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WO2023163015A1 - 乳酸菌、乳酸菌組成物、乳酸菌の製造方法、乳酸菌の酸耐性向上方法、乳酸菌のスクリーニング方法、及び発酵乳の製造方法 - Google Patents

乳酸菌、乳酸菌組成物、乳酸菌の製造方法、乳酸菌の酸耐性向上方法、乳酸菌のスクリーニング方法、及び発酵乳の製造方法 Download PDF

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WO2023163015A1
WO2023163015A1 PCT/JP2023/006381 JP2023006381W WO2023163015A1 WO 2023163015 A1 WO2023163015 A1 WO 2023163015A1 JP 2023006381 W JP2023006381 W JP 2023006381W WO 2023163015 A1 WO2023163015 A1 WO 2023163015A1
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WO
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lactic acid
acid bacteria
bacteria
gene
bacterium
Prior art date
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PCT/JP2023/006381
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English (en)
French (fr)
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達也 石田
明子 小泉
恵理 山本
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Meiji Co Ltd
Original Assignee
Meiji Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to CN202380022959.2A priority patent/CN118742636A/zh
Priority to US18/837,974 priority patent/US20250136923A1/en
Priority to JP2024503194A priority patent/JPWO2023163015A1/ja
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/335—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Lactobacillus (G)

Definitions

  • the present invention relates to lactic acid bacteria, lactic acid bacteria compositions, methods for producing lactic acid bacteria, methods for improving acid tolerance of lactic acid bacteria, methods for screening lactic acid bacteria, and methods for producing fermented milk.
  • the present invention relates to a method for producing lactic acid bacteria, a method for improving acid tolerance of lactic acid bacteria, a method for screening lactic acid bacteria, and a method for producing fermented milk using these lactic acid bacteria and/or lactic acid bacteria compositions.
  • Lactic acid bacteria are microorganisms that have long been used in the production of fermented milk such as yogurt and fermented foods such as pickles. It is also gaining attention as a probiotic that exerts various beneficial effects on the host, such as tumor effects.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-160 (Patent Document 1) describes a method for improving the survival of microorganisms in vivo in humans and animals by disrupting the hrcA gene of microorganisms including lactic acid bacteria. there is Further, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • Patent Document 2 describes lactic acid derived from a microorganism belonging to the genus Bifidobacterium or Lactobacillus for the purpose of obtaining a microorganism having high lactic acid productivity even under acidic conditions.
  • An acid-tolerant lactic acid-producing microorganism containing a recombinant vector incorporating a dehydrogenase gene and promoter has been described.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems of the prior art, and the production of lactic acid bacteria having sufficiently excellent resistance to acids such as gastric acid, lactic acid bacteria compositions containing the same, and lactic acid bacteria having improved acid resistance.
  • the object is to provide a method, a method for improving acid tolerance of lactic acid bacteria, a screening method for lactic acid bacteria with sufficiently excellent acid tolerance, and a method for producing fermented milk using these lactic acid bacteria and/or lactic acid bacteria compositions.
  • the present inventors conducted intensive research to achieve the above objectives, and succeeded in isolating lactic acid bacteria that showed a high survival rate in acid tolerance tests.
  • lactic acid bacteria with a high survival rate in the acid tolerance test high acid-tolerant lactic acid bacteria
  • conventional common lactic acid bacteria i.e., survival rate in the acid tolerance test
  • Genome analysis was performed between lactic acid bacteria with low acidity: low acid-tolerant lactic acid bacteria).
  • frameshift mutations and nonsense mutations in the kup gene were extracted as mutations common to highly acid-tolerant lactic acid bacteria and accompanied by amino acid mutations.
  • the present inventors have found that the kup gene is a factor involved in the acid tolerance of lactic acid bacteria, and that lactic acid bacteria in which the function of the kup gene is suppressed have sufficiently excellent acid tolerance. . Therefore, by artificially suppressing the function of the kup gene, it is possible to improve the acid tolerance of lactic acid bacteria. The present inventors have also found that it is possible to screen for .
  • a method for improving acid tolerance of lactic acid bacteria comprising a step of artificially suppressing the function of the kup gene of lactic acid bacteria.
  • a method for producing lactic acid bacteria with improved acid tolerance comprising a step of artificially suppressing the function of the kup gene of lactic acid bacteria.
  • the lactic acid bacterium composition according to [10] further containing Streptococcus lactic acid bacteria.
  • a method of screening for highly acid-tolerant lactic acid bacteria comprising a selection step of selecting lactic acid bacteria using suppression of kup gene function as an index.
  • Any one selected from the group consisting of the lactic acid bacterium composition according to any one of the above and the lactic acid bacterium selected by the screening method of [14] is added to a formula liquid containing raw milk to ferment, A method for producing fermented milk, comprising a fermentation step of obtaining fermented milk.
  • the method for producing fermented milk according to [15] comprising the step of further adding Streptococcus lactic acid bacteria to the milk formula.
  • a lactic acid bacterium having sufficiently excellent resistance to acids such as gastric acid a lactic acid bacterium composition containing the same, a method for producing lactic acid bacteria having improved acid resistance, a method for improving acid resistance of lactic acid bacteria, and a method for improving acid resistance. It is possible to provide a sufficiently excellent screening method for lactic acid bacteria and a method for producing fermented milk using these lactic acid bacteria and/or lactic acid bacteria compositions.
  • lactic acid bacteria is a general term for microorganisms capable of assimilating glucose to produce lactic acid at a yield of 50% or more based on sugar, and as physiological properties, they are Gram-positive cocci or bacilli. It has characteristics such as no motility, basically no ability to form spores (as an exception, there are lactic acid bacteria with ability to form spores, such as Bacillus coagulans), and negative for catalase.
  • lactic acid bacteria examples include Streptococciaceae lactic acid bacteria, Lactobacillus lactic acid bacteria, Leuconostocaceae lactic acid bacteria, and more specifically, Lactobacillus lactic acid bacteria, Lacticaseibacillus lactic acid bacteria, Lactiplantibacillus lactic acid bacteria, Liquorilactobacillus lactic acid bacteria, Limosilactobacillus lactic acid bacteria, Levilactobacillus (L Evilactobacillus) lactic acid bacteria, lenti Lactobacilus lactobacillus bacteria, lactobacillus such as lactic acid bacteria (WEISSELLA) lactic acid bacteria; Pediococcus lactic acid bacteria, LeuconostoC lactic acid bacteria, lactoco, lactoco.
  • Lactobacillus lactic acid bacteria Lacticaseibacillus lactic acid bacteria
  • Lactiplantibacillus lactic acid bacteria Liquorilactobacillus lactic acid bacteria
  • Lactococcus lactic acid bacteria Streptococcus (Streptococus) Lactic acid bacteria such as lactic acid bacteria and Enterococcus lactic acid bacteria; Bifidobacterium lactic acid bacteria and the like.
  • lactic acid bacteria of the Lactobacillus family are preferred, and lactic acid bacteria of the genus Lactobacillus are more preferred.
  • Lactobacillus lactic acid bacteria include, for example, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus nasaridis, Lactobacillus equiculusolis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus gasseri, and Lactobacillus paragasseri , Lactobacillus amyloboros, and Lactobacillus crispatus, and in the present invention, each species also includes its subspecies.
  • Lactobacillus delbrueckii is particularly preferable as the lactic acid bacterium of the present invention.
  • Lactobacillus delbrueckii subsp. Subspecies Jacobseni is mentioned.
  • the acid resistance of Bifidobacterium can be improved, and the function of the kup gene can be improved.
  • the suppression as an index, it becomes possible to easily screen bifidobacteria with sufficiently excellent resistance to acid.
  • Bifidobacterium is a general term for bacteria belonging to the genus Bifidobacterium of the order Bifidobacteriales, Actinomycetes, and is an obligatory anaerobic Gram-positive bacterium capable of assimilating lactose and oligosaccharides to produce acetic acid and lactic acid. It is a bacillus.
  • the lactic acid bacterium of the present invention is a lactic acid bacterium in which the function of the kup gene is suppressed.
  • the "kup gene” is a gene that is widely conserved among microorganisms, and is known as a gene that encodes a protein that functions as a potassium transporter (Kup; potassium uptake transporter) in Escherichia coli and the like.
  • Kup potassium transporter
  • lactic acid bacteria particularly Lactobacillus lactic acid bacteria
  • a kup gene according to the present invention includes, for example, a gene encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and its typical nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 2 are Lactobacillus delbrueckii subsp. 1-29-1) Nanakuni, Hachioji City).
  • lactic acid bacteria especially Lactobacillus lactic acid bacteria, preferably Lactobacillus lactic acid bacteria
  • the amino acid sequence encoded by the kup gene is conserved with high identity. Genes encoding the amino acid sequences shown in 1 are also included. It should be understood that the nucleotide sequences of genes encoding these amino acids may have individual differences at the strain level due to polymorphism and the like. Table 1 shows the accession number (No.) of the amino acid sequence encoded by the typical kup gene of lactic acid bacteria, the amino acid identity (%) with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence The name of the lactic acid bacterium from which it originated is shown.
  • the function of the kup gene is suppressed means that the kup gene is mutated with a function-suppressing amino acid mutation, and/or Shows decreased expression.
  • the specific function of the amino acid sequence encoded by the kup gene of lactic acid bacteria has not yet been sufficiently clarified, the present inventors have found that the function of the kup gene in lactic acid bacteria, that is, at least the correct amino acid sequence It was found that by suppressing the function of encoding and expressing (for example, SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence shown in Table 1), acid tolerance can be improved. Therefore, it can be said that the "function of the kup gene" in the present invention includes at least an acid-sensing function.
  • “suppression" of a function also includes deletion of the function.
  • the "function-suppressing amino acid mutation” is not particularly limited as long as it is an amino acid mutation that suppresses (including deletion) the acid-sensing function, that is, improves the acid tolerance of lactic acid bacteria. or multiple amino acid substitutions, deletions, insertions and/or additions, more specifically, for example, SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequences listed in Table 1, or one or more in the amino acid sequences corresponding to these and preferably one or more amino acid substitutions, deletions, insertions and/or additions in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:1.
  • the amino acid sequence or region "corresponding" to the amino acid sequence or region refers to amino acid sequence analysis software (GENETYX-MAC, Sequencer, etc.) and BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information ( U.S. National Center for Biological Information Basic Local Alignment Search Tool)), etc. (e.g., parameters: default values (i.e., default values)), a reference amino acid sequence or region (e.g., SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence shown in Table 1, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 below) or the region that is homologous to the amino acid sequence or region.
  • amino acid sequence analysis software GENETYX-MAC, Sequencer, etc.
  • BLAST Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information ( U.S. National Center for Biological Information Basic Local Alignment Search Tool)
  • parameters i.e., default values
  • SEQ ID NO: 1 the amino acid sequence shown in Table 1
  • Mutations of the kup gene with such function-suppressing amino acid mutations include, for example, missense mutations, nonsense mutations, due to substitution, deletion, insertion and/or addition of one or more bases in the nucleotide sequence of the kup gene.
  • Frameshift mutations and combinations thereof are included, and substitutions and/or deletions of multiple or all bases due to gene knockout and the like are also included.
  • a function-suppressing amino acid mutation capable of sufficiently suppressing the acid-sensing function is preferably a substitution, deletion, insertion and/or addition, preferably is substituted and / or deleted, more preferably the number of deleted amino acids is preferably 46 residues or more, more preferably 60 residues or more, more preferably 70 residues or more .
  • such function-inhibiting amino acid mutations more preferably include substitution, deletion, insertion, and/or addition in all or part of at least the C-terminal domain of the amino acid sequence encoded by the kup gene. It is particularly preferred to include a deletion of all or part of the C-terminal domain.
  • the C-terminal domain of the amino acid sequence encoded by the kup gene refers to the region on the C-terminal side after Gly at position 450 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the region corresponding to said region.
  • SEQ ID NO: 3 shows a typical sequence of the C-terminal domain (from 450th Gly in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1)
  • SEQ ID NO: 4 shows a typical nucleotide sequence encoding it.
  • deletion of all or part of the C-terminal domain is preferable, and 26 % or more, further preferably 30% or more, 50% or more, 70% or more, 80% or more, or 100% of amino acids.
  • Examples of the function-inhibiting amino acid mutation include, for example, 46 residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or Table 1, or the amino acid sequence corresponding thereto (preferably the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1) Substitution and / or deletion of amino acids of 60 residues or more or 70 residues or more; 20% or more (preferably 26% or more, 30% or more, 50% or more, 70% or more, 80% or more, or 100%) of the amino acid sequence of is not limited to
  • detection of mutation of a gene means, in principle, detection of mutation in genomic DNA. Since it is reflected in the change of , it also includes detection of the change in these transcription products and translation products (that is, indirect detection at the transcription level and translation level).
  • the detection method includes a method of detecting a mutation by directly determining the nucleotide sequence of the gene region of the kup gene and comparing it with a control.
  • the "gene region of the kup gene” means a certain region containing at least the kup gene on the genomic DNA, and in addition to the translation region, the expression control region of the kup gene as an untranslated region (e.g., promoter region, enhancer region) ) and the 5′ terminal untranslated region of the kup gene.
  • a DNA sample is prepared from the target lactic acid bacterium.
  • DNA samples include genomic DNA samples and cDNA samples prepared by reverse transcription from RNA.
  • the method for extracting genomic DNA or RNA from the lactic acid bacteria and the method for preparing cDNA are not particularly limited, and known methods or methods based thereon can be appropriately employed.
  • DNA containing the gene region of the kup gene is then isolated and the nucleotide sequence of the isolated DNA is determined.
  • the isolation of the DNA is performed by PCR using genomic DNA or RNA as a template, for example, using a pair of oligonucleotide primers designed to sandwich all or part (preferably all) of the gene region of the kup gene. etc.
  • nucleotide sequence of the kup gene (preferably, the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 2 or the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence described in Table 1) that can be obtained from public databases (Genbank, etc.) Based on this, suitable oligonucleotide primers can be routinely designed.
  • the nucleotide sequence of the isolated DNA can be determined by methods known to those skilled in the art, such as the Maxam-Gilbert method and the Sanger method.
  • a DNA library may be prepared from the prepared genomic DNA or cDNA, and the nucleotide sequence of the entire genomic DNA may be determined using a next-generation sequencer or the like.
  • the nucleotide sequence of the determined DNA or cDNA is compared with the control, and if a mutation in the gene region of the kup gene is detected in the target lactic acid bacterium, the function of the kup gene is determined according to the type and / or degree of the mutation. It can be determined that it is suppressed.
  • the type and / or degree of mutation in the gene region of the kup gene detected at this time the type and / or degree of mutation capable of sufficiently improving the acid resistance of lactic acid bacteria is the function-suppressing type.
  • the type and/or degree of mutation accompanied by amino acid mutation exemplified as preferred embodiments of amino acid mutation is preferred.
  • the control at this time includes the known nucleotide sequence of the kup gene, more specifically, for example, the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence set forth in Table 1. . Further, in the case of the production method or acid tolerance improving method of the present invention described below, the control includes the nucleotide sequence of the kup gene of lactic acid bacteria before the function of the kup gene is artificially suppressed.
  • Another embodiment of the detection method includes, for example, the following method: Restriction Fragment Length Polymorphism/RFLP in which DNA containing all or part (preferably all) of the gene region of the kup gene is amplified, and the size of the DNA fragment produced by the restriction enzyme of the amplified product is compared with a control. ) and PCR-RFLP method; A PCR-SSCP (single-strand conformation polymorphism) method in which the amplified product is dissociated into single-stranded DNA, separated on a non-denaturing gel, and the mobility on the gel is compared with a control.
  • Restriction Fragment Length Polymorphism/RFLP in which DNA containing all or part (preferably all) of the gene region of the kup gene is amplified, and the size of the DNA fragment produced by the restriction enzyme of the amplified product is compared with a control.
  • PCR-RFLP method A PCR-SSCP (single-strand conformation polymorphis
  • a denaturant gradient gel electrophoresis (DGGE) method in which the amplified products are separated on a DNA denaturant concentration gradient gel and the mobility on the gel is compared with a control;
  • DGGE denaturant gradient gel electrophoresis
  • an oligo having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence on the 1-base 3' side of all or part (preferably all) bases of the gene region of the kup gene and the nucleotide sequence on the 3' side thereof
  • MALDI-TOF/MS method in which ddNTP primer extension reactions are performed using "nucleotide primers" and mass-determined genotypes are compared to controls;
  • the amplified product is dissociated into single strands to separate only one strand, and an extension reaction is performed one by one from the vicinity of all or part (preferably all) bases of the gene region of the kup gene, Pyrosequencing method in which pyrophosphate produced is measured and compared to a control;
  • AcycloPrime method in which a single-base extension reaction is performed with "oligonucleotide primer having a typical nucleotide sequence" and the degree of fluorescence polarization is measured and compared with a control, and the type of base used in the single-base extension reaction is determined and compared with the control.
  • the SNuPE method etc. to compare are mentioned.
  • each detection method when the obtained results are compared with the control and the detection results are different, for example, when the chain length of the kup gene is shorter than that of the control, the gene region of the kup gene in the lactic acid bacterium is mutated, that is, the function of the kup gene can be determined to be suppressed.
  • the chain length of the kup gene at this time the chain length that can sufficiently improve the acid resistance of lactic acid bacteria is the chain length that accompanies the amino acid mutation mentioned as a preferred embodiment of the function-suppressing amino acid mutation. is preferred.
  • a DNA sample of the kup gene which is known to have no mutation, can be mentioned.
  • Examples include standard DNA samples that are artificially synthesized based on nucleotide sequences. Further, in the case of the production method or the method for improving acid tolerance of the present invention described below, examples of the control include a DNA sample extracted from lactic acid bacteria before the function of the kup gene is artificially suppressed.
  • the expression of the kup gene is reduced indicates that about the full length of the amino acid sequence encoded by the kup gene is not expressed.
  • the “approximately the full length of the amino acid sequence encoded by the kup gene” at this time is the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or Table 1, or an amino acid sequence corresponding thereto (preferably described in SEQ ID NO: 1 is preferably 70% or more, 80% or more, 90% or more, 93% or more, 95% or more, or 100% of the amino acid sequence of
  • the non-expression of approximately the full-length amino acid sequence encoded by the kup gene can be detected by, for example, Western blotting, SDS-PAGE, or amino acid sequence sequencing.
  • promoter hypermethylation is one of the causes of decreased gene expression. Therefore, as another aspect of the detection method, for example, a method of detecting the expression of the kup gene at the transcription level using the methylation of the kup gene promoter as an indicator can also be employed.
  • a method of directly detecting changes in a nucleotide sequence after bisulfite treatment, which has the activity of converting methylated cytosine to uracil, by nucleotide sequencing For example, a method of directly detecting changes in a nucleotide sequence after bisulfite treatment, which has the activity of converting methylated cytosine to uracil, by nucleotide sequencing, A known method such as a method of indirect detection using a restriction endonuclease that can recognize (can cut) the nucleotide sequence of , but cannot recognize (cannot cut) the nucleotide sequence after bisulfite treatment can be used. Depending on the degree of methylation, expression at the transcription level is not detected, that is, it can be determined that the function of the kup gene is suppressed.
  • any one of the above-described detection methods can be employed as a method for detecting "function suppression of the kup gene" of lactic acid bacteria, and two or more types may be combined.
  • the method of detecting the function suppression of the kup gene by detecting a mutation accompanied by a function-suppressing amino acid mutation in the kup gene in the target lactic acid bacterium is preferable. More preferred is a method of detecting said mutation by directly determining the nucleotide sequence of and comparing it to a control.
  • the lactic acid bacteria of the present invention may be of one type or a combination of two or more types. More specifically, the lactic acid bacterium of the present invention includes Lactobacillus delbrueckii (L. delbrueckii) in which the function of the kup gene is suppressed. delbrueckii subsp. bulgaricus OLL205405 (hereinafter sometimes referred to as "strain f"), L. delbrueckii subsp. bulgaricus OLL205406 (hereinafter sometimes referred to as "strain i") and other Lactobacillus delbrueckii.
  • Lactobacillus delbrueckii L. delbrueckii
  • Strain f and strain i have a mutation with a function-suppressing amino acid mutation as a function-suppressing kup gene.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is accompanied by a nonsense mutation in which the codon (TGG) corresponding to Trp at position 617 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 becomes a termination codon (TAG). It has a G to A substitution mutation at position 1850.
  • the amino acids after the 174th Phe in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are substituted, and the codon corresponding to the 190th Leu in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a frame-shifted termination codon. It has a deletion mutation of T at position 521 of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2, with mutations and nonsense mutations.
  • Strain f has (1) identification indication: L. delbrueckii subsp. bulgaricus OLL205405, (2) Accession number: NITE BP-03574, (3) Accession date: December 16, 2021, and strain i is (1) Identification: L. delbrueckii subsp. bulgaricus OLL205406, (2) Accession number: NITE BP-03575, (3) Accession date: December 16, 2021, respectively, (4) Depositary institution: National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganism Depositary Center ( It has been deposited in Room 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, zip code 292-0818).
  • Lactobacillus delbrueckii identified by these accession numbers within the range that does not impede the effects of the present invention, the same strain, the same strain or an artificial mutant strain of the subculture strain, a natural mutation They may be strains, genetically modified strains, derivative strains, or the like, and may have mutations other than the aforementioned kup gene mutations associated with function-suppressing amino acid mutations.
  • the lactic acid bacterium of the present invention is a lactic acid bacterium (herein sometimes referred to as a "high acid-tolerant lactic acid bacterium”) that is sufficiently excellent in acid resistance due to the suppression of the function of the kup gene.
  • high acid-tolerant lactic acid bacteria refer to lactic acid bacteria that can survive even at low pH (eg, pH 3.5 or lower, preferably pH 3.0 or lower).
  • the acid tolerance of lactic acid bacteria can actually be confirmed and evaluated by, for example, the following acid tolerance test. That is, first, the target lactic acid bacteria are first activated and cultured in MRS medium at 37° C. under anaerobic conditions for 18 hours, and then cultured in MRS medium at 37° C. under anaerobic conditions for 18 hours. Next, the cells collected after culturing were added to artificial gastric juice (pH 3.0, 0.2% NaCl, 0.175% pepsin) and acid-treated at 37°C for 2 hours. The number of viable bacteria/the number of viable bacteria before acid treatment) ⁇ 100 (%)) can be calculated, and it can be confirmed and evaluated that the higher the survival rate, the higher the acid resistance.
  • artificial gastric juice pH 3.0, 0.2% NaCl, 0.175% pepsin
  • the "highly acid-tolerant lactic acid bacterium" in the present invention may have a moderate survival rate as long as it can survive at the low pH. More specifically, for the highly acid-tolerant lactic acid bacteria, for example, in the acid treatment test, the survival rate is preferably 20% or more, more preferably 30% or more, and 50% or more. is more preferred.
  • the present invention includes a method for producing lactic acid bacteria with improved acid tolerance, which includes a step of artificially suppressing the function of the kup gene of lactic acid bacteria, and a step of artificially suppressing the function of the kup gene of lactic acid bacteria. , and also provide a method for improving acid tolerance of lactic acid bacteria.
  • the kup gene which is the target of the production method or the method for improving acid tolerance of the present invention, typically includes genes encoding the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1 and Table 1. Since the nucleotide sequence of the kup gene can change due to genetic mutation, mating, etc., the kup gene that is the target of the production method or acid tolerance improving method of the present invention, for example, encodes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 Also included are genes of lactic acid bacteria that are orthologous to the genes that do.
  • a gene that is orthologous to the gene encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 refers to "a gene that has the closest identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1" in a certain lactic acid bacterium. It means “a gene encoding an amino acid sequence having a specific property", which corresponds to "a gene encoding an amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1" in this specification.
  • Such a gene sequence can be obtained, for example, by obtaining the nucleotide sequence of the whole genome DNA of the target lactic acid bacterium, and using the amino acid sequence analysis software, BLAST, etc., to search the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as a query.
  • the nucleotide sequence of the whole genomic DNA of the target lactic acid bacterium can be determined and obtained by a suitable known method (for example, whole genome sequencing), or can be obtained from a database such as Gen Bank (NCBI).
  • the lactic acid bacteria to be subjected to the production method or the method for improving acid tolerance of the present invention are preferably lactic acid bacteria in which the function of the kup gene is not suppressed or may be suppressed.
  • Lactic acid bacteria whose function is suppressed or may be suppressed can be selected, for example, by the acid tolerance test described above or the screening method for lactic acid bacteria of the present invention described below.
  • Methods for artificially suppressing the function of the kup gene in lactic acid bacteria include, for example, a method of introducing a mutation accompanied by a function-inhibiting amino acid mutation into the kup gene and/or a method of reducing the expression of the kup gene. be done. Mutations and reductions in expression associated with function-suppressing amino acid mutations, including preferred embodiments thereof, are as described above. A conventionally known method or a method based thereon can be appropriately adopted according to these purposes and degrees.
  • methods for introducing mutations with function-suppressing amino acid mutations into the kup gene include gene knockout methods; gene targeting methods using homologous recombination, Kunkel methods, site-directed mutagenesis methods such as SOE-PCR methods.
  • Genome editing method site-specific nuclease (meganuclease; zinc finger nuclease; TALEN; PPR; CRISPR-Cas such as CRISPR-Cas9, etc.), etc.); method of inducing mutation by repeated subculture ; A method of inducing mutation by irradiation with UV, X-ray, gamma ray, etc.; A method of inducing mutation by treatment with chemical agents (e.g., nitrosoguanidine, diethyl sulfate, nitrous acid); Exposure to gastric acid or artificial digestive juice mutagenesis, etc., and a combination of two or more of these may be used.
  • chemical agents e.g., nitrosoguanidine, diethyl sulfate, nitrous acid
  • Exposure to gastric acid or artificial digestive juice mutagenesis, etc., and a combination of two or more of these may be used.
  • methods for reducing the expression of the kup gene include the knockdown method, promoter methylation, suppression of expression by expression of antisense RNA (van der Krol AR et al., Nature 333:866, 1988), Examples thereof include suppression of expression by RNA interference (RNAi) using double-stranded RNA having a corresponding sequence, and a combination of two or more of these.
  • RNAi RNA interference
  • the acid tolerance is improved compared to the lactic acid bacteria before the step of artificially suppressing the function of the kup gene.
  • the survival rate calculated in the above acid resistance test is higher than that of the lactic acid bacteria before the above step.
  • the lactic acid bacteria subjected to the step of artificially suppressing the function of the kup gene can be confirmed to have the high acid tolerance by, for example, performing the acid tolerance test.
  • a step of confirming that it is a lactic acid bacterium may be included.
  • the present invention provides a screening method for highly acid-tolerant lactic acid bacteria, which comprises a selection step of selecting lactic acid bacteria using the suppression of the function of the kup gene as an indicator. also provide.
  • the screening method of the present invention includes not only a method for screening lactic acid bacteria that are actually highly acid-tolerant, but also a method for screening lactic acid bacteria that may be highly acid-tolerant, and can be expected to have moderate acid-tolerance. It may be a method of screening lactic acid bacteria at the level.
  • the selection step for example, whether or not the function of the kup gene is suppressed by at least one of the detection methods exemplified for the suppression of function of the kup gene (i.e., a function-suppressing amino acid mutation in the kup gene is and/or whether a decrease in the expression of the kup gene is detected), and the lactic acid bacteria in which suppression of the function of the kup gene is detected are selected from the highly acid-tolerant lactic acid bacteria (medium (including lactic acid bacteria with moderate acid tolerance), or lactic acid bacteria that may be the above-mentioned highly acid-tolerant lactic acid bacteria.
  • the determination method including its preferred mode, is as described for each of the above detection methods.
  • the screening method of the present invention may further include a step of confirming that the screened lactic acid bacteria are indeed the highly acid-tolerant lactic acid bacteria, for example, by conducting the acid tolerance test.
  • lactic acid bacterium composition refers to a composition containing lactic acid bacteria, but is not particularly limited. It may consist of only lactic acid bacteria (including a combination of two or more of the lactic acid bacteria of the present invention).
  • the present invention also provides a lactic acid bacterium composition containing lactic acid bacteria produced by the method for producing lactic acid bacteria of the present invention and lactic acid bacteria selected by the screening method for lactic acid bacteria.
  • the lactic acid bacteria composition of the present invention includes, for example, the following lactic acid bacteria starter and fermented milk.
  • the lactic acid bacterium composition of the present invention may further contain components other than the lactic acid bacterium of the present invention.
  • the other components include, but are not limited to, a solvent such as water; culture of the lactic acid bacterium; A culture that is the supernatant of the culture solution after completion, a medium component, etc.; may be a combination of
  • the lactic acid bacterium starter of the present invention contains at least the lactic acid bacterium of the present invention, and can be suitably used for the following method for producing fermented milk of the present invention.
  • a lactic acid bacterium starter of the present invention may consist of only the lactic acid bacterium of the present invention, or may further contain the other ingredients, other lactic acid bacteria, yeast, bifidobacteria, and the like.
  • the other lactic acid bacteria, yeast, and bifidobacteria examples include lactic acid bacteria, yeast, and bifidobacteria that are conventionally known to be contained in fermented milk.
  • the other lactic acid bacterium includes lactic acid bacteria other than the lactic acid bacterium of the present invention, and may be one type or a combination of two or more types thereof.
  • the lactic acid bacteria starter of the present invention preferably further contains Streptococcus lactic acid bacteria other than the lactic acid bacteria of the present invention.
  • the lactic acid bacteria starter of the present invention preferably contains the lactic acid bacterium of the present invention, which is the Lactobacillus lactic acid bacterium, and the lactic acid bacterium of the present invention, which is the Streptococcus lactic acid bacterium.
  • Lactic acid bacteria of the genus Streptococcus are aerobic Gram-positive cocci, and examples include Streptococcus thermophilus and Streptococcus salivarius.
  • the Streptococcus lactic acid bacterium is preferably a lactic acid bacterium belonging to Streptococcus thermophilus.
  • the lactic acid bacteria starter of the present invention may be liquid or solid such as a frozen state or dry powder, and may further contain other ingredients.
  • Other components that can be contained in the lactic acid bacteria starter include, for example, fermentation promoters (formic acid, nucleic acids, etc.); protective agents (sugars); medium components (milk, whey, etc.). It may be one of or a combination of two or more.
  • the content of the lactic acid bacteria of the present invention in the lactic acid bacteria starter of the present invention is not particularly limited, but is preferably 0.01 to 100% by mass, more preferably 0.1 to 90% by mass.
  • the viable cell count is preferably 1 ⁇ 10 7 cfu/g or more, more preferably 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 11 cfu/g.
  • the ratio of the content of the lactic acid bacteria of the present invention to the content of the other lactic acid bacteria in the lactic acid bacteria starter is The number (converted to the number of viable bacteria, hereinafter the same) ratio is preferably 1:0.1 to 1:100, more preferably 1:1 to 1:10.
  • the lactic acid bacteria starter of the present invention is a combination of the lactic acid bacteria of the present invention, Lactobacillus lactic acid bacteria, and the lactic acid bacteria of the present invention, Streptococcus lactic acid bacteria, the content of Lactobacillus lactic acid bacteria in the lactic acid bacteria starter and The ratio to the content of Streptococcus lactic acid bacteria is preferably 1:0.1 to 1:100, preferably 1:1 to 1:10, in terms of the number of bacteria (converted to the number of viable bacteria, the same shall apply hereinafter). is more preferable.
  • the lactic acid bacteria starter of the present invention can be used, for example, in combination with the composition containing the other lactic acid bacteria (second lactic acid bacteria composition) as a lactic acid bacteria starter kit containing the lactic acid bacteria starter of the present invention and the second lactic acid bacteria composition. good.
  • additives for producing fermented milk Fermentation promoting substance, protective agent, etc.
  • a container, instructions for use of the lactic acid bacteria starter, etc. may be combined to form a lactic acid bacteria starter kit.
  • the fermented milk of the present invention contains at least the lactic acid bacterium of the present invention, and can be obtained, for example, by the following method for producing fermented milk of the present invention.
  • the present invention also provides fermented milk containing lactic acid bacteria produced by the method for producing lactic acid bacteria of the present invention or lactic acid bacteria selected by the screening method for lactic acid bacteria. Since the lactic acid bacterium of the present invention contained in the fermented milk of the present invention has excellent acid resistance, even when the fermented milk is orally ingested and exposed to acids such as gastric acid, it reaches the intestine with a high survival rate. It is possible.
  • the fermented milk of the present invention is not particularly limited. 0% or more, and the number of lactic acid bacteria or yeast (preferably the number of lactic acid bacteria (more preferably the number of lactic acid bacteria of the present invention), hereinafter the same) of 10 million/mL or more).
  • the fermented milk of the present invention satisfies the standards of "dairy lactic acid bacteria beverage" according to the milk ministerial ordinance (more specifically, the content of non-fat milk solids is 3.0% or more, the number of lactic acid bacteria Or those with a yeast count of 10 million / mL or more); 1,000,000/mL or more) are also included.
  • the non-fat milk solids content refers to the remaining components (mainly protein, lactose, minerals, etc.) after subtracting the fat content from the whole milk solids.
  • the number of viable bacteria measured by a prescribed test method, a method using a BCP-added plate count agar medium, but when the fermented milk is sterilized, it is measured by the test method before the sterilization. It is a viable count conversion.
  • the fermented milk of the present invention may be a fermented product after the fermentation step in the method for producing fermented milk described below, or may be a fermented product that has been sterilized (pulverized, heat-treated, etc.). Alternatively, they may be concentrated, diluted, dried, frozen, or the like. In addition, in this invention, when the said fermented milk is pasteurized, the number of lactic acid bacteria in the said fermented milk is viable count conversion.
  • the lactic acid bacteria contained in the fermented milk of the present invention include not only live bacteria but also dead bacteria, crushed products and heat-treated products of lactic acid bacteria, concentrates, diluted products, dried products, and frozen products thereof.
  • the fermented milk of the invention preferably contains at least live lactic acid bacteria, and more preferably contains the lactic acid bacteria of the present invention as live bacteria.
  • the fermented milk of the present invention contains ingredients derived from the lactic acid bacterium of the present invention and the following raw material milk (preferably emulsion liquid).
  • ingredients derived from the lactic acid bacterium of the present invention and the following raw material milk (preferably emulsion liquid).
  • other ingredients listed in the lactic acid bacteria starter, other lactic acid bacteria, yeast, bifidobacteria, and the like may be further contained within the range that does not impair the effects of the present invention.
  • it may contain various components that can be contained in food and drink.
  • fermented milk examples include sugars, sugar alcohols, minerals, vitamins, proteins, peptides, amino acids, organic acids, pH adjusters, starch and Modified starch, dietary fiber, fruits/vegetables and their processed products, animal and plant crude drug extracts, naturally derived polymers (collagen, hyaluronic acid, chondroitin, etc.), fats and oils, thickeners, emulsifiers, solvents, surfactants, gelling agents, stabilizers, buffers, suspending agents, thickening agents, excipients, disintegrating agents, binders, fluidizing agents, preservatives, coloring agents, flavoring agents, flavoring agents, sweetening agents and the like. It may be one of or a combination of two or more.
  • yogurt is particularly preferable.
  • Specific examples of the yogurt include set-type yogurt (solid fermented milk) such as plain yogurt, soft-type yogurt (paste-like fermented milk), and drink-type yogurt (liquid fermented milk). It may be frozen yogurt used as.
  • the fermented milk of the present invention can also be used as a material for fermented foods such as cheese, fermented cream, fermented butter and kefir.
  • the fermented milk of the present invention can also be used as a lactic acid bacteria starter in the following method for producing fermented milk.
  • the method for producing fermented milk of the present invention includes the lactic acid bacterium of the present invention, the lactic acid bacterium produced by the method for producing lactic acid bacteria of the present invention, and the lactic acid bacterium selected by the screening method for lactic acid bacteria of the present invention, and the lactic acid bacterium of the present invention.
  • a fermentation step is included in which at least one of the lactic acid bacteria compositions is added to a formula liquid containing raw material milk and fermented to obtain fermented milk.
  • the method for producing fermented milk of the present invention includes the step of artificially suppressing the function of the kup gene and the selection. Further steps may be included, but only the first step is sufficient.
  • the emulsion liquid according to the present invention contains raw material milk.
  • the raw material milk preferably contains lactose, for example, raw milk (e.g., milk of cow, buffalo, sheep, goat, etc.), pasteurized milk, whole milk, skim milk, whey, and these Processed products (e.g. whole milk powder, whole milk concentrate, skim milk powder, skim concentrate, condensed milk, whey powder, buttermilk, butter, cream, cheese, whey protein concentrate (WPC), whey protein isolate (WPI ), ⁇ -lactalbumin ( ⁇ -La), ⁇ -lactoglobulin ( ⁇ -Lg)), and one of them or a mixture of two or more thereof may be used.
  • raw milk e.g., milk of cow, buffalo, sheep, goat, etc.
  • WPC whey protein concentrate
  • WPI whey protein isolate
  • ⁇ -La ⁇ -lactoglobulin
  • ⁇ -Lg ⁇ -Lg
  • the emulsion liquid according to the present invention may consist of only the raw material milk, or may be an aqueous solution, a diluted solution, or a concentrated liquid of the raw material milk. It may further contain other components. Such other ingredients include water; soymilk, sugars and other sugars, sweeteners, flavorings, fruit juices, pulp, vitamins, minerals, fats and oils, ceramides, collagen, milk phospholipids, foods such as polyphenols, food ingredients, or food additives; pectin, soybean polysaccharides, CMC (carboxymethylcellulose), agar, gelatin, carrageenan, stabilizers such as gums, thickeners, gelling agents, etc., and one of these It may be one or a mixture of two or more.
  • the liquid formula can be prepared by mixing the ingredients, optionally with heating and/or while optionally homogenizing.
  • heat sterilized or sterilized liquid can also be used as the emulsion liquid.
  • the fermentation step of adding the lactic acid bacterium of the present invention or the lactic acid bacterium composition of the present invention to the emulsion preparation and fermenting the mixture a conventionally known method can be appropriately employed, and there is no particular limitation.
  • the amount of the lactic acid bacterium of the present invention or the lactic acid bacterium composition of the present invention to be added can be appropriately set according to the amount of the lactic acid bacterium starter to be added that is employed in conventionally known methods for producing fermented milk.
  • the viable cell count of the lactic acid bacteria of the present invention is preferably 1 ⁇ 10 7 to 5 ⁇ 10 9 cfu/g, more preferably 1 ⁇ 10 8 to 2 ⁇ 10 9 cfu/g, relative to the mass of the emulsion. is more preferred.
  • lactic acid bacteria of the present invention or the lactic acid bacteria composition of the present invention
  • other lactic acid bacteria, yeast, bifidobacteria, etc. may be added to the emulsion preparation.
  • the lactic acid bacterium of the present invention is a lactic acid bacterium of the genus Lactobacillus
  • the ratio of the added amount of the lactic acid bacterium of the present invention to the added amount of the other lactic acid bacterium is The ratio is preferably 1:0.1 to 1:100, more preferably 1:1 to 1:10.
  • the lactic acid bacterium of the present invention is a combination of the lactic acid bacterium of the present invention, Lactobacillus lactic acid bacterium, and the lactic acid bacterium of the present invention, Streptococcus lactic acid bacterium, the amount of lactic acid bacterium of the genus Lactobacillus added and the amount of lactic acid bacterium of the genus Streptococcus added
  • the ratio to the amount is preferably 1:0.1 to 1:100, more preferably 1:1 to 1:10, in terms of the number of bacteria (converted to the number of viable bacteria, hereinafter the same).
  • the conditions for the fermentation are not particularly limited and can be appropriately selected according to the growth conditions of the lactic acid bacteria to be added, the amount of the milk preparation, and the like.
  • the pH of the emulsion solution to which the lactic acid bacterium of the present invention or the lactic acid bacterium composition of the present invention has been added is 4.7 or less, more preferably 4.6 or less, and still more preferably 4.0. It is preferable to stand still or stir (preferably leave still) for generally 2 to 24 hours, more preferably 3 to 8 hours, still more preferably 4 to 6 hours, until the temperature reaches ⁇ 4.5.
  • the fermented milk of the present invention can be obtained by the above fermentation.
  • the fermented product after the fermentation step can be used as the fermented milk of the present invention as it is or by concentrating, diluting, drying, freezing, or the like as necessary.
  • the fermented milk of the present invention may be obtained by crushing or heat-treating the lactic acid bacteria in the fermented product, or by concentrating, diluting, drying, freezing, or the like as necessary. Therefore, the method for producing fermented milk of the present invention may further include these steps (concentration step, dilution step, drying step, freezing step, crushing step, heat treatment step, etc.).
  • Strain P2103001 (Comparative Example 1): Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus. Strains deposited by the Meiji Innovation Center of Meiji Co., Ltd., 1-29-1 Shichikoku, Hachioji, Tokyo 192-0919 Japan; Strain f (Example 1): Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus identified by accession number NITE BP-03574; Strain i (Example 2): Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus identified by accession number NITE BP-03575 was used.
  • 1 mL of the bacterial cell suspension was added to 9 mL of the artificial gastric juice, and acid treatment was performed at 37° C. for 2 hours. 1 mL of the acid-treated solution was collected and neutralized by adding 9 mL of 67 mM phosphate buffer (pH 6.5) to obtain an acid-treated bacterial solution. After serially diluting each of the cell suspension and the acid-treated cell solution with PBS, 100 ⁇ L of each was spread on an agar medium and cultured at 37° C. under anaerobic conditions for 48 hours.
  • Survival rate (%) (number of viable cells in acid-treated bacterial solution ⁇ 100/number of viable cells in cell suspension) ⁇ 100 The survival rate was determined by As a result, the survival rate of the P2103001 strain was 2.58%, which is about the same as that of conventional lactic acid bacteria, whereas the survival rate of strain f was 65.8%, and the survival rate of strain i was 95%. At .4%, strain f and strain i were found to be highly resistant strains to simulated gastric juice (acid).
  • a DNA library was prepared from the genomic DNA sample obtained above using Nextera XT DNA Library Prep kit (manufactured by Illumina) and purified by AMPure XP (manufactured by Beckman Coulter Life Sciences). The average library size was measured with the High Sensitivity DNA kit (manufactured by Agilent), and the concentration was measured with the Quan-iT dsDNA High Sensitivity Assay kit (manufactured by Thermo Fisher Scientific). Then, the DNA was diluted with ultrapure water to a DNA concentration of 2 nM, all samples were mixed in equal amounts, and 0.2N sodium hydroxide solution was added to the resulting mixture for denaturation.
  • the 1850th G in the nucleotide sequence of the P2103001 strain was replaced with A, and the codon corresponding to the 617th Trp in the amino acid sequence of the P2103001 strain was replaced with a stop codon (nonsense mutation, Table 4 below).
  • strain i the 521st T in the nucleotide sequence of the P2103001 strain is deleted, the amino acid after the 174th Phe in the amino acid sequence of the P2103001 strain is replaced by frameshift mutation, and the amino acid sequence of the P2103001 strain is The codon corresponding to Leu at position 190 (Phe174 to 16) was replaced with a stop codon (Table 6 below).
  • transposase-related indicates a gene encoding a transposase-related protein
  • no annotation indicates a gene whose information cannot be specified
  • lysA indicates a phage. It can be said that these are genes encoding Lyzozyme from which they are derived, and that none of these are genes that affect acid tolerance. Therefore, the kup gene was considered to be a factor involved in acid tolerance.
  • strain f (Test Example 2) Analysis of revertant strain [strain f] Strain f was placed in a 10% skim milk powder medium containing 10% skim milk powder (10 parts by mass of skim milk powder and 90 parts by mass of distilled water) mixed with 0.1% Yeast Extract (manufactured by Gibco) at 37°C under anaerobic conditions. for 18 hours, 50 ⁇ L of the cultured bacterial solution was inoculated into 5 mL of 10% skim milk powder medium, and the operation of culturing under the above conditions (passaging) was repeated to induce mutation. When the acid resistance test was performed in the same manner as in (2) of Test Example 1 at the 10th passage, a strain (f-1) with a significantly reduced survival rate of 0.74% was obtained.
  • strain f is cultured in MRS medium at 37° C. for 18 hours under anaerobic conditions, 50 ⁇ L of the cultured bacterial solution is inoculated into 5 mL of MRS medium, and further cultured under the above conditions (passage). was repeated 10 times to induce mutation.
  • an acid tolerance test was performed in the same manner as in Test Example 1 (2), and the survival rate was 37.7%, indicating that the acid tolerance was maintained.
  • strain f-1 and strain f-2 were subjected to draft genome sequencing in the same manner as in (3) of Test Example 1, except that the contig of strain f was used as the reference sequence to detect gene mutation sites. , only mutation sites with amino acid mutations from strain f were extracted.
  • Table 3 shows the mutations from strain f that were confirmed in strain f-1 and strain f-2. Table 3 also shows the survival rate of each of the above strains. Further, Table 4 below shows the details of the mutation at amino acid sequence 617 (nucleotide sequence 1849-1851) in strain P2103001, strain f, strain f-1, and strain f-2.
  • strain f-1 and strain f-2 there were 9 and 6 mutations (non-synonymous substitutions) associated with amino acid mutations from strain f, respectively.
  • the only mutations other than "transposase-related", “unannotated”, and "lysA" above were mutations in the kup gene in strain f-1.
  • T at position 1849 in the nucleotide sequence of strain f was replaced with C, and the termination codon of strain f was replaced with Gln in the kup gene.
  • strain f-1 only had a mutation in which Trp at position 617 was replaced with Gln (one amino acid substitution).
  • the strain f-2 in which acid resistance was maintained, no mutation associated with the amino acid mutation from the strain f was confirmed in the kup gene.
  • the strain f-1 it was shown that the loss of the nonsense mutation in the kup gene in the strain f restored the acid sensitivity and reduced the acid tolerance. Therefore, it was confirmed that the kup gene is a factor involved in acid tolerance, and suppression of its function improves acid tolerance.
  • [Stock i] Strain i is cultured in MRS medium at 37° C. under anaerobic conditions for 18 hours, 50 ⁇ L of the cultured bacterial solution is inoculated into 5 mL of MRS medium, and the operation of further culturing under the above conditions (passaging) is repeated. Ta. At the 10th passage, an acid resistance test was performed in the same manner as in Test Example 1 (2), and a strain (i-1) with a significantly reduced survival rate of 0.074% was obtained.
  • strain i-1 was subjected to draft genome sequencing in the same manner as in Test Example 1 (3) except that the contig of strain i was used as a reference sequence to detect gene mutation sites, and Only mutation sites with amino acid mutations were extracted.
  • Table 5 shows the mutations from strain i that were confirmed in strain i-1.
  • Table 5 also shows the survival rate of strain i-1.
  • Table 6 shows the amino acid sequences 172 to 190 in the P2103001 strain, strain i, and strain i-1, and the nucleotide sequences (base sequences) 514 to 525 corresponding to the amino acid sequences 172 to 175. Details are given, as well as SEQ ID NOs indicating positions 172-190 of each amino acid sequence (172-189 for strain i).
  • strain i-1 As shown in Tables 5 and 6, in strain i-1, there were 18 mutations (non-synonymous substitutions) accompanied by amino acid mutations from strain i. Mutations other than "no annotation" and "lysA" were only mutations in the kup gene.
  • strain i-1 which has reduced resistance to acid, in the kup gene, A was inserted at position 516 in the nucleotide sequence of strain i. It was reverted to the same amino acid sequence as the amino acid sequence after the 174th Phe in the amino acid sequence of the P2103001 strain.
  • loss of the frameshift mutation in the kup gene in strain i restored acid sensitivity and reduced acid tolerance. Therefore, this also confirmed that the kup gene is a factor involved in acid tolerance, and that suppression of its function improves acid tolerance.
  • lactic acid bacteria having sufficiently excellent resistance to acids such as gastric acid lactic acid bacteria compositions containing the same, methods for producing lactic acid bacteria having improved acid resistance, and improved acid resistance of lactic acid bacteria. It is possible to provide a method, a screening method for lactic acid bacteria with sufficiently excellent acid resistance, and a method for producing fermented milk using these lactic acid bacteria and/or lactic acid bacteria compositions.

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Abstract

乳酸菌のｋｕｐ遺伝子の機能を人為的に抑制する工程を含む、乳酸菌の酸耐性向上方法。

Description

乳酸菌、乳酸菌組成物、乳酸菌の製造方法、乳酸菌の酸耐性向上方法、乳酸菌のスクリーニング方法、及び発酵乳の製造方法
　本発明は、乳酸菌、乳酸菌組成物、乳酸菌の製造方法、乳酸菌の酸耐性向上方法、乳酸菌のスクリーニング方法、及び発酵乳の製造方法に関し、より詳細には、乳酸菌及びこれを含有する乳酸菌組成物、乳酸菌の製造方法、乳酸菌の酸耐性向上方法、乳酸菌のスクリーニング方法、並びに、これらの乳酸菌及び／又は乳酸菌組成物を用いた発酵乳の製造方法を提供することに関する。
　乳酸菌は、ヨーグルト等の発酵乳や漬物等の発酵食品の製造に古くから用いられている微生物であるが、近年では、消化管内の細菌叢の調節による整腸効果、免疫機能改善効果、及び抗腫瘍効果といった、宿主に対して様々な有益な効果をもたらすプロバイオティクスとしても注目が高まっている。
　しかしながら、従来の乳酸菌は一般に酸耐性が低く、例えば、経口で摂取された乳酸菌は、胃酸や胆汁酸といった酸によって腸内での生残率が低減してしまうため、乳酸菌が前記プロバイオティクスとして本来有する効果が腸内で十分に発揮されないという問題を有していた。そのため、乳酸菌の酸耐性を向上させることを目的とした研究がこれまでにいくつかなされている。例えば、特開２００５－１６０号公報（特許文献１）には、乳酸菌を含む微生物のｈｒｃＡ遺伝子を破壊することにより、ヒト及び動物の生体内で微生物の生残性を向上させる方法が記載されている。また、例えば、特開２００１－２０４４６８号公報（特許文献２）には、酸性条件でも乳酸生産性の高い微生物を得ることを目的とした、ビフィドバクテリウム属又はラクトバシラス属に属する微生物由来の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及びプロモーターが組み込まれた組み換えベクターを含む酸耐性乳酸生成微生物が記載されている。
特開２００５－１６０号公報 特開２００１－２０４４６８号公報
　しかしながら、乳酸菌の酸耐性に関与する因子については、報告数が未だ十分ではない。そのため、例えば、乳酸菌が優れた酸耐性を有するか否かの試験としては、従来、人工胃液耐性試験（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）や、動物による消化管通過性試験が行われているが、これらの方法では、一度に大量の乳酸菌種に対して試験を行うことが困難であるという問題も有していた。したがって、乳酸菌の酸耐性に関与する因子のさらなる研究が望まれていた。
　本発明は、上記従来技術が有する課題に鑑みてなされたものであり、胃酸等の酸に対する耐性が十分に優れた乳酸菌及びこれを含有する乳酸菌組成物、酸に対する耐性が向上された乳酸菌の製造方法、乳酸菌の酸耐性向上方法、酸に対する耐性が十分に優れた乳酸菌のスクリーニング方法、並びに、これらの乳酸菌及び／又は乳酸菌組成物を用いた発酵乳の製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を行い、酸耐性試験において高い生残率を示す乳酸菌を単離することに成功した。次いで、乳酸菌における酸耐性に関与する因子を探索するために、前記酸耐性試験において生残率が高い乳酸菌（高酸耐性乳酸菌）と、従来の一般的乳酸菌（すなわち、酸耐性試験において生残率が低い乳酸菌：低酸耐性乳酸菌）との間で、ゲノム解析を行った。かかるゲノム解析では、高酸耐性乳酸菌に共通する変異であってアミノ酸変異を伴う変異として、ｋｕｐ遺伝子におけるフレームシフト変異やナンセンス変異が抽出された。さらに、前記高酸耐性乳酸菌を複数回継代して変異を誘発したところ、酸耐性が失われた乳酸菌が得られたため、これと前記高酸耐性乳酸菌との間でもゲノム解析を行った。その結果、酸耐性が失われた乳酸菌では、誘発された変異によって、前記高酸耐性乳酸菌で抽出されたｋｕｐ遺伝子におけるフレームシフト変異やナンセンス変異が消失し、元の低酸耐性乳酸菌のｋｕｐ遺伝子のヌクレオチド配列にほぼ復帰していた。
　よって、これら知見から、本発明者らは、ｋｕｐ遺伝子は乳酸菌の酸耐性に関与する因子であって、かかるｋｕｐ遺伝子の機能が抑制されている乳酸菌は酸に対する耐性が十分に優れることを見い出した。そのため、ｋｕｐ遺伝子の機能を人為的に抑制することで、乳酸菌の酸耐性を向上させることや、ｋｕｐ遺伝子の機能が抑制されていることを指標として、酸に対する耐性が十分に優れた乳酸菌を容易にスクリーニングすることが可能となることも見出し、本発明を完成するに至った。
　したがって、本発明は、下記の態様を提供する。
［１］
　乳酸菌のｋｕｐ遺伝子の機能を人為的に抑制する工程を含む、乳酸菌の酸耐性向上方法。
［２］
　前記乳酸菌がラクトバシラセエ科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）乳酸菌である、［１］に記載の方法。
［３］
　前記乳酸菌がラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）乳酸菌である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
　乳酸菌のｋｕｐ遺伝子の機能を人為的に抑制する工程を含む、酸耐性が向上された乳酸菌の製造方法。
［５］
　前記乳酸菌がラクトバシラセエ科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）乳酸菌である、［４］に記載の製造方法。
［６］
　前記乳酸菌がラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）乳酸菌である、［４］又は［５］に記載の製造方法。
［７］
　ｋｕｐ遺伝子の機能が抑制されている乳酸菌。
［８］
　ラクトバシラセエ科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）乳酸菌である、［７］に記載の乳酸菌。
［９］
　ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）乳酸菌である、［７］又は［８］に記載の乳酸菌。
［１０］
　［７］～［９］のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌を含有する、乳酸菌組成物。
［１１］
　ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）乳酸菌をさらに含有する、［１０］に記載の乳酸菌組成物。
［１２］
　乳酸菌スターターである、［１０］又は［１１］に記載の乳酸菌組成物。
［１３］
　発酵乳である、［１０］又は［１１］に記載の乳酸菌組成物。
［１４］
　ｋｕｐ遺伝子の機能が抑制されていることを指標として、乳酸菌を選択する選択工程を含む、高酸耐性乳酸菌のスクリーニング方法。
［１５］
　［４］～［６］のうちのいずれか一項の製造方法で得られた乳酸菌、［７］～［９］のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌、［１０］～［１３］のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌組成物、及び［１４］のスクリーニング方法で選択された乳酸菌からなる群から選択されるいずれかを、原料乳を含有する調乳液に添加して発酵させ、発酵乳を得る発酵工程を含む、発酵乳の製造方法。
［１６］
　前記調乳液にストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）乳酸菌をさらに添加する工程を含む、［１５］に記載の発酵乳の製造方法。
　本発明によれば、胃酸等の酸に対する耐性が十分に優れた乳酸菌及びこれを含有する乳酸菌組成物、酸に対する耐性が向上された乳酸菌の製造方法、乳酸菌の酸耐性向上方法、酸に対する耐性が十分に優れた乳酸菌のスクリーニング方法、並びに、これらの乳酸菌及び／又は乳酸菌組成物を用いた発酵乳の製造方法を提供することが可能となる。
　以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。
　＜乳酸菌＞
　本発明において、「乳酸菌」とは、ブドウ糖を資化して対糖収率で５０％以上の乳酸を生産可能な微生物の総称であり、生理学的性質としては、グラム陽性菌の球菌又は桿菌であって、運動性なし、基本的に胞子形成能なし（例外として、バシラス・コアギュランスのように胞子形成能のある乳酸菌もある）、カタラーゼ陰性等の特徴を有する。
　本発明に係る乳酸菌としては、ストレプトコッカセエ科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕａｃｅａｅ）乳酸菌、ラクトバシラセエ科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）乳酸菌、ロイコノストック科（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃａｃｅａｅ）乳酸菌等が挙げられ、より具体的には、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）乳酸菌、ラクチカゼイバチルス属（Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）乳酸菌、ラクチプランティバチルス属（Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ）乳酸菌、リクォリラクトバチルス属（Ｌｉｑｕｏｒｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）乳酸菌、リモシラクトバチルス属（Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）乳酸菌、レビラクトバチルス属（Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）乳酸菌、レンチラクトバチルス属（Ｌｅｎｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）乳酸菌、ワイセラ属（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）乳酸菌等の乳酸桿菌；ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）乳酸菌、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）乳酸菌、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）乳酸菌、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）乳酸菌、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）乳酸菌等の乳酸球菌；ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）乳酸菌等が挙げられる。これらの中でも、ラクトバシラセエ科乳酸菌であることが好ましく、ラクトバチルス属乳酸菌であることがより好ましい。
　ラクトバチルス属乳酸菌としては、例えば、ラクトバチルス・デルブルッキー、ラクトバチルス・ナサリディス、ラクトバチルス・エクイクルソリス、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・パラガセリ、ラクトバチルス・アミロボロス、ラクトバチルス・クリスパータスが挙げられ、本発明において、各種には、それぞれその亜種（サブスピーシズ）も含む。
　前記ラクトバチルス属乳酸菌の中でも、本発明の乳酸菌としては、ラクトバチルス・デルブルッキーであることが特に好ましく、ラクトバチルス・デルブルッキーとしては、例えば、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシズ・ブルガリクス（ブルガリア菌）、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシズ・デルブルッキー、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシズ・ラクティス、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシズ・インディカス、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシズ・スンキ、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシズ・ヤコブセニが挙げられる。
　なお、本発明によれば、乳酸菌に加えて、ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｉｕｍ）においても、ｋｕｐ遺伝子の機能を人為的に抑制することで、ビフィズス菌の酸耐性を向上させることや、ｋｕｐ遺伝子の機能が抑制されていることを指標として、酸に対する耐性が十分に優れたビフィズス菌を容易にスクリーニングすることが可能となる。本発明において、「ビフィズス菌」とは、放線菌綱Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ目Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌の総称であり、乳糖及びオリゴ糖を資化して酢酸及び乳酸を生産可能な、グラム陽性菌の偏性嫌気性桿菌である。
　（ｋｕｐ遺伝子）
　本発明の乳酸菌は、ｋｕｐ遺伝子の機能が抑制されている乳酸菌である。「ｋｕｐ遺伝子」は、微生物間で広く保存されている遺伝子であり、大腸菌等では、カリウムトランスポーター（Ｋｕｐ；ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｕｐｔａｋｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）として機能するタンパク質をコードする遺伝子として知られている。しかしながら、乳酸菌（特にラクトバチルス属乳酸菌）においては、ｋｕｐ遺伝子がコードするタンパク質（又はアミノ酸配列）がどのような機能を有しているかは未だ十分に明らかではなかった。
　本発明に係るｋｕｐ遺伝子としては、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子が挙げられ、その典型的なヌクレオチド配列は配列番号２に示す。なお、配列番号１に記載のアミノ酸配列及び配列番号２に記載のヌクレオチド配列は、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシズ・ブルガリクスＰ２１０３００１（株式会社明治の明治イノベーションセンター（郵便番号１９２－０９１９　日本国東京都八王子市七国１－２９－１）により保管されている菌株）のものである。
　また、乳酸菌（特にラクトバシラセエ科乳酸菌、好ましくはラクトバチルス属乳酸菌）間において、ｋｕｐ遺伝子がコードするアミノ酸配列は高い同一性で保存されており、本発明に係るｋｕｐ遺伝子としては、例えば、下記の表１に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子も挙げられる。なお、これらアミノ酸をコードする遺伝子のヌクレオチド配列については、多型などによって株レベルでの個体差が生じ得ることは理解されたい。表１には、乳酸菌の典型的なｋｕｐ遺伝子がコードするアミノ酸配列のアクセッション番号（Ｎｏ．）、及び配列番号１に記載のアミノ酸配列とのアミノ酸同一性（％）、並びに、同アミノ酸配列が由来する乳酸菌名を示す。
　（ｋｕｐ遺伝子の機能抑制）
　本発明において、「ｋｕｐ遺伝子の機能が抑制されている（ｋｕｐ遺伝子の機能抑制）」とは、機能抑制型のアミノ酸変異を伴う変異がｋｕｐ遺伝子になされていること、及び／又は、ｋｕｐ遺伝子の発現が低下していることを示す。乳酸菌（特にラクトバチルス属乳酸菌）のｋｕｐ遺伝子がコードするアミノ酸配列の具体的機能までは未だ十分に明らかではないが、本発明者らは、乳酸菌において、ｋｕｐ遺伝子の機能、すなわち、少なくとも正しいアミノ酸配列（例えば配列番号１や表１に記載のアミノ酸配列）をコードして発現する機能を抑制することにより、酸耐性を向上させることが可能となることを見出した。そのため、本発明における「ｋｕｐ遺伝子の機能」には、少なくとも酸感受機能が含まれるといえる。なお本発明において、機能の「抑制」という場合には、当該機能の欠失も含む。
　〔機能抑制型のアミノ酸変異を伴う変異〕
　本発明において、「機能抑制型のアミノ酸変異」としては、前記酸感受機能が抑制（欠失も含む）される、すなわち、乳酸菌の酸耐性が向上するアミノ酸変異である限り特に制限されないが、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加が挙げられ、より具体的には、例えば、配列番号１若しくは表１に記載のアミノ酸配列、又はこれらに対応するアミノ酸配列における１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加が挙げられ、配列番号１に記載のアミノ酸配列における１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加が好ましい。
　なお、本発明において、アミノ酸配列又は領域に「対応する」アミノ酸配列又は領域とは、アミノ酸配列解析ソフトウェア（ＧＥＮＥＴＹＸ－ＭＡＣ、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ等）やＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等を用いて（例えば、パラメータ：デフォルト値（すなわち初期設定値））アミノ酸配列を整列させた際に、対照のアミノ酸配列又は領域（例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列、表１に記載のアミノ酸配列、下記の配列番号３に記載のアミノ酸配列）と同列になるアミノ酸配列又は領域を示す。
　このような機能抑制型のアミノ酸変異を伴うｋｕｐ遺伝子の変異としては、例えば、ｋｕｐ遺伝子のヌクレオチド配列における１若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加によるミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異、及びこれらの組み合わせが挙げられ、遺伝子ノックアウト等による複数又は全部の塩基の置換及び／又は欠失も含まれる。
　前記酸感受機能がより十分に抑制される、すなわち、乳酸菌の酸耐性をより十分に向上させることが可能な機能抑制型のアミノ酸変異として好ましくは、置換、欠失、挿入及び／又は付加、好ましくは置換及び／又は欠失、より好ましくは欠失されたアミノ酸数が、４６残基以上であることが好ましく、６０残基以上であることがより好ましく、７０残基以上であることがさらに好ましい。また、かかる機能抑制型のアミノ酸変異としては、ｋｕｐ遺伝子がコードするアミノ酸配列の少なくともＣ末ドメインの全部又は一部における置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むことがさらに好ましく、少なくとも前記Ｃ末ドメインの全部又は一部の欠失を含むことが特に好ましい。
　本発明において、ｋｕｐ遺伝子がコードするアミノ酸配列のＣ末ドメインとは、配列番号１で示されるアミノ酸配列の第４５０番目のＧｌｙ以降のＣ末側の領域、及び前記領域に対応する領域を示す。配列番号３に、前記Ｃ末ドメインの典型的な配列（配列番号１で示されるアミノ酸配列の第４５０番目のＧｌｙ以降）を示し、これをコードする典型的なヌクレオチド配列を配列番号４に示す。
　前記Ｃ末ドメインの全部又は一部の欠失として、より具体的には、Ｃ末ドメイン（配列番号３ではアミノ酸数２２７）のうちの２０％以上のアミノ酸の欠失であることが好ましく、２６％以上、さらには３０％以上、５０％以上、７０％以上、８０％以上、又は１００％のアミノ酸の欠失であることがより好ましい。
　前記機能抑制型のアミノ酸変異の例としては、例えば、配列番号１若しくは表１に記載のアミノ酸配列、又はこれらに対応するアミノ酸配列（好ましくは配列番号１に記載のアミノ酸配列）のうちの４６残基以上（好ましくは、６０残基以上、又は７０残基以上）のアミノ酸の置換及び／又は欠失；配列番号３に記載のアミノ酸配列又はこれに対応するアミノ酸配列（好ましくは配列番号３に記載のアミノ酸配列）のうちの２０％以上（好ましくは、２６％以上、３０％以上、５０％以上、７０％以上、８０％以上、又は１００％）のアミノ酸の欠失等が挙げられるが、これらに制限されるものではない。
　本発明において、乳酸菌のｋｕｐ遺伝子における「機能抑制型のアミノ酸変異を伴う変異」を検出する方法としては、従来公知の方法を適宜適用することができ、特に制限はないが、例えば、下記の方法が挙げられる。なお、本発明において遺伝子の「変異の検出」とは、原則として、ゲノムＤＮＡ上の変異を検出することを意味するが、当該ゲノムＤＮＡ上の変異は転写産物における塩基の変化や翻訳産物におけるアミノ酸の変化に反映されるため、これら転写産物や翻訳産物における当該変化を検出すること（すなわち、転写レベルや翻訳レベルでの間接的な検出）をも含む意味である。
　前記検出方法の一態様としては、ｋｕｐ遺伝子の遺伝子領域のヌクレオチド配列を直接決定して対照と比較することにより、変異を検出する方法が挙げられる。本発明において「ｋｕｐ遺伝子の遺伝子領域」とは、ゲノムＤＮＡ上の少なくともｋｕｐ遺伝子を含む一定領域を意味し、翻訳領域以外に非翻訳領域としてｋｕｐ遺伝子の発現制御領域（例えば、プロモーター領域、エンハンサー領域）やｋｕｐ遺伝子の５’末端非翻訳領域等も含んでいてよい。
　この態様においては、先ず、対象の乳酸菌からＤＮＡ試料を調製する。ＤＮＡ試料としては、ゲノムＤＮＡ試料、及びＲＮＡからの逆転写によって調製されるｃＤＮＡ試料が挙げられる。前記乳酸菌からゲノムＤＮＡ又はＲＮＡを抽出する方法、及びｃＤＮＡを調製する方法としては特に制限はなく、それぞれ公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができる。次いで、ｋｕｐ遺伝子の遺伝子領域を含むＤＮＡを単離し、単離したＤＮＡのヌクレオチド配列を決定する。該ＤＮＡの単離は、例えば、ｋｕｐ遺伝子の遺伝子領域の全て又は一部（好ましくは全て）を挟み込むように設計された一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡ、或いはＲＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって行うことができる。当業者であれば、公共のデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋ等）等から取得可能なｋｕｐ遺伝子のヌクレオチド配列（好ましくは、配列番号２に記載のヌクレオチド配列や表１に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）に基づいて、適したオリゴヌクレオチドプライマーを常法により設計することができる。単離したＤＮＡのヌクレオチド配列の決定は、マキサムギルバート法やサンガー法など当業者に公知の方法で行うことができる。また、調製したゲノムＤＮＡやｃＤＮＡからＤＮＡライブラリを作成し、次世代シークエンサー等を用いて全ゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を決定してもよい。
　決定したＤＮＡ若しくはｃＤＮＡのヌクレオチド配列を対照と比較し、対象の乳酸菌においてｋｕｐ遺伝子の遺伝子領域の変異が検出された場合には、その変異の種類及び／又は程度に応じて、ｋｕｐ遺伝子の機能が抑制されていると判定することができる。このときに検出されるｋｕｐ遺伝子の遺伝子領域の変異の種類及び／又は程度として、乳酸菌の酸耐性をより十分に向上させることが可能な変異の種類及び／又は程度としては、前記機能抑制型のアミノ酸変異の好ましい態様として挙げたアミノ酸変異を伴う変異の種類及び／又は程度であることが好ましい。このときの対照としては、ｋｕｐ遺伝子の公知のヌクレオチド配列が挙げられ、より具体的には、例えば、配列番号２に記載のヌクレオチド配列や表１に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が挙げられる。また、下記の本発明の製造方法又は酸耐性向上方法の場合、前記対照としては、ｋｕｐ遺伝子の機能を人為的に抑制する前の乳酸菌のｋｕｐ遺伝子のヌクレオチド配列が挙げられる。
　前記検出方法の別の態様としては、例えば、下記の方法：
　ｋｕｐ遺伝子の遺伝子領域の全て又は一部（好ましくは全て）を含むＤＮＡを増幅し、増幅産物の制限酵素によるＤＮＡ断片の大きさを対照と比較する制限酵素断片長変異（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を利用した方法やＰＣＲ－ＲＦＬＰ法；
　前記増幅産物を一本鎖ＤＮＡに解離させ、非変性ゲル上で分離してゲル上での移動度を対照と比較するＰＣＲ－ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造変異）法；
　前記増幅産物をＤＮＡ変性剤の濃度勾配のあるゲル上で分離し、当該ゲル上での移動度を対照と比較する変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ）法；
　前記ＤＮＡ試料を鋳型として、「ｋｕｐ遺伝子の遺伝子領域の全て又は一部（好ましくは全て）の塩基の１塩基３’側の塩基及びその３’側のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー」を用いてｄｄＮＴＰプライマー伸長反応を行い、質量測定により決定した遺伝子型を対照と比較するＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ法；
　前記増幅産物を一本鎖に解離させてその片鎖のみを分離し、ｋｕｐ遺伝子の遺伝子領域の全て又は一部（好ましくは全て）の塩基の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行い、その際に生成されるピロリン酸を測定して対照と比較するＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法；
　蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、前記増幅産物を鋳型として「ｋｕｐ遺伝子の遺伝子領域の全て又は一部（好ましくは全て）の塩基の１塩基３’側の塩基及びその３’側のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー」で一塩基伸長反応を行い、蛍光の偏光度を測定して対照と比較するＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ法や前記一塩基伸長反応に使われた塩基種を判定して対照と比較するＳＮｕＰＥ法
等が挙げられる。
　各検出方法において、得られた結果を対照と比較して検出結果が異なる場合、例えば対照よりもｋｕｐ遺伝子の鎖長が短いという結果が得られた場合には、当該乳酸菌においてｋｕｐ遺伝子の遺伝子領域が変異している、すなわち、ｋｕｐ遺伝子の機能が抑制されていると判定することができる。このときのｋｕｐ遺伝子の鎖長として、乳酸菌の酸耐性をより十分に向上させることが可能な鎖長としては、前記機能抑制型のアミノ酸変異の好ましい態様として挙げたアミノ酸変異を伴う鎖長であることが好ましい。このときの対照としては、変異が無いことが既知のｋｕｐ遺伝子のＤＮＡ試料が挙げられ、より具体的には、例えば、配列番号２に記載のヌクレオチド配列や表１に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に基づいて人工合成した標準ＤＮＡ試料が挙げられる。また、下記の本発明の製造方法又は酸耐性向上方法の場合、前記対照としては、ｋｕｐ遺伝子の機能を人為的に抑制する前の乳酸菌から抽出したＤＮＡ試料が挙げられる。
　〔ｋｕｐ遺伝子の発現低下〕
　本発明において、「ｋｕｐ遺伝子の発現が低下している（ｋｕｐ遺伝子の発現低下）」とは、ｋｕｐ遺伝子がコードするアミノ酸配列の約全長が発現しないことを示す。このときの「ｋｕｐ遺伝子がコードするアミノ酸配列の約全長」としては、具体的には、配列番号１若しくは表１に記載のアミノ酸配列、又はこれらに対応するアミノ酸配列（好ましくは配列番号１に記載のアミノ酸配列）のうちの７０％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、又は１００％の長さであることが好ましい。
　前記ｋｕｐ遺伝子がコードするアミノ酸配列の約全長が発現しないことは、例えば、ウエスタンブロッティング法やＳＤＳ－ＰＡＧＥ法、アミノ酸配列のシークエンスにより検出することができる。
　また、遺伝子の発現低下は、プロモーターの過剰メチル化が要因の一つであることが当該技術分野で公知である。したがって、前記検出方法の別の態様としては、例えば、ｋｕｐ遺伝子のプロモーターのメチル化を指標として、ｋｕｐ遺伝子の転写レベルでの発現を検出する方法も採用可能である。プロモーターのメチル化の検出には、例えば、メチル化されたシトシンをウラシルに変換する活性を有するバイサルファイト処理後のヌクレオチド配列の変化をヌクレオチド配列決定により直接的に検出する方法や、バイサルファイト処理前のヌクレオチド配列は認識できる（切断できる）がバイサルファイト処理後のヌクレオチド配列は認識できない（切断できない）制限エンドヌクレアーゼを利用して間接的に検出する方法などの公知の方法を利用することができる。前記メチル化の程度に応じて、転写レベルでの発現が検出されない、すなわち、ｋｕｐ遺伝子の機能が抑制されていると判定することができる。
　本発明において、乳酸菌の「ｋｕｐ遺伝子の機能抑制」を検出する方法としては、上記のうちのいずれか１種の検出方法を採用することができ、２種以上を組み合わせてもよい。これらの中でも、精度及び簡便性の観点からは、対象の乳酸菌において、ｋｕｐ遺伝子における機能抑制型のアミノ酸変異を伴う変異を検出することにより、ｋｕｐ遺伝子の機能抑制を検出する方法が好ましく、ｋｕｐ遺伝子のヌクレオチド配列を直接決定して対照と比較することにより前記変異を検出する方法がより好ましい。
　本発明の乳酸菌としては、１種であっても、２種以上の組み合わせであってもよい。本発明の乳酸菌として、より具体的には、ｋｕｐ遺伝子が機能抑制されたラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）が挙げられ、例えば、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５７４号で特定されるＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ＯＬＬ２０５４０５（以下、場合により「株ｆ」という）、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５７５号で特定されるＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ＯＬＬ２０５４０６（以下、場合により「株ｉ」という）等のラクトバチルス・デルブルッキーが挙げられる。
　株ｆ及び株ｉは、ｋｕｐ遺伝子の機能抑制として、機能抑制型のアミノ酸変異を伴う変異を有している。具体的に、株ｆでは、配列番号１に記載のアミノ酸配列の６１７番目のＴｒｐに対応するコドン（ＴＧＧ）が終始コドン（ＴＡＧ）となるナンセンス変異を伴う、配列番号２に記載のヌクレオチド配列の１８５０番目のＧからＡへの置換変異を有する。株ｉでは、配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７４番目のＰｈｅ以降のアミノ酸が置換され、さらに、配列番号１に記載のアミノ酸配列の１９０番目のＬｅｕに対応するコドンが終始コドンとなるフレームシフト変異及びナンセンス変異を伴う、配列番号２に記載のヌクレオチド配列の５２１番目のＴの欠失変異を有する。
　株ｆは、（１）識別の表示：Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ＯＬＬ２０５４０５、（２）受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５７４号、（３）受託日：２０２１年１２月１６日で、株ｉは、（１）識別の表示：Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ＯＬＬ２０５４０６、（２）受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５７５号、（３）受託日：２０２１年１２月１６日で、それぞれ、（４）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（郵便番号２９２－０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に寄託されている。なお、これらの受託番号で特定されるラクトバチルス・デルブルッキーとしては、本発明の効果を阻害しない範囲内において、同株の継代株、同株又はその継代株の人工変異株、自然変異株、遺伝子組み換え株、又は派生株等であってよく、上記の機能抑制型のアミノ酸変異を伴うｋｕｐ遺伝子の変異以外の変異を有していてもよい。
　（酸耐性）
　本発明の乳酸菌は、ｋｕｐ遺伝子が機能抑制されていることにより酸耐性に十分に優れる乳酸菌（本明細書中、場合により「高酸耐性乳酸菌」という）である。本発明において、「高酸耐性乳酸菌」とは、低ｐＨ（例えば、ｐＨ３．５以下、好ましくはｐＨ３．０以下）においても生残可能な乳酸菌を示す。
　乳酸菌の酸耐性は、実際には、例えば次の酸耐性試験で確認及び評価することができる。すなわち、先ず、対象の乳酸菌を、必要に応じてＭＲＳ培地で３７℃、嫌気条件下で１８時間賦活培養した後、ＭＲＳ培地において、３７℃、嫌気条件下で１８時間培養する。次いで、培養後に回収した菌体を人工胃液（ｐＨ３．０、０．２％ＮａＣｌ、０．１７５％ペプシン）に加え、３７℃で２時間酸処理したときの生残率（（酸処理後の生菌数／酸処理前の生菌数）×１００（％））を算出し、前記生残率が高いほど酸耐性が高いと確認及び評価することができる。本発明における「高酸耐性乳酸菌」としては、前記低ｐＨにおいて生残可能であればよく、中程度の生残率であってもよい。より具体的に、前記高酸耐性乳酸菌としては、例えば、前記酸処理試験において、生残率が２０％以上であることが好ましく、３０％以上であることがより好ましく、５０％以上であることがさらに好ましい。
　＜乳酸菌の製造方法、乳酸菌の酸耐性向上方法＞
　ｋｕｐ遺伝子の機能が抑制されている乳酸菌は酸耐性に優れるため、乳酸菌のｋｕｐ遺伝子の機能を人為的に抑制することにより、当該乳酸菌の酸耐性を向上させることが可能である。したがって、本発明は、乳酸菌のｋｕｐ遺伝子の機能を人為的に抑制する工程を含む、酸耐性が向上された乳酸菌の製造方法、並びに、乳酸菌のｋｕｐ遺伝子の機能を人為的に抑制する工程を含む、乳酸菌の酸耐性向上方法も提供する。
　本発明の製造方法又は酸耐性向上方法の対象となるｋｕｐ遺伝子としては、上記のように、典型的には、配列番号１や表１に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子が挙げられるが、自然界における遺伝子変異や交配などによってｋｕｐ遺伝子のヌクレオチド配列は変化し得ることから、本発明の製造方法又は酸耐性向上方法の対象となるｋｕｐ遺伝子には、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子とオーソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）の関係にある乳酸菌の遺伝子も含まれる。
　本発明において、「オーソログ」には、異なる種間において互いに同じ機能を有する遺伝子に加えて、同一種内であっても異なる株間において互いに同じ機能を有する遺伝子も包含する。より具体的に、本発明において、「配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子とオーソログの関係にある遺伝子」とは、ある乳酸菌において、「配列番号１に記載のアミノ酸配列と最も近い同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子」のことを示し、これは、本明細書中の「配列番号１に記載のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列をコードする遺伝子」に相当する。このような遺伝子の配列は、例えば、対象の乳酸菌の全ゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を取得し、前記アミノ酸配列解析ソフトウエアやＢＬＡＳＴ等を用いて、配列番号１のアミノ酸配列をクエリーとして検索することで得ることができる。前記対象の乳酸菌の全ゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列は、適宜公知の方法（例えば、全ゲノムシークエンス等）で決定して取得できる他、例えば、Ｇｅｎ　Ｂａｎｋ（ＮＣＢＩ）等のデータベースより取得してもよい。
　本発明の製造方法又は酸耐性向上方法の対象となる乳酸菌としては、ｋｕｐ遺伝子の機能が抑制されていない又は抑制されている可能性がある乳酸菌であることが好ましいが、このようなｋｕｐ遺伝子の機能が抑制されている乳酸菌又は抑制されている可能性がある乳酸菌は、例えば、上記の酸耐性試験や下記の本発明の乳酸菌のスクリーニング方法によって選択することができる。
　乳酸菌において、ｋｕｐ遺伝子の機能を人為的に抑制する方法としては、例えば、ｋｕｐ遺伝子に機能抑制型のアミノ酸変異を伴う変異を導入する方法、及び／又は、ｋｕｐ遺伝子の発現を低下させる方法が挙げられる。前記機能抑制型のアミノ酸変異を伴う変異や発現の低下としては、それらの好ましい態様も含めて、それぞれ上述したとおりであり、本発明に係るｋｕｐ遺伝子の機能を人為的に抑制する方法としては、これらの目的や程度に応じて、従来公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができる。
　例えば、ｋｕｐ遺伝子に機能抑制型のアミノ酸変異を伴う変異を導入する方法としては、遺伝子ノックアウト法；相同組換えを利用したジーンターゲティング法、Ｋｕｎｋｅｌ法、ＳＯＥ－ＰＣＲ法等の部位特異的変異誘発法；ゲノム編集法（部位特異的ヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ；ジンクフィンガーヌクレアーゼ；ＴＡＬＥＮ；ＰＰＲ；ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９等のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ等）を使用する方法など）；継代培養の繰り返しにより突然変異を誘発する方法；ＵＶ、Ｘ線、ガンマ線等の照射により突然変異を誘発する方法；化学薬剤（例えば、ニトロソグアニジン、ジエチルサルフエイト、亜硝酸）による処理によって突然変異を誘発する方法；胃酸や人工消化液に晒して突然変異を誘発する方法等が挙げられ、これらのうちの２種以上の組み合わせであってもよい。
　また例えば、ｋｕｐ遺伝子の発現を低下させる方法としては、ノックダウン法、プロモーターのメチル化、アンチセンスＲＮＡの発現による発現抑制（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｋｒｏｌ　ＡＲら、Ｎａｔｕｒｅ　３３３：８６６、１９８８年）、ｋｕｐ遺伝子と対応する配列を有する２本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒａｎｃｅ（ＲＮＡｉ）による発現抑制等が挙げられ、これらのうちの２種以上の組み合わせであってもよい。
　本発明の製造方法又は酸耐性向上方法において、酸耐性は、ｋｕｐ遺伝子の機能を人為的に抑制する工程を施す前の乳酸菌と比べて向上していればよく、酸耐性が向上したことは、例えば、上記の酸耐性試験で算出される生残率が、前記工程を施す前の乳酸菌よりも高いことで確認することができる。
　また、本発明の製造方法又は酸耐性向上方法には、さらに、例えば上記酸耐性試験を実施することにより、ｋｕｐ遺伝子の機能を人為的に抑制する工程を施した乳酸菌が確かに前記高酸耐性乳酸菌であることを確認する工程を含んでいてもよい。
　＜乳酸菌のスクリーニング方法＞
　ｋｕｐ遺伝子が機能抑制されている乳酸菌は酸耐性に優れるため、本発明は、ｋｕｐ遺伝子の機能が抑制されていることを指標として、乳酸菌を選択する選択工程を含む、高酸耐性乳酸菌のスクリーニング方法も提供する。本発明のスクリーニング方法には、実際に高酸耐性である乳酸菌のスクリーニング方法の他に、高酸耐性である可能性がある乳酸菌のスクリーニング方法も含まれ、また、中程度の酸耐性が期待できるレベルで乳酸菌をスクリーニングする方法であってもよい。
　前記選択工程では、例えば、上記のｋｕｐ遺伝子の機能抑制で挙げた検出方法のうちの少なくとも１種により、ｋｕｐ遺伝子が機能抑制されているか否か（すなわち、ｋｕｐ遺伝子における機能抑制型のアミノ酸変異を伴う変異が検出されるか否か、及び／又は、ｋｕｐ遺伝子の発現低下が検出されるか否か）を判定し、ｋｕｐ遺伝子の機能抑制が検出された乳酸菌を、前記高酸耐性乳酸菌（中程度の酸耐性の乳酸菌も含む）、又は前記高酸耐性乳酸菌である可能性がある乳酸菌であるとして選択する。前記判定方法としては、その好ましい態様も含めて、上記の各検出方法で述べたとおりである。
　また、本発明のスクリーニング方法には、さらに、例えば上記酸耐性試験を実施することにより、スクリーニングした乳酸菌が確かに前記高酸耐性乳酸菌であることを確認する工程を含んでいてもよい。
　＜乳酸菌組成物＞
　「乳酸菌組成物」とは、乳酸菌を含有する組成物を示すが、特に限定されず、本発明の乳酸菌組成物としては、少なくとも前記本発明の乳酸菌を含有するものであればよく、本発明の乳酸菌のみ（２種以上の本発明の乳酸菌の組み合わせを含む）からなるものであってもよい。また、本発明は、前記本発明の乳酸菌の製造方法で製造された乳酸菌や乳酸菌のスクリーニング方法で選択された乳酸菌を含有する乳酸菌組成物も提供する。本発明の乳酸菌組成物には、例えば、下記の乳酸菌スターター及び発酵乳が包含される。
　本発明の乳酸菌組成物としては、本発明の乳酸菌以外の他の成分をさらに含有していてもよく、前記他の成分としては、特に制限されないが、例えば、水等の溶媒；前記乳酸菌の培養終了後の培養液の上清や培地成分等である培養物；前記培養物の濃縮物、希釈物、乾燥物、凍結物等が含まれ、これらのうちの１種であっても２種以上の組み合わせであってもよい。
　（乳酸菌スターター）
　本発明の乳酸菌スターターは、前記本発明の乳酸菌を少なくとも含有し、下記の本発明の発酵乳の製造方法のために好適に用いることができる。このような本発明の乳酸菌スターターとしては、前記本発明の乳酸菌のみからなるものであっても、前記他の成分や他の乳酸菌、酵母、ビフィズス菌等をさらに含有するものであってもよい。
　前記他の乳酸菌、酵母、及びビフィズス菌としては、従来から発酵乳に含有させることが公知の乳酸菌や酵母、ビフィズス菌が挙げられる。例えば、前記他の乳酸菌としては、本発明の乳酸菌以外の乳酸菌が挙げられ、これらのうちの１種であっても２種以上の組み合わせであってもよい。これらの中でも、前記本発明の乳酸菌がラクトバチルス属乳酸菌である場合、本発明の乳酸菌スターターとしては、本発明の乳酸菌以外のストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）乳酸菌をさらに含有することが好ましい。また、本発明の乳酸菌スターターとしては、本発明の乳酸菌であるラクトバチルス属乳酸菌と本発明の乳酸菌であるストレプトコッカス属乳酸菌とを含有していることも好ましい。
　ストレプトコッカス属乳酸菌は、好気性グラム陽性球菌であり、例えば、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）が挙げられる。前記ストレプトコッカス属乳酸菌としては、このうち、ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌であることが好ましい。
　本発明の乳酸菌スターターとしては、液体であっても凍結状態や乾燥粉末等の固体であってもよく、さらに他の成分を含有していてもよい。乳酸菌スターターに含有させることが可能な、さらなる他の成分としては、例えば、発酵促進物質（ギ酸、核酸等）；保護剤（糖類糖）；培地成分（乳又は乳清等）が挙げられ、これらのうちの１種であっても２種以上の組み合わせであってもよい。
　本発明の乳酸菌スターターにおける本発明の乳酸菌の含有量としては、特に制限されないが、０．０１～１００質量％であることが好ましく、０．１～９０質量％であることがより好ましい。また、生菌数量で、１×１０７ｃｆｕ／ｇ以上であることが好ましく、１×１０７～１×１０１１ｃｆｕ／ｇであることがより好ましい。また、他の乳酸菌（好ましくは本発明の乳酸菌以外のストレプトコッカス属乳酸菌）をさらに含有する場合、当該乳酸菌スターターにおける本発明の乳酸菌の含有量と前記他の乳酸菌の含有量との比としては、菌数（生菌数換算、以下同じ）比で、１：０．１～１：１００であることが好ましく、１：１～１：１０であることがより好ましい。さらに、本発明の乳酸菌スターターが、本発明の乳酸菌であるラクトバチルス属乳酸菌と本発明の乳酸菌であるストレプトコッカス属乳酸菌との組み合わせである場合には、当該乳酸菌スターターにおけるラクトバチルス属乳酸菌の含有量とストレプトコッカス属乳酸菌の含有量との比としては、菌数（生菌数換算、以下同じ）比で、１：０．１～１：１００であることが好ましく、１：１～１：１０であることがより好ましい。
　本発明の乳酸菌スターターは、例えば、前記他の乳酸菌を含有する組成物（第２の乳酸菌組成物）と組み合わせて、本発明の乳酸菌スターターと第２の乳酸菌組成物とを含む乳酸菌スターターキットとしてもよい。また、例えば、発酵乳製造のための添加物（前記発酵促進物質、保護剤等）、容器、乳酸菌スターターの使用説明書等を組み合わせて、乳酸菌スターターキットとしてもよい。
　（発酵乳）
　本発明の発酵乳は、前記本発明の乳酸菌を少なくとも含有し、例えば、下記の本発明の発酵乳の製造方法によって得ることができる。また、本発明は、前記本発明の乳酸菌の製造方法で製造された乳酸菌や乳酸菌のスクリーニング方法で選択された乳酸菌を含有する発酵乳も提供する。本発明の発酵乳に含まれる本発明の乳酸菌は酸耐性に優れるため、例えば発酵乳を経口で摂取して胃酸等の酸に曝された場合であっても、高い生残率で腸まで到達可能である。
　本発明の発酵乳としては、特に限定されるものではなく、例えば、前記乳等省令による「発酵乳」の規格を満たす発酵乳（より具体的には、無脂乳固形分の含有量が８．０％以上、乳酸菌数又は酵母数（好ましくは乳酸菌数（より好ましくは本発明の乳酸菌の数）、以下同じ）が１，０００万／ｍＬ以上のもの）が挙げられる。また、本発明の発酵乳には、前記乳等省令による「乳製品乳酸菌飲料」の規格を満たすもの（より具体的には、無脂乳固形分の含有量が３．０％以上、乳酸菌数又は酵母数が１０００万／ｍＬ以上のもの）；「乳酸菌飲料」の規格を満たすもの（より具体的には、無脂乳固形分の含有量が３．０％未満、乳酸菌数又は酵母数が１００万／ｍＬ以上のもの）も含む。なお、前記無脂乳固形分とは、全乳固形分から脂肪分を差引いた残りの成分（主に、タンパク質、乳糖、及びミネラル等）を示し、前記乳酸菌及び酵母数は、前記乳等省令で定められた検査法、ＢＣＰ加プレートカウント寒天培地を用いた方法により測定される生菌数であるが、発酵乳が殺菌されたものである場合には当該殺菌前において前記検査法により測定される生菌数換算である。
　本発明の発酵乳としては、下記の発酵乳の製造方法の発酵工程後の発酵物であっても、若しくは前記発酵物を殺菌処理（粉砕処理、加熱処理等）したものであってもよく、又はこれらを濃縮、希釈、乾燥、若しくは凍結等したものであってもよい。なお、本発明において、前記発酵乳が殺菌処理したものである場合、当該発酵乳における乳酸菌数は、生菌数換算である。本発明の発酵乳に含有される乳酸菌には、生菌の他、死菌も含み、乳酸菌の破砕物及び加熱処理物、これらの濃縮物、希釈物、乾燥物、凍結物も含むが、本発明の発酵乳には、少なくとも乳酸菌の生菌が含有されていることが好ましく、本発明の乳酸菌が生菌として含有されていることがより好ましい。
　本発明の発酵乳は、本発明の乳酸菌及び下記の原料乳（好ましくは調乳液）に由来する成分を含む。また、本発明の効果を阻害しない範囲内において、上記の乳酸菌スターターに挙げた他の成分や、他の乳酸菌や酵母、ビフィズス菌等をさらに含有していてもよい。さらに、飲食品に含有させることが可能な各種成分を含有してもよい。発酵乳に含有させることが可能な、さらなる成分としては、特に制限されず、例えば、糖類、糖アルコール類、ミネラル類、ビタミン類、タンパク質、ペプチド、アミノ酸類、有機酸、ｐＨ調整剤、澱粉及び加工澱粉、食物繊維、果実・野菜及びその加工品、動物及び植物生薬エキス、天然由来高分子（コラーゲン、ヒアルロン酸、コンドロイチン等）、油脂、増粘剤、乳化剤、溶剤、界面活性剤、ゲル化剤、安定剤、緩衝剤、懸濁化剤、粘稠剤、賦形剤、崩壊剤、結合剤、流動化剤、保存料、着色料、香料、矯味剤、甘味剤等が挙げられ、これらのうちの１種であっても２種以上の組み合わせであってもよい。
　このような発酵乳としては、ヨーグルト、チーズ、発酵クリーム、発酵バター等が好ましく、特にヨーグルトが好ましい。前記ヨーグルトとしては、具体的には、プレーンヨーグルト等のセットタイプヨーグルト（固形状発酵乳）、ソフトタイプヨーグルト（糊状発酵乳）、及びドリンクタイプヨーグルト（液状発酵乳）が挙げられ、これらを材料として用いたフローズンヨーグルトであってもよい。また、本発明の発酵乳は、チーズ、発酵クリーム、発酵バター、ケフィア等の発酵食品の材料として用いることもできる。さらに、本発明の発酵乳は、下記の発酵乳の製造方法において、乳酸菌スターターとして用いることもできる。
　＜発酵乳の製造方法＞
　本発明の発酵乳の製造方法は、前記本発明の乳酸菌、前記本発明の乳酸菌の製造方法で製造された乳酸菌、及び前記本発明の乳酸菌のスクリーニング方法で選択された乳酸菌、並びに、本発明の乳酸菌組成物のうちの少なくとも１種を、原料乳を含有する調乳液に添加して発酵させ、発酵乳を得る発酵工程を含む。なお、本発明の乳酸菌の製造方法、又は乳酸菌のスクリーニング方法で選択された乳酸菌を用いる場合、本発明の発酵乳の製造方法としては、前記ｋｕｐ遺伝子の機能を人為的に抑制する工程や前記選択工程をさらに含んでいてもよいが、これら工程としては最初の１回のみでよい。
　（調乳液）
　本発明に係る調乳液は、原料乳を含有する。前記原料乳としては、乳糖を含有するものであることが好ましく、例えば、生乳（例えば、ウシ、スイギュウ、ヒツジ、ヤギ等の乳）、殺菌乳、全脂乳、脱脂乳、ホエイ、及びこれらの加工品（例えば、全脂粉乳、全脂濃縮乳、脱脂粉乳、脱脂濃縮乳、練乳、ホエイ粉、バターミルク、バター、クリーム、チーズ、ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、ホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）、α－ラクトアルブミン（α－Ｌａ）、β－ラクトグロブリン（β－Ｌｇ））が挙げられ、これらのうちの１種であっても２種以上の混合物であってもよい。
　本発明に係る調乳液としては、前記原料乳のみからなるものであっても、前記原料乳の水溶液、希釈液、又は濃縮液であってもよく、前記原料乳の他に、必要に応じて他の成分をさらに含有するものであってもよい。このような他の成分としては、水；豆乳、砂糖を始めとする糖類や甘味料、香料、果汁、果肉、ビタミン、ミネラル、油脂、セラミド、コラーゲン、ミルクリン脂質、ポリフェノール等の食品、食品成分、又は食品添加物；ペクチン、大豆多糖類、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）、寒天、ゼラチン、カラギーナン、ガム類などの安定化剤、増粘剤、ゲル化剤等が挙げられ、これらのうちの１種であっても２種以上の混合物であってもよい。前記調乳液は、必要に応じて加温しながら、及び／又は、必要に応じて均質化させながら、前記成分を混合することにより調製することができる。また、前記調乳液としては、加熱滅菌又は殺菌したものを用いることもできる。
　（発酵）
　前記調乳液に、本発明の乳酸菌又は本発明の乳酸菌組成物を添加して発酵させる発酵工程としては、従来公知の方法を適宜採用することができ、特に制限されない。また、本発明の乳酸菌又は本発明の乳酸菌組成物の添加量は、従来公知の発酵乳の製造方法において採用されている乳酸菌スターターの添加量に従って、適宜設定することができるが、例えば、前記調乳液の質量に対して、本発明の乳酸菌の生菌数で、１×１０７～５×１０９ｃｆｕ／ｇであることが好ましく、１×１０８～２×１０９ｃｆｕ／ｇであることがより好ましい。
　前記調乳液には、本発明の乳酸菌又は本発明の乳酸菌組成物に加えて、前記他の乳酸菌及び酵母、ビフィズス菌等を添加してもよい。これらの中でも、前記本発明の乳酸菌がラクトバチルス属乳酸菌である場合、本発明の発酵乳の製造方法としては、前記他の乳酸菌としてストレプトコッカス属乳酸菌をさらに添加することが好ましく、ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌をさらに添加することがより好ましい。また、他の乳酸菌（好ましくはストレプトコッカス属乳酸菌）をさらに添加する場合、本発明の乳酸菌の添加量と前記他の乳酸菌の添加量との比としては、菌数（生菌数換算、以下同じ）比で、１：０．１～１：１００であることが好ましく、１：１～１：１０であることがより好ましい。さらに、本発明の乳酸菌が、本発明の乳酸菌であるラクトバチルス属乳酸菌と本発明の乳酸菌であるストレプトコッカス属乳酸菌との組み合わせである場合には、ラクトバチルス属乳酸菌の添加量とストレプトコッカス属乳酸菌の添加量との比としては、菌数（生菌数換算、以下同じ）比で、１：０．１～１：１００であることが好ましく、１：１～１：１０であることがより好ましい。
　前記発酵の条件としては、添加される乳酸菌の生育条件、前記調乳液の量等に応じて適宜選択することができ、特に制限されないが、例えば、温度３５～４５℃、より好ましくは温度３８～４３℃において、好気又は嫌気条件下で、本発明の乳酸菌又は本発明の乳酸菌組成物を添加した調乳液のｐＨが４．７以下、より好ましくは４．６以下、さらに好ましくは４．０～４．５になるまで、通常、２～２４時間、より好ましくは３～８時間、さらに好ましくは４～６時間、静置又は撹拌（好ましくは静置）することが好ましい。
　上記発酵により、本発明の発酵乳を得ることができる。前記発酵工程後の発酵物は、そのまま、又は必要に応じて濃縮、希釈、乾燥、若しくは凍結等することにより、本発明の発酵乳とすることができる。また、前記発酵物における乳酸菌を破砕若しくは加熱処理等して、又は必要に応じてこれを濃縮、希釈、乾燥、若しくは凍結等することにより、本発明の発酵乳としてもよい。したがって、本発明の発酵乳の製造方法としては、これらの工程（濃縮工程、希釈工程、乾燥工程、凍結工程、破砕工程、加熱処理工程等）をさらに含んでいてもよい。
　以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、下記の各試験例において、「％」の表示は、特に記載のない場合、重量／容量（ｗ／ｖ：ｇ／ｍＬ）パーセントを示す。
　（試験例１）
　（１）下記の３株の乳酸菌：
　Ｐ２１０３００１株（比較例１）：ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシズ・ブルガリクス。株式会社明治の明治イノベーションセンター（郵便番号１９２－０９１９　日本国東京都八王子市七国１－２９－１）により保管されている菌株；
　株ｆ（実施例１）：受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５７４号で特定されるラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシズ・ブルガリクス；
　株ｉ（実施例２）：受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５７５号で特定されるラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシズ・ブルガリクス
を用いた。
　（２）酸耐性試験
　各乳酸菌株（Ｐ２１０３００１株、株ｆ、株ｉ）を、ＭＲＳ培地において、３７℃、嫌気条件下で１８時間賦活培養した。賦活培養後の菌液５０μＬを、それぞれ、５ｍＬのＭＲＳ培地が入った小試験管に接種して、さらに３７℃、嫌気条件下で１８時間培養した後、３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、沈殿（菌体ペレット）を回収した。回収した沈殿を０．８５％生理食塩水で懸濁して再度上記条件で遠心し、上清を除去する操作（洗浄）を２回行った後、上清を除去した後の沈殿に５ｍＬの０．８５％生理食塩水を添加し、菌体懸濁液とした。また、０．２％ＮａＣｌ、及び０．１７５％ペプシン（１：１００００、富士フィルム和光純薬株式会社製）を混合した水溶液のｐＨを塩酸（１Ｎ）で調整してフィルター濾過し、ｐＨ３．０の人工胃液を調製した。
　前記人工胃液９ｍＬに対して前記菌体懸濁液を１ｍＬ加え、３７℃で２時間酸処理した。酸処理後の溶液から１ｍＬ採取し、６７ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を９ｍＬ加えて中和し、酸処理菌液とした。前記菌体懸濁液及び前記酸処理菌液をそれぞれＰＢＳで段階希釈した後、寒天培地に１００μＬ塗抹し、３７℃、嫌気条件下で４８時間培養した。培養後に観察されたコロニー数と希釈倍率とからそれぞれの液における生菌数を求め、次式：
　生残率（％）＝（酸処理菌液における生菌数×１００／菌体懸濁液における生菌数）×１００
により、生残率を求めた。その結果、Ｐ２１０３００１株では生残率が従来一般的な乳酸菌と同程度の２．５８％であったのに対し、株ｆの生残率は６５．８％、株ｉの生残率は９５．４％と、株ｆ及び株ｉは人工胃液（酸）に対する耐性が高い株であることが見出された。
　（３）ドラフトゲノムシークエンス
　〔ゲノムＤＮＡ抽出〕
　各乳酸菌株（Ｐ２１０３００１株、株ｆ、株ｉ）を、ＭＲＳ培地において３７℃、嫌気条件下で１８時間培養した後、培養液を１ｍＬとり、１３０００ｇ、室温で２分間遠心分離し、沈殿（菌体ペレット）を回収した。回収した沈殿を１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で懸濁して再度上記条件で遠心し、上清を除去する操作（洗浄）を２回行った後、Ｗｉｚａｒｄ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ濃度をＱｕｂｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で測定し、超純水で０．２ｎｇ／μＬとなるよう希釈してゲノムＤＮＡサンプルを得た。
　〔Ｍｉｓｅｑでのドラフトゲノム取得〕
　先ず、上記で得られたゲノムＤＮＡサンプルから、Ｎｅｘｔｅｒａ　ＸＴ　ＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｐｒｅｐ　ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いてＤＮＡライブラリを調製し、ＡＭＰｕｒｅ　ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で精製した。Ｈｉｇｈ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ＤＮＡ　ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）で平均ライブラリサイズを測定し、Ｑｕａｎ－ｉＴ　ｄｓＤＮＡ　Ｈｉｇｈ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　Ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で濃度を測定した。次いで、ＤＮＡ濃度が２ｎＭとなるように超純水で希釈し、全サンプルを等量ずつ混合し、得られた混合液に０．２Ｎ水酸化ナトリウム溶液を加えて変性処理した。次いで、変性処理した混合液（変性ＤＮＡ）１０μＬとＨＴ１バッファー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）９９０μＬとを混合した後、０．２ｐＭ　ＰｈｉＸ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を等量混合し、Ｍｉｓｅｑ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ　ｖ３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製、６００ｃｙｃｌｅｓ）を用いて、次世代シークエンサーＭｉｓｅｑ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）にてシークエンス解析を行った。
　〔データ解析〕
　上記で得られたシークエンスデータをＣＬＣ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ＱＩＡＧＥＮ社製）に移し、ｃｏｎｔｉｇを作成した後、アノテーションを付加した。上記（２）の酸耐性試験で生残率の低かったＰ２１０３００１株のｃｏｎｔｉｇをリファレンス配列とし、生残率の高かった株ｆ及び株ｉのｃｏｎｔｉｇを張り付けて遺伝子変異箇所を検出し、Ｐ２１０３００１株からのアミノ酸変異を伴う変異箇所のみを抽出した。下記の表２に、株ｆ及び株ｉにおいて確認された、Ｐ２１０３００１株からの変異内容を示す。表２には、上記の各株の生残率も合わせて示す。
　表２に示したように、酸に対する耐性が高い株ｆ及び株ｉにおいて、Ｐ２１０３００１株からのアミノ酸変異を伴う変異（非同義的置換）はそれぞれ７箇所及び９箇所であったが、このうち、２つの株に共通する変異はｋｕｐ遺伝子における変異のみであった。Ｐ２１０３００１株のｋｕｐ遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号２に示し、同ヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を配列番号１に示す。ｋｕｐ遺伝子において、株ｆでは、Ｐ２１０３００１株のヌクレオチド配列の１８５０番目のＧがＡに置換され、Ｐ２１０３００１株のアミノ酸配列の６１７番目のＴｒｐに対応するコドンが終始コドンに置換されていた（ナンセンス変異、下記の表４）。また、株ｉでは、Ｐ２１０３００１株のヌクレオチド配列の５２１番目のＴが欠失し、フレームシフト変異によってＰ２１０３００１株のアミノ酸配列の１７４番目のＰｈｅ以降のアミノ酸が置換され、さらに、Ｐ２１０３００１株のアミノ酸配列の１９０番目（Ｐｈｅ１７４から１６番目）のＬｅｕに対応するコドンが終始コドンに置換されていた（下記の表６）。なお、表２中、「トランスポゼース関連」は、トランスポゼースに関連するタンパク質をコードする遺伝子であることを示し、「アノテーションなし」は、情報が特定できない遺伝子であることを示し、「ｌｙｓＡ」は、ファージ由来のＬｙｚｏｚｙｍｅをコードする遺伝子であることを示し、これらはいずれも酸耐性に影響を与えない遺伝子であるといえる。したがって、ｋｕｐ遺伝子が酸耐性に関与する因子であると考えられた。
　（試験例２）　復帰変異株の解析
　〔株ｆ〕
　株ｆを、１０質量％脱脂粉乳（脱脂粉乳１０質量部及び蒸留水９０質量部）に０．１％のＹｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｘｔ（Ｇｉｂｃｏ製）を配合した１０％脱脂粉乳培地において、３７℃、嫌気条件下で１８時間培養し、培養後の菌液５０μＬを、５ｍＬの１０％脱脂粉乳培地に接種して、さらに上記条件で培養する操作（継代）を繰り返し、変異を誘発させた。継代１０回目で試験例１の（２）と同様にして酸耐性試験を行ったところ、生残率が０．７４％と、著しく低下した株（ｆ－１）を取得した。
　また、株ｆを、ＭＲＳ培地において、３７℃、嫌気条件下で１８時間培養し、培養後の菌液５０μＬを、５ｍＬのＭＲＳ培地に接種して、さらに上記条件で培養する操作（継代）を１０回繰り返し、変異を誘発させた。継代１０回目の株を株ｆ－２として、試験例１の（２）と同様にして酸耐性試験を行ったところ、生残率は３７．７％と、酸耐性は維持されていた。
　得られた株ｆ－１及び株ｆ－２について、株ｆのｃｏｎｔｉｇをリファレンス配列としたこと以外は試験例１の（３）と同様にして、ドラフトゲノムシークエンスを行って遺伝子変異箇所を検出し、株ｆからのアミノ酸変異を伴う変異箇所のみを抽出した。下記の表３に、株ｆ－１及び株ｆ－２において確認された、株ｆからの変異内容を示す。表３には、上記の各株の生残率も合わせて示す。また、下記の表４に、Ｐ２１０３００１株、株ｆ、株ｆ－１、及び株ｆ－２におけるアミノ酸配列６１７番目（ヌクレオチド配列１８４９～１８５１番目）の変異の詳細を示す。
　表３～４に示したように、株ｆ－１及び株ｆ－２において、株ｆからのアミノ酸変異を伴う変異（非同義的置換）はそれぞれ９箇所及び６箇所であったが、このうち、上記の「トランスポゼース関連」、「アノテーションなし」、及び「ｌｙｓＡ」以外の変異は、株ｆ－１におけるｋｕｐ遺伝子の変異のみであった。酸に対する耐性が低下した株ｆ－１では、ｋｕｐ遺伝子において、株ｆのヌクレオチド配列の１８４９番目のＴがＣに置換され、株ｆの終始コドンがＧｌｎに置換されていた。そのため、株ｆ－１は、Ｐ２１０３００１株のアミノ酸配列と比べると、６１７番目のＴｒｐがＧｌｎに置換された変異（１アミノ酸置換）を有するのみであった。他方、酸に対する耐性が維持されていた株ｆ－２では、ｋｕｐ遺伝子において、株ｆからのアミノ酸変異を伴う変異は確認されなかった。つまり、株ｆ－１では、株ｆにおけるｋｕｐ遺伝子のナンセンス変異が消失したことによって、酸に対する感受性が復活して酸耐性が低下したことが示された。したがって、ｋｕｐ遺伝子が酸耐性に関与する因子であり、その機能が抑制されることによって、酸耐性が向上することが確認された。
　〔株ｉ〕
　株ｉを、ＭＲＳ培地において、３７℃、嫌気条件下で１８時間培養し、培養後の菌液５０μＬを、５ｍＬのＭＲＳ培地に接種して、さらに上記条件で培養する操作（継代）を繰り返した。継代１０回目で、試験例１の（２）と同様にして酸耐性試験を行ったところ、生残率が０．０７４％と、著しく低下した株（ｉ－１）を取得した。
　得られた株ｉ－１について、株ｉのｃｏｎｔｉｇをリファレンス配列としたこと以外は試験例１の（３）と同様にして、ドラフトゲノムシークエンスを行って遺伝子変異箇所を検出し、株ｉからのアミノ酸変異を伴う変異箇所のみを抽出した。下記の表５に、株ｉ－１において確認された、株ｉからの変異内容を示す。表５には、株ｉ－１の生残率も合わせて示す。また、下記の表６に、Ｐ２１０３００１株、株ｉ、及び株ｉ－１におけるアミノ酸配列１７２～１９０番目、及びアミノ酸配列１７２～１７５番目に対応するヌクレオチド配列（塩基配列）５１４～５２５番目の変異の詳細、並びに、各アミノ酸配列の１７２～１９０番目（株ｉは１７２～１８９番目）を示す配列番号を示す。
　表５～６に示したように、株ｉ－１において、株ｉからのアミノ酸変異を伴う変異（非同義的置換）は１８箇所であったが、このうち、上記の「トランスポゼース関連」、「アノテーションなし」、及び「ｌｙｓＡ」以外の変異は、ｋｕｐ遺伝子の変異のみであった。酸に対する耐性が低下した株ｉ－１では、ｋｕｐ遺伝子において、株ｉのヌクレオチド配列の５１６番目にＡが挿入された結果、１７３番目のＡｌａのＧｌｙへの置換に加えて、フレームシフト変異によって、Ｐ２１０３００１株のアミノ酸配列の１７４番目のＰｈｅ以降のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列に復帰していた。つまり、株ｉ－１では、株ｉにおけるｋｕｐ遺伝子のフレームシフト変異が消失したことによって、酸に対する感受性が復活して酸耐性が低下したことが示された。したがって、これによっても、ｋｕｐ遺伝子が酸耐性に関与する因子であり、その機能が抑制されることによって、酸耐性が向上することが確認された。
　以上説明したように、本発明によれば、胃酸等の酸に対する耐性が十分に優れた乳酸菌及びこれを含有する乳酸菌組成物、酸に対する耐性が向上された乳酸菌の製造方法、乳酸菌の酸耐性向上方法、酸に対する耐性が十分に優れた乳酸菌のスクリーニング方法、並びに、これらの乳酸菌及び／又は乳酸菌組成物を用いた発酵乳の製造方法を提供することが可能となる。
１．
（１）識別の表示：Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ＯＬＬ２０５４０５
（２）受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５７４
（３）受託日：２０２１年１２月１６日
（４）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター
２．
（１）識別の表示：Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ＯＬＬ２０５４０６
（２）受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３５７５
（３）受託日：２０２１年１２月１６日
（４）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター

Claims (16)

  1. 　乳酸菌のｋｕｐ遺伝子の機能を人為的に抑制する工程を含む、乳酸菌の酸耐性向上方法。
  2. 　前記乳酸菌がラクトバシラセエ科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）乳酸菌である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記乳酸菌がラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）乳酸菌である、請求項１に記載の方法。
  4. 　乳酸菌のｋｕｐ遺伝子の機能を人為的に抑制する工程を含む、酸耐性が向上された乳酸菌の製造方法。
  5. 　前記乳酸菌がラクトバシラセエ科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）乳酸菌である、請求項４に記載の製造方法。
  6. 　前記乳酸菌がラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）乳酸菌である、請求項４に記載の製造方法。
  7. 　ｋｕｐ遺伝子の機能が抑制されている、乳酸菌。
  8. 　ラクトバシラセエ科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）乳酸菌である、請求項７に記載の乳酸菌。
  9. 　ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）乳酸菌である、請求項７に記載の乳酸菌。
  10. 　請求項７に記載の乳酸菌を含有する、乳酸菌組成物。
  11. 　ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）乳酸菌をさらに含有する、請求項１０に記載の乳酸菌組成物。
  12. 　乳酸菌スターターである、請求項１０に記載の乳酸菌組成物。
  13. 　発酵乳である、請求項１０に記載の乳酸菌組成物。
  14. 　ｋｕｐ遺伝子の機能が抑制されていることを指標として、乳酸菌を選択する選択工程を含む、高酸耐性乳酸菌のスクリーニング方法。
  15. 　請求項４～６のうちのいずれか一項の製造方法で得られた乳酸菌、請求項７～９のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌、請求項１０～１３のうちのいずれか一項に記載の乳酸菌組成物、及び請求項１４のスクリーニング方法で選択された乳酸菌からなる群から選択されるいずれかを、原料乳を含有する調乳液に添加して発酵させ、発酵乳を得る発酵工程を含む、発酵乳の製造方法。
  16. 　前記調乳液にストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）乳酸菌をさらに添加する工程を含む、請求項１５に記載の発酵乳の製造方法。
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