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WO2023033408A1 - 스트렙토마이세스 에스피 jck-6131 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 병해충 방제용 조성물, 이의 제조 방법 및 식물 병해충 방제 방법 - Google Patents

스트렙토마이세스 에스피 jck-6131 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 병해충 방제용 조성물, 이의 제조 방법 및 식물 병해충 방제 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2023033408A1
WO2023033408A1 PCT/KR2022/012165 KR2022012165W WO2023033408A1 WO 2023033408 A1 WO2023033408 A1 WO 2023033408A1 KR 2022012165 W KR2022012165 W KR 2022012165W WO 2023033408 A1 WO2023033408 A1 WO 2023033408A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pests
xanthomonas
streptomyces
composition
jck
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2022/012165
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김진철
리듸켕
박애란
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Industry Foundation of Chonnam National University
Original Assignee
Industry Foundation of Chonnam National University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Industry Foundation of Chonnam National University filed Critical Industry Foundation of Chonnam National University
Publication of WO2023033408A1 publication Critical patent/WO2023033408A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/28—Streptomyces
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P1/00—Disinfectants; Antimicrobial compounds or mixtures thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P3/00—Fungicides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P5/00—Nematocides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P7/00—Arthropodicides
    • A01P7/04—Insecticides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces

Definitions

  • the present invention was made by the project number PJ015296042021 under the support of the Rural Development Administration, and the research management institution for the project is the Rural Development Administration.
  • “Development of biological control technology for fruit burn disease (4 joint)” the leading institution is the Chonnam National University Industry-University Cooperation Foundation, and the research period is 2021.01.01 ⁇ 2021.12.31.
  • the present invention relates to a composition for controlling plant diseases and pests, including a culture medium of Streptomyces sp. JCK-6131 strain or an extract thereof, a method for preparing the same, and a method for controlling plant pests using the same.
  • Plant pests partially or totally damage the shape, function and integrity of plants. These plant pests include Bacteria, Fungus, Oomycetes, Pests, Nematodes, Viruses and Parasites. plants, etc.
  • Plant pathogenic bacteria are mainly carried by agricultural implements and insects such as aphids and bees. When a bacterial disease occurs in one plant or tree, it is very contagious enough to infect the entire agricultural orchard and is difficult to control.
  • methods for controlling bacterial diseases include a method of using a single agent or a mixture of an antibiotic and a copper synthetic compound, or a method of cultivating resistant varieties.
  • this method is also ineffective under favorable environmental conditions for the generation and spread of plant pathogenic bacteria, and there are various problems such as contamination of the agroecological ecosystem and the appearance of antibiotic-resistant strains due to the use of chemical fungicides.
  • Plant pathogenic fungi settle inside or on the surface of plants, deprive plants of nutrients and propagate, causing serious damage to various crops worldwide. Plant diseases caused by fungi are more diverse and more damaging than other pathogens, to the extent that 17 out of 33 cases of serious damage caused by plant diseases in the past were caused by fungi.
  • Plant pathogenic oomycetes cause damping off, root rot, blight or downy mildew of hundreds of different plant hosts including corn, soybean, potato, wheat, fir and many ornamental species.
  • Pests that damage plants include aphids, mites, brown mealybugs, cotton mealybugs, etc.
  • aphids are pests that often appear on plants, and control them by manually catching them as they can be seen and spraying them with pesticides at intervals of four days.
  • meadowsweet aphid has a serious effect on apples, pears, tangerines, and meadowsweet trees, and may reoccur even after drug control.
  • Streptomyces is the largest genus of actinomycetes, and like other actinomycetes, it is known to be gram-positive and have a genome with a high GC content as a streptococcus. Most Streptomyces, found primarily in soil and necrotic plants, produce spores and are characterized by complex secondary metabolisms, which produce the clinically useful naturally occurring antibiotics neomycin, cypamycin, botoromycin, and chloramphenicol. known to produce As antibiotics as well as various physiologically active substances have been isolated from Streptomyces sp. strains, these strains have been treated as industrially and medically very important microorganisms. Research on these antibiotics is progressing from materials effective for bacterial or fungal infections to searching for materials effective for viral diseases, but these studies have been conducted with an emphasis on medicine.
  • control activity was excellent when the culture solution or extract of Streptomyces sp. JCK-6131 strain was treated with a plant disease causative agent or pest.
  • an object of the present invention is to provide a Streptomyces sp JCK-6131 strain having antibacterial activity and induction resistance.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for controlling plant pests comprising a culture medium or an extract of Streptomyces sp. JCK-6131 strain.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for controlling plant pests comprising at least one member selected from the group consisting of streptothricin E acid, streptothricin D and 12-carbamoylstreptotricin D.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a composition for controlling plant diseases and pests comprising a culturing step of culturing the Streptomyces sp JCK-6131 strain.
  • Another object of the present invention is to provide a plant pest control method comprising a composition treatment step of treating the culture broth or extract of Streptomyces sp JCK-6131 strain.
  • the present invention relates to a composition for controlling plant diseases and pests, including a culture medium of Streptomyces sp. JCK-6131 strain or an extract thereof, a method for preparing the same, and a method for controlling plant diseases and pests. It was confirmed that the composition for plant disease has excellent antibacterial activity when treated with pathogens, and effectively controls pests in plants through an induction resistance mechanism.
  • One aspect of the present invention relates to a Streptomyces sp JCK-6131 strain having antibacterial activity and induction resistance.
  • the Streptomyces sp JCK-6131 strain may be the Streptomyces sp JCK-6131 strain deposited under accession number KCTC 14658BP.
  • Streptomyces sp JCK-6131 strain of the present invention was deposited with the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KCTC (Korean Collection for Type Cultures) on August 18, 2021 as accession number KCTC 14658BP.
  • compositions for controlling plant pests comprising a culture medium or an extract of Streptomyces sp. JCK-6131 strain.
  • the Streptomyces sp strain JCK-6131 may be a Streptomyces sp strain deposited under accession number KCTC 14658BP.
  • culture medium in the present specification means that the microorganisms are included after culturing the microorganisms.
  • culture filtrate in the present specification refers to the liquid remaining after filtration and removal of cells from the culture medium by centrifugation and filtration.
  • the culture filtrate contains substances formed and discharged during the growth of microorganisms, so the substances can be purified or extracted.
  • culture supernatant in the present specification refers to a supernatant obtained after removing most of the microorganisms from the culture medium through a centrifugation method.
  • extract in the present specification means that it is separated from the culture solution of the strain, and the extract includes fractions.
  • pests may be one or more selected from the group consisting of bacteria, fungus, oomycetes, pests, and nematodes, but is not limited thereto.
  • the bacteria are Acidovorax avenae subsp Cattleya ( Acidovorax avenae subsp. cattleyae ), Acidovorax konjaci ( Acidovorax konjaci ), Agrobacterium tumefaciens ( Agrobacterium tumefaciens ), Berkolderia glume ( Burkholderia glumae ), Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis ( Clavibacter michiganensis subsp.
  • Pseudomonas syringae Pasoba actinidia Pseudomonas syringae pv. actinidiae
  • Ralstonia solanasia room Ralstonia solanacearum
  • Pseudomonas janto yubejikatoria Xanthomonas euvesicatoria
  • Citri Citri
  • Xantho It may be at least one selected from the group consisting of Monas acricola passoba pruni ( Xanthomonas arboricola pv. pruni ) and Xanthomonas duck material passoba duck material ( Xanthomonas oryzae pv. oryzae ), but is not limited thereto.
  • the fungus is Botrytis cinerea, Colletotrichum coccodes , Fusarium graminearum , Fusarium oxysporum F Espi Cucumerinum ( Fusarium oxysporum f .sp. cucumerinum ), Raphaella quercus-mongolice ( Raffaelea quercus-mongolicae ), Rhizoctonia solani ( Rhizoctonia solani ) and Sclerotinia homoeookapa ( Sclerotinia homoeocarpa ) At least one species selected from the group consisting of It may be, but is not limited thereto.
  • the oomycete may include Pythium ultimum , but is not limited thereto.
  • pests may include bridal aphids ( Aphis citricola ), but are not limited thereto.
  • the disease caused by pests may be at least one selected from the group consisting of fruit tree burn, bacterial blight, creeper blight, and diseases caused by spirea aphid, but is not limited thereto.
  • composition for controlling plant diseases and pests is selected from the group consisting of streptothricin E acid, streptothricin D and 12-carbamoylstreptothricin D It may include one or more, but is not limited thereto.
  • streptothricin E acid has a molecular weight of 649 and a molecular formula of C 25 H 48 N 10 O 10 .
  • streptothricin E acid has the following formula (I).
  • streptothricin D has a molecular weight of 759 and a molecular formula of C 31 H 59 N 12 O 10 .
  • streptothricin D has the following formula II.
  • 12-carbamoylstreptotricin D has a molecular weight of 759 and a molecular formula of C 31 H 59 N 12 O 10 .
  • 12-carbamoylstreptotricin D has the following formula III.
  • composition for controlling plant diseases and pests may further include additives such as additives, extenders, nutrients, or sealants, but is not limited thereto.
  • the additive is polycarboxylate, sodium lignosulfonate, calcium lignosulfonate, sodium dialkyl sulfosuccinate, sodium alkyl aryl sulfonate, polyoxyethylene alkyl phenyl ether, sodium tripolyphosphate, polyoxyethylene
  • the bulking agent may include one or more selected from the group consisting of bentonite, talc, dialite, kaolin, and calcium carbonate. It is not limited.
  • the nutrient may include at least one selected from the group consisting of skim milk (media), soy flour, rice, wheat, ocher, diatomaceous earth, bentonite, dextrin, glucose, and starch. , but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present invention is to use at least one selected from the group consisting of streptothricin E acid, streptothricin D and 12-carbamoylstreptothricin D It relates to a composition for pest control comprising
  • pests may be one or more selected from the group consisting of bacteria, fungus, oomycetes, pests, and nematodes, but is not limited thereto.
  • the bacteria are Acidovorax avenae subsp Cattleya ( Acidovorax avenae subsp. cattleyae ), Acidovorax konjaci ( Acidovorax konjaci ), Agrobacterium tumefaciens ( Agrobacterium tumefaciens ), Berkolderia glume ( Burkholderia glumae ), Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis ( Clavibacter michiganensis subsp.
  • Pseudomonas syringae Pasoba actinidia Pseudomonas syringae pv. actinidiae
  • Ralstonia solanasia room Ralstonia solanacearum
  • Pseudomonas janto yubejikatoria Xanthomonas euvesicatoria
  • Citri Citri
  • Xantho It may be at least one selected from the group consisting of Monas acricola passoba pruni ( Xanthomonas arboricola pv. pruni ) and Xanthomonas duck material passoba duck material ( Xanthomonas oryzae pv. oryzae ), but is not limited thereto.
  • the fungus is Botrytis cinerea, Colletotrichum coccodes , Fusarium graminearum , Fusarium oxysporum F Espi Cucumerinum ( Fusarium oxysporum f .sp. cucumerinum ), Raphaella quercus-mongolice ( Raffaelea quercus-mongolicae ), Rhizoctonia solani ( Rhizoctonia solani ) and Sclerotinia homoeookapa ( Sclerotinia homoeocarpa ) At least one species selected from the group consisting of It may be, but is not limited thereto.
  • the oomycete may include Pythium ultimum , but is not limited thereto.
  • pests may include bridal aphids ( Aphis citricola ), but are not limited thereto.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for producing a composition for controlling pests comprising a step of culturing Streptomyces sp. JCK-6131 strain to prepare a culture medium.
  • the Streptomyces sp JCK-6131 strain may be the Streptomyces sp JCK-6131 strain deposited under accession number KCTC 14658BP.
  • pests may be one or more selected from the group consisting of bacteria, fungus, oomycetes, pests, and nematodes, but is not limited thereto.
  • the bacteria are Acidovorax avenae subsp Cattleya ( Acidovorax avenae subsp. cattleyae ), Acidovorax konjaci ( Acidovorax konjaci ), Agrobacterium tumefaciens ( Agrobacterium tumefaciens ), Berkolderia glume ( Burkholderia glumae ), Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis ( Clavibacter michiganensis subsp.
  • Pseudomonas syringae Pasoba actinidia Pseudomonas syringae pv. actinidiae
  • Ralstonia solanasia room Ralstonia solanacearum
  • Pseudomonas janto yubejikatoria Xanthomonas euvesicatoria
  • Citri Citri
  • Xantho It may be at least one selected from the group consisting of Monas acricola passoba pruni ( Xanthomonas arboricola pv. pruni ) and Xanthomonas duck material passoba duck material ( Xanthomonas oryzae pv. oryzae ), but is not limited thereto.
  • the fungus is Botrytis cinerea, Colletotrichum coccodes , Fusarium graminearum , Fusarium oxysporum F Espi Cucumerinum ( Fusarium oxysporum f .sp. cucumerinum ), Raphaella quercus-mongolice ( Raffaelea quercus-mongolicae ), Rhizoctonia solani ( Rhizoctonia solani ) and Sclerotinia homoeookapa ( Sclerotinia homoeocarpa ) At least one species selected from the group consisting of It may be, but is not limited thereto.
  • the oomycete may include Pythium ultimum , but is not limited thereto.
  • pests may include bridal aphids ( Aphis citricola ), but are not limited thereto.
  • the method may include a fractionation step of obtaining an active fraction from the culture medium, but is not limited thereto.
  • the active fraction is at least one selected from the group consisting of streptothricin E acid, streptothricin D and 12-carbamoylstreptothricin D It may include, but is not limited to.
  • the culture medium may contain at least one selected from the group consisting of milk proteins such as skim milk, whey, casein, saccharides, homo and extracts, but is not limited thereto.
  • the method for preparing a composition for controlling plant diseases and pests may further include a concentration step of concentrating the culture medium.
  • the method for preparing a composition for controlling plant diseases and pests may further include a dilution step of diluting the culture medium.
  • the method for preparing a composition for controlling plant diseases and pests may further include a drying step of drying the culture medium.
  • the drying step may be freeze drying, but is not limited thereto.
  • the method for preparing a composition for controlling plant diseases and pests may further include an extraction step of extracting components from cells.
  • the method for preparing a composition for controlling plant diseases and pests may further include a fractionation step of obtaining an active fraction from the culture medium.
  • the fractionation step may include the following steps:
  • a fractionation step of purifying the precipitate to select an active fraction A fractionation step of purifying the precipitate to select an active fraction
  • a purification step to purify the active fraction is
  • the culture filtrate obtaining step is centrifuging the culture medium at 2000 to 5000 rpm, 2500 to 5000 rpm, 3000 to 5000 rpm, 3500 to 5000 rpm, 4000 to 5000 rpm, 4500 to 5000 rpm, for example, 4500 rpm It may include the step of doing, but is not limited thereto.
  • the filtration step adjusts the pH of the culture filtrate to pH 3.0 to 5.0, pH 3.4 to 5.0, pH 3.6 to 5.0, pH 3.0 to 4.5, pH 3.4 to 4.5, pH 3.6 to 4.5, pH 3.0 to 4.0, pH 3.4 to It may include the step of adjusting to 4.0, pH 3.6 to 4.0, for example, pH 3.6, but is not limited thereto.
  • the precipitation step may include a step of precipitating with acetone to produce a precipitate, but is not limited thereto.
  • the fractionation step may include a step of purifying the precipitate using a Sephadex LH20 open column, but is not limited thereto.
  • the purification step may include, but is not limited to, purification by reverse-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC).
  • RP-HPLC reverse-phase high-performance liquid chromatography
  • the fractionation step may further include a pure substance identification step.
  • the step of identifying a pure substance may include drying the active fraction.
  • the ZORBAX C18 column may serve as a stationary phase, but is not limited thereto.
  • a 0.01 to 8% acetonitrile solution may serve as a mobile phase, but is not limited thereto.
  • the acetonitrile solution may be one to which 0.05% trifluoroacetic acid is added, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present invention relates to a plant disease and pest control method comprising a composition treatment step of treating a culture broth or an extract of Streptomyces sp. JCK-6131 strain.
  • the Streptomyces sp JCK-6131 strain may be the Streptomyces sp JCK-6131 strain deposited under accession number KCTC 14658BP.
  • composition treatment step may be performed by one or more methods selected from the group consisting of spraying, soil drenching, surface spraying, rhizosphere treatment, seed treatment, immersion, poisoning, and smoking, but is not limited thereto .
  • “spraying” may be carried out in one or more ways selected from the group consisting of spraying, misting, atomizing, powder spraying, granule spraying, lifetime use and regular use.
  • the term “drench” is a method of spraying a drug by injecting a chemical solution by digging a hole in soil or trees.
  • soil drench is a method of injecting or spraying a chemical solution to crop cultivation soil.
  • the contents overlapping with the composition for controlling plant diseases and pests are omitted in consideration of the complexity of the present specification.
  • the present invention relates to a composition for controlling plant pests comprising a culture medium of Streptomyces sp. JCK-6131 strain or an extract thereof, a method for preparing the same, and a method for controlling plant pests, wherein the culture medium of the strain or an extract thereof has antibacterial activity and induction Since it has excellent resistance, it can be used to control plant diseases and pests.
  • Figure 1a is a phylogenetic diagram shown through nucleotide sequence analysis of 16S rRNA gene of Streptomyces sp. JCK-6131 strain according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 1b is a photograph showing the result of analyzing the similarity between the Streptomyces sp JCK-6131 strain and the related Streptomyces strain according to an embodiment of the present invention with OAT software.
  • Figure 2a is a graph showing the total ion chromatogram (TIC) of LC-ESI-MS of the antibacterial active fraction derived from Streptomyces sp JCK-6131 strain according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2b is a graph showing the results of ESI-MS analysis of the positive ion mode of the antibacterial active fraction derived from Streptomyces sp JCK-6131 strain according to an embodiment of the present invention.
  • 2c is a result showing the structural identification of Streptothricin E acid in the antibacterial active fraction derived from Streptomyces sp JCK-6131 strain according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3a is a graph showing the total ion chromatogram of LC-ESI-MS of the antibacterial active fraction derived from Streptomyces sp JCK-6131 strain according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3b is a graph showing the results of ESI-MS analysis of the positive ion mode of the antibacterial active fraction derived from Streptomyces sp JCK-6131 strain according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3c is a result showing the structural identification of streptothricin D in the antibacterial active fraction derived from Streptomyces sp JCK-6131 strain according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4a is a graph showing the total ion chromatogram of LC-ESI-MS of the antibacterial active fraction derived from Streptomyces sp JCK-6131 strain according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4b is a graph showing the results of ESI-MS analysis of the positive ion mode of the antibacterial active fraction derived from Streptomyces sp JCK-6131 strain according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4c is a result showing the structural identification of 12-carbamoylstreptothricin D in the antibacterial active fraction derived from Streptomyces sp JCK-6131 strain according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5a is a graph showing the apple burn disease control effect of Streptomyces sp JCK-6131 strain culture medium according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5b is a photograph showing the apple burn disease control effect of Streptomyces sp JCK-6131 strain culture medium according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6a is a graph showing the tomato blight control effect of Streptomyces sp JCK-6131 strain culture medium according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6b is a photograph showing the tomato blight control effect of Streptomyces sp JCK-6131 strain culture medium according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7a is a graph showing the control effect of cucumber vine peeling disease of the culture medium of Streptomyces sp JCK-6131 strain according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7b is a photograph showing the effect of controlling cucumber vine peeling disease of the culture medium of Streptomyces sp JCK-6131 strain according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 8 is a photograph showing the results of the assay of PR1 gene expression according to the presence or absence of GUS expression in the culture medium and culture filtrate of Streptomyces sp JCK-6131 strain according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 9a shows the induction resistance gene, PR1 , after treating Streptomyces sp JCK-6131 strain culture medium according to an embodiment of the present invention. It is a graph showing the results of comparative evaluation of the expression amount.
  • Figure 9b shows the induced resistance gene, PR3 , after treating the culture medium of Streptomyces sp JCK-6131 strain according to an embodiment of the present invention. It is a graph showing the results of comparative evaluation of the expression amount.
  • Figure 9c shows the induced resistance gene, PR5 , after treating the culture medium of Streptomyces sp JCK-6131 strain according to an embodiment of the present invention. It is a graph showing the results of comparative evaluation of the expression amount.
  • Figure 9d is a Streptomyces sp JCK-6131 strain culture medium according to an embodiment of the present invention after treatment of the induction resistance gene PR12 It is a graph showing the results of comparative evaluation of the expression amount.
  • Figure 10a is a photograph evaluating the preventive effect of spirea aphid ( Aphis citricola ) on apple trees not treated with a powdered hydrating agent containing Streptomyces sp JCK-6131 strain according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 10b is a photograph evaluating the preventive effect of spirea aphid ( Aphis citricola ) on apple trees treated with a powdered hydrating agent containing Streptomyces sp JCK-6131 strain according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 11a shows the partially purified fraction (partially purified extract, PPE) of three antibacterial active substances of Streptomyces sp JCK-6131 strain culture medium according to an embodiment of the present invention, Streptothricin E acid, streptothricin D, and 12-carbamoylstreptothricin D. It is a graph showing the results of evaluating the control effect on tomato blight by soil drenching.
  • Figure 11b shows the partially purified fraction (partially purified extract, PPE) of three antibacterial active substances of Streptomyces sp JCK-6131 strain culture medium according to an embodiment of the present invention, Streptothricin E acid, streptothricin D, and 12-carbamoylstreptothricin D. It is a photograph showing the result of evaluating the control effect on tomato blight by soil drenching.
  • % used to indicate the concentration of a specific substance is (weight/weight)% for solid/solid, (weight/volume)% for solid/liquid, unless otherwise specified. /liquid is (volume/volume)%.
  • Strains with control activity against plant diseases and pests are found in healthy pepper rhizosphere (the soil environment that causes various changes, such as the ratio of constituent organisms changing as the growing roots consume and store substances) in the hot pepper blight-prone area of Daejeon. isolated from the soil present. After collecting 100 g of soil, diluting it in Phosphate Buffered Saline (pH 7.0), spreading it on a Tryptic Soy Agar (TSA) plate, culturing at 30 ° C for 3 to 7 days or more to strain the strain. separated.
  • Phosphate Buffered Saline pH 7.0
  • TSA Tryptic Soy Agar
  • PCR was performed at 95 °C for 5 minutes, followed by 30 cycles of 95 °C for 30 seconds, 55 °C for 30 seconds, and 72 °C for 30 seconds, and then amplification was completed at 72 °C for 7 minutes and 12 °C.
  • a total of 1386 bp of nucleotide sequence was determined as the 16s rRNA coding nucleotide sequence of the isolated strain, JCK-6131 strain, and the results are shown in Table 2 below.
  • strain JCK-6131 was identified as Streptomyces sp. JCK-6131, and a partial 16S rRNA nucleotide sequence (SEQ ID NO: 3) was registered in GenBank as accession number MW911616.
  • the JCK-6131 strain showed genetic similarity with the Streptomyces strain as shown in Table 3 below (FIGS. 1a and 1b).
  • JCK-6131 strain was identified as Streptomyces sp., and the strain was named Streptomyces sp. JCK-6131, and as of August 18, 2021, Korea KCTC (Korean Collection for Type Cultures) and received accession number KCTC 14658BP.
  • ISP1 yeast extract 3 g per 1 L, tryptone 5 g, agar 18 g, pH 7.0-7.2
  • ISP2 yeast extract per 1 L to confirm the colony color and pigmentation of Streptomyces sp JCK-6131 4 g, malt extract 10 g, dextrose 4 g, agar 18 g, pH 7.3
  • ISP3 oil extract 10 g per 1 L, agar 18 g, pH 7.2
  • ISP4 soluble starch 10 g per 1 L, K 2 HPO 4 1 g, MgSO 4 .7H 2 O 1 g, NaCl 1 g, (NH 4 ) 2 SO 4 2 g, CaCO 3 2 g, trace salt solution 1 mL, agar 18 g, pH 7.0-7.4)
  • protease, amylase, lipase, cellulase, and chitinase of Streptomyces sp JCK-6131 strain were measured.
  • the activity of the proteolytic enzyme was inoculated with Streptomyces sp JCK-6131 strain in a medium supplemented with 1% skim milk and 1% agar, and then cultured to measure the presence or absence of a clear zone.
  • the activity of amylase was measured in a medium supplemented with 2% starch and 1% agar, lipase in a medium supplemented with 2% Tween 80, 0.01% methyl red and 1% agar, and cellulase 0.2
  • media containing % Carboxymethylcellulose (CMC) and 1% agar chitinase was K 2 HPO 4 0.7 g/L, KH 2 PO 4 0.3 g/L, MgSO 4 .5H 2 O 0.5 g/L , FeSO 4 .7H 2 0, 0.01 g/L, ZnSO 4 , 0.001 g/L, MnCl 2 0.001 g/L mixed solution, 2.0% moist coll
  • Streptomyces sp JCK-6131 strain possesses protease, amylase, lipase and cellulase activities except for chitinase.
  • ISP4 medium soluble starch 10 g per 1 L, K 2 HPO 4 1 g, MgSO 4 . 7H 2 O 1 g, NaCl 1 g, (NH 4 ) 2 SO 4 2 g, CaCO 3 2 g, trace salt solution 1 mL, agar 18 g, pH 7.0 to 7.4 were used.
  • the carbon source 10 g of soluble starch was removed and various 1% carbon sources were used.
  • the nitrogen source 2 g of (NH 4 ) 2 SO 4 was removed and various 0.1% nitrogen sources were added to the final concentration to measure the utilization concentration. As a result, are shown in Table 6 below.
  • Streptomyces sp JCK-6131 strain was used for all carbon sources (D-fructose, D-galactose, D-mannose, D-xylose, lactose, L-arabinose, maltose, mannitol, raffinose , rhamnose, sacarose, starch, trehalose) and nitrogen sources (arginine, cysteine, phenylalanine, histidine, L-methionine, lysine, proline, serine, threonine, valine) were confirmed to be able to grow.
  • carbon sources D-fructose, D-galactose, D-mannose, D-xylose, lactose, L-arabinose, maltose, mannitol, raffinose , rhamnose, sacarose, starch, trehalose
  • nitrogen sources arginine, cysteine, phenylalanine, histidine,
  • Bennet agar medium (glucose 10 g/L, yeast extract 1 g/L, peptone 2 g/L, beef extract 1 g/L, agar 20 g/L) was used.
  • Example 4 Evaluation of mycelial growth inhibitory concentration of various phytopathogenic bacteria and fungi of Streptomyces sp JCK-6131 strain
  • Streptomyces sp JCK-6131 strain was inoculated in a Glucose-Soybean meal-Sodium chloride (GSS) liquid medium, and then cultured with shaking at 180 rpm for 3 days at 28 °C.
  • the culture solution was centrifuged at 10,000 rpm for 20 minutes, and the culture filtrate was harvested by filtering through a 0.2 ⁇ m sterile filter, and at concentrations of 0.08, 0.16, 0.33, 0.63, 1.25, 2.5, 5, and 10%, the mycelia and bacteria of plant pathogenic fungi processed.
  • Acidovorax avenae subsp Cattleya Acidovorax avenae subsp. cattleyae
  • Acidovorax konjaci Acidovorax konjaci
  • Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens
  • Berkolderia glume Burkholderia glumae
  • Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis Clavibacter michiganensis subsp.
  • Pseudomonas syringae Pasova actini Diae Pseudomonas syringae pv. actinidiae
  • Ralstonia solanasia room Ralstonia solanacearum
  • Pseudomonas janto yubejikatoria Xanthomonas euvesicatoria
  • Pseudomonas janto Pseudomonas axonopodiso bar citri Xanthomonas axonopodis pv.
  • Xanthomonas Acricola Passoba Pruni Xanthomonas arboricola pv. pruni
  • Xanthomonas duck material Passoba duck material Xanthomonas oryzae pv. oryzae
  • TSA tripsin soy agar
  • the shake-cultured plant pathogenic bacteria were inoculated into a 96-well plate by adjusting the OD 600 value to 0.1 using a UV spectrophotometer, and then diluted with sterile water to 10 6 CFU/ml.
  • the pathogen inoculation concentration for the antibacterial activity assay was adjusted to a concentration of 10 5 CFU/ml by inoculating 1% in TSB liquid medium after adjusting the OD value to 0.1.
  • 180 ⁇ L of the pathogen suspension was added to each well of a 96-well plate, and then 20 ⁇ L of Streptomyces sp JCK-6131 strain culture filtrate was dispensed thereto to treat the sample at a concentration of 10%.
  • the culture filtrate of the Streptomyces sp JCK-6131 strain showed strong antibacterial activity that inhibited the growth of various plant pathogenic bacteria, and the 100% growth inhibitory concentration was slightly different depending on the plant pathogenic bacteria , but showed an MIC value in the range of 0.31 to 10%, and exhibited excellent antibacterial activity.
  • the culture filtrate of the Streptomyces sp JCK-6131 strain showed superior antibacterial activity against all pathogenic bacteria than streptomycin used as a control.
  • Botrytis cinerea Botrytis cinerea
  • Colletotrichum coccodes Colletotrichum coccodes
  • Fusarium graminearum Fusarium graminearum
  • Fusarium oxysporum F. sp. Cucumerinum Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum
  • Raffaelea quercus-mongolicae Rhizoctonia solani and Sclerotinia homoeocarpa and one phytopathogenic oomycete Pythium ultimum was inoculated on PDA (Potato Dextrose agar) and incubated at 25° C. for 3 to 5 days to activate it. Then, the 7 plant pathogenic fungi and 1 plant pathogenic oomycete were cultured at 25° C. for 7 days.
  • the mycelium After adjusting the mycelium to a concentration of 500 ⁇ g/mL (w/v), it was prepared by grinding using a blender (DAIHAN, HG-15D). 180 ⁇ L of mycelial suspension was added to each well of a 96-well plate, and then 20 ⁇ L of the sample was dispensed thereto to treat the culture filtrate of the Streptomyces sp JCK-6131 strain at a concentration of 10%. Then, 100 ⁇ L was taken from the well treated with a concentration of 10% and dispensed to the next well, and 100 ⁇ L of the ground mycelia was mixed to prepare a concentration of 5%. 2.5% to 0.08% were also diluted in the same manner as above. The same experiment was repeated three times, and the results were observed after 1 to 3 days, and the results are shown in Table 9 below.
  • the culture filtrate of Streptomyces sp JCK-6131 strain showed strong antibacterial activity that inhibited the mycelial growth of various plant pathogenic fungi, and the 100% mycelial growth inhibitory concentration was somewhat different depending on the plant pathogenic fungus. Although different, they showed good antifungal activity with MIC values ranging from 0.42 to 1.67%.
  • the strain was inoculated into a Glucose-Soybean meal-Sodium chloride (GSS) liquid medium, and then at 28 ° C. for 7 days at 180 rpm shake culture. After incubation, the culture medium (total of 1 L) was centrifuged at 4500 rpm for 10 minutes to obtain the culture supernatant. After adjusting the pH of the culture supernatant to 3.6, Amberlite XAD-16N resin (50 g) was added, left for 8 hours or more, and then filtered with filter paper. Then, the filtrate was precipitated with cold acetone and centrifuged at 10,000 rpm to obtain a precipitate.
  • GSS Glucose-Soybean meal-Sodium chloride
  • the precipitate was then dissolved with PBS (50 mM, pH 7.0).
  • the dissolved precipitate was purified with a Sephadex LH20 open column, and among the separated fractions, a fraction having antibacterial activity was selected, and the selected antibacterial active fraction was subjected to reverse phase high-performance liquid chromatography (Reverse phase high-performance liquid chromatography). It was purified by chromatography; RP-HPLC).
  • the antibacterial active substances purified from the JCK-6131 strain of Streptomyces sp were positive ion mode liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry (LC-ESI-MS, Shimadzu 6AD HPLC) equipped with a ZORBAX C18 column (4.6 ⁇ 250 mm) ; API2000) was used for mass spectrometry.
  • LC-ESI-MS positive ion mode liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry
  • API2000 API2000
  • elution solvent distilled water and acetonitrile with 0.05% trifluoroacetic acid (TFA) added were used, and acetonitrile with 0.05% trifluoroacetic acid (TFA) added from 0% to 8% was used at a flow rate of 1 ml/min. Elution was performed, and the results are shown in Figs. 2a to 4c.
  • the active materials were streptothricin E acid, streptothricin D and 12-carbamoylstreptothricin D by comparing the molecular weight and mass spectrum of the existing literature. (12-carbamoylstreptothricin D).
  • Each treatment group was examined for disease severity at 75% humidity and 30 ° C. after pathogen inoculation. Each treatment was repeated 3 times, each repetition consisted of 3 ports, and the same experiment was repeated 3 times to evaluate the efficacy.
  • the onset index of the disease was examined by dividing into four types as follows.
  • index 0 no symptoms
  • the disease control value was calculated using Equation 1 described below, and the results are shown in Table 10 and FIGS. 5a and 5b.
  • Control rate (%) (Incidence in untreated area - Infestation in treated area) / Incidence in non-treated area ⁇ 100%
  • the Streptomyces sp JCK-6131 strain culture medium controlled apple burn disease in a concentration-dependent manner.
  • the strain culture was diluted 5 times and treated, it showed an apple fire blight control effect of 77.78%, which is a control activity similar to that of the control drug bramycin hydrolyzate.
  • Streptomyces sp JCK-6131 strain culture medium has the same in vitro pathogenic bacteria growth reduction effect as well as the apple burn disease pathogen in vivo . ( Erwinia amylovora ) It was confirmed that there is an excellent effect on the control of diseases caused by.
  • Example 7 Evaluation of control effect and induction resistance to tomato blight of Streptomyces sp JCK-6131 strain
  • Streptomyces sp JCK-6131 strain culture medium was 5 times (FB_5 Fold), 10 times (FB_10 Fold), 20 times (FB_20 Fold) and 100 times (FB_100 Fold) with sterile water on the prepared plants. After dilution, each 20 mL soil drench was treated, and then 1 day later, the causative agent of tomato blight ( Ralstonia solanacearum ) was inoculated with 20 mL soil drench at a concentration of 10 8 cfu / mL. At this time, as a control agent, streptomycin sulfate 20% WP; 1000-fold diluted and treated 1 day before inoculation.
  • Streptomyces sp JCK-6131 strain culture medium (FB_100 Fold) was foliarly sprayed (F) and inoculated with soil drench (S) 3 days before pathogen inoculation to the prepared plants.
  • the results of the efficacy evaluation experiment were compared.
  • streptomycin sulfate 20% WP; Farm Hannong; Bu was used after diluting 1000 times.
  • onset index of the disease was divided into four categories as follows.
  • the disease control value was calculated using Equation 1, and the results are shown in Tables 11 and 12 and FIGS. 6a and 6b.
  • the Streptomyces sp JCK-6131 strain culture medium effectively controlled tomato foot blight, and in particular, the Streptomyces sp JCK-6131 strain culture medium was diluted 5-fold and 10-fold. When, it exhibited similar or superior control activity to that of the control drug bramycin hydrate.
  • Streptomyces sp JCK-6131 strain culture medium was diluted 100 times 3 days before pathogen inoculation and foliar spraying was performed to evaluate induction resistance.
  • foliar spraying (FB_100 Fold, F (Foliar spray)) resulted in 52.78% control.
  • soil drench control (FB_100 Fold, S (soil drenching) showed a control value of 55.55% (Fig. 6b).
  • Example 8 Evaluation of the control effect of Cucumber vine peeling disease of Streptomyces sp. JCK-6131 strain
  • Fusarium oxyspoirum f.sp. cucumerinum (hereinafter, Foc), the causative bacterium of cucumber vine splitting disease, was inoculated into a PDA medium and incubated at 25 ° C for 7 days. Inoculated into V8-juice broth (V8 broth, V-8 juice 200 mL, CaCO 3 3 g, distilled water 1 L) medium, and cultured with shaking at 150 rpm in the dark at 25 ° C. for 7 days. After shaking culture, the pathogen culture was harvested, filtered through 4 layers of gauze to remove mycelia, and centrifuged (5,000 rpm, 10 minutes, 4 °C) to remove the culture filtrate.
  • V8-juice broth V8 broth, V-8 juice 200 mL, CaCO 3 3 g, distilled water 1 L
  • the pathogen culture was harvested, filtered through 4 layers of gauze to remove mycelia, and centrifuged (5,000 rpm, 10 minutes, 4 °C) to remove the
  • the concentration of spores (small conidia) was diluted with sterile water to 1.0 x 10 6 conidia/mL under an optical microscope using a calculator (Hemacytometer), and the Foc spore suspension was used as an inoculum.
  • Pregerminated cucumber seeds were transplanted one per pot and grown as cucumber seedlings at 25 °C for 7 days. Then, the Streptomyces sp JCK-6131 strain culture medium was diluted 5 times (FB_5 Fold), 10 times (FB_10 Fold), 20 times (FB_20 Fold) and 100 times (FB_100 Fold), 20 mL each of germinated 7-day-old cucumbers Seedlings were treated with soil drench. Then, 1 day after sample treatment, 20 mL of spore suspension of Foc strain was inoculated by soil drench.
  • the untreated group was treated with a solution to which Tween 20 was added at a level of 250 ug/mL, and as a control drug, Janrokend (Ja) dispersible liquid (active ingredient hymexazole 30%, penthiopyrad 5%) , Korea Samgong, Korea) was diluted 1000 times. All treatments were treated with soil drench by 20 mL per pot.
  • the inoculated cucumber seedlings were cultured in the dark for 24 hours in a humid room at 25 °C, transferred to a constant temperature room at 25 °C, and grown for 4 weeks while irradiating light for 12 hours a day, and the occurrence of cucumber vine break disease was investigated. Each treatment was repeated 3 times, each repetition consisted of 3 ports, and the same experiment was repeated 3 times to evaluate the efficacy. In addition, the disease severity was converted into the following index.
  • the Streptomyces sp JCK-6131 strain culture medium reduced the occurrence of oil vine splinter disease caused by Foc strains in the 5-fold, 10-fold, 20-fold and 100-fold dilution treatment groups.
  • the 5-fold dilution of the Streptomyces sp JCK-6131 strain sample showed a control value of about 83.33%, showing a control activity similar to that of the control drug, zanroxen.
  • Plant resistance is induced through the salicylic acid signaling pathway, resulting in expression of the PR1 protein.
  • Expression of the PR1 gene is used as a marker gene to test whether or not resistance is induced in plants.
  • the resistance-inducing activity of the Streptomyces sp JCK-6131 strain culture medium was assayed with the PR1 gene expression system.
  • Example 10 Mechanism of tomato blight control by induction resistance of Streptomyces sp. JCK-6131 strain
  • Streptomyces sp JCK-6131 culture medium was diluted 100 times to tomato seedlings in the fourth leaf stage and treated with soil drench by 20 mL, then Ralstonia solanacearum, the causative agent of tomato green blight, was added at a concentration of 10 8 cfu/mL to 20 Inoculated by mL soil drench.
  • Streptomyces sp JCK-6131 culture medium was foliarly sprayed 3 days before inoculation of Ralstonia solanacearum, and Streptomyces sp JCK-6131 was used as a sample for confirmation of induced resistance gene expression.
  • qRT-PCR was performed at 95 °C for 3 minutes, followed by 95 °C for 15 seconds and 57 °C for 60 seconds 40 times. Then, to confirm the specificity of the amplified product, a melting curve step was performed. qRT-PCR was performed three times under the same conditions.
  • the relative expression level of each gene was calculated by the ⁇ Ct method, a relative quantification method, and a housekeeping gene (ubiquitin (UBI)) was used for normalization to accurately measure target gene expression.
  • UBI housekeeping gene
  • the experiment was repeated three times, and the expression patterns of the PR1, PR3, PR5, and PR12 genes related to the finally analyzed silicylic acid signaling pathway and jasmonic acid signaling pathway are shown in Table 15 and FIGS. 9a to 9d.
  • a powdered wettable powder containing the Streptomyces sp JCK-6131 strain was prepared, and the control effect on bridal aphid ( Aphis citricola ), which is a major damage to apples, was evaluated.
  • Streptomyces sp JCK-6131 strain was inoculated into GS (Glucose-Soybean meal-Sodium chloride; GSS) medium, and then cultured at 28 ° C. for 7 days with shaking at 180 rpm. Then, 100 mL of the strain culture was freeze-dried to prepare a lyophilisate of about 6 g. In 2 g of lyophilisate, 0.5 g of white carbon, 0.5 g of sodium dodecylsufate (CR-SDS) wetting agent, and sodium poly (naphthalene formaldehyde) sulfonate (CR-SDS) were added.
  • GSS Glucose-Soybean meal-Sodium chloride
  • a total of 10 g of powdered wettable powder was prepared by mixing 0.5 g of dispersant and 5.5 g of kaolin (Kaoline extender). Then, after grinding very finely with a blender, it was used for experiments while stored at room temperature.
  • kaolin Kaolin
  • FIG. 10a a large amount of spirea aphid was easily observed on the leaves and stems of apple seedlings in the untreated group.
  • FIG. 10b no spirea aphid was observed on the leaves and stems of the dead flower seedlings treated with the powdered hydrating agent containing the Streptomyces sp JCK-6131 strain.
  • Example 12 Evaluation of tomato blight control effect of antibacterial active fraction derived from Streptomyces sp JCK-6131 strain
  • Streptomyces sp JCK-6131 strain was inoculated in GS (Glucose-Soybean meal-Sodium chloride; GSS) liquid medium, and then cultured with shaking at 180 rpm at 28 ° C. for 3 days. 1 L of the culture medium was centrifuged at 4500 rpm for 10 minutes to obtain a culture supernatant. After adjusting the pH of the culture supernatant to 3.6, Amberlite XAD-16N resin (50 g) was added, left for 8 hours or more, and then filtered with filter paper. Then, the filtrate was precipitated with cold acetone and centrifuged at 5,000 rpm for 15 minutes to obtain a precipitate.
  • GSS Glucose-Soybean meal-Sodium chloride
  • the precipitate was then dissolved in PBS (50 mM, pH 7.0). The dissolved precipitate was purified with a Sephadex LH20 open column, and the separated fraction was selected. Streptothricin E acid, streptothricin D, and 12- carbamoylstreptothricin D was used as a partially purified extract (PPE).
  • PPE partially purified extract
  • tomatoes of Seogwang variety were used after growing up to 4 leaves in horticultural medium.
  • Each treatment group was inoculated with the causative agent of the tomato blight pathogen ( Ralstonia solanacearum ), and then the degree of disease was evaluated after 10 days at 75% humidity and 30 ° C.
  • the incidence index was divided into 4 as follows.
  • the partially purified fractions of the Streptomyces sp JCK-6131 strain (1000 ⁇ g/mL, 100 ⁇ g/mL, 10 ⁇ g/mL concentrations) showed tomato blight in a concentration-dependent manner. prevented.
  • the partially purified fraction of the Streptomyces sp JCK-6131 strain (1000 ⁇ g/mL) was treated, it showed a control value of about 88.89%, which was about 72.22% of the control value of Buramycin used as a control. It showed 16.67% better control effect.
  • the present invention relates to a composition for controlling plant diseases and pests, including a culture medium of Streptomyces sp. JCK-6131 strain or an extract thereof, a method for preparing the same, and a method for controlling plant pests using the same.

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Abstract

본 발명은 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 병해충 방제용 조성물, 이의 제조 방법 및 식물 병해충 방제 방법에 관한 것으로서, 상기 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 처리하였을 때 항균 활성 및 유도저항성이 월등히 우수하므로, 식물 병해충의 방제에 이용할 수 있다.

Description

스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 병해충 방제용 조성물, 이의 제조 방법 및 식물 병해충 방제 방법
본 발명은 농촌진흥청의 지원 하에서 과제번호 PJ015296042021에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 농촌진흥청, 연구사업명은 "과수화상병등현안문제병해충피해경감기술개발(R＆D)", 연구과제명은 "과수화상병의 생물학적 방제 기술 개발(4공동)", 주관기관은 전남대학교산학협력단, 연구기간은 2021.01.01 ~ 2021.12.31이다.
본 특허출원은 2021년 8월 30일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2021-0115010호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 스트렙토마이세스 에스피 (Streptomyces sp.) JCK-6131 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 병해충 방제용 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 식물 병해충 방제 방법에 관한 것이다.
식물 병해충은 식물의 형태, 기능 및 보전을 부분적 또는 전체적으로 손상시키며, 이러한 식물 병해충으로는 세균 (Bacteria), 진균 (Fungus), 난균 (Oomycetes), 해충 (Pest), 선충 (Nematode), 바이러스 및 기생식물 등이 포함된다.
식물 병원성 세균은 주로 농작업 기구 및 진딧물, 벌 등의 곤충에 의해 옮겨진다. 한 식물체 혹은 나무에서 세균병이 발생할 경우, 농과원 전체가 감염될 정도로 전염성이 매우 강하고, 방제가 어렵다. 현재 세균병의 방제 방법은 항생제와 구리 합성 화합물의 단제 또는 혼합제를 사용하는 방법, 또는 저항성 품종을 재배하는 방법이 있다. 하지만, 이러한 방법도 식물병원 세균의 발생 및 확산에 유리한 환경조건에서는 효과가 미비하며, 화학 살균제 사용에 따른 농업생태계 오염과 항생제 저항성 균주가 출현하는 등 여러 가지 문제점이 있다.
식물 병원성 진균은 식물 내부 또는 표면에 정착하여 식물의 영양분을 빼앗아 번식하며 전 세계적으로 다양한 작물에 있어서 심각한 피해를 야기하고 있다. 과거 식물병에 의한 심각한 피해 사례 33개 중에서 17개가 진균에 의한 것으로 나타날 정도로 진균에 의한 식물병은 다른 병원균에 비해 다양하고 피해 정도가 크다.
식물 병원성 난균은 옥수수, 대두, 감자, 밀, 전나무 및 많은 관상용 종을 포함한 수백가지 다양한 식물 숙주의 댐핑 오프 (Damping off), 뿌리 썩음병, 역병 또는 노균병을 유발한다.
식물에 피해를 주는 해충은 진딧물, 응애, 갈색 깍지벌레, 솜깍지벌레 등이 있으며, 이 중 진딧물은 식물에 자주 나타나는 해충으로 수작업으로 눈에 보이는 대로 잡아준 후에, 사오일 간격으로 약제를 살포하여 방제한다. 다만, 진딧물 중 조팝나무진딧물은 사과, 배, 감귤, 조팝나무 등에 심각한 영향을 끼쳐, 약제방제 후에도 다시 다발생 할 수 있다.
지난 수십년 동안 병해충을 방제하기 위하여 화학농약을 사용하여 왔으나, 이들의 반복적인 사용과 사용량 오남용으로 인하여 토양과 주변수를 포함한 환경의 오염, 유용 미생물의 감소, 잔류 독성 및 저항성 균주의 발생이라는 심각한 문제들을 유발하였다. 따라서, 이러한 문제점을 해결하고자 화학농약을 대체할 수 있는 미생물 및 미생물 유래 천연 물질을 이용한 친환경 농약이 대안으로 제시되었고 관련 연구들이 현재까지 활발하게 진행되고 있다.
하지만, 개발된 생물제제의 효능 및 종류는 아직 화학 농약과 비교하였을 때 충분하지 않기 때문에 더욱 우수한 생물학적 제제의 개발이 시급한 실정이다.
스트렙토마이세스 (Streptomyces)속은 방선균의 가장 큰 속이며, 다른 방선균과 마찬가지로 연쇄상 구균으로 그람 양성이며 GC 함량이 높은 게놈을 가진 것으로 알려져 있다. 주로 토양과 괴사하는 식물에서 발견되는 대부분의 스트렙토마이세스는 포자를 생산하며 복잡한 이차 대사에 의해 특징지어지는데, 이들은 임상적으로 유용한 자연 발생 항생제인 네오마이신, 사이파마이신, 보토로마이신, 클로람페니콜 등을 생산한다고 알려져 있다. 스트렙토마이세스속 균주로부터 항생 물질뿐만 아니라 여러 가지 생리활성 물질들이 분리되면서 이 균주는 산업적으로나 의학적으로 매우 중요한 미생물로 다루어지고 있다. 이러한 항생물질의 연구는 세균이나 진균 감염증에 유효한 물질에서 바이러스 병에 유효한 물질 탐색까지 발전하고 있으나, 이러한 연구들은 의학에 그 중점을 두고 진행됐다.
기존에 스트렙토마이세스 속을 이용한 인 비트로 (in vitro)연구는 방선균이 다양한 식물 병원성 미생물의 생장을 저해한다고 보고하였으며, 스트렙토마이세스 속이 분비하는 키틴네이즈는 식물 병원성 진균세포벽에 작용하여 진균의 생장을 저해할 수 있다고 보고하였다. 이러한 특징들로 미루어 볼 때, 스트렙토마이세스 속은 항균 생물 방제제로서 우수한 잠재력을 가지고 있다.
따라서, 이러한 스트렙토마이세스 속을 이용한 생물 방제제의 개발이 시급한 실정이다.
이에 본 발명자들은 스트렙토마이세스 에스피 (Streptomyces sp.) JCK-6131 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 식물병 원인균 또는 해충에 처리하였을 때 방제 활성이 월등히 우수한 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 항균 활성 및 유도저항성을 갖는 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 병해충 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 스트렙토트리신 E산, 스트렙토트리신 D 및 12-카바모일스트렙토트리신 D로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 식물 병해충 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 배양하는 배양 단계를 포함하는 식물 병해충 방제용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 처리하는 조성물 처리 단계를 포함하는 식물 병해충 방제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 스트렙토마이세스 에스피 (Streptomyces sp.) JCK-6131 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 병해충 방제용 조성물, 이의 제조방법, 및 식물 병해충 방제 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 식물 병해충 방제용 조성물은 식물병 원인균에 처리하였을 때 항균 활성이 월등히 우수하며, 유도저항성 기작으로 식물에서 병해충을 효과적으로 방제하는 것을 확인하였다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 항균 활성 및 유도저항성을 갖는 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주는 수탁번호 KCTC 14658BP로 기탁된 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주인 것일 수 있다.
본 발명의 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주는 한국생명공학연구원 KCTC (Korean Collection for Type Cultures)에 2021년08월18일자 수탁번호 KCTC 14658BP로 기탁되었다.
본 발명의 다른 양태는 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 병해충 방제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주는 수탁번호 KCTC 14658BP로 기탁된 스트렙토마이세스 에스피 균주인 것일 수 있다.
본 명세서상의 용어 “배양액”은 미생물을 배양한 후 상기 미생물을 포함한 것을 의미한다.
본 명세서상의 용어“배양여액”은 원심분리 및 여과를 수행함으로써 배양액으로부터 균체를 여과하여 제거한 뒤에 남은 액체를 의미한다. 배양여액은 미생물이 자라는 과정에서 형성하여 배출한 물질들이 포함되어 있어서 그 물질을 정제하거나 추출할 수 있다.
본 명세서상의 용어 “배양 상층액”은 원심분리 방법을 통해 배양액으로부터 대부분의 미생물을 제거한 후 획득한 상층액을 의미한다.
본 명세서상의 용어 “추출물”은 균주의 배양액에서 분리한 것을 의미하며, 추출물은 분획물을 포함한다.
본 발명에 있어서 병해충은 세균 (Bacteria), 진균 (Fungus), 난균 (Oomycetes), 해충 (Pest) 및 선충 (Nematode)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 세균은 아시도보락 아베나이 서브에스피 카틀레야 (Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 아시도보락 코냐시 (Acidovorax konjaci), 아그로박테리움 투머페시언스 (Agrobacterium tumefaciens), 버콜데리아 글루메 (Burkholderia glumae), 클라비박터 미시가넨시스 서브에스피 미시가넨시스 (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 어위니아 피리폴리에 (Erwinia pyrifoliae), 에르위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora), 펙토박테리움 카로토보룸 서브에스피 카로토보롬 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 펙토박테리움 크리산테미 (Pectobacterium chrysanthemi), 슈도모나스 시린게 패소바 라크리만스 (Pseudomonas syringae pv. lachrymans), 슈도모나스 시린게 패소바 액티니디애 (Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 랄스토니아 솔라나시아룸 (Ralstonia solanacearum), 잔토모나스 유베지카토리아 (Xanthomonas euvesicatoria), 잔토모나스 악소노포디스 패소바 사이트리 (Xanthomonas axonopodis pv. citri), 잔토모나스 아크리콜라 패소바 프루니 (Xanthomonas arboricola pv. pruni) 및 잔토모나스 오리재 패소바 오리재 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 진균은 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 콜레토크리쿰 코코데스 (Colletotrichum coccodes), 푸자리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 푸자리움 옥시스포룸 에프 에스피 쿠쿠메리눔 (Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum), 라파엘라 쿼르쿠스-몽고리케 (Raffaelea quercus-mongolicae), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani) 및 스크레로티니아 호모에오카파 (Sclerotinia homoeocarpa)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 난균은 피디움 울티뭄 (Pythium ultimum)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 해충은 조팝나무진딧물 (Aphis citricola)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 병해충으로 인한 병 (disease)은 과수 화상병, 세균성 풋마름병, 덩굴쪼김병 및 조팝나무진딧물로 인한 병으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 식물 병해충 방제용 조성물은 스트렙토트리신 E산 (Streptothricin E acid), 스트렙토트리신 D (streptothricin D) 및 12-카바모일스트렙토트리신 D (12-carbamoylstreptothricin D)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 스트렙토트리신 E산은 분자량이 649이며, 분자식이 C25H48N10O10이다.
본 발명에 있어서 스트렙토트리신 E산은 하기의 화학식 I을 갖는다.
[화학식 I]
Figure PCTKR2022012165-appb-img-000001
본 발명에 있어서 스트렙토트리신 D는 분자량이 759이며, 분자식이 C31H59N12O10이다.
본 발명에 있어서 스트렙토트리신 D는 하기의 화학식 II를 갖는다.
[화학식 II]
Figure PCTKR2022012165-appb-img-000002
본 발명에 있어서 12-카바모일스트렙토트리신 D는 분자량이 759이며, 분자식이 C31H59N12O10이다.
본 발명에 있어서 12-카바모일스트렙토트리신 D는 하기의 화학식 III을 갖는다.
[화학식 III]
Figure PCTKR2022012165-appb-img-000003
본 발명에 있어서 식물 병해충 방제용 조성물은 첨가제, 증량제, 영양제 또는 봉해제 등의 부가제를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 첨가제는 폴리카복실레이트, 소듐 리그노설포네이트, 칼슘 리그노설포네이트, 소듐 다이알킬 설포석시네이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르, 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 증량제는 벤토나이트 (bentonite), 탈크 (talc), 다이아라이트 (dialite), 카올린 (kaolin) 및 칼슘 카보네이트 (calcium carbonate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 영양제는 스킴 밀크 (skim milk, 배지), 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 벤토나이트 (bentonite), 덱스트린, 포도당 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태는 스트렙토트리신 E산 (Streptothricin E acid), 스트렙토트리신 D (streptothricin D) 및 12-카바모일스트렙토트리신 D (12-carbamoylstreptothricin D)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 병해충 방제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 병해충은 세균 (Bacteria), 진균 (Fungus), 난균 (Oomycetes), 해충 (Pest) 및 선충 (Nematode)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 세균은 아시도보락 아베나이 서브에스피 카틀레야 (Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 아시도보락 코냐시 (Acidovorax konjaci), 아그로박테리움 투머페시언스 (Agrobacterium tumefaciens), 버콜데리아 글루메 (Burkholderia glumae), 클라비박터 미시가넨시스 서브에스피 미시가넨시스 (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 어위니아 피리폴리에 (Erwinia pyrifoliae), 에르위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora), 펙토박테리움 카로토보룸 서브에스피 카로토보롬 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 펙토박테리움 크리산테미 (Pectobacterium chrysanthemi), 슈도모나스 시린게 패소바 라크리만스 (Pseudomonas syringae pv. lachrymans), 슈도모나스 시린게 패소바 액티니디애 (Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 랄스토니아 솔라나시아룸 (Ralstonia solanacearum), 잔토모나스 유베지카토리아 (Xanthomonas euvesicatoria), 잔토모나스 악소노포디스 패소바 사이트리 (Xanthomonas axonopodis pv. citri), 잔토모나스 아크리콜라 패소바 프루니 (Xanthomonas arboricola pv. pruni) 및 잔토모나스 오리재 패소바 오리재 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 진균은 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 콜레토크리쿰 코코데스 (Colletotrichum coccodes), 푸자리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 푸자리움 옥시스포룸 에프 에스피 쿠쿠메리눔 (Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum), 라파엘라 쿼르쿠스-몽고리케 (Raffaelea quercus-mongolicae), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani) 및 스크레로티니아 호모에오카파 (Sclerotinia homoeocarpa)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 난균은 피디움 울티뭄 (Pythium ultimum)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 해충은 조팝나무진딧물 (Aphis citricola)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태는 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 배양하여 배양액을 제조하는 배양 단계를 포함하는 병해충 방제용 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주는 수탁번호 KCTC 14658BP로 기탁된 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 병해충은 세균 (Bacteria), 진균 (Fungus), 난균 (Oomycetes), 해충 (Pest) 및 선충 (Nematode)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 세균은 아시도보락 아베나이 서브에스피 카틀레야 (Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 아시도보락 코냐시 (Acidovorax konjaci), 아그로박테리움 투머페시언스 (Agrobacterium tumefaciens), 버콜데리아 글루메 (Burkholderia glumae), 클라비박터 미시가넨시스 서브에스피 미시가넨시스 (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 어위니아 피리폴리에 (Erwinia pyrifoliae), 에르위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora), 펙토박테리움 카로토보룸 서브에스피 카로토보롬 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 펙토박테리움 크리산테미 (Pectobacterium chrysanthemi), 슈도모나스 시린게 패소바 라크리만스 (Pseudomonas syringae pv. lachrymans), 슈도모나스 시린게 패소바 액티니디애 (Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 랄스토니아 솔라나시아룸 (Ralstonia solanacearum), 잔토모나스 유베지카토리아 (Xanthomonas euvesicatoria), 잔토모나스 악소노포디스 패소바 사이트리 (Xanthomonas axonopodis pv. citri), 잔토모나스 아크리콜라 패소바 프루니 (Xanthomonas arboricola pv. pruni) 및 잔토모나스 오리재 패소바 오리재 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 진균은 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 콜레토크리쿰 코코데스 (Colletotrichum coccodes), 푸자리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 푸자리움 옥시스포룸 에프 에스피 쿠쿠메리눔 (Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum), 라파엘라 쿼르쿠스-몽고리케 (Raffaelea quercus-mongolicae), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani) 및 스크레로티니아 호모에오카파 (Sclerotinia homoeocarpa)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 난균은 피디움 울티뭄 (Pythium ultimum)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 해충은 조팝나무진딧물 (Aphis citricola)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 방법은 배양액으로부터 활성 분획을 획득하는 분획 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 활성 분획은 스트렙토트리신 E산 (Streptothricin E acid), 스트렙토트리신 D (streptothricin D) 및 12-카바모일스트렙토트리신 D (12-carbamoylstreptothricin D)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 배양 단계의 배지는 탈지유, 훼이, 카제인 등의 우유 단백질, 당류, 호모 및 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 식물 병해충 방제용 조성물의 제조방법은 배양액을 농축하는 농축 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 식물 병해충 방제용 조성물의 제조방법은 배양액을 희석하는 희석 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 식물 병해충 방제용 조성물의 제조방법은 배양액을 건조하는 건조 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 건조 단계는 동결로 건조하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 식물 병해충 방제용 조성물의 제조방법은 균체 내의 성분을 추출하는 추출 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 식물 병해충 방제용 조성물의 제조방법은 배양액으로부터 활성 분획을 획득하는 분획 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 분획 단계는 하기의 단계를 포함하는 것일 수 있다:
배양액으로부터 배양여액을 얻는 배양여액 수득 단계;
배양여액을 여과하여 여과액을 제조하는 여과 단계;
여과액을 침전시켜 침전물을 생성하는 침전 단계;
침전물을 순화 (purify)하여 활성 분획을 선별하는 분획 단계; 및
활성 분획을 정제하는 정제 단계.
본 발명에 있어서 배양여액 수득 단계는 배양액을 2000 내지 5000 rpm, 2500 내지 5000 rpm, 3000 내지 5000 rpm, 3500 내지 5000 rpm, 4000 내지 5000 rpm, 4500 내지 5000 rpm, 예를 들어, 4500 rpm으로 원심분리하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 여과 단계는 배양여액의 pH를 pH 3.0 내지 5.0, pH 3.4 내지 5.0, pH 3.6 내지 5.0, pH 3.0 내지 4.5, pH 3.4 내지 4.5, pH 3.6 내지 4.5, pH 3.0 내지 4.0, pH 3.4 내지 4.0, pH 3.6 내지 4.0, 예를 들어, pH 3.6 인으로 조정하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 침전 단계는 아세톤으로 침전 시켜 침전물을 생성하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 분획 단계는 침전물을 세파덱스 LH20 오픈 컬럼 (Sephadex LH20 open column)을 사용하여 순화 (Purify) 하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 정제 단계는 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Reverse-phase high-performance liquid chromatography; RP-HPLC)로 정제하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 분획 단계는 순수물질 동정 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 순수물질 동정 단계는 활성 분획을 건조하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 순수물질 동정 단계는 ZORBAX C18 컬럼이 정지상 역할을 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 순수물질 동정 단계는 0.01 내지 8 % 아세토나이트릴 용액이 이동상 역할을 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 아세토나이트릴 용액은 0.05 % 트리플루오로초산 (Trifluoroacetic acid)이 첨가된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태는 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 처리하는 조성물 처리 단계를 포함하는 식물 병해충 방제 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주는 수탁번호 KCTC 14658BP로 기탁된 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 조성물 처리 단계는 살포, 토양관주, 표면살포, 근권 처리, 종자 처리, 침지, 독이 및 훈연시용으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방식으로 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 “살포”는 분무, 미스팅, 아토마이징, 분말살포, 과립살포, 수명시용 및 상시용으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방식으로 수행되는 것일 수 있다.
본 명세서상 용어 “관주”는 토양이나 나무에 구멍을 파서 약액을 주입하는 약제 살포의 한 방법이다.
본 명세서상 용어 “토양 관주”는 작물 재배토양에 약액을 주입 또는 살포하는 방법이다.
상기 식물 병해충 방제용 조성물의 제조 방법 및 식물 병해충 방제 방법에 있어서, 상기 식물 병해충 방제용 조성물과 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략한다.
본 발명은 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 병해충 방제용 조성물, 이의 제조 방법, 및 식물 병해충 방제 방법에 관한 것으로서, 상기 균주의 배양액 또는 이의 추출물은 항균 활성 및 유도저항성이 월등히 우수하므로, 식물 병해충의 방제에 이용할 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 (Streptomyces sp.) JCK-6131 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석을 통해 나타낸 계통도이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주와 관련 스트렙토마이세스 균주 간에 유사도를 OAT 소프트웨어로 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 유래 항균 활성분획의 LC-ESI-MS의 총 이온 크로마토그램 (Total ion chromatogram; TIC)을 나타낸 그래프이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 유래 항균 활성분획의 양이온 모드의 ESI-MS 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 유래 항균 활성분획 중 Streptothricin E acid의 구조 동정을 나타낸 결과이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 유래 항균 활성분획의 LC-ESI-MS의 총 이온 크로마토그램을 나타낸 그래프이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 유래 항균 활성분획의 양이온 모드의 ESI-MS 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 유래 항균 활성분획 중 streptothricin D의 구조 동정을 나타낸 결과이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 유래 항균 활성분획의 LC-ESI-MS의 총 이온 크로마토그램을 나타낸 그래프이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 유래 항균 활성분획의 양이온 모드의 ESI-MS 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4c는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 유래 항균 활성분획 중 12-carbamoylstreptothricin D의 구조 동정을 나타낸 결과이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액의 사과화상병 방제효과를 나타내는 그래프이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액의 사과화상병 방제효과를 나타낸 사진이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액의 토마토 풋마름병 방제효과를 나타낸 그래프이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액의 토마토 풋마름병 방제효과를 나타낸 사진이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액의 오이덩굴쪼김병 방제효과를 나타낸 그래프이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액의 오이덩굴쪼김병 방제효과를 나타낸 사진이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 배양액 및 배양여액의 처리구의 GUS 발현 유무에 따른 PR1 유전자 발현유무의 검정 결과를 나타낸 사진이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액을 처리한 후 유도저항성 유전자인 PR1의 발현양을 비교 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액을 처리한 후 유도저항성 유전자인 PR3의 발현양을 비교 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9c는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액을 처리한 후 유도저항성 유전자인 PR5의 발현양을 비교 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9d는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액을 처리한 후 유도저항성 유전자인 PR12의 발현양을 비교 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 포함하는 분말수화제를 처리하지 않은 사과나무에서 조팝나무진딧물 (Aphis citricola)의 예방 효과를 평가한 사진이다.
도 10b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 포함하는 분말수화제를 처리한 사과나무에서 조팝나무진딧물 (Aphis citricola)의 예방 효과를 평가한 사진이다.
도 11a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액에서 Streptothricin E acid, streptothricin D, 12-carbamoylstreptothricin D의 항균 활성물질 3종이 부분 정제된 분획(partially purified extract, PPE)을 토양관주하여 토마토 풋마름병에 대한 방제효과를 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액에서 Streptothricin E acid, streptothricin D, 12-carbamoylstreptothricin D의 항균 활성물질 3종이 부분 정제된 분획(partially purified extract, PPE)을 토양관주하여 토마토 풋마름병에 대한 방제효과를 평가한 결과를 나타낸 사진이다.
항균 활성 및 유도저항성을 갖는 수탁번호 KCTC 14658BP로 기탁된 스트렙토마이세스 에스피 (Streptomyces sp.) JCK-6131 균주.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%”는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
실시예 1. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 분리
식물 병해충에 방제 활성이 있는 균주는 대전의 고추풋마름병 다발생지역에서 건전한 고추 근권 (생장하는 뿌리가 물질을 섭취하고 저장함으로써, 결과적으로 구성 생물의 비율이 달라지는 등 다양한 변화를 일으키는 토양 환경)에 존재하는 토양에서 분리하였다. 토양 100 g을 채취하여 인산 완충 생리식염수 (Phosphate Buffered Saline, pH 7.0)에 희석한 후, 트립신 소이 아가 (Tryptic Soy Agar, TSA) 플레이트에 도말하여, 30℃에서 3 내지 7 일 이상 배양하여 균주를 분리하였다.
실시예 2. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 분자생물학적 분석 및 계통도 분석
토양으로부터 분리한 균주는 16s rDNA의 염기서열 분석을 통해 분자생물학적으로 동정하였다. 분리한 균주를 효모*맥아 추출 한천배지 (Yeast extract malt extract agar; IPS2)에 도말하여, 28℃에서 7 일간 180 rpm으로 진탕배양 (Shaking culture)을 하였다. 그리고 아이-제노믹 비와이에프 디엔에이 추출 미니 키트 (I-genomic BYF DNA Extraction Mini kit, 인트론바이오테크놀로지사(iNtRON), 대한민국)를 이용하여 프로토콜에 따라서 균주의 게놈 DNA (gDNA)를 추출하였다. 구체적으로, 균주의 추출된 gDNA와 PCR-프리믹스 (Polymerase chain reaction-premix, 인트론바이오테크놀로지사, 대한민국) 그리고 균주의 16s rDNA를 증폭할 수 있는 하기 표 1의 프라이머 세트 27F/1492R을 혼합한 후 PCR을 통해 유전자를 증폭하였다.
서열
번호		 명칭 서열 (5'---> 3') bp
1 JCK-6131 16S rRNA 27F forward primer AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 20 bp
2 JCK-6131 16S rRNA 1492R reverse primer GGTTACCTTGTTACGACTT 19 bp
PCR은 95 ℃에서 5분을 시작으로 30초 동안 95 ℃, 30초 동안 55 ℃, 30초 동안 72 ℃를 30번 반복한 후, 72 ℃에서 7분, 12 ℃에서 증폭을 끝냈다.
증폭된 16s rRNA 유전자 PCR산물의 염기서열 분석을 제노텍 (대전, 대한민국)에 의뢰하여 염기서열을 얻었다.
상기 분리 균주인 JCK-6131 균주의 16s rRNA 코딩 염기서열로 총 1386 bp의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
서열
번호		 명칭 서열 (5'---> 3') bp
3 JCK-6131 16s rRNA GAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATGCCGTGAGGTGGAGCGAATCTCTAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTGTGGAGGA 1386 bp
상기 수행한 염기서열을 기초로 염기서열의 상동성 검사는 등록된 정보 (Genebank database)를 대상으로 블라스트 프로그램(Blast program, www.ncbi.nlm.nhi.gov)에 의해 실행하였다. 그 결과 JCK-6131 균주는 스트렙토마이세스 에스피 (Streptomyces sp.) JCK-6131로 동정되었으며 부분적인 16S rRNA의 염기서열(서열번호 3)은 GenBank에 accession number MW911616번으로 등록되었다. JCK-6131 균주는 하기 표 3과 같이 스트렙토마이세스 균주와 유전적 유사성을 나타내었다 (도 1a 및 1b).
염기서열 분석을 수행한 JCK-6141 균주의 유전자 NCBI BlastN 분석을 통한 동정결과 accession number 유사성 (%)
16S rRNA Streptomyces coelicolor NRRL B-2812 NR115770 97.77
Streptomyces griseoviridis NBRC12874 NR112313 97.84
Streptomyces albidoflavus DH3 MG597555 97.99
Streptomyces violascens EGI125 MN704434 97.99
Streptomyces koyangensis VK-A60 CP031742 98.13
Streptomyces rutgersensis NBRC12819 NR112395 97.92
따라서, JCK-6131 균주는 스트렙토마이세스 에스피 (Streptomyces sp.)로 동정되었으며, 상기 균주를 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131로 명명하였고, 2021년 08월 18일자로 대한민국 KCTC (Korean Collection for Type Cultures)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 14658BP를 부여 받았다.
실시예 3. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 생리학적 및 생화학적 특성
3-1. 균총 색깔 및 색소 생성유무 평가
스트렙토마이세스속의 세균은 생성된 색소에 의해 종(species) 특이성을 결정되기도 하며, 이 색소의 생합성과정이 항생제 생합성과 상관관계가 있다고 알려져 있다. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 균총 색깔과 색소 생성 유무를 확인하기 위하여 ISP1 (1 L 당 yeast extract 3 g, tryptone 5 g, agar 18 g, pH 7.0-7.2), ISP2 (1 L 당 yeast extract 4 g, malt extract 10 g, dextrose 4 g, agar 18 g, pH 7.3), ISP3 (1 L 당 oatmeal 20 g, agar 18 g, pH 7.2), ISP4 (1 L 당 soluble starch 10 g, K2HPO4 1 g, MgSO4 .7H2O 1 g, NaCl 1 g, (NH4)2SO4 2 g, CaCO3 2 g, trace salt solution 1 mL, agar 18 g, pH 7.0-7.4), ISP5 (1 L 당 peptic digest of animal tissue 15 g, proteose peptone 5 g, yeast extract 1 g, C12H22FeN3O14 0.5 g, K2HPO4 1 g, Na2S2O3, agar 18 g, pH 7.0-7.2), ISP7 (1 L 당 glycerol 15 g, L-tyrosine 0.5 g, L-asparagine 1 g, K2HPO4 0.5 g, MgSO4 .7H2O 0.5 g, NaCl 0.5 g, FeSO4 .7H2O 0.01 g, trace salt solution 1 mL, agar 18 g, pH 7.2-7.4) 배지를 사용하여 28 ℃에서 7일간 배양한 후 관찰 한 후, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
배지 ISP1 ISP2 ISP3 ISP4 ISP5 ISP7
균총 기저부의 색깔 회색 회색 흰색 흰색 흰색 회색
색소생성 짙은갈색 짙은갈색 옅은갈색 - - 검정색
상기 표 4에서 확인할 수 있듯이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주는 배지에 따라 회색에서 흰색의 균총을 생성하였으며, 짙은 갈색, 옅은 갈색 또는 검정색의 색소를 생성한 것을 관찰하였다.
3-2. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 효소활성 평가
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 단백질분해효소 (protease), 아밀라아제 (amylase), 리파아제 (lipase), 셀룰라아제 (cellulase), 키티나제 (chitinase)의 활성을 측정하였다.
단백질분해효소의 활성은 1% 스킴 밀크 (skim milk)와 1% agar 첨가된 배지에 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 접종한 후 배양하여 성장 저지환(clear zone)의 유무를 측정하였다. 아밀라아제의 활성은 2% 전분 (starch)과 1% agar 첨가된 배지에서, 리파아제는 2% 트윈 (Tween) 80, 0.01 % 메틸 레드 (Methyl red)와 1% agar가 첨가된 배지에서, 셀룰라아제는 0.2% 카르복시메틸셀룰로오스 (Carboxymethylcellulose; CMC)와 1% agar가 첨가된 배지에서, 키티나제는 K2HPO4 0.7 g/L, KH2PO4 0.3 g/L, MgSO4.5H2O 0.5 g/L, FeSO4.7H20, 0.01 g/L, ZnSO4, 0.001 g/L, MnCl2 0.001 g/L 혼합용액에 2.0 % moist colloidal chitin과 2 % agar를 첨가한 배지에서 각각 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 접종한 후 배양한 후 성장 저지환 (clear zone)의 유무를 측정하여 하기 표 5에 나타내었다.
효소활성/배지 ISP1 ISP2 ISP3 ISP4 ISP5 ISP7
단백질분해효소 +
아밀라아제 +
리파아제 +
셀룰라아제 +
키티나제 -
상기 표 5에서 확인할 수 있듯이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주는 키티나제를 제외한 단백질분해효소, 아밀라아제, 리파아제 및 셀룰라아제 활성을 보유하고 있음을 확인할 수 있었다.
3-3. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 탄소원 및 질소원 활용능력 평가
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 다양한 탄소원 및 질소원의 활용 능력을 평가하기 위해, 기본배지로 ISP4 배지(1 L 당 가용성 녹말 (soluble starch) 10 g, K2HPO4 1 g, MgSO4 .7H2O 1 g, NaCl 1 g, (NH4)2SO4 2 g, CaCO3 2 g, 미량의 염분 용액 (trace salt solution) 1 mL, agar 18 g, pH 7.0 내지 7.4)를 사용하였다.
탄소원은 가용성 녹말 10 g을 제거하고, 다양한 1 % 탄소원을 사용하였으며, 질소원은 (NH4)2SO4 2 g을 제거하고 다양한 0.1% 질소원을 최종농도로 첨가하여 활용농도를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
탄소원/배지 ISP1 ISP2 ISP3 ISP4 ISP5 ISP7
D-Fructose +
D-Galactose +
D-Mannose +
D-Xylose +
Lactose +
L-Arabinose +
Maltose +
Mannitol +
Raffinose +
Rhamnose +
Sacarose +
Starch +
Trehalose +
질소원/배지 ISP1 ISP2 ISP3 ISP4 ISP5 ISP7
Arginine +
Cysteine +
Phenylalanine +
Histidine +
L-Methionine +
Lysine +
Proline +
Serine +
Threonine +
Valine +
상기 표 6에서 확인할 수 있듯이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주는 실험에 사용한 모든 탄소원 (D-fructose, D-galactose, D-mannose, D-xylose, lactose, L-arabinose, maltose, mannitol, raffinose, rhamnose, sacarose, starch, trehalose)과 질소원 (arginine, cysteine, phenylalanine, histidine, L-methionine, lysine, proline, serine, threonine, valine)을 활용하여 생장할 수 있음을 확인하였다.
3-4. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 최적 생육온도, pH 및 염내성
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 최적 생육온도, pH 및 염내성을 분석하기 위하여 기본배지로 Bennet agar 배지(glucose 10 g/L, yeast extract 1 g/L, peptone 2 g/L, beef extract 1 g/L, agar 20 g/L)를 이용하였다.
pH 및 염내성 분석은 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 접종 후, 28 ℃에서 7일간 배양한 후 관찰하였으며, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
NaCl (%)/배지 ISP1 ISP2 ISP3 ISP4 ISP5 ISP7
0 +++
2 +++
4 ++
6 +
8 +
온도 (℃)/배지 ISP1 ISP2 ISP3 ISP4 ISP5 ISP7
15 +
20 ++
30 +++
40 ++
45 +
pH/배지 ISP1 ISP2 ISP3 ISP4 ISP5 ISP7
5 ++
7 +++
8 +++
10 ++
- : 음성, + : 양성
실시예 4. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 다양한 식물병원성 세균 및 진균의 균사 생장 저해농도 평가
4-1. 균주의 준비
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 지에스에스 (Glucose-Soybean meal-Sodium chloride; GSS) 액체배지에 접종한 다음, 28 ℃에서 3일간 180 rpm으로 진탕배양을 하였다. 배양액을 10,000 rpm로 20분간 원심분리한 다음 0.2 μm 무균필터로 여과하여 배양여액을 수확하여 0.08, 0.16, 0.33, 0.63, 1.25, 2.5, 5 및 10%의 농도로 식물병원균 진균의 균사 및 세균에 처리하였다.
4-2. 균주의 식물 병원성 세균의 생장 최소 저해 농도 평가
16종의 식물 병원성 세균인 아시도보락 아베나이 서브에스피 카틀레야 (Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 아시도보락 코냐시 (Acidovorax konjaci), 아그로박테리움 투머페시언스 (Agrobacterium tumefaciens), 버콜데리아 글루메 (Burkholderia glumae), 클라비박터 미시가넨시스 서브에스피 미시가넨시스 (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 어위니아 피리폴리에 (Erwinia pyrifoliae), 에르위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora), 펙토박테리움 카로토보룸 서브에스피 카로토보롬 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 펙토박테리움 크리산테미 (Pectobacterium chrysanthemi), 슈도모나스 시린게 패소바 라크리만스 (Pseudomonas syringae pv. lachrymans), 슈도모나스 시린게 패소바 액티니디애 (Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 랄스토니아 솔라나시아룸 (Ralstonia solanacearum), 잔토모나스 유베지카토리아 (Xanthomonas euvesicatoria), 잔토모나스 악소노포디스 패소바 사이트리 (Xanthomonas axonopodis pv. citri), 잔토모나스 아크리콜라 패소바 프루니 (Xanthomonas arboricola pv. pruni) 및 잔토모나스 오리재 패소바 오리재 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae)은 20 %(v/v) 글리세롤 용액에 현탁하여 -80 ℃에 저장되어 있던 상기 식물 병원성 세균을 TSA (Tripsin soy agar) 배지에 접종하여 30±2 ℃에서 1 내지 2일간 배양하여 접종원으로 이용하였다.
정치배양한 상기 16종의 식물 병원성 세균의 균사 생장 저해농도를 평가하기 위하여, 시험관에 5 mL의 TSB 액체 배지를 넣어 입구를 면전으로 막고 멸균한 후, 각각의 식물 병원성 세균의 콜로니를 하나씩 스트리퍼로 긁어 멸균한 TSB 액체 배지에 넣었다. 그 다음, 150 rpm으로 30±2 ℃에서 2일간 180 rpm으로 진탕배양하였다.
진탕배양한 식물 병원성 세균은 UV 스펙트로포토메타를 사용하여 OD600값을 0.1로 조절한 후, 멸균수로 희석하여 106 CFU/ml로 맞추어 96-웰 플레이트에 접종하였다. 항세균 활성 검정을 위한 병원균 접종 농도는 OD 값을 0.1로 맞춘 후 TSB 액체 배지에 1% 접종하여 농도 105 CFU/ml로 맞추어 진행하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 병원균 현탁액 180μL을 가한 다음 여기에 20μL의 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양여액을 분주하여 시료를 10 %의 농도로 처리하였다. 그 다음, 10 %의 농도로 처리한 웰에서 100μL를 취하여 다음 웰에 분주하고 100μL의 105 CFU/ml 세균 현탁액과 섞어 5%의 농도로 제조하였다. 2.5 % 내지 0.08 %도 상기 동일한 방법으로 희석하였다. 동일한 실험을 3회 반복하여 수행하였으며, 1 내지 3일 후에 결과를 관찰하였으며, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
번호 식물병원성 세균 생장 최소저해농도 (MIC)
배양여액(%) 대조구
Streptomycin sulfate (μg/mL)
1 Acidovorax avenae subsp. cattleyae 0.31 ± 0.00e 500 ± 0.00b
2 Acidovorax konjaci 0.42 ± 0.18e 7.81± 0.00e
3 Agrobacterium tumefaciens 10.00 ± 0.00a 166.67 ± 72.17c
4 Burkholderia glumae 10.00 ± 0.00a 20.84 ± 9.02e
5 Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis 10.00 ± 0.00a 20.84 ± 9.02e
6 Erwinia amylovora TS3128 2.50 ± 0.00bcd 5.21 ± 2.25e
7 Erwinia pyrifoliae 3.33 ± 1.44bc 5.21 ± 2.25e
8 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum 3.33 ± 1.44bc 15.63 ± 0.00a
9 Pectobacterium chrysanthemi 4.17 ± 1.44b 500 ± 0.00b
10 Pseudomonas syringae pv. actinidiae 3.33 ± 1.44bc 15.63 ± 0.00e
11 Pseudomonas syringae pv. lachrymans 3.33 ± 1.44bc 15.63 ± 0.00e
12 Ralstonia solanacearum 1.25 ± 0.00de 10.42 ± 4.52e
13 Xanthomonas euvesicatoria 2.50 ± 0.00bcd 20.83 ± 9.02e
14 Xanthomonas arboricola pv. pruni 2.50 ± 0.00bcd 62.5 ± 0.00d
15 Xanthomonas campestris pv. citri 3.33 ± 1.44bc 31.25 ± 0.00e
16 Xanthomonas oryzae pv. oryzae 1.25 ± 0.00de 10.42 ± 4.52e
Ducan의 다중검정에 따라 상기 표의 숫자 옆에 다른 문자를 보유한 경우, 통계적으로 유의성을 나타냄 (p<0.05)
상기 표 8에서 확인할 수 있듯이, 스트렙토마이에스 에스피 JCK-6131 균주의 배양여액은 다양한 식물 병원성 세균의 증식을 저해하는 강력한 항세균 활성을 보였으며, 100 % 생장억제농도는 식물 병원성 세균에 따라 다소 차이를 보이기는 했지만 0.31 내지 10 % 범위의 MIC값을 나타내며, 우수한 항균활성을 나타내었다. 특히, 스트렙토마이에스 에스피 JCK-6131 균주의 배양여액은 대조구로 사용된 스트렙토마이신 보다 모든 병원성 세균에서 우수한 항균 활성을 나타내었다.
4-3. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 식물 병원성 진균의 생장 최소 저해 농도 평가
7종의 식물 병원성 진균인 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 콜레토크리쿰 코코데스 (Colletotrichum coccodes), 푸자리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 푸자리움 옥시스포룸 에프 에스피 쿠쿠메리눔 (Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum), 라파엘라 쿼르쿠스-몽고리케 (Raffaelea quercus-mongolicae), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani) 및 스크레로티니아 호모에오카파 (Sclerotinia homoeocarpa)과 1종의 식물 병원성 난균인 피디움 울티뭄 (Pythium ultimum)을 PDA (Potato Dextrose agar)에 접종하여 25 ℃에서 3 내지 5일간 배양하여 활성화 시켰다. 그 다음, 상기 7종의 식물 병원성 진균 및 1종의 식물 병원성 난균을 25℃에서 7일간 정치배양하였다.
균사체를 500 μg/mL (w/v) 농도로 조정한 뒤 블렌더 (DAIHAN, HG-15D)를 이용하여 마쇄하여 준비하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 균사 현탁액 180 μL을 가한 다음 여기에 20 μL의 시료를 분주하여 스트렙토마이에스 에스피 JCK-6131 균주의 배양여액을 10 %의 농도로 처리하였다. 그 다음, 10 %의 농도로 처리한 웰에서 100 μL를 취하여 다음 웰에 분주하고 100 μL의 마쇄된 균사를 섞어 5 %의 농도로 제조하였다. 2.5 % 내지 0.08 %도 상기 동일한 방법으로 희석하였다. 동일한 실험을 3회 반복하여 수행하였으며, 1 내지 3일 후에 결과를 관찰하였으며, 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
번호 식물병원성 진균 및 난균 배양여액 (%)
1 Botrytis cinerea 0.42 ± 0.18d
2 Colletotrichum coccodes 1.67 ± 0.72a
3 Fusarium graminearum 0.63 ± 0.00cd
4 Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum 1.25 ± 0.00ab
5 Raffaelea quercus-mongolicae 1.04 ± 0.63bc
6 Rhizoctonia solani 0.63 ± 0.00cd
7 Sclerotinia homoeocarpa 1.25 ± 0.00ab
8 Pythium ultimum 1.04 ± 0.36bc
Ducan의 다중검정에 따라 상기 표의 숫자 옆에 다른 문자를 보유한 경우, 통계적으로 유의성을 나타냄 (p<0.05)
상기 표 9에서 확인할 수 있듯이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 배양여액은 다양한 식물 병원성 진균의 균사생장을 저해하는 강력한 항균 활성을 보였으며, 100 % 균사생장억제농도는 식물 병원성 진균에 따라 다소 차이를 보이기는 했지만, 0.42 내지 1.67 % 범위의 MIC 값의 우수한 항진균 활성을 보였다.
또한, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 배양여액은 난균인 피디움 울티뭄 (Pythium ultimum)에도 우수한 항균활성이 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 항균 활성물질의 분리 및 구조 동정
5-1. 항균활성 물질의 분리
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주가 생산하는 항균 활성물질을 분리하기 위해, 상기 균주를 지에스에스 (Glucose-Soybean meal-Sodium chloride; GSS) 액체배지에 접종한 다음, 28 ℃에서 7일간 180 rpm으로 진탕배양 하였다. 배양 후, 배양액 (총 1L)를 4500 rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 배양 상층액을 얻었다. 상기 배양 상층액을 pH=3.6으로 조정한 후, Amberlite XAD-16N resin (50 g)을 첨가하여 8시간 이상 방치 후 여과지로 여과하였다. 그 다음, 여과액을 차가운 아세톤으로 침전시킨 후, 10,000 rpm으로 원심분리를 하여 침전을 얻었다.
그 다음, 침전을 PBS (50 mM, pH 7.0)로 용해하였다. 용해된 침전물은 세파덱스 LH200 오픈 컬럼 (Sephadex LH20 open column)으로 순화되었으며, 분리된 분획 중 항균활성을 갖는 분획을 선발하였고, 선발된 항균 활성분획을 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Reverse phase high-performance liquid chromatography; RP-HPLC)로 정제하였다.
5-2. 항균활성 물질의 질량분석
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주로부터 정제한 항균 활성물질은 ZORBAX C18 column (4.6 × 250 mm)을 장착한 양이온 모드의 액체 크로마토그래피-전자분무이온화-질량분석법 (LC-ESI-MS, Shimadzu 6AD HPLC; API2000)을 통해 질량분석을 실시하였다. 용출용매는 증류수와 0.05 % 트리플루오르초산 (TFA)이 첨가된 아세토나이트릴을 이용하였으며, 0 %부터 8 %의 0.05% 트리플루오르초산(TFA)이 첨가된 아세토나이트릴을 유속 1 ml/min으로 용출하고, 그 결과를 도 2a 내지 4c에 나타내었다.
도 2a 내지 4c에서 확인할 수 있듯이, 기존 문헌의 분자량 및 질량 스펙트럼을 비교하여 활성물질을 스트렙토트리신 E산 (Streptothricin E acid), 스트렙토트리신 D (streptothricin D) 및 12-카바모일스트렙토트리신 D (12-carbamoylstreptothricin D)으로 동정하였다.
실시예 6. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 사과 화상병에 대한 인 비보 ( in vivo ) 방제효과 평가
6-1. 식물체 준비
3년생의 사과 유묘 품종인 '홍로'의 새로 나온 가지의 첨단에 달린 어린잎을 떼어내어 1분간 1 % 소독액 (Bleach 용액)에서 표면 살균을 한 후, 증류수로 3번 세척하였다. 그 다음, 크린벤치에서 바람에 건조하여 사과 화상병에 대한 인 비보 (in vivo) 방제효과 평가에 사용될 식물체를 준비하였다.
6-2. 시료 처리 및 접종
준비된 식물체에 핀셋으로 상처를 낸 후, 상처부위에 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액을 멸균수로 5배 (FB_5 Fold), 10배 (FB_10 Fold) 및 20배 (FB_20 Fold) 희석한 후 각각 10 μL씩 처리하였다. 그 다음, 107 CFU/ml농도로 준비된 사과화상병 병원균 (Erwinia amylovora, 10 μL)을 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액이 선처리된 위치에 접종하였다. 대조약제로는 부라마이신수화제 (streptomycin sulfate 20% WP; 팜한농; Bu)를 1000배 희석하여 사용하였다. 각각의 처리구는 병원균 접종 후 습도 75 %, 30 ℃에서 발병도를 조사하였다. 각 처리당 3반복이며, 각 반복은 3개의 포트로 구성되며, 동일한 실험을 3회 반복하여 효능을 평가하였다. 병의 발병지수는 하기와 같이 4가지로 나누어 검사하였다.
지수 0 = 병징 없음,
지수 1 = 상처주변 괴사
지수 2 = 상처에서 먼 거리도 괴사
지수 3 = 전체식물 괴사
병 방제가는 하기 기술된 계산식 1을 사용하여 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 10 및 도 5a, 5b에 나타내었다.
[계산식]
방제가 (%) = (무처리구 발병도-처리구 발병도)/ 무처리구 발병도 × 100 %
FB_5 Fold FB_10 Fold FB_20 Fold Bu
평균 77.78 51.85 40.74 70.37
표준편차 6.41 6.41 6.41 11.11
상기 표 10 및 도 5a, 5b에서 확인할 수 있듯이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액은 농도 의존적으로 사과화상병을 방제하였다. 특히, 균주 배양액을 5 배 희석하여 처리하였을 때, 대조약제인 부라마이신수화제과 유사한 방제 활성인 77.78 %의 사과 화상병 방제효과를 나타내었다.
이를 통해, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액은 인 비트로 (in vitro) 병원성 세균 생육저하효과와 마찬가지로 인 비보 (in vivo)에서도 사과 화상병 병원균 (Erwinia amylovora)에 의해 발병되는 병의 방제에 우수한 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 7. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 토마토 풋마름병에 대한 방제효과 및 유도저항성 평가
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 토마토 풋마름병에 대한 방제효과를 평가하였다. 식물체로는 서광 품종의 토마토를 원예용 상토에서 4엽까지 키운 후 사용하였다.
방제 효능을 평가하기 위해, 준비된 식물체에 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액을 멸균수로 5배 (FB_5 Fold), 10배 (FB_10 Fold), 20배(FB_20 Fold) 및 100배 (FB_100 Fold) 희석한 후, 각각 20 mL씩 토양 관주 처리한 다음, 1일 후에 토마토 풋마름병의 원인균 (Ralstonia solanacearum)을 108 cfu/mL 농도로 20 mL을 토양 관주로 접종하였다. 이때, 대조약제로는 부라마이신수화제(streptomycin sulfate 20% WP; 팜한농)를 1000배 희석하여 접종 1일 전에 처리하였다.
또한, 유도 저항성을 평가하기 위해, 준비된 식물체에 병원균 접종 3일 전에 100배 희석한 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액 (FB_100 Fold)을 엽면살포(F)하여 토양관주(S)로 접종한 방제 효능 평가 실험의 결과와 비교하였다. 이때, 대조 약제로는 부라마이신수화제(streptomycin sulfate 20% WP; 팜한농; Bu)를 1000 배 희석하여 사용하였다.
각 처리당 3회씩 반복하였으며, 매회 반복 시 3개의 포트로 구성하였다. 동일한 실험을 3회 반복하여 효능을 평가하였으며, 각각의 처리구는 토양 관주에 의한 병원균 접종 후 습도 75 %, 온도 30 ℃에서 10일 후의 발병도를 평가하였다. 병의 발병지수는 하기와 같이 4가지로 나누어 검사하였다.
지수 0 = 병징 없음
지수 1 = 잎 하나 시들음
지수 2 = 잎 2 내지 3장 시들음
지수 3 = 잎 4장 이상 시들음
지수 4 = 식물고사
병 방제가는 계산식 1을 사용하여 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 11, 12 및 도 6a, 6b에 나타내었다.
FB_5 Fold FB_10 Fold FB_20 Fold FB_100 Fold Bu
평균 86.11 66.67 47.22 52.78 72.26
표준편차 4.82 8.34 4.81 4.81 4.75
FB_100 Fold, F FB_100 Fold, S
평균 52.78 55.55
표준편차 9.62 4.81
상기 표 11 및 도 6a에서 확인할 수 있듯이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액은 토마토 풋마름병을 효과적으로 방제하였으며, 특히, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액을 5 배 및 10 배로 희석하여 처리하였을 때, 대조약제인 부라마이신수화제와 유사거나 더 우수한 방제 활성을 나타내었다.
또한, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액을 병원균 접종 3일 전에 100 배 희석하여 엽면살포하여 유도저항성을 평가한 결과, 엽면살포한 경우 (FB_100 Fold, F (Foliar spray))는 52.78%의 방제가를, 토양 관주로 방제한 경우 (FB_100 Fold, S (soil drenching)는 55.55 %의 방제가를 나타내었다 (도 6b).
이를 통해, 토마토 풋마름병 방제에 있어서, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액은 토양 관주나 엽면살포 시 모두 우수한 방제활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 8. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 오이덩굴쪼김병 방제효과 평가
8-1. 식물체 준비
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 오이덩굴쪼김병에 대한 인 비보 (in vivo)에서의 방제 효과를 평가하였다. 8 x 16 연결포트 (15 mL/pot, 범농상, 대한민국)에 원예용상토 5호 (부농상토사, 대한민국)를 넣고 포트당 감수성 품종의 오이 종인 아시아청장 (아시아종묘, 대한민국)을 1립씩 파종하여 온실에서 7일간 재배하여 방제효과 평가에 사용될 식물체를 준비하였다.
8-2. 시료 처리
오이덩굴쪼갬병의 원인균인 푸자리움 옥시스포름 에프 에스피 쿠쿠머리눔 (Fusarium oxyspoirum f.sp. cucumerinum, 이하, Foc)을 PDA 배지에 접종하고, 25 ℃에서 7일간 배양한 균총으로부터 균사 조각을 떼어내어 브이8-주스 브로스 (V8 broth, V-8 주스 200 mL, CaCO3 3g, 증류수 1L)배지에 접종하고, 7일 동안 25 ℃의 암상태로 150 rpm에서 진탕배양 하였다. 진탕배양 후, 병원균 배양액을 수확하여 4겹의 거즈로 걸러 균사를 제거하고 원심 분리하여 (5,000 rpm, 10분, 4 ℃) 배양여액을 제거하였으며, 포자 침전물에 멸균수를 넣고 잘 현탁한 후에 혈구 계산기 (Hemacytometer)를 이용하여 광학현미경하에서 포자 (소형분생포자)의 농도를 1.0 x 106 conidia/mL이 되도록 멸균수로 희석하여 Foc 포자현택액을 접종원으로 사용하였다.
8-3. 인 비보 ( in vivo ) 생물검정
최아 (pregerminated seed)된 오이 종자를 포트당 1 개씩 이식한 후 25 ℃에서 7일 동안 오이유묘로 키웠다. 그 다음, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액를 5배 (FB_5 Fold), 10배 (FB_10 Fold), 20배 (FB_20 Fold) 및 100배 (FB_100 Fold) 희석 배양하여 각각 20 mL씩 발아 7일된 오이유묘에 토양 관주로 처리하였다. 그 다음, 시료처리 1일 후, Foc 균주의 포자 현탁액 20 mL을 토양관주로 접종하였다.
무처리구는 트윈20 (Tween 20)이 250 ug/mL 수준으로 첨가된 용액을 처리하였으며, 대조약제로는 잘록엔 (Janrokend; Ja) 분산성액제 (활성성분 하이멕사졸 30%, 펜티오피라드 5%, 한국삼공, 대한민국)을 1000 배 희석하여 처리하였다. 모든 처리구는 포트 당 20 mL씩 토양 관주 처리하였다.
접종한 오이유묘는 25 ℃ 습실상에서 24시간 동안 암배양한 후에, 25 ℃ 항온실로 옮기고 하루에 12시간 동안 광을 조사하면서 4주 동안 재배하고, 오이덩굴쪼김병 발생을 조사하였다. 각 처리당 3회씩 반복하였으며, 각 반복은 3개의 포트로 구성되며, 동일한 실험을 3회 반복하여 효능을 평가하였다. 또한, 발병도는 다음과 같은 지수로 환산하였다.
지수 0 = 병징 없음
지수 1 = 25 % 이하 잎이 황변하거나 괴사
지수 2 = 전체잎의 26 내지 50 % 황변하거나 괴사
지수 3 = 전체잎의 51 내지 75 % 황변하거나 괴사
지수 4 = 전체잎의 76 내지 100 % 황변하거나 괴사
그리고 병 방제가는 계산식 1을 사용하여 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 13 및 7a, 7b에 나타내었다.
FB_5 Fold FB_10 Fold FB_20 Fold FB_100 Fold Ja
평균 83.33 58.41 41.66 55.56 91.66
표준편차 4.81 9.75 4.81 4.81 4.81
상기 표 13 및 도 7a, 7b에서 확인할 수 있듯이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액은 5 배, 10 배, 20 배 및 100 배 희석액 처리구에서 Foc 균주가 야기하는 오일덩굴쪼김병의 발생을 감소시켰으며, 특히, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 시료의 5 배 희석액 처리구는 약 83.33 %의 방제가를 보여, 대조약제인 잔록엔과 유사한 방제활성을 나타내었다.
이를 통해, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 배양액은 오이덩굴쪼김병의 원인균인 Foc 균주에 대해 우수한 항진균 활성을 갖는다는 것을 인 비보 (in vivo)로 확인할 수 있었다.
실시예 9. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액의 저항성유도 활성 평가
식물의 저항성은 살리실산 신호 전달계를 통하여 유도되고, 그 결과로 PR1 단백질이 발현된다. PR1 유전자의 발현은 식물에서 저항성의 유도여부를 검정하는 마커유전자로 사용되고 있다. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액의 저항성유도 활성을 PR1 유전자 발현시스템으로 검정하였다.
PR1 프로모터 (Promoter)에 GUS가 표지 된 vector가 형질 전환된 애기장대를 이용하여, GUS의 발현유무에 따른 PR1 유전자 발현유무를 확인하고, 유도활성을 검정하여, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에서 확인할 수 있듯이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 배양액 (FB) 및 배양여액 (FF)의 처리구는 양성대조구인 살리실산 (SA) 처리구와 동일하게 GUS가 발현되어, PR1 유전자가 발현되었음을 확인하였다.
이를 통해, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주가 식물의 살리실산과 유사한 기작으로 저항성을 유도하여 병원성 세균이나 진균을 방제할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 10. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 유도저항성에 의한 토마토 풋마름병 방제 기작
토마토 풋마름병을 앓고 있는 토마토 잎에 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 처리한 후, 토마토 풋마름병 방제 유도저항성 관련 유전자의 발현도를 평가하였다.
10-1. 식물체 준비
토마토 풋마름병의 원인균인 랄스토니아 솔라나세아룸 (Ralstonia solanacearum)에 대한 방제효과를 조사하기 위해 서광 토마토 씨앗 (팜한농, 서울, 대한민국)을 부농(경주, 대한민국)에서 제조한 상업용 원예 상토로 채워진 소주컵 (직경 36 mm)에 파종하였다. 10일 후 자란 새싹 들 중에서 상대적으로 더 잘 자란 토마토 새싹을 남겨두었다. 26일 후, 4엽기의 토마토 모종을 음료수 컵 (직경 7 cm)으로 이식하였다.
10-2. 유도저항성 유전자 발현 확인을 위한 시료 준비
4엽기의 토마토 모종에 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 배양액 100배 희석하여 20 mL씩 토양 관주로 처리한 후, 토마토 풋마름병의 원인균인 랄스토니아 솔라나세아룸을 108 cfu/mL 농도로 20 mL 토양 관주로 접종하였다.
유도저항성을 확인을 위해, 랄스토니아 솔라나세아룸을 접종하기 3일 전에 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 배양액을 엽면살포 하였으며, 유도 저항성 유전자 발현의 확인을 위한 시료로 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 배양액 처리 후 1일 (1dpt), 2일 (2dpt) 및 3일 (3dpt)과 랄스토니아 솔라나세아룸 접종 후 1일 (1dpi), 2일 (2dpi) 및 3일 (3dpi)에 각각 토마토 잎을 수확하였다.
10-3. 유도저항성 유전자의 발현 확인
각각의 수확한 토마토 잎을 RNA로 추출한 후 cDNA를 합성하였고, qRT-PCR을 통해서 특이적으로 증가되는 유도저항성 유전자의 발현을 확인하였다. qRT-PCR에 사용한 유도저항성 관련 유전자는 하기 표 14와 같다.
서열
번호		 명칭 서열 (5'---> 3') bp
4 PR1 Forward GCCAAGCTATAACTACGCTACCAAC 25
5 PR1 Reverse GCAAGAAATGAACCACCATCC 21
6 PR3 Forward ATGGCGGAAACTGTCCTAGTGGAA 24
7 PR3 Reverse ACATGGTCTACCATCAGCTTGCCA 24
8 PR5 Forward GAGGTTCATGCCAAACTGGTC 21
9 PR5 Reverse CCGTCAACCAAAGAAATGTCC 21
10 PR12 Forward TCACCAAACTATTGGATTTCAA 22
11 PR12 Reverse GACTCAATTTTTGACTTCTTAATCC 25
12 UBI Forward GGACGGACGTACTCTAGCTGAT 22
13 UBI Reverse AGCTTTCGACCTCAAGGGTA 20
구체적으로, IQeasy plus Plant RNA Extraction Mini Kit (iNtRON, Korea)를 이용하여 식물체의 잎 조직으로부터 총 RNA를 추출하였다. 분광 광도계 (NanoDrop ND-1000 spectrophotometer, 미국)를 사용하여 RNA 농도와 순도를 측정하였다. 정량화한 총 RNA 1 ug으로부터 SuperScript Ⅳ First-strand Synthesis System (invitrogen, 미국)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA는 iQ TM SYBR Green Supermix (Bio-Rad, USA) 및 유도저항성 관련 서열번호 4 내지 13의 프라이머와 함께 CFX96 Real-Time PCR detection system (Bio-Rad, USA)을 이용하여 증폭시켰다.
qRT-PCR은 95 ℃에서 3분을 시작으로, 15초 동안 95 ℃, 60초 동안 57 ℃를 40번 반복하였다. 그 다음, 증폭된 생성물의 특이성 확인을 위해, 멜팅 곡선 단계를 수행하였다. qRT-PCR은 동일한 조건으로 3회 반복하여 수행하였다.
각 유전자의 상대적 발현양은 상대 정량법인 ΔΔCt 방법으로 계산하였으며, 타겟 유전자 발현의 정확한 측정을 위해 세포유지 유전자 (Housekeeping gene, ubiquitin (UBI))를 정규화에 이용하였다. 상기 실험은 3회 반복하여 수행하였고, 최종적으로 분석된 실리실산 신호전달계와 자스모닉산 신호전달계에 관련된 PR1, PR3, PR5, PR12 유전자의 발현 양상을 하기 표 15 및 도 9a 내지 9d에 나타내었다.
PR1 0 1 dpt 2 dpt 3 dpt 1 dpi 2 dpi 3 dpi
FB_100 fold 평균 0.412 1.148 0.906 0.530 1.420 5.596 1.859
표준편차 0.135 0.536 0.075 0.066 0.161 1.495 0.170
무처리구 평균 0.406 0.383 0.479 0.445 0.552 1.107 1.489
표준편차 0.087 0.091 0.016 0.044 0.031 0.136 0.192
PR3 0 1 dpt 2 dpt 3 dpt 1 dpi 2 dpi 3 dpi
FB_100 fold 평균 0.480 0.950 0.720 0.343 2.132 0.526 0.458
표준편차 0.260 0.292 0.135 0.081 0.166 0.040 0.085
무처리구 평균 0.482 0.505 0.494 0.486 1.119 0.611 0.617
표준편차 0.145 0.079 0.081 0.104 0.257 0.129 0.056
PR5 0 1 dpt 2 dpt 3 dpt 1 dpi 2 dpi 3 dpi
FB_100 fold 평균 0.412 1.125 0.691 0.338 0.846 6.946 1.812
표준편차 0.135 0.262 0.336 0.045 0.560 1.402 0.352
무처리구 평균 0.406 0.401 0.462 0.266 0.444 0.767 1.537
표준편차 0.087 0.174 0.192 0.045 0.064 0.282 0.134
PR12 0 1 dpt 2 dpt 3 dpt 1 dpi 2 dpi 3 dpi
FB_100 fold 평균 0.487 0.632 0.421 0.320 2.940 0.399 1.053
표준편차 0.286 0.212 0.092 0.073 0.655 0.364 0.563
무처리구 평균 0.462 0.467 0.447 0.320 0.552 1.202 0.592
표준편차 0.241 0.131 0.192 0.229 0.031 0.297 0.449
상기 표 15 및 도 9a 내지 9d에서 확인할 수 있듯이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액 처리 1일 (1dpt) 후 PR1, PR3, PR5, PR12 유전자의 발현량이 증가하였으며, 특히, PR1 및 PR5 유전자 발현량은 무처리구 대비 각각 약 2.99 배 및 약 2.80 배 상승하였으며, PR3 및 PR12 유전자 발현량은 무처리구 대비 각각 약 1.88 배 및 약 1.35 배 증가하였다.
또한, 토마토 풋마름병 병원균 접종 1일 (1dpi) 후 PR3와 PR12 유전자의 발현양은 무처리구 대비 각각 약 1.9배 및 약 5.3배 상승하였으며, 토마토 풋마름병 병원균 접종 2일 (2dpi) 후 PR1 및 PR5 유전자의 발현량은 무처리구 대비 각각 약 5.05 배 및 약 5.32배 상승하였다.
이를 통해, 식물의 저항성 유도에 관여하는 살리실산 신호전달계에 관련된 PR1 및 PR5 유전자와, 자스모닉산 신호전달계와 관련된 PR3 및 PR12 유전자 모두 토마토 풋마름병의 방제활성 증가에 우수한 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 11. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 포함하는 분말수화제의 조팝나무진딧물 방제효과 평가
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 포함하는 분말수화제를 제조하여, 사과에 주요한 피해를 입히는 해충인 조팝나무진딧물 (Aphis citricola)에 대한 방제효과를 평가하였다.
11-1. 분말수화제의 제조
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 지에스에스 (Glucose-Soybean meal-Sodium chloride; GSS) 배지에 접종한 다음, 28 ℃에서 7일간 180 rpm으로 진탕배양 하였다. 그 다음, 균주 배양액 100 mL을 동결 건조하여 약 6 g의 동결건조물을 제조하였다. 동결건조물 2 g에 화이트 카본 (White carbon) 0.5 g, 소듐 도데실설페이트 (Sodium dodecylsufate; CR-SDS) 습윤제 0.5 g, 소듐 폴리 (나프탈렌 포름알데히드) 설포네이트 (Sodium poly (naphthalene formaldehyde) sulfonate; CR-100) 분산제 0.5 g 및 카올린 (Kaoline 증량제) 5.5 g을 혼합하여 총 10 g의 분말수화제를 제조하였다. 그 다음, 블렌더 (Blender)로 아주 미세하게 마쇄한 후, 상온에서 보관하면서 실험에 사용하였다.
11-2. 분말수화제의 조팝나무진딧물 방제효과
제조한 분말수화제를 물로 500배 희석한 후, 3년생의 사과 유묘 품종인 '홍로'에 조팝나무진딧물이 발생하는 초기인 6월 16일과 6월 23일 7일 간격으로 2회 약제를 엽면분무처리 한 후, 그 결과를 도 10a 및 10b에 나타내었다.
도 10a에서 확인할 수 있듯이, 무처리구의 사과 유묘 잎 및 줄기에는 조팝나무진딧물이 윤안으로 관찰하기 매우 쉬울 정도로 다량 발생하였다. 반면, 도 10b에서 확인할 수 있듯이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 포함하는 분말수화제를 처리한 사화 유묘의 잎 및 줄기에는 조팝나무진딧물이 전혀 관찰되지 않았다.
이를 통해, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 포함하는 분말수화제는 조팝나무진딧물의 방제에 우수한 효과를 나타내고 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 12. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 유래 항세균 활성 분획의 토마토 풋마름병 방제효과 평가
12-1. 항세균 활성 분획물 및 식물체 준비
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 지에스에스(Glucose-Soybean meal-Sodium chloride; GSS) 액체배지에 접종한 다음, 28 ℃에서 3일간 180 rpm으로 진탕배양을 하였다. 상기 배양액 1 L를 4500 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 배양 상층액을 수득하였다. 상기 배양 상층액을 pH=3.6으로 조정한 후, Amberlite XAD-16N resin (50 g)을 첨가하여 8시간 이상 방치 후 여과지로 여과하였다. 그 다음, 여과액을 차가운 아세톤으로 침전시킨 후, 5,000 rpm에서 15분 원심분리하여 침전물을 수득하였다. 그 다음, 침전물을 PBS (50 mM, pH 7.0)로 용해하였다. 용해된 침전물은 세파덱스 LH20 오픈 컬럼 (Sephadex LH20 open column)으로 순화되었으며, 분리된 분획을 선택하였으며, 도 11a 내지 11c에 나타낸 항균활성을 갖는 3종의 물질인 Streptothricin E acid, streptothricin D, 12-carbamoylstreptothricin D이 부분 정제된 분획 (partially purified extract, PPE)으로 사용하였다.
식물체로는 서광 품종의 토마토를 원예용 상토에서 4엽까지 키운 후 사용하였다.
12-2. 항세균 활성 분획물의 방제효과 평가
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 (1000 μg/mL, 100 μg/mL, 10 μg/mL 농도)의 부분 정제된 분획 (PPE) 20 mL을 각각 준비한 식물체에 토양 관주로 처리하였다. 대조약제로는 부라마이신수화제 (Streptomycin sulfate 20 % WP, 팜한농; Bu)를 1000배 희석하여 사용하였다. 각 처리당 3회 반복하였으며, 각 반복은 3개의 포트로 구성되며, 동일한 실험을 3회 반복하여 효과를 평가하였다.
각각의 처리구는 토마토 풋마름병 병원균의 원인균 (Ralstonia solanacearum)을 접종 후 습도 75 %, 30 ℃에서 10일 후 발병도를 평가하였다. 병발병 지수는 하기와 같이 4로 나누어 검사하였다.
지수 0 = 병징 없음
지수 1 = 잎 하나 시들음
지수 2 = 잎 2 내지 3장 시들음
지수 3 = 잎 4장 이상 시들음
지수 4 = 식물고사
그리고 병 방제가는 계산식 1을 사용하여 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 16 및 도 11a, 11b에 나타내었다.
PPE_1000 μg/mL PPE_100 μg/mL PPE_10 μg/mL Bu
평균 88.89 63.89 288.33 72.26
표준편차 4.82 12.73 412.81 4.75
표 16 및 도 11a, 11b에서 확인할 수 있듯이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 (1000 μg/mL, 100 μg/mL, 10 μg/mL 농도)의 부분 정제된 분획은 토마토 풋마름병을 농도의존적으로 방제하였다. 특히, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 (1000 μg/mL)의 부분 정제된 분획을 처리하였을 때 약 88.89 %의 방제가를 나타내었으며, 이는 대조구로 사용한 부라마이신의 약 72.22 %의 방제가보다 약 16.67 % 더 우수한 방제효과를 나타내었다.
[수탁번호]
기탁기관명: 한국생명공학연구원
수탁번호: KCTC 14658BP
수탁일자: 20210818
본 발명은 스트렙토마이세스 에스피 (Streptomyces sp.) JCK-6131 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 병해충 방제용 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 식물 병해충 방제 방법에 관한 것이다.
[기탁증]
Figure WO-DOC-FIGURE-1

Claims (24)

  1. 항균 활성 및 유도저항성을 갖는 수탁번호 KCTC 14658BP로 기탁된 스트렙토마이세스 에스피 (Streptomyces sp.) JCK-6131 균주.
  2. 수탁번호 KCTC 14658BP로 기탁된 스트렙토마이세스 에스피 (Streptomyces sp.) JCK-6131 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 병해충 방제용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 병해충은 세균 (Bacteria), 진균 (Fungus), 난균 (Oomycetes), 해충 (Pest) 및 선충 (Nematode)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 식물 병해충 방제용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 세균은 아시도보락 아베나이 서브에스피 카틀레야 (Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 아시도보락 코냐시 (Acidovorax konjaci), 아그로박테리움 투머페시언스 (Agrobacterium tumefaciens), 버콜데리아 글루메 (Burkholderia glumae), 클라비박터 미시가넨시스 서브에스피 미시가넨시스 (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 어위니아 피리폴리에 (Erwinia pyrifoliae), 에르위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora), 펙토박테리움 카로토보룸 서브에스피 카로토보롬 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 펙토박테리움 크리산테미 (Pectobacterium chrysanthemi), 슈도모나스 시린게 패소바 라크리만스 (Pseudomonas syringae pv. lachrymans), 슈도모나스 시린게 패소바 액티니디애 (Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 랄스토니아 솔라나시아룸 (Ralstonia solanacearum), 잔토모나스 유베지카토리아 (Xanthomonas euvesicatoria), 잔토모나스 악소노포디스 패소바 사이트리 (Xanthomonas axonopodis pv. citri), 잔토모나스 아크리콜라 패소바 프루니 (Xanthomonas arboricola pv. pruni) 및 잔토모나스 오리재 패소바 오리재 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 식물 병해충 방제용 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 진균은 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 콜레토크리쿰 코코데스 (Colletotrichum coccodes), 푸자리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 푸자리움 옥시스포룸 에프 에스피 쿠쿠메리눔 (Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum), 라파엘라 쿼르쿠스-몽고리케 (Raffaelea quercus-mongolicae), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani) 및 스크레로티니아 호모에오카파 (Sclerotinia homoeocarpa)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 식물 병해충 방제용 조성물.
  6. 제3항에 있어서, 상기 난균은 피디움 울티뭄 (Pythium ultimum)을 포함하는 것인, 식물 병해충 방제용 조성물.
  7. 제3항에 있어서, 상기 해충은 조팝나무진딧물 (Aphis citricola)을 포함하는 것인, 식물 병해충 방제용 조성물.
  8. 제2항에 있어서, 상기 병해충 방제용 조성물은 스트렙토트리신 E산 (Streptothricin E acid), 스트렙토트리신 D (streptothricin D) 및 12-카바모일스트렙토트리신 D (12-carbamoylstreptothricin D)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 식물 병해충 방제용 조성물.
  9. 스트렙토트리신 E산 (Streptothricin E acid), 스트렙토트리신 D (streptothricin D) 및 12-카바모일스트렙토트리신 D (12-carbamoylstreptothricin D)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 식물 병해충 방제용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 병해충은 세균 (Bacteria), 진균 (Fungus), 난균 (Oomycetes), 및 해충 (Pest)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 식물 병해충 방제용 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 세균은 상기 세균은 아시도보락 아베나이 서브에스피 카틀레야 (Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 아시도보락 코냐시 (Acidovorax konjaci), 아그로박테리움 투머페시언스 (Agrobacterium tumefaciens), 버콜데리아 글루메 (Burkholderia glumae), 클라비박터 미시가넨시스 서브에스피 미시가넨시스 (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 어위니아 피리폴리에 (Erwinia pyrifoliae), 에르위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora), 펙토박테리움 카로토보룸 서브에스피 카로토보롬 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 펙토박테리움 크리산테미 (Pectobacterium chrysanthemi), 슈도모나스 시린게 패소바 라크리만스 (Pseudomonas syringae pv. lachrymans), 슈도모나스 시린게 패소바 액티니디애 (Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 랄스토니아 솔라나시아룸 (Ralstonia solanacearum), 잔토모나스 유베지카토리아 (Xanthomonas euvesicatoria), 잔토모나스 악소노포디스 패소바 사이트리 (Xanthomonas axonopodis pv. citri), 잔토모나스 아크리콜라 패소바 프루니 (Xanthomonas arboricola pv. pruni) 및 잔토모나스 오리재 패소바 오리재 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 식물 병해충 방제용 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 상기 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 콜레토크리쿰 코코데스 (Colletotrichum coccodes), 푸자리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 푸자리움 옥시스포룸 에프 에스피 쿠쿠메리눔 (Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum), 라파엘라 쿼르쿠스-몽고리케 (Raffaelea quercus-mongolicae), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani) 및 스크레로티니아 호모에오카파 (Sclerotinia homoeocarpa)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 식물 병해충 방제용 조성물.
  13. 제10항에 있어서, 상기 난균은 피디움 울티뭄 (Pythium ultimum)을 포함하는 것인, 식물 병해충 방제용 조성물.
  14. 제10항에 있어서, 상기 해충은 조팝나무진딧물 (Aphis citricola)을 포함하는 것인, 식물 병해충 방제용 조성물.
  15. 수탁번호 KCTC 14658BP로 기탁된 스트렙토마이세스 에스피 (Streptomyces sp.) JCK-6131 균주를 배양하여 배양액을 제조하는 배양 단계를 포함하는 것인, 식물 병해충 방제용 조성물의 제조방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 병해충은 세균 (Bacteria), 진균 (Fungus), 난균 (Oomycetes), 해충 (Pest) 및 선충 (Nematode)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 식물 병해충 방제용 조성물의 제조방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 세균은 아시도보락 아베나이 서브에스피 카틀레야 (Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 아시도보락 코냐시 (Acidovorax konjaci), 아그로박테리움 투머페시언스 (Agrobacterium tumefaciens), 버콜데리아 글루메 (Burkholderia glumae), 클라비박터 미시가넨시스 서브에스피 미시가넨시스 (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 어위니아 피리폴리에 (Erwinia pyrifoliae), 에르위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora), 펙토박테리움 카로토보룸 서브에스피 카로토보롬 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 펙토박테리움 크리산테미 (Pectobacterium chrysanthemi), 슈도모나스 시린게 패소바 라크리만스 (Pseudomonas syringae pv. lachrymans), 슈도모나스 시린게 패소바 액티니디애 (Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 랄스토니아 솔라나시아룸 (Ralstonia solanacearum), 잔토모나스 유베지카토리아 (Xanthomonas euvesicatoria), 잔토모나스 악소노포디스 패소바 사이트리 (Xanthomonas axonopodis pv. citri), 잔토모나스 아크리콜라 패소바 프루니 (Xanthomonas arboricola pv. pruni) 및 잔토모나스 오리재 패소바 오리재 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 식물 병해충 방제용 조성물의 제조방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 진균은 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 콜레토크리쿰 코코데스 (Colletotrichum coccodes), 푸자리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 푸자리움 옥시스포룸 에프 에스피 쿠쿠메리눔 (Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum), 라파엘라 쿼르쿠스-몽고리케 (Raffaelea quercus-mongolicae), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani) 및 스크레로티니아 호모에오카파 (Sclerotinia homoeocarpa)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 식물 병해충 방제용 조성물의 제조방법.
  19. 제16항에 있어서, 상기 난균은 피디움 울티뭄 (Pythium ultimum)을 포함하는 것인, 식물 병해충 방제용 조성물의 제조방법.
  20. 제16항에 있어서, 상기 해충은 조팝나무진딧물 (Aphis citricola)을 포함하는 것인, 식물 병해충 방제용 조성물의 제조방법.
  21. 제15항에 있어서, 상기 방법은 배양액으로부터 활성 분획을 획득하는 분획 단계를 포함하는 것인, 식물 병해충 방제용 조성물의 제조방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 활성 분획은 스트렙토트리신 E산 (Streptothricin E acid), 스트렙토트리신 D (streptothricin D) 및 12-카바모일스트렙토트리신 D (12-carbamoylstreptothricin D)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 식물 병해충 방제용 조성물의 제조방법.
  23. 수탁번호 KCTC 14658BP로 기탁된 스트렙토마이세스 에스피 (Streptomyces sp.) JCK-6131 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 처리하는 조성물 처리 단계를 포함하는 식물 병해충 방제 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 조성물 처리 단계는 살포, 토양관주, 표면살포, 근권 처리, 종자 처리, 침지, 독이 및 훈연시용으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방식으로 수행되는 것인, 식물 병해충 방제 방법.
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