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WO2023190176A1 - 脾臓組織へ核酸を送達するための脂質ナノ粒子およびこれを用いて脾臓組織へ核酸を送達する方法 - Google Patents

脾臓組織へ核酸を送達するための脂質ナノ粒子およびこれを用いて脾臓組織へ核酸を送達する方法 Download PDF

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WO2023190176A1
WO2023190176A1 PCT/JP2023/011850 JP2023011850W WO2023190176A1 WO 2023190176 A1 WO2023190176 A1 WO 2023190176A1 JP 2023011850 W JP2023011850 W JP 2023011850W WO 2023190176 A1 WO2023190176 A1 WO 2023190176A1
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WO
WIPO (PCT)
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group
glycero
carbon atoms
formula
lipid
Prior art date
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PCT/JP2023/011850
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English (en)
French (fr)
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悠太 中井
耕太 丹下
遊 櫻井
英万 秋田
浩揮 田中
瑞歩 堀
昌樹 五味
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tohoku University NUC
Chiba University NUC
NOF Corp
Original Assignee
Tohoku University NUC
Chiba University NUC
NOF Corp
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Priority to JP2024512364A priority patent/JPWO2023190176A1/ja
Priority to CA3247039A priority patent/CA3247039A1/en
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    • A61P37/04—Immunostimulants
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle

Definitions

  • the present invention relates to lipid nanoparticles used to deliver nucleic acids to spleen tissue, and methods for delivering nucleic acids to spleen tissue using the same.
  • Viral vectors are nucleic acid delivery carriers with high expression efficiency, but have practical problems from the viewpoint of safety. Therefore, development of non-viral nucleic acid delivery carriers that can be used more safely is underway.
  • lipid nanoparticles which are carriers using ionic lipids, are currently the most commonly used non-viral nucleic acid delivery carriers.
  • Ionic lipids are broadly divided into amine parts and lipid parts.
  • the amine moiety that protonates under acidic conditions interacts electrostatically with nucleic acids, which are polyanions, to form lipid nanoparticles, which promotes uptake into cells and enhances nucleic acids. It is delivered into cells.
  • a known ionic lipid that is generally widely used includes 1,2-dioleoyloxy-3-dimethylaminopropane (DODAP). It is known that by combining such known ionic lipids with phospholipids, cholesterol, and PEG lipids, lipid nanoparticles can be formed and nucleic acids can be delivered into cells (for example, Non-Patent Document 1). reference).
  • DODAP 1,2-dioleoyloxy-3-dimethylaminopropane
  • Patent Document 1 describes an ionic lipid having a structure in which compounds consisting of one or two amine sites and one lipid site are connected to each other by disulfide bonds that exhibit biodegradability.
  • Patent Document 1 shows that the ionic lipid improves in-vivo dynamics such as blood stability and tumor targeting.
  • the pKa of the lipid membrane structure can be adjusted to a value that is advantageous for endosomal escape within cells, and by utilizing the fact that disulfide bonds are broken within cells, It has been shown to have the effect of dissociating nucleic acids from lipid membrane structures.
  • an ionic lipid with an aromatic ring introduced near the lipid site is used to increase the ability to fuse with endosomal membranes and improve the efficiency of nucleic acid delivery to the cytoplasm.
  • a lipid membrane structure with even higher efficiencies is shown.
  • ionic lipids with improved intracellular dynamics have been developed by increasing endosomal escape efficiency and membrane fusion ability, while lipid nanoparticles made of ionic lipids have been used as nucleic acid delivery carriers in vivo. In order to have more practical effects, it is necessary to have directivity to target organs and cells.
  • Dimyristoylglycerol PEG is one of the PEG lipids widely used in lipid nanoparticles.
  • PEG lipids gradually dissociate from the lipid nanoparticles in the blood, and apolipoprotein E (ApoE) present in the blood adheres to the lipid nanoparticles.
  • ApoE apolipoprotein E
  • DMG-PEG which has a hydrophobic group derived from myristic acid as a PEG lipid, but distearoylglycerol PEG (which has a hydrophobic group derived from stearic acid).
  • DSG-PEG Non-Patent Document 3
  • DSG-PEG is difficult to dissociate from lipid nanoparticles in the blood, so it avoids ApoE adhesion in the blood, suppresses its accumulation in the liver, and has high retention in the blood. As a result, the accumulation in tumors increases.
  • Another example of providing directivity to organs other than the liver is an example in which the efficiency of nucleic acid introduction into the spleen was increased by controlling the particle size of lipid nanoparticles to 140 to 230 nm (for example, patented (See Reference 3). It has been shown that lipid nanoparticles with a particle diameter of 200 nm avoid nucleic acid introduction into the liver and increase the efficiency of nucleic acid introduction into the spleen compared to lipid nanoparticles with a particle diameter of 100 nm.
  • the efficiency of nucleic acid introduction can be increased by using lipid nanoparticles with improved intracellular dynamics, and by changing the PEG lipid that is a component of the lipid nanoparticles and adjusting the particle size of the lipid nanoparticles, It is also possible to efficiently deliver nucleic acids to target tissues such as the liver and spleen.
  • the spleen can be a target for nucleic acid vaccine applications because it is an organ with many immune cells, but despite advances in this field, conventional nucleic acid delivery to the spleen using lipid nanoparticles is difficult. Efficiency is not sufficient and there is room for improvement.
  • Non-Patent Document 4 and Patent Document 3 each indicate the use of ionic lipids with different structural characteristics regarding lipid nanoparticles for delivery to the spleen.
  • different phospholipids are used as components of lipid nanoparticles, and the optimal combination with phospholipids differs depending on the structure of the ionic lipid.
  • the present invention aims to provide lipid nanoparticles for delivering nucleic acids to spleen tissue that can improve the efficiency of nucleic acid delivery to spleen tissue cells, and a method for delivering nucleic acids to spleen tissue using the same. purpose.
  • the appropriate combination of phospholipids differs depending on the structure of the ionic lipid, and for efficient delivery of nucleic acids, it is necessary to optimize the combination of ionic lipids and phospholipids. is required.
  • an ionic lipid that has a pKa suitable for endosomal escape and is specifically decomposed in a reducing environment within cells and an anionic phospholipid or a formula (2) It has been found that lipid nanoparticles produced using anionic cholesterol represented by ) can efficiently introduce nucleic acids into spleen tissue.
  • the present invention based on this knowledge is as follows.
  • R 1a and R 1b each independently represent an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms
  • X a and X b are each independently an acyclic alkyl tertiary amino group having 1 to 6 carbon atoms and 1 tertiary amino group, or 2 to 5 carbon atoms, and represents a cyclic alkylene tertiary amino group having 1 to 2 tertiary amino groups
  • R 2a and R 2b each independently represent an alkylene group or an oxydialkylene group having 8 or less carbon atoms
  • Y a and Y b each independently represent an ester bond, amide bond, carbamate bond, ether bond or urea bond
  • Z a and Z b each independently represent a divalent group derived from an aromatic compound having 3 to 16 carbon atoms, having at least one aromatic ring, and optionally having a hetero atom.
  • n a and n b are each independently 0 or 1
  • R 3a and R 3b are each independently a residue derived from a reaction product of a fat-soluble vitamin having a hydroxyl group and succinic anhydride or glutaric anhydride, or a sterol derivative having a hydroxyl group and succinic anhydride or glutaric anhydride.
  • R 9 -O-CO-(CH 2 )a- (4) (In formula (4), R 9 represents an aliphatic hydrocarbon group having 2 to 20 carbon atoms, a represents an integer from 2 to 10. ) represents a group represented by ) ionic lipid represented by (B) Anionic phospholipid or formula (2):
  • T represents a divalent aliphatic hydrocarbon group having 1 to 8 carbon atoms.
  • Any two of R 6 , R 7 and R 8 represent a myristoyl group, and the remaining one represents a myristoyl group having 1 to 6 carbon atoms connected via a polyethylene glycol chain having a number average molecular weight of 1,000 to 3,000. Represents an alkyl group.
  • Dimyristoylglycerol PEG represented by Lipid nanoparticles used to deliver nucleic acids to spleen tissue.
  • the anionic phospholipid is 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DMPG), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DPPG), 1-palmitoyl -2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (POPG), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DOPG), 1-stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3 -Phosphoglycerol (SOPG), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoserine (DPPS), 1-palmitoyl-2- Oleoyl-sn-glycero-3-phosphoserine (POPS), 1,2-dioleoyl-sn-s
  • the anionic phospholipid is 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (POPG), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DOPG), or 1 , 2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoserine (DLoPS).
  • POPG 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol
  • DOPG 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol
  • DLoPS 2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoserine
  • the ionic lipid represented by formula (1) has the following formula:
  • lipid nanoparticle according to any one of [1] to [5], which is any ionic lipid represented by:
  • the neutral phospholipid is 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), 1,2-dierkyl- sn-glycero-3-phosphocholine (DEPC), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC), 1 -stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (SOPC), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), and 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-
  • DOPC 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • DOPE 1,2-dioleoyl-sn-
  • the ionic lipid is 30 to 70 mol% of the total of the ionic lipid, the anionic phospholipid or the compound represented by formula (2), the neutral phospholipid, and the cholesterol. and the anionic phospholipid or the compound represented by formula (2) is 2.5 to 15 mol%, the neutral phospholipid is 0 to 15 mol%, and the cholesterol is 20 to 60 mol%.
  • a method for delivering a nucleic acid to a spleen tissue which comprises intravenously administering to a living body the lipid nanoparticle according to any one of [1] to [11] encapsulating a nucleic acid.
  • T is as defined in [1].
  • Dimyristoylglycerol PEG represented by Use of lipid nanoparticles comprising: for the manufacture of a medicament used to deliver nucleic acids to spleen tissue.
  • the anionic phospholipid is 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DMPG), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DPPG), 1-palmitoyl -2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (POPG), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DOPG), 1-stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3 -Phosphoglycerol (SOPG), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoserine (DPPS), 1-palmitoyl-2- Oleoyl-sn-glycero-3-phosphoserine (POPS), 1,2-dioleoyl-sn-s
  • the anionic phospholipid is 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (POPG), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DOPG), or 1 , 2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoserine (DLoPS).
  • POPG 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol
  • DOPG 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol
  • DLoPS 2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoserine
  • T in formula (2) is a divalent aliphatic hydrocarbon group having 1 to 3 carbon atoms.
  • the ionic lipid represented by formula (1) has the following formula:
  • lipid nanoparticles may contain a neutral phospholipid as a component.
  • the neutral phospholipid is 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), 1,2-dierkyl- sn-glycero-3-phosphocholine (DEPC), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC), 1 -stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (SOPC), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), and 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-
  • DOPC 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • DOPE 1,2-dioleoyl-sn-
  • the ionic lipid is 30 to 70 mol% of the total of the ionic lipid, the anionic phospholipid or the compound represented by formula (2), the neutral phospholipid, and the cholesterol. and the anionic phospholipid or the compound represented by formula (2) is 2.5 to 15 mol%, the neutral phospholipid is 0 to 15 mol%, and the cholesterol is 20 to 60 mol%. , the use according to any one of [19] to [22], wherein the dimyristoylglycerol PEG is 0.5 to 1.5 mol%.
  • the lipid nanoparticles of the present invention are a combination of an ionic lipid and an anionic phospholipid or anionic cholesterol that have a pKa suitable for endosomal escape and are specifically decomposed in a reducing environment within cells, and a lipid nanoparticle that has a pKa suitable for endosomal escape.
  • the optimized composition allows for more efficient delivery of nucleic acids to spleen tissue compared to prior art lipid compositions.
  • FIG. 2 is a diagram showing the gene expression activity in the spleen of the lipid nanoparticles (LNP) of Examples 1 and 2 and the LNP of Comparative Example 1, which is a composition for liver delivery.
  • FIG. 3 is a diagram showing the accumulation of LNP in the spleen of LNP of Example 3 and LNP of Comparative Example 2, which is a composition for liver transport.
  • FIG. 3 is a diagram showing the gene expression activity in the spleen of LNP of Example 3 and LNP of Comparative Example 2, which is a composition for liver transfer.
  • FIG. 2 is a diagram showing gene expression activity in the spleen of LNPs of Examples 1 and 4 to 10 and LNPs of Comparative Example 1, which is a composition for liver transfer.
  • FIG. 3 is a diagram showing the gene expression activity in the spleen of LNPs of Examples 5 and 11 to 24.
  • FIG. 7 is a diagram showing the gene expression activity in the spleen of LNPs of Examples 18 and 25 to 29.
  • FIG. 7 is a diagram showing gene expression activity in the spleen of LNP of Example 30 and LNP of Comparative Example 3, which is a composition for liver delivery.
  • FIG. 3 is a diagram showing CTL activity when LNPs of Examples 18 and 24 encapsulating OVA-mRNA and LNPs of Comparative Example 1, which is a composition for liver delivery, are administered to mice.
  • FIG. 7 is a diagram showing CTL activity when LNP of Example 30 encapsulating OVA-mRNA, LNP of Comparative Example 3 having a composition for liver delivery, and LNP of Comparative Example 4 having a composition for spleen delivery were administered to mice. It is.
  • FIG. 7 is a diagram showing CTL activity when LNP of Example 31 encapsulating OVA-mRNA and LNP of Comparative Example 4, which is a composition for spleen delivery, were administered to mice.
  • FIG. 7 is a diagram showing pathological scores of mice administered with LNP or PBS of Example 32 encapsulating MOG-mRNA or luc-mRNA.
  • FIG. 7 is a diagram showing body weight fluctuation (%) (relative to Day 10) of mice administered with LNP or PBS of Example 32 encapsulating MOG-mRNA or luc-mRNA.
  • the present invention provides an ionic lipid represented by formula (1) (i.e., an ionic lipid having a tertiary amino group, a lipid moiety, and a disulfide bond that is a biodegradable group), an anionic phospholipid, or a formula (2).
  • the present invention relates to lipid nanoparticles containing anionic cholesterol represented by formula (3), cholesterol, and dimyristoylglycerol PEG represented by formula (3), and a method for delivering nucleic acids to spleen cells using the same.
  • Lipid nanoparticles are nanoparticles in which the hydrophilic groups of amphiphilic lipids are directed toward the aqueous phase side of the interface.
  • amphiphilic lipid refers to a lipid having a membrane structure arranged in a diaphragm structure and having a particle diameter of less than 1 ⁇ m.
  • the particle size of the lipid nanoparticles of the present invention is preferably 10 nm to 500 nm, more preferably 30 nm to 300 nm.
  • the particle size can be measured using, for example, a particle size distribution measuring device such as Zetasizer Nano (Malvern).
  • the particle size of the lipid nanoparticles can be adjusted as appropriate by the method for producing lipid nanoparticles.
  • particle size means an average particle size (zeta average) measured by a dynamic light scattering method.
  • amphipathic lipids examples include ionic lipids, phospholipids, PEG lipids, and the like.
  • PEG means polyethylene glycol
  • PEG lipid means a lipid modified with PEG
  • Y modified with X for example, X: PEG, Y: lipid
  • PEG lipid means a lipid to which PEG is attached.
  • the lipid nanoparticles of the present invention include an ionic lipid represented by the formula (1), an anionic phospholipid, or an anionic cholesterol represented by the formula (2), a neutral phospholipid, cholesterol, and a lipid nanoparticle represented by the formula (3). It may contain lipids other than the dimyristoylglycerol PEG (hereinafter sometimes referred to as "other lipids"). Examples of other lipids include sterols other than cholesterol and PEG lipids other than dimyristoylglycerol PEG represented by formula (3).
  • the amount of other lipids in the lipid nanoparticles of the present invention is preferably 0 to 50 mol%, more preferably 0 to 30 mol%, and even more preferably 0 to 10 mol%, based on the total amount of lipids in the lipid nanoparticles.
  • the "total amount of lipids in the lipid nanoparticles” means, for example, that the lipid nanoparticles contain ionic lipids represented by formula (1), phospholipids, cholesterol, and dioxins represented by formula (3).
  • the amount of B (mol%) with respect to A means “100 ⁇ the amount of B (mol)/the amount of A (mol)".
  • the amount of other lipids (mol%) relative to the total amount of lipids means “100 x amount of other lipids (mol)/total amount of lipids (mol)”.
  • the lipids constituting the lipid nanoparticles of the present invention are ionic lipids represented by formula (1), anionic phospholipids represented by formula (2), or Most preferably, it consists of anionic cholesterol, neutral phospholipid, cholesterol, and dimyristoylglycerol PEG represented by formula (3).
  • the ionic lipid used in the present invention is an ionic lipid represented by the following formula (1) (herein sometimes abbreviated as "ionic lipid (1)"). Only one type of ionic lipid (1) may be used, or two or more types may be used in combination.
  • R 1a and R 1b each independently represent an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms
  • X a and X b are each independently an acyclic alkyl tertiary amino group having 1 to 6 carbon atoms and 1 tertiary amino group, or 2 to 5 carbon atoms, and represents a cyclic alkylene tertiary amino group having 1 to 2 tertiary amino groups
  • R 2a and R 2b each independently represent an alkylene group or an oxydialkylene group having 8 or less carbon atoms
  • Y a and Y b each independently represent an ester bond, amide bond, carbamate bond, ether bond or urea bond
  • Z a and Z b each independently represent a divalent group derived from an aromatic compound having 3 to 16 carbon atoms, having at least one aromatic ring, and optionally having a hetero atom.
  • n a and n b are each independently 0 or 1
  • R 3a and R 3b are each independently a residue derived from a reaction product of a fat-soluble vitamin having a hydroxyl group and succinic anhydride or glutaric anhydride, or a sterol derivative having a hydroxyl group and succinic anhydride or glutaric anhydride.
  • R 9 -O-CO-(CH 2 )a- (4) (In formula (4), R 9 represents an aliphatic hydrocarbon group having 2 to 20 carbon atoms, a represents an integer from 2 to 10. ) represents a group represented by )
  • R 1a and R 1b each independently represent an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms, and may be linear or branched, but are preferably linear.
  • the alkylene group preferably has 1 to 4 carbon atoms, more preferably 1 to 2 carbon atoms.
  • Specific examples of the alkylene group having 1 to 6 carbon atoms include methylene group, ethylene group, trimethylene group, isopropylene group, tetramethylene group, isobutylene group, pentamethylene group, and neopentylene group.
  • R 1a and R 1b are preferably each independently a methylene group, ethylene group, trimethylene group, isopropylene group or tetramethylene group, most preferably each is an ethylene group.
  • R 1a may be the same as or different from R 1b , but preferably R 1a is the same group as R 1b .
  • X a and X b are each independently an acyclic alkyl tertiary amino group having 1 to 6 carbon atoms and 1 tertiary amino group, or 2 to 5 carbon atoms, and Represents a cyclic alkylene tertiary amino group having 1 to 2 tertiary amino groups, preferably each independently a cyclic alkylene tertiary amino group having 2 to 5 carbon atoms and 1 to 2 tertiary amino groups. is an alkylene tertiary amino group.
  • the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms in the acyclic alkyl tertiary amino group having 1 to 6 carbon atoms and 1 tertiary amino group may be linear or branched. It may also be circular.
  • the alkyl group preferably has 1 to 3 carbon atoms. Examples of the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms include methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, isobutyl group, tert-butyl group, pentyl group, and isopentyl group.
  • neopentyl group, tert-pentyl group 1,2-dimethylpropyl group, 2-methylbutyl group, 2-methylpentyl group, 3-methylpentyl group, 2,2-dimethylbutyl group, 2,3-dimethylbutyl group
  • Examples include a cyclohexyl group, preferably a methyl group, an ethyl group, a propyl group or an isopropyl group, and most preferably a methyl group.
  • a preferred specific structure of the acyclic alkyl tertiary amino group having 1 to 6 carbon atoms and 1 tertiary amino group is represented by X 1 .
  • R 5 in X 1 represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and may be linear, branched, or cyclic.
  • the alkyl group preferably has 1 to 3 carbon atoms.
  • Examples of the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms include methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, isobutyl group, tert-butyl group, pentyl group, and isopentyl group.
  • neopentyl group, tert-pentyl group 1,2-dimethylpropyl group, 2-methylbutyl group, 2-methylpentyl group, 3-methylpentyl group, 2,2-dimethylbutyl group, 2,3-dimethylbutyl group
  • Examples include a cyclohexyl group, preferably a methyl group, an ethyl group, a propyl group or an isopropyl group, and most preferably a methyl group.
  • the number of carbon atoms in the cyclic alkylene tertiary amino group having 2 to 5 carbon atoms and 1 to 2 tertiary amino groups is preferably 4 to 5 carbon atoms.
  • Examples of the cyclic alkylene tertiary amino group having 2 to 5 carbon atoms and 1 to 2 tertiary amino groups include aziridylene group, azetidylene group, pyrrolidylene group, piperidylene group, imidazolidylene group, It is a piperadylene group, preferably a pyrrolidylene group, a piperidylene group, or a piperadylene group, and most preferably a piperidylene group.
  • a preferred specific structure of the cyclic alkylene tertiary amino group having 2 to 5 carbon atoms and 1 tertiary amino group is represented by X 2 .
  • p in X 2 is 1 or 2.
  • X 2 is a pyrrolidylene group
  • X 2 is a piperidylene group.
  • p is 2.
  • a preferred specific structure of the cyclic alkylene tertiary amino group having 2 to 5 carbon atoms and 2 tertiary amino groups is represented by X 3 .
  • w in X 3 is 1 or 2.
  • X 3 is an imidazolidylene group
  • X 3 is a piperazylene group.
  • X a may be the same as or different from X b , preferably X a is the same group as X b .
  • R 2a and R 2b each independently represent an alkylene group or oxydialkylene group having 8 or less carbon atoms, and preferably each independently represents an alkylene group having 8 or less carbon atoms.
  • the alkylene group having 8 or less carbon atoms may be linear or branched, but is preferably linear.
  • the number of carbon atoms contained in the alkylene group is preferably 6 or less, most preferably 4 or less.
  • Examples of the alkylene group having 8 or less carbon atoms include methylene group, ethylene group, trimethylene group, isopropylene group, tetramethylene group, isobutylene group, pentamethylene group, hexamethylene group, heptamethylene group, octamethylene group, etc. Among them, methylene group, ethylene group, trimethylene group, and tetramethylene group are preferable, and ethylene group is most preferable.
  • oxydialkylene group having 8 or less carbon atoms refers to an alkylene group via an ether bond (alkylene-O-alkylene, in other words, “alkyleneoxyalkylene group”), of which there are two It means a group in which the total number of carbon atoms in the alkylene group is 8 or less.
  • alkylene-O-alkylene in other words, "alkyleneoxyalkylene group”
  • Examples of the oxydialkylene group having 8 or less carbon atoms include an oxydimethylene group, an oxydiethylene group, an oxydi(trimethylene) group (i.e., a trimethyleneoxytrimethylene group), an oxydi(tetramethylene) group (i.e., tetramethyleneoxytetramethylene group) and the like.
  • Preferred are an oxydimethylene group, an oxydiethylene group, and an oxydi(trimethylene) group, and most preferred is an oxydiethylene group.
  • R 2a may be the same as or different from R 2b , but preferably R 2a is the same group as R 2b .
  • Y a and Y b are each independently an ester bond, an amide bond, a carbamate bond, an ether bond, or a urea bond, preferably each independently an ester bond, an amide bond, or a carbamate bond, and more preferably each Independently, it is an ester bond or an amide bond, most preferably each an ester bond.
  • the direction of the bond between Y a and Y b is not limited, but when Y a and Y b are ester bonds, preferably -Z a -CO-O-R 2a - and -Z b -CO-O-R 2b It exhibits a structure of -.
  • Y a may be the same as or different from Y b , but preferably Y a is the same group as Y b .
  • Z a and Z b each independently represent a divalent group derived from an aromatic compound having 3 to 16 carbon atoms, having at least one aromatic ring, and optionally having a hetero atom. represents.
  • the number of carbon atoms contained in the aromatic compound is preferably 6 to 12, most preferably 6 to 7.
  • the number of aromatic rings contained in the aromatic compound is preferably one.
  • aromatic rings contained in aromatic compounds having 3 to 16 carbon atoms include benzene rings, naphthalene rings, anthracene rings for aromatic hydrocarbon rings, imidazole rings, pyrazole rings, oxazole rings for aromatic heterocycles, Isoxazole ring, thiazole ring, isothiazole ring, triazine ring, pyrrole ring, furanthiophene ring, pyrimidine ring, pyridazine ring, pyrazine ring, pyridine ring, purine ring, pteridine ring, benzimidazole ring, indole ring, benzofuran ring, quinazoline ring, phthalazine ring, quinoline ring, isoquinoline ring, coumarin ring, chromone ring, benzodiazepine ring, phenoxazine ring, phenothiazine ring, acrid
  • the aromatic ring may have a substituent, and examples of the substituent include an acyl group having 2 to 4 carbon atoms, an alkoxycarbonyl group having 2 to 4 carbon atoms, a carbamoyl group having 2 to 4 carbon atoms, and a carbamoyl group having 2 to 4 carbon atoms.
  • acyloxy group acylamino group having 2 to 4 carbon atoms, alkoxycarbonylamino group having 2 to 4 carbon atoms, fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom, alkylsulfanyl group having 1 to 4 carbon atoms, 1 carbon number ⁇ 4 alkylsulfonyl group, arylsulfonyl group with 6 to 10 carbon atoms, nitro group, trifluoromethyl group, cyano group, alkyl group with 1 to 4 carbon atoms, ureido group with 1 to 4 carbon atoms, 1 to 4 carbon atoms 4 alkoxy group, aryl group having 6 to 10 carbon atoms, aryloxy group having 6 to 10 carbon atoms, and preferable examples include acetyl group, methoxycarbonyl group, methylcarbamoyl group, acetoxy group, acetamido group, Methoxycarbonylamino group,
  • a preferred specific structure of Z a and Z b includes Z 1 .
  • s represents an integer of 0 to 3
  • t represents an integer of 0 to 3
  • u represents an integer of 0 to 4
  • u R 4 each independently represent a substituent.
  • s in Z 1 is preferably an integer of 0 to 1, more preferably 0.
  • t in Z 1 is preferably an integer of 0 to 2, more preferably 1.
  • u in Z 1 is preferably an integer of 0 to 2, more preferably an integer of 0 to 1.
  • R 4 in Z 1 is a substituent of an aromatic ring (benzene ring) contained in an aromatic compound having 3 to 16 carbon atoms, which does not inhibit the reaction in the synthesis process of the ionic lipid.
  • substituents include an acyl group having 2 to 4 carbon atoms, an alkoxycarbonyl group having 2 to 4 carbon atoms, a carbamoyl group having 2 to 4 carbon atoms, an acyloxy group having 2 to 4 carbon atoms, and an acylamino group having 2 to 4 carbon atoms.
  • Arylsulfonyl group, nitro group, trifluoromethyl group, cyano group, alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, ureido group having 1 to 4 carbon atoms, alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms, aryl group having 6 to 10 carbon atoms , an aryloxy group having 6 to 10 carbon atoms, and preferable examples include an acetyl group, a methoxycarbonyl group, a methylcarbamoyl group, an acetoxy group, an acetamido group, a methoxycarbonylamino group, a fluorine atom,
  • each R 4 may be the same or different.
  • Z a may be the same as or different from Z b , but preferably Z a is the same group as Z b .
  • n a and n b are each independently 0 or 1.
  • na may be the same as or different from nb , preferably na is the same as nb .
  • R 3a and R 3b are each independently a residue derived from a reaction product of a fat-soluble vitamin having a hydroxyl group and succinic anhydride or glutaric anhydride, or a sterol derivative having a hydroxyl group and succinic anhydride or glutaric anhydride.
  • ) represents a group represented by, preferably each independently, a residue derived from a reaction product of a fat-soluble vitamin having a hydroxyl group and succinic anhydride or glutaric anhydride, or a carbonized aliphatic group having 12 to 22 carbon atoms.
  • a hydrogen group most preferably each independently an aliphatic hydrocarbon group having 12 to 22 carbon atoms.
  • a residue derived from a reaction product of a fat-soluble vitamin having a hydroxyl group and succinic anhydride or glutaric anhydride means that the hydroxyl group of the fat-soluble vitamin having a hydroxyl group is *-O-CO-CH 2 -CH 2 - or * -O-CO-CH 2 -CH 2 -CH 2 - represents a group having a structure replaced with -. * represents the bonding position with fat-soluble vitamins.
  • a residue derived from a reaction product of a sterol derivative having a hydroxyl group and succinic anhydride or glutaric anhydride means that the hydroxyl group of the sterol derivative having a hydroxyl group is *-O-CO-CH 2 -CH 2 - or *-O -CO-CH 2 -CH 2 -CH 2 - represents a group having a structure replaced with -CO-CH 2 -CH 2 -CH 2 -. * represents the bonding position with the sterol derivative.
  • fat-soluble vitamins having a hydroxyl group examples include retinol, ergosterol, 7-dehydrocholesterol, calciferol, colcalciferol, dihydroergocalciferol, dihydrotachysterol, tocopherol, and tocotrienol.
  • the fat-soluble vitamin having a hydroxyl group is preferably tocopherol.
  • sterol derivatives having a hydroxyl group examples include cholesterol, cholestanol, stigmasterol, ⁇ -sitosterol, lanosterol, and ergosterol, with cholesterol or cholestanol being preferred.
  • the aliphatic hydrocarbon group having 1 to 40 carbon atoms may be linear or branched.
  • the aliphatic hydrocarbon group may be saturated or unsaturated.
  • the number of unsaturated bonds contained in the aliphatic hydrocarbon group is usually 1 to 6, preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2.
  • Unsaturated bonds include carbon-carbon double bonds and carbon-carbon triple bonds, with carbon-carbon double bonds being preferred.
  • the number of carbon atoms contained in the aliphatic hydrocarbon group is preferably 12 to 22, more preferably 13 to 19, and most preferably 13 to 17.
  • the aliphatic hydrocarbon group includes an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, etc., and preferably an alkyl group or an alkenyl group.
  • Examples of aliphatic hydrocarbon groups having 1 to 40 carbon atoms include methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, isobutyl group, tert-butyl group, and pentyl group.
  • the aliphatic hydrocarbon group having 1 to 40 carbon atoms is preferably a tridecyl group, a pentadecyl group, a heptadecyl group, a nonadecyl group, a heptadecenyl group, a heptadecadienyl group, or a 1-hexylnonyl group, and particularly preferably a tridecyl group, They are a heptadecyl group, a heptadecenyl group, and a heptadecadienyl group.
  • the aliphatic hydrocarbon groups having 1 to 40 carbon atoms (preferably 12 to 22 carbon atoms) represented by R 3a and R 3b are derived from fatty acids.
  • the carbonyl carbon derived from the fatty acid is included in -CO-O- in formula (1).
  • Specific examples of the aliphatic hydrocarbon group include a heptadecadienyl group when linoleic acid is used as the fatty acid, and a heptadecenyl group when oleic acid is used as the fatty acid.
  • the alkyl group having 3 to 40 carbon atoms having a cyclopropane ring in R 3a and R 3b means an alkyl group having 3 to 40 carbon atoms having at least one cyclopropane ring in the alkyl chain.
  • the number of carbon atoms in the alkyl group from 3 to 40 does not include the number of carbon atoms in the cyclopropane ring.
  • the number of cyclopropane rings that the alkyl group has is preferably one.
  • the alkyl group having 3 to 40 carbon atoms having a cyclopropane ring in R 3a and R 3b preferably has the formula (5):
  • b and c are each independently integers, and the sum of b and c is 2 to 39.
  • b is an integer from 1 to 20 and c is an integer from 1 to 19.
  • b is more preferably an integer of 2 to 18, still more preferably an integer of 3 to 17, even more preferably an integer of 4 to 12.
  • c is more preferably an integer of 3 to 15, still more preferably an integer of 3 to 11, even more preferably an integer of 3 to 9.
  • Examples of the group represented by formula (5) include 7-(2-octylcyclopropyl)heptyl.
  • the aliphatic hydrocarbon group having 2 to 20 carbon atoms represented by R 9 may be linear or branched.
  • the aliphatic hydrocarbon group may be saturated or unsaturated.
  • the number of unsaturated bonds contained in the aliphatic hydrocarbon group is usually 1 to 6, preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2.
  • Unsaturated bonds include carbon-carbon double bonds and carbon-carbon triple bonds, with carbon-carbon double bonds being preferred.
  • the number of carbon atoms contained in the aliphatic hydrocarbon group is preferably 8 to 20, more preferably 9 to 19, still more preferably 13 to 19, and most preferably 13 to 17.
  • the aliphatic hydrocarbon group includes an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, etc., preferably an alkyl group or an alkenyl group, and more preferably an alkyl group.
  • Examples of aliphatic hydrocarbon groups having 2 to 20 carbon atoms include methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, isobutyl group, tert-butyl group, and pentyl group.
  • the aliphatic hydrocarbon group having 2 to 20 carbon atoms is preferably a tridecyl group, a pentadecyl group, a heptadecyl group, a nonadecyl group, a heptadecenyl group, a heptadecadienyl group, or a 1-hexylnonyl group, and particularly preferably a tridecyl group, They are a heptadecyl group, a heptadecenyl group, and a heptadecadienyl group.
  • a is preferably an integer of 3 to 9, more preferably an integer of 3 to 7, even more preferably an integer of 5 to 7, and most preferably 5 or 7.
  • R 3a may be the same as or different from R 3b , but preferably R 3a is the same group as R 3b .
  • R 1a is the same as R 1b
  • X a is the same as X b
  • R 2a is the same as R 2b
  • Y a is the same as Y b
  • Z a is the same as Y b
  • Z is the same as b
  • R 3a is the same as R 3b .
  • ionic lipid (1) include the following ionic lipids.
  • R 1a and R 1b are each independently an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms (e.g., methylene group, ethylene group);
  • X a and X b are each independently an acyclic alkyl tertiary amino group having 1 to 6 carbon atoms and having 1 tertiary amino group (e.g., -N(CH 3 )-); or a cyclic alkylene tertiary amino group having 2 to 5 carbon atoms and 1 to 2 tertiary amino groups (e.g., piperidylene group);
  • R 2a and R 2b are each independently an alkylene group having 8 or less carbon atoms (e.g., methylene group, ethylene group, trimethylene group);
  • Y a and Y b are each independently an ester bond or an amide bond;
  • a divalent group in which Z a and Z b are each alkylene
  • tocopherol and succinic anhydride or glutaric anhydride, or an aliphatic group having 12 to 22 carbon atoms.
  • is a hydrocarbon group e.g., heptadecenyl group, heptadecadienyl group, 1-hexylnonyl group
  • Ionic lipids (1).
  • R 1a and R 1b are each independently an alkylene group having 1 to 4 carbon atoms (e.g., methylene group, ethylene group);
  • X a and X b are each independently an acyclic alkyl tertiary amino group having 1 to 3 carbon atoms and having 1 tertiary amino group (e.g., -N(CH 3 )-); or a cyclic alkylene tertiary amino group having 2 to 5 carbon atoms and 1 tertiary amino group (e.g., piperidylene group);
  • R 2a and R 2b are each independently an alkylene group having 6 or less carbon atoms (e.g., methylene group, ethylene group, trimethylene group);
  • Y a and Y b are each independently an ester bond or an amide bond;
  • Z a and Z b are each independently a divalent group derived from an aromatic compound having 6 to 12 carbon atoms, one aromatic ring, and optionally
  • tocopherol and succinic anhydride, or an aliphatic hydrocarbon group having 13 to 19 carbon atoms (e.g. , heptadecenyl group, heptadecadienyl group, 1-hexylnonyl group); Ionic lipids (1).
  • R 1a and R 1b are each independently an alkylene group having 1 to 2 carbon atoms (i.e., a methylene group or an ethylene group);
  • X a and X b are each independently X 1 :
  • R 5 is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms (eg, methyl group).), or X 2 :
  • R 2a and R 2b are each independently an alkylene group having 4 or less carbon atoms (e.g., methylene group, ethylene group, trimethylene group); Y a and Y b are each independently an ester bond or an amide bond; Z a and Z b are each independently Z 1 :
  • s is an integer of 0 to 1
  • t is an integer of 0 to 2
  • u is an integer of 0 to 2 (preferably 0)
  • u R 4 are each independently (represents a substituent)
  • n a and n b are each independently 0 or 1
  • R 3a and R 3b each independently represent a residue derived from a reaction product of a fat-soluble vitamin having a hydroxyl group (e.g. tocopherol) and succinic anhydride, or an aliphatic hydrocarbon group having 13 to 17 carbon atoms (e.g. , heptadecenyl group, heptadecadienyl group, 1-hexylnonyl group); Ionic lipids (1).
  • the ionic lipid (1) include the following O-Ph-P3C1, O-Ph-P4C1, O-Ph-P4C2, O-Bn-P4C2, E-Ph-P4C2, L-Ph-P4C2, HD -Ph-P4C2, O-Ph-amide-P4C2, O-Ph-C3M, and TS-P4C2.
  • Lipid 1 to Lipid 20 described in WO 2021/195529 A2 can be mentioned, and in particular, the following Lipid 1, Lipid 5, and Lipid 8 can be mentioned.
  • the ionic lipid (1) is preferably an ionic lipid represented by the following formula.
  • the amount of ionic lipid (1) in the lipid nanoparticles of the present invention is determined from the viewpoints of nucleic acid encapsulation efficiency, intracellular nucleic acid release efficiency, and stability of lipid nanoparticles.
  • Ionic lipid (1) can be produced by a known method (for example, the method described in WO 2019/188867 A1, US 9708628 B2, WO 2021/195529 A2).
  • the lipid nanoparticles of the present invention contain anionic phospholipids as phospholipids.
  • anionic phospholipids may be used, or anionic phospholipids and other neutral phospholipids may be used in combination.
  • anionic phospholipids include 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoserine (PS), 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (PG), and 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (PG).
  • PS 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoserine
  • PG 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol
  • PG 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol
  • PA -sn-glycero-3-phosphatidic acid
  • 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoserine include: 1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphoserine (DDPS), 1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoserine (DLPS), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoserine (DMPS), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoserine (DPPS), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine (DSPS), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoserine (DOPS), 1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoserine (DLoPS), 1,2-diercyl-sn-glycero-3-phosphoserine (DEPS), 1-myristoyl-2-palmitoyl-sn-glycero-3-
  • phospholipids may be described by their abbreviations.
  • 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoserine is sometimes described as PS
  • 1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphoserine is sometimes described as DDPS.
  • 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol include: 1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DDPG), 1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DLPG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DMPG), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DPPG), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DOPG), 1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DLoPG), 1,2-diercyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DEPG), 1-myristoyl-2-pal, 1,2-pal
  • 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphatidic acid include: 1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphatidic acid (DDPA), 1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphatidic acid (DLPA), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidic acid (DMPA), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidic acid (DPPA), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphatidic acid (DSPA), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidic acid (DOPA), 1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphatidic acid (DLoPA), 1,2-diercyl-sn-glycero-3-phosphatidic acid (DEPA), 1-myristoyl-2-palmitoyl-sn-glycero-3-
  • the anionic phospholipid is preferably 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol, more preferably at least one selected from the group consisting of DMPG, DPPG, POPG, DOPG, SOPG and DSPG. , more preferably POPG or DOPG. Since these phospholipids have similar acyl chain structures, they are thought to have similar effects.
  • anionic phospholipid are preferably 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoserine, more preferably at least one selected from the group consisting of DPPS, POPS, DOPS, DLoPS, SOPS and DSPS.
  • DPPS 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoserine
  • DOPS DOPS
  • DLoPS DOPS
  • DLoPS DLoPS
  • Examples of other neutral phospholipids include 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC), 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PE), Examples include the body.
  • PC 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • PE 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphocholine include: 1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DDPC), 1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DLPC), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DLoPC), 1,2-Dialachidoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DAPC) 1,2-dieicosenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DEi)
  • 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine examples include: 1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DDPE), 1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DLPE), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DMPE), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DSPE), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DLoPE), 1,2-diercyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DEPE), 1-myristoyl-2-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DDPE), 1,
  • neutral phospholipids are not particularly limited, but are preferably at least one selected from the group consisting of DPPC, DOPC, DSPC, DEPC, POPC, SOPC, POPE, and DOPE, and more preferably DSPC, DOPC, and DOPE. At least one selected from the group consisting of DEPC, most preferably DEPC.
  • the ratio of anionic phospholipids to neutral phospholipids is preferably 100:0-25:75 mol%, more preferably 75:25-25:75 mol%.
  • the ratio is 25:75 mol%, more preferably 50:50 mol%.
  • the total amount of anionic phospholipids in the lipid nanoparticles of the present invention is determined from the viewpoints of nucleic acid encapsulation efficiency, intracellular nucleic acid release efficiency, and lipid nanoparticle stability. It is preferably 1 to 20 mol%, more preferably 2.5 to 15 mol%, and even more preferably It is 2.5 to 10 mol%.
  • the total amount of neutral phospholipids in the lipid nanoparticles of the present invention is determined from the viewpoints of nucleic acid encapsulation efficiency, intracellular nucleic acid release efficiency, and lipid nanoparticle stability. It is preferably 0 to 15 mol%, more preferably 2 to 10 mol%, even more preferably 2. It is 5 to 7.5 mol%.
  • the lipid nanoparticles of the present invention may contain the anionic cholesterol of formula (2) (herein sometimes abbreviated as "anionic cholesterol (2)”) instead of the anionic phospholipid.
  • T represents a divalent aliphatic hydrocarbon group having 1 to 8 carbon atoms.
  • the divalent aliphatic hydrocarbon group having 1 to 8 carbon atoms represented by T may be linear, branched, or contain unsaturation.
  • T is preferably a straight chain divalent saturated aliphatic hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms, more preferably a straight chain divalent saturated aliphatic hydrocarbon group having 1 to 3 carbon atoms.
  • a specific example of the anionic cholesterol (2) is cholesteryl hemisuccinate.
  • the total amount of anionic cholesterol (2) in the lipid nanoparticles of the present invention is determined from the viewpoints of nucleic acid encapsulation efficiency, intracellular nucleic acid release efficiency, and stability of lipid nanoparticles. It is preferably 1 to 20 mol%, more preferably 2.5 to 15 mol%, and even more preferably 2. .5 to 10 mol%.
  • the lipid nanoparticles of the present invention contain cholesterol.
  • the amount of cholesterol in the lipid nanoparticles of the present invention is determined from the viewpoints of nucleic acid encapsulation efficiency, intracellular nucleic acid release efficiency, and lipid nanoparticle stability.
  • the amount is preferably 20 to 60 mol%, more preferably 25 to 50 mol%, and even more preferably 30 to 40 mol%, based on the total of anionic cholesterol (2), neutral phospholipid, and cholesterol.
  • Dimyristoylglycerol PEG The lipid nanoparticles of the present invention have the formula (3): CH 2 (OR 6 )-CH (OR 7 )-CH 2 (OR 8 ) (3) (In formula (3), Any two of R 6 , R 7 and R 8 represent a myristoyl group, and the remaining one represents the number of carbon atoms connected via a polyethylene glycol chain (PEG chain) with a number average molecular weight of 1,000 to 3,000. Represents 1 to 6 alkyl groups. ) It includes dimyristoylglycerol PEG (sometimes abbreviated as "dimyristoylglycerol PEG (3)" herein) represented by:
  • the number average molecular weight of the PEG chain in formula (3) is 1,000 to 3,000, preferably 1,500 to 2,500.
  • the number average molecular weight of the PEG used to form this PEG chain can be determined by gel permeation chromatography (GPC).
  • the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms may be linear, branched, or cyclic.
  • the alkyl group preferably has 1 to 3 carbon atoms.
  • Examples of the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms include methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, isobutyl group, tert-butyl group, pentyl group, and isopentyl group.
  • Examples include cyclohexyl group. Preferably it is a methyl group.
  • the amount of dimyristoylglycerol PEG (3) in the lipid nanoparticles of the present invention is determined based on the ionic lipid (1) from the viewpoint of nucleic acid encapsulation efficiency, intracellular nucleic acid release efficiency, and stability of lipid nanoparticles. , anionic phospholipid or anionic cholesterol (2), neutral phospholipid, and cholesterol, preferably 0.5 to 1.5 mol%, more preferably 1.0 mol%.
  • Optimal Composition The optimal molar ratio of ionic lipid (1): anionic phospholipid or anionic cholesterol (2): neutral phospholipid: cholesterol: dimyristoylglycerol PEG (3) in the lipid nanoparticles of the present invention is 55 :5:5:35:1.0.
  • the lipid nanoparticles of the present invention are produced by preparing lipid raw materials containing an ionic lipid (1), an anionic phospholipid or anionic cholesterol (2), cholesterol, and dimyristoylglycerol PEG (3) in an appropriate manner. It can be produced by dispersing it in a dispersion medium (for example, an aqueous dispersion medium, an alcoholic dispersion medium), and performing an operation to induce organization as necessary.
  • a dispersion medium for example, an aqueous dispersion medium, an alcoholic dispersion medium
  • Examples of the "organization-inducing operation" for producing the lipid nanoparticles of the present invention include an alcohol (e.g., ethanol, tert-butanol, etc.) dilution method using a microchannel or vortex, and a simple hydration method. , ultrasonication, heating, vortexing, ether injection method, French press method, cholic acid method, Ca 2+ fusion method, freeze-thaw method, reverse phase evaporation method, etc., and preferably microflow method.
  • the method is an alcohol dilution method using a channel or a vortex, and more preferably an alcohol dilution method using a microchannel.
  • a dispersion containing lipid nanoparticles is prepared by mixing an acidic buffer containing a nucleic acid with an ethanol solution of a lipid. liquid can be produced.
  • the dispersion produced by this method contains lipid nanoparticles and a dispersion medium (acidic buffer and alcohol), but the dispersion medium (especially alcohol) can be removed by operations such as ultrafiltration, dialysis, and dilution. (especially buffer solutions) can be exchanged.
  • the present invention also provides a method for delivering nucleic acids to spleen cells, which comprises administering to a subject the lipid nanoparticles of the present invention encapsulating nucleic acids.
  • the lipid nanoparticles are preferably administered intravenously to the subject.
  • nucleic acid examples include, but are not limited to, DNA, RNA, chimeric nucleic acids of RNA, hybrids of DNA/RNA, and the like. Further, the nucleic acid can be used in any one- to three-stranded form, but is preferably single-stranded or double-stranded. Nucleic acids are, for example, nucleotides having N-glycosides of purine or pyrimidine bases, oligomers having non-nucleotide backbones (such as commercially available peptide nucleic acids (PNA), etc.), or oligomers having special bonds (provided that the oligomers are not DNA). or containing nucleotides having a configuration that allows base pairing or base attachment as found in RNA).
  • PNA commercially available peptide nucleic acids
  • nucleic acids may include, for example, nucleic acids with known modifications, nucleic acids with labels known in the art, capped nucleic acids, methylated nucleic acids, substitution of one or more natural nucleotides with analogs.
  • Nucleic acids with side groups such as proteins (e.g., nucleases, nuclease inhibitors, toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.) or sugars (e.g., monosaccharides, etc.)
  • Nucleic acids containing intercurrent compounds e.g., acridine, psoralen, etc.
  • nucleic acids containing chelating compounds e.g., metals, radioactive metals, boron, oxidizing metals, etc.
  • alkylating agents e.g., metals, radioactive metals, boron, oxidizing metals, etc.
  • It may be a nucleic acid having a modified bond (for example, an ⁇ -anomer type nucleic acid, etc.).
  • the type of DNA that can be used in the present invention is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the purpose of use.
  • the DNA include plasmid DNA, cDNA, antisense DNA, chromosomal DNA, PAC, BAC, CpG oligo, etc., preferably plasmid DNA, cDNA, and antisense DNA, and more preferably plasmid DNA.
  • Circular DNA such as plasmid DNA can be digested with restriction enzymes as appropriate and used as linear DNA.
  • RNA that can be used in the present invention is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the purpose of use.
  • examples of RNA include siRNA, miRNA, shRNA, antisense RNA, messenger RNA (mRNA), single-stranded RNA genome, double-stranded RNA genome, RNA replicon, transfer RNA, ribosomal RNA, etc., and preferably, siRNA, miRNA, shRNA, mRNA, antisense RNA, and RNA replicon.
  • nucleic acids used in the present invention are preferably purified by methods commonly used by those skilled in the art.
  • the nucleic acids used in the present invention preferably have prophylactic and/or therapeutic activity against a certain disease (preventive/therapeutic nucleic acids).
  • examples of such nucleic acids include nucleic acids used in so-called gene therapy.
  • the particle size of the lipid nanoparticles encapsulating nucleic acid is not particularly limited, but is preferably 10 nm to 500 nm, more preferably 30 nm to 300 nm.
  • the particle size can be measured using, for example, a particle size distribution measuring device such as Zetasizer Nano (Malvern).
  • Zetasizer Nano Zetasizer Nano
  • the particle size of lipid nanoparticles encapsulating nucleic acids can be adjusted as appropriate depending on the manufacturing method.
  • the surface potential (zeta potential) of lipid nanoparticles encapsulating nucleic acids for introducing nucleic acids into spleen cells is preferably -30 to +10 mV, more preferably -25 to 0 mV.
  • particles with positively charged surfaces have been mainly used. This is useful as a method for promoting electrostatic interaction with negatively charged heparin sulfate on the cell surface and promoting its uptake into cells.
  • a positive surface potential may result in (a) inhibition of the release of nucleic acid from the carrier due to interaction with the delivered nucleic acid within the cell, and (b) inhibition of protein synthesis due to the interaction of mRNA with the delivered nucleic acid.
  • the surface potential (zeta potential) can be measured using, for example, a zeta potential measuring device such as Zetasizer Nano.
  • the surface potential (zeta potential) of lipid nanoparticles can be adjusted by the composition of the constituent components of the lipid nanoparticles.
  • the lipid nanoparticles of the present invention By administering the lipid nanoparticles of the present invention encapsulating a nucleic acid to a living body, the lipid nanoparticles reach and contact the spleen tissue, and the nucleic acid encapsulated in the lipid nanoparticles is delivered to the spleen tissue in the living body.
  • the subjects to which the lipid nanoparticles can be administered are not particularly limited, and include, for example, mammals (e.g., humans, monkeys, mice, rats, hamsters, cows, etc.), birds (e.g., chickens, ostriches, etc.), amphibians (e.g. , frog, etc.), fish (e.g., zebrafish, medaka, etc.), and the like.
  • the subject into which the lipid nanoparticles are introduced is preferably a human or other mammalian cell.
  • the method of administering the lipid nanoparticles encapsulating a nucleic acid to a subject is not particularly limited as long as the lipid nanoparticles can deliver the nucleic acid to spleen cells, and can be administered by any known method (for example, oral administration, parenteral administration).
  • any known method for example, oral administration, parenteral administration.
  • intravenous administration is preferred.
  • the dosage of the lipid nanoparticles can be appropriately selected in consideration of the type of recipient, administration method, and the like.
  • the lipid nanoparticles of the present invention can be used as they are or mixed with a pharmaceutically acceptable carrier to form oral preparations (e.g., tablets, capsules, etc.) or parenteral preparations (e.g., nasal preparations, injections, inhalation preparations, etc.). It can be produced as a parenteral agent (more preferably a nasal agent).
  • pharmaceutically acceptable carriers those commonly used as pharmaceutical ingredients are used; for example, excipients, lubricants, binders, disintegrants, etc. are used in solid preparations, and in liquid preparations, A solvent, a solubilizing agent, a suspending agent, an isotonizing agent, a buffering agent, an analgesic agent, and the like are used. Further, if necessary, formulation additives such as preservatives, antioxidants, colorants, and sweeteners can also be used. For example, in the case of nasal preparations, they are used in the form of nasal drops or sprays.
  • ionic lipid (1) is shown by the name listed in the table above. Furthermore, the meanings of the abbreviations used in the following examples are as follows.
  • DOPC 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • DSPC 1,2-distearoyl-sn -Glycero-3-phosphocholine
  • SOPC 1-stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • DEPC 1,2-diercoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • POPE 1-palmitoyl-2-oleoyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • DOPE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • DOPG 1,2-
  • the acidic buffer solution of nucleic acid is to prepare mRNA (luc-mRNA) encoding the luciferase gene at 0.0067 ⁇ g/ ⁇ L in 20 mM acidic malate buffer containing 30 mM NaCl ( pH 3.0).
  • the transferred LNP solution was subjected to ultrafiltration under centrifugal conditions (25° C., 1000 g, about 10 minutes) and concentrated to about 500 ⁇ L.
  • the obtained concentrate was diluted to 4 mL using PBS, and ultrafiltrated again under centrifugal conditions (25° C., 1000 g, about 10 minutes) to concentrate to about 200 ⁇ L.
  • the solution was diluted with PBS to a nucleic acid concentration of 10 ⁇ g/mL.
  • Spleen gene expression activity evaluation 1 (combination evaluation with anionic phospholipid or anionic cholesterol)
  • IV administration to mice Luc-mRNA-encapsulated LNP prepared according to the method described in Production Example 1 was diluted with PBS to an mRNA concentration of 5.0 ⁇ g/mL.
  • the diluted mRNA-encapsulated LNPs were intravenously administered to 6-week-old female BALB/c mice at a dose of 200 ⁇ L per mouse (mRNA dose: 1.0 ⁇ g per mouse).
  • mRNA dose 1.0 ⁇ g per mouse
  • the cryopreserved tube was taken out, and 800 ⁇ L of Lysis buffer (77 mM Tris, 2 mM EDTA 2Na, MQ pH 7.8 containing 0.1% Triton X-100) was added. Homogenization was repeated twice at -2° C. and 4500 rpm for 30 seconds using Micro Smash (TOMY). 500 ⁇ L of the supernatant was transferred to another tube, centrifuged (4° C., 13000 rpm, 10 minutes), and 300 ⁇ L of the supernatant was collected.
  • Lysis buffer 77 mM Tris, 2 mM EDTA 2Na, MQ pH 7.8 containing 0.1% Triton X-100
  • the gene expression activity is shown in FIG. 1 as a relative value to Comparative Example 1.
  • the LNPs of Examples 1 and 2 had higher gene expression activity in the spleen than the LNPs of Comparative Example 1, which had a composition for liver transport. Since gene expression activity depends on the efficiency of nucleic acid delivery into target cells, this shows that the LNP can efficiently deliver nucleic acids to the spleen.
  • the diluted mRNA-encapsulated LNPs were intravenously administered to 6-week-old female BALB/c mice at a dose of 200 ⁇ L per mouse (mRNA dose: 1.0 ⁇ g per mouse).
  • FIG. 2 is a diagram showing the fluorescence intensity of each LNP, and shows the amount of fluorescently labeled LNP accumulated in the spleen.
  • FIG. 3 is a diagram showing gene expression activity in the spleen and shows nucleic acid delivery efficiency. It was confirmed that the LNP of Example 3 has higher LNP accumulation in the spleen and higher nucleic acid delivery efficiency than the LNP of Comparative Example 2, which is LNP with a composition for liver transport.
  • Test Example 4 Evaluation of gene expression activity in spleen 3 (combination evaluation with neutral phospholipid) (1) IV administration to mice Luc-mRNA-encapsulated LNPs prepared according to the method described in Production Example 1 were intravenously administered to mice under the same conditions as Test Example 1 (mRNA dose: 1.0 ⁇ g per mouse). ). (2) Measurement of gene expression activity Measurement was performed by the method described in Test Example 2, and gene expression activity was calculated as a relative value to Comparative Example 1.
  • CTL OVA-specific cytotoxic T cell activity.
  • the following composition was used as a culture medium for splenocytes: 500 mL of RPMI1640, 50 mL of FBS, 5 mL of 100 mM sodium pyruvate, 5 mL of 1M HEPES, 500 ⁇ L of 55 mM 2-mercaptoethanol, and 5 mL of penicillin/streptomycin (hereinafter referred to as the medium). Untreated mice were euthanized by cervical dislocation, and the spleens were harvested.
  • the spleen was cut from the center, and spleen cells were taken out from the cut surface using tweezers and suspended in a medium.
  • the cell suspension medium was collected through a 40 ⁇ m cell strainer into a 50 mL tube and centrifuged (4° C., 500 g, 5 minutes). The supernatant was discarded, 1 mL of Red Blood Cell Lysis Buffer (SIGMA) was added per animal, and the mixture was allowed to stand for 5 minutes. After diluting the mixture 5 times with a medium, it was centrifuged (4°C, 500g, 5 minutes). Furthermore, it was suspended in 10 mL of medium and centrifuged (4° C., 500 g, 5 minutes).
  • SIGMA Red Blood Cell Lysis Buffer
  • the cells were suspended in 30 mL of medium and the number of cells was counted. Thereafter, the mixture was passed through a 40 ⁇ m cell strainer and divided into two 50 mL tubes in equal amounts and centrifuged (4° C., 500 g, 5 minutes). The cells were suspended in a medium to a concentration of 1.0 ⁇ 10 7 cells/mL.
  • a 2 mM OVA epitope (consisting of the amino acid sequence of positions 257-264 of OVA) solution was added to one of the cell suspensions in an amount of 1/400 of the cell suspension, and the suspension was left standing in a culture incubator for 1 hour. This epitope pulse group was centrifuged (4°C, 500g, 5 minutes).
  • mice 100 ⁇ L of “target cells” and 100 ⁇ L of “control cells” were mixed and administered to immunized mice. Both can be distinguished from the intensity of CFSE fluorescence. Twenty hours after administration of the cell mixture, the spleen was collected from the mouse and subjected to flow cytometry analysis. Epitope-specific CTL activity was quantified by correcting the abundance of "target cells” with "control cells.”
  • the evaluation results are shown in Figures 8 and 9.
  • the LNPs with the compositions of Examples 18 and 24 exhibited approximately three times as much CTL activity as the LNPs with the composition of Comparative Example 1, which is the LNP composition for liver delivery.
  • the LNP having the composition of Example 30 showed higher CTL activity than the LNP of Comparative Example 3, which is LNP having a composition for liver delivery, and the LNP of Comparative Example 4, which has LNP having a composition for spleen delivery.
  • CTL activity is an index for evaluating whether acquired immunity can be obtained, and the higher the CTL activity, the more acquired immunity can be obtained. Therefore, it was shown that the LNPs of Examples 18, 24, and 30 were able to enhance acquired immunity more than the comparative example.
  • mice Ten-week-old female C57BL/6J mice were preliminarily bred for one week to acclimate them to the breeding environment.
  • Myelin oligodendrocyte glycoprotein hereinafter referred to as MOG
  • EAE experimental autoimmune encephalomyelitis
  • a mixed emulsion of an autoantigen peptide consisting of the amino acid sequence of positions 35-55 of MOG
  • complete Freund's adjuvant was subcutaneously administered to the neck and lumbar region of the mouse in an amount of 100 ⁇ L.
  • the pertussis toxin stock included in the kit product was diluted with PBS to 165 ng/100 ⁇ L.
  • the diluted pertussis toxin was intraperitoneally administered at 100 ⁇ L per animal twice, on the day of administration of the mixed emulsion and the next day.
  • MOG-mRNA IV administration to mice mRNA encoding luc-mRNA-encapsulated LNP or MOG peptide (consisting of the amino acid sequence at positions 27-63 of MOG) prepared according to the method described in Production Example 1 (hereinafter referred to as MOG-mRNA)
  • MOG-mRNA MOG-mRNA
  • the LNPs encapsulating LNPs were diluted with PBS to an mRNA concentration of 1.0 ⁇ g/200 ⁇ L.
  • the diluted mRNA-encapsulated LNPs were intravenously administered to EAE mice in an amount of 200 ⁇ L per mouse three times on days 7, 10, and 13 from the day of EAE induction.
  • the lipid nanoparticles of the present invention are useful for delivering nucleic acids to spleen cells.

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Abstract

本発明は、脾臓組織細胞への核酸送達効率を改善できる脾臓組織へ核酸を送達するための脂質ナノ粒子およびこれを用いて脾臓組織へ核酸を送達する方法を提供する。（Ａ）式（１）で表されるイオン性脂質、 （Ｂ）アニオン性リン脂質または式（２）で表される化合物、 （Ｃ）コレステロール、および （Ｄ）式：ＣＨ２（ＯＲ６）－ＣＨ（ＯＲ７）－ＣＨ２（ＯＲ８）で表されるジミリストイルグリセロールＰＥＧ を含む核酸を脾臓組織へ送達するために用いられる脂質ナノ粒子（式中の記号の定義は明細書に記載の通りである）、およびこれを用いて脾臓組織へ核酸を送達する方法。

Description

脾臓組織へ核酸を送達するための脂質ナノ粒子およびこれを用いて脾臓組織へ核酸を送達する方法
　本発明は、脾臓組織へ核酸を送達するために用いられる脂質ナノ粒子、およびこれを用いて脾臓組織へ核酸を送達する方法に関する。
　ｓｉＲＮＡなどのオリゴ核酸を用いた核酸治療やｍＲＮＡやｐＤＮＡ等を用いた遺伝子治療を実用化するために、効果的で安全な核酸送達キャリアが求められている。ウイルスベクターは、発現効率のよい核酸送達キャリアであるが、安全性の観点から実用上問題がある。そのため、より安全に使用できる非ウイルス核酸送達キャリアの開発が進められている。そのなかでもイオン性脂質を用いたキャリアである脂質ナノ粒子は、現在最も一般的に使用されている非ウイルス核酸送達キャリアである。
　イオン性脂質は、大別してアミン部位と脂質部位とから構成されている。例えば、イオン性脂質は、酸性条件下でプロトン化するアミン部位とポリアニオンである核酸とが静電的に相互作用し、脂質ナノ粒子を形成することで、細胞への取り込みを促進し、核酸を細胞内へ送達するものである。
　一般に広く用いられている公知のイオン性脂質としては、１，２－ジオレオイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＡＰ）が挙げられる。このような公知のイオン性脂質と、リン脂質、コレステロール及びＰＥＧ脂質を組み合わせることによって、脂質ナノ粒子を形成し、細胞内に核酸を送達し得ることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。
　例えば、特許文献１では、一つまたは二つのアミン部位と一つの脂質部位とからなる化合物同士を、生分解性を示すジスルフィド結合で繋いだ構造を有するイオン性脂質について述べられている。この特許文献１では、当該イオン性脂質が血中安定性や腫瘍標的性などの体内動態を改善することが示されている。また、アミン部位周辺の構造を変更することで、脂質膜構造体としてのｐＫａを細胞内でのエンドソーム脱出に有利な値に調整できる他、細胞内でジスルフィド結合が切断されることを利用し、核酸を脂質膜構造体から解離させる効果を有することが示されている。実際、公知のイオン性脂質であるＤＯＤＡＰと比較して、高い核酸送達効率を示すことから、当該イオン性脂質は核酸の細胞質内への送達効率の向上などの細胞内動態を改善できることが明らかとなっている。
　例えば、特許文献２では、３級アミン部位、ジスルフィド結合に加えて、脂質部位近傍に芳香環を導入したイオン性脂質を用いることで、エンドソーム膜との融合能を高め、細胞質への核酸送達効率をさらに高めた脂質膜構造体が示されている。
　上述のようにエンドソーム脱出効率や膜融合能を高めることで、細胞内動態を改善したイオン性脂質が開発されている一方で、イオン性脂質からなる脂質ナノ粒子が、核酸送達キャリアとして生体内でより実用的な効果を発揮するためには、標的とする臓器や細胞への指向性が求められている。
　脂質ナノ粒子に広く用いられているＰＥＧ脂質の一つにジミリストイルグリセロールＰＥＧ（ＤＭＧ－ＰＥＧ）がある。これを用いた脂質ナノ粒子は血中に投与された際、血中で徐々にＰＥＧ脂質が脂質ナノ粒子から解離し、血中に存在するアポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）が脂質ナノ粒子に接着することで、ＡｐｏＥの受容体を発現する肝臓への集積性が高まることが知られている（例えば、非特許文献２参照）。
　肝臓以外への臓器への指向性を付与した例としては、ＰＥＧ脂質としてミリスチン酸に由来する疎水性基を有するＤＭＧ－ＰＥＧではなく、ステアリン酸に由来する疎水性基を有するジステアロイルグリセロールＰＥＧ（ＤＳＧ－ＰＥＧ）を用いることで、腫瘍への集積性を高めた例がある（非特許文献３）。ＤＳＧ－ＰＥＧはＤＭＧ－ＰＥＧと比較して血中で脂質ナノ粒子から解離しがたいことから、血中でのＡｐｏＥの接着を回避し、肝臓への集積を抑制し、高い血中滞留性を示し、結果として腫瘍への集積性が高まる。
　肝臓以外への臓器への指向性を付与したその他の例としては、脂質ナノ粒子の粒子径を１４０～２３０ｎｍにコントロールすることで、脾臓への核酸導入効率を高めた例がある（例えば、特許文献３参照）。２００ｎｍの粒子径の脂質ナノ粒子が１００ｎｍの粒子径の脂質ナノ粒子と比較して、肝臓への核酸導入を回避し、脾臓への核酸導入効率を高めていることが示されている。
　上述のように、細胞内動態を改善した脂質ナノ粒子を用いて核酸導入効率を高められ、かつ脂質ナノ粒子の構成成分であるＰＥＧ脂質の変更や脂質ナノ粒子の粒子径の調節することで、核酸を肝臓や脾臓などの標的組織へ効率良く送達することも可能である。
米国特許第９７０８６２８号明細書 国際公開第２０１９／１８８８６７号 米国特許出願公開第２０２０／０３４５６４１号明細書
Molecular Therapy，25(7)：1467-1475 (2017) J. Control. Release, 235: 236-244 (2016) J. Control. Release, 200: 97-105 (2015) Biomater. Sci, 9: 1449-1463 (2021)
　ところで、脾臓は、免疫細胞が多く存在する臓器であるため、核酸ワクチン用途での標的対象となり得るが、当該分野での進歩にも関わらず、従来の脂質ナノ粒子を用いた脾臓への核酸送達効率は十分ではなく、改善の余地がある。
　また、特許文献１に記載の脂質ナノ粒子では、肝臓への核酸送達効率は高いことが示されているものの、脾臓への核酸送達に関しては示されていない。
　この点、非特許文献４および特許文献３のそれぞれには、脾臓送達用の脂質ナノ粒子に関して、構造的特徴の異なるイオン性脂質を用いることが示されている。しかしながら、これらの文献では、それぞれ異なるリン脂質が脂質ナノ粒子の構成成分として使用されており、イオン性脂質の構造毎にリン脂質との最適な組み合せが異なっている。
　上述のように、脂質ナノ粒子を用いて脾臓への核酸導入効率を高めた例はあるが、イオン性脂質の構造ごとに適切なリン脂質が異なることから、実用化に向けては十分に満足されるものではなく、さらなる核酸送達効率の改善が求められている。
　本発明は、上記課題を鑑み、脾臓組織細胞への核酸送達効率を改善できる脾臓組織へ核酸を送達するための脂質ナノ粒子およびこれを用いて脾臓組織へ核酸を送達する方法を提供することを目的とする。
　上述のように、脂質ナノ粒子ではイオン性脂質の構造毎にリン脂質の適切な組み合わせが異なっており、効率良い核酸の送達には、イオン性脂質とリン脂質などとの組合せを最適化することが求められる。
　発明者らは上記課題に鑑み鋭意検討した結果、エンドソーム脱出に適したpKaを有し、かつ細胞内の還元的環境下で特異的に分解するイオン性脂質と、アニオン性リン脂質または式（２）で表されるアニオン性コレステロールとを用いて製造された脂質ナノ粒子が、効率良く脾臓組織へ核酸導入できることを見出した。この知見に基づく本発明は、以下の通りである。
［１］　（Ａ）式（１）：
（式（１）中、
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂはそれぞれ独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、
　ＸａおよびＸｂはそれぞれ独立して、炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基、または炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基を表し、
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂはそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基またはオキシジアルキレン基を表し、
　ＹａおよびＹｂはそれぞれ独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合またはウレア結合を表し、
　ＺａおよびＺｂはそれぞれ独立して、炭素数が３～１６であり、少なくとも一つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を表し、
　ｎａおよびｎｂはそれぞれ独立して、０または１であり、
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂはそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、水酸基を有するステロール誘導体とコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、炭素数１～４０の脂肪族炭化水素基、シクロプロパン環を有する炭素数３～４０のアルキル基、または式（４）：
　　Ｒ９－Ｏ－ＣＯ－（ＣＨ２）ａ－　　　（４）
　（式（４）中、
　　Ｒ９は炭素数２～２０の脂肪族炭化水素基を表し、
　　ａは２～１０の整数を表す。）
で表される基を表す。）
で表されるイオン性脂質、
（Ｂ）アニオン性リン脂質または式（２）：
（式（２）中、
　Ｔは炭素数１～８の２価の脂肪族炭化水素基を表す。）
で表される化合物、
（Ｃ）コレステロール、および
（Ｄ）式（３）：
　ＣＨ２（ＯＲ６）－ＣＨ（ＯＲ７）－ＣＨ２（ＯＲ８）　　　（３）
（式（３）中、
　Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のいずれか二つはミリストイル基を表し、残りの一つは数平均分子量１，０００～３，０００のポリエチレングリコール鎖を介して連結される炭素数１～６のアルキル基を表す。）
で表されるジミリストイルグリセロールＰＥＧ
を含む核酸を脾臓組織へ送達するために用いられる脂質ナノ粒子。
［２］　前記アニオン性リン脂質が１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロールまたは１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリンである［１］に記載の脂質ナノ粒子。
［３］　前記アニオン性リン脂質が１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＤＭＰＧ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＤＰＰＧ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＰＯＰＧ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＤＯＰＧ）、１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＳＯＰＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＤＳＰＧ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＰＰＳ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＰＯＰＳ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＯＰＳ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＬｏＰＳ）、１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＳＯＰＳ）、および１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＳＰＳ）からなる群から選ばれる少なくとも一つである［１］または［２］に記載の脂質ナノ粒子。
［４］　前記アニオン性リン脂質が１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＰＯＰＧ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＤＯＰＧ）、または１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＬｏＰＳ）である［１］～［３］のいずれか一つに記載の脂質ナノ粒子。
［５］　式（２）中のＴが炭素数１～３の２価の脂肪族炭化水素基である［１］～［４］のいずれか一つに記載の脂質ナノ粒子。
［６］　式（１）で表されるイオン性脂質が、下記式：
または
で表されるいずれかのイオン性脂質である［１］～［５］のいずれか一つに記載の脂質ナノ粒子。
［７］　前記脂質ナノ粒子の成分として中性リン脂質が含まれていてもよい［１］～［６］のいずれか一つに記載の脂質ナノ粒子。
［８］　前記中性リン脂質が１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンまたは１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンである［７］に記載の脂質ナノ粒子。
［９］　前記中性リン脂質が１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＳＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、および１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）からなる群から選ばれる少なくとも一つである［７］または［８］に記載の脂質ナノ粒子。
［１０］　前記アニオン性リン脂質または前記式（２）で表される化合物と前記中性リン脂質との比率が１００：０～２５：７５ｍｏｌ％である［７］～［９］のいずれか一つに記載の脂質ナノ粒子。
［１１］　前記イオン性脂質、前記アニオン性リン脂質または前記式（２）で表される化合物、前記中性リン脂質、および前記コレステロールの合計に対して、前記イオン性脂質が３０～７０ｍｏｌ％であり、前記アニオン性リン脂質または前記式（２）で表される化合物が２．５～１５ｍｏｌ％であり、前記中性リン脂質が０～１５ｍｏｌ％であり、前記コレステロールが２０～６０ｍｏｌ％であり、ジミリストイルグリセロールＰＥＧが０．５～１．５ｍｏｌ％である［７］～［１０］のいずれか一つに記載の脂質ナノ粒子。
［１２］　核酸を封入した［１］～［１１］のいずれか一つに記載の脂質ナノ粒子を生体に静脈内投与することを含む、脾臓組織へ核酸を送達する方法。
［１３］　（Ａ）式（１）：
（式（１）中、各記号は［１］で定義した通りである。）
で表されるイオン性脂質、
（Ｂ）アニオン性リン脂質または式（２）：
（式（２）中、Ｔは［１］で定義した通りである。）
で表される化合物、
（Ｃ）コレステロール、および
（Ｄ）式（３）：
　ＣＨ２（ＯＲ６）－ＣＨ（ＯＲ７）－ＣＨ２（ＯＲ８）　　　（３）
（式（３）中、各記号は［１］で定義した通りである。）
で表されるジミリストイルグリセロールＰＥＧ
を含む脂質ナノ粒子の、核酸を脾臓組織へ送達するために用いられる医薬を製造するための使用。
［１４］　前記アニオン性リン脂質が１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロールまたは１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリンである［１３］に記載の使用。
［１５］　前記アニオン性リン脂質が１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＤＭＰＧ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＤＰＰＧ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＰＯＰＧ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＤＯＰＧ）、１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＳＯＰＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＤＳＰＧ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＰＰＳ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＰＯＰＳ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＯＰＳ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＬｏＰＳ）、１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＳＯＰＳ）、および１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＳＰＳ）からなる群から選ばれる少なくとも一つである［１３］または［１４］に記載の使用。
［１６］　前記アニオン性リン脂質が１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＰＯＰＧ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＤＯＰＧ）、または１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＬｏＰＳ）である［１３］～［１５］のいずれか一つに記載の使用。
［１７］　式（２）中のＴが炭素数１～３の２価の脂肪族炭化水素基である［１３］～［１６］のいずれか一つに記載の使用。
［１８］　式（１）で表されるイオン性脂質が、下記式：
または
で表されるいずれかのイオン性脂質である［１３］～［１７］のいずれか一つに記載の使用。
［１９］　前記脂質ナノ粒子の成分として中性リン脂質が含まれていてもよい［１３］～［１８］のいずれか一つに記載の使用。
［２０］　前記中性リン脂質が１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンまたは１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンである［１９］に記載の使用。
［２１］　前記中性リン脂質が１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＳＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、および１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）からなる群から選ばれる少なくとも一つである［１９］または［２０］に記載の使用。
［２２］　前記アニオン性リン脂質または前記式（２）で表される化合物と前記中性リン脂質との比率が１００：０～２５：７５ｍｏｌ％である［１９］～［２１］のいずれか一つに記載の使用。
［２３］　前記イオン性脂質、前記アニオン性リン脂質または前記式（２）で表される化合物、前記中性リン脂質、および前記コレステロールの合計に対して、前記イオン性脂質が３０～７０ｍｏｌ％であり、前記アニオン性リン脂質または前記式（２）で表される化合物が２．５～１５ｍｏｌ％であり、前記中性リン脂質が０～１５ｍｏｌ％であり、前記コレステロールが２０～６０ｍｏｌ％であり、ジミリストイルグリセロールＰＥＧが０．５～１．５ｍｏｌ％である［１９］～［２２］のいずれか一つに記載の使用。
　本発明の脂質ナノ粒子は、エンドソーム脱出に適したpKaを有し、かつ細胞内の還元的環境下で特異的に分解するイオン性脂質とアニオン性リン脂質またはアニオン性コレステロールとの組合せ、および脂質組成を最適化したことで、従来技術の脂質組成と比較して脾臓組織へ効率良く核酸を送達できる。
実施例１および２の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ならびに肝臓移行用の組成である比較例１のＬＮＰの脾臓における遺伝子発現活性を示す図である。 実施例３のＬＮＰおよび肝臓移行用の組成である比較例２のＬＮＰの脾臓におけるＬＮＰの集積性を示す図である。 実施例３のＬＮＰおよび肝臓移行用の組成である比較例２のＬＮＰの脾臓における遺伝子発現活性を示す図である。 実施例１および４から１０のＬＮＰならびに肝臓移行用の組成である比較例１のＬＮＰの脾臓における遺伝子発現活性を示す図である。 実施例５および１１から２４のＬＮＰの脾臓における遺伝子発現活性を示す図である。 実施例１８および２５から２９のＬＮＰの脾臓における遺伝子発現活性を示す図である。 実施例３０のＬＮＰおよび肝臓送達用の組成である比較例３のＬＮＰの脾臓における遺伝子発現活性を示す図である。 ＯＶＡ－ｍＲＮＡを封入した実施例１８および２４のＬＮＰならびに肝臓送達用の組成である比較例１のＬＮＰをマウスに投与した際のＣＴＬ活性を示す図である。 ＯＶＡ－ｍＲＮＡを封入した実施例３０のＬＮＰ、肝臓送達用の組成である比較例３のＬＮＰ、および脾臓送達用の組成である比較例４のＬＮＰをマウスに投与した際のＣＴＬ活性を示す図である。 ＯＶＡ－ｍＲＮＡを封入した実施例３１のＬＮＰおよび脾臓送達用の組成である比較例４のＬＮＰをマウスに投与した際のＣＴＬ活性を示す図である。 ＭＯＧ－ｍＲＮＡもしくはｌｕｃ－ｍＲＮＡを封入した実施例３２のＬＮＰまたはＰＢＳを投与したマウスの病態スコアを示す図である。 ＭＯＧ－ｍＲＮＡもしくはｌｕｃ－ｍＲＮＡを封入した実施例３２のＬＮＰまたはＰＢＳを投与したマウスの体重変動（％）（Ｄａｙ１０に対して）を示す図である。
　以下、本発明の実施形態を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本発明は、式（１）で表されるイオン性脂質（即ち、３級アミノ基、脂質部位、そして生分解性基であるジスルフィド結合を有するイオン性脂質）、アニオン性リン脂質または式（２）で表されるアニオン性コレステロール、コレステロール、および式（３）で表されるジミリストイルグリセロールＰＥＧを含む脂質ナノ粒子、並びにこれを用いて脾臓細胞に核酸を送達する方法に関するものである。
脂質ナノ粒子
　本明細書中、「脂質ナノ粒子」（Ｌｉｐｉｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ、本明細書中「ＬＮＰ」と略称することがある）とは、両親媒性脂質の親水性基が界面の水相側に向かって配列した膜構造を有し、粒子径が１μｍ未満である粒子を意味し、「両親媒性脂質」とは、親水性基および疎水性基の両方を有する脂質を意味する。
　本発明の脂質ナノ粒子の粒子径は、好ましくは１０ｎｍ～５００ｎｍであり、より好ましくは３０ｎｍ～３００ｎｍである。粒子径の測定は、例えばＺｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ社）などの粒度分布測定装置を用いて行うことができる。脂質ナノ粒子の粒子径は、脂質ナノ粒子の製造方法により、適宜調整することができる。本明細書中、「粒子径」とは、動的光散乱法により測定した平均粒子径（ゼータ平均）を意味する。
　両親媒性脂質としては、例えば、イオン性脂質、リン脂質、ＰＥＧ脂質等を挙げることができる。本明細書中、「ＰＥＧ」とは、ポリエチレングリコールを意味し、「ＰＥＧ脂質」とは、ＰＥＧで修飾した脂質を意味し、「Ｘで修飾したＹ」（例えば、Ｘ：ＰＥＧ、Ｙ：脂質）とは、Ｘが結合したＹを意味する。言い換えると、「ＰＥＧ脂質」とは、ＰＥＧが結合した脂質を意味する。
　本発明の脂質ナノ粒子は、式（１）で表されるイオン性脂質、アニオン性リン脂質または式（２）で表されるアニオン性コレステロール、中性リン脂質、コレステロール、および式（３）で表されるジミリストイルグリセロールＰＥＧ以外の脂質（以下「他の脂質」と記載することがある）を含んでいてもよい。他の脂質としては、例えば、コレステロール以外のステロール、式（３）で表されるジミリストイルグリセロールＰＥＧ以外のＰＥＧ脂質が挙げられる。
　本発明の脂質ナノ粒子中の他の脂質の量は、脂質ナノ粒子中の脂質の総量に対して、好ましくは０～５０ｍｏｌ％、より好ましくは０～３０ｍｏｌ％、さらに好ましくは０～１０ｍｏｌ％である。ここで、「脂質ナノ粒子中の脂質の総量」とは、例えば、脂質ナノ粒子が、式（１）で表されるイオン性脂質、リン脂質、コレステロール、および式（３）で表されるジミリストイルグリセロールＰＥＧおよび他の脂質を構成成分として含有する場合、「式（１）で表されるイオン性脂質、リン脂質、コレステロール、および式（３）で表されるジミリストイルグリセロールＰＥＧおよび他の脂質の合計量」を意味する。また、本明細書中、「Ａに対するＢの量（ｍｏｌ％）」とは、「１００×Ｂの量（ｍｏｌ）／Ａの量（ｍｏｌ）」を意味する。例えば「脂質の総量に対する他の脂質の量（ｍｏｌ％）」とは、「１００×他の脂質の量（ｍｏｌ）／脂質の総量（ｍｏｌ）」を意味する。
　本発明において他の脂質を使用しないこと、即ち、本発明の脂質ナノ粒子を構成する脂質は、式（１）で表されるイオン性脂質、アニオン性リン脂質または式（２）で表されるアニオン性コレステロール、中性リン脂質、コレステロール、および式（３）で表されるジミリストイルグリセロールＰＥＧからなることが最も好ましい。
イオン性脂質
　本発明で使用するイオン性脂質は、下記式（１）で表されるイオン性脂質（本明細書中「イオン性脂質（１）」と略称することがある）である。イオン性脂質（１）は、１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
（式（１）中、
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂはそれぞれ独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、
　ＸａおよびＸｂはそれぞれ独立して、炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基、または炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基を表し、
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂはそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基またはオキシジアルキレン基を表し、
　ＹａおよびＹｂはそれぞれ独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合またはウレア結合を表し、
　ＺａおよびＺｂはそれぞれ独立して、炭素数が３～１６であり、少なくとも一つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を表し、
　ｎａおよびｎｂはそれぞれ独立して、０または１であり、
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂはそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、水酸基を有するステロール誘導体とコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、炭素数１～４０の脂肪族炭化水素基、シクロプロパン環を有する炭素数３～４０のアルキル基、または式（４）：
　　Ｒ９－Ｏ－ＣＯ－（ＣＨ２）ａ－　　　（４）
　（式（４）中、
　　Ｒ９は炭素数２～２０の脂肪族炭化水素基を表し、
　　ａは２～１０の整数を表す。）
で表される基を表す。）
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂはそれぞれ独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、直鎖状であっても良く、分岐を有していても良いが、好ましくは直鎖状である。該アルキレン基の炭素数は、好ましくは１～４であり、より好ましくは１～２である。炭素数１～６のアルキレン基としては、具体的にはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基、テトラメチレン基、イソブチレン基、ペンタメチレン基、ネオペンチレン基等を挙げることができる。Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、好ましくはそれぞれ独立して、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基またはテトラメチレン基であり、最も好ましくはそれぞれエチレン基である。
　Ｒ１ａはＲ１ｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、Ｒ１ａはＲ１ｂと同一の基である。
　ＸａおよびＸｂはそれぞれ独立して、炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基、または炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基を表し、好ましくはそれぞれ独立して、炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基である。
　炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基中の炭素数１～６のアルキル基は、直鎖状であっても分岐状であっても環状であっても良い。該アルキル基の炭素数は、好ましくは１～３である。炭素数１～６のアルキル基としては、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、１，２－ジメチルプロピル基、２－メチルブチル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、２，２－ジメチルブチル基、２，３－ジメチルブチル基、シクロヘキシル基等を挙げることができ、好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基またはイソプロピル基であり、最も好ましくはメチル基である。
　炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基の好ましい具体的な構造は、Ｘ１で示される。
　Ｘ１のＲ５は炭素数１～６のアルキル基を表し、直鎖状であっても分岐状であっても環状であっても良い。該アルキル基の炭素数は、好ましくは１～３である。炭素数１～６のアルキル基としては、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、１，２－ジメチルプロピル基、２－メチルブチル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、２，２－ジメチルブチル基、２，３－ジメチルブチル基、シクロヘキシル基等を挙げることができ、好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基またはイソプロピル基であり、最も好ましくはメチル基である。
　炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基中の炭素数は、好ましくは４～５である。炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基としては、具体的にはアジリジレン基、アゼチジレン基、ピロリジレン基、ピペリジレン基、イミダゾリジレン基、ピペラジレン基であり、好ましくはピロリジレン基、ピペリジレン基、ピペラジレン基であり、最も好ましくはピペリジレン基である。
　炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１の環状のアルキレン３級アミノ基の好ましい具体的な構造はＸ２で示される。
　Ｘ２のｐは１または２である。ｐが１のときＸ２はピロリジレン基であり、ｐが２のときＸ２はピペリジレン基である。好ましくは、ｐは２である。
　炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が２の環状のアルキレン３級アミノ基の好ましい具体的な構造はＸ３で示される。
　Ｘ３のｗは１または２である。ｗが１のときＸ３はイミダゾリジレン基であり、ｗが２のときＸ３はピペラジレン基である。
　ＸａはＸｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、ＸａはＸｂと同一の基である。
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂはそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基またはオキシジアルキレン基を表し、好ましくはそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基である。
　炭素数８以下のアルキレン基は、直鎖状であっても、分岐を有していても良いが、好ましくは直鎖状である。該アルキレン基に含まれる炭素数は、好ましくは６以下であり、最も好ましくは４以下である。炭素数８以下のアルキレン基としては、具体的にはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基、テトラメチレン基、イソブチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、ヘプタメチレン基、オクタメチレン基等を挙げることができ、好ましくはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基であり、最も好ましくはエチレン基である。
　本明細書中、「炭素数８以下のオキシジアルキレン基」とは、エーテル結合を介したアルキレン基（アルキレン－Ｏ－アルキレン、言い換えると「アルキレンオキシアルキレン基」）であって、二つ存在するアルキレン基の炭素数の合計が８以下の基を意味する。ここで、二つ存在するアルキレンは同一でも異なっていてもよいが、好ましくは同一である。炭素数８以下のオキシジアルキレン基としては、具体的にはオキシジメチレン基、オキシジエチレン基、オキシジ（トリメチレン）基（即ち、トリメチレンオキシトリメチレン基）、オキシジ（テトラメチレン）基（即ち、テトラメチレンオキシテトラメチレン基）等を挙げることができる。好ましくは、オキシジメチレン基、オキシジエチレン基、オキシジ（トリメチレン）基であり、最も好ましくはオキシジエチレン基である。
　Ｒ２ａはＲ２ｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、Ｒ２ａはＲ２ｂと同一の基である。
　ＹａおよびＹｂはそれぞれ独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合またはウレア結合であり、好ましくはそれぞれ独立して、エステル結合、アミド結合またはカーバメート結合であり、より好ましくはそれぞれ独立して、エステル結合またはアミド結合であり、最も好ましくはそれぞれエステル結合である。ＹａおよびＹｂの結合の向きは制限されないが、ＹａおよびＹｂがエステル結合の場合、好ましくは、－Ｚａ－ＣＯ－Ｏ－Ｒ２ａ－および－Ｚｂ－ＣＯ－Ｏ－Ｒ２ｂ－の構造を呈する。
　ＹａはＹｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、ＹａはＹｂと同一の基である。
　ＺａおよびＺｂはそれぞれ独立して、炭素数が３～１６であり、少なくとも一つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を表す。該芳香族化合物に含まれる炭素数は好ましくは６～１２であり、最も好ましくは６～７である。また、該芳香族化合物に含まれる芳香環は、好ましくは一つである。
　炭素数３～１６の芳香族化合物に含まれる芳香環の種類として、芳香族炭化水素環については、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、芳香族ヘテロ環についてはイミダゾール環、ピラゾール環、オキサゾール環、イソオキサゾール環、チアゾール環、イソチアゾール環、トリアジン環、ピロール環、フランチオフェン環、ピリミジン環、ピリダジン環、ピラジン環、ピリジン環、プリン環、プテリジン環、ベンズイミダゾール環、インドール環、ベンゾフラン環、キナゾリン環、フタラジン環、キノリン環、イソキノリン環、クマリン環、クロモン環、ベンゾジアゼピン環、フェノキサジン環、フェノチアジン環、アクリジン環等を挙げることができ、好ましくは、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環であり、最も好ましくは、ベンゼン環である。
　芳香環は置換基を有してもよく、その置換基としては、炭素数２～４のアシル基、炭素数２～４のアルコキシカルボニル基、炭素数２～４のカルバモイル基、炭素数２～４のアシルオキシ基、炭素数２～４のアシルアミノ基、炭素数２～４のアルコキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１～４のアルキルスルファニル基、炭素数１～４のアルキルスルホニル基、炭素数６～１０のアリールスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のウレイド基、炭素数１～４のアルコキシ基、炭素６～１０のアリール基、炭素数６～１０のアリールオキシ基等を挙げることができ、好ましい例としてはアセチル基、メトキシカルボニル基、メチルカルバモイル基、アセトキシ基、アセトアミド基、メトキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、メチルスルファニル基、フェニルスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ウレイド基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、フェニル基およびフェノキシ基等が挙げられる。
　ＺａおよびＺｂの好ましい具体的な構造としては、Ｚ１が挙げられる。
　式中、ｓは０～３の整数を表し、ｔは０～３の整数を表し、ｕは０～４の整数を表し、ｕ個のＲ４はそれぞれ独立して置換基を表す。
　Ｚ１のｓは、好ましくは０～１の整数であり、より好ましくは０である。
　Ｚ１のｔは、好ましくは０～２の整数であり、より好ましくは１である。
　Ｚ１のｕは、好ましくは０～２の整数であり、より好ましくは０～１の整数である。
　Ｚ１のＲ４は、該イオン性脂質の合成過程における反応を阻害しない、炭素数３～１６の芳香族化合物に含まれる芳香環（ベンゼン環）の置換基である。該置換基としては、炭素数２～４のアシル基、炭素数２～４のアルコキシカルボニル基、炭素数２～４のカルバモイル基、炭素数２～４のアシルオキシ基、炭素数２～４のアシルアミノ基、炭素数２～４のアルコキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１～４のアルキルスルファニル基、炭素数１～４のアルキルスルホニル基、炭素数６～１０のアリールスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のウレイド基、炭素数１～４のアルコキシ基、炭素６～１０のアリール基、炭素数６～１０のアリールオキシ基等を挙げることができ、好ましい例としてはアセチル基、メトキシカルボニル基、メチルカルバモイル基、アセトキシ基、アセトアミド基、メトキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、メチルスルファニル基、フェニルスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ウレイド基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、フェニル基およびフェノキシ基等が挙げられる。Ｒ４が複数個存在する場合、各Ｒ４は同一であっても異なっていてもよい。
　ＺａはＺｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、ＺａはＺｂと同一の基である。
　ｎａおよびｎｂはそれぞれ独立して、０または１である。
　ｎａはｎｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、ｎａはｎｂと同一である。
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂはそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、水酸基を有するステロール誘導体とコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、炭素数１～４０の脂肪族炭化水素基、シクロプロパン環を有する炭素数３～４０のアルキル基、または式（４）：
　　Ｒ９－Ｏ－ＣＯ－（ＣＨ２）ａ－　　　（４）
　（式（４）中、
　　Ｒ９は炭素数２～２０の脂肪族炭化水素基を表し、
　　ａは２～１０の整数を表す。）
で表される基を表し、好ましくはそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、または炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基であり、最も好ましくはそれぞれ独立して、炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基である。
　水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基とは、水酸基を有する脂溶性ビタミンの水酸基が＊－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－または＊－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－に置き換えられた構造を有する基を表す。＊は脂溶性ビタミンとの結合位置を表す。水酸基を有するステロール誘導体とコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基とは、水酸基を有するステロール誘導体の水酸基が＊－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－または＊－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－に置き換えられた構造を有する基を表す。＊はステロール誘導体との結合位置を表す。
　水酸基を有する脂溶性ビタミンとしては、例えばレチノール、エルゴステロール、７－デヒドロコレステロール、カルシフェロール、コルカルシフェロール、ジヒドロエルゴカルシフェロール、ジヒドロタキステロール、トコフェロール、トコトリエノール等を挙げることができる。水酸基を有する脂溶性ビタミンは、好ましくはトコフェロールである。
　水酸基を有するステロール誘導体としては、例えばコレステロール、コレスタノール、スチグマステロール、β－シトステロール、ラノステロール、およびエルゴステロール等が挙げられ、好ましくはコレステロール、またはコレスタノールである。
　炭素数１～４０の脂肪族炭化水素基は、直鎖状であっても、分岐を有していてもよい。該脂肪族炭化水素基は、飽和であっても不飽和であってもよい。不飽和脂肪族炭化水素基の場合、該脂肪族炭化水素基に含まれる不飽和結合の数は通常１～６個、好ましくは１～３個、より好ましくは１～２個である。不飽和結合には炭素－炭素二重結合および炭素－炭素三重結合が含まれるが、好ましくは炭素－炭素二重結合である。該脂肪族炭化水素基に含まれる炭素数は、好ましくは１２～２２であり、より好ましくは１３～１９であり、最も好ましくは１３～１７である。脂肪族炭化水素基には、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基等が含まれるが、好ましくはアルキル基またはアルケニル基が含まれる。炭素数１～４０の脂肪族炭化水素基としては、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基、ヘンイコシル基、ドコシル基、トリコシル基、テトラコシル基、ペンタコシル基、ヘキサコシル基、ヘプタコシル基、オクタコシル基、ノナコシル基、トリアコンチル基、テトラコンチル基、ドデセニル基、トリデセニル基、テトラデセニル基、ペンタデセニル基、ヘキサデセニル基、ヘプタデセニル基、オクタデセニル基、ノナデセニル基、イコセニル基、ヘンイコセニル基、ドコセニル基、ドデカジエニル基、トリデカジエニル基、テトラデカジエニル基、ペンタデカジエニル基、ヘキサデカジエニル基、ヘプタデカジエニル基、オクタデカジエニル基、ノナデカジエニル基、イコサジエニル基、ヘンイコサジエニル基、ドコサジエニル基、オクタデカトリエニル基、イコサトリエニル基、イコサテトラエニル基、イコサペンタエニル基、ドコサヘキサエニル基、イソステアリル基、１－ヘキシルヘプチル基、１－ヘキシルノニル基、１－オクチルノニル基、１－オクチルウンデシル基、１－デシルウンデシル基等を挙げることができる。炭素数１～４０の脂肪族炭化水素基は、好ましくはトリデシル基、ペンタデシル基、ヘプタデシル基、ノナデシル基、ヘプタデセニル基、ヘプタデカジエニル基、１－ヘキシルノニル基であり、特に好ましくはトリデシル基、ヘプタデシル基、ヘプタデセニル基、ヘプタデカジエニル基である。
　本発明の一態様において、Ｒ３ａおよびＲ３ｂで表される炭素数１～４０（好ましくは炭素数１２～２２）の脂肪族炭化水素基は脂肪酸由来である。この場合、脂肪酸由来のカルボニル炭素は式（１）中の－ＣＯ－Ｏ－に含まれる。脂肪族炭化水素基の具体例としては、脂肪酸としてリノール酸を用いた場合ではヘプタデカジエニル基となり、脂肪酸としてオレイン酸を用いた場合ではヘプタデセニル基となる。
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂにおけるシクロプロパン環を有する炭素数３～４０のアルキル基は、アルキル鎖中に少なくとも一つのシクロプロパン環を有する、炭素数３～４０のアルキル基を意味する。アルキル基の炭素数３～４０はシクロプロパン環の炭素数を含まない。該アルキル基が有するシクロプロパン環の数は、好ましくは一つである。Ｒ３ａおよびＲ３ｂにおけるシクロプロパン環を有する炭素数３～４０のアルキル基は、好ましくは式（５）：
（式（５）中、ｂおよびｃはそれぞれ独立して整数であり、ｂおよびｃの合計が２～３９である。）
で表される基である。好ましくは、ｂは１～２０の整数であり、ｃは１～１９の整数である。ｂはより好ましくは２～１８の整数であり、さらに好ましくは３～１７の整数であり、さらにより好ましくは４～１２の整数である。ｃはより好ましくは３～１５の整数であり、さらに好ましくは３～１１の整数であり、さらにより好ましくは３～９の整数である。式（５）で表される基としては、例えば、７－（２－オクチルシクロプロピル）ヘプチル等が挙げられる。
　式（４）において、Ｒ９で表される炭素数２～２０の脂肪族炭化水素基は、直鎖状であっても、分岐を有していてもよい。該脂肪族炭化水素基は、飽和であっても不飽和であってもよい。不飽和脂肪族炭化水素基の場合、該脂肪族炭化水素基に含まれる不飽和結合の数は通常１～６個、好ましくは１～３個、より好ましくは１～２個である。不飽和結合には炭素－炭素二重結合および炭素－炭素三重結合が含まれるが、好ましくは炭素－炭素二重結合である。該脂肪族炭化水素基に含まれる炭素数は、好ましくは８～２０であり、より好ましくは９～１９であり、さらに好ましくは１３～１９であり、最も好ましくは１３～１７である。脂肪族炭化水素基には、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基等が含まれるが、好ましくはアルキル基またはアルケニル基が含まれ、より好ましくはアルキル基である。炭素数２～２０の脂肪族炭化水素基としては、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基、ドデセニル基、トリデセニル基、テトラデセニル基、ペンタデセニル基、ヘキサデセニル基、ヘプタデセニル基、オクタデセニル基、ノナデセニル基、イコセニル基、ヘンイコセニル基、ドコセニル基、ドデカジエニル基、トリデカジエニル基、テトラデカジエニル基、ペンタデカジエニル基、ヘキサデカジエニル基、ヘプタデカジエニル基、オクタデカジエニル基、ノナデカジエニル基、イコサジエニル基、イコサトリエニル基、イコサテトラエニル基、イコサペンタエニル基、イソステアリル基、１－ヘキシルヘプチル基、１－エチルノニル基、１－ブチルノニル基、１－ヘキシルノニル基、１－オクチルノニル基、１－オクチルウンデシル基、３－オクチルウンデシル基等を挙げることができる。炭素数２～２０の脂肪族炭化水素基は、好ましくはトリデシル基、ペンタデシル基、ヘプタデシル基、ノナデシル基、ヘプタデセニル基、ヘプタデカジエニル基、１－ヘキシルノニル基であり、特に好ましくはトリデシル基、ヘプタデシル基、ヘプタデセニル基、ヘプタデカジエニル基である。
　式（４）において、ａは好ましくは３～９の整数であり、より好ましくは３～７の整数であり、さらに好ましくは５～７の整数であり、最も好ましくは５または７である。
　Ｒ３ａはＲ３ｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、Ｒ３ａはＲ３ｂと同一の基である。
　本発明の一態様において、Ｒ１ａはＲ１ｂと同一であり、ＸａはＸｂと同一であり、Ｒ２ａはＲ２ｂと同一であり、ＹａはＹｂと同一であり、ＺａはＺｂと同一であり、Ｒ３ａはＲ３ｂと同一である。
　イオン性脂質（１）の好適な例としては、以下のイオン性脂質が挙げられる。
［イオン性脂質（１－１）］
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂがそれぞれ独立して、炭素数１～６のアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基）であり；
　ＸａおよびＸｂがそれぞれ独立して、炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基（例、－Ｎ（ＣＨ３）－）、または炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基（例、ピペリジレン基）であり；
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂがそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基）であり；
　ＹａおよびＹｂがそれぞれ独立してエステル結合またはアミド結合であり；
　ＺａおよびＺｂがそれぞれ独立して、炭素数が３～１６であり、少なくとも一つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基（例、－Ｃ６Ｈ４－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ４－ＣＨ２－）であり；
　ｎａおよびｎｂがそれぞれ独立して、０または１であり；
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂがそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミン（例、トコフェロール）とコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、または炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基（例、ヘプタデセニル基、ヘプタデカジエニル基、１－ヘキシルノニル基）である；
イオン性脂質（１）。
［イオン性脂質（１－２）］
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂがそれぞれ独立して、炭素数１～４のアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基）であり；
　ＸａおよびＸｂがそれぞれ独立して、炭素数が１～３であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基（例、－Ｎ（ＣＨ３）－）、または炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１の環状のアルキレン３級アミノ基（例、ピペリジレン基）であり；
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂがそれぞれ独立して、炭素数６以下のアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基）であり；
　ＹａおよびＹｂがそれぞれ独立してエステル結合またはアミド結合であり；
　ＺａおよびＺｂがそれぞれ独立して、炭素数が６～１２であり、１つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基（例、－Ｃ６Ｈ４－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ４－ＣＨ２－）であり；
　ｎａおよびｎｂがそれぞれ独立して、０または１であり；
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂがそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミン（例、トコフェロール）とコハク酸無水物との反応物由来の残基、または炭素数１３～１９の脂肪族炭化水素基（例、ヘプタデセニル基、ヘプタデカジエニル基、１－ヘキシルノニル基）である；
イオン性脂質（１）。
［イオン性脂質（１－３）］
　Ｒ１ａおよびＲ１ｂがそれぞれ独立して、炭素数１～２のアルキレン基（即ち、メチレン基またはエチレン基）であり；
　ＸａおよびＸｂがそれぞれ独立して、Ｘ１：
（式中、Ｒ５は炭素数１～３のアルキル基（例、メチル基）である。）、またはＸ２：
（式中、ｐは１または２である。）
であり；
　Ｒ２ａおよびＲ２ｂがそれぞれ独立して、炭素数４以下のアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基）であり；
　ＹａおよびＹｂがそれぞれ独立してエステル結合またはアミド結合であり；
　ＺａおよびＺｂがそれぞれ独立して、Ｚ１：
（式中、ｓは０～１の整数であり、ｔは０～２の整数であり、ｕは０～２の整数（好ましくは０）であり、ｕ個のＲ４は、それぞれ独立して置換基を表す。）
であり；
　ｎａおよびｎｂがそれぞれ独立して、０または１であり；
　Ｒ３ａおよびＲ３ｂがそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミン（例、トコフェロール）とコハク酸無水物との反応物由来の残基、または炭素数１３～１７の脂肪族炭化水素基（例、ヘプタデセニル基、ヘプタデカジエニル基、１－ヘキシルノニル基）である；
イオン性脂質（１）。
　イオン性脂質（１）の具体例として、以下のＯ－Ｐｈ－Ｐ３Ｃ１、Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ１、Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、Ｏ－Ｂｎ－Ｐ４Ｃ２、Ｅ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、Ｌ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、ＨＤ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、Ｏ－Ｐｈ－ａｍｉｄｅ－Ｐ４Ｃ２、Ｏ－Ｐｈ－Ｃ３Ｍ、ＴＳ－Ｐ４Ｃ２を挙げることができる。
　また、イオン性脂質（１）の具体例として、ＷＯ　２０２１／１９５５２９　Ａ２に記載のＬｉｐｉｄ１からＬｉｐｉｄ２０を挙げることができ、特に、以下のＬｉｐｉｄ１、Ｌｉｐｉｄ５、Ｌｉｐｉｄ８を挙げることができる。
　イオン性脂質（１）の具体例の中でも、ＳＳ－ＯＰまたはＳＳ－ＥＣが好ましい。即ち、イオン性脂質（１）は、好ましくは下記式で表されるイオン性脂質である。
　本発明の脂質ナノ粒子中のイオン性脂質（１）の量は、核酸の内封効率、細胞内での核酸の放出効率および脂質ナノ粒子の安定性の観点から、イオン性脂質（１）、アニオン性リン脂質または式（２）で表される化合物、中性リン脂質、およびコレステロールの合計に対して、好ましくは３０～７０ｍｏｌ％、より好ましくは４０～６５ｍｏｌ％、さらに好ましくは５０～６０ｍｏｌ％である。
　イオン性脂質（１）は、公知の方法（例えば、ＷＯ　２０１９／１８８８６７　Ａ１、ＵＳ　９７０８６２８　Ｂ２、ＷＯ　２０２１／１９５５２９　Ａ２に記載の方法）によって製造することができる。
リン脂質
　本発明の脂質ナノ粒子は、リン脂質としてアニオン性リン脂質を含む。リン脂質はアニオン性リン脂質のみを使用してもよく、アニオン性リン脂質とその他、中性リン脂質とを併用してもよい。
　アニオン性リン脂質の具体例としては、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＰＳ）、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＰＧ）、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸（ＰＡ）、これらのリゾ体等が挙げられる。
　１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＰＳ）の具体例としては、
１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＤＰＳ）、
１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＬＰＳ）、
１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＭＰＳ）、
１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＰＰＳ）、
１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＳＰＳ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＯＰＳ）、
１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＬｏＰＳ）、
１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＥＰＳ）、
１－ミリストイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＭＰＰＳ）、
１－ミリストイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＭＳＰＳ）、
１－パルミトイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＰＭＰＳ）、
１－パルミトイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＰＳＰＳ）、
１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＰＯＰＳ）、
１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＳＯＰＳ）
が挙げられる。なお、本明細書中、リン脂質をその略号で記載することがある。例えば、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリンをＰＳと記載し、１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリンをＤＤＰＳと記載することがある。
　１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＰＧ）の具体例としては、
１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＤＤＰＧ）、
１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＤＬＰＧ）、
１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＤＭＰＧ）、
１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＤＰＰＧ）、
１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＤＳＰＧ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＤＯＰＧ）、
１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＤＬｏＰＧ）、
１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＤＥＰＧ）、
１－ミリストイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＭＰＰＧ）、
１－ミリストイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＭＳＰＧ）、
１－パルミトイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＰＭＰＧ）、
１－パルミトイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＰＳＰＧ）、
１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＰＯＰＧ）、
１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＳＯＰＧ）
が挙げられる。
　１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸（ＰＡ）の具体例としては、
１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸（ＤＤＰＡ）、
１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸（ＤＬＰＡ）、
１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、
１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、
１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸（ＤＯＰＡ）、
１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸（ＤＬｏＰＡ）、
１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸（ＤＥＰＡ）、
１－ミリストイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸（ＭＰＰＡ）、
１－ミリストイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸（ＭＳＰＡ）、
１－パルミトイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸（ＰＭＰＡ）、
１－パルミトイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸（ＰＳＰＡ）、
１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸（ＰＯＰＡ）、
１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸（ＳＯＰＡ）
が挙げられる。
　アニオン性リン脂質は、好ましくは１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロールであり、より好ましくはＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＰＯＰＧ、ＤＯＰＧ、ＳＯＰＧおよびＤＳＰＧからなる群から選ばれる少なくとも一つであり、さらに好ましくはＰＯＰＧまたはＤＯＰＧである。これらのリン脂質は類似のアシル鎖構造であることから同様の効果を奏すると考えられる。
　アニオン性リン脂質のその他の形態としては、好ましくは１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリンであり、より好ましくはＤＰＰＳ、ＰＯＰＳ、ＤＯＰＳ、ＤＬｏＰＳ、ＳＯＰＳおよびＤＳＰＳからなる群から選ばれる少なくとも一つであり、さらに好ましくはＤＬｏＰＳである。これらのリン脂質は類似のアシル鎖構造であることから同様の効果を奏すると考えられる。
　その他の中性リン脂質の例としては、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＣ）、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＥ）、これらのリゾ体等が挙げられる。
　１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＣ）の具体例としては、
１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＤＰＣ）、
１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、
１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、
１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、
１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、
１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬｏＰＣ）、
１，２－ジアラキドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＡＰＣ）
１，２－ジエイコセノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥｉＰＣ）、
１，２－ジベヘノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、
１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、
１，２－ジリグノセロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬｉＰＣ）、
１，２－ジネルボノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＮＰＣ）、
１－ミリストイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＭＰＰＣ）、
１－ミリストイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＭＳＰＣ）、
１－パルミトイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＭＰＣ）、
１－パルミトイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＳＰＣ）、
１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、
１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＳＯＰＣ）
が挙げられる。
　１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＥ）の具体例としては、
１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＤＰＥ）、
１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、
１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、
１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、
１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、
１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬｏＰＥ）、
１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、
１－ミリストイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＰＰＥ）、
１－ミリストイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＳＰＥ）、
１－パルミトイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＭＰＥ）、
１－パルミトイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＳＰＥ）、
１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、
１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＳＯＰＥ）
が挙げられる。
　その他の中性リン脂質は、特に限定されないが、好ましくはＤＰＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＥＰＣ、ＰＯＰＣ、ＳＯＰＣ、ＰＯＰＥおよびＤＯＰＥからなる群から選ばれる少なくとも一つであり、より好ましくは、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＣおよびＤＥＰＣからなる群から選ばれる少なくとも一つであり、最も好ましくはＤＥＰＣである。
　アニオン性リン脂質とその他の中性リン脂質を併用する場合は、アニオン性リン脂質と中性リン脂質の比率は、好ましくは１００：０～２５：７５ｍｏｌ％であり、より好ましくは７５：２５～２５：７５ｍｏｌ％であり、さらに好ましくは５０：５０ｍｏｌ％である。
　本発明の脂質ナノ粒子中のアニオン性リン脂質の総量は、核酸の内封効率、細胞内での核酸の放出効率および脂質ナノ粒子の安定性の観点から、イオン性脂質（１）、アニオン性リン脂質または式（２）で表される化合物、中性リン脂質、およびコレステロールの合計に対して、好ましくは１～２０ｍｏｌ％であり、より好ましくは２．５～１５ｍｏｌ％であり、さらに好ましくは２．５～１０ｍｏｌ％である。
　本発明の脂質ナノ粒子中の中性リン脂質の総量は、核酸の内封効率、細胞内での核酸の放出効率および脂質ナノ粒子の安定性の観点から、イオン性脂質（１）、アニオン性リン脂質または式（２）で表される化合物、中性リン脂質、およびコレステロールの合計に対して、好ましくは０～１５ｍｏｌ％であり、より好ましくは２～１０ｍｏｌ％であり、さらに好ましくは２．５～７．５ｍｏｌ％である。
コレステロール
　本発明の脂質ナノ粒子は、アニオン性リン脂質の代わりに式（２）のアニオン性コレステロール（本明細書中「アニオン性コレステロール（２）」と略称することがある）を含んでもよい。
　（式（２）中、
　Ｔは炭素数１～８の２価の脂肪族炭化水素基を表す。）
　Ｔで表される炭素数１～８の２価の脂肪族炭化水素基は直鎖であっても分岐であっても不飽和を含んでいてもよい。Ｔは好ましくは炭素数１～６の直鎖の２価の飽和脂肪族炭化水素基であり、より好ましくは炭素数１～３の直鎖の２価の飽和脂肪族炭化水素基である。アニオン性コレステロール（２）の具体例としては、コレステリル　ヘミスクシネートが挙げられる。
　本発明の脂質ナノ粒子中のアニオン性コレステロール（２）の総量は、核酸の内封効率、細胞内での核酸の放出効率および脂質ナノ粒子の安定性の観点から、イオン性脂質（１）、アニオン性リン脂質またはアニオン性コレステロール（２）、中性リン脂質、およびコレステロールの合計に対して、好ましくは１～２０ｍｏｌ％であり、より好ましくは２．５～１５ｍｏｌ％であり、さらに好ましくは２．５～１０ｍｏｌ％である。
　本発明の脂質ナノ粒子は、コレステロールを含む。本発明の脂質ナノ粒子中のコレステロールの量は、核酸の内封効率、細胞内での核酸の放出効率および脂質ナノ粒子の安定性の観点から、イオン性脂質（１）、アニオン性リン脂質またはアニオン性コレステロール（２）、中性リン脂質、およびコレステロールの合計に対して、好ましくは２０～６０ｍｏｌ％、より好ましくは２５～５０ｍｏｌ％、さらに好ましくは３０～４０ｍｏｌ％である。
ジミリストイルグリセロールＰＥＧ
　本発明の脂質ナノ粒子は、式（３）：
　ＣＨ２（ＯＲ６）－ＣＨ（ＯＲ７）－ＣＨ２（ＯＲ８）　　　（３）
（式（３）中、
　Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のいずれか二つはミリストイル基を表し、残りの一つは数平均分子量１，０００～３，０００のポリエチレングリコール鎖（ＰＥＧ鎖）を介して連結される炭素数１～６のアルキル基を表す。）
で表されるジミリストイルグリセロールＰＥＧ（本明細書中「ジミリストイルグリセロールＰＥＧ（３）」と略称することがある）を含む。
　式（３）中のＰＥＧ鎖の数平均分子量は１，０００～３，０００であり、好ましくは１，５００～２，５００である。このＰＥＧ鎖を形成するために用いられるＰＥＧの数平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定することができる。
　炭素数１～６のアルキル基は、直鎖状であっても分岐状であっても環状であってもよい。該アルキル基の炭素数は、好ましくは１～３である。炭素数１～６のアルキル基としては、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、１，２－ジメチルプロピル基、２－メチルブチル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、２，２－ジメチルブチル基、２，３－ジメチルブチル基、シクロヘキシル基等を挙げることができる。好ましくはメチル基である。
　本発明の脂質ナノ粒子中のジミリストイルグリセロールＰＥＧ（３）の量は、核酸の内封効率、細胞内での核酸の放出効率および脂質ナノ粒子の安定性の観点から、イオン性脂質（１）、アニオン性リン脂質またはアニオン性コレステロール（２）、中性リン脂質、およびコレステロールの合計に対して、好ましくは０．５～１．５ｍｏｌ％、より好ましくは１．０ｍｏｌ％である。
最適組成
　本発明の脂質ナノ粒子におけるイオン性脂質（１）：アニオン性リン脂質またはアニオン性コレステロール（２）：中性リン脂質：コレステロール：ジミリストイルグリセロールＰＥＧ（３）の最適のモル比は、５５：５：５：３５：１．０である。
脂質ナノ粒子の製造方法
　本発明の脂質ナノ粒子は、イオン性脂質（１）、アニオン性リン脂質またはアニオン性コレステロール（２）、コレステロール、およびジミリストイルグリセロールＰＥＧ（３）を含む脂質原料を適当な分散媒（例えば水性分散媒、アルコール性分散媒）中に分散させ、必要に応じて組織化を誘導する操作を行うことにより製造することができる。
　本発明の脂質ナノ粒子を製造するための「組織化を誘導する操作」としては、例えば、マイクロ流路またはボルテックスを用いたアルコール（例えば、エタノール、ｔｅｒｔ－ブタノールなど）希釈法、単純水和法、超音波処理、加熱、ボルテックス、エーテル注入法、フレンチ・プレス法、コール酸法、Ｃａ２＋融合法、凍結－融解法、逆相蒸発法等の自体公知の方法が挙げられ、好ましくはマイクロ流路またはボルテックスを用いたアルコール希釈法であり、さらに好ましくはマイクロ流路を用いたアルコール希釈法である。マイクロ流路を用いたアルコール希釈法では、例えばＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、核酸を含む酸性緩衝液と、脂質のエタノール溶液とを混合することによって脂質ナノ粒子を含む分散液を製造することができる。この方法で製造した分散液は、脂質ナノ粒子と、分散媒（酸性緩衝液およびアルコール）とを含むが、限外ろ過、透析、希釈等の操作によって分散媒（特にアルコール）の除去、分散媒（特に緩衝液）の交換等を行うことができる。
脾臓細胞への核酸送達方法
　本発明は、核酸を内封した本発明の脂質ナノ粒子を対象に投与することを含む、脾臓細胞に核酸を送達する方法も提供する。この方法では、脂質ナノ粒子を、対象に静脈内投与することが好ましい。
　核酸としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡのキメラ核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッド等を挙げることができるが、これらに限定されない。また、核酸は１～３本鎖のいずれも用いることができるが、好ましくは１本鎖または２本鎖である。核酸は、例えば、プリンまたはピリミジン塩基のＮ－グリコシドを有するヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格を有するオリゴマー（例えば、市販のペプチド核酸（ＰＮＡ）等）、または特殊な結合を有するオリゴマー（但し、該オリゴマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置を有するヌクレオチドを含有する）等であってもよい。
　さらに核酸は、例えば、公知の修飾が付加された核酸、該分野で知られた標識のある核酸、キャップの付いた核酸、メチル化された核酸、１個以上の天然ヌクレオチドを類縁物で置換した核酸、ヌクレオチドが修飾された核酸、非荷電結合（例えば、メチルスルホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カーバメート等）を有する核酸、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を有する核酸、例えば蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ－Ｌ－リジン等）や糖（例えば、モノサッカライド等）等の側鎖基を有している核酸、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレン等）を含有する核酸、キレート化合物（例えば、金属、放射活性を有する金属、ホウ素、酸化性の金属等）を含有する核酸、アルキル化剤を含有する核酸、修飾された結合を有する核酸（例えば、αアノマー型の核酸等）等であってもよい。
　本発明において使用できるＤＮＡの種類は特に制限されず、使用の目的に応じて適宜選択することができる。ＤＮＡとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＣｐＧオリゴ等が挙げられ、好ましくはプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡであり、より好ましくはプラスミドＤＮＡである。プラスミドＤＮＡ等の環状ＤＮＡは適宜制限酵素等により消化され、線形ＤＮＡとして用いることもできる。
　本発明において使用できるＲＮＡの種類は特に制限されず、使用の目的に応じて適宜選択することができる。ＲＮＡとしては、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡゲノム、二本鎖ＲＮＡゲノム、ＲＮＡレプリコン、トランスファーＲＮＡ、リボゾーマルＲＮＡ等が挙げられ、好ましくは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡレプリコンである。
　本発明において用いられる核酸は、当業者が通常用いる方法により精製されていることが好ましい。
　本発明において用いられる核酸は、ある所定の疾患に対して予防および／または治療活性を有するもの（予防・治療用核酸）が好ましい。そのような核酸としては、例えば、いわゆる遺伝子治療に用いられる核酸などが挙げられる。
　核酸を内封した脂質ナノ粒子の粒子径は、特に制限は無いが、好ましくは１０ｎｍ～５００ｎｍであり、より好ましくは３０ｎｍ～３００ｎｍである。粒子径の測定は、例えばＺｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ社）などの粒度分布測定装置を用いて行うことができる。核酸を内封した脂質ナノ粒子の粒子径は、その製造方法により、適宜調整することができる。
　脾臓細胞へ核酸を導入するための核酸を内封した脂質ナノ粒子の表面電位（ゼータ電位）は、好ましくは－３０～＋１０ｍＶ、さらに好ましくは－２５～０ｍＶである。従前の遺伝子導入においては、表面がプラスに荷電された粒子が主に用いられてきた。これは、負電荷を有する細胞表面のヘパリン硫酸との静電的相互作用を促進し、細胞への取り込みを促進するための方法としては有用である。しかし、正の表面電位によって、（ａ）細胞内において送達核酸との相互作用によるキャリアからの核酸の放出の抑制、（ｂ）ｍＲＮＡと送達核酸との相互作用によるタンパク質合成の抑制が生じる可能性がある。表面電位（ゼータ電位）を上記の範囲内に調整することにより、この問題を解決し得る。表面電位（ゼータ電位）の測定は、例えばＺｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏなどのゼータ電位測定装置を用いて行うことができる。脂質ナノ粒子の表面電位（ゼータ電位）は、脂質ナノ粒子の構成成分の組成により、調整することができる。
　核酸を内封した本発明の脂質ナノ粒子を生体に投与することにより、当該脂質ナノ粒子が脾臓組織へ到達・接触し、生体内で当該脂質ナノ粒子に内封された核酸が脾臓組織へ送達される。当該脂質ナノ粒子を投与可能な対象としては、特に限定されず、例えば、哺乳類（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウシ等）、鳥類（例えば、ニワトリ、ダチョウ等）、両生類（例えば、カエル等）、魚類（例えば、ゼブラフィッシュ、メダカ等）等の細胞を挙げることができる。該脂質ナノ粒子を導入させる対象は、好ましくはヒトまたは他の哺乳類の細胞である。
　核酸を内封した脂質ナノ粒子の対象への投与方法としては、当該脂質ナノ粒子が脾臓細胞に核酸を送達できれば特に限定はされず、自体公知の投与方法（例えば、経口投与、非経口投与（例えば、経鼻投与、静脈内投与、筋肉内投与、局所投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、スプレー等）等）を適宜選択することができる。投与方法としては、静脈内投与が好ましい。当該脂質ナノ粒子の投与量は、投与対象の種類、投与方法、等を考慮して適宜選択することができる。
　本発明の脂質ナノ粒子は、そのままで、あるいは薬学的に許容される担体と混合して、経口剤（例えば、錠剤、カプセル剤等）あるいは非経口剤（例えば、経鼻剤、注射剤、吸入剤等）として、好ましくは非経口剤（より好ましくは、経鼻剤）として製造することができる。
　薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用されているものが用いられ、例えば、固形製剤においては、賦形剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤等が用いられ、液状製剤においては、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、及び無痛化剤等が用いられる。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を用いることもできる。
　例えば、経鼻剤の場合、点鼻液またはスプレーの形態で使用される。
　以下に本発明の実施例について更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されない。
　以下の実施例等では、イオン性脂質（１）を、上述の表に記載の名称で示した。また、以下の実施例等において使用する略号の意味は、それぞれ以下の通りである。
Ｃｈｏｌ：コレステロール
ＣＨＥＭＳ：コレステリル　ヘミスクシネート
ＰＯＰＣ：１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン
ＤＯＰＣ：１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン
ＤＳＰＣ：１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン
ＳＯＰＣ：１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン
ＤＥＰＣ：１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン
ＰＯＰＥ：１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン
ＤＯＰＥ：１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン
ＤＯＰＧ：１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール
ＤＭＰＧ：１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール
ＤＰＰＧ：１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール
ＤＳＰＧ：１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール
ＰＯＰＧ：１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール
ＳＯＰＧ：１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール
ＤＬｏＰＳ：１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン
ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００：１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロール，メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧの数平均分子量（Ｍｎ）：２０００）
ＭＥＳ：２－モルホリノエタンスルホン酸
ＤｉＲ：１，１’－ジオクタデシル－３，３，３’，３’－テトラメチルインドトリカルボシアニン，ヨウ化物
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
　脂質組成のｍｏｌ％は、イオン性脂質（１）、アニオン性リン脂質またはアニオン性コレステロール（２）、中性リン脂質、およびコレステロールの合計に対するｍｏｌ％を示す。
［製造例１］ｍＲＮＡ封入ＬＮＰの調製
（１）脂質のアルコール溶液の調製
　１０ｍＭのＳＳ－ＯＰ、５ｍＭのリン脂質、５ｍＭのＣＨＥＭＳ、１０ｍＭのＣｈｏｌ、１ｍＭのＤＭＧ－ＰＥＧ２０００となるように各脂質をエタノールで溶解した。これらの溶液から、総ｍоｌ量が１０００ｎｍｏｌとなるように選択した各脂質を任意の比率で混合し、そこへ１ｍＭのＤＭＧ－ＰＥＧ２０００のエタノール溶液を目的の割合となるように添加した。最後に全量が４５０μＬとなるようにエタノールを加えることで脂質のエタノール溶液を調製した。
　脂質のｔｅｒｔ－ブタノール溶液を使用する場合も同様の方法で調製した。
（２）核酸の酸性バッファー溶液の調製
　核酸の酸性バッファー溶液は、０．００６７μｇ／μＬとなるようにルシフェラーゼ遺伝子をコードしたｍＲＮＡ（ｌｕｃ－ｍＲＮＡ）を３０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭの酸性リンゴ酸バッファー（ｐＨ３．０）に混合した。
（３）アルコール希釈法によるＬＮＰの調製
　ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（登録商標）超高速ナノ医薬作製装置（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、核酸の酸性バッファー溶液１２００μＬと脂質のアルコール溶液３００μＬをそれぞれ３ｍＬ／ｍｉｎおよび１ｍＬ／ｍｉｎの流速で混合し、１ｍＬのＬＮＰ溶液を回収した。得られたＬＮＰを３ｍＬの２０ｍＭのＭＥＳバッファー（ｐＨ６．５）で希釈し、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）へ移した。移したＬＮＰ溶液を、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，約１０分）で限外濾過を行って、約５００μＬまで濃縮した。得られた濃縮物を、ＰＢＳを用いて４ｍＬまで希釈し、再度、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，約１０分）で限外濾過を行って約２００μＬまで濃縮した。最後に核酸濃度として１０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳでメスアップした。
［試験例１］各種ｍＲＮＡ封入ＬＮＰの粒子径および表面電位の測定
　製造例１で調製した脂質組成の異なる実施例１から１０までのｍＲＮＡ封入ＬＮＰならびに比較例１および比較例２のｍＲＮＡ封入ＬＮＰについて、粒子径および粒子の表面電位を、動的散乱法（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ；Ｍａｌｖｅｒｎ社）により測定した。結果を表２に示す。いずれのＬＮＰも好ましい粒子径であり、－３ｍＶ～－１５ｍＶの表面電荷を有していた。実施例１１から３２および比較例３および４のＬＮＰは表３に示す組成で作成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
［試験例２］脾臓での遺伝子発現活性評価１（アニオン性リン脂質またはアニオン性コレステロールとの組み合わせ評価）
（１）マウスへのI.V.投与
　製造例１に記載の方法に従い調製したｌｕｃ－ｍＲＮＡ封入ＬＮＰをｍＲＮＡの濃度で５．０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。希釈したｍＲＮＡ封入ＬＮＰを、６週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに１匹あたり２００μＬとなるように静脈内投与した（ｍＲＮＡの投与量として１匹あたり１．０μｇ）。
（２）遺伝子発現活性の測定
　投与から６時間後にマウスから脾臓を採取し、細胞破砕用ビーズを入れたホモジェナイズ用チューブで－８０℃にて凍結保存した。凍結保存したチューブを取り出し、Ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（７７ｍＭ　Ｔｒｉｓ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ　２Ｎａ、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００含有ＭＱ　ｐＨ７．８）を８００μＬ加えた。Ｍｉｃｒｏ　Ｓｍａｓｈ（ＴＯＭＹ）を用いて、－２℃にて４５００ｒｐｍで３０秒間ホモジェナイズを２度繰り返した。上清５００μＬを別のチューブに移し、遠心（４℃、１３０００ｒｐｍ、１０分）し、上清３００μＬを回収した。Ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ２０μＬにメーカープロトコルに従い調製したＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を５０μＬ加え、Ｇｌｏｍａｘ　２０／２０　ルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅを測定し、これをｂａｃｋｇｒоｕｎｄとした。同様に、各サンプル２０μＬにＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを５０μＬ加え、発光を測定した。上清１０μＬをＭＱで１００倍希釈して１ｍＬの希釈液を調製し、希釈液２５μＬを用いてＢＣＡ法にてタンパク質濃度を測定した。Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ／（タンパク濃度×０．０２）で相対発光量（ＲＬＵ）として遺伝子発現活性を算出した。その遺伝子発現活性を比較例１に対する相対値とて図１に示した。結果として、実施例１および実施例２のＬＮＰは肝臓移行用の組成である比較例１のＬＮＰと比較して脾臓において、遺伝子発現活性が高いことを確認した。遺伝子発現活性は標的細胞内への核酸送達効率に依存するため、当該ＬＮＰは脾臓へ効率良く核酸送達できていることを示している。
［試験例３］脾臓での遺伝子発現活性の評価２（ＰＳとの組み合わせ評価）
（１）蛍光標識化ＬＮＰの調製
　製造例１に記載の脂質アルコール溶液に総脂質量に対して０．２ｍｏｌ％となるようにＤｉＲのアルコール溶液を添加した蛍光色素入りの脂質アルコール溶液を調製した。この脂質アルコール溶液を用いて製造例１に記載の手順に従い、ＬＮＰを調製することで、蛍光標識化ＬＮＰを得た。
（２）マウスへのI.V.投与
　製造例１に記載の方法に従い調製したｌｕｃ－ｍＲＮＡ封入ＬＮＰをｍＲＮＡの濃度で５．０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。希釈したｍＲＮＡ封入ＬＮＰを、６週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに１匹あたり２００μＬとなるように静脈内投与した（ｍＲＮＡの投与量として１匹あたり１．０μｇ）。
（３）ＬＮＰの集積性および遺伝子発現活性の評価
　投与５時間５５分後に、ＰＢＳで１５ｍｇ／ｍＬとなるように希釈したルシフェリンをマウスに１匹あたり２００μＬとなるように腹腔内投与した。ルシフェリン投与の５分後（ＬＮＰ投与の６時間後）、マウスを安楽死させ、シャーレ上に取り出した脾臓と肝臓をＩＶＩＳ(ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ)によりイメージングした。画像定量を用いて、ＬＮＰの集積をＤｉＲの蛍光強度により、遺伝子の発現をルシフェリンの発光強度により測定した。図２は、各ＬＮＰの蛍光強度を表す図であり、蛍光標識化したＬＮＰの脾臓での集積量を示している。また図３は脾臓での遺伝子発現活性を表す図であり、核酸送達効率を示している。実施例３のＬＮＰは肝臓移行用組成のＬＮＰである比較例２のＬＮＰと比較して、脾臓におけるＬＮＰの集積性や核酸送達効率が高いことを確認した。
［試験例４］脾臓での遺伝子発現活性評価３（中性リン脂質との組合せ評価）
（１）マウスへのI.V.投与
　製造例１に記載の方法に従い調製したｌｕｃ－ｍＲＮＡ封入ＬＮＰを試験例１と同様の条件でマウスに静脈内投与した（ｍＲＮＡの投与量として１匹あたり１．０μｇ）。
（２）遺伝子発現活性の測定
　試験例２に記載の方法で測定を実施し、比較例１に対する相対値として遺伝子発現活性を算出した。結果として、リン脂質にアニオン性リン脂質であるＤＯＰＧ単体を用いた系やＤＯＰＧと中性リン脂質（１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンまたは１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）とを組み合わせた何れのＬＮＰにおいても肝臓移行用の組成である比較例１のＬＮＰと比較して、脾臓における遺伝子発現活性が高いことを確認した（図４）。
［試験例５］脾臓での遺伝子発現活性評価４（各種脂質組成での評価）
（１）マウスへのI.V.投与
　製造例１に記載の方法に従い調製したｌｕｃ－ｍＲＮＡ封入ＬＮＰを試験例１と同様の条件でマウスに静脈内投与した（ｍＲＮＡの投与量として１匹あたり１．０μｇ）。
（２）遺伝子発現活性の測定
　試験例２に記載の方法で測定を実施し、実施例５に対する相対値として遺伝子発現活性を算出した。いずれの脂質組成のＬＮＰでも脾臓での遺伝子発現が確認された。実施例１１、１８、１９および２１は、実施例５に対して特に高い遺伝子発現活性を示した（図５）。
［試験例６］脾臓での遺伝子発現活性評価５（各種ＰＧを用いた評価）
（１）マウスへのI.V.投与
　製造例１に記載の方法に従い調製したｌｕｃ－ｍＲＮＡ封入ＬＮＰを試験例１と同様の条件でマウスに静脈内投与した（ｍＲＮＡの投与量として１匹あたり１．０μｇ）。
（２）遺伝子発現活性の測定
　試験例２に記載の方法で測定を実施し、実施例１８に対する相対値として遺伝子発現活性を算出した。いずれのＰＧを用いたＬＮＰでも脾臓での遺伝子発現活性が確認された。ＤＯＰＧやＰＯＰＧいた脂質組成のＬＮＰは、特に高い遺伝子発現活性を示した（図６）。
［試験例７］脾臓での遺伝子発現活性評価６（SS-ECを用いた評価）
（１）マウスへのI.V.投与
　製造例１に記載の方法に従い調製したｌｕｃ－ｍＲＮＡ封入ＬＮＰを試験例１と同様の条件でマウスに静脈内投与した（ｍＲＮＡの投与量として１匹あたり１．０μｇ）。
（２）遺伝子発現活性の測定
　試験例２に記載の方法で測定を実施し、比較例３に対する相対値として遺伝子発現活性を算出した。肝臓送達用の組成のＬＮＰである比較例３に対して、実施例３０のＬＮＰは脾臓での高い遺伝子発現活性を示した（図７）。
［試験例８］ＬＮＰを用いたＣＴＬ活性の評価
（１）マウスへのI.V.投与
　製造例１に記載の方法に従い調製したオボアルブミン遺伝子（以下、ＯＶＡと称する）をコードしたｍＲＮＡ（以下、ＯＶＡ－ｍＲＮＡと称する）を封入したＬＮＰをｍＲＮＡの濃度で５．０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。希釈したｍＲＮＡ封入ＬＮＰを、６週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに１匹あたり２００μＬとなるように静脈内投与した（ｍＲＮＡの投与量として１匹あたり１．０μｇ）。
（２）ＣＴＬ活性の評価
　投与から一週間後に、次に記すＣＴＬアッセイを行いＯＶＡ特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性を評価した。脾細胞の培養培地として次の組成：ＲＰＭＩ１６４０　５００ｍＬ，ＦＢＳ　５０ｍＬ，１００ｍＭピルビン酸ナトリウム　５ｍＬ，１Ｍ　ＨＥＰＥＳ　５ｍＬ，５５ｍＭ　２－メルカプトエタノール　５００μＬ，ペニシリン／ストレプトマイシン　５ｍＬ（以下、培地と称する）を用いた。未処置マウスを頸椎脱臼で安楽死させ、脾臓を採取した。脾臓を中央から切断し、ピンセットを用いて切断面から脾臓細胞をとりだし培地中に懸濁した。細胞懸濁培地を、４０μｍセルストレイナーを通して５０ｍＬチューブに回収し遠心した（４℃、５００ｇ、５分）。上清を捨て、Ｒｅｄ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅｌｌ　Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＩＧＭＡ）を一匹分あたり１ｍＬ加え５分静置した。培地で５倍に希釈した後、遠心した（４℃、５００ｇ、５分）。さらに１０ｍＬの培地に懸濁し遠心した（４℃、５００ｇ、５分）。３０ｍＬの培地へ懸濁し細胞数を計測した。その後、４０μｍセルストレイナーを通して２本の５０ｍＬチューブに等量分割し、遠心した（４℃、５００ｇ、５分）。１．０×１０７細胞／ｍＬとなるように培地で懸濁した。（１）片方の細胞懸濁液には細胞懸濁液の１／４００量の２ｍＭ　ＯＶＡエピトープ（ＯＶＡの２５７－２６４位のアミノ酸配列からなる）溶液を加え培養インキュベータ内で１時間静置した。このエピトープパルス群を遠心した（４℃、５００ｇ、５分）。１０ｍＬの培地で洗浄した後、１０ｍＬのＰＢＳで洗浄し、再度細胞数を計測してから３．０×１０７細胞／ｍＬとなるよう懸濁し、終濃度５μＭのＣＦＳＥで染色することで『ターゲット細胞』を得た。（２）もう片方の細胞懸濁液はエピトープを加えずインキュベーションし、培地およびＰＢＳで洗浄した。３．０×１０７細胞／ｍＬとなるよう懸濁し、終濃度０．５μＭのＣＦＳＥで染色することで『コントロール細胞』を得た。ターゲット細胞、コントロール細胞をともに培地で２回、ＰＢＳで二回洗浄し、５．０×１０７細胞／ｍＬとなるように懸濁した。１００μＬの『ターゲット細胞』と１００μＬの『コントロール細胞』とを混合し、免疫したマウスへ投与した。両者はＣＦＳＥの蛍光の強さから区別することができる。細胞混合液の投与から２０時間後、マウスから脾臓を採取しフローサイトメトリー解析を行った。『ターゲット細胞』の存在量を『コントロール細胞』により補正することで、エピトープに特異的なＣＴＬ活性を定量した。
　評価結果を図８および９に示した。実施例１８および実施例２４の組成のＬＮＰは、肝臓送達用の組成のＬＮＰである比較例１の組成のＬＮＰに対して３倍程度のＣＴＬ活性を示した。また、実施例３０の組成のＬＮＰは、肝臓送達用の組成のＬＮＰである比較例３や脾臓送達用の組成のＬＮＰである比較例４のＬＮＰよりも高いＣＴＬ活性を示した。ＣＴＬ活性は獲得免疫が得られるかを評価するための指標であり、ＣＴＬ活性が高い程、獲得免疫を得られることを表している。そのため、実施例１８、２４および３０のＬＮＰは比較例よりも獲得免疫を高められることが示された。
［試験例９］ＬＮＰを用いたＣＴＬ活性の評価２
（１）マウスへのI.V.投与
　製造例１に記載の方法に従い調製したＯＶＡ－ｍＲＮＡ封入ＬＮＰをｍＲＮＡの濃度で１．０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。希釈したｍＲＮＡ封入ＬＮＰを、６週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに１匹あたり２００μＬとなるように静脈内投与した（ｍＲＮＡの投与量として１匹あたり０．２μｇ）。
（２）ＣＴＬ活性の評価
　［試験例８］に記載の方法でＣＴＬ活性を評価した。結果を図１０に示す。
　実施例３１の組成のＬＮＰは比較例４に対して高いＣＴＬ活性を示した。
［試験例１０］マウスでの多発性硬化症治療効果の評価
（１）モデルマウスの作成
　１０週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを１週間予備飼育し、飼育環境に馴化させた。多発性硬化症モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（以下、ＥＡＥと称する）を誘導するキット製品（Ｈｏｏｋｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のメーカープロトコルに従い、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（以下、ＭＯＧと称する）の自己抗原ペプチド（ＭＯＧの３５－５５位のアミノ酸配列からなる）と完全フロイントアジュバントの混合エマルションをマウスの頸部および腰部に１００μＬずつ皮下投与した。キット製品に含まれる百日咳毒素ストックを１６５ｎｇ／１００μＬとなるようにＰＢＳで希釈した。希釈した百日咳毒素を、混合エマルションの投与当日と翌日の２回、１匹あたり１００μＬずつ腹腔内投与した。
（２）マウスへのI.V.投与
　製造例１に記載の方法に従い調製したｌｕｃ－ｍＲＮＡ封入ＬＮＰまたはＭＯＧペプチド（ＭＯＧの２７－６３位のアミノ酸配列からなる）をコードしたｍＲＮＡ（以下、ＭＯＧ－ｍＲＮＡと称する）を封入したＬＮＰを、ｍＲＮＡの濃度で１．０μｇ／２００μＬとなるようにＰＢＳで希釈した。希釈したｍＲＮＡ封入ＬＮＰを、ＥＡＥマウスに対してＥＡＥ誘導日から７日目、１０日目、１３日目の３回、１匹あたり２００μＬずつ静脈内投与した。
（３）多発性硬化症治療効果の評価
　ＥＡＥ誘導日から１０日目以降、マウスの病態スコアと体重を毎日測定した。病態スコアは以下の基準で決定した。０：無症状、１：尾を根元から持ち上げたときに垂れ下がる、２：片後肢の麻痺・歩行異常、３：両後肢の麻痺、３．５：スコア３かつ明らかな運動量低下、４：前肢の麻痺、５：瀕死・死亡。スコアの測定にバイアスが生じるのを避けるため、ＬＮＰの投与とスコアの測定を別の実験者が実施し、盲検下にてスコアを測定した。
　評価結果を図１１および図１２に示した。ＭＯＧ－ｍＲＮＡを封入した実施例３２のＬＮＰはＥＡＥ症状の軽減が確認された。またｌｕｃ－ｍＲＮＡを封入した実施例３２のＬＮＰにおいてもＥＡＥ症状が軽減しており、実施例３２のＬＮＰ自体がＥＡＥ症状の軽減に寄与していることが示唆された。
　本発明の脂質ナノ粒子は、核酸を脾臓細胞に送達するために有用である。
　本出願は、日本で出願された特願２０２２－０５１９１８を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。

Claims (13)

  1. 　（Ａ）式（１）：
    （式（１）中、
    　Ｒ１ａおよびＲ１ｂはそれぞれ独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、
    　ＸａおよびＸｂはそれぞれ独立して、炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基、または炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基を表し、
    　Ｒ２ａおよびＲ２ｂはそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基またはオキシジアルキレン基を表し、
    　ＹａおよびＹｂはそれぞれ独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合またはウレア結合を表し、
    　ＺａおよびＺｂはそれぞれ独立して、炭素数が３～１６であり、少なくとも一つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を表し、
    　ｎａおよびｎｂはそれぞれ独立して、０または１であり、
    　Ｒ３ａおよびＲ３ｂはそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、水酸基を有するステロール誘導体とコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、炭素数１～４０の脂肪族炭化水素基、シクロプロパン環を有する炭素数３～４０のアルキル基、または式（４）：
    　　Ｒ９－Ｏ－ＣＯ－（ＣＨ２）ａ－　　　（４）
    　（式（４）中、
    　　Ｒ９は炭素数２～２０の脂肪族炭化水素基を表し、
    　　ａは２～１０の整数を表す。）
    で表される基を表す。）
    で表されるイオン性脂質、
    （Ｂ）アニオン性リン脂質または式（２）：
    （式（２）中、
    　Ｔは炭素数１～８の２価の脂肪族炭化水素基を表す。）
    で表される化合物、
    （Ｃ）コレステロール、および
    （Ｄ）式（３）：
    　ＣＨ２（ＯＲ６）－ＣＨ（ＯＲ７）－ＣＨ２（ＯＲ８）　　　（３）
    （式（３）中、
    　Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のいずれか二つはミリストイル基を表し、残りの一つは数平均分子量１，０００～３，０００のポリエチレングリコール鎖を介して連結される炭素数１～６のアルキル基を表す。）
    で表されるジミリストイルグリセロールＰＥＧ
    を含む核酸を脾臓組織へ送達するために用いられる脂質ナノ粒子。
  2. 　前記アニオン性リン脂質が１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロールまたは１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリンである請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
  3. 　前記アニオン性リン脂質が１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＤＭＰＧ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＤＰＰＧ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＰＯＰＧ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＤＯＰＧ）、１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＳＯＰＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＤＳＰＧ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＰＰＳ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＰＯＰＳ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＯＰＳ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＬｏＰＳ）、１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＳＯＰＳ）、および１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＳＰＳ）からなる群から選ばれる少なくとも一つである請求項１または２に記載の脂質ナノ粒子。
  4. 　前記アニオン性リン脂質が１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＰＯＰＧ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＤＯＰＧ）、または１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＬｏＰＳ）である請求項１～３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  5. 　式（２）中のＴが炭素数１～３の２価の脂肪族炭化水素基である請求項１～４のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  6. 　式（１）で表されるイオン性脂質が、下記式：
    または
    で表されるいずれかのイオン性脂質である請求項１～５のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  7. 　前記脂質ナノ粒子の成分として中性リン脂質が含まれていてもよい請求項１～６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  8. 　前記中性リン脂質が１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンまたは１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンである請求項７に記載の脂質ナノ粒子。
  9. 　前記中性リン脂質が１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＳＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、および１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）からなる群から選ばれる少なくとも一つである請求項７または８に記載の脂質ナノ粒子。
  10. 　前記アニオン性リン脂質または前記式（２）で表される化合物と前記中性リン脂質との比率が１００：０～２５：７５ｍｏｌ％である請求項７～９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  11. 　前記イオン性脂質、前記アニオン性リン脂質または前記式（２）で表される化合物、前記中性リン脂質、および前記コレステロールの合計に対して、前記イオン性脂質が３０～７０ｍｏｌ％であり、前記アニオン性リン脂質または前記式（２）で表される化合物が２．５～１５ｍｏｌ％であり、前記中性リン脂質が０～１５ｍｏｌ％であり、前記コレステロールが２０～６０ｍｏｌ％であり、ジミリストイルグリセロールＰＥＧが０．５～１．５ｍｏｌ％である請求項７～１０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  12. 　核酸を封入した請求項１～１１のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子を生体に静脈内投与することを含む、脾臓組織へ核酸を送達する方法。
  13. 　（Ａ）式（１）：
    （式（１）中、
    　Ｒ１ａおよびＲ１ｂはそれぞれ独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、
    　ＸａおよびＸｂはそれぞれ独立して、炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基、または炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基を表し、
    　Ｒ２ａおよびＲ２ｂはそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基またはオキシジアルキレン基を表し、
    　ＹａおよびＹｂはそれぞれ独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合またはウレア結合を表し、
    　ＺａおよびＺｂはそれぞれ独立して、炭素数が３～１６であり、少なくとも一つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を表し、
    　ｎａおよびｎｂはそれぞれ独立して、０または１であり、
    　Ｒ３ａおよびＲ３ｂはそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、水酸基を有するステロール誘導体とコハク酸無水物またはグルタル酸無水物との反応物由来の残基、炭素数１～４０の脂肪族炭化水素基、シクロプロパン環を有する炭素数３～４０のアルキル基、または式（４）：
    　　Ｒ９－Ｏ－ＣＯ－（ＣＨ２）ａ－　　　（４）
    　（式（４）中、
    　　Ｒ９は炭素数２～２０の脂肪族炭化水素基を表し、
    　　ａは２～１０の整数を表す。）
    で表される基を表す。）
    で表されるイオン性脂質、
    （Ｂ）アニオン性リン脂質または式（２）：
    （式（２）中、
    　Ｔは炭素数１～８の２価の脂肪族炭化水素基を表す。）
    で表される化合物、
    （Ｃ）コレステロール、および
    （Ｄ）式（３）：
    　ＣＨ２（ＯＲ６）－ＣＨ（ＯＲ７）－ＣＨ２（ＯＲ８）　　　（３）
    （式（３）中、
    　Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のいずれか二つはミリストイル基を表し、残りの一つは数平均分子量１，０００～３，０００のポリエチレングリコール鎖を介して連結される炭素数１～６のアルキル基を表す。）
    で表されるジミリストイルグリセロールＰＥＧ
    を含む脂質ナノ粒子の、核酸を脾臓組織へ送達するために用いられる医薬を製造するための使用。
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