼインの添加濃度を変えた細胞洗浄溶液で、ウシ胎児血清洗浄工程を行った際のロス率をグラフに示す。カゼインを添加していない０％群による通常の洗浄方法では、洗浄中に約２０％の細胞を喪失し、回収できた細胞は７８．８％となった。カゼインを添加していない０％群と比較して、０．０３％、０．１％、０．３％添加群で有意に洗浄後の細胞の回収率が向上した。特に０．１％のカゼイン添加により９７．９％とほぼ全ての細胞を回収することができた。
　（実施例２：ラクトフェリンの細胞洗浄溶液への添加によるロス率の低減）
　（材料）
・不死化ヒト角膜内皮細胞（ｉＨＣＥＣ）
・１５０ｍｍ　ｄｉｓｈ　（Ｃｏｒｎｉｎｇ　４３０５９９）
・ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ（Ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ　０８４５６－３６）
・０．５ｇ／Ｌ－Ｔｒｙｐｓｉｎ－０．５３ｍｍｏｌ／Ｌ－ＥＤＴＡ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｗｉｔｈ　Ｐｈｅｎｏｌ　Ｒｅｄ　　（Ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ　３２７７８－３４）
・ラクトフェリン、牛乳由来　（富士フィルム和光純薬株式会社　１２７－０４１２２）・１×Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ（－）：１×ＰＢＳ（－）　（Ｎｉｓｓｕｉ　ｐｈａｒｍａ　０５９１３）
・遠沈管５０ｍＬ　（Ｃｏｒｎｉｎｇ　４３０８２９）
・０．５％トリパンブルー染色液　（Ｎａｋａｒａｉ　ｔｅｓｑｕｅ　２９８５３－３４）
　（方法）
１．ＤＭＥＭにラクトフェリンを添加することで各ラクトフェリン濃度の細胞洗浄溶液を作製した。
２．不死化ヒト角膜内皮細胞を使用した。培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいた１×ＰＢＳ（－）を添加し、洗浄した。この作業を２回繰り返した。
３．１×ＰＢＳ（－）除去後、０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡを添加し、３７℃（５％ＣＯ２）で３ｍｉｎインキュベートした。
４．３分後、細胞洗浄溶液１０ｍＬで懸濁し、５０ｍｌ遠沈管に回収した。懸濁液における細胞濃度は、実験ごとに異なるが０．５×１０７～１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。
５．生細胞数をトリパンブルー染色によりカウントした。
６．３００Ｇ×５ｍｉｎ遠心した。
７．上清を除去し、細胞洗浄溶液１０ｍＬで懸濁した。
８．３００Ｇ×５ｍｉｎ遠心した。
９．７－８を再び繰り返した。
１０．上清を除去し、ＤＭＥＭで懸濁し、生細胞数をトリパンブルー染色により再度カウントした。
１１．５でカウントした生細胞数を１００％として、１０でカウントした生細胞数からロス率を算出した。
　実施例２の概要を図１に示す。
　（結果）
　図３は、ラクトフェリンの添加濃度を変えた細胞洗浄溶液で、ウシ胎児血清洗浄工程を行った際のロス率をグラフに示す。ラクトフェリンを添加していない０％群と比較して、１％、２％、３％、４％添加群で回収率の向上が確認できた。
　（実施例３：オボアルブミンの細胞洗浄溶液への添加によるロス率の低減）
　（材料）
・不死化ヒト角膜内皮細胞（ｉＨＣＥＣ）
・１５０ｍｍ　ｄｉｓｈ　（Ｃｏｒｎｉｎｇ　４３０５９９）
・　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ（Ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ　０８４５６－３６）　
・０．５ｇ／Ｌ－Ｔｒｙｐｓｉｎ－０．５３ｍｍｏｌ／Ｌ－ＥＤＴＡ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｗｉｔｈ　Ｐｈｅｎｏｌ　Ｒｅｄ　　（Ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ　３２７７８－３４）
・アルブミン、卵由来　（富士フィルム和光純薬株式会社　０１８－０９８８２）
・１×Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ（－）：１×ＰＢＳ（－）　（Ｎｉｓｓｕｉ　ｐｈａｒｍａ　０５９１３）
・遠沈管５０ｍＬ　（Ｃｏｒｎｉｎｇ　４３０８２９）
・０．５％トリパンブルー染色液　（Ｎａｋａｒａｉ　ｔｅｓｑｕｅ　２９８５３－３４）
　（方法）
１．１×ＰＢＳ（－）にオボアルブミンを添加し、１．５％の溶液を作成した。
２．ＤＭＥＭに１で作製した溶液を添加することで各オボアルブミン濃度の細胞洗浄溶液を作製した。
３．不死化ヒト角膜内皮細胞を使用した。培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいた１×ＰＢＳ（－）を添加し、洗浄した。この作業を２回繰り返した。
４．１×ＰＢＳ（－）除去後、０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡを添加し、３７℃（５％ＣＯ２）で３ｍｉｎインキュベートした。
５．３分後、細胞洗浄溶液１０ｍＬで懸濁し、５０ｍｌ遠沈管に回収した。懸濁液における細胞濃度は、実験ごとに異なるが０．５×１０７～１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。
６．生細胞数をトリパンブルー染色によりカウントした。
７．３００Ｇ×５ｍｉｎ遠心した。
８．上清を除去し、細胞洗浄溶液１０ｍＬで懸濁した。
９．３００Ｇ×５ｍｉｎ遠心した。
１０．８－９を再び繰り返した。
１１．上清を除去し、ＤＭＥＭで懸濁し、生細胞数をトリパンブルー染色により再度カウントした。
１２．６でカウントした生細胞数を１００％として、１１でカウントした生細胞数からロス率を算出した。
　実施例３の概要を図１に示す。
　（結果）
　図４は、オボアルブミンの添加濃度を変えた細胞洗浄溶液で、ウシ胎児血清洗浄工程を行った際のロス率をグラフに示す。オボアルブミンを添加していない０％群と比較して、０．０１％、０．０３％、０．１％、０．３％添加群で回収率の向上が確認できた。
　（実施例４：ヒト血清アルブミンの細胞洗浄溶液への添加によるロス率の低減）
　（材料）
・不死化ヒト角膜内皮細胞（ｉＨＣＥＣ）
・１５０ｍｍ　ｄｉｓｈ　（Ｃｏｒｎｉｎｇ　４３０５９９）
・　ＯｐｔｉＭＥＭＴＭ－Ｉ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　２１５８５－０７０）
・ＴｒｙｐｌｅＴＭＳｅｌｅｃｔ　Ｅｎｚｙｍｅ（１０×）　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａ１２１７７－０１）
・赤十字アルブミン２５％静注１２．５ｇ／５０ｍＬ　（日本血液製剤機構）
・１×Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ（－）：１×ＰＢＳ（－）　（Ｎｉｓｓｕｉ　ｐｈａｒｍａ　０５９１３）
・遠沈管５０ｍＬ　（Ｃｏｒｎｉｎｇ　４３０８２９）
・０．５％トリパンブルー染色液　（Ｎａｋａｒａｉ　ｔｅｓｑｕｅ　２９８５３－３４）
　（方法）
１．ＯｐｔｉＭＥＭにヒト血清アルブミンを添加することで各ヒト血清アルブミン濃度の細胞洗浄溶液を作製した。
２．不死化ヒト角膜内皮細胞を使用した。培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいたＯｐｔｉＭＥＭを添加し、洗浄した。この作業を２回繰り返した。
３．ＯｐｔｉＭＥＭ除去後、ＴｒｙｐｌｅＴＭＳｅｌｅｃｔ　Ｅｎｚｙｍｅ（１０×）を添加し、３７℃（５％ＣＯ２）で２０ｍｉｎインキュベートした。
４．２０分後、細胞洗浄溶液１０ｍＬで懸濁し、５０ｍｌ遠沈管に回収した。懸濁液における細胞濃度は、実験ごとに異なるが０．５×１０７～１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。
５．生細胞数をトリパンブルー染色によりカウントした。
６．３００Ｇ×５ｍｉｎ遠心した。
７．上清を除去し、細胞洗浄溶液１０ｍＬで懸濁した。
８．３００Ｇ×５ｍｉｎ遠心した。
９．７－８を再び繰り返した。
１０．上清を除去し、ＤＭＥＭで懸濁し、生細胞数をトリパンブルー染色により再度カウントした。
１１．５でカウントした生細胞数を１００％として、１０でカウントした生細胞数からロス率を算出した。
　実施例４の概要を図１に示す。
　（結果）
　図５は、ヒト血清アルブミンの添加濃度を変えた細胞洗浄溶液で、ウシ胎児血清洗浄工程を行った際の細胞回収率をグラフに示す。ヒト血清アルブミンを添加していない０％群と比較して、０．４％、０．５％、１％、２％、５％添加群で回収率の向上が確認できた。
　（実施例５：ヒト血清アルブミンの細胞洗浄溶液への添加による臨床使用用非不死化角膜内皮細胞のロス率の低減）
（ヒト角膜内皮細胞の培養方法）
　ヒト角膜組織から角膜内皮細胞を採取し、初代培養および継代培養を行った。まずドナー角膜中央に０．４ｗ／ｖ％　トリパンブルー溶液　細胞染色用（富士フィルム和光純薬株式会社、２０７－１７０８１）を添加して染色した。染色後、ゲンタマイシン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５７１０－０６４）を終濃度５０μｇ／ｍＬとなるように加えたＯｐｔｉＭＥＭＴＭ－Ｉ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３１９８５－０８８）を用いてトリパンブルー染色液を洗い流した。クリーンベンチ内に設置した顕微鏡およびモニターを用いて角膜を観察し、トリパンブルーによって染色されたデスメ膜を鑷子にて角膜から剥離した。剥離したデスメ膜をコラゲナーゼ（天野エンザイム株式会社　６３９－４４６５１）が入った１２ウェルプレートに移し、３７℃（５％ＣＯ２）で１６時間インキュベートした。インキュベート後、デスメ膜を１５ｍＬ遠沈管に移し、３００Ｇで３分間遠心分離した。遠心後上清を除去し、ゲンタマイシンを終濃度５０μｇ／ｍＬとなるように添加したＯｐｔｉＭＥＭを添加し、再び３００Ｇで３分間遠心分離した。この作業を２回繰り返した。遠心後上清を除去し、Ｙ－２７６３２（ＷＡＫＯ、２５９－００６１３）を終濃度１０μＭとなるように添加した培地を用いてペレットを再懸濁した。再懸濁した細胞懸濁液を、ラミニンＥ８フラグメント（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１；ニッピ株式会社、８９２０１２）を用いてコーティングした６ウェルプレートに播種した。２４時間後、Ｙ－２７６３２が入っていない培地に交換し、その後は２日ごとに培地交換を行い、１０日間培養した。培地としてＯｐｔｉＭＥＭＴＭ－Ｉに８％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＧＶＪ００８１）、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、２００ｍｇ／Ｌ塩化カルシウム（大塚製薬　８７３２１５）、０．０８％コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム（ＷＡＫＯ、０３２－１４６１３）、５ｎｇ／ｍＬ上皮増殖因子（ＥＧＦ；ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＨＧ０３１１）、２０μｇ／ｍＬアスコルビン酸（ｎｉｐｒｏ　２１Ｆ０１）、１０μＭ　ＳＢ２０３５８０(Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、１３０６７）を添加したものを用いた。
（材料）
・４代継代後のヒト角膜内皮細胞
・Ｔ２５フラスコ　（Ｃｏｒｎｉｎｇ　４３０１６８）
・ＯｐｔｉＭＥＭＴＭ－Ｉ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　２１５８５－０７０）
・ＴｒｙｐｌｅＴＭＳｅｌｅｃｔ　Ｅｎｚｙｍｅ　（１０×）　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａ１２１７７－０１）
・赤十字アルブミン２５％静注１２．５ｇ／５０ｍＬ　（日本血液製剤機構）
・ステムフル　遠沈管１５ｍＬ　（住友ベークライト　ＭＳ－９０１５０）
・０．５％トリパンブルー染色液　（Ｎａｋａｒａｉ　ｔｅｓｑｕｅ　２９８５３－３４）
（方法）
１．ＯｐｔｉＭＥＭにヒト血清アルブミンを添加することで各ヒト血清アルブミン濃度の細胞洗浄溶液を作製した。
２．４代継代後のヒト角膜内皮細胞を使用した。培養中のＴ２５フラスコから培地を除去し、事前に３７℃に温めておいたＯｐｔｉＭＥＭＴＭ－Ｉを添加し、洗浄した。この作業を２回繰り返した。
３．ＯｐｔｉＭＥＭ除去後、ＴｒｙｐｌｅＴＭＳｅｌｅｃｔ　Ｅｎｚｙｍｅ（１０×）を添加し、３７℃（５％ＣＯ２）で２０ｍｉｎインキュベートした。
４．２０分後、細胞洗浄溶液１０ｍＬで懸濁し、１５ｍｌステムフルに回収した。懸濁液における細胞濃度は、約９×１０ ６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。
５．生細胞数をトリパンブルー染色によりカウントした。
６．３００Ｇ×５ｍｉｎ遠心した。
７．上清を除去し、細胞洗浄溶液１０ｍＬで懸濁した。懸濁液における細胞濃度は、実験ごとに異なるが０．５×１０７～１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。
８．３００Ｇ×５ｍｉｎ遠心した。
９．７－８を再び繰り返した。
１０．上清を除去し、ＯｐｔｉＭＥＭで懸濁し、生細胞数をトリパンブルー染色により再度カウントした。
１１．５でカウントした生細胞数を１００％として、１０でカウントした生細胞数からロス率を算出した。
　実施例５の概要を図６に示す。
　（結果）
　図７は、ヒト血清アルブミンの添加濃度を変えた細胞洗浄溶液で、ウシ胎児血清洗浄工程を行った際のロス率をグラフに示す。ヒト血清アルブミンを添加していない０％群による通常の洗浄方法では、洗浄中に約２０％の細胞を喪失し、回収できた細胞は８２．５％となった。ヒト血清アルブミンを添加していない０％群と比較して、２％、５％添加群で回収率の向上が確認できた。特に、２％のヒト血清アルブミンを細胞洗浄液に添加することで、ほぼ全ての細胞をロスなく回収することができた。
　（実施例６－１：角膜内皮細胞製剤の製造例１）
　本実施例では、角膜内皮細胞製剤（凍結保存製剤）の製造例を示す。
　（材料）
　２％ヒト血清アルブミン／ＣＴＳ－ＯＰＴＩ－ＭＥＭ
　２５％ヒト血清アルブミン　３．６ｍＬ
　ＣＴＳ－ＯＰＴＩ－ＭＥＭ　４１．４ｍＬ
　　　　　　　　　　　　合計４５ｍＬ
　４５ｍＬ／５０ｍＬチューブ　２本
□滅菌バイアル
□Ｙ２７６３２
　（方法）
・角膜内皮細胞培養物の培養上清を回収する。
・角膜内皮細胞を２％ヒト血清アルブミン／ＣＴＳ－ＯＰＴＩ－ＭＥＭ（３０ｍＬ）で懸濁する。
・３００×ｇで５分遠心する。
・２％ヒト血清アルブミン／ＣＴＳ－ＯＰＴＩ－ＭＥＭ（２０ｍＬ）で懸濁する。
・３００×ｇで５分遠心する。
・２％ヒト血清アルブミン／ＣＴＳ－ＯＰＴＩ－ＭＥＭ（２０ｍＬ）で懸濁する。
・３００×ｇで５分遠心する。
・Ｙ２７６３２を１００μＭの濃度になるに溶解したＣｒｙｏＳｔｏｒ　ＣＳ２で懸濁して、２．６×１０６個／ｍＬになるように希釈する。
・上記細胞懸濁液を製剤化用バイアルに４５０μＬずつ分注し、それぞれのバイアルをプログラムフリーザーにより－０．５℃／分の速度で－８０℃まで冷却し、細胞を凍結する。
・－８０℃フリーザーもしくは液体窒素下で保管する。
　（実施例６－２：角膜内皮細胞製剤の製造例２）
　本実施例では、角膜内皮細胞製剤（凍結保存製剤）の製造例を示す。
　（材料）
　ＴｒｙｐＬＥＴＭ　Ｓｅｌｅｃｔ　Ｅｎｚｙｍｅ（１０×）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ａ１２１７７０１）
　２％ＨＳＡ＋ＣＴＳＴＭ　Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＴＭ　Ｉ　Ｍｅｄｉｕｍ（３７℃）
　ＣｒｙｏＳｔｏｒ　ＣＳ２（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ；２０２１０２）
　コーニング接着細胞培養用７５ｃｍ２フラスコ
　ＣｒｙｏＳｔｏｒ　ＣＳ２（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ；２０２１０２）
　Ｙ２７６３２
　（方法）
・コーニング接着細胞培養用７５ｃｍ２フラスコに、ＴｒｙｐＬＥＴＭ　Ｓｅｌｅｃｔ　Ｅｎｚｙｍｅ（１０×）（３７℃加温）を５ｍＬ加えて、３７℃にてインキュベータ内で２０分間インキュベートする。
・コーニング接着細胞培養用７５ｃｍ２フラスコから、細胞懸濁液をオートピペッターで全量回収し、遠沈管５０ｍＬに入れる（液量１５ｍＬ）。
・コーニング接着細胞培養用７５ｃｍ２フラスコに、２％ＨＳＡ＋ＣＴＳＴＭ　Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＴＭ　Ｉ　Ｍｅｄｉｕｍ（３７℃）を１０ｍＬ加えて角膜内皮細胞を懸濁する。これを２回行う（液量３５ｍＬ）。
・遠沈管５０ｍＬを遠心分離する（３００×ｇ，５ｍｉｎ，室温）。
・ペレットにマイクロピペッターで２％ＨＳＡ＋ＣＴＳＴＭ　Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＴＭ　Ｉ　Ｍｅｄｉｕｍ　１０００μＬを加えピペッティングにより細胞を懸濁させる。その後、チップを変えずに１０００μＬで洗いこむ。
・２％ＨＳＡ＋ＣＴＳＴＭ　Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＴＭ　Ｉ　Ｍｅｄｉｕｍを１８ｍＬ加える（合計２０ｍＬ）。
・遠沈管５０ｍＬを遠心分離する（３００×ｇ，５ｍｉｎ，室温）。
・２％ＨＳＡ＋ＣＴＳＴＭ　Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＴＭ　Ｉ　Ｍｅｄｉｕｍを２０ｍＬ加える。
・遠沈管５０ｍＬを遠心分離する（３００×ｇ，５ｍｉｎ，室温）。
・細胞数に応じてＣｒｙｏＳｔｏｒ　ＣＳ２を４ｍＬを目安に添加する（３５０～４５０×１０４　ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）。
・Ｙ２７６３２を４５０μＭの濃度になるに溶解したＣｒｙｏＳｔｏｒ　ＣＳ２で懸濁する。
・上記細胞懸濁液を製剤化用バイアルに４５０μＬずつ分注し、それぞれのバイアルをプログラムフリーザーにより－０．１℃／分→－２．０℃／分の速度で－８０℃まで冷却し、細胞を凍結する。
・－８０℃フリーザーで保管する。
　（実施例７：角膜内皮細胞製剤の使用例）
　本実施例では、角膜内皮細胞製剤の使用例を示す。
（材料）
・日本白色ウサギ
・実施例６－２で調製した角膜内皮細胞凍結製剤
（方法）
・細胞移入の７～１４日前にウサギの水晶体除去手術を実施した。
・細胞移入当日にウサギ角膜内皮を直径８ｍｍにわたりスクレイパーを使用して除去した。
・３０ゲージのニードルがついた注射器によりウサギ前房液を吸引除去した後、予め３７℃のウォーターバスで急速融解しておいた角膜内皮細胞製剤（８．０×１０５　ＨＣＥＣ＋０．３ｍＬ　ＣＳ２＋１００μＭ　Ｙ－２７６３２）を２７ゲージのナノニードルの注射器で吸引し、前房内に３００μＬの角膜内皮製剤を移入した。
・細胞移入後、ウサギの顔面（眼の面）を３時間下向きにしたままで固定することで、角膜内皮細胞が角膜内皮に定着するようにした。
・移入５日後にウサギを安楽死させ、免疫組織学的検討を行った。
　（結果）
　代表的な結果を図８に示す。バリア機能マーカーであるＺＯ－１およびヒト角膜内皮細胞マーカーであるＣＤ１６６によって示されるように正常な角膜内皮細胞が角膜内皮に生着したことが認められた。また、５日後には、角膜の透明度が正常に回復した。
　以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、２０２２年３月３１日に出願された日本国特許出願第２０２２－６０１４８号の優先権の利益を請求し、その内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
　再生医療に使用するために培養した角膜内皮細胞を製剤化する過程において、異種由来成分であるウシ胎児血清を洗浄する必要がある。洗浄液に、人体に投与可能なタンパク質を添加することで、細胞洗浄時に生じる細胞回収のロスを低減化することができる。人体に投与可能なタンパク質を用いて洗浄した細胞製剤は細胞移植等に用いられ得るため、製薬等の分野において利用可能である。

Claims (35)

  1. 　角膜内皮細胞製剤を製造する方法であって、該方法が、
    　約０．０１重量％～約１０重量％のタンパク質を含む溶液で角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を洗浄する工程、および
    　該角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞と、製剤化用組成物とを混合して、角膜内皮細胞製剤とする工程
    を含み、該タンパク質が、ヒト血清アルブミン、カゼイン、ラクトフェリン、オボアルブミン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
  2. 　前記洗浄する工程が、前記溶液で前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を懸濁して前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞の懸濁物を提供すること、および該懸濁物を遠心分離して前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を回収することを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記洗浄により、前記角膜内皮細胞製剤に対する不純物が取り除かれる、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記洗浄工程における前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、２０％以下である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記洗浄工程における前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、１５％以下である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　前記洗浄工程における前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、１０％以下である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　前記タンパク質が、ヒト血清アルブミンである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　前記溶液が、約０．５重量％～約１０重量％のヒト血清アルブミンを含む、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記溶液が、約１重量％～約５重量％のヒト血清アルブミンを含む、請求項７に記載の方法。
  10. 　前記溶液が、約１重量％～約３重量％のヒト血清アルブミンを含む、請求項７に記載の方法。
  11. 　前記溶液が、約２重量％のヒト血清アルブミンを含む、請求項７に記載の方法。
  12. 　前記溶液が、培養培地、緩衝液または眼内灌流液であるか、あるいは培養培地、緩衝液または眼内灌流液の１つまたは複数の成分を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 　前記培養培地または眼内灌流液が、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｈａｎｋｓ’　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）、生理食塩液、オキシグルタチオン液またはオペガードである、請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記培養培地の成分が、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、リン酸塩、重炭酸塩、ビタミン、必須アミノ酸、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１２に記載の方法。
  15. 　前記培養培地の成分が、トランスフェリン、インシュリン、ヒポキサンチン、チミジン、重炭酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン酸、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 　前記製剤化用組成物が、細胞保存液、培養培地、緩衝液または眼内灌流液であるか、あるいは細胞保存液、培養培地、緩衝液または眼内灌流液の１つまたは複数の成分を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 　前記細胞保存液が、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５、バンバンカー（登録商標）、またはセルバンカー（登録商標）である、請求項１６に記載の方法。
  18. 　前記細胞保存液の成分が、ＤＭＳＯ、グリセリン、ポリエチレングリコール、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１６に記載の方法。
  19. 　角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を洗浄する方法であって、該方法が、
    　約０．０１重量％～約１０重量％のタンパク質を含む溶液で角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を懸濁して角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞の懸濁物を提供する工程、および
    　該懸濁物を遠心分離して該角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を回収する工程
    を含み、該タンパク質が、ヒト血清アルブミン、カゼイン、ラクトフェリン、オボアルブミン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
  20. 　約０．０１重量％～約１０重量％のタンパク質を含む角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞の細胞洗浄溶液であって、該タンパク質が、ヒト血清アルブミン、カゼイン、ラクトフェリン、オボアルブミンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、細胞洗浄溶液。
  21. 　前記角膜内皮細胞の洗浄が、前記細胞洗浄溶液で前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を懸濁して前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞の懸濁物を提供すること、および該懸濁物を遠心分離して前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞を回収することによって実施される、請求項２０に記載の細胞洗浄溶液。
  22. 　前記洗浄により、前記角膜内皮細胞製剤に対する不純物が取り除かれる、請求項２０または２１に記載の細胞洗浄溶液。
  23. 　前記洗浄による前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、２０％以下である、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の細胞洗浄溶液。
  24. 　前記洗浄による前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、１５％以下である、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の細胞洗浄溶液。
  25. 　前記洗浄による前記角膜内皮細胞または角膜内皮様細胞のロス率が、１０％以下である、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の細胞洗浄溶液。
  26. 　前記タンパク質が、ヒト血清アルブミンである、請求項１７～２２のいずれか一項に記載の細胞洗浄溶液。
  27. 　約０．５重量％～約１０重量％のヒト血清アルブミンを含む、請求項２６に記載の細胞洗浄溶液。
  28. 　約１重量％～約５重量％のヒト血清アルブミンを含む、請求項２６に記載の細胞洗浄溶液。
  29. 　約１重量％～約３重量％のヒト血清アルブミンを含む、請求項２６に記載の細胞洗浄溶液。
  30. 　約２重量％のヒト血清アルブミンを含む、請求項２６に記載の細胞洗浄溶液。
  31. 　前記溶液が、培養培地、緩衝液または眼内灌流液であるか、あるいは培養培地、緩衝液または眼内灌流液の１つまたは複数の成分を含む、請求項２０～３０のいずれか一項に記載の細胞洗浄溶液。
  32. 　前記培養培地または眼内灌流液が、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｈａｎｋｓ’　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）、生理食塩液、オキシグルタチオン液である、請求項３１記載の細胞洗浄溶液。
  33. 　前記培養培地の成分が、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、リン酸塩、重炭酸塩、ビタミン、必須アミノ酸、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３１に記載の細胞洗浄溶液。
  34. 　前記培養培地の成分が、トランスフェリン、インシュリン、ヒポキサンチン、チミジン、重炭酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン酸、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項３１に記載の細胞洗浄溶液。
  35. 　懸濁状態の角膜内皮細胞製剤を製造するための、約０．０１重量％～約１０重量％のタンパク質を含む組成物であって、該タンパク質が、ヒト血清アルブミン、カゼイン、ラクトフェリン、オボアルブミンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、組成物。
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