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WO2023174029A1 - 一种prlr抗原结合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

一种prlr抗原结合蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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WO2023174029A1
WO2023174029A1 PCT/CN2023/077847 CN2023077847W WO2023174029A1 WO 2023174029 A1 WO2023174029 A1 WO 2023174029A1 CN 2023077847 W CN2023077847 W CN 2023077847W WO 2023174029 A1 WO2023174029 A1 WO 2023174029A1
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WO
WIPO (PCT)
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antigen
prlr
binding protein
amino acid
antibody
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PCT/CN2023/077847
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English (en)
French (fr)
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娄竞
刘颖
刘芝兰
陈葆峰
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SHENYANG SUNSHINE PHARMACEUTICAL CO Ltd
Original Assignee
SHENYANG SUNSHINE PHARMACEUTICAL CO Ltd
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • PRL combines with its receptor to form a trimer, resulting in the activation of PRL-R, which is a necessary condition and prerequisite for various biological effects.
  • PRL-R After activation of PRL-R, it can phosphorylate JAK2 and induce distal tyrosine in the receptor cell. Phosphorylation activates STAT protein, and the activated STAT moves into the nucleus to activate target gene transcription and produce biological effects.
  • PRL after PRL binds to its receptor, it can activate the PI3K and MAPK signaling pathways, increase the expression of cyclin D1, and promote the growth of breast cancer cells.
  • PRLR is highly expressed on a variety of endocrine-related tumor cells, including breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, etc. It is related to the occurrence and development of these tumors.
  • the increase in the concentration of its ligand prolactin (PRL) in the circulation is a high-risk factor for the occurrence of breast cancer, and in breast cancer patients, it is a negative correlation indicator for judging prognosis.
  • PRLR ligand prolactin
  • Recent studies have shown that activation of PRLR is associated with hair loss, and elevated prolactin concentrations in the circulation are closely related to hair loss. Therefore, PRLR, as a target for drug development, can effectively inhibit the activation of PRLR and can treat a variety of related diseases.
  • the present invention provides a new PRLR antigen-binding protein and its preparation method and application.
  • the present invention uses hybridoma technology to obtain a series of new PRLR antigen-binding proteins with biological functions.
  • the PRLR antigen-binding proteins have good affinity and binding activity to human PRLR-ECD and inhibit the activation of PRLR.
  • the PRLR antigen-binding protein of the present invention can be used to treat various PRLR-related diseases including tumors and alopecia, and provides a new idea for the treatment of PRLR-related diseases.
  • the PRLR antigen-binding protein contains the following complementarity determining regions:
  • Heavy chain complementarity determining region 3 HCDR3 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 or its variant sequence;
  • the variant sequence is a CDR sequence with one or several amino acid substitutions, deletions or additions compared to the CDR from which it is derived; the substitutions are conservative substitutions.
  • Or (2) compared with the VH in (1), it has at least 70%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95% , a VH that has at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99% sequence identity; and/or has at least 70%, at least 80%, at least 85%, at least A VL that has a sequence identity of 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%;
  • PRLR antigen-binding proteins include full-length antibodies, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, di-scFv, bispecific antibodies, multispecific antibodies, heavy chain antibodies and/or Single domain antibodies, or monoclonal antibodies and/or polyclonal antibodies prepared from the above antibodies.
  • the heavy chain has at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92% compared to the heavy chain and light chain in (1) , at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% sequence identity; and/or, the light chain has at least 70%, at least 80%, At least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% sequence identity.
  • the nucleic acid molecules comprise one or more codon-optimized nucleic acid molecules.
  • the detectable labeling molecule is an enzyme (such as horseradish peroxidase), a radionuclide, a fluorescent dye, a luminescent substance (such as a chemiluminescent substance) or biotin.
  • an enzyme such as horseradish peroxidase
  • a radionuclide such as a radionuclide
  • a fluorescent dye such as a fluorescent dye
  • a luminescent substance such as a chemiluminescent substance
  • the present invention provides a multispecific antibody comprising the above-mentioned PRLR antigen-binding protein or humanized PRLR antigen-binding protein, and additional antibodies or fragments thereof or antibody analogs.
  • the pharmaceutically acceptable carrier includes, but is not limited to: diluents, excipients, fillers, wetting agents, disintegrating agents, flavoring agents and binders.
  • the present invention provides a PRLR detection method that utilizes the above-mentioned PRLR antigen-binding protein or humanized PRLR antigen-binding protein for qualitative or quantitative analysis to detect PRLR.
  • the detection method is used for non-disease diagnosis or treatment purposes.
  • Figure 3 shows the detection results of mouse monoclonal antibody SPGA02-260 inhibiting PRL signaling (STAT5 phosphorylation).
  • Figure 4 shows the detection results of mouse monoclonal antibody SPGA02-260 inhibiting PRL signaling (phosphorylation of ERK1/2).
  • Figure 7 is a graph showing the affinity detection results of T47D cells of chimeric antibody SPGA02-ch260 binding to highly expressed human PRLR.
  • Figure 16 shows the results of humanized monoclonal antibody SPGA02-hu260 inhibiting the growth of BAF3-huPRLR cells.
  • variable region The sequence of approximately 110 amino acids near the N-terminus of the antibody heavy chain and light chain varies greatly and is the variable region (Fv region); the remaining amino acid sequences near the C-terminus are relatively stable and are the constant region.
  • the variable region includes 3 hypervariable regions (HVR) and 4 framework regions (FR) with relatively conserved sequences. Three hypervariable regions determine the specificity of the antibody, also known as complementarity-determining regions (CDRs).
  • Each light chain variable region (VL or LCVR) and heavy chain variable region (VH or HCVR) consists of 3 CDR regions and 4 FR regions.
  • the order from the amino terminus to the carboxyl terminus is: FR1, CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
  • the three CDR regions of the light chain refer to LCDR1, LCDR2 and LCDR3, and the three CDR regions of the heavy chain refer to HCDR1, HCDR2 and HCDR3.
  • transgenic animals that are capable of producing no endogenous immunoglobulins upon immunization and are capable of producing a complete human antibody repertoire can also be utilized (see, e.g., Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci.
  • conservative substitution refers to an amino acid substitution that does not adversely affect or alter the expected properties of the protein/polypeptide comprising the amino acid sequence.
  • conservative substitutions can be introduced by standard techniques known in the art, such as site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis.
  • Conservative amino acid substitutions include those in which an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain, e.g., one that is physically or functionally similar to the corresponding amino acid residue (e.g., has similar size, shape, charge, chemical properties, including ability to form covalent bonds or hydrogen bonds, etc.). Families of amino acid residues with similar side chains have been defined in the art.
  • Stabilizers have the meaning commonly understood by those skilled in the art, which can stabilize the desired activity of active ingredients in medicines, including but not limited to sodium glutamate, gelatin, SPGA, sugars (such as sorbitol, mannitol, Starch, sucrose, lactose, dextran, or glucose), amino acids (such as glutamic acid, glycine), proteins (such as dry whey, albumin or casein) or their degradation products (such as lactalbumin hydrolyzate), etc.
  • sugars such as sorbitol, mannitol, Starch, sucrose, lactose, dextran, or glucose
  • amino acids such as glutamic acid, glycine
  • proteins such as dry whey, albumin or casein
  • degradation products such as lactalbumin hydrolyzate
  • subject refers to a mammal, such as a primate mammal, such as a non-human primate mammal, or a human.
  • the subject eg, human
  • the tumors include but are not limited to: breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, lung cancer, skin cancer, pancreatic cancer, kidney cancer, stomach cancer, etc.
  • CDR Complementarity determining region in an immunoglobulin variable region.
  • HC Antibody heavy chain.
  • Light chain complementarity determining region 1 LCDR1 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 or a variant sequence thereof;
  • the antigen-binding proteins provided by the present invention as described in the above section include antibodies or antigen-binding fragments that can be derivatized (eg, linked to another molecule, such as another polypeptide or protein).
  • derivatization eg, labeling
  • the antibodies or antigen-binding fragments thereof of the invention are also intended to include such derivatized forms.
  • the linker may comprise one or more linker components, and a variety of linker components are known in the art, for example, maleimidocaproyl (MC), maleimidopropionyl (MP), Valine-citrulline (val-cit or vc, valine-citrulline), paminobenzyloxycarbonyl (PAB, paminobenzyloxycarbonyl).
  • linker components for example, maleimidocaproyl (MC), maleimidopropionyl (MP), Valine-citrulline (val-cit or vc, valine-citrulline), paminobenzyloxycarbonyl (PAB, paminobenzyloxycarbonyl).
  • the invention provides a method for preparing an antibody of the invention or an antigen-binding fragment thereof, comprising culturing a host cell of the invention under conditions that allow expression of the antibody or antigen-binding fragment thereof, and The antibody or antigen-binding fragment thereof is recovered from the cultured host cell culture.
  • the invention provides a kit comprising an antigen-binding protein of the invention.
  • the antigen-binding proteins of the invention are detectably labeled.
  • the kit further includes a second antibody that specifically recognizes the antibody of the present invention or its antigen-binding fragment.
  • the second antibody further includes a detectable label.
  • the supernatant was harvested, and hybridomas with positive human PRLR-ECD binding activity were screened by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Wells, the human PRLR-ECD binding positive hybridoma wells were subjected to the first and second rounds of subcloning through the limiting dilution method to obtain the target hybridoma cell line, named SPGA02-260.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • This example uses Western blot method to determine the effect of antibody SPGA02-260 on the downstream transcription activator family STAT5 and ERK1/2 signaling pathways of human breast cancer cells T47D after PRL stimulation.
  • ⁇ -actin After performing SDS-PAGE electrophoresis (100 ⁇ g/lane) on the above cell lysate, transfer to PVDF membrane by electrotransfer method, block in 1% BSA-TBST (shake at room temperature for 1 hour), add 1 ⁇ g/mL (1% BSA-TBST dilution) mouse anti-human ⁇ -actin monoclonal antibody (purchased from Thermo Company, Cat#MA1-140), incubated with shaking at room temperature for 2 hours, washed 3 times with TBST, and added HRP-labeled goat anti-mouse IgG Secondary antibody (purchased from Beijing Boaolong Immunology Technology Co., Ltd., Cat#BF03001, diluted 10000 times with 1% BSA-TBST according to the instructions), incubated with shaking at room temperature for 1 hour, washed 3 times with TBST, and dropped an appropriate amount of Pierce on the PVDF membrane.
  • TM ECL Western blotting substrate solution purchased from Therm
  • the heavy chain variable region and light chain variable region of SPGA02-260 were obtained through molecular biology related methods, and the chimeric antibody SPGA02-ch260 was further constructed.
  • RNA of SPGA02-260 hybridoma cells was extracted by Trizol and reverse transcription of the mRNA was performed to obtain cDNA. Then, using the cDNA as a template, the heavy chain and light chain degenerate primers of the mouse antibody were used ("Antibody Engineering” Volume 1, Edited by Roland Kontermann and Stefan Dübel (the sequence of the combined primers is from page 323) performed PCR, sequenced the obtained PCR product (about 700 bp) and analyzed it through the kabat database to determine that the obtained sequence was the variable region of the mouse antibody. sequence.
  • the full length of the SPGA02-260 heavy chain variable region gene sequence is 360bp, encoding 120 amino acid residues.
  • the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2, and the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 3; the light chain variable region
  • the full length of the gene sequence is 321bp, encoding 107 amino acid residues.
  • the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4, and the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 5.
  • the affinity of chimeric antibody SPGA02-ch260 to human PRLR-ECD was determined by ELISA.
  • the amino acid sequences of the SPGA02-260 heavy chain complementarity determining region are HCDR1: TVSGFSLTRNGV (SEQ ID NO: 12), HCDR2: IWGDGST (SEQ ID NO: 13), HCDR3: AKEGLYYYGRYFDV (SEQ ID NO: 14), and the light chain complementarity determining region
  • the amino acid sequences are LCDR1: KASQDVGSAV (SEQ ID NO: 15), LCDR2: WASTRHT (SEQ ID NO: 16) and LCDR3: QQYSNYPLT (SEQ ID NO: 17).
  • the heavy chain and light chain of the humanized antibody were constructed into the pcDNA3.4 expression vector respectively, transfected into Expi-293F cells, and the humanized antibody SPGA02-hu260 was obtained through ProteinA purification, and each was determined by SDS-PAGE electrophoresis and SEC-HPLC. The antibody molecular weight is correct and the purity is >95%. SPGA02-260.
  • T47D STAT5 is significantly phosphorylated under the action of PRL; the antibody SPGA02-hu260 can completely inhibit the phosphorylation of STAT5 caused by T47D cells stimulated by PRL at concentrations of 1 ⁇ g/mL and 0.5 ⁇ g/mL, while at 0.25 ⁇ g/mL At mL concentration, it partially inhibits the phosphorylation of STAT5 caused by PRL.
  • Example 15 Humanized antibody SPGA02-hu260 inhibits signaling caused by the binding of PRLR to GH
  • the experimental method was basically the same as in Example 5, except that 1 ⁇ g/mL human growth hormone (GH1, SinoBiological Company, Cat#16122-HNCE) was used instead of human PRL as a stimulant to induce PRLR signal transduction.
  • GH1 Human growth hormone
  • SinoBiological Company Cat#16122-HNCE

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Abstract

提供一种PRLR抗原结合蛋白及其制备方法和应用。通过杂交瘤技术得到了对人PRLR-ECD具有较好的亲和力及结合活性的PRLR抗原结合蛋白，能够有效抑制PRLR的激活。所述的PRLR抗原结合蛋白可用于治疗包括肿瘤和脱发在内的多种PRLR阳性疾病。

Description

一种PRLR抗原结合蛋白及其制备方法和应用 技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种PRLR抗原结合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
催乳素(prolactin，PRL)又称促乳素或生乳素，是繁殖成功所必需的垂体前叶肽类激素。催乳素受体(prolactin receptor，PRLR)与生长激素受体(growth hormone receptor，GHR)、胎盘催乳素受体(placental lactogen receptor，PLR)构成一个基因家族。PRLR是一种细胞膜受体，表达于乳腺、卵巢、垂体、心脏、肺、胸腺、脾脏、肝脏、胰腺、肾脏、肾上腺、子宫、骨骼肌、皮肤和中枢神经系统。PRLR与多种生理功能相关，包括细胞增殖，分化，泌乳和生殖等。
已知哺乳动物中PRL至少有2种形式的受体存在，即长型受体(long form)和短型受体(short form)。PRLR结构具有多样性，主要由胞内域的变异造成。PRLR为仅含有1个跨膜区域的跨膜蛋白，由膜外域、跨膜域和胞内域3部分组成，具有细胞因子受体超家族的结构特征，其中PRLR由两个domain构成，分别是：Fibronectin type-III 1和Fibronectin type-III 2。哺乳动物和禽类PRLR结构的不同之处在于哺乳动物只有1个胞外配体结合区，而禽类则具有2个重复单位的配体结合区。人PRLR基因的基因组结构已经清楚(Hu,Z.-Z.等，J.Clin.Endocr.Metab.84:1153-1156,1999)。PRLR基因的5-引导-非翻译区包含两种第一外显子：E13，大鼠和小鼠E13的人对应物，和一种新的人型第一外显子，被称为E1N。5-引导-非翻译区还包含一个通用的非编码外显子2和外显子3的一部分，后者包含翻译起始密码子。E13和ElN外显子在800个碱基对以内。这两个外显子在人乳腺组织、乳腺癌细胞、生殖腺和肝脏中有表达。总之，包含E13的转录子表达于大多数组织中。PRLR基因产物由外显子3-10编码，其中外显子10编码胞内区的大部分。E13和ElN外显子分别从启动子PIII和PN二者之一开始转录。PIII启动子包含Spl和C/EBP元件，这些元件与啮齿类动物启动子中的元件一致，与大鼠和小鼠的该基因的-480/-106区有81％的同源性。PN启动子包含推测的ETS家族蛋白的结合位点和核受体的半位点。
PRL与其受体结合形成三聚体导致PRL-R被激活，是产生各种生物作用的必要条件和前提，PRL-R激活后，能够使JAK2磷酸化，诱导受体细胞内远侧酪氨酸磷酸化，激活STAT蛋白，激活后的STAT移入细胞核内，激活靶基因转录，产生生物学效应，这是作为神经、内分泌和免疫网络中介体的PRL调节免疫功能的基本模式。此外，PRL与其受体结合后，能够活化PI3K和MAPK信号通路，增加细胞周期素D1的表达，促进乳腺癌细胞生长。
PRLR在多种内分泌相关的肿瘤细胞上高表达，包括乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌等。其与这些肿瘤的发生和发展相关，其配体泌乳素(PRL)在循环中浓度的升高是乳腺癌发生的高危因素，而且在乳腺癌患者，是判断预后的一个负相关指标。最近的研究表明，PRLR的激活与脱发相关，循环中泌乳素浓度升高，与脱发密切相关。因此，PRLR作为一个药物开发的靶点，有效抑制PRLR的激活，可以治疗多种相关的疾病。专利CN200780030284.7公开了一种PRLR特异性抗体和包含这种抗体的药物组合物、包含药物组合物的试剂盒及预防和治疗癌症的方法。专利CN201480055822.8也公开了一种结合到催乳素受体PRLR的抗体和其使用方法，所述的抗体以高亲和力结合人类PRLR，并阻断催乳素介导的细胞信号传导，可用于治疗各种癌症以及其他PRLR相关病症。
但现有技术中针对PRLR的抗体较少，因此，亟需提供一种新的高亲和力的PRLR特异性抗体，可以与PRLR结合并抑制PRLR的激活，从而用于治疗包括肿瘤和脱发在内的多种PRLR相关的疾病。
发明内容
针对上述不足，本发明提供了一种新的PRLR抗原结合蛋白及其制备方法和应用。本发明采用杂交瘤技术，得到了一系列新的具有生物学功能的PRLR抗原结合蛋白，所述的PRLR抗原结合蛋白对人PRLR-ECD具有较好的亲和力及结合活性，并抑制PRLR的激活。本发明所述的PRLR抗原结合蛋白可用于治疗包括肿瘤和脱发在内的多种PRLR相关的疾病，为PRLR相关疾病的治疗提供了一种新的思路。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种PRLR抗原结合蛋白。
具体地，所述的PRLR抗原结合蛋白包含以下互补决定区：
(1)包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或其变体序列的重链互补决定区1 HCDR1；
(2)包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或其变体序列的重链互补决定区2 HCDR2；
(3)包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或其变体序列的重链互补决定区3 HCDR3；
(4)包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或其变体序列的轻链互补决定区1 LCDR1；
(5)包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或其变体序列的轻链互补决定区2 LCDR2；
(6)包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或其变体序列的轻链互补决定区3 LCDR3；
优选地，所述变体序列为与其来源的CDR相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的CDR序列；所述的置换为保守置换。
进一步具体地，所述的PRLR抗原结合蛋白包含：
(1)、包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的重链可变区VH；和/或包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的轻链可变区VL；
或者(2)、与(1)中的VH相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VH；和/或，与(1)中的VL相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VL；
或者(3)、与(1)中的VH相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合的VH；和/或，与(1)中的VL相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合的VL；所述的置换是保守置换。
进一步具体地，所述的PRLR抗原结合蛋白还包含人的IgG1恒定区和人的kappa链恒定区，所述的人的IgG1恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述的人的kappa链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
进一步具体地，所述的PRLR抗原结合蛋白的VH与人的IgG1恒定区连接形成重链，所述的PRLR抗原结合蛋白的VL与人的kappa链恒定区连接形成轻链。
进一步具体地，所述的PRLR抗原结合蛋白包含：
(1)包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的重链HC；和/或包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的轻链LC；
或者(2)重链和轻链，其中，与(1)中的重链和轻链相比，所述重链具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；和/或，所述轻链具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
进一步具体地，上述PRLR抗原结合蛋白包括嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。
进一步具体地，上述PRLR抗原结合蛋白包括全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、di-scFv、双特异性抗体、多特异性抗体、重链抗体和/或单域抗体，或由上述抗体制得的单克隆抗体和/或多克隆抗体。
另一方面，本发明提供了一种人源化PRLR抗原结合蛋白，所述的人源化PRLR抗原结合蛋白包含：
(1)、包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的重链可变区VH；和/或包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的轻链可变区VL；
或者(2)、与(1)中的VH相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VH；和/或，与(1)中的VL相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VL；
或者(3)、与(1)中的VH相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合的VH；和/或，与(1)中的VL相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合的VL；所述的置换是保守置换。
具体地，所述的人源化PRLR抗原结合蛋白包含：
(1)包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的重链HC；和/或包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列的轻链LC；
或者(2)重链和轻链，其中，与(1)中的重链和轻链相比，所述重链具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；和/或，所述轻链具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
又一方面，本发明提供了一系列编码所述PRLR抗原结合蛋白或人源化PRLR抗原结合蛋白的核酸分子。
具体地，所述的核酸分子包含一种或多种经密码子优化的核酸分子。
又一方面，本发明提供了一系列载体，所述的载体包含本申请所述的一个或多个核酸分子。
具体地，所述的载体包括但不限于质粒、病毒、噬菌体。
又一方面，本发明提供了一系列包含上述核酸分子或上述载体的宿主细胞。
具体地，所述的宿主细胞包括但不限于微生物、植物或动物细胞，可通过本领域技术人员已知的方法将本发明所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等方法。
又一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述的嵌合抗原受体包含上述PRLR抗原结合蛋白或人源化PRLR抗原结合蛋白。
又一方面，本发明提供了一种免疫细胞，所述的免疫细胞包含上述嵌合抗原受体。
又一方面，本发明提供了一种抗原结合蛋白衍生物，所述的抗原结合蛋白衍生物包含上述PRLR抗原结合蛋白或人源化PRLR抗原结合蛋白和可检测的标记分子。
具体地，所述的可检测的标记分子为酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。
又一方面，本发明提供了一种多特异性抗体，所述的多特异性抗体包含上述PRLR抗原结合蛋白或人源化PRLR抗原结合蛋白，和另外的抗体或其片段或抗体类似物。
具体地，所述多特异性抗体是双特异性抗体或三特异性抗体或四特异性抗体。
又一方面，本发明提供了一种抗体药物偶联物，所述的抗体药物偶联物包括抗体部分和偶联部分，所述抗体部分包含上述PRLR抗原结合蛋白或人源化PRLR抗原结合蛋白，所述偶联部分包括但不限于可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合，所述抗体部分和偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
又一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包含上述PRLR抗原结合蛋白、人源化PRLR抗原结合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞、嵌合抗原受体、免疫细胞、抗原结合蛋白衍生物、多特异性抗体和/或抗体药物偶联物。
具体地，所述的药物组合物还包含任选的药学上可接受的载体。
进一步具体地，所述的药学上可接受的载体包括但不限于：稀释剂、赋形剂、填充剂、润湿剂、崩解剂、矫味剂和粘合剂。
具体地，所述的药物组合物还包含组合治疗剂，所述的组合治疗剂包括但不限于化学治疗剂、放射治疗剂、免疫抑制剂、细胞毒性药物。
又一方面，本发明提供了上述PRLR抗原结合蛋白或人源化PRLR抗原结合蛋白的生产方法，所述的方法包括在使得所述抗原结合蛋白表达的情况下，培养上述宿主细胞。
又一方面，本发明提供了所述的PRLR抗原结合蛋白、人源化PRLR抗原结合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞、嵌合抗原受体、免疫细胞、抗原结合蛋白衍生物、多特异性抗体、抗体药物偶联物和/或药物组合物在制备用于PRLR阻断药物、试剂盒和/或医疗装置中的应用。
具体地，所述的PRLR阻断药物、试剂盒和/或装置主要应用于PRLR表达量增高的疾病中。
又一方面，本发明提供了所述的PRLR抗原结合蛋白、人源化PRLR抗原结合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞、嵌合抗原受体、免疫细胞、抗原结合蛋白衍生物、多特异性抗体、抗体药物偶联物和/或药物组合物在制备用于预防和/或治疗PRLR阳性疾病的药物、试剂盒和/或给药装置中的应用。
具体地，所述的PRLR阳性疾病为肿瘤或脱发等。
进一步具体地，所述的肿瘤包括但不限于：乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、皮肤癌、胰腺癌、肾癌、胃癌等。
又一方面，本发明提供了所述的PRLR抗原结合蛋白、人源化PRLR抗原结合蛋白和/或抗原结合蛋白衍生物在制备PRLR检测试剂或试剂盒中的用途。
又一方面，本发明提供了PRLR检测方法，利用上述PRLR抗原结合蛋白或人源化PRLR抗原结合蛋白定性或定量分析检测PRLR，所述的检测方法用于非疾病诊断或治疗目的。
又一方面，本发明提供了PRLR阳性相关疾病的治疗方法，所述的治疗方法为向有需要的受试者施用有效量的上述PRLR抗原结合蛋白、人源化PRLR抗原结合蛋白、免疫细胞、抗原结合蛋白衍生物、多特异性抗体，抗体药物偶联物和/或药物组合物。
具体地，所述的PRLR阳性疾病为肿瘤或脱发等。
进一步具体地，所述的肿瘤包括但不限于：乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、皮肤癌、胰腺癌、肾癌、胃癌等。
又一方面，本发明提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括所述的PRLR抗原结合蛋白、人源化PRLR抗原结合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞、嵌合抗原受体、免疫细胞、抗原结合蛋白衍生物、多特异性抗体、抗体药物偶联物和/或药物组合物，及任选地，说明书。
又一方面，本发明提供了一种给药装置，所述的给药装置包含：(1)用于对有需要的受试者施用所述的药物组合物的输注模块，以及(2)任选的药效监控模块。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
(1)本发明提供了一种新的PRLR抗原结合蛋白，所述的PRLR抗原结合蛋白通过杂交瘤技术得到，对人PRLR-ECD具有较好的亲和力及结合活性，能够有效抑制PRLR的激活。
(2)本发明所述的PRLR抗原结合蛋白可用于治疗包括肿瘤和脱发在内的多种PRLR阳性疾病，为PRLR阳性疾病的治疗提供了一种新的思路。
附图说明
图1为鼠源单抗SPGA02-260结合人PRLR-ECD亲和力检测结果图。
图2为鼠源单抗SPGA02-260结合高表达人PRLR的T47D细胞亲和力检测结果图。
图3为鼠源单抗SPGA02-260抑制PRL的信号传导(STAT5磷酸化)检测结果图。
图4为鼠源单抗SPGA02-260抑制PRL的信号传导(ERK1/2磷酸化)检测结果图。
图5为鼠源单抗SPGA02-260结合T47D细胞后导致内吞效应检测结果图。
图6为嵌合抗体SPGA02-ch260结合人PRLR-ECD亲和力检测结果图。
图7为嵌合抗体SPGA02-ch260结合高表达人PRLR的T47D细胞亲和力检测结果图。
图8为嵌合抗体SPGA02-ch260结合小鼠源PRLR-ECD亲和力检测结果图。
图9为SPGA02-260对靶抗原PRLR-ECD不同结合区域的结合能力检测结果图。
图10为SPGA02-260对靶抗原PRLR-ECD多肽的结合检测结果图。
图11为人源化单抗SPGA02-hu260对结合小鼠源PRLR的检测结果图。
图12为人源化单抗SPGA02-hu260抑制PRL引起的信号传导(STAT5磷酸化)检测结果图。
图13为人源化单抗SPGA02-hu260抑制PRL引起的信号传导(ERK1/2磷酸化)检测结果图。
图14为人源化单抗SPGA02-hu260抑制GH1引起的信号传导(STAT5磷酸化)检测结果图。
图15为人源化单抗SPGA02-hu260抑制GH1引起的信号传导(ERK1/2磷酸化)检测结果图
图16为人源化单抗SPGA02-hu260抑制BAF3-huPRLR细胞的生长检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
术语定义
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学用语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有的其他技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968,IUPAC-IUB委员会)中所述。
本发明所述的“抗原结合蛋白”通常是指包含结合抗原部分的蛋白质，以及任选地允许结合抗原的部分采用促进抗原结合蛋白与抗原结合的构象的支架或骨架部分。可典型地包含抗体轻链可变区(VL)、抗体重链可变区(VH)或上述两者。VH和VL区可进一步被区分为称为互补决定区(CDR)的高变区，它们散布在称为框架区(FR或FWR)的更保守的区域中。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗原结合蛋白的实例包括但不限于抗体、抗原结合片段(Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb)、免疫缀合物、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段、抗体衍生物、抗体类似物、嵌合抗原受体或融合蛋白等，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。
本发明所述的“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键链接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA、IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键 的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可以分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补决定区(CDR)。每条轻链可变区(VL或LCVR)和重链可变区(VH或HCVR)由3个CDR区和4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2和LCDR3，重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。
术语“互补决定区”(CDR)指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。通常每个重链可变区中存在三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。CDR可根据本领域已知的各种编号系统确定，例如Kabat、Chothia或，AbM或IMGT编号系统。本发明中使用“Kabat编号规则”(参见Kabat等(1991))确定CDR的氨基酸序列边界。
术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
术语“单克隆抗体”、“单抗”、“mAb”是指从基本上均质抗体的群里获得的抗体，即除可能的变体抗体外，构成所述群体的个别抗体相同和/或结合相同的表位。与通常包含针对不同决定簇的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体是针对抗原上的单一决定簇的。因此。“单克隆”是指从基本上均质抗体群体获得的抗体的特性，且不应解释为需要通过任何特定方法来制造抗体。本发明所述的单克隆抗体可通过各种本领域技术人员已知的技术制备，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法及转基因方法等。
术语“人源化单克隆抗体”是指将鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体框架序列中产生的抗体，可以克服由于嵌合抗体携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异源性反应。为避免免疫原性下降的同时，引起 的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变(或回复突变)，以保持活性。为制备人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人源框架序列(参见Winter的美国专利No.5,225,539；Queen等人的美国专利Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370；以及Lo,Benny,K.C.,editor,in Antibody Engineering:Methods and Protocols,volume 248,Humana Press,New Jersey,2004)。或者，还可以利用转基因动物，其能够在免疫后不产生内源性免疫球蛋白、并且能够产生完整人抗体库(参见例如，Jakobovits等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551；Jakobovits等，1993，Nature 362：255-258；Bruggermann等，1993，Year in Immunology 7：33；和Duchosal等，1992，Nature 355：258；Lonberg等人(1994)Nature 368(6474):856-859；WO02/43478)。其他抗体人源化改造的方法还包括噬菌体展示技术(Hoogenboom等，1991，J.Mol.Biol.227：381；Marks等，J.Mol.Biol.1991，222：581-597；Vaughan等，1996，Nature Biotech 14：309)。
术语“特异性结合”、“选择性结合”是指两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以用相互作用的解离平衡常数(KD)表示。在本文中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。解离平衡常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体以大约小于10-8M，例如大约小于10-9M、10-10M、10-11M或更小的亲和力(KD)结合。
术语“同一性”通常是指在比对序列后，查询序列中氨基酸残基或核苷酸与第二参考多肽序列或其部分中相同的残基所占百分比，必要时引入空位(GAPS)以实现最大序列同一性百分比，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。用于确定氨基酸/核苷酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域已知的各种方式来实现，例如，使用可公开获得的计算机软件，例如BLAST，BLAST-2，ALIGN，NEEDLE或Megalign(DNASTAR)。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。同一性百分比可以在整个确定的多肽/多核苷酸序列的长度上测定，或者可以在较短的长度上，例如在从较大的确定的多肽/多核苷酸序列中获得的片段的长度 上测定。应当理解，在表，附图或序列表中，本文所示的序列所支持的任何片段长度可用于作为可测量同一性百分比的长度。具有“％同一性”的序列保留与其比较或来源的序列的重要生物活性，如抗体结合特异性。具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合的序列保留与其比较或来源的序列的重要生物活性，如抗体结合特异性。具有“％同一性”的核苷酸序列或相差不超过3、6、15、30或45个核苷酸的核苷酸序列能够实现与其比较或来源的核苷酸序列近似的功能，如所表达的蛋白都能特异地结合同一抗原或分子。
术语“保守置换”指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.Natl Acad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒 等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
术语“宿主细胞”，通常是指可以或已经含有包括本申请所述的核酸分子的质粒或载体，或者能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段的个体细胞、细胞系或细胞培养物。所述细胞可以包括单个宿主细胞的子代。由于天然的、意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段即可。所述细胞可以通过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)，也可以是真核细胞(例如酵母细胞，例如COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，HEK293细胞，COS-1细胞，NS0细胞或骨髓瘤细胞)。在某些情形中，所述细胞可以是哺乳动物细胞。例如，所述哺乳动物细胞可以是CHOK1细胞。
术语“药学上可接受的载体”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体，是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇， 淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。
术语“药物组合物”通常是指这样的制剂，其以允许活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对将施用所述组合物的对象具有不可接受的毒性的另外的成分。所述组合物是无菌的。
术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如非人灵长类哺乳动物或人。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有肿瘤或脱发等疾病(所述的肿瘤包括但不限于：乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、皮肤癌、胰腺癌、肾癌、胃癌等)，或者，具有患有上述疾病的风险。
术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如，PRLR阳性相关)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如，PRLR阳性相关疾病)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
术语“嵌合抗原受体”指的是嵌合抗原受体T细胞通过识别某种抗原的抗体的抗原结合部位与CD3-δ链或FcεRIγ的胞内部分在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染患者的T细胞，使其表达嵌合抗原受体，使得患者的T细胞被“重编码”后，能够生成大量特异性的CAR-T细胞。把重新编码后的嵌合抗原受体T细胞加进患者身体里，这种嵌合抗原受体就像GPS一样可以特异性地追踪和识别并引导T细胞杀伤细胞。大多数嵌合抗原受体由胞外抗原结合区(由来源于单克隆抗体的轻链和重链组成，中间由带韧性的铰链区连接形成单链抗体)、跨膜区域和胞内信号转导区组成。通过将识别相关抗原的scFv和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序”在体外进行基因重组获得CAR结构。
术语“免疫细胞”包括具有造血的起源并在免疫应答中起作用的细胞，例如淋巴细胞，例如B细胞和T细胞；天然杀伤细胞；髓样细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞、嗜碱细胞和粒细胞。
缩略词
CDR：免疫球蛋白可变区中的互补决定区。
VH：抗体重链可变区。
VL：抗体轻链可变区。
HC：抗体重链。
LC：抗体轻链。
IgG：免疫球蛋白G。
AbM：AbM CDR定义方式来源于Martin的相关研究(Martin ACR,Cheetham JC,Rees AR(1989)Modelling antibody hypervariable loops:A combined algorithm.Proc Natl Acad Sci USA 86:9268-9272)，此定义方法整合了Kabat及Chothia两者的部分定义。
Kabat：由Elvin A.Kabat提出的免疫球蛋白比对及编号系统(参见，例如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。
Chothia：由Chothia等人提出的免疫球蛋白编号系统，其是基于结构环区的位置鉴定CDR区边界的经典规则(参见，例如Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)。
IMGT：基于由Lefranc等人发起的国际免疫遗传学信息系统(The international ImMunoGeneTics information system(IMGT))的编号系统，可参阅Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003。
mAb：单克隆抗体。
EC50：产生50％功效或结合的浓度。
IC50：产生50％抑制的浓度。
ELISA：酶联免疫吸附测定。
PCR：聚合酶链式反应。
HRP：辣根过氧化物酶。
PRLR：催乳素受体。
hFc：人IgG抗体Fc段。
KD：解离平衡常数。
HCDR1：免疫球蛋白重链可变区中的互补决定区1。
HCDR2：免疫球蛋白重链可变区中的互补决定区2。
HCDR3：免疫球蛋白重链可变区中的互补决定区3。
LCDR1：免疫球蛋白轻链可变区中的互补决定区1。
LCDR2：免疫球蛋白轻链可变区中的互补决定区2。
LCDR3：免疫球蛋白轻链可变区中的互补决定区3。
发明详述
抗原结合蛋白
本发明制备了一系列PRLR抗原结合蛋白，这些PRLR抗原结合蛋白通过免疫小鼠、分子生物学和抗体工程技术制备得到。
在某些实施方式中，本发明提供的抗原结合蛋白包括以下互补决定区：
(1)包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或其变体序列的重链互补决定区1 HCDR1；
(2)包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或其变体序列的重链互补决定区2 HCDR2；
(3)包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或其变体序列的重链互补决定区3 HCDR3；
(4)包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或其变体序列的轻链互补决定区1 LCDR1；
(5)包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或其变体序列的轻链互补决定区2 LCDR2；
(6)包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或其变体序列的轻链互补决定区3 LCDR3；
优选地，所述变体序列为与其来源的CDR相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的CDR序列；所述的置换为保守置换。
在某些实施方式中，本发明提供的抗原结合蛋白包含如下重链可变区VH和轻链可变区VL：
(1)、包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的重链可变区VH；和/或包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的轻链可变区VL；
或者(2)、与(1)中的VH相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VH；和/或，与(1)中的VL相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VL；
或者(3)、与(1)中的VH相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合的VH；和/或，与(1)中的VL相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合的VL；所述的置换是保守置换。
在某些实施方式中，本发明提供的抗原结合蛋白包括如下重链HC和轻链LC：
(1)包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的重链HC；和/或包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的轻链LC；
或者(2)重链和轻链，其中，与(1)中的重链和轻链相比，所述重链具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；和/或，所述轻链具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在某些具体的实施方式中，本发明制备获得的PRLR抗原结合蛋白包括下表1所述的重链及轻链的组合。
表1.PRLR抗原结合蛋白的序列特征

抗体衍生物和多特异性抗体
如上部分所述的本发明提供的抗原结合蛋白包括抗体或抗原结合片段，其可进行衍生化(例如被连接至另一个分子，例如另一个多肽或蛋白)。通常，抗体或其抗原结合片段的衍生化(例如，标记)不会对其与PRLR的结合产生不利影响。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段还意欲包括此类衍生化的形式。例如，可以将本发明的抗体或其抗原结合片段连接于一个或多个其它分子基团，形成双特异性抗体，检测试剂，药用试剂，和/或能够介导抗体或抗原结合片段与另一个分子结合的蛋白或多肽(例如，抗生物素蛋白或多组氨酸标签)。
一种类型的衍生化抗体是标记的抗体。例如，可以将本发明的抗体或其抗原结合片段连接至可检测的标记。本发明所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，其实例包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、吖啶酯类化合物、磁珠(例如，)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。教导该标记物的使用的专利包括，但不限于，美国专利3817837、3850752、3939350、3996345、4277437、4275149及4366241(全部通过引用并入本文)。如上所述的可检测的标记可通过本领域已知的方法检测。例如，放射性标记可使用摄影胶片或闪烁计算器检测，荧光标记物可使用光检测器检测，以检测发射的光。酶标记物一般通过给酶提供底物及检测通过酶对底物的作用产生的反应产物来检测，及测热标记物通过简单可视化着色标记物来检测。在某些实施方案中，此类标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、 放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。在某些实施方案中，可通过不同长度的接头(linker)将如上所述的可检测的标记连接至本发明的抗体或其抗原结合片段，以降低潜在的位阻。
此外，本发明的抗体或其抗原结合片段还可以用化学基团进行衍生，例如聚乙二醇(PEG)，甲基或乙基，或者糖基。这些基团可用于改善抗体的生物学特性，例如增加血清半衰期。
作为另一种抗体的衍生物，本发明提供一种多特异性抗体，所述多特异性抗体包含第一抗体或其片段，和另外的抗体或其片段，或抗体类似物，其中第一抗体或其片段，另外的抗体或其片段，或抗体类似物保留其原始结合特异性。所述第一抗体或其片段是本发明的任一结合TSLP的(单克隆)抗体或其抗原结合片段。如本文中所使用的，“抗体类似物(antibody mimetic)”，指与抗体一样特异性结合抗原，但却没有抗体结构。它们通常是人工肽或蛋白质，摩尔质量约为3至20kDa，例如锚蛋白重复蛋白(DARPin)和fynomer。经设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)可以与IgG抗体、scFv-Fc抗体片段或其组合相连，如CN104341529A所述。抗IL-17a的fynomer与抗IL-6R抗体融合产生双特异性融合多肽，如WO2015141862A1所述。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体由第一抗体或其抗原结合片段与其他抗体或其抗原结合片段或抗体类似物通过偶联形成，并且其中各抗体或其抗原结合片段或抗体类似物保持其原结合特异性，所述第一抗体或其抗原结合片段为本发明所述的抗体或其抗原结合片段。某些实施方案中，所述多特异性抗体为双特异性抗体或三特异性抗体或四特异性抗体。
抗体药物偶联物
抗体药物偶联物包括本发明提供的抗原结合蛋白部分以及偶联部分。抗原结合蛋白部分包括如上所述的“抗原结合蛋白”，以及在“抗原结合蛋白”基础上获得的抗原结合片段。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb等。偶联部分可以包含至少一个载荷药物。所述载荷药物可以包含药物活性物成分和/或前述的标记分子。载荷药物是一类具有药学活性的小分子化合物或者毒素或其他药物分子形式，可以是但不局限于小分子化合物、毒素分子、寡核苷酸、蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)、亲和配 体、荧光基团、核素基团等。本领域已知多种载荷药物。例如，小分子化合物通常是指具有较强细胞毒性的一类物质。示例性的小分子化合物可通过包括但不限于微管蛋白结合、DNA结合、抑制RNA聚合酶、蛋白质合成或抑制拓扑异构酶等机制来发挥此类细胞毒性和细胞抑制性效应。例如，小分子化合物可以是微管蛋白抑制剂；例如，所述微管蛋白抑制剂可以是美登素(例如，DM1或DM4)和奥瑞司他汀(例如，MMAE或MMAF)等等。例如，所述小分子化合物可以是DNA损伤剂；例如，所述DNA损伤剂可以是卡奇霉素(Calicheamicins)、吡咯并苯并二氮杂卓(PBD，pyrrolobenzodiazepines)等等。例如，蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)是一类能够通过诱导靶蛋白的多聚泛素化而导致靶蛋白降解的化合物；例如，所述PROTAC可以是BET蛋白降解剂。所述药物偶联物还可以包含至少一个连接子。例如，所述连接子可包含可断裂连接子或非可断裂连接子。所述连接子用于将一个或多个载荷药物连接到抗原结合蛋白。在本申请中，可断链的连接子可以是便于释放药物的“可切割”连接子。例如，可切割连接子可以包括但不局限于酸敏感连接子，蛋白酶敏感连接子，光敏感连接子，或含二硫化物连接子。连接子可包含一种或多种连接子构件，本领域已知多种连接子构件，例如，马来酰亚胺基己酰基(MC，maleimidocaproyl)，马来酰亚胺基丙酰基(MP)，缬氨酸-瓜氨酸(val-cit或vc，valine-citrulline)，对氨基苄氧羰基(PAB，paminobenzyloxycarbonyl)。
核酸、载体、宿主细胞及抗体的制备
本发明的抗原结合蛋白可通过本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明抗体的重链和轻链基因的DNA分子。将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体。
在某些具体的实施方式中，本发明提供了分离的核酸分子，包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段、或其重链可变区和/或轻链可变区、或其一个或多个CDR的核苷酸序列。根据本领域已知的密码子简并性，在某些实施方案中，所述核苷酸序列是可以根据密码子简并性进行替换的。在某些实施方案中，所述核苷酸序列是密码子最优化的。
在某些实施方式中，本发明提供了包含本发明的分离的核酸分子的克隆载体或表达载体。在某些实施方案中，所述的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，慢病毒等。在某些实施方案中，所述的载体能够在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内表达本发明的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，本发明提供了包含本发明的分离的核酸分子或本发明的载体的宿主细胞。宿主细胞可以是真核细胞(例如哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞)或原核细胞(例如大肠杆菌)。合适的真核细胞包括但不限于NS0细胞、Vero细胞、Hela细胞、COS细胞、CHO细胞、HEK293细胞、BHK细胞、和MDCKII细胞。适宜的昆虫细胞包括但不限于Sf9细胞。在某些实施方案中，本发明的宿主细胞是哺乳动物细胞，例如CHO(例如CHO-K1、CHO-S、CHO DXB11、CHO DG44)。
在某些实施方式中，本发明提供了制备本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养本发明的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
制药用途、治疗方法、药物组合物和给药装置
本发明提供了所述的PRLR抗原结合蛋白、抗原结合蛋白衍生物、多特异性抗体、免疫细胞、抗体药物偶联物在制备用于PRLR阻断药物、制备用于预防和/或治疗PRLR阳性疾病的药物中的用途。
相应地，本发明提供了所述的PRLR抗原结合蛋白、抗原结合蛋白衍生物、多特异性抗体、免疫细胞、抗体药物偶联物用于阻断PRLR、用于预防和/或治疗PRLR阳性疾病方法。
在某些实施方式中，本发明提供了用于治疗的药物组合物，所述的药物组合物包含所述的PRLR抗原结合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞、免疫细胞、抗原结合蛋白衍生物、多特异性抗体和/或抗体药物偶联物及任选地药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”包括但不限于：稀释剂、赋形剂、填充剂、润湿剂、崩解剂、矫味剂和粘合剂。
在某些实施方式中，所述的药物组合物还包含组合治疗剂，所述的组合治疗剂包括但不限于化学治疗剂、放射治疗剂、免疫抑制剂、细胞毒性药物。
在某些实施方式中，在所述药物组合物中，本发明的抗原结合蛋白与所述组合治疗剂作为分离的组分或作为同一组合物的组分提供。因此，本发明的抗原结 合蛋白与所述组合治疗剂可以联合或分开，同时或相继施用。抗PRLR的抗体或其抗原结合片段可单独或与其它治疗剂组合给药。抗PRLR的抗体或其抗原结合片段和一种或多种其它治疗剂可分开、同时或相继给药。
药物组合物可呈任何适合形式(视将其投予患者的所需方法而定)，可通过多种途径(例如经口、经皮、皮下、鼻内、静脉内、肌肉内、眼内、局部、鞘内和脑室内)向患者投予本发明的PRLR抗体。在任何指定情况下最适于投药的途径将视特定抗体、个体和疾病的性质和严重度以及个体的身体状况而定。
在某些实施方式中，本发明还提供了施用所述抗原结合蛋白、抗原结合蛋白衍生物、多特异性抗体、免疫细胞、抗体药物偶联物及包含上述成分的药物组合物的给药装置，所述装置包括：
(i)输注模块，所述输注模块用于对受试者施用包括具有一活性成分的药物组合物；
(ii)用于输注的药物组合物，所述药物组合物中含有一活性成分，所述活性成分选自下组：抗原结合蛋白、抗原结合蛋白衍生物、多特异性抗体、免疫细胞、抗体药物偶联物或其组合；以及
(iii)任选的药效监控模块。
在另一优选例中，所述的施用包括肠道外施用和非肠道外施用。在另一优选例中，所述肠道外施用包括注射施用，所用的注射的路径包括：静脉内、肌内、动脉内、膜内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜上和胸骨内注射和推注。在另一优选例中，所述非肠道外施用包括外用、表皮施用或粘膜施用，例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下、或局部外用。在另一优选例中，所述的输注模块为无针皮下注射设备、微量输液泵、经皮给药设备、推注设备，或渗透设备。
检测方法、试剂盒
本发明的抗体或其抗原结合片段能够结合PRLR，从而可用于检测PRLR在样品中的存在或其水平。
在一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的抗原结合蛋白。在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白带有可检测的标记。在一个优选的实施方 案中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本发明的抗体或其抗原结合片段。优选地，所述第二抗体还包括可检测的标记。
在本发明中，所述可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。特别优选的是，此类标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。
在本发明中，提供了对PRLR表达的检测，其包含使用一种或一种以上本发明的PRLR抗体(任选接合于可检测部分)接触生物样品(个体细胞、组织或体液)，和检测样品关于PRLR表达是否呈阳性，或检测样品相较于对照样品是否具有改变(例如减少或增加)的表达。在某些实施例中，组织或体液为周边血液、周边血液白血球、活组织检查组织(例如肺或皮肤活组织检查)以及组织。所述方法可以用于诊断目的，或者非诊断目的(例如，用于PRLR途径研究、药物筛选、组化分析等)。在某些实施方案中，用于非诊断目的的样品是细胞样品，例如细胞系或离体细胞培养物。
在一个实施方案中，本发明提供了一种检测样品中PRLR的存在或其水平的方法，所述方法包括在允许本发明所述抗体或其抗原结合片段与PRLR之间形成复合物的条件下，使所述样品与所述抗体或其抗原结合片段接触，并且检测所述复合物的形成。
在另一个方面，本发明提供了一种诊断受试者中PRLR阳性疾病的方法，包括将本发明所述的抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体、或抗体药物偶联物与来自受试者的样品在允许抗体或其抗原结合片段与PRLR之间形成复合物的条件下接触，检测所述复合物的形成，其中与健康对照相比，PRLR水平升高指示存在肿瘤或脱发等疾病。
可选地，所述受试者是哺乳动物，包括非人哺乳动物和人。优选地，所述受试者是人。
优选地，所述的肿瘤包括但不限于：乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、皮肤癌、胰腺癌、肾癌、胃癌等。
在另一个方面，本发明提供了检测试剂盒，其包含本发明所述的PRLR抗原结合蛋白、抗原结合蛋白衍生物等，在优选的实施例中，所述试剂盒包含用于描述其使用方法的使用说明书。
实施例1.抗原免疫动物以及杂交瘤的制备和筛选
1.1小鼠免疫
用商购的PRLR-ECD蛋白(购自Acro公司，货号为PRR-H52Ha，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)，皮下免疫Balb/c小鼠(购自浙江维通利华实验动物技术有限公司)。第1天，PRLR-ECD蛋白与弗氏完全佐剂(Sigma公司)乳化后，对Balb/c小鼠进行背部皮下注射(人PRLR-ECD 50μg/鼠/0.5mL)，第14天，人PRLR-ECD蛋白与弗氏不完全佐剂(Sigma公司)乳化后，对Balb/c小鼠进行背部皮下注射(人PRLR-ECD 30μg/鼠/0.5mL)，在第28天，人PRLR-ECD蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后，对Balb/c小鼠进行背部皮下注射(人PRLR-ECD30μg/鼠/0.5mL)，三周以后尾静脉注射30μg PRLR-ECD激发，3-4天后，取小鼠脾脏进行融合实验。
1.2杂交瘤细胞制备及筛选
在小鼠末次冲击免疫后3-4天，使用常规的杂交瘤技术方案，将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0通过PEG法进行融合。融合后的细胞在完全培养基(含RPMI1640培养基，GlutaMax，1％Penicillin-streptomycin，1×HAT及20％FBS，(所有产品均购自Gibco公司)中混合均匀，按3×106个细胞/200μL/孔，分入共30块96孔培养板中培养。在7-12天后，收获上清液，通过间接酶联免疫吸附测定法(ELISA)筛选人PRLR-ECD结合活性阳性的杂交瘤孔，将人PRLR-ECD结合阳性的杂交瘤孔通过有限稀释法进行第一、第二轮亚克隆，获得目标杂交瘤细胞株，命名为SPGA02-260。
其中，间接酶联免疫吸附测定法筛选人PRLR-ECD结合活性阳性的杂交瘤孔的方法如下：将重组人PRLR-ECD蛋白以包被液(磷酸盐包被缓冲液，pH7.4)稀释至0.5μg/mL，100μL/孔加入酶标板，4℃包被过夜。PBST洗板1次，加入300μL/孔封闭液(1％BSA-PBST)，37℃孵育2h后PBST洗板3次待用。将收取的杂交瘤上清液依次加入封闭后的酶标板，100μL/孔，37℃孵育1h。PBST洗 板3次，加入HRP标记的羊抗小鼠IgG二抗(购自Abcam，货号ab6789)，37℃孵育30min；PBST洗板3次后，在吸水纸上尽量拍干残留液滴，每孔加入100μL的TMB(购自KPL公司，货号52-00-03)，室温(20±5℃)避光放置5min；每孔加入50μL 2M H2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取OD值，分析待测杂交瘤上清与靶抗原PRLR-ECD结合能力。
实施例2.鼠源抗人PRLR单克隆抗体的大量制备及鉴定
在含血清完全培养基中扩增筛选获得的杂交瘤细胞株，离心换液至无血清培养液SFM培养基，使细胞密度为1-2×107/mL，在5％CO2，37℃条件下培养2周，离心获取培养上清，通过Protein A亲和层析进行纯化，获得鼠源抗人PRLR-ECD蛋白单克隆抗体SPGA02-260。
实施例3.鼠源单克隆抗体对人PRLR-ECD结合活性
间接酶联免疫吸附测定法测定鼠源抗体对人PRLR的结合能力，具体方法如下：将重组人PRLR-ECD蛋白以包被液(磷酸盐包被缓冲液，pH7.4)稀释至0.5μg/mL，100μL/孔加入酶标板，4℃包被过夜。PBST洗板1次，加入300μL/孔封闭液(1％BSA-PBST)，37℃孵育2h后PBST洗板3次。将纯化的抗体用1％BSA-PBST稀释至1μg/mL，1:3梯度稀释后加入酶标板，100μL/孔，37℃孵育1h。PBST洗板3次，加入HRP标记的羊抗小鼠IgG二抗(购自Abcam，货号ab6789)，37℃孵育30min；PBST洗板3次后，在吸水纸上尽量拍干残留液滴，每孔加入100μl的TMB(购自KPL公司，货号52-00-03)，室温(20±5℃)避光放置5min；每孔加入50μL 2M H2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取OD值，分析待测抗体与靶抗原PRLR-His结合能力。
结果如图1所示，结果表明SPGA02-260高亲和力结合人PRLR-ECD，EC50为20.9ng/mL，即0.14nM。
实施例4.鼠源抗体对人乳腺癌细胞T47D的结合亲和力的测定
本实施例通过流式细胞荧光分选技术(Fluorescence activated Cell Sorting，FACS)的方法测定SPGA02-260对人乳腺癌细胞T47D的结合亲和力。
本实验以人乳腺管癌细胞T47D作为靶细胞，SPGA02-260作为一抗，按照6倍梯度将SPGA02-260从20μg/mL连续稀释6个梯度，分别取100μL梯度稀释的抗体与100μLT47D细胞于室温孵育30min，(该细胞悬浮于100μL RPMI-1640 无血清培养基(购自Gibco公司，货号61870036)，单抗的最高工作浓度为10μg/mL)，PBS洗涤细胞两次以去除未结合的SPGA02-260，再将细胞与50μL含5μg/mL Alexa Fluor 488标记的抗鼠荧光二抗(购自Thermo，invitrogen公司，货号A11001)于4℃避光孵育40min，PBS洗涤细胞两次以去除未结合的二抗，最后将细胞重悬在100μL PBS中，通过流式细胞仪(购自Beckman，型号CytoFLEX)测定SPGA02-260对该细胞的结合亲和力，所得数据通过GraphPad Prism 6软件拟合分析。
结果如图2所示，结果表明SPGA02-260可以特异性结合细胞表面PRLR高表达的人乳腺管癌细胞T47D，且其EC50为26.0ng/mL，即0.17nM。
实施例5.鼠源抗体抑制PRL引起的信号传导
本实施例采用Western blot的方法测定抗体SPGA02-260对PRL刺激后人乳腺癌细胞T47D后下游转录激活因子家族STAT5和ERK1/2信号通路的影响。
将处于对数生长期的乳腺癌细胞T47D以胰酶消化并重悬于完全培养基中，按照2×106cells/1mL/孔铺于6孔板中，于CO2细胞培养箱37℃过夜培养。次日细胞贴壁后，移除6孔板中的培养基，每孔轻轻加入2mL室温的无菌PBS洗去残余的培养基，移除PBS。SPGA02-260用不含胎牛血清的1640培养基稀释至浓度为20μg/mL、2μg/mL和0.2μg/mL，每孔细胞中缓慢加入1mL上述不同浓度的抗体，培养箱中培养30min后，每孔缓慢加入500μL/孔500ng/mL的PRL(ACRO公司，Cat#PRN-H5257)溶液(1640培养基配制)，加好后轻摇6孔板，并置于CO2培养箱中继续培养。作用30min后，将6孔板置于冰上，移除培养基，每孔轻轻加入2mL无菌冰上预冷的PBS洗涤一次。移除PBS，每孔加入200μL RIPA lysis buffer(TEKNOVA，Cat#R3792)，混匀后静置裂解10min。将孔板中的细胞裂解液收集入离心管中，13,000rpm离心10min，取上清，并进行BCA定量，随后冻入-80℃冰箱中备用或通过常规Western blot方法检测磷酸化STST5(pSTAT5)和磷酸化ERK1/2(pERK1/2)。
检测pSTAT5：将上述细胞裂解液进行SDS-PAGE电泳(100μg/泳道)后，通过电转移法转印至PVDF膜，于1％BSA-TBST中封闭(室温震荡1h)，加入1μg/mL(1％BSA-TBST稀释)的兔抗人磷酸化STAT5(Tyr694)(购自CST，Cat#94205S)，室温震荡孵育2h，TBST洗3次后，加入HRP标记羊抗兔IgG 二抗(购自abcam，Cat#ab97051，按说明书以1％BSA-TBST稀释10000倍)，室温震荡孵育1h后，TBST洗3次后，PVDF膜上滴加适量PierceTM ECL Western印迹底物溶液(购自Thermo公司，货号32209)，室温避光于生物分子成像仪(购自Thermo公司，型号CL1500)上自动成像。
检测pERK1/2：将上述细胞裂解液进行SDS-PAGE电泳(100μg/泳道)后，通过电转移法转印至PVDF膜，于1％BSA-TBST中封闭(室温震荡1h)，加入1μg/mL(1％BSA-TBST稀释)的兔抗Phospho-p44/42MAPK(Erk1/2，Thr202/Tyr204)Antibody(cell signaling technology公司，Cat#9101)，室温震荡孵育2h，TBST洗3次后，加入HRP标记羊抗兔IgG二抗(购自abcam，Cat#ab97051，按说明书以1％BSA-TBST稀释10000倍)，室温震荡孵育1h后，TBST洗3次后，PVDF膜上滴加适量PierceTM ECL Western印迹底物溶液(购自Thermo公司，货号32209)，室温避光于生物分子成像仪(购自Thermo公司，型号CL1500)上自动成像。
检测β-actin：将上述细胞裂解液进行SDS-PAGE电泳(100μg/泳道)后，通过电转移法转印至PVDF膜，于1％BSA-TBST中封闭(室温震荡1h)，加入1μg/mL(1％BSA-TBST稀释)的小鼠抗人β-actin单抗(购自Thermo公司，Cat#MA1-140)，室温震荡孵育2h，TBST洗3次后，加入HRP标记羊抗小鼠IgG二抗(购自北京博奥龙免疫技术有限公司，Cat#BF03001，按说明书以1％BSA-TBST稀释10000倍)，室温震荡孵育1h后，TBST洗3次后，PVDF膜上滴加适量PierceTM ECL Western印迹底物溶液(购自Thermo公司，货号32209)，室温避光于生物分子成像仪(购自Thermo公司，型号CL1500)上自动成像。
结果如图3所示，检测的各样品中，作为对照的β-actin含量一致；实验中，T47D细胞在没有PRL刺激作用下，STAT5不被磷酸化；而在PRL的作用下，STAT5则明显被磷酸化。SPGA02-260抗体在20μg/mL、2μg/mL浓度下，可以完全抑制PRL刺激引起的STAT5的磷酸化，在0.2μg/mL浓度下，仍然能够部分抑制STAT5的磷酸化。
结果如图4所示，检测的各样品中，作为对照的β-actin含量一致；实验中，T47D细胞在没有PRL刺激作用下，ERK1/2不被磷酸化；而在PRL的作用下， ERK1/2则明显被磷酸化；SPGA02-260在20μg/mL、2μg/mL、0.2μg/mL浓度下，均可以完全抑制PRL刺激引起的ERK1/2的磷酸化。
实施例6.靶细胞T47D对鼠源抗体的胞吞作用
本实施例通过流式细胞荧光分选技术(Fluorescence activated Cell Sorting，FACS)的方法测定SPGA02-260在人乳腺癌细胞T47D上发生的内吞作用。
实验方法如下：T47D细胞以3×105/孔种植于24孔培养板，次日弃上清，用PBS洗一遍，每孔加入含10μg/mL SPGA02-260的培养液0.5mL，37℃分别反应0h、1h、3h和6h，弃上清，用胰酶消化细胞，转移到离心管，PBS洗一遍，加入5μg/mL、Alexa Fluor 488标记的抗鼠荧光二抗(购自Thermo，invitrogen公司，货号A11001)，4℃避光孵育40min后，用PBS洗一遍，再用100μL的PBS重悬进行流式检测。
结果如图5所示，结果表明抗体SPGA02-260和T47D细胞表面的PRLR抗原结合后发生内吞作用，且与作用时间相关，3小时后，约50％PRLR发生内吞。
实施例7.嵌合抗体的制备
本实施例通过分子生物学的相关方法获取SPGA02-260的重链可变区和轻链可变区，并进一步构建嵌合抗体SPGA02-ch260。
通过Trizol提取SPGA02-260杂交瘤细胞的RNA并进行mRNA反转录获取cDNA，随后以cDNA为模板，分别用鼠源抗体的重链和轻链简并引物(《Antibody Engineering》Volume 1，Edited by Roland Kontermann and Stefan Dübel，组合引物的序列来自第323页)进行PCR，对所获得的PCR产物(约700bp左右)进行测序并通过kabat数据库分析，确定所获得的序列为鼠源抗体的可变区序列。
相关序列具体信息如上表1所示，其中，
SPGA02-260重链可变区基因序列全长360bp，编码120个氨基酸残基，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；轻链可变区基因序列全长321bp，编码107个氨基酸残基，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
对所得的重链可变区氨基酸序列与人的IgG1恒定区(氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示)拼接，轻链可变区与人的kappa链恒定区(氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示)拼接，构建得到SPGA02-ch260的重链(氨基酸序列如SEQ ID NO：8 所示)和轻链(氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示)，分别构建至pcDNA3.4表达载体，转染Expi293F细胞，纯化获取嵌合抗体SPGA02-ch260，通过SDS-PAGE电泳初步确定所表达抗体分子量正确及抗体纯度大于95％，定量，保存至4℃备用。
实施例8.嵌合抗体对靶抗原的亲和力的测定
本实施例通过ELISA的方法测定嵌合抗体SPGA02-ch260对人PRLR-ECD的亲和力。
实验方法参照实施例3。
结果如图6所示，表明SPGA02-ch260和PRLR具有高亲和力结合，EC50为12.9ng/mL，即0.09nM。
实施例9.嵌合抗体对靶细胞的结合亲和力的测定
本实施例通过FACS的方法测定嵌合抗体SPGA01-ch260对人乳腺癌细胞T47D的结合亲和力。
实验方法参照实施例4。
结果如图7所示，表明SPGA02-ch260与高表达PRLR的T47D细胞具有高亲和力结合，EC50为31.0ng/mL，即0.21nM。
实施例10.嵌合抗体结合小鼠PRLR的测定
本实施例通过ELISA的方法测定了SPGA02-ch260结合人PRLR和小鼠PRLR的差异性。
将小鼠的PRLR蛋白(购自北京Sinobiological公司，货号为50457-M08H)，即小鼠PRLR按照0.5μg/孔包被96孔ELISA板，测定SPGA02-ch18、SPGA02-ch260对小鼠PRLR的交叉反应，其它具体实验方法参照实施例8。
结果如图8所示，表明SPGA02-ch260可以结合小鼠的PRLR蛋白，EC50为297.3ng/mL，较与人PRLR的结合力明显降低(EC50为12.9ng/mL)。
实施例11.抗体SPGA02-260对靶抗原结合区域的确定
本实施例通过蛋白免疫印迹(Western Blot)方法和ELISA方法测定SPGA02-260结合PRLR的表位。
为确认SPHA02-260对人PRLR的结合表位，经查阅文献及NCBI获取人PRLR的胞外域(PRLR-ECD)基因(NCBI登记号为NP_000940.1的1至234 位氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中，功能结构域Fibronectin type-III 1(27-128)氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，功能结构域Fibronectin type-III 2(129-229)氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。分别表达PRLR-ECD两个功能结构域即Fibronectin type-III 1和Fibronectin type-III 2的Fc融合蛋白。
将还原变性的人PRLR、重组表达的两个功能结构域即Fibronectin type-III 1和Fibronectin type-III 2进行SDS-PAGE电泳(400ng/泳道)后，通过电转移法转印至PVDF膜，于1％BSA-TBST中封闭(室温震荡1h)，加入1μg/mL的鼠源抗体SPGA02-260(1％BSA-TBST稀释)，室温震荡孵育2h，TBST洗3次后，加入HRP标记羊抗小鼠IgG二抗(购自Abcam公司，货号ab6789，按说明书以1％BSA-TBST稀释10000倍)，室温震荡孵育1h后，TBST洗3次后，PVDF膜上滴加适量PierceTM ECL Western印迹底物溶液(购自Thermo公司，货号32209)，室温避光于生物分子成像仪(购自Thermo公司，型号CL1500)上自动成像。
结果如图9所示，SPGA02-260可以特异性结合还原变性的人PRLR；检测SPGA02-260结合PRLR位于人PRLR-ECD的第二个功能结构域，即Fibronectin type-III 2。
将人PRLR-ECD-Fibronectin type-III 2分解成相互有重叠的10个多肽，各多肽的氨基酸序列如下：
1：bio-PPLELAVEVKQPEDRKPYLW(129-148)；
2：bio-QPEDRKPYLWIKWSPPTLID(139-158)；
3：bio-IKWSPPTLIDLKTGWFTLLY(149-168)；
4：bio-LKTGWFTLLYEIRLKPEKAA(159-178)；
5：bio-EIRLKPEKAAEWEIHFAGQQ(169-188)；
6：bio-EWEIHFAGQQTEFKILSLHP(179-198)；
7：bio-TEFKILSLHPGQKYLVQVRC(189-208)；
8：bio-GQKYLVQVRCKPDHGYWSAW(199-218)；
9：bio-KPDHGYWSAWSPATFIQIPS(209-228)；
10：bio-SPATFIQIPSDFTMND(219-234)。
采用ELISA方法，测定SPGA02-260与上述10条多肽的结合情况，判断SPGA02-260与PRLR的结合表位。
结果如图10所示，SPGA02-260只与上述肽7结合，即人PRLR蛋白N端的第189-208位氨基酸的多肽结合，说明SPGA02-260的结合表位位于人PRLR蛋白的G189至C208之间。
实施例12.抗体SPGA02-260的人源化
对候选鼠源抗体SPGA02-260轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列进行分析，依据Kabat规则确定鼠源抗体的3个抗原互补决定区(CDR)和4个框架区(FR)。SPGA02-260重链互补决定区的氨基酸序列为HCDR1：TVSGFSLTRNGV(SEQ ID NO：12)、HCDR2：IWGDGST(SEQ ID NO：13)、HCDR3：AKEGLYYYGRYFDV(SEQ ID NO：14)，轻链互补决定区的氨基酸序列为LCDR1：KASQDVGSAV(SEQ ID NO：15)、LCDR2：WASTRHT(SEQ ID NO：16)和LCDR3：QQYSNYPLT(SEQ ID NO：17)。
在Germline数据库中选取与上述各鼠源抗体FR区匹配最好的人源化模板。然后将鼠源抗体的CDR区移植到所选择的人源化模板上，替换人源模板的CDR区，形成人源化抗体重链可变区(SPGA02-hu260VH，SEQ ID NO：18)，与人IgG1恒定区(包含S228P突变，SEQ ID NO：6)重组，形成人源化单抗重链(SPGA02-hu260H，SEQ ID NO：20)；人源化抗体轻链可变区(SPGA02-hu260 VL，SEQ ID NO：19)与人的kappa链恒定区重组形成人源化轻链(SPGA02-hu260 L，SEQ ID NO：21)。分别构建人源化抗体的重链和轻链至pcDNA3.4表达载体，转染Expi-293F细胞，通过ProteinA纯化获得人源化抗体SPGA02-hu260，并通过SDS-PAGE电泳及SEC-HPLC确定各抗体分子量大小正确及纯度>95％。SPGA02-260。
实施例13.人源化抗体SPGA02-hu260对靶抗原的亲和力的测定
本实施例通过ELISA的方法测定人源化抗体SPGA02-hu260对人PRLR-ECD的亲和力。
实验方法参照实施例3。
结果如图11所示，表明SPGA02-hu260和PRLR具有高亲和力结合，EC50为8.98ng/mL，即0.06nM。
实施例14.人源化抗体SPGA02-hu260抑制PRLR与PRL结合引起的信号传导
实验方法参考实施例5，抗体SPGA02-hu260的作用浓度调整为1.0/0.5/0.25/0.1μg/mL。
结果如图12和图13所示，检测的各样品中，作为对照的β-actin含量一致。
T47D在PRL的作用下，STAT5明显被磷酸化；抗体SPGA02-hu260在1μg/mL和0.5μg/mL浓度下，可以完全抑制T47D细胞在PRL刺激下引起的STAT5的磷酸化，而在0.25μg/mL浓度下，部分抑制PRL引起的STAT5的磷酸化。
T47D在PRL的作用下，ERK1/2明显被磷酸化；SPGA02-hu260抗体在浓度低至0.1μg/mL时，仍然能够完全抑制PRL刺激引起的ERK1/2的磷酸化。
实施例15.人源化抗体SPGA02-hu260抑制PRLR与GH结合引起的信号传导
实验方法基本同实施例5，以1μg/mL人生长激素(GH1，SinoBiological公司，Cat#16122-HNCE)替代人PRL作为刺激剂诱导PRLR的信号传导。
结果如图14和图15所示，检测的各样品中，作为对照的β-actin含量一致。
T47D在GH1的作用下，STAT5明显被磷酸化。抗体在20μg/mL和2μg/mL浓度下，可以明显抑制T47D细胞在GH1刺激下STAT5的磷酸化，而在0.2μg/mL浓度下，这种抑制作用基本消失。
T47D在GH1的作用下，ERK1/2明显被磷酸化。SPGA02-hu260抗体在浓度低至0.2μg/mL时，仍然能够明显抑制GH1刺激引起的ERK1/2的磷酸化。
实施例16.抗体SPGA02-hu260抑制BAF3-huPRLR细胞的生长
将以含10ng/mL小鼠IL3(碧云天公司，P5912)和10％FBS(Gibico公司)的1640培养液(完全培养基)培养的处于生长对数期的小鼠原B细胞BAF3，用人PRLR过表达慢病毒(吉满生物，货号GM-10162OL01)感染上述细胞，在5μg/mL嘌呤霉素盐酸Puromycin Dihydrochloride(吉满生物，货号GM-040401-1)条件下筛选和亚克隆获得稳定过表达人PRLR的细胞系，即BAF3-huPRLR。
将BAF3-huPRLR细胞在含40ng/mL人PRL(北京百普赛斯公司，PRR-H52Ha)的1640细胞培养液培养，2×105/100μL接种至96孔细胞培养板，以不含PRL的1640培养液稀释抗体SPGA02-hu260至30μg/mL后，10倍稀释共8个梯度， 100μL/孔分别加入上述含BAF3-huPRLR细胞的96孔细胞培养板，将细胞放入CO2培养箱培养72小时后，按说明书加入CCK8试剂，37℃孵育2小时后，测定OD450。
结果如图16所示，SPGA02-hu260能够有效抑制人PRL刺激引起的BAF3-huPRLR细胞的生长，IC50为8.28ng/mL，即0.06nM。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (12)

  1. 一种PRLR抗原结合蛋白，其特征在于：所述的抗原结合蛋白包含以下互补决定区：
    (1)包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或其变体序列的重链互补决定区1 HCDR1；
    (2)包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或其变体序列的重链互补决定区2 HCDR2；
    (3)包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或其变体序列的重链互补决定区3 HCDR3；
    (4)包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或其变体序列的轻链互补决定区1 LCDR1；
    (5)包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或其变体序列的轻链互补决定区2 LCDR2；
    (6)包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或其变体序列的轻链互补决定区3 LCDR3。
  2. 根据权利要求1所述的抗原结合蛋白，其特征在于：所述的抗原结合蛋白包含：
    (1)、包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的重链可变区VH；和/或包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的轻链可变区VL；
    或者(2)、与(1)中的VH相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VH；和/或，与(1)中的VL相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VL；
    或者(3)、与(1)中的VH相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合的VH；和/或，与(1)中的VL相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合的VL；所述的置换是保守置换。
  3. 根据权利要求2所述的抗原结合蛋白，其特征在于：所述的抗原结合蛋白还包含人的IgG1恒定区和人的kappa链恒定区，所述的人的IgG1恒定区的氨基 酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述的人的kappa链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述的PRLR抗原结合蛋白的VH与人的IgG1恒定区连接形成重链，所述的PRLR抗原结合蛋白的VL与人的kappa链恒定区连接形成轻链。
  4. 根据权利要求3所述的抗原结合蛋白，其特征在于：所述的抗原结合蛋白包含：
    (1)包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的重链HC；和/或包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的轻链LC；
    或者(2)重链和轻链，其中，与(1)中的重链和轻链相比，所述重链具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；和/或，所述轻链具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
  5. 一种人源化PRLR抗原结合蛋白，其特征在于：所述的人源化PRLR抗原结合蛋白包含：
    (1)、包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的重链可变区VH；和/或包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的轻链可变区VL；
    或者(2)、与(1)中的VH相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VH；和/或，与(1)中的VL相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VL；
    或者(3)、与(1)中的VH相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合的VH；和/或，与(1)中的VL相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合的VL；所述的置换是保守置换。
  6. 根据权利要求5所述的人源化PRLR抗原结合蛋白，其特征在于：所述的人源化PRLR抗原结合蛋白包含：
    (1)包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的重链HC；和/或包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列的轻链LC；
    或者(2)重链和轻链，其中，与(1)中的重链和轻链相比，所述重链具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；和/或，所述轻链具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
  7. 编码权利要求1-4任一项所述的PRLR抗原结合蛋白或权利要求5-6任一项所述的人源化PRLR抗原结合蛋白的核酸分子。
  8. 一种包含权利要求7所述的核酸分子的载体。
  9. 一种包含权利要求7所述的核酸分子或权利要求8所述的载体的宿主细胞。
  10. 一种药物组合物，其特征在于：所述的药物组合物包含权利要求1-4任一项所述的PRLR抗原结合蛋白、权利要求5-6任一项所述的人源化PRLR抗原结合蛋白、权利要求7所述的核酸分子、权利要求8所述的载体、和/或权利要求9所述的宿主细胞。
  11. 权利要求1-4任一项所述的PRLR抗原结合蛋白、权利要求5-6任一项所述的人源化PRLR抗原结合蛋白、权利要求7所述的核酸分子、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的宿主细胞和/或权利要求10所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗PRLR阳性疾病的药物、试剂盒和/或给药装置中的应用。
  12. 根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述的PRLR阳性疾病为肿瘤或脱发。
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