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WO2023167122A1 - 増殖因子産生細胞及びその製造方法 - Google Patents

増殖因子産生細胞及びその製造方法 Download PDF

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WO2023167122A1
WO2023167122A1 PCT/JP2023/006927 JP2023006927W WO2023167122A1 WO 2023167122 A1 WO2023167122 A1 WO 2023167122A1 JP 2023006927 W JP2023006927 W JP 2023006927W WO 2023167122 A1 WO2023167122 A1 WO 2023167122A1
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WO
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inhibitor
growth factor
producing
cells
cas
Prior art date
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PCT/JP2023/006927
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French (fr)
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平 戴
義規 原田
敏裕 倉橋
寛子 難波
潤一 松本
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Kyoto Prefectural PUC
Kataoka Corp
Original Assignee
Kyoto Prefectural PUC
Kataoka Corp
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Priority to EP23763380.5A priority patent/EP4488362A1/en
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1307—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from adult fibroblasts

Definitions

  • the present invention mainly relates to a method for producing growth factor-producing cells from somatic cells using so-called low-molecular-weight compounds (e.g., compounds with a molecular weight of 1000 or less), and growth factor-producing cells produced by such a production method.
  • the invention further relates to methods of producing growth factors from such growth factor-producing cells, and compositions that can be used for methods of producing such growth factor-producing cells.
  • Non-Patent Document 1 discusses attempts at regenerative medicine for patients with subacute spinal cord injury by transplantation of induced pluripotent stem cell (iPS cell)-derived neural progenitor cells.
  • iPS cell induced pluripotent stem cell
  • HGF Hepatocyte Growth Factor
  • HGF Hepatocyte Growth Factor
  • the main object of the present invention is to provide a new method for safely and rapidly inducing or converting somatic cells to growth factor-producing cells without requiring gene transfer.
  • Another object of the present invention is to provide growth factor-producing cells that are useful in regenerative medicine and the like.
  • somatic cells can be rapidly and directly converted to growth factor-producing cells by using TGF- ⁇ inhibitors, p53 inhibitors, cAMP inducers, and the like.
  • TGF- ⁇ inhibitors TGF- ⁇ inhibitors, p53 inhibitors, cAMP inducers, and the like.
  • Examples of the present invention include the following.
  • [1] A method for producing growth factor-producing cells by direct differentiation induction from somatic cells, comprising at least one selected from the group consisting of TGF- ⁇ inhibitors, p53 inhibitors, and cAMP inducers.
  • a method for producing growth factor-producing cells comprising the step of culturing somatic cells in the presence of [2] Proliferation according to [1] above, wherein the step is a step of culturing somatic cells in the presence of at least four of a TGF- ⁇ inhibitor, a BMP inhibitor, a p53 inhibitor, and a cAMP inducer.
  • a method for producing factor-producing cells comprising the step of culturing somatic cells in the presence of at least four of a TGF- ⁇ inhibitor, a BMP inhibitor, a p53 inhibitor, and a cAMP inducer.
  • the step is a step of culturing the somatic cells in the presence of at least 6 types of TGF- ⁇ inhibitor, BMP inhibitor, p53 inhibitor, cAMP inducer, GSK3 inhibitor, and Erk inhibitor.
  • [4] The method for producing growth factor-producing cells according to [2] or [3] above, wherein the TGF- ⁇ inhibitor is an ALK5 inhibitor and the BMP inhibitor is an ALK2 ⁇ 3 inhibitor.
  • the ALK5 inhibitor is SB431542 (CAS No.: 301836-41-9) or Repsox (CAS No.: 446859-33-2), or the ALK2/3 inhibitor is LDN193189 (CAS No.
  • the GSK3 inhibitor is CHIR99021 (CAS No.: 252917-06-9), or the Erk inhibitor is PD0325901 (CAS No.: 391210-10-9) [3] to The method for producing growth factor-producing cells according to any one of [5].
  • the somatic cells are fibroblasts.
  • the growth factor-producing cell of [9] above which produces a growth factor and an anti-inflammatory factor.
  • IL-1RN Interleukin-1 receptor antagonist
  • a cell sheet or pharmaceutical composition comprising the growth factor-producing cells according to any one of [9] to [11] above and used for treating a disease.
  • the cell sheet or pharmaceutical composition of [12] above, wherein the disease is spinal cord injury, burns, or bedsores.
  • a method for producing a growth factor which comprises the step of extracting and isolating the growth factor from the growth factor-producing cells or secretions thereof according to [9] above.
  • a method for producing a growth factor or anti-inflammatory factor comprising the step of extracting and isolating the growth factor or anti-inflammatory factor from the growth factor-producing cells or secretions thereof according to [10] or [11] above.
  • a composition for producing growth factor-producing cells by direct differentiation induction from somatic cells, wherein at least any one selected from the group consisting of TGF- ⁇ inhibitors, p53 inhibitors, and cAMP inducers A composition for producing growth factor-producing cells, comprising: [17] The composition of [16] above, comprising at least four of a TGF- ⁇ inhibitor, a BMP inhibitor, a p53 inhibitor, and a cAMP inducer. [18] The composition of [17] above, further comprising a GSK3 inhibitor and an Erk inhibitor. [19] The composition of [17] or [18] above, wherein the TGF- ⁇ inhibitor is an ALK5 inhibitor and the BMP inhibitor is an ALK2 ⁇ 3 inhibitor.
  • the ALK5 inhibitor is SB431542 (CAS No.: 301836-41-9) or Repsox (CAS No.: 446859-33-2), or the ALK2/3 inhibitor is LDN193189 (CAS No. : 1062368-24-4), or the p53 inhibitor is pifithrin- ⁇ (CAS No.: 63208-82-2), or the cAMP inducer is forskolin (CAS No.: 66428-89- 5), the composition according to any one of [16] to [19] above.
  • the GSK3 inhibitor is CHIR99021 (CAS No.: 252917-06-9), or the Erk inhibitor is PD0325901 (CAS No.: 391210-10-9) [18] to The composition according to any one of [20].
  • growth factor-producing cells or growth factors or anti-inflammatory factors can be produced in a short period of time from somatic cells (especially terminally differentiated somatic cells or fibroblasts).
  • somatic cells especially terminally differentiated somatic cells or fibroblasts.
  • the growth factor-producing cells obtained by the present invention are useful in regenerative medicine and the like.
  • the upper figure shows phase-contrast images of fibroblasts A47B22 (DMEM) and NM and CiN cells derived from the same fibroblasts (8 days after induction).
  • the lower panel shows a similar phase contrast image for KA45.
  • the left figure shows the amount of HGF secreted in fibroblast A47B22 (DMEM) and NM and CiN cells derived from the same fibroblast (8 days after induction).
  • the figure on the right shows the amount of HGF secreted in fibroblast KA45 (DMEM) and NM and CiN cells derived from the same fibroblast (8 days after induction).
  • ND is an abbreviation for Not Detected, and indicates that it was below the detection limit of the measurement method.
  • the left figure shows the amount of IL-1RN secretion in A47B22 fibroblasts (DMEM) and NM and CiN cells derived from the same fibroblasts (8 days after induction).
  • the figure on the right shows IL-1RN secretion in fibroblast KA45 (DMEM) and fibroblast-derived NM and CiN cells (8 days after induction).
  • ND is an abbreviation for Not Detected, and indicates that it was below the detection limit of the measurement method.
  • Induction of fibroblast A47B22-derived NM (A47B22.CiN), CiN cells (A47B22.CiN) and fibroblast KA45-derived (KA45.CiN), CiN cells (KA45.CiN) 0, 4, 8, 12, A phase-contrast image of each cell on day 16 is shown.
  • Induction of NM (A47B22.CiN), CiN cells (A47B22.CiN) from fibroblast A47B22 and (KA45.CiN), CiN cells (KA45.CiN) from fibroblast KA45 from day 0 to day 16 of induction shows the transition of the HGF secretion amount in .
  • Induction of NM (A47B22.CiN), CiN cells (A47B22.CiN) from fibroblast A47B22 and (KA45.CiN), CiN cells (KA45.CiN) from fibroblast KA45 from day 0 to day 16 of induction shows changes in IL-1RN secretion levels in Phase-contrast images of fibroblast KA45-derived CiN cells (8 types) (8 days after induction) cultured as Examples 2-1 to 2-8 are shown. Phase-contrast images of fibroblast KA45-derived CiN cells (8 types) (8 days after induction) cultured as Examples 2-9 to 2-16 are shown. Fig.
  • Fig. 2 shows the amount of HGF secreted in fibroblast KA45-derived CiN cells (8 types) (8 days after induction) cultured as Examples 2-1 to 2-8.
  • Fig. 3 shows the amount of HGF secreted in fibroblast KA45-derived CiN cells (8 types) (8 days after induction) cultured as Examples 2-9 to 2-16.
  • Fig. 2 shows IL-1RN secretion levels in fibroblast KA45-derived CiN cells (8 types) (8 days after induction) cultured as Examples 2-1 to 2-8.
  • ND is an abbreviation for Not Detected, and indicates that it was below the detection limit of the measurement method.
  • Fig. 2 shows IL-1RN secretion levels in fibroblast KA45-derived CiN cells (8 types) (8 days after induction) cultured as Examples 2-9 to 2-16.
  • ND is an abbreviation for Not Detected, and indicates that it was below the detection limit of the measurement method.
  • Fig. 3 shows the amount of HGF secreted in fibroblast KA45-derived CiN cells (14 types) (8 days after induction) cultured as Examples 3-1 to 3-14.
  • Fig. 3 shows IL-1RN secretion levels in fibroblast KA45-derived CiN cells (14 types) (8 days after induction) cultured as Examples 3-1 to 3-14.
  • ND is an abbreviation for Not Detected, and indicates that it was below the detection limit of the measurement method.
  • the method for producing growth factor-producing cells according to the present invention produces growth factor-producing cells by directly inducing differentiation from somatic cells.
  • a method comprising culturing somatic cells in the presence of at least one selected from the group consisting of TGF- ⁇ inhibitors, p53 inhibitors, and cAMP inducers.
  • Cells that produce growth factors eg, HGF
  • HGF growth factors
  • the relevant steps in the production method of the present invention may include a step of culturing somatic cells in the presence of at least four of a TGF- ⁇ inhibitor, a BMP inhibitor, a p53 inhibitor, and a cAMP inducer. Furthermore, a step of culturing somatic cells in the presence of at least six of TGF- ⁇ inhibitor, BMP inhibitor, p53 inhibitor, cAMP inducer, GSK3 inhibitor, and Erk inhibitor may be employed. By culturing somatic cells in the presence of these four to six agents, cells that produce not only growth factors but also anti-inflammatory factors (eg, IL-1RN) can be produced.
  • anti-inflammatory factors eg, IL-1RN
  • the TGF- ⁇ inhibitor is preferably an ALK5 inhibitor
  • the BMP inhibitor is preferably an ALK2/3 inhibitor.
  • the ALK5 inhibitor is SB431542 (CAS No.: 301836-41-9) and/or Lepsox (CAS No.: 446859-33-2)
  • the ALK2/3 inhibitor is LDN193189 (CAS No.: 1062368-24-4) and/or Dorsomorphin (CAS No.: 866405-64-3) are more preferred.
  • cAMP inducer forskolin (CAS No.: 66428-89-5), GSK3 inhibitor CHIR99021 (CAS No.: 252917-06-9), Erk inhibitor PD0325901 (CAS No.: 391210-10 -9), or the p53 inhibitor is more preferably pifithrin- ⁇ (CAS No.: 63208-82-2).
  • somatic cells may be cultured in the presence of a combination of at least any of the above inhibitors, inducers, etc., and if necessary, other inhibitors, inducers, etc. may be optionally present.
  • the somatic cells can be cultured to produce growth factor-producing cells.
  • Each of the above inhibitors and inducers may be used alone or in combination of two or more.
  • Some of the above specific inhibitors and the like may have two or more types of inhibitory actions, etc. In that case, it can be considered that a single inhibitor or the like exists.
  • the production method of the present invention may not include the step of gene introduction.
  • “gene” refers to a substance (molecule or its complex) that has a chemical structure containing multiple nucleobases and can be involved in the carrying, transcription, or translation of genetic information, or inhibition of these. , DNA and RNA.
  • “gene transfer” includes introduction of DNA by viral vectors, etc., introduction of RNA (siRNA, miRNA, piRNA, etc.) for the purpose of RNA silencing (RNA interference, etc.), and introduction of exogenous genes into cells. general events that introduce into .
  • the production method of the present invention since growth factor-producing cells can be induced without gene transfer, the possibility (risk) of unexpected genomic mutation and insertion, tumorigenesis, etc. is extremely low. can be
  • Somatic Cells can be classified into somatic cells and germ cells. Any somatic cell can be used as a starting material for the production method of the present invention. Somatic cells are not particularly limited, and may be primary cells collected from living organisms or established cell lines. In the production method of the present invention, somatic cells at various stages of differentiation, such as terminally differentiated somatic cells, somatic cells on the way to terminal differentiation, or somatic cells that have been reprogrammed and have acquired pluripotency are used. can be done.
  • any somatic cells such as hematopoietic cells (various lymphocytes, macrophages, dendritic cells, bone marrow cells, etc.), organ-derived cells (hepatocytes, splenocytes , pancreatic cells, kidney cells, lung cells, etc.), muscle tissue cells (skeletal muscle cells, smooth muscle cells, myoblasts, cardiomyocytes, etc.), fibroblasts, nerve cells, osteoblasts, chondrocytes, endothelium cells, stromal cells, adipocytes (white adipocytes, etc.), embryonic stem cells (ES cells), and the like.
  • the production method of the present invention can also be applied to progenitor cells of these cells and cancer cells.
  • fibroblasts can be used.
  • sources of the above somatic cells include, but are not limited to, humans, mammals other than humans, and animals other than mammals (birds, reptiles, amphibians, fish, etc.).
  • Preferred sources of somatic cells are humans and mammals other than humans, with humans being particularly preferred.
  • growth factor-producing cells are produced by the production method of the present invention for the purpose of administration to humans, it is preferable to use somatic cells collected from a donor whose histocompatibility antigen type matches or is similar to that of the recipient. can. Somatic cells collected from the recipient themselves may be subjected to production of growth factor-producing cells by the production method of the present invention.
  • TGF- ⁇ (transforming growth factor- ⁇ ) includes TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 2, TGF- Three types of ⁇ 3 exist and are produced by almost all cells. TGF- ⁇ is involved in a wide variety of cellular functions such as regulation of cell proliferation, transformation, differentiation, development, and apoptosis, including suppression of proliferation of many cells including epithelial cells.
  • ALK5 is also called TGF- ⁇ 1 receptor.
  • ALK5 is a serine/threonine kinase that forms a heterodimeric complex with type II TGF ⁇ receptors when bound to TGF ⁇ , transducing the TGF ⁇ signal from the cell surface to the cytoplasm.
  • the TGF- ⁇ inhibitor is preferably an ALK5 inhibitor.
  • ALK5 inhibitor refers to culture conditions that can inhibit ALK5, and the means is not particularly limited, and any means that can inhibit ALK5 can be used. can.
  • substances that directly act on ALK5 to inhibit its function eg, anti-ALK5 antibodies and other drugs
  • drugs that suppress the production of ALK5 itself, and the like can be used.
  • ALK5 can also be inhibited by inhibiting signal transduction involving ALK5 upstream thereof.
  • the following compounds can be used as ALK5 inhibitors.
  • SB431542 or Repsox can be used.
  • ALK5 Inhibitor manufactured by Wako Pure Chemical Industries
  • Repsox manufactured by abcam
  • the concentration of the ALK5 inhibitor may be determined as appropriate and is not particularly limited, but can be used, for example, in the range of 0.2 ⁇ mol/L to 20 ⁇ mol/L, preferably 0.5 ⁇ mol/L to 10 ⁇ mol/L.
  • BMP Inhibitor BMP (Bone Morphogenetic Protein) is a growth factor belonging to the TGF- ⁇ superfamily, and controls embryonic and tissue development, cell differentiation, cell death, and the like. . BMPs bind to type I receptors and type II receptors on the cell membrane to form heterotetramers and transduce BMP signals into the nucleus via phosphorylation of the transcription factor SMAD. Most BMP inhibitors inhibit the phosphorylation of SMAD by ALK (Activin receptor-like kinase)-2,3,6, a type I receptor activated by BMP binding.
  • ALK Activin receptor-like kinase
  • ALK2 is an ALK family member receptor serine/threonine kinase and is located upstream in the signal transduction pathway involving SMAD proteins, particularly SMAD1/5/8. Endoglin reduces prostate cancer cell motility through activation of the ALK2-Smad1 pathway.
  • the ALK2 gene is the major gene involved in fibrodysplasia ossificans progressis (FOP), a rare autosomal dominant congenital disorder characterized by progressive ectopic bone formation in muscle tissue.
  • FOP fibrodysplasia ossificans progressis
  • ALK3 is a transmembrane serine/threonine kinase family member.
  • the ALK3 gene acts as a faint susceptibility gene in PTEN (phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10) mutation-negative Cowden's disease.
  • PTEN phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10 mutation-negative Cowden's disease.
  • ALK3 trafficking plays an important role in FOP pathogenesis and is also involved in human T cell differentiation.
  • BMP inhibitor refers to culture conditions that can inhibit the BMP signaling pathway, and the means is not particularly limited, and any means that can inhibit the BMP signaling pathway. means can be used.
  • substances that act directly on BMPs and BMP receptors to inhibit their functions eg, anti-BMP antibodies and other drugs
  • drugs that suppress their expression can be used.
  • the BMP signaling pathway can also be inhibited by inhibiting the expression of SMAD transcription factors located downstream of BMP-mediated signal transduction and their post-translational modifications.
  • somatic cells are cultured in the presence of BMP inhibitors, and among BMP inhibitors, it is preferable to culture somatic cells in the presence of ALK2 ⁇ 3 inhibitors.
  • ALK2 ⁇ 3 inhibitors refers to culture conditions that can inhibit both ALK2 and 3, and the means is not particularly limited, and both ALK2 and 3 can be inhibited. Any means that can be used can be used.
  • the present invention utilizes substances that directly act on both ALK2 and 3 to inhibit their functions (e.g., anti-ALK2/3 antibodies and other drugs), drugs that suppress the production of ALK2 and 3 themselves, and the like. can be done. Alternatively, if both ALK2 and 3 can be inhibited, then signal transduction involving ALK2 and 3 may be inhibited upstream thereof.
  • the BMP inhibitor or ALK2/3 inhibitor that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it can exhibit its function, and examples include the following compounds. Preferred are LDN193189 and Dorsomorphin, which are ALK2/3 inhibitors.
  • Dorsomorphin also known as AMPK Inhibitor, Compound C
  • DMH1 CAS No.: 1206711-16-1
  • K02288 CAS No.: 1431985-92-0
  • LDN212854 CAS No.: 1432597-26-6
  • LDN193189 HCl CAS No.: 1062368-62-0
  • ML347 CAS No.: 1062368-49-3
  • LDN214117 CAS No.: 1627503-67-6)
  • the concentration of the BMP inhibitor or ALK2 ⁇ 3 inhibitor may be determined as appropriate and is not particularly limited, but for example, 0.1 ⁇ mol/L to 10 ⁇ mol/L, preferably 0.5 ⁇ mol/L to 5 ⁇ mol/L. can be used in the range of
  • p53 is one of the most important tumor suppressor genes, suppressing cell proliferation and playing an important role in cancer suppression. It also activates target genes in response to various stresses and serves as a starting point for cell cycle arrest, apoptosis, DNA repair, cell senescence, and the like.
  • a p53 inhibitor refers to culture conditions that can inhibit p53, and the means is not particularly limited, and any means that can inhibit p53 can be used. can.
  • substances that directly act on p53 to inhibit its function eg, anti-p53 antibodies and other drugs
  • drugs that suppress the production of p53 itself, and the like can be used.
  • p53 can also be inhibited by inhibiting signal transduction involving p53 upstream thereof.
  • the p53 inhibitor that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it can exhibit its function.
  • the following compounds can be used.
  • pifithrin or pifithrin- ⁇ can be used.
  • Pifithrin- ⁇ (CAS No.: 511296-88-1) Pifithrin- ⁇ (CAS No.: 64984-31-2) NSC66811 (CAS No.: 6964-62-1) Nultin-3 (CAS No.: 548472-68-0)
  • the concentration of the p53 inhibitor may be determined as appropriate, and is not particularly limited. .
  • cAMP inducer cAMP (cyclic adenosine monophosphate) is a substance involved in various intracellular signal transductions as a second messenger. cAMP is produced in cells by cyclization of adenosine triphosphate (ATP) by adenylate cyclase.
  • ATP adenosine triphosphate
  • a cAMP inducer refers to culture conditions capable of inducing cAMP, and the means is not particularly limited, for example, any means capable of increasing the intracellular cAMP concentration. can be used.
  • Substances that can directly act on and induce adenylate cyclase, an enzyme involved in the production of cAMP, substances that can promote the expression of adenylate cyclase, substances that inhibit phosphodiesterase, an enzyme that degrades cAMP, etc. can be used as a means of increasing intracellular cAMP concentrations. It is also possible to use dibutyryl cAMP, a structural analogue of cAMP, which has the same action as cAMP in cells.
  • the cAMP inducer that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it can exhibit its function. 2002-348243) and the following compounds. Forskolin can preferably be used.
  • Isoproterenol (CAS No.: 7683-59-2)
  • NKH477 (CAS No.: 138605-00-2)
  • PACAP1-27 (CAS No.: 127317-03-7)
  • PACAP1-38 (CAS No.: 137061-48-4)
  • the concentration of the cAMP inducer may be determined as appropriate, and is not particularly limited. .
  • GSK3 GSK3 Inhibitor GSK3 (glycogen synthase kinase-3) was found as a protein kinase that phosphorylates and inactivates glycogen synthase. In mammals, GSK3 is divided into two isoforms, 51 kDa ⁇ (GSK3 ⁇ ) and 47 kDa ⁇ (GSK3 ⁇ ). GSK3 has the activity of phosphorylating various proteins, and is involved not only in glycogen metabolism but also in physiological phenomena such as cell division and cell proliferation.
  • GSK3 inhibitor refers to culture conditions that can inhibit GSK3, and the means is not particularly limited, and substances that inhibit the activity of GSK3, such as anti-GSK3 antibodies and GSK3 Means of inhibiting GSK3 signaling, such as inhibitors, are available.
  • the means for promoting phosphorylation described above can also be used to inhibit GSK3 signaling.
  • the GSK3 inhibitor that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it can exhibit its function, and examples include the following compounds.
  • CHIR99021 can be mentioned.
  • BIO ((2′Z,3′E)-6-bromoindirubin-3′-oxime) (CAS No.: 667463-62-9) Ken Paullone (CAS No.: 142273-20-9) A1070722 (CAS No.: 1384424-80-9) SB216763 (CAS No.: 280744-09-4) CHIR98014 (CAS No.: 556813-39-9) TWS119 (CAS No.: 601514-19-6) Tideglusib (CAS No.: 865854-05-3) SB415286 (CAS No.: 264218-23-7) Bikini (CAS No.: 188011-69-0) IM-12 (CAS No.: 1129669-05-1) 1-Azaken Paullone (CAS No.: 676596-65-9) LY2090314 (CAS No.: 603288-22-8) AZD1080 (CAS No.: 612487-72-6) AZD2858 (CAS No.: 486424-20-8) AR-
  • the concentration of the GSK3 inhibitor may be determined as appropriate, and is not particularly limited. can be done.
  • Erk is a subfamily of MAPKs that is activated by EGF (epidermal growth factor), serum stimulation or oxidative stress. It is divided into ERK5, ERK7 and ERK8. Binding of a ligand to a tyrosine kinase receptor such as epidermal growth factor receptor (EGFR) signals flow, resulting in phosphorylation and activation of the TEY motif present in the activation loop of Erk.
  • EGF epidermal growth factor receptor
  • Erk inhibitor refers to culture conditions that can inhibit Erk, and the means is not particularly limited. Erk signal inhibitory means such as inhibitors can be utilized. Means for inhibiting enzymes involved in Erk activation, such as Erk kinase and Erk kinase kinase, can also be used for Erk inhibition.
  • the Erk inhibitor that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it can exhibit its function, but the following compounds can be mentioned, for example. PD0325901 can be mentioned preferably.
  • the concentration of the Erk inhibitor may be determined as appropriate, and is not particularly limited. can be done.
  • histone-associated components means substantially no histone-associated components. It shall include the case where it exists in Components involved in histones include, for example, histone deacetylase inhibitors (eg, valproic acid) and the like. Without the use of histone deacetylase inhibitors, which are said to promote reprogramming by nuclear reprogramming factors, there is a lower risk of inducing pluripotent cells that could undergo unintended differentiation.
  • Cultivation of somatic cells in the production method of the present invention selects the medium, temperature, and other conditions according to the type of somatic cells used, and the various inhibitors (and, in some cases, inducers) agent or activator).
  • Media can be selected from known media or commercially available media.
  • common media MEM minimum essential medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • DMEM / F12 or a medium modified thereof
  • appropriate components serum, proteins, amino acids, sugars, vitamins, Fatty acids, antibiotics, etc.
  • growth factor-producing cells are produced from somatic cells.
  • Brain-derived neurotrophic factor (BDNF; Brain-Derived Neurotrophic Factor), glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), cAMP, ascorbic acid, ascorbic acid-2-phosphate, etc.
  • BDNF Brain-derived neurotrophic factor
  • GDNF glial cell-derived neurotrophic factor
  • cAMP ascorbic acid, ascorbic acid-2-phosphate, etc.
  • somatic cells may be cultured in the presence of the above substances.
  • the culture conditions general cell culture conditions may be selected. Conditions such as 37° C. and 5% CO 2 are exemplified. During culturing, it is preferable to replace the medium at appropriate intervals (preferably once every 1 to 7 days, more preferably once every 3 to 4 days). When the production method of the present invention is carried out using fibroblasts as a material, growth factor-producing cells appear in 4 days to 1 week under conditions of 37° C. and 5% CO 2 .
  • the culture period is suitably in the range of 4 to 16 days, preferably in the range of 5 to 12 days, more preferably in the range of 7 to 9 days. .
  • somatic cells that are easy to culture it is also possible to convert somatic cells that have been increased in number in advance into growth factor-producing cells. Therefore, scaled-up production of growth factor-producing cells is also easy.
  • Cell culture vessels such as plates, dishes, cell culture flasks, and cell culture bags can be used for culturing somatic cells.
  • a bag having gas permeability is suitable. Larger fermenters may be used when large numbers of cells are required. Cultivation can be performed in either an open system or a closed system, but when the purpose is to administer the obtained growth factor-producing cells to humans, etc., the culture is preferably performed in a closed system.
  • growth factor-producing cells can be produced from somatic cells in a single step by culturing somatic cells in a medium containing the various inhibitors described above.
  • a growth factor-producing cell produced by the production method of the present invention is also within the scope of the present invention (hereinafter referred to as "the present cell”).
  • the cells of the invention produce growth factors. Examples of the growth factors include HGF (hepatocyte growth factor), NGF (nerve growth factor), VEGF (vascular endothelial growth factor), EGF (epidermal growth factor) and the like.
  • the cells of the present invention can be cells that produce not only growth factors but also anti-inflammatory factors. Examples of such anti-inflammatory factors include IL-1RN.
  • the cells of the present invention can be produced by direct induction or direct conversion from somatic cells.
  • the cells of the present invention can be confirmed, for example, by morphological changes in the cells. Since growth factor-producing cells take characteristic morphologies depending on the cell type, the presence of growth factor-producing cells can be known by comparing the morphology of the cells before and after culturing. Growth factor-producing cells can also be identified by detecting molecules characteristic of growth factor-producing cells, such as enzymes, receptors, or low-molecular-weight compounds.
  • Molecules characteristic of growth factor-producing cells include ⁇ 3-tubulin, synapsin I, vesicular glutamate transporter (vGULT), microtubule-associated protein (MAP) 2, ⁇ -amino Examples include, but are not limited to, butyric acid (GABA), tyrosine hydroxylase, and the like.
  • a quarantine method can be used to detect the above molecules, but protein molecules may be detected by quantifying the amount of their mRNA.
  • Antibodies that recognize molecules characteristic of growth factor-producing cells are also useful in isolating and purifying the cells of the present invention.
  • the cells of the present invention can be used for treating diseases. Among them, it can be preferably applied to diseases whose prognosis can be improved by promotion of wound healing. For example, it is useful for treating nervous system diseases, liver diseases, and skin diseases.
  • the cells of the present invention may be directly transplanted into the affected area, or, as described below, the cells of the present invention can be used to produce cell sheets or pharmaceutical compositions. It may be applied to the affected area in the form of a pharmaceutical composition.
  • the above nervous system diseases include spinal cord injury, cerebrovascular disorders (cerebral infarction, etc.), Parkinson's disease, Alzheimer's disease, amyotrophic lateral sclerosis, and the like.
  • liver diseases include fatty liver, liver failure, hepatitis, and the like.
  • the above skin diseases include burns, bedsores, and the like.
  • the cells of the present invention can be used more preferably in the treatment of spinal cord injuries, burns, and bedsores among the above diseases.
  • the coated substrate is coated with a temperature-responsive substrate by a conventional method, and the coated substrate is It may be produced by culturing the cells of the present invention in .
  • a cell culture substrate grafted with a temperature-responsive polymer is suitable.
  • the material of the cell culture substratum is not particularly limited, but the cell adhesion surface can be, for example, polystyrene, polycarbonate, polymethylmethacrylate, or a combination of two or more of these. Among them, polystyrene is preferred.
  • the temperature-responsive polymer used in the cell sheet of the present invention may be either a homopolymer or a copolymer.
  • Usable monomers include, for example, acrylamide, N-alkyl-substituted acrylamide derivatives, N,N-dialkyl-substituted acrylamide derivatives, methacrylamide, N-alkyl-substituted methacrylamide derivatives, N,N-dialkyl-substituted methacrylamide derivatives, vinyl ether derivatives. can be mentioned. In the case of copolymers, any two or more of these can be used.
  • the method of coating the surface of the coated substrate with the temperature-responsive substrate is not particularly limited.
  • the cell culture substrate and the monomer or polymer are subjected to electron beam irradiation (EB), electromagnetic wave irradiation ( ⁇ -ray irradiation, ultraviolet irradiation, etc.), plasma treatment, corona treatment, or organic polymerization reaction, or
  • EB electron beam irradiation
  • ⁇ -ray irradiation ⁇ -ray irradiation, ultraviolet irradiation, etc.
  • plasma treatment corona treatment
  • organic polymerization reaction or
  • the substrate surface can be coated by physical adsorption such as coating or kneading.
  • glass glass, modified glass, polystyrene, polymethyl methacrylate, etc., which are usually used for cell culture, are suitable. ) can be widely used.
  • the temperature of the culture substrate to which the cultured cells are attached is adjusted to the upper critical melting temperature (UCST) or higher or lower critical solution temperature (LCST) or lower. Due to the temperature change, the coating polymer changes from a hydrophobic state to a hydrophilic state, so that the cultured cells can be peeled off while the cell-cell adhesion is maintained, and the sheet-like cell tissue can be recovered. .
  • UCST critical melting temperature
  • LCST critical solution temperature
  • the growth factor-producing cells are mixed with a pharmaceutically acceptable carrier by a conventional method to obtain a formulation suitable for administration to an individual. good.
  • carriers include physiological saline, distilled water for injection made isotonic with the addition of glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservation agents eg, antioxidants and the like.
  • antioxidants and the like may be added.
  • the cells of the present invention can also be combined with other cells or components that are effective in exhibiting the functions of the growth factor-producing cells and improving engraftment to form a composition.
  • the cells of the present invention can also be used for screening drug candidate compounds that act on growth factor-producing cells and for safety evaluation of drug candidate compounds. According to the production method of the present invention, a large number of growth factor-producing cells can be obtained in a single operation, so reproducible research results can be obtained without being affected by cell lot differences. .
  • HGF Growth factors
  • IL-1RN anti-inflammatory factors
  • Suitable means for the extraction and isolation include conventional methods.
  • a freeze-thaw method in which the suspension is rapidly frozen in liquid nitrogen and then thawed
  • an osmotic shock method in which the cells of the present invention are suspended in a hypotonic solution such as sterilized water, and a suspension of the cells of the present invention.
  • Examples include an ultrasonic treatment method in which a liquid is irradiated with high frequency waves to destroy cell membranes, a mechanical method in which the cells of the present invention are pulverized and mashed, and an enzymatic digestion method in which the cells of the present invention are treated with enzymes.
  • composition of the present invention is a composition for producing growth factor-producing cells by directly inducing differentiation from somatic cells, comprising TGF- ⁇ It is characterized by containing at least one selected from the group consisting of inhibitors, p53 inhibitors, and cAMP inducers.
  • the cell of the present invention can be produced.
  • the composition of the invention it is possible to produce the cells of the invention by direct induction or direct conversion from somatic cells.
  • the composition of the present invention may comprise a step of culturing somatic cells in the presence of at least four of a TGF- ⁇ inhibitor, a BMP inhibitor, a p53 inhibitor, and a cAMP inducer. Furthermore, at least one selected from the group consisting of TGF- ⁇ inhibitors, p53 inhibitors, and cAMP inducers, or the above four, may contain a GSK3 inhibitor and an Erk inhibitor.
  • a GSK3 inhibitor and an Erk inhibitor By using the composition of the present invention containing the above 4 agents or 6 agents including a GSK3 inhibitor and an Erk inhibitor, not only growth factors but also anti-inflammatory factors (eg, IL-1RN) can be obtained. Producing cells of the present invention can be produced.
  • the TGF- ⁇ inhibitor is preferably an ALK5 inhibitor
  • the BMP inhibitor is preferably an ALK2/3 inhibitor.
  • the ALK5 inhibitor is SB431542 (CAS No.: 301836-41-9) and/or Lepsox (CAS No.: 446859-33-2)
  • the ALK2/3 inhibitor is LDN193189 (CAS No.: 1062368-24-4) and/or Dorsomorphin (CAS No.: 866405-64-3) are more preferred.
  • cAMP inducer forskolin (CAS No.: 66428-89-5), GSK3 inhibitor CHIR99021 (CAS No.: 252917-06-9), Erk inhibitor PD0325901 (CAS No.: 391210-10 -9), or the p53 inhibitor is more preferably pifithrin- ⁇ (CAS No.: 63208-82-2).
  • composition of the present invention may contain at least one of the above inhibitors, inducers, and the like, and may optionally further contain other inhibitors, inducers, and the like, if necessary.
  • Each of the above inhibitors and inducers may be used alone or in combination of two or more.
  • Some of the above specific inhibitors and the like may have two or more types of inhibitory actions, etc. In that case, one can be considered to contain a plurality of inhibitors and the like.
  • Specific examples and preferred examples of the above-described inhibitors and inducers are the same as those described above.
  • composition of the present invention can be used as a composition for producing growth factor-producing cells from somatic cells.
  • composition of the present invention can also be used as a medium for producing growth factor-producing cells from somatic cells.
  • the medium used for the production of growth factor-producing cells from somatic cells is a basal medium prepared by mixing components necessary for cell culture, and an ALK5 inhibitor, a type of TGF- ⁇ inhibitor, is added as an active ingredient. and BMP inhibitors (preferably ALK2 3 inhibitors), or in addition to these, any three or more selected from a group of four consisting of cAMP inducers, GSK3 inhibitors, Erk inhibitors, and p53 inhibitors
  • An example can be a medium that has been subjected to
  • the above-mentioned active ingredients may be contained at concentrations effective for production of growth factor-producing cells, and the concentrations can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • the basal medium can be selected from known media or commercially available media. For example, common media such as MEM (Minimum Essential Medium), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), DMEM/F12, or modified media thereof can be used as the basal medium.
  • the medium may be further supplemented with the known medium components described above, such as serum, proteins (albumin, transferrin, growth factors, etc.), amino acids, sugars, vitamins, fatty acids, antibiotics, and the like. good.
  • the medium may further include Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF), Glial cell-Derived Neurotrophic Factor (GDNF), cAMP, ascorbic acid, Substances effective for inducing differentiation into growth factor-producing cells, such as ascorbic acid-2-phosphate, may be added.
  • BDNF Brain-Derived Neurotrophic Factor
  • GDNF Glial cell-Derived Neurotrophic Factor
  • cAMP ascorbic acid
  • Substances effective for inducing differentiation into growth factor-producing cells such as ascorbic acid-2-phosphate, may be added.
  • ALK5 inhibitor and BMP inhibitor which are a kind of TGF- ⁇ inhibitor, or cAMP inducer, GSK3 inhibitor, Erk inhibitor in addition to these , and a p53 inhibitor, growth factor-producing cells can also be produced in vivo from somatic cells.
  • ALK5 inhibitors and BMP inhibitors which are a kind of TGF- ⁇ inhibitors, or, in addition to these, cAMP inducers, GSK3 inhibitors, Erk
  • a method for producing growth factor-producing cells in vivo from somatic cells comprising administering to a living body a composition containing any three or more selected from the group consisting of an inhibitor and a p53 inhibitor. be done. Preferred combinations of the inhibitors and the like to be administered to the living body are as described herein.
  • Examples of living organisms include humans, mammals other than humans, and animals other than mammals (birds, reptiles, amphibians, fish, etc.), with humans being particularly preferred.
  • ALK5 inhibitors and BMP inhibitors preferably ALK2 3 inhibitors
  • BMP inhibitors which are a kind of TGF- ⁇ inhibitors, or cAMP inducers
  • GSK3 inhibitors a kind of TGF- ⁇ inhibitors, or cAMP inducers
  • GSK3 inhibitors a kind of TGF- ⁇ inhibitors, or cAMP inducers
  • GSK3 inhibitors a kind of TGF- ⁇ inhibitors, or cAMP inducers
  • GSK3 inhibitors a kind of TGF- ⁇ inhibitors
  • Erk inhibitors Erk inhibitors
  • p53 inhibitors in addition to these
  • Example 1 Production of growth factor-producing cells (1) Human fibroblasts Table 1 shows background information on two human fibroblasts used as materials.
  • a nerve cell culture medium containing seven low-molecular-weight compounds shown in Table 2 was prepared.
  • This neuronal cell culture medium is DMEM/F12 containing 1% (v/v) N2 supplement (manufactured by Lifetech) and NeurobasalMedium (manufactured by Lifetech) containing 2% (v/v) B27 supplement (manufactured by Lifetech). Co., Ltd.) was mixed at a ratio of 1:1.
  • the medium of the dish of human fibroblasts cultured for 2 days was replaced with this neuronal cell medium, and culture was continued by exchanging the medium every 2 or 3 days under conditions of 37° C. and 5% CO 2 .
  • Human fibroblasts cultured for 2 days were replaced with DMEM and the cells cultured in the neuron medium, and the cells cultured in the neuron medium containing 7 types of low-molecular-weight compounds were used as NM, and the cells cultured in the neuron medium containing 7 kinds of low-molecular-weight compounds were used as CiN.
  • cytokine-secreting cells Culture supernatants (for 24 hours) of DMEM and NM and CiN induced for 8 days were collected, and secreted amounts of cytokines HGF and IL-1RN were measured by ELISA.
  • the ELISA kit used for measurement is as follows. AuthentiKine TM Human HGF ELISA Kit (manufactured by Proteintech, Cat No# PGI-KE00168-1) Human IL-1ra/IL-1F3 Quantikine ELISA Kit (R&D, Cat No#DRA00B)
  • DMEM and NM and CiN induced for 8 days are shown in Fig. 1, respectively.
  • the results of measurement of HGF and IL-1RN secretion levels are shown in FIGS. 2 and 3, respectively. It can be seen that CiN secretes both HGF and IL-1RN.
  • cytokine-secreting cells Culture supernatants (for 24 hours) of NM and CiN induced for 0, 4, 8, 12 and 16 days were collected, and secreted amounts of cytokines HGF and IL-1RN were measured by ELISA.
  • the ELISA kit used for measurement is as follows. AuthentiKine TM Human HGF ELISA Kit (manufactured by Proteintech, Cat No# PGI-KE00168-1) Human IL-1ra/IL-1F3 Quantikine ELISA Kit (R&D, Cat No#DRA00B)
  • Fig. 4 shows how NM and CiN are induced.
  • 5 and 6 show the results of measuring the secretion levels of HGF and IL-1RN, respectively. It can be seen that CiN secretes both HGF and IL-1RN particularly well around day 8 or later.
  • Example 2 (1) Direct induction of cytokine-secreting cells from human fibroblasts (2) Human fibroblast KA45 shown in Table 1 was seeded in a 35 mm dish or 6-well plate at 1 ⁇ 10 5 cells, and 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 ⁇ g/mL streptomycin were added to the DMEM highglucose culture medium, and 37 °C and 5% CO2 for 2 days. Each cell was cultured within the range of passage number (Passage) shown in Table 1.
  • Passage passage number
  • a nerve cell medium containing seven low-molecular-weight compounds shown in Table 2 or Table 3 and a nerve cell medium lacking each of these seven low-molecular-weight compounds were prepared.
  • This neuronal cell culture medium is DMEM/F12 containing 1% (v/v) N2 supplement (manufactured by Lifetech) and NeurobasalMedium (manufactured by Lifetech) containing 2% (v/v) B27 supplement (manufactured by Lifetech). Co., Ltd.) was mixed at a ratio of 1:1.
  • the medium of the dish of human fibroblasts cultured for 2 days was replaced with this neuronal cell medium, and culture was continued by exchanging the medium every 2 or 3 days under conditions of 37° C. and 5% CO 2 .
  • FIGS. 9 and 10 show the measurement results of HGF secretion
  • FIGS. 11 and 12 show the measurement results of IL-1RN secretion, respectively.
  • HGF is well secreted in all examples, but all examples that well secrete IL-1RN are TGF- ⁇ inhibitors, BMP inhibitors, p53 inhibitors, and at least four cAMP inducers. This was the case of induction using seeds.
  • Example 3 (1) Direct induction of cytokine-secreting cells from human fibroblasts (3) Human fibroblast KA45 shown in Table 1 was seeded in a 35 mm dish or 6-well plate at 1 ⁇ 10 5 cells, and 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 ⁇ g/mL streptomycin were added to the DMEM highglucose culture medium, and 37 °C and 5% CO2 for 2 days. Each cell was cultured within the range of passage number (Passage) shown in Table 1. A nerve cell medium containing the seven low-molecular-weight compounds shown in Table 2 and a nerve cell medium lacking multiple of these seven low-molecular-weight compounds were prepared. Table 6 shows the combinations of low-molecular-weight compounds used.
  • Passage passage number
  • This neuronal cell culture medium is DMEM/F12 containing 1% (v/v) N2 supplement (manufactured by Lifetech) and NeurobasalMedium (manufactured by Lifetech) containing 2% (v/v) B27 supplement (manufactured by Lifetech). Co., Ltd.) was mixed at a ratio of 1:1.
  • the medium of the dish of human fibroblasts cultured for 2 days was replaced with this neuronal cell medium, and culture was continued by exchanging the medium every 2 or 3 days under conditions of 37° C. and 5% CO 2 .
  • Example 3-1 to 3-14 For each cell induced for 8 days (Examples 3-1 to 3-14), the measurement results of HGF secretion are shown in FIG. 13, and the measurement results of IL-1RN secretion are shown in FIG. All examples secreted HGF, but all examples that also secreted IL-1RN used at least four of TGF- ⁇ inhibitor, BMP inhibitor, p53 inhibitor, and cAMP inducer. was induced by Both HGF and IL-1RN were well secreted when TGF- ⁇ inhibitor, BMP inhibitor, p53 inhibitor, cAMP inducer, GSK3 inhibitor and Erk inhibitor were used.
  • cells producing growth factors can be obtained from somatic cells (especially terminally differentiated somatic cells or fibroblasts) for a short period of time.
  • somatic cells especially terminally differentiated somatic cells or fibroblasts
  • the cells according to the present invention are useful in medical treatments related to regeneration of spinal cord injuries, burns, pressure ulcers, etc. and promotion of wound healing.

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Abstract

体細胞から増殖因子産生細胞を速やかに誘導する新たな方法、即ち、体細胞から増殖因子産生細胞を速やかに製造することができる新たな製造方法を提供することを主な課題とする。　本発明として、例えば、ＴＧＦ－β阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤からなる群から選択される少なくともいずれか１種の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、増殖因子産生細胞の製造方法や、かかる製造方法により得られる増殖因子産生細胞、かかる増殖因子産生細胞から抽出単離する工程を含む、増殖因子ないし抗炎症因子の製造方法を挙げることができる。　本発明により得られた増殖因子産生細胞は、再生医療などにおいて有用である。

Description

増殖因子産生細胞及びその製造方法
（関連出願の相互参照）
　本出願は、２０２２年３月１日に日本国特許庁に出願された日本国出願番号第２０２２－３０９０８号の利益を主張するものである。当該日本国出願は、その出願書類（明細書、特許請求の範囲、図面、要約書）の全体が本明細書に明示されているかのように全ての目的で参照により本明細書に援用される。
　本発明は、主としていわゆる低分子化合物（例えば、分子量が１０００以下の化合物）により体細胞から増殖因子産生細胞を製造する方法、及びかかる製造方法によって製造される増殖因子産生細胞に関するものである。本発明はさらに、当該増殖因子産生細胞から増殖因子を製造する方法、及び当該増殖因子産生細胞を製造する方法のために使用することができる組成物に関するものである。
　近年の細胞関連研究の発展、特に多能性細胞に関する研究の発展により、治療用細胞を個体への移植に利用可能な品質及び量において入手することが可能になりつつある。幾つかの疾患については、治療に有効な細胞を患者に適用する試みが開始されている。例えば、非特許文献１では、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）由来神経前駆細胞の移植による、亜急性脊髄損傷患者への再生医療の試みが検討されている。
　一方、増殖因子（growth factor）の一種であるＨＧＦ（肝細胞増殖因子：Hepatocyte Growth Factor）は、当初は肝細胞の増殖因子として発見されたが、近年の多数の研究により、中枢神経系においても血管新生作用、神経栄養作用を有していることが見出されている。例えば、非特許文献２では、霊長類脊髄損傷モデルに対しＨＧＦ投与を行い、有意に四股の運動機能回復が促進されたことが報告されている。また、特許文献１には、ＨＧＦ蛋白質を有効成分とする脊髄損傷治療剤が開示されている。
 
国際公開第２００８／１０５５０７号パンフレット
O.Tsuji et al., Stem Cells. 2019;37(1):6-13. K.Kitamura et al., PloS one. 2011;6(11):e27706.
　上記のような増殖因子を産生する細胞を、一般の体細胞から簡易迅速に直接誘導又は直接転換することができれば、再生医療用途として有望であると考えられるが、そのような細胞の作製方法は知られていない。
　本発明は、遺伝子導入を必要とせず、体細胞から増殖因子産生細胞を安全かつ速やかに誘導又は転換する新たな方法を提供することを主な課題とする。また本発明は、再生医療等において有用な増殖因子産生細胞を提供することも課題とする。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、ＴＧＦ－β阻害剤、ｐ５３阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤等を用いることによって、体細胞から増殖因子産生細胞へと速やかに直接転換することができることを見出し、本発明を完成するに到った。
　本発明として、例えば、下記のものを挙げることができる。
［１］体細胞から直接分化誘導することにより増殖因子産生細胞を製造する方法であって、ＴＧＦ－β阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤からなる群から選択される少なくともいずれか１種の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、増殖因子産生細胞の製造方法。
［２］前記工程が、少なくともＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤の４種の存在下で体細胞を培養する工程である、上記［１］に記載の増殖因子産生細胞の製造方法。
［３］前記工程が、少なくともＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＧＳＫ３阻害剤、及びＥｒｋ阻害剤の６種の存在下で体細胞を培養する工程である、上記［１］又は［２］に記載の増殖因子産生細胞の製造方法。
［４］前記ＴＧＦ－β阻害剤がＡＬＫ５阻害剤であり、前記ＢＭＰ阻害剤がＡＬＫ２・３阻害剤である、上記［２］又は［３］に記載の増殖因子産生細胞の製造方法。
［５］前記ＡＬＫ５阻害剤がＳＢ４３１５４２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３０１８３６－４１－９）若しくはレプソックス（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４４６８５９－３３－２）であるか、前記ＡＬＫ２・３阻害剤がＬＤＮ１９３１８９（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１０６２３６８－２４－４）であるか、前記ｐ５３阻害剤がピフィスリン－α（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６３２０８－８２－２）であるか、又は前記ｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリン（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６６４２８－８９－５）である、上記［１］～［４］のいずれか一項に記載の増殖因子産生細胞の製造方法。
［６］前記ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２５２９１７－０６－９）であるか、又は前記Ｅｒｋ阻害剤がＰＤ０３２５９０１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３９１２１０－１０－９）である、上記［３］～［５］のいずれか一項に記載の増殖因子産生細胞の製造方法。
［７］前記体細胞が終分化した体細胞である、上記［１］～［６］のいずれか一項に記載の増殖因子産生細胞の製造方法。
［８］前記体細胞が線維芽細胞である、上記［１］～［７］のいずれか一項に記載の増殖因子産生細胞の製造方法。
［９］上記［１］～［８］のいずれか一項に記載の増殖因子産生細胞の製造方法から製造される、増殖因子産生細胞。
［１０］増殖因子及び抗炎症因子を産生する、上記［９］に記載の増殖因子産生細胞。
［１１］前記増殖因子がＨＧＦであり、前記抗炎症因子がＩＬ－１ＲＮ（Interleukin-1 receptor antagonist：インターロイキン－１受容体アンタゴニスト）である、上記［１０］に記載の増殖因子産生細胞。
［１２］上記［９］～［１１］のいずれか一項に記載の増殖因子産生細胞を含み、疾患の治療のために用いられる、細胞シート又は医薬組成物。
［１３］前記疾患が、脊髄損傷、熱傷、又は褥瘡である、上記［１２］に記載の細胞シート又は医薬組成物。
［１４］上記［９］に記載の増殖因子産生細胞又はその分泌物から増殖因子を抽出単離する工程を含む、増殖因子の製造方法。
［１５］上記［１０］若しくは［１１］に記載の増殖因子産生細胞又はその分泌物から増殖因子又は抗炎症因子を抽出単離する工程を含む、増殖因子又は抗炎症因子の製造方法。
［１６］体細胞から直接分化誘導することにより増殖因子産生細胞を製造するための組成物であって、ＴＧＦ－β阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤からなる群から選択される少なくともいずれか１種を含むことを特徴とする、増殖因子産生細胞を製造するための組成物。
［１７］少なくともＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤の４種を含む、上記［１６］に記載の組成物。
［１８］さらに、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤を含む、上記［１７］に記載の組成物。
［１９］前記ＴＧＦ－β阻害剤がＡＬＫ５阻害剤であり、前記ＢＭＰ阻害剤がＡＬＫ２・３阻害剤である、上記［１７］又は［１８］に記載の組成物。
［２０］前記ＡＬＫ５阻害剤がＳＢ４３１５４２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３０１８３６－４１－９）若しくはレプソックス（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４４６８５９－３３－２）であるか、前記ＡＬＫ２・３阻害剤がＬＤＮ１９３１８９（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１０６２３６８－２４－４）であるか、前記ｐ５３阻害剤がピフィスリン－α（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６３２０８－８２－２）であり、又は前記ｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリン（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６６４２８－８９－５）である、上記［１６］～［１９］のいずれか一項に記載の組成物。
［２１］前記ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２５２９１７－０６－９）であるか、又は前記Ｅｒｋ阻害剤がＰＤ０３２５９０１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３９１２１０－１０－９）である、上記［１８］～［２０］のいずれか一項に記載の組成物。
 
　本発明によれば、体細胞（特に終分化した体細胞ないし線維芽細胞）から、増殖因子産生細胞ないし増殖因子又は抗炎症因子を短期間で製造することができる。本発明により得られた増殖因子産生細胞は、再生医療などにおいて有用である。
 
上図は、線維芽細胞Ａ４７Ｂ２２（ＤＭＥＭ）と同線維芽細胞由来のＮＭ、ＣｉＮ細胞（誘導８日目）における細胞の位相差画像を示す。下図は、ＫＡ４５についての同様の位相差画像を示す。 左図は、線維芽細胞Ａ４７Ｂ２２（ＤＭＥＭ）と同線維芽細胞由来のＮＭ、ＣｉＮ細胞（誘導８日目）におけるＨＧＦ分泌量を示す。右図は、線維芽細胞ＫＡ４５（ＤＭＥＭ）と同線維芽細胞由来のＮＭ、ＣｉＮ細胞（誘導８日目）におけるＨＧＦ分泌量を示す。いずれも、ＮＤはNot Detectedの略で、測定方法の検出限界以下であったことを示す。 左図は、線維芽細胞Ａ４７Ｂ２２（ＤＭＥＭ）と同線維芽細胞由来のＮＭ、ＣｉＮ細胞（誘導８日目）におけるＩＬ－１ＲＮ分泌量を示す。右図は、線維芽細胞ＫＡ４５（ＤＭＥＭ）と同線維芽細胞由来のＮＭ、ＣｉＮ細胞（誘導８日目）におけるＩＬ－１ＲＮ分泌量を示す。いずれも、ＮＤはNot Detectedの略で、測定方法の検出限界以下であったことを示す。 線維芽細胞Ａ４７Ｂ２２由来のＮＭ（Ａ４７Ｂ２２．ＣｉＮ）、ＣｉＮ細胞（Ａ４７Ｂ２２．ＣｉＮ）及び線維芽細胞ＫＡ４５由来の（ＫＡ４５．ＣｉＮ）、ＣｉＮ細胞（ＫＡ４５．ＣｉＮ）の誘導０、４、８、１２、１６日目における各細胞の位相差画像を示す。 線維芽細胞Ａ４７Ｂ２２由来のＮＭ（Ａ４７Ｂ２２．ＣｉＮ）、ＣｉＮ細胞（Ａ４７Ｂ２２．ＣｉＮ）及び線維芽細胞ＫＡ４５由来の（ＫＡ４５．ＣｉＮ）、ＣｉＮ細胞（ＫＡ４５．ＣｉＮ）の誘導０日目から誘導１６日目におけるＨＧＦ分泌量の推移を示す。 線維芽細胞Ａ４７Ｂ２２由来のＮＭ（Ａ４７Ｂ２２．ＣｉＮ）、ＣｉＮ細胞（Ａ４７Ｂ２２．ＣｉＮ）及び線維芽細胞ＫＡ４５由来の（ＫＡ４５．ＣｉＮ）、ＣｉＮ細胞（ＫＡ４５．ＣｉＮ）の誘導０日目から誘導１６日目におけるＩＬ－１ＲＮ分泌量の推移を示す。 実施例２－１～２－８として培養した線維芽細胞ＫＡ４５由来ＣｉＮ細胞（８種）（誘導８日目）の位相差画像を示す。 実施例２－９～２－１６として培養した線維芽細胞ＫＡ４５由来ＣｉＮ細胞（８種）（誘導８日目）の位相差画像を示す。 実施例２－１～２－８として培養した線維芽細胞ＫＡ４５由来ＣｉＮ細胞（８種）（誘導８日目）におけるＨＧＦ分泌量を示す。 実施例２－９～２－１６として培養した線維芽細胞ＫＡ４５由来ＣｉＮ細胞（８種）（誘導８日目）におけるＨＧＦ分泌量を示す。 実施例２－１～２－８として培養した線維芽細胞ＫＡ４５由来ＣｉＮ細胞（８種）（誘導８日目）におけるＩＬ－１ＲＮ分泌量を示す。ＮＤはNot Detectedの略で、測定方法の検出限界以下であったことを示す。 実施例２－９～２－１６として培養した線維芽細胞ＫＡ４５由来ＣｉＮ細胞（８種）（誘導８日目）におけるＩＬ－１ＲＮ分泌量を示す。ＮＤはNot Detectedの略で、測定方法の検出限界以下であったことを示す。 実施例３－１～３－１４として培養した線維芽細胞ＫＡ４５由来ＣｉＮ細胞（１４種）（誘導８日目）におけるＨＧＦ分泌量を示す。 実施例３－１～３－１４として培養した線維芽細胞ＫＡ４５由来ＣｉＮ細胞（１４種）（誘導８日目）におけるＩＬ－１ＲＮ分泌量を示す。ＮＤはNot Detectedの略で、測定方法の検出限界以下であったことを示す。
　以下、本発明について詳細に説明する。
１　増殖因子産生細胞の製造方法
　本発明に係る、増殖因子産生細胞の製造方法（以下、「本発明製造方法」という。）は、体細胞から直接分化誘導することにより増殖因子産生細胞を製造する方法であって、ＴＧＦ－β阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤からなる群から選択される少なくともいずれか１種の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする。本発明製造方法により、増殖因子（例えば、ＨＧＦ。）を産生する細胞を製造することができる。
　本発明製造方法における当該工程は、少なくともＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤の４種の存在下で体細胞を培養する工程を含むものとしてもよい。さらには、少なくともＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＧＳＫ３阻害剤、及びＥｒｋ阻害剤の６種の存在下で体細胞を培養する工程としてもよい。これら４種ないし６種の剤の存在下で体細胞を培養することにより、増殖因子のみならず抗炎症因子（例えば、ＩＬ－１ＲＮ。）をも産生する細胞を製造し得る。
　本発明製造方法において、ＴＧＦ－β阻害剤はＡＬＫ５阻害剤であることが好ましく、ＢＭＰ阻害剤はＡＬＫ２・３阻害剤であることが好ましい。また、本発明製造方法において、ＡＬＫ５阻害剤はＳＢ４３１５４２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３０１８３６－４１－９）及び／若しくはレプソックス（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４４６８５９－３３－２）、並びに／又はＡＬＫ２・３阻害剤はＬＤＮ１９３１８９（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１０６２３６８－２４－４）及び／若しくはドルソモルフィン（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８６６４０５－６４－３）であることがより好ましい。また、ｃＡＭＰ誘導剤はフォルスコリン（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６６４２８－８９－５）、ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２５２９１７－０６－９）、Ｅｒｋ阻害剤はＰＤ０３２５９０１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３９１２１０－１０－９）、又はｐ５３阻害剤はピフィスリン－α（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６３２０８－８２－２）であることがより好ましい。
　本発明製造方法においては、少なくとも上記いずれかの阻害剤や誘導剤等の組み合わせの存在下で体細胞を培養すればよく、必要に応じて、任意にさらに他の阻害剤や誘導剤等を存在させて体細胞を培養し増殖因子産生細胞を製造することができる。
　上記阻害剤や誘導剤は、それぞれにおいて、１種を用いても２種以上を併用してもよい。
　具体的な上記阻害剤等においては、２種類以上の阻害作用等を有するものもあり得るが、その場合、一つで複数の阻害剤等が存在しているとみなすことができる。
　本発明製造方法は、遺伝子導入を行う工程を含まないものとすることができる。ここで「遺伝子」とは、核酸塩基を複数含んだ化学構造を有し、遺伝情報の担持、転写、若しくは翻訳、又はこれらの阻害に関与し得る物質（分子又はその複合体）のことをいい、ＤＮＡ及びＲＮＡのいずれもが含まれる。また、「遺伝子導入」には、ウイルスベクター等によるＤＮＡの導入の他、ＲＮＡサイレンシング（ＲＮＡ干渉等）を目的としたＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ等）の導入等、外来の遺伝子を細胞内に導入する事象全般が含まれる。本発明製造方法によれば、遺伝子導入を行うことなく増殖因子産生細胞を誘導することができるため、予期しないゲノムの変異及び挿入、並びに腫瘍化等の可能性（危険性）を、非常に低いものとすることができる。
１．１　体細胞について
　生物の細胞は、体細胞と生殖細胞とに分類できる。本発明製造方法には、その出発材料として任意の体細胞を使用することができる。体細胞には特に限定はなく、生体から採取された初代細胞、又は株化された細胞の何れでもよい。本発明製造方法では、分化の種々の段階にある体細胞、例えば、終分化した体細胞、終分化への途上にある体細胞、又は初期化され多能性を獲得した体細胞を使用することができる。本発明製造方法に使用できる体細胞としては、任意の体細胞、例えば、造血系の細胞（各種のリンパ球、マクロファージ、樹状細胞、骨髄細胞等）、臓器由来の細胞（肝細胞、脾細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞等）、筋組織系の細胞（骨格筋細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、心筋細胞等）、線維芽細胞、神経細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、内皮細胞、間質細胞、脂肪細胞（白色脂肪細胞等）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等が挙げられる。また、これらの細胞の前駆細胞、癌細胞にも本発明製造方法を適用できる。好ましくは、線維芽細胞を使用することができる。
　上記の体細胞の供給源としては、ヒト、ヒト以外の哺乳動物、及び哺乳動物以外の動物（鳥類、爬虫類、両生類、魚類等）が例示されるが、これらに限定されるものではない。体細胞の供給源としては、ヒト、及びヒト以外の哺乳動物が好ましく、ヒトが特に好ましい。ヒトへの投与を目的として本発明製造方法により増殖因子産生細胞を製造する場合、好ましくは、レシピエントと組織適合性抗原のタイプが一致又は類似したドナーより採取された体細胞を使用することができる。レシピエント自身より採取された体細胞を本発明製造方法による増殖因子産生細胞の製造に供してもよい。
１．２　本発明に係る阻害剤等について
１．２．１　ＴＧＦ－β阻害剤
　ＴＧＦ－β（transforming growth factor-β、形質転換増殖因子β）には、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３の３種類が存在し、ほぼ全ての細胞から生産されている。ＴＧＦ－βは、上皮細胞をはじめ、多くの細胞の増殖を抑制するなど細胞増殖、形質転換、分化、発生、アポトーシスの制御等の多種多様な細胞機能に関与している。
　上記３種類のＴＧＦ－βにおいて、ＡＬＫ５は、ＴＧＦ－β１受容体とも称される。ＡＬＫ５は、ＴＧＦβに結合した際にＩＩ型ＴＧＦβ受容体とヘテロ二量体複合体を形成するセリン／スレオニンキナーゼであり、ＴＧＦβシグナルを細胞表面から細胞質へと伝達する。
　本発明製造方法において、ＴＧＦ－β阻害剤はＡＬＫ５阻害剤であることが好ましい。「ＡＬＫ５阻害剤の存在下」とは、ＡＬＫ５を阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＡＬＫ５を阻害することができる任意の手段を利用することができる。本発明には、ＡＬＫ５に直接作用してその機能を阻害する物質（例えば、抗ＡＬＫ５抗体やその他の薬剤）、ＡＬＫ５自体の産生を抑制する薬剤等を利用することができる。また、ＡＬＫ５が関わるシグナル伝達をその上流で阻害することによってもＡＬＫ５を阻害することができる。
　本発明では特に限定されないが、ＡＬＫ５阻害剤としては、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ＳＢ４３１５４２又はＲｅｐｓｏｘを使用することができる。
ＳＢ４３１５４２（和光純薬工業製）（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３０１８３６－４１－９）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  
ＡＬＫ５　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（和光純薬工業製）又はＲｅｐｓｏｘ（ａｂｃａｍ社製）（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４４６８５９－３３－２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  
ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）Ａ８３－０１（和光純薬工業製）（ＣＡＳ　Ｎｏ．：９０９９１０－４３－６）
Ｄ４４７６（和光純薬工業製）（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３０１８３６－４３－１）
ＬＹ３６４９４７（和光純薬工業製）（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３９６１２９－５３－６）
ＳＢ５２５３３４（和光純薬工業製）（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３５６５５９－２０－１）
ＳＤ２０８（和光純薬工業製）（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６２７５３６－０９－８）
　ＡＬＫ５阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．２μｍｏｌ／Ｌ～２０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌ～１０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
１．２．２　ＢＭＰ阻害剤
　ＢＭＰ（Bone Morphogenetic Protein、骨形成タンパク質）は、ＴＧＦ－βスーパーファミリーに属する成長因子であり、胚や組織の発生、細胞の分化、細胞死などを制御している。ＢＭＰは細胞膜上のＩ型受容体とＩＩ型受容体に結合してヘテロ四量体を形成し、転写因子ＳＭＡＤのリン酸化を経て核内にＢＭＰシグナルを伝達する。ＢＭＰ阻害剤の多くは、ＢＭＰの結合によって活性化されたＩ型受容体であるＡＬＫ（Activin receptor-like kinase）-２，３，６によるＳＭＡＤのリン酸化を阻害する。
　上記ＡＬＫの中、ＡＬＫ２は、ＡＬＫファミリーメンバーの受容体セリン／スレオニンキナーゼであり、ＳＭＡＤタンパク質、特にＳＭＡＤ１／５／８が関与するシグナル伝達経路の上流に位置する。ＡＬＫ２－Ｓｍａｄ１経路の活性化を通じてエンドグリンにより前立腺癌細胞の運動性が低下する。ＡＬＫ２遺伝子は、筋肉組織において進行性の異所性骨形成が特徴の珍しい常染色体性優性先天性疾患である進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）に関与する主要遺伝子である。
　ＡＬＫ３は、膜貫通型セリン／スレオニンキナーゼファミリーメンバーである。ＡＬＫ３遺伝子は、ＰＴＥＮ（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10）変異陰性カウデン病において微働感受性遺伝子として作用する。ＡＬＫ３輸送は、ＦＯＰの病変形成において重要な役割を担い、またヒトＴ細胞分化にも関与する。
　「ＢＭＰ阻害剤の存在下」とは、ＢＭＰシグナル伝達経路を阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＢＭＰシグナル伝達経路を阻害することができる任意の手段を利用することができる。本発明には、ＢＭＰ及びＢＭＰ受容体に直接作用してその機能を阻害する物質（例えば、抗ＢＭＰ抗体、その他の薬剤）、あるいはこれらの発現を抑制する薬剤等を利用することができる。また、ＢＭＰが関わるシグナル伝達の下流に位置するＳＭＡＤ転写因子の発現及びその翻訳後修飾を阻害することによってもＢＭＰシグナル伝達経路を阻害することができる。
　本発明においては、ＢＭＰ阻害剤の存在下で体細胞を培養するが、ＢＭＰ阻害剤の中、ＡＬＫ２・３阻害剤の存在下で体細胞を培養することが好ましい。
　「ＡＬＫ２・３阻害剤の存在下」とは、ＡＬＫ２及び３の両方を阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＡＬＫ２及び３の両方を阻害することができる任意の手段を利用することができる。本発明には、ＡＬＫ２及び３の両方に直接作用してその機能を阻害する物質（例えば、抗ＡＬＫ２・３抗体やその他の薬剤）、ＡＬＫ２及び３自体の産生を抑制する薬剤等を利用することができる。また、ＡＬＫ２及び３の両方を阻害することができるのであれば、ＡＬＫ２及び３が関わるシグナル伝達をその上流で阻害することによってもよい。
　本発明で用いうるＢＭＰ阻害剤ないしＡＬＫ２・３阻害剤としては、その機能を発揮することができれば特に限定されないが、例えば、以下の化合物を挙げることができる。好ましくは、ＡＬＫ２・３阻害剤であるＬＤＮ１９３１８９、ドルソモルフィンを挙げることができる。
ＬＤＮ１９３１８９（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１０６２３６８－２４－４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  
ドルソモルフィン（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）（ＡＭＰＫ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　Ｃとも称する）（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８６６４０５－６４－３）
Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ　ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２１９１６８－１８－９）
ＤＭＨ１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２０６７１１－１６－１）
Ｋ０２２８８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１４３１９８５－９２－０）
ＬＤＮ２１２８５４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１４３２５９７－２６－６）
ＬＤＮ１９３１８９　ＨＣｌ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１０６２３６８－６２－０）
ＭＬ３４７（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１０６２３６８－４９－３）
ＬＤＮ２１４１１７（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１６２７５０３－６７－６）
　本発明において、ＢＭＰ阻害剤ないしＡＬＫ２・３阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．１μｍｏｌ／Ｌ～１０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌ～５μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
１．２．３　ｐ５３阻害剤
　ｐ５３は、最も重要な癌抑制遺伝子の一つであり、細胞増殖を抑制し、がんの抑制に重要な役割を担っている。また種々のストレスに応答して標的遺伝子を活性化し、細胞周期の停止、アポトーシス、ＤＮＡ修復、細胞老化などに対する起点となっている。
　「ｐ５３阻害剤の存在下」とは、ｐ５３を阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ｐ５３を阻害することができる任意の手段を利用することができる。本発明には、ｐ５３に直接作用してその機能を阻害する物質（例えば、抗ｐ５３抗体、その他の薬剤）、ｐ５３自体の産生を抑制する薬剤等を利用することができる。また、ｐ５３が関わるシグナル伝達をその上流で阻害することによってもｐ５３を阻害することができる。
　本発明で用いうるｐ５３阻害剤としては、その機能を発揮することができれば特に限定されないが、例えば、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ピフィスリンないしピフィスリン－αを使用することができる。
ピフィスリン－α（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６３２０８－８２－２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
  
ピフィスリン－β（ＣＡＳ　Ｎｏ．：５１１２９６－８８－１）
ピフィスリン－μ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６４９８４－３１－２）
ＮＳＣ６６８１１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６９６４－６２－１）
Ｎｕｌｔｉｎ－３（ＣＡＳ　Ｎｏ．：５４８４７２－６８－０）
　本発明において、ｐ５３阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．５μｍｏｌ／Ｌ～３０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ～１０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
１．２．４　ｃＡＭＰ誘導剤
　ｃＡＭＰ（環状アデノシン１リン酸）は、セカンドメッセンジャーとして種々の細胞内シグナル伝達に関わっている物質である。ｃＡＭＰは、細胞内ではアデニル酸シクラーゼ（adenylate cyclase）によりアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）が環状化されることで生成する。
　「ｃＡＭＰ誘導剤の存在下」とは、ｃＡＭＰを誘導することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、例えば、細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させることができる任意の手段を利用することができる。ｃＡＭＰの生成に関わる酵素であるアデニル酸シクラーゼに直接作用して誘導することができる物質、アデニル酸シクラーゼの発現を促進しうる物質の他、ｃＡＭＰを分解する酵素であるホスホジエステラーゼを阻害する物質等を、細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させる手段として使用することができる。細胞内でｃＡＭＰと同じ作用を持つ、ｃＡＭＰの構造類似体であるジブチリルｃＡＭＰ（ｄｉｂｕｔｙｒｙｌ　ｃＡＭＰ）を使用することもできる。
　本発明で用いうるｃＡＭＰ誘導剤としては、その機能を発揮することができれば特に限定されないが、例えば、フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ：ＣＡＳ　Ｎｏ．：６６５７５－２９－９）、及びフォルスコリン誘導体（例えば特開２００２－３４８２４３号公報）や以下の化合物などが挙げられる。好ましくは、フォルスコリンを使用することができる。
フォルスコリン（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６６４２８－８９－５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
  
イソプロテレノール（ＣＡＳ　Ｎｏ．：７６８３－５９－２）
ＮＫＨ４７７（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１３８６０５－００－２）
ＰＡＣＡＰ１－２７（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２７３１７－０３－７）
ＰＡＣＡＰ１－３８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１３７０６１－４８－４）
　本発明において、ｃＡＭＰ誘導剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．２μｍｏｌ／Ｌ～５０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ～３０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
１．２．５　ＧＳＫ３阻害剤
　ＧＳＫ３（glycogen synthase kinase-3、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３）は、グリコーゲン合成酵素をリン酸化して不活性化するプロテインキナーゼとして見いだされた。哺乳類では、ＧＳＫ３は５１ｋＤａのα（ＧＳＫ３α）と４７ｋＤａのβ（ＧＳＫ３β）の二つのアイソフォームに分類される。ＧＳＫ３は種々のタンパク質をリン酸化する活性を有しており、グリコーゲン代謝のみならず、細胞分裂、細胞増殖等の生理現象にも関わっている。
　「ＧＳＫ３阻害剤の存在下」とは、ＧＳＫ３を阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＧＳＫ３の活性を阻害する物質、例えば、抗ＧＳＫ３抗体やＧＳＫ３阻害剤のようなＧＳＫ３シグナル阻害手段を利用することができる。また、ＧＳＫ３は自身の特定の部位がリン酸化されると活性を失うことから、上記のリン酸化を促進する手段も、ＧＳＫ３シグナルの阻害に利用することができる。
　本発明で用いうるＧＳＫ３阻害剤としては、その機能を発揮することができれば特に限定されないが、例えば、以下の化合物を挙げることができる。好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１を挙げることができる。
ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２５２９１７－０６－９）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
  
ＢＩＯ（（２’Ｚ，３’Ｅ）－６－Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３’－ｏｘｉｍｅ）（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６６７４６３－６２－９）
Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１４２２７３－２０－９）
Ａ１０７０７２２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１３８４４２４－８０－９）
ＳＢ２１６７６３（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２８０７４４－０９－４）
ＣＨＩＲ９８０１４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：５５６８１３－３９－９）
ＴＷＳ１１９（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６０１５１４－１９－６）
Ｔｉｄｅｇｌｕｓｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８６５８５４－０５－３）
ＳＢ４１５２８６（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２６４２１８－２３－７）
Ｂｉｋｉｎｉｎ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１８８０１１－６９－０）
ＩＭ－１２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１１２９６６９－０５－１）
１－Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６７６５９６－６５－９）
ＬＹ２０９０３１４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６０３２８８－２２－８）
ＡＺＤ１０８０（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６１２４８７－７２－６）
ＡＺＤ２８５８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４８６４２４－２０－８）
ＡＲ－Ａ０１４４１８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４８７０２１－５２－３）
ＴＤＺＤ－８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３２７０３６－８９－５）
Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４７９－４１－４）
　本発明において、ＧＳＫ３阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．１μｍｏｌ／Ｌ～２０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌ～１０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
１．２．６　Ｅｒｋ阻害剤について
　Ｅｒｋは、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、血清刺激又は酸化ストレスなどによって活性化されるＭＡＰＫのサブファミリーで、Ｅｒｋはその関わるシグナル伝達経路の違いからＥＲＫ１／２、ＥＲＫ５、ＥＲＫ７、ＥＲＫ８に分けられる。上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）などのチロシンキナーゼ受容体にリガンドが結合することでシグナルが流れた結果、Ｅｒｋの活性化ループに存在するＴＥＹモチーフがリン酸化されて活性化する。
　「Ｅｒｋ阻害剤の存在下」とは、Ｅｒｋを阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、Ｅｒｋの活性を阻害する物質、例えば、抗Ｅｒｋ抗体やＥｒｋ阻害剤のようなＥｒｋシグナル阻害手段を利用することができる。また、Ｅｒｋの活性化に関わる酵素、例えば、ＥｒｋキナーゼやＥｒｋキナーゼキナーゼ等を阻害する手段もＥｒｋ阻害に利用することができる。
　本発明で用いうるＥｒｋ阻害剤としては、その機能を発揮することができれば特に限定されないが、例えば、以下の化合物を挙げることができる。好ましくは、ＰＤ０３２５９０１を挙げることができる。
ＰＤ０３２５９０１　（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３９１２１０－１０－９）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
  
Ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１０１６２２－５１－９）
Ａｍｉｎｏｐｕｒｖａｌａｎｏｌ　Ａ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２２０７９２－５７－４）
ＡＳ７０３０２６（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２３６６９９－９２－５）
ＡＺＤ８３３０（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８６９３５７－６８－６）
ＢＩＸ０２１８８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３３４９４９－５９－６）
ＢＩＸＯ２１８９（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２６５９１６－４１－３）
ＣＩ－１０４０（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２１２６３１－７９－３）
Ｃｏｂｉｍｅｔｉｒｌｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：９３４６６０－９３－２）
ＧＤＣ－０６２３（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１１６８０９１－６８－６）
ＭＥｋ１６２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６０６１４３－８９－９）
ＰＤ３１８０８８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３９１２１０－００－７）
ＰＤ９８０５９（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１６７８６９－２１－８）
Ｒｅｆａｍｅｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：９２３０３２－３７－５）
ＲＯ４９８７６５５（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８７４１０１－００－５）
ＳＣＨ７７２９８４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：９４２１８３－８０－４）
Ｓｅｌｕｍｅｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６０６１４３－５２－６）
ＳＬ３２７（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３０５３５０－８７－２）
Ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８７１７００－１７－３）
ＡＲＲＹ－１４２８８６（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６０６１４３－５２－６）
ＸＬ５１８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：９３４６６０－９３－２）
ＲＤＥＡ１１９（ＣＡＳ　Ｎｏ．：９２３０３２－３８－６）
　本発明において、Ｅｒｋ阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．１μｍｏｌ／Ｌ～１０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．２μｍｏｌ／Ｌ～５μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
 
１．３　その他の好ましい条件
　本発明においては特に限定されないが、製造工程において、ヒストンに関与する成分の非存在下で体細胞を培養することが好ましい。ヒストンに関与する成分の非存在下とは、ヒストンに関与する成分が実質的に存在しないことを意味し、ヒストンに関与する成分が全く存在しない場合だけでなく、ヒストンに関与する成分が痕跡量で存在する場合を包含するものとする。ヒストンに関与する成分としては、例えば、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（例、バルプロン酸）等を挙げることができる。核初期化因子によるリプログラミングを促進すると言われるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を使用しない場合には、意図しない分化を起こしかねない多能性細胞が誘導されるリスクはより低くなる。
 
１．４　体細胞の培養
　本発明製造方法における体細胞の培養は、使用する体細胞の種類に応じた培地、温度、その他の条件を選択し、上記の各種の阻害剤（及び、場合により誘導剤ないし活性化剤）の存在下において実施すればよい。培地は、公知の培地又は市販の培地から選択することができる。例えば、一般的な培地であるＭＥＭ（最少必須培地）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、又はこれらを改変した培地に、適切な成分（血清、タンパク質、アミノ酸、糖類、ビタミン類、脂肪酸類、抗生物質等）を添加して使用することができる。
　本発明においては、体細胞から増殖因子産生細胞を製造する。脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ；Brain-Derived Neurotrophic Factor）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ：Glial cell-Derived Neurotrophic Factor）、ｃＡＭＰ、アスコルビン酸、アスコルビン酸－２－リン酸等は、増殖因子産生細胞への分化の誘導に有効な物質として知られている。増殖因子産生細胞への分化の誘導に有効な物質としては、例えば、分化誘導剤として市販されているものを使用することもできる。本発明においては、上記した物質の存在下において体細胞を培養してもよい。
　培養条件としては、一般的な細胞培養の条件を選択すればよい。３７℃、５％ＣＯ２の条件などが例示される。培養中は適切な間隔（好ましくは１日から７日に１回、より好ましくは３日から４日に１回）で培地を交換することが好ましい。線維芽細胞を材料として本発明製造方法を実施する場合、３７℃、５％ＣＯ２の条件では４日間から１週間で増殖因子産生細胞が出現する。培養期間は、４日間～１６日間の範囲内であることが適当であり、中でも、５日間～１２日間の範囲内であることが好ましく、７日間～９日間の範囲内であることがより好ましい。
　使用する体細胞として培養が容易なものを選択することにより、あらかじめ細胞数を増加させた体細胞を増殖因子産生細胞に転換することも可能である。従って、スケールアップした増殖因子産生細胞の製造も容易である。
　体細胞の培養には、プレート、ディッシュ、細胞培養用フラスコ、細胞培養用バッグ等の細胞培養容器を使用することができる。なお、細胞培養用バッグとしては、ガス透過性を有するものが好適である。大量の細胞を必要とする場合には、大型培養槽を使用してもよい。培養は開放系又は閉鎖系のどちらでも実施することができるが、得られた増殖因子産生細胞のヒトへの投与等を目的とする場合には、閉鎖系で培養を行うことが好ましい。
　本発明製造方法においては、上記した各種の阻害剤等を含む培地において体細胞を培養することにより、一段階の培養によって体細胞から増殖因子産生細胞を製造することができる。
 
１．５　増殖因子産生細胞
　上記した本発明製造方法により、増殖因子産生細胞を含有する細胞集団を得ることができる。本発明製造方法により製造される増殖因子産生細胞も本発明の範囲内である（以下、「本発明細胞」という。）。本発明細胞は増殖因子を産生する。当該増殖因子として例えば、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、ＮＧＦ（神経成長因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）、ＥＧＦ（上皮成長因子）等を挙げることができる。本発明細胞は、増殖因子のみならず抗炎症因子をも産生する細胞とすることができる。当該抗炎症因子として、例えば、ＩＬ－１ＲＮを挙げることができる。上記の本発明製造方法を用いることにより、本発明細胞は、体細胞からの直接誘導又は直接転換により製造することが可能である。
　本発明細胞は、例えば、細胞の形態的変化により確認することができる。増殖因子産生細胞は、細胞の種類によって特徴的な形態をとることから、培養前後の細胞の形態を比較することによって増殖因子産生細胞の存在を知ることができる。また、増殖因子産生細胞に特徴的な分子、例えば、酵素、レセプター又は低分子化合物等を検出して、増殖因子産生細胞を確認することもできる。増殖因子産生細胞に特徴的な分子としては、β３－チューブリン、シナプシンＩ、ベシクル型グルタミン酸トランスポーター（vesicular glutamate transporter：ｖＧＵＬＴ）、微小管関連タンパク質（microtubule-associated protein：ＭＡＰ）２、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、チロシン水酸化酵素等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　上記分子の検出には、検疫的方法（抗体による検出）を利用できるが、タンパク質分子に関してはそのｍＲＮＡ量の定量により検出を実施してもよい。増殖因子産生細胞に特徴的な分子を認識する抗体は、本発明細胞を単離及び精製する上でも有用である。
　本発明細胞は、疾患の治療のために用いることができる。中でも、創傷治癒促進により予後が改善し得る疾患に対して好ましく適用することができる。例えば、神経系疾患、肝臓疾患、皮膚疾患の治療に有用である。治療の際には、本発明細胞を直接患部に移植してもよいし、また後述の通り、本発明細胞を使用して細胞シート又は医薬用組成物を製造することができるから、細胞シート又は医薬用組成物の態様にて患部に適用してもよい。
　上記神経系疾患としては、脊髄損傷、脳血管障害（脳梗塞等）、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症等が挙げられる。
　上記肝臓疾患としては、脂肪肝、肝不全、肝炎等が挙げられる。
　上記皮膚疾患としては、熱傷、褥瘡等が挙げられる。
　本発明細胞は、上記疾患の中でも、脊髄損傷、熱傷、褥瘡の治療においてより好ましく用いることができる。
　本発明細胞を細胞シート（以下、「本発明細胞シート」という。）とする場合には、常法により、被覆基材に温度応答性基材を被覆し、当該被覆が施された基材上で本発明細胞を培養する等して作製すればよい。
　当該温度応答性基材としては、温度応答性ポリマーを細胞培養基材にグラフト化させたものが適当である。細胞培養基材の材質は、特に限定されるものではないが、細胞付着表面は、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、若しくはポリメチルメタクリレート、又はこれらの中から２以上を組み合わせたものとすることができる。中でも、ポリスチレンが好ましい。
　本発明細胞シートに用いる温度応答性ポリマーは、ホモポリマー、コポリマーのいずれであってもよい。使用し得るモノマーとしては、例えば、アクリルアミド、Ｎ－アルキル置換アクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ－ジアルキル置換アクリルアミド誘導体、メタクリルアミド、Ｎ－アルキル置換メタクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ－ジアルキル置換メタクリルアミド誘導体、ビニルエーテル誘導体を挙げることができる。コポリマーの場合は、これらの中から任意の２種以上を使用することができる。
　上述の温度応答性基材の被覆基材表面への被覆方法は、特に制限されない。例えば、上記細胞培養基材と上記モノマーまたはポリマーとを、電子線照射（ＥＢ）、電磁波照射（γ線照射、紫外線照射等）、プラズマ処理、コロナ処理、若しくは有機重合反応のいずれかにより、又は塗布、混練等の物理的吸着により被覆基材表面に被覆することができる。
　被覆基材としては、通常細胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等が適当であり、これら以外にも、一般に形態付与が可能な高分子化合物や無機化合物（セラミックス類等）を広く用いることができる。
　培養した細胞シートを温度応答性基材から剥離回収する際は、培養された細胞の付着した培養基材の温度を、培養基材上の被覆ポリマー（温度応答性ポリマー）の上限臨界溶解温度（ＵＣＳＴ）以上又は下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）以下にすればよい。当該温度変化により、被覆ポリマーは疎水性状態から親水性状態へと変化するため、細胞－細胞間接着を維持したまま培養細胞を剥離することができ、シート状の細胞組織を回収することができる。
　本発明細胞を医薬用組成物とする場合には、常法により、増殖因子産生細胞を医薬的に許容される担体と混合するなどして、個体への投与に適した形態の製剤とすればよい。担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等）を加えて等張とした注射用蒸留水を挙げることができる。さらに、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤等を配合してもよい。
　本発明細胞は、さらに増殖因子産生細胞の機能発揮や生着性向上に有効な他の細胞や成分と組み合わせた組成物とすることもできる。
　さらに、本発明細胞は、増殖因子産生細胞に作用する医薬候補化合物のスクリーニングや医薬候補化合物の安全性評価のために使用することもできる。本発明製造方法によれば、一度の操作で多くの増殖因子産生細胞を取得することができることから、細胞のロット差の影響を受けずに、再現性のある研究結果を得ることが可能になる。
　本発明細胞を適当な手段により処理することにより、本発明細胞又はその分泌物から増殖因子（ＨＧＦ等）や抗炎症因子（ＩＬ－１ＲＮ等）を抽出単離し、精製することができる。当該抽出単離するための適当な手段としては、常法を挙げることができるが、具体的には、例えば、本発明細胞を適当な界面活性剤に溶解して行う方法、本発明細胞の懸濁液を液体窒素で急速に凍結した後、解凍することにより行う凍結融解法、本発明細胞を滅菌水などの低張溶液に懸濁することにより行う浸透圧ショック法、本発明細胞の懸濁液に高周波を照射し、細胞膜を破壊する超音波処理法、本発明細胞を粉砕しすりつぶすことにより行う機械的方法、本発明細胞を酵素処理することにより行う酵素消化法を挙げることができる。
 
２　組成物
　本発明に係る組成物（以下、「本発明組成物」という。）は、体細胞から直接分化誘導することにより増殖因子産生細胞を製造するための組成物であって、ＴＧＦ－β阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤からなる群から選択される少なくともいずれか１種を含むことを特徴とする。本発明組成物を用いることにより、本発明細胞を製造することができる。本発明組成物を用いることにより、体細胞からの直接誘導又は直接転換により本発明細胞を製造することが可能となる。
　本発明組成物は、少なくともＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤の４種の存在下で体細胞を培養する工程を含むものとしてもよい。さらに、ＴＧＦ－β阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤からなる群から選択される少なくともいずれか１種に、又は前記４種に、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤を含むものとしてもよい。前記４種ないし、これにＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤を加えた６種の剤を含む本発明組成物を用いることにより、増殖因子のみならず抗炎症因子（例えば、ＩＬ－１ＲＮ。）をも産生し得る本発明細胞を製造することができる。
　本発明組成物において、ＴＧＦ－β阻害剤はＡＬＫ５阻害剤であることが好ましく、ＢＭＰ阻害剤はＡＬＫ２・３阻害剤であることが好ましい。また、本発明製造方法において、ＡＬＫ５阻害剤はＳＢ４３１５４２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３０１８３６－４１－９）及び／若しくはレプソックス（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４４６８５９－３３－２）、並びに／又はＡＬＫ２・３阻害剤はＬＤＮ１９３１８９（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１０６２３６８－２４－４）及び／若しくはドルソモルフィン（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８６６４０５－６４－３）であることがより好ましい。また、ｃＡＭＰ誘導剤はフォルスコリン（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６６４２８－８９－５）、ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２５２９１７－０６－９）、Ｅｒｋ阻害剤はＰＤ０３２５９０１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３９１２１０－１０－９）、又はｐ５３阻害剤はピフィスリン－α（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６３２０８－８２－２）であることがより好ましい。
　本発明組成物においては、少なくとも上記いずれかの阻害剤や誘導剤等を含んでいればよく、必要に応じて、任意にさらに他の阻害剤や誘導剤等を含むことができる。
　上記阻害剤や誘導剤は、それぞれにおいて、１種を用いても２種以上を併用してもよい。
　具体的な上記阻害剤等においては、２種類以上の阻害作用等を有するものもあり得るが、その場合、一つで複数の阻害剤等を含んでいるとみなすことができる。
　上記した阻害剤や誘導剤等の具体例や好ましい例などは、前記と同義である。
　本発明組成物は、体細胞から増殖因子産生細胞を製造するための組成物として使用することができる。本発明組成物は、また、体細胞から増殖因子産生細胞を製造するための培地として使用することもできる。
　体細胞から増殖因子産生細胞の製造に使用される培地としては、細胞の培養に必要な成分を混合して製造した基礎培地に、有効成分として、ＴＧＦ－β阻害剤の一種であるＡＬＫ５阻害剤及びＢＭＰ阻害剤（好ましくはＡＬＫ２・３阻害剤）、あるいはこれらに加えてｃＡＭＰ誘導剤、ＧＳＫ３阻害剤、Ｅｒｋ阻害剤、及びｐ５３阻害剤からなる４種群から選択されるいずれか３種以上を含有させた培地を例示することができる。上記の有効成分は、増殖因子産生細胞の製造に有効な濃度で含まれていればよく、濃度は当業者が適宜決定することができる。基礎培地は、公知の培地又は市販の培地から選択することができる。例えば、一般的な培地であるＭＥＭ（最少必須培地）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、又はこれらを改変した培地を、基礎培地として使用することができる。
　培地にはさらに、本明細書中で上記した公知の培地成分、例えば、血清、タンパク質（アルブミン、トランスフェリン、成長因子等）、アミノ酸、糖類、ビタミン類、脂肪酸類、抗生物質等を添加してもよい。
　培地にはさらに、本明細書中で上記した、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ；Brain-Derived Neurotrophic Factor）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ：Glial cell-Derived Neurotrophic Factor）、ｃＡＭＰ、アスコルビン酸、アスコルビン酸－２－リン酸等の増殖因子産生細胞への分化の誘導に有効な物質を添加してもよい。
　さらに本発明においては、例えば、ＴＧＦ－β阻害剤の一種であるＡＬＫ５阻害剤及びＢＭＰ阻害剤（好ましくはＡＬＫ２・３阻害剤）、あるいはこれらに加えてｃＡＭＰ誘導剤、ＧＳＫ３阻害剤、Ｅｒｋ阻害剤、及びｐ５３阻害剤からなる４種群から選択されるいずれか３種以上を含有する組成物を生体に投与することによって、生体内において体細胞から増殖因子産生細胞を製造することもできる。即ち、本発明によれば、例えば、ＴＧＦ－β阻害剤の一種であるＡＬＫ５阻害剤及びＢＭＰ阻害剤（好ましくはＡＬＫ２・３阻害剤）、あるいはこれらに加えてｃＡＭＰ誘導剤、ＧＳＫ３阻害剤、Ｅｒｋ阻害剤、及びｐ５３阻害剤からなる４種群から選択されるいずれか３種以上を含有する組成物を生体に投与することを含む、生体内において体細胞から増殖因子産生細胞を製造する方法が提供される。生体に投与する当該阻害剤等の好ましい組み合わせは、本明細書中に記載した通りである。
　また、生体としては、ヒト、ヒト以外の哺乳動物、及び哺乳動物以外の動物（鳥類、爬虫類、両生類、魚類等）が例示されるが、ヒトが特に好ましい。例えば、ＴＧＦ－β阻害剤の一種であるＡＬＫ５阻害剤及びＢＭＰ阻害剤（好ましくはＡＬＫ２・３阻害剤）、あるいはこれらに加えてｃＡＭＰ誘導剤、ＧＳＫ３阻害剤、Ｅｒｋ阻害剤、及びｐ５３阻害剤からなる４種群から選択されるいずれか３種以上を含有する組成物を生体内の特定部位に投与することによって、上記特定部位において、体細胞から増殖因子産生細胞を製造することができる。
 
　以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
［実施例１］増殖因子産生細胞の製造
（１）ヒト線維芽細胞
　材料とした２つのヒト線維芽細胞の背景情報を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
（２）ヒト線維芽細胞からのサイトカイン分泌細胞直接誘導
　表１に示したヒト繊維芽細胞を、それぞれ３５ｍｍディッシュ又は6ウェルプレートに１×１０５個ずつ播種し、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ培養液で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２日間インキュベートした。各細胞は表１に記載の継代数（Passage）の範囲で培養に供した。
　表２に示した低分子化合物7種を含む神経細胞培地を調製した。この神経細胞培地は１％ （ｖ／ｖ）Ｎ２サプリメント（ライフテック社製）を含んだＤＭＥＭ／Ｆ１２と、２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７サプリメント（ライフテック社製）を含んだＮｅｕｒｏｂａｓａｌＭｅｄｉｕｍ（ライフテック社製）を１：１で混合したものである。前記の、２日間培養したヒト線維芽細胞のディッシュの培地をこの神経細胞培地に置換し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で２日又は３日毎に培地交換し培養を継続した。
　２日間培養したヒト線維芽細胞をＤＭＥＭ、神経細胞培地に置換し培養した細胞をＮＭ、低分子化合物７種を含む神経細胞培地に置換し培養した細胞をＣｉＮとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
  
（３）サイトカイン分泌細胞の評価１
　ＤＭＥＭ及び８日間誘導したＮＭ、ＣｉＮの培養上清（２４時間分）を回収し、ＥＬＩＳＡ法にてサイトカインであるＨＧＦ及びＩＬ－１ＲＮの分泌量を測定した。測定に使用したＥＬＩＳＡキットは次の通りである。
AuthentiKineTM Human HGF ELISA Kit（Proteintech社製、Cat No＃ PGI-KE00168-1）
Human IL-1ra/IL-1F3 Quantikine ELISA Kit（R＆D、Cat No＃DRA00Ｂ）
　ＤＭＥＭ及び８日間誘導したＮＭ、ＣｉＮをそれぞれ図１に示す。また、ＨＧＦ及びＩＬ－１ＲＮの分泌量の測定結果を図２及び図３にそれぞれ示す。ＣｉＮは、ＨＧＦ及びＩＬ－１ＲＮのいずれをも分泌していることが分かる。
（４）サイトカイン分泌細胞の評価２
　０、４、８、１２、１６日間誘導したＮＭ、ＣｉＮの培養上清（２４時間分）を回収し、ＥＬＩＳＡ法にてサイトカインであるＨＧＦ及びＩＬ－１ＲＮの分泌量を測定した。測定に使用したＥＬＩＳＡキットは次の通りである。
AuthentiKineTM Human HGF ELISA Kit（Proteintech社製、Cat No＃ PGI-KE00168-1）
Human IL-1ra/IL-1F3 Quantikine ELISA Kit（R＆D、Cat No＃DRA00Ｂ）
　ＮＭ、ＣｉＮの誘導の様子を図４に示す。また、ＨＧＦ及びＩＬ－１ＲＮの分泌量の測定結果を図５及び図６にそれぞれ示す。ＣｉＮは、ＨＧＦ及びＩＬ－１ＲＮのいずれをも、特に８日目前後かそれ以降によく分泌していることが分かる。
［実施例２］
（１）ヒト線維芽細胞からのサイトカイン分泌細胞直接誘導（２）
　表１に示したヒト繊維芽細胞ＫＡ４５を、３５ｍｍディッシュ又は６ウェルプレートに１×１０５個ずつ播種し、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ培養液で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２日間インキュベートした。各細胞は表１に記載の継代数（Passage）の範囲で培養に供した。
　表２又は表３に示した低分子化合物７種を含む神経細胞培地、ならびにこれら７種類の低分子化合物をそれぞれ１つずつ欠いた神経細胞培地を調製した。この神経細胞培地は１％（ｖ／ｖ）　Ｎ２サプリメント（ライフテック社製）を含んだＤＭＥＭ／Ｆ１２と、２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７サプリメント（ライフテック社製）を含んだＮｅｕｒｏｂａｓａｌＭｅｄｉｕｍ（ライフテック社製）を１：１で混合したものである。前記の、２日間培養したヒト線維芽細胞のディッシュの培地をこの神経細胞培地に置換し、３７℃、５％　ＣＯ２の条件で２日又は３日毎に培地交換し培養を継続した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
 表中、「実」は実施例を意味する。
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
 表中、「実」は実施例を意味する。
 
（２）サイトカイン分泌細胞の評価
　８日間誘導した細胞の培養上清（２４時間分）を回収し、ＥＬＩＳＡ法にてサイトカインであるＨＧＦ及びＩＬ－１ＲＮの分泌量を測定した。測定に使用したＥＬＩＳＡキットは次の通りである。
AuthentiKineTM Human HGF ELISA Kit（Proteintech社製、Cat No＃ PGI-KE00168-1）
Human IL-1ra/IL-1F3 Quantikine ELISA Kit（R＆D、Cat No＃DRA00Ｂ）
　８日間誘導した各細胞（実施例２－１～２－１６）を図７及び８に示す。また、ＨＧＦの分泌量の測定結果を図９及び１０、ＩＬ－１ＲＮの分泌量の測定結果を図１１及び１２にそれぞれ示す。ＨＧＦはいずれの実施例も良好に分泌しているが、ＩＬ－１ＲＮを良好に分泌した実施例は、いずれもＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤の少なくとも４種を用いて誘導した場合であった。
［実施例３］
（１）ヒト線維芽細胞からのサイトカイン分泌細胞直接誘導（３）
　表１に示したヒト繊維芽細胞ＫＡ４５を、３５ｍｍディッシュ又は６ウェルプレートに１×１０５個ずつ播種し、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ培養液で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２日間インキュベートした。各細胞は表１に記載の継代数（Passage）の範囲で培養に供した。表２に示した低分子化合物７種を含む神経細胞培地、ならびにこれら７種類の低分子化合物を複数欠いた神経細胞培地を調製した。用いた低分子化合物の組み合わせを表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
 表中、「実」は実施例を意味する。
 
　この神経細胞培地は１％（ｖ／ｖ）Ｎ２サプリメント（ライフテック社製）を含んだＤＭＥＭ／Ｆ１２と、２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７サプリメント（ライフテック社製）を含んだＮｅｕｒｏｂａｓａｌＭｅｄｉｕｍ（ライフテック社製）を１：１で混合したものである。前記の、２日間培養したヒト線維芽細胞のディッシュの培地をこの神経細胞培地に置換し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で２日又は３日毎に培地交換し培養を継続した。
（２）サイトカイン分泌細胞の評価
　８日間誘導した細胞の培養上清（２４時間分）を回収し、ＥＬＩＳＡ法にてサイトカインであるＨＧＦ及びＩＬ－１ＲＮの分泌量を測定した。測定に使用したＥＬＩＳＡキットは次の通りである。
AuthentiKineTM Human HGF ELISA Kit（Proteintech社製、Cat No＃ PGI-KE00168-1）
Human IL-1ra/IL-1F3 Quantikine ELISA Kit（R＆D、Cat No＃DRA00Ｂ）
　８日間誘導した各細胞（実施例３－１～３－１４）について、ＨＧＦの分泌量の測定結果を図１３、ＩＬ－１ＲＮの分泌量の測定結果を図１４にそれぞれ示す。ＨＧＦはいずれの実施例も分泌しているが、ＩＬ－１ＲＮをも分泌した実施例は、いずれもＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤の少なくとも４種を用いて誘導した場合であった。また、ＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＧＳＫ３阻害剤、及びＥｒｋ阻害剤を用いた場合には、ＨＧＦ及びＩＬ－１ＲＮのいずれも良好に分泌した。
 
　本発明によれば、体細胞（特に終分化体細胞ないし線維芽細胞）から、増殖因子（特にＨＧＦ）を産生する細胞、或いはさらに抗炎症因子（特にＩＬ－１ＲＮ）をも産生する細胞を短期間で製造することができる。本発明による細胞は、脊髄損傷、熱傷、褥瘡等に対する再生や創傷治癒促進に関する医療において有用である。
 

Claims (21)

  1. 体細胞から直接分化誘導することにより増殖因子産生細胞を製造する方法であって、ＴＧＦ－β阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤からなる群から選択される少なくともいずれか１種の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、増殖因子産生細胞の製造方法。
  2. 前記工程が、少なくともＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤の４種の存在下で体細胞を培養する工程である、請求項１に記載の増殖因子産生細胞の製造方法。
  3. 前記工程が、少なくともＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＧＳＫ３阻害剤、及びＥｒｋ阻害剤の６種の存在下で体細胞を培養する工程である、請求項１又は２に記載の増殖因子産生細胞の製造方法。
  4. 前記ＴＧＦ－β阻害剤がＡＬＫ５阻害剤であり、前記ＢＭＰ阻害剤がＡＬＫ２・３阻害剤である、請求項２又は３に記載の増殖因子産生細胞の製造方法。
  5. 前記ＡＬＫ５阻害剤がＳＢ４３１５４２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３０１８３６－４１－９）若しくはレプソックス（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４４６８５９－３３－２）であるか、前記ＡＬＫ２・３阻害剤がＬＤＮ１９３１８９（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１０６２３６８－２４－４）であるか、前記ｐ５３阻害剤がピフィスリン－α（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６３２０８－８２－２）であるか、又は前記ｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリン（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６６４２８－８９－５）である、請求項１～４のいずれか一項に記載の増殖因子産生細胞の製造方法。
  6. 前記ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２５２９１７－０６－９）であるか、又は前記Ｅｒｋ阻害剤がＰＤ０３２５９０１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３９１２１０－１０－９）である、請求項３～５のいずれか一項に記載の増殖因子産生細胞の製造方法。
  7. 前記体細胞が終分化した体細胞である、請求項１～６のいずれか一項に記載の増殖因子産生細胞の製造方法。
  8. 前記体細胞が線維芽細胞である、請求項１～７のいずれか一項に記載の増殖因子産生細胞の製造方法。
  9. 請求項１～８のいずれか一項に記載の増殖因子産生細胞の製造方法から製造される、増殖因子産生細胞。
  10. 増殖因子及び抗炎症因子を産生する、請求項９に記載の増殖因子産生細胞。
  11. 前記増殖因子がＨＧＦであり、前記抗炎症因子がＩＬ－１ＲＮである、請求項１０に記載の増殖因子産生細胞。
  12. 請求項９～１１のいずれか一項に記載の増殖因子産生細胞を含み、疾患の治療のために用いられる、細胞シート又は医薬組成物。
  13. 前記疾患が、脊髄損傷、熱傷、又は褥瘡である、請求項１２に記載の細胞シート又は医薬組成物。
  14. 請求項９に記載の増殖因子産生細胞又はその分泌物から増殖因子を抽出単離する工程を含む、増殖因子の製造方法。
  15. 請求項１０若しくは１１に記載の増殖因子産生細胞又はその分泌物から増殖因子又は抗炎症因子を抽出単離する工程を含む、増殖因子又は抗炎症因子の製造方法。
  16. 体細胞から直接分化誘導することにより増殖因子産生細胞を製造するための組成物であって、ＴＧＦ－β阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤からなる群から選択される少なくともいずれか１種を含むことを特徴とする、増殖因子産生細胞を製造するための組成物。
  17. 少なくともＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ｐ５３阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤の４種を含む、請求項１６に記載の組成物。
  18. さらに、ＧＳＫ３阻害剤及びＥｒｋ阻害剤を含む、請求項１７に記載の組成物。
  19. 前記ＴＧＦ－β阻害剤がＡＬＫ５阻害剤であり、前記ＢＭＰ阻害剤がＡＬＫ２・３阻害剤である、請求項１７又は１８に記載の組成物。
  20. 前記ＡＬＫ５阻害剤がＳＢ４３１５４２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３０１８３６－４１－９）若しくはレプソックス（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４４６８５９－３３－２）であるか、前記ＡＬＫ２・３阻害剤がＬＤＮ１９３１８９（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１０６２３６８－２４－４）であるか、前記ｐ５３阻害剤がピフィスリン－α（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６３２０８－８２－２）であるか、又は前記ｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリン（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６６４２８－８９－５）である、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の組成物。
  21. 前記ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２５２９１７－０６－９）であるか、又は前記Ｅｒｋ阻害剤がＰＤ０３２５９０１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３９１２１０－１０－９）である、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の組成物。
     
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