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WO2023013785A1 - Ｓｎａｒｅを活用した核酸構築物 - Google Patents

Ｓｎａｒｅを活用した核酸構築物 Download PDF

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WO2023013785A1
WO2023013785A1 PCT/JP2022/030200 JP2022030200W WO2023013785A1 WO 2023013785 A1 WO2023013785 A1 WO 2023013785A1 JP 2022030200 W JP2022030200 W JP 2022030200W WO 2023013785 A1 WO2023013785 A1 WO 2023013785A1
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WO
WIPO (PCT)
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antigen
nucleic acid
seq
ova
amino acid
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Ceased
Application number
PCT/JP2022/030200
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English (en)
French (fr)
Inventor
慧門 佐山
貴也 菅沼
智史 堀
竣 久保
征輝 山本
聡子 深川
准子 石川
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kao Corp
Original Assignee
Kao Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Kao Corp filed Critical Kao Corp
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Priority to EP22853203.2A priority patent/EP4382605A4/en
Priority to CA3228426A priority patent/CA3228426A1/en
Priority to CN202280055113.4A priority patent/CN117795081A/zh
Priority to US18/681,254 priority patent/US20250049905A1/en
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid construct comprising a polynucleotide encoding a SNARE protein and a polynucleotide encoding an antigen.
  • Vaccines are a means of preventing infection and treating diseases by administering antigens and establishing acquired immunity against them.
  • live vaccines that use attenuated bacteria and viruses as vaccines, inactivated vaccines that lose their infectivity by treating them with formalin or heat, etc.
  • Vaccines such as inactivated toxoids are administered mainly by subcutaneous or intramuscular injection.
  • mucosal vaccines in which the site of administration is a mucous membrane, nucleic acid vaccines in which the antigen component is a nucleic acid, etc. is being developed.
  • nucleic acid vaccines is rapidly progressing as a new modality that can be rapidly manufactured at low cost.
  • Patent Document 1 by using a nucleic acid encoding a fusion protein in which an allergen protein (antigen) is inserted between an organelle stabilization domain and a transmembrane domain of a lysosomal associated membrane protein (LAMP), , disclose that the immune response to the antigen was enhanced. On the other hand, it has been reported that addition of an antigen to the LAMP lumen may result in a significant reduction in antigen-specific antibody production (Non-Patent Document 1).
  • an allergen protein antigen
  • LAMP lysosomal associated membrane protein
  • Patent Document 2 discloses that the immunogenicity of an antigen is increased by using a nucleic acid encoding a fusion molecule containing an antigen, a transmembrane region, and a cytoplasmic region of a major histocompatibility complex (MHC) molecular chain. is disclosed. Patent Document 2 also mentions a fusion molecule comprising an antigen and a cytoplasmic region of a soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor (SNARE) protein. No indication is given as to whether it will change.
  • MHC major histocompatibility complex
  • SNARE proteins are a protein family with a SNARE motif of 20-30 kDa. Many SNARE proteins are tethered on lipid bilayer membranes via their C-terminal transmembrane domains and are involved in the process of vesicle fusion to target organelles (Non-Patent Documents 2 and 3). . Membrane fusion involving SNARE proteins is involved in vesicle transport, organelle membrane morphogenesis, endocytic processes including extracellular receptor recycling, hormone secretion and synaptic neurotransmitter release in eukaryotic cells. It is essential for many important life events that are essential for cell function, such as the exocytosis process.
  • SNARE protein is believed to be conserved in all eukaryotes, from unicellular Saccharomyces cerevisiae to higher animals including humans.
  • SNARE proteins are further classified into four subfamilies, QA-SNARE, QB-SNARE, QC-SNARE, and R-SNARE, based on the amino acid residue characteristics of the SNARE motif.
  • Each SNARE protein is localized in a specific intracellular membrane fraction (endoplasmic reticulum (ER), Golgi apparatus, endosomes, organelles such as vacuoles and lysosomes, secretory vesicles, cytoplasmic membrane, etc.) It is thought to function in the process of membrane fusion in the internal transport pathway. It is also known that SNARE proteins may be contained in exosomes.
  • ER endoplasmic reticulum
  • Golgi apparatus endosomes
  • organelles such as vacuoles and lysosomes, secretory vesicles, cytoplasmic membrane, etc.
  • Patent Document 1 JP-A-2017-79742 (Patent Document 2) National Publication of International Patent Application No. 2008-500014 (Non-Patent Document 1) Chen AC, et al. J Immunother Cancer. 2020; 8(1): e000258.
  • Non-Patent Document 2 Jahn R, Scheller RH. Nat Rev Mol Cell Biol. 2006; 7(9): 631-643.
  • Non-Patent Document 3 Hong W. Biochim Biophys Acta. 2005; 1744(2): 120-144.
  • the present invention provides the following 1) to 4).
  • An antigen-specific Th1-type immune response inducer or enhancer comprising the nucleic acid construct of 1) as an active ingredient.
  • An antigen-specific cellular immune response inducer or enhancer comprising the nucleic acid construct of 1) as an active ingredient.
  • a nucleic acid vaccine comprising the nucleic acid construct of 1) as an active ingredient.
  • IFN ⁇ immunogenicity of mRNA encoding SNARE protein-antigen fusion polypeptides.
  • the amount of IFN ⁇ produced is indicated by the number of producing cells (spot forming cells; SFC). Empty indicates transfection reagent only control, Empty (N.T.) indicates no antigen restimulation control, SNARE protein-OVA indicates mRNA encoding SNARE protein-antigen (OVA) fusion polypeptide. . IgG subclass antibody titers when a plasmid vector encoding a SNARE protein-antigen fusion polypeptide was administered to mice.
  • (A) shows IgG antibody titer
  • (B) shows IgG1 antibody titer
  • (C) shows IgG2a antibody titer.
  • Empty indicates an empty plasmid vector that does not encode an antigen (OVA)
  • OVA indicates an OVA-encoding plasmid vector
  • V7-OVA indicates a VAMP7-OVA fusion polypeptide-encoding plasmid vector.
  • (A) shows the amount of IFN ⁇ produced
  • (B) shows the amount of IL-4 produced by SFC.
  • C shows the ratio of IFN ⁇ production to IL-4 production (IFN ⁇ /IL-4).
  • Empty indicates an empty plasmid vector that does not encode an antigen (OVA)
  • OVA indicates an OVA-encoding plasmid vector
  • V7-OVA indicates a VAMP7-OVA fusion polypeptide-encoding plasmid vector.
  • IgG subclass antibody titers when a plasmid vector encoding a SNARE protein-antigen fusion polypeptide was administered to mice.
  • A shows the IgG antibody titer
  • B the IgG1 antibody titer
  • C the IgG2a antibody titer
  • D the ratio of the IgG2a antibody titer to the IgG1 antibody titer (IgG2a/IgG1).
  • Empty is an empty plasmid vector that does not encode an antigen (OVA)
  • OVA is a plasmid vector that encodes OVA
  • V7-OVA, STX10-OVA, STX18-OVA, and GOSR1-OVA are VAMP7-OVA, STX10-OVA, and STX18, respectively.
  • OVA is a plasmid vector that encodes OVA
  • V7-OVA, STX10-OVA, STX18-OVA, and GOSR1-OVA are VAMP7-OVA, STX10-OVA, and STX18, respectively.
  • -OVA indicating a plasmid vector encoding the GOSR1-OVA fusion polypeptide.
  • Antibody titer over time when a plasmid vector encoding a SNARE protein-antigen fusion polypeptide or a fusion polypeptide containing an antigen inside LAMP was administered to mice.
  • A is the IgG antibody titer
  • B is the IgG1 antibody titer
  • C is the IgG2a antibody titer
  • D is the ratio of the IgG2a antibody titer to the IgG1 antibody titer at week 5 (IgG2a/IgG1).
  • Empty is an empty plasmid vector that does not encode an antigen (OVA)
  • OVA is a plasmid vector that encodes OVA
  • V7-OVA is a plasmid vector that encodes a VAMP7-OVA fusion polypeptide
  • V7-pc-OVA is a proprotein conversion.
  • a plasmid vector encoding a VAMP7-OVA fusion polypeptide containing an enzyme recognition sequence, and LAMP[OVA] indicates a plasmid vector encoding a fusion polypeptide containing OVA inside LAMP.
  • Evaluation of immune responses upon administration of plasmid vectors encoding SNARE protein-antigen fusion polypeptides to mice. shows the amount of IFN ⁇ produced, and (B) shows the amount of IL-4 produced by SFC.
  • C) shows the ratio of IL-4 production under antigen-stimulated conditions to non-stimulated conditions (IL-4 ratio).
  • OVA is a plasmid vector that encodes OVA
  • V7-OVA is a plasmid vector that encodes a VAMP7-OVA fusion polypeptide
  • V7-pc-OVA is a proprotein conversion.
  • a plasmid vector encoding a VAMP7-OVA fusion polypeptide containing an enzyme recognition sequence is shown. IgG subclass antibody titer when a plasmid vector encoding the SNARE protein-antigen fusion polypeptide was administered to mice.
  • (A) to (D) show the results when WT1 was used as the antigen, and (E) to (H) the results when MOG 35-55 was used as the antigen.
  • (A) and (E) are IgG antibody titers
  • (B) and (F) are IgG1 antibody titers
  • (C) and (G) are IgG2a antibody titers
  • (D) and (H) are IgG1 antibody titers IgG2a antibody titer ratio (IgG2a/IgG1) is shown.
  • WT1 and MOG 35-55 are plasmid vectors encoding WT1 and MOG 35-55 , respectively, V7-pc-WT1 and V7-pc- MOG 35-55 indicate plasmid vectors encoding VAMP7-proprotein convertase recognition sequence-WT1 and VAMP7-proprotein convertase recognition sequence-MOG 35-55 fusion polypeptides, respectively. Evaluation of immune responses upon administration of plasmid vectors encoding SNARE protein-antigen fusion polypeptides to mice.
  • (A) to (D) show the results when WT1 was used as the antigen
  • (E) to (H) the results when MOG 35-55 was used as the antigen.
  • (A) and (E) show the amount of IFN ⁇ produced
  • (B) and (F) show the amount of IL-4 produced by SFC.
  • (C) and (G) are the ratio of IL-4 production under antigen-stimulated conditions to non-stimulated conditions (IL-4 ratio)
  • (D) and (H) are IFN ⁇ production relative to IL-4 production. ratio (IFN ⁇ /IL-4).
  • WT1 and MOG 35-55 are plasmid vectors that encode WT1 and MO 35-55 , respectively, V7-pc-WT1 and V7-pc- MOG 35-55 indicate plasmid vectors encoding VAMP7-proprotein convertase recognition sequence-WT1 and VAMP7-proprotein convertase recognition sequence-MOG 35-55 fusion polypeptides, respectively. Evaluation of immune responses upon administration of SNARE protein-antigen fusion polypeptides or plasmid vectors encoding fusion polypeptides containing antigens within LAMP to mice.
  • A shows the amount of IFN ⁇ produced
  • B shows the amount of IL-4 produced by SFC.
  • C shows the ratio of IL-4 production under antigen-stimulated conditions to non-stimulated conditions (IL-4 ratio)
  • D shows the ratio of IFN ⁇ production to IL-4 production (IFN ⁇ /IL-4 ).
  • Empty is an empty plasmid vector that does not encode an antigen (OVA)
  • OVA is a plasmid vector that encodes OVA
  • V7-OVA is a plasmid vector that encodes a VAMP7-OVA fusion polypeptide
  • V7-pc-OVA is a proprotein conversion.
  • a plasmid vector encoding a VAMP7-OVA fusion polypeptide containing an enzyme recognition sequence, and LAMP[OVA] indicates a plasmid vector encoding a fusion polypeptide containing OVA inside LAMP.
  • nucleic acid includes cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA
  • RNA includes total RNA, mRNA, rRNA, tRNA, non-coding RNA, and synthetic RNA.
  • mRNA is synthesized by in vitro transcription reaction for the reasons of initiation of translation reaction in vivo, stabilization of mRNA, suppression of degradation, etc., and then addition of 5' Cap (methylated guanosine) by capping enzyme, Also, addition of poly A by Poly (A) Polymerase is performed.
  • a poly A sequence may be incorporated into a template DNA used for in vitro transcription reaction.
  • mRNAs to which a Cap structure or polyA is added and RNAs to which some bases are modified (for example, uridine is replaced with pseudouridine or 1-methylpseudouridine) are also included.
  • the term “gene” refers to double-stranded DNA containing genomic DNA, single-stranded DNA (positive strand) containing cDNA, and single-stranded DNA (complementary strand) having a sequence complementary to the positive strand. strands), and fragments thereof, which contain some biological information in the sequence information of the bases that make up the DNA.
  • the “gene” includes not only “gene” represented by a specific nucleotide sequence, but also nucleic acids encoding their homologues (i.e., homologues or orthologs), variants such as genetic polymorphisms, and derivatives. be done.
  • the gene names and Gene IDs disclosed herein follow the Official Symbols and Gene IDs described in NCBI ([www.ncbi.nlm.nih.gov/]).
  • peptide As used herein, the terms “peptide”, “polypeptide” or “protein” are used interchangeably.
  • amino acid residue refers to 20 amino acid residues that constitute proteins, alanine (Ala or A), arginine (Arg or R), asparagine (Asn or N), aspartic acid (Asp or D), cysteine (Cys or C), glutamine (Gln or Q), glutamic acid (GIu or E), glycine (Gly or G), histidine (His or H), isoleucine (Ile or I), leucine (Leu or L ), Lysine (Lys or K), Methionine (Met or M), Phenylalanine (Phe or F), Proline (Pro or P), Serine (Ser or S), Threonine (Thr or T), Tryptophan (Trp or W) , tyrosine (Tyr or Y) and valine (Val or V).
  • nucleotide sequences or amino acid sequences is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, 227: 1435-1441). Specifically, it is calculated by performing analysis using a homology analysis (Search homology) program of genetic information processing software Genetyx-Win with Unit size to compare (ktup) set to 2.
  • search homology search homology program of genetic information processing software Genetyx-Win with Unit size to compare (ktup) set to 2.
  • At least 80% identity with respect to a nucleotide sequence or amino acid sequence means 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, even more preferably Identity of 98% or more, preferably 99% or more.
  • nucleotide sequence means preferably 1 to 15, more preferably 1 to 9 , more preferably 1 to 6.
  • one or several used in relation to deletion, substitution, addition or insertion of amino acid residues in an amino acid sequence means preferably 1 to 5, more preferably It can mean 1-3, more preferably 1-2.
  • addition of nucleotides or amino acid residues includes addition of nucleotides or amino acid residues to one and both termini of a sequence.
  • stringent conditions include the conditions described in Molecular Cloning-A Laboratory Manual Third Edition (Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001), for example, Southern hybridization conditions , 6 ⁇ SSC (composition of 1 ⁇ SSC: 0.15 M sodium chloride, 0.015 M sodium citrate, pH 7.0), 0.5% SDS, 5 ⁇ Denhardt and 100 mg/mL herring sperm DNA. and incubating at 42° C. for 8 to 16 hours for hybridization.
  • a "fragment" of a polynucleotide means a partial polynucleotide of the polynucleotide.
  • the length of the partial polynucleotide is not particularly limited as long as it encodes a polypeptide having the same function as the polypeptide encoded by the full-length polynucleotide.
  • the partial polynucleotide is preferably 30% or more, more preferably 40% or more, still more preferably 50% or more, and preferably 90% or less, more preferably 80% or less, and still more preferably can mean a polynucleotide consisting of no more than 70%, even more preferably no more than 60% of the length of contiguous nucleotides.
  • a "fragment" of a polypeptide means a partial polypeptide of the polypeptide.
  • the length of the partial polypeptide is not particularly limited.
  • the partial polypeptide is preferably 30% or more, more preferably 40% or more, still more preferably 50% or more, and preferably 90% or less, more preferably 80% or less, and still more preferably may mean a polypeptide consisting of 70% or less, even more preferably 60% or less of the length of contiguous amino acid residues.
  • a "regulatory region” is a region that has the function of regulating the expression of a gene (for example, a protein-encoding region) located downstream thereof. More specifically, a “regulatory region” can be defined as a region located upstream of the coding region of a gene and having the function of interacting with RNA polymerase to regulate transcription of the coding region.
  • the control region includes a transcription initiation control region and/or a translation initiation control region, or a region from the transcription initiation control region to the translation initiation control region.
  • a transcription initiation regulatory region is a region containing a promoter and a transcription initiation site
  • a translation initiation regulatory region is a site corresponding to a Kozak sequence recognized by ribosomes and necessary for translation initiation together with an initiation codon.
  • operably linked between a regulatory region and a polynucleotide of a gene (e.g., a polynucleotide encoding a protein) means that the gene and the regulatory region are in a state where the gene is under the control of the regulatory region. It means that they are linked so that they can be expressed. Procedures for "operably linking" genes and regulatory regions are well known to those of skill in the art.
  • the term “expressible linkage” between a polynucleotide of a first gene (e.g., a polynucleotide encoding a protein) and a polynucleotide of a second gene (e.g., a polynucleotide encoding a protein) refers to When the first gene and the second gene are inserted into an appropriate expression vector and the expression vector is introduced into an appropriate cell, the protein encoded by the first gene and the second gene encode It means that two proteins are linked so that they are produced as a fusion protein.
  • “ligation” is a concept that includes both cases in which the first gene and the second gene are directly linked and cases in which they are linked via another nucleotide sequence. Procedures for "expressible linking" of a first gene with a second gene are well known to those skilled in the art.
  • upstream and downstream with respect to a gene or its nucleotide sequence refer to upstream and downstream in the transcription direction of the gene.
  • upstream sequence and downstream sequence refer to the sequences located on the 5' and 3' sides of the gene in the DNA sense strand, respectively.
  • the term "antigen” means a molecule that causes an immune response such as antibody production or cell-mediated immunity in a living body.
  • the term “immunogenicity” means the property of an antigen to induce antibody production and cell-mediated immunity.
  • nucleic acid vaccine refers to a vaccine that induces immunity by administering a polynucleotide (DNA or RNA) encoding an antigen to a living body.
  • Nucleic acid vaccines include DNA vaccines, mRNA vaccines, and virus vector vaccines, all of which are believed to induce both humoral and cellular immunity.
  • DNA vaccines contain plasmids encoding antigens. Plasmids administered to living organisms are taken up by cells and transcribed into mRNA in the nucleus, and the mRNA is translated into antigen proteins in the cytoplasm to induce antigen-specific immune responses.
  • An mRNA vaccine contains the mRNA that encodes the antigen.
  • Viral vector vaccines comprise apathogenic or attenuated viral vectors incorporating polynucleotides encoding antigens.
  • a virus administered to a living body invades cells, causes the cells to synthesize antigen proteins, and induces an antigen-specific immune response.
  • cell-mediated immunity refers to acquired immune responses that work to eliminate foreign substances such as pathogens, virus-infected cells, and cancer cells that have invaded the body, such as cytotoxic T cells, macrophages, and NK cells. refers to an immune response in which is an effector.
  • cytotoxic T cells cytotoxic T cells
  • macrophages macrophages
  • NK cells cytotoxic T cells
  • NK cells cytotoxic T cells
  • NK cells refers to an immune response in which is an effector.
  • Th1-type immune response refers to an immune response promoted by Th1 cells, which are a subset of helper T cells. Th1 cells mainly produce IFN ⁇ as a cytokine, target M1 macrophages, cytotoxic T cells and NK cells as main target cells, and mainly induce cell-mediated immunity. Th1 cells are known to activate B cells and induce the production of IgG2a. As used herein, the term “Th2-type immune response” refers to an immune response promoted by Th2 cells, which are a subset of helper T cells.
  • Th2 cells mainly produce IL-4, IL-5, IL-13 as cytokines, mast cells, M2 macrophages, eosinophils and basophils as main target cells, and mainly induce humoral immunity. do. Th2 cells are known to activate B cells and induce the production of IgG1.
  • the present invention relates to providing nucleic acid constructs that enhance antigen-specific immune responses.
  • nucleic acid construct comprising a polynucleotide encoding a particular SNARE protein and a polynucleotide encoding an antigen, antigen-specific It has been found that a specific Th1-type immune response can be induced or enhanced, and an antigen-specific cellular immune response can be induced or enhanced.
  • the nucleic acid construct of the present invention can induce or enhance an antigen-specific Th1-type immune response, and can induce or enhance an antigen-specific cellular immune response.
  • Such nucleic acid constructs are useful as nucleic acid vaccines.
  • the present invention provides a polynucleotide encoding any SNARE protein selected from the group consisting of VAMP7, GOSR2, STX10, STX18, BNIP1, STX7, VTI1A, STX16, STX5, GOSR1, STX8, STX12, VAMP8, and SEC22B. , and a polynucleotide encoding an antigen.
  • a SNARE protein is a protein belonging to a protein family having a SNARE motif, specifically VAMP7, GOSR2, STX10, STX18, BNIP1, STX7, VTI1A, STX16, STX5, GOSR1, STX8, STX12, VAMP8. , and SEC22B (hereinafter sometimes simply referred to as SNARE protein).
  • the SNARE protein is preferably any one selected from the group consisting of VAMP7, GOSR2, STX10, STX18, BNIP1, STX7, VTI1A, STX16, STX5, and GOSR1 from the viewpoint of immune induction or enhancement, and VAMP7, GOSR2, Any selected from the group consisting of STX10, STX18, BNIP1, STX7, VTI1A, and GOSR1 is more preferred, and any selected from the group consisting of VAMP7, GOSR2, STX10, and GOSR1 is more preferred, and VAMP7 is even more preferred. .
  • the SNARE protein has a transmembrane domain and localizes to intracellular vesicles.
  • VAMP7 vesicle-associated membrane protein 7
  • VAMP7 is a type of SNARE protein, has a transmembrane domain, and is expected to be localized in late endosomes, lysosomes and cell membranes.
  • the VAMP7 is a mammalian VAMP7.
  • VAMP7 is human VAMP7 and is a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 encoded by the gene (Gene ID: 6845) consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • VAMP7 used in the present invention includes VAMP7 and polypeptides having functions equivalent thereto.
  • GOSR2 (golgi SNAP receptor complex member 2) is a type of SNARE protein, has a transmembrane domain, and is expected to be localized in the endoplasmic reticulum-Golgi body intermediate interval and the Golgi body.
  • the GOSR2 is mammalian GOSR2.
  • GOSR2 is human GOSR2 and is a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 encoded by the gene (Gene ID: 9570) consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • GOSR2 used in the present invention includes GOSR2 and polypeptides having functions equivalent thereto.
  • STX (syntaxin) 10 is a type of SNARE protein, has a transmembrane domain, and is predicted to be localized in the trans-Golgi network.
  • the STX10 is mammalian STX10.
  • STX10 is human STX10, a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 encoded by the gene (Gene ID: 8677) consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
  • STX10 used in the present invention includes STX10 and polypeptides having functions equivalent thereto.
  • STX18 is a type of SNARE protein, has a transmembrane domain, and is expected to be localized in the endoplasmic reticulum.
  • the STX18 is a mammalian STX18.
  • STX18 is human STX18, a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 encoded by the gene (Gene ID: 53407) consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • STX18 used in the present invention includes STX18 and polypeptides having functions equivalent thereto.
  • BNIP1 (BCL2 interacting protein 1) is a type of SNARE protein, has a transmembrane domain, and is predicted to be localized in the endoplasmic reticulum.
  • the BNIP1 is a mammalian BNIP1.
  • BNIP1 is human BNIP1 and is a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 encoded by the gene (Gene ID: 662) consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.
  • BNIP1 used in the present invention includes BNIP1 and polypeptides having functions equivalent thereto.
  • STX7 is a type of SNARE protein, has a transmembrane domain, and is expected to be localized in early and late endosomes.
  • the STX7 is a mammalian STX7.
  • STX7 is human STX7, a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 encoded by the gene (Gene ID: 8417) consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6.
  • STX7 used in the present invention includes STX7 and polypeptides having functions equivalent thereto.
  • VTI1A (vesicle transport through interaction with-SNAREs 1A) is a type of SNARE protein, has a transmembrane domain, and is predicted to localize in the trans-Golgi network.
  • the VTI1A is a mammalian VTI1A.
  • VTI1A is human VTI1A and is a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 encoded by the gene (Gene ID: 143187) consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7.
  • VTI1A used in the present invention includes VTI1A and polypeptides having functions equivalent thereto.
  • STX16 is a type of SNARE protein, has a transmembrane domain, and is predicted to be localized in the trans-Golgi network.
  • the STX16 is a mammalian STX16.
  • STX16 is human STX16, a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 encoded by the gene (Gene ID: 8675) consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8.
  • STX16 used in the present invention includes STX16 and polypeptides having functions equivalent thereto.
  • STX5 is a type of SNARE protein, has a transmembrane domain, and is predicted to be localized in the Golgi apparatus.
  • the STX5 is a mammalian STX5.
  • STX5 is human STX5 and is a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 encoded by the gene (Gene ID: 6811) consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9.
  • STX5 used in the present invention includes STX5 and polypeptides having functions equivalent thereto.
  • GOSR1 is a type of SNARE protein, has a transmembrane domain, and is predicted to be localized in the Golgi apparatus and trans-Golgi network.
  • the GOSR1 is a mammalian GOSR1.
  • GOSR1 is human GOSR1 and is a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 76 encoded by the gene (Gene ID: 9527) consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 71.
  • GOSR1 used in the present invention includes GOSR1 and polypeptides having functions equivalent thereto.
  • STX8 is a type of SNARE protein, has a transmembrane domain, and is expected to be localized in early endosomes, late endosomes, and cell membranes.
  • the STX8 is a mammalian STX8.
  • STX8 is human STX8 and is a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 77 encoded by the gene (Gene ID: 9482) consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 72.
  • STX8 used in the present invention includes STX8 and polypeptides having functions equivalent thereto.
  • STX12 is a type of SNARE protein, has a transmembrane domain, and is predicted to be localized in the Golgi apparatus, early endosomes and recycling endosomes.
  • the STX12 is a mammalian STX12.
  • STX12 is human STX12 and is a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 78 encoded by the gene (Gene ID: 23673) consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 73.
  • STX12 used in the present invention includes STX12 and polypeptides having functions equivalent thereto.
  • VAMP8 is a type of SNARE protein, has a transmembrane domain, and is expected to be localized in lysosomes, early endosomes, late endosomes and cell membranes.
  • the VAMP8 is a mammalian VAMP8.
  • VAMP8 is human VAMP8 and is a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 79 encoded by the gene (Gene ID: 8673) consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 74.
  • VAMP8 used in the present invention includes VAMP8 and polypeptides having functions equivalent thereto.
  • SEC22B (SEC22 homolog B, vesicle trafficking protein) is a type of SNARE protein, has a transmembrane domain, and is localized to the endoplasmic reticulum, endoplasmic reticulum-Golgi intermediate interval, Golgi apparatus, cis-Golgi network and trans-Golgi network. expected to exist.
  • the SEC22B is a mammalian SEC22B.
  • SEC22B is human SEC22B and is a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 80 encoded by the gene (Gene ID: 9554) consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 75.
  • SEC22B used in the present invention includes SEC22B and polypeptides having equivalent functions.
  • a polypeptide having a function equivalent to that of a SNARE protein refers to a polypeptide having biological activity equivalent to that of the SNARE protein.
  • Such polypeptides include, for example, polypeptides that have a transmembrane domain and can localize to intracellular vesicles (preferably intracellular vesicles in which the corresponding SNARE proteins are localized) or exosomes. . Specific examples include the following (b) to (e), or the following (b), (c) and (e) polypeptides.
  • VAMP7 include the following.
  • (d) consists of an amino acid sequence encoded by a splicing variant of a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, has a transmembrane domain, and is localized in intracellular vesicles (e.g., late endosomes or lysosomes) or exosomes a polypeptide capable of;
  • (e) is a fragment of any of the polypeptides of (a) to (d) above, has a transmembrane domain, and can be localized in intracellular vesicles (e.g., late endosomes or lysosomes) or exosomes
  • Polypeptides that can As a splicing variant of the VAMP7 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, proteins registered as NM_001185183.2 or NM_001145149.3 in RefSe
  • GOSR2 include the following.
  • (c) consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added, or inserted with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, and has a transmembrane domain, intracellular vesicles (e.g.
  • endoplasmic reticulum-Golgi intermediate interval or Golgi or exosomes
  • exosomes consists of an amino acid sequence encoded by a splicing variant of a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, has a transmembrane domain, and has an intracellular vesicle (e.g., endoplasmic reticulum-Golgi intermediate interval or Golgi apparatus ) or a polypeptide capable of localizing in exosomes; (e) a fragment of any of the polypeptides of (a) to (d) above, and having a transmembrane domain, intracellular vesicles (e.g., endoplasmic reticulum-Golgi intermediate interval or Golgi apparatus) or exosomes
  • STX 10 include the following.
  • (c) consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added, or inserted with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, and has a transmembrane domain, intracellular vesicles (e.g.
  • trans-Golgi network or a polypeptide capable of localizing in exosomes
  • (d) consists of an amino acid sequence encoded by a splicing variant of a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, has a transmembrane domain, and is localized in intracellular vesicles (e.g., trans-Golgi network) or exosomes
  • a polypeptide capable of (e) is a fragment of any of the polypeptides of (a) to (d) above, has a transmembrane domain, and can be localized in intracellular vesicles (e.g., trans-Golgi network) or exosomes Polypeptide.
  • Splicing variants of the STX10 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 are registered in RefSeq of NCBI as NM_001271610.2, NM_1271609.2, or NM_001271611.2, respectively, NP_001258539.1, NP_001258538.1, or NP_0011258540.
  • STX 18 include the following.
  • a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 consists of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, has a transmembrane domain, and can be localized in intracellular vesicles (e.g., endoplasmic reticulum) or exosomes a polypeptide;
  • c) consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added, or inserted with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and has a transmembrane domain, intracellular vesicles (e.g.
  • endoplasmic reticulum or exosomes
  • exosomes consisting of an amino acid sequence encoded by a splicing variant of a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, having a transmembrane domain, and being localized in intracellular vesicles (e.g., endoplasmic reticulum) or exosomes a polypeptide capable of (e) a fragment of any of the polypeptides of (a) to (d) above and having a transmembrane domain and capable of localizing in intracellular vesicles (e.g., endoplasmic reticulum) or exosomes peptide.
  • Splicing variants of the STX18 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 are registered in RefSeq of NCBI as NM_001346281.2, NM_001346282.2, or NM_001346300.2, respectively, NP_001333210.1, NP_001333211.1, or NP_0011332.
  • BNIP1 include the following.
  • (c) consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added, or inserted with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, and has a transmembrane domain, intracellular vesicles (e.g.
  • (d) consists of an amino acid sequence encoded by a splicing variant of a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, and has a transmembrane domain, and is localized in intracellular vesicles (e.g., endoplasmic reticulum) or exosomes a polypeptide capable of (e) a fragment of any of the polypeptides of (a) to (d) above and having a transmembrane domain and capable of localizing in intracellular vesicles (e.g., endoplasmic reticulum) or exosomes peptide.
  • a polypeptide capable of (e) a fragment of any of the polypeptides of (a) to (d) above and having a transmembrane domain and capable of localizing in intracellular vesicles (e.g., endoplasmic reticulum) or exosomes peptide.
  • Splicing variants of the BNIP1 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 are registered as NM_013980.3, NM_001205.3, or NM_013978.3 in RefSeq of NCBI, and are NP_053583.2, NP_001196.2, or NP_053581.2, respectively.
  • STX7 include the following.
  • (c) consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added, or inserted with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and has a transmembrane domain, intracellular vesicles (e.g.
  • (d) consists of an amino acid sequence encoded by a splicing variant of a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6, has a transmembrane domain, and is localized to intracellular vesicles (e.g., early endosomes or late endosomes) or exosomes a polypeptide that can be present; (e) is a fragment of any of the polypeptides (a) to (d) above, has a transmembrane domain, and is localized in intracellular vesicles (e.g., early endosomes or late endosomes) or exosomes
  • a polypeptide capable of Splicing variants of the STX7 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 are registered in RefSeq of NCBI as NM_001326578.2, NM_001326579.2,
  • VTI1A include the following.
  • trans-Golgi network or a polypeptide capable of localizing in exosomes
  • (d) consists of an amino acid sequence encoded by a splicing variant of a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, has a transmembrane domain, and is localized in intracellular vesicles (e.g., trans-Golgi network) or exosomes
  • a polypeptide capable of (e) is a fragment of any of the polypeptides of (a) to (d) above, has a transmembrane domain, and can be localized in intracellular vesicles (e.g., trans-Golgi network) or exosomes Polypeptide.
  • Splicing variants of the VTI1A gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 are registered in RefSeq of NCBI as NM_145206.4, NM_001365711.1, NM_001365710.2, NM_001365712.1, NM_001365713.1, NM_001365714.1, or NM_812014.1. and variants encoding proteins designated as NP_660207.2, NP_001352640.1, NP_001352639.1, NP_001352641.1, NP_001352642.1, NP_001352643.1, or NP_001305134.1, respectively.
  • STX 16 include the following.
  • trans-Golgi network or a polypeptide capable of localizing in exosomes
  • (d) consists of an amino acid sequence encoded by a splicing variant of a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8, has a transmembrane domain, and is localized in intracellular vesicles (e.g., trans-Golgi network) or exosomes
  • a polypeptide capable of (e) is a fragment of any of the polypeptides of (a) to (d) above, has a transmembrane domain, and can be localized in intracellular vesicles (e.g., trans-Golgi network) or exosomes Polypeptide.
  • Splicing variants of the STX16 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 are registered as NM_001134772.3, NM_1134773.3, NM_003763.6, or NM_001204868.2 in RefSeq of NCBI. NP_003754.2, or variants encoding proteins registered as NP_001191797.1.
  • STX5 include the following.
  • (d) consists of an amino acid sequence encoded by a splicing variant of a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, and has a transmembrane domain, and is localized in intracellular vesicles (e.g., Golgi apparatus) or exosomes a polypeptide capable of (e) a fragment of any of the polypeptides of (a) to (d) above and having a transmembrane domain and capable of localizing in intracellular vesicles (e.g., Golgi apparatus) or exosomes peptide.
  • Splicing variants of the STX5 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 are registered in RefSeq of NCBI as NM_001244666.3 or NM_001330294.2, and encode proteins registered as NP_001231595.1 or NP_001317223.1, respectively. variants.
  • GOSR1 include the following.
  • c) consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added, or inserted with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 76, and has a transmembrane domain, intracellular vesicles (e.g.
  • STX8 include the following.
  • (c) consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added, or inserted with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 77, and has a transmembrane domain, intracellular vesicles (e.g.
  • (e) is a fragment of any of the polypeptides of (a) to (c) above, has a transmembrane domain, and is localized in intracellular vesicles (e.g., early endosomes or late endosomes) or exosomes
  • STX 12 include the following.
  • c) consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added, or inserted with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 78, and has a transmembrane domain, intracellular vesicles (e.g.
  • Golgi apparatus early endosomes or recycling endosomes
  • exosomes a fragment of any of the polypeptides of (a) to (c) above, and having a transmembrane domain, in intracellular vesicles (e.g., Golgi apparatus, early endosomes or recycling endosomes) or exosomes
  • a polypeptide capable of localization e.g., Golgi apparatus, early endosomes or recycling endosomes
  • VAMP8 include the following.
  • a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:79 consists of an amino acid sequence having at least 80% identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 79 and has a transmembrane domain and is localized to intracellular vesicles (e.g., lysosomes, early endosomes or late endosomes) or exosomes a polypeptide that can be present;
  • c) consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added, or inserted with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 79, and has a transmembrane domain, intracellular vesicles (e.g.
  • a polypeptide capable of a polypeptide having a transmembrane domain has a transmembrane domain, and is localized in intracellular vesicles (e.g., lysosomes, early endosomes or late endosomes) or exosomes
  • SEC 22B include the following.
  • (c) consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added, or inserted with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 80, and has a transmembrane domain, intracellular vesicles (e.g.
  • endoplasmic reticulum endoplasmic reticulum-Golgi intermediate interval, Golgi apparatus, cis-Golgi network or trans-Golgi network
  • exosomes exosomes
  • a polynucleotide encoding a SNARE protein used in the present invention includes a polynucleotide encoding a SNARE protein and a polynucleotide encoding a polypeptide having a function equivalent to that of the SNARE protein.
  • Specific examples of polynucleotides encoding polypeptides having functions equivalent to SNARE proteins include (g) to (k) and (m) to (o) below, or (g) and (h) below, (j), (k) and (m)-(o) polynucleotides.
  • polynucleotides encoding VAMP7 include the following.
  • (g) consists of a nucleotide sequence having at least 80% identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, has a transmembrane domain, and is localized in intracellular vesicles (e.g., late endosomes or lysosomes) or exosomes;
  • a polynucleotide encoding a polypeptide capable of (h) consists of a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted, added, or inserted with respect to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and has a transmembrane domain, and intracellular vesicles (e.g.
  • late endosomes or lysosomes or a polypeptide that can be localized in exosomes
  • (O) is a fragment of any of the polypeptides (l) to (n) above, has a transmembrane domain, and can be localized in intracellular vesicles (e.g., late endosomes or lysosomes) or exosomes
  • polynucleotides encoding GOSR2 include the following.
  • (h) consists of a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted, added, or inserted with respect to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and has a transmembrane domain, intracellular vesicles (e.g.
  • endoplasmic reticulum-Golgi intermediate interval or Golgi or a polynucleotide encoding a polypeptide capable of localizing in exosomes
  • endoplasmic reticulum-Golgi intermediate interval or Golgi or a polypeptide that can be localized in exosomes;
  • polynucleotides encoding STX10 include the following.
  • (g) consists of a nucleotide sequence having at least 80% identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, has a transmembrane domain, and can be localized in intracellular vesicles (e.g., trans-Golgi network) or exosomes
  • a polynucleotide encoding a polypeptide capable of (h) consists of a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted, added, or inserted with respect to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, and has a transmembrane domain, intracellular vesicles (e.g.
  • trans-Golgi network or a polypeptide capable of localizing in exosomes
  • (O) is a fragment of any of the polypeptides of (l) to (n) above, has a transmembrane domain, and can be localized in intracellular vesicles (e.g., trans-Golgi network) or exosomes
  • polynucleotides encoding STX18 include the following.
  • (h) consists of a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted, added, or inserted with respect to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, and has a transmembrane domain, intracellular vesicles (e.g.
  • polypeptide that is a fragment of any of the polypeptides of (l) to (n) above, has a transmembrane domain, and can be localized in intracellular vesicles (e.g., endoplasmic reticulum) or exosomes
  • a polynucleotide that encodes a peptide is a fragment of any of the polypeptides of (l) to (n) above, has a transmembrane domain, and can be localized in intracellular vesicles (e.g., endoplasmic reticulum) or exosomes.
  • polynucleotides encoding BNIP1 include the following.
  • (h) consists of a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted, added, or inserted with respect to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, and has a transmembrane domain, intracellular vesicles (e.g.
  • endoplasmic reticulum or exosomes, encoding a polypeptide
  • polynucleotides encoding STX7 include the following.
  • (g) consists of a nucleotide sequence having at least 80% identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 and has a transmembrane domain and is localized in intracellular vesicles (e.g., early endosomes or late endosomes) or exosomes a polynucleotide encoding a polypeptide capable of;
  • (h) consists of a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted, added, or inserted with respect to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6, and has a transmembrane domain, intracellular vesicles (e.g.
  • an intracellular vesicle e.g., early endosome or late endosome
  • a polynucleotide encoding a polypeptide capable of localizing in exosomes is a fragment of the
  • (O) is a fragment of any of the polypeptides of (l) to (n) above, has a transmembrane domain, and is localized in intracellular vesicles (e.g., early endosomes or late endosomes) or exosomes
  • polynucleotides encoding VTI1A include the following.
  • a polynucleotide encoding a polypeptide capable of (h) consists of a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted, added, or inserted with respect to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, and has a transmembrane domain, intracellular vesicles (e.g.
  • trans-Golgi network or a polypeptide capable of localizing in exosomes
  • (O) is a fragment of any of the polypeptides of (l) to (n) above, has a transmembrane domain, and can be localized in intracellular vesicles (e.g., trans-Golgi network) or exosomes
  • polynucleotides encoding STX16 include the following.
  • (g) consists of a nucleotide sequence having at least 80% identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8, has a transmembrane domain, and can be localized in intracellular vesicles (e.g., trans-Golgi network) or exosomes
  • a polynucleotide encoding a polypeptide capable of (h) consists of a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted, added, or inserted with respect to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8, and has a transmembrane domain, intracellular vesicles (e.g.
  • (k) is a fragment of the polynucleo
  • trans-Golgi network or a polypeptide capable of localizing in exosomes
  • (O) is a fragment of any of the polypeptides of (l) to (n) above, has a transmembrane domain, and can be localized in intracellular vesicles (e.g., trans-Golgi network) or exosomes
  • polynucleotides encoding STX5 include the following.
  • (h) consists of a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted, added, or inserted with respect to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, and has a transmembrane domain, intracellular vesicles (e.g.
  • Golgi apparatus or a polypeptide capable of localizing to exosomes
  • (O) a fragment of any of the polypeptides of (l) to (n) above and having a transmembrane domain and capable of localizing in intracellular vesicles (e.g., Golgi apparatus) or exosomes
  • polynucleotides encoding GOSR1 include the following.
  • (h) consists of a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted, added, or inserted with respect to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 71, and has a transmembrane domain, intracellular vesicles (e.g.
  • (O) is a fragment of any of the polypeptides of (l) to (n) above, has a transmembrane domain, and is localized in intracellular vesicles (e.g., Golgi apparatus or trans-Golgi network) or exosomes
  • polynucleotides encoding STX8 include the following.
  • (g) consists of a nucleotide sequence having at least 80% identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 72 and has a transmembrane domain and is localized in intracellular vesicles (e.g., early endosomes or late endosomes) or exosomes a polynucleotide encoding a polypeptide capable of;
  • (h) consists of a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted, added, or inserted with respect to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 72, and has a transmembrane domain, intracellular vesicles (e.g.
  • (O) is a fragment of any of the polypeptides of (l) to (n) above, has a transmembrane domain, and is localized in intracellular vesicles (e.g., early endosomes or late endosomes) or exosomes
  • polynucleotides encoding STX12 include the following. (f) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO:73; (g) consisting of a nucleotide sequence having at least 80% identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 73 and having a transmembrane domain, an intracellular vesicle (e.g.
  • a polynucleotide encoding a polypeptide capable of localizing in a (h) consists of a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted, added, or inserted with respect to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 73, and has a transmembrane domain, intracellular vesicles (e.g.
  • polynucleotides encoding VAMP8 include the following.
  • (h) consists of a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted, added, or inserted with respect to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 74, and has a transmembrane domain, intracellular vesicles (e.g.
  • lysosomes, early endosomes or late endosomes hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 74, has a transmembrane domain, and contains intracellular vesicles (e.g., lysosomes, early endosomes or late a polynucleotide encoding a polypeptide capable of localizing to endosomes) or exosomes; (k) is a fragment of the polynucleotide of any of (f)-(h) and (j) above and has a transmembrane domain and is an intracellular vesicle (e.g., lysosome, early endosome or late endosome); or a polynucleotide encoding a polypeptide capable of localizing in exosomes; (l) a polynucleo
  • lysosomes, early endosomes or late endosomes or a polypeptide that can be localized in exosomes
  • (O) is a fragment of any of the polypeptides of (l) to (n) above, has a transmembrane domain, and is localized in intracellular vesicles (e.g., lysosomes, early endosomes, or late endosomes) or exosomes
  • Polynucleotides encoding SEC22B specifically include the following.
  • endoplasmic reticulum endoplasmic reticulum-Golgi intermediate interval, Golgi apparatus, cis-Golgi network or trans-Golgi network
  • a polynucleotide encoding a polypeptide capable of localizing in exosomes
  • (j) hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 75, has a transmembrane domain, and has an intracellular vesicle (e.g., endoplasmic reticulum, endoplasmic reticulum- a polynucleotide encoding a polypeptide capable of localizing to the intermediate Golgi, Golgi, cis-Golgi network or trans-Golgi network) or exosomes; (k) is a fragment of the polynucleotide of any one of (f) to (h) and (j
  • endoplasmic reticulum endoplasmic reticulum-Golgi intermediate interval, Golgi apparatus, cis-Golgi network or trans-Golgi network
  • polypeptide that can be localized in exosomes
  • (O) is a fragment of the polypeptide of any one of (l) to (n) above, has a transmembrane domain, and contains an intracellular vesicle (e.g., endoplasmic reticulum, endoplasmic reticulum-Golgi intermediate interval, Golgi apparatus) , cis-Golgi network or trans-Golgi network) or a polypeptide capable of localizing to exosomes.
  • intracellular vesicle e.g., endoplasmic reticulum, endoplasmic reticulum-Golgi intermediate interval, Golgi apparatus
  • cis-Golgi network or trans-Golgi network a polypeptide capable of local
  • the method for obtaining the polynucleotide encoding the SNARE protein of the present invention is not particularly limited, and it can be obtained by a conventional chemical synthesis method or genetic engineering method.
  • a polynucleotide encoding a SNARE protein can be artificially synthesized based on the nucleotide sequences of any of SEQ ID NOs: 1-9 and 71-75.
  • a commercially available DNA synthesis service provided by GenScript, etc. can be used.
  • SEQ ID NOS: 1-9 and 71-75 Any nucleotide sequence can be cloned.
  • Polynucleotides encoding SNARE proteins of the present invention can also be produced by introducing mutations into DNA consisting of the nucleotide sequences of any of SEQ ID NOs: 1-9 and 71-75, for example.
  • Techniques for mutagenesis include, for example, ultraviolet irradiation and site-directed mutagenesis.
  • Techniques for site-directed mutagenesis include methods using Splicing overlap extension (SOE) PCR (Horton et al., Gene, 77, 61-68, 1989), ODA method (Hashimoto-Gotoh et al., Gene, 152, 271-276, 1995), Kunkel method (Kunkel, TA, Proc. Natl. Acad. Sci.
  • SOE Splicing overlap extension
  • polynucleotides encoding the SNARE proteins of the present invention can be obtained by selecting mutagenized DNAs that have transmembrane domains and can localize to intracellular vesicles.
  • Whether or not the polypeptide encoded by the mutated DNA has a transmembrane domain can be determined, for example, by SOSUI (Hirokawa et al., Bioinformatics, 14(4)) based on the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the DNA. :378-379, 1998), TMHMM (Krogh et al., J Mol Biol. 305(3):567-580, 2001).
  • nucleotide sequences are described, for example, in Dieffenbach et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 581-621, 1995).
  • the polynucleotide encoding the SNARE protein of the present invention can be obtained by using artificial DNA nucleases or programmable nucleases, for example, DNA consisting of the nucleotide sequences of any one of SEQ ID NOS: 1-9 and 71-75. It can also be obtained by subjecting it to genome editing.
  • Any antigen can be used in the present invention.
  • Specific examples include cancer antigens, autoantigens, infectious disease antigens, allergens, and the like.
  • a cancer antigen is a marker for distinguishing cancer cells from normal cells when the immune system attacks cancer, and is expressed in cancer cells but not in normal cells. It means a protein or a peptide derived from a protein that is not expressed or expressed in a small amount even if it is expressed.
  • Cancer antigens include, but are not limited to, MAGEA1-4, NY-ESO-1, PRAME, SSX2, CT83, CD19, GP100, MART1, PSA, PSMA, tyrosinase, WT1, HER2, MUC1, CEA, survivin, cyclin B1, EGFR, mesothelin, telomerase, MUC1T, LSP1, BCR-ABL1, HRAS, proteins commonly found in cancer patients such as KRAS or peptides derived from them, newly generated due to gene mutation in cancer cells and neoantigens, which are cancer antigens and are considered to be highly immunogenic.
  • WT1, neoantigens, or peptides derived therefrom are preferred as cancer antigens, and WT1 or peptides derived therefrom are more preferred.
  • an autoantigen is a protein that induces an autoimmune reaction in a host and causes an autoimmune disease although it is originally a normal body constituent, or a peptide derived therefrom, or a specific disease cause in the host. It means a target protein or a peptide derived from it that is expected to treat a disease by artificially inducing an immune response against the antigen.
  • Autoantigens that cause autoimmune diseases are not particularly limited, but for type I diabetes, for example, Carboxypeptidase H, Chromogranin A, Glutamate decarboxylase, Imogen-38, Insulin, Insulinoma antigen-2, Insulinoma antigen-2B, Islet Proteins such as specific glucose-6-phosphatase catalytic subunit related protein and proinsulin or peptides derived therefrom, and in multiple sclerosis, ⁇ -enolase, aquaporin-4, ⁇ -arrestin, Myelin basic protein, Myelin oligolytic, Proteins such as proteolipid protein and S100- ⁇ , or peptides derived therefrom, and rheumatoid arthritis include proteins such as Citrullinated protein, Collagen II, Heat shock proteins, Human cartilage glycoprotein 39, and peptides derived therefrom. ⁇ La antigen ⁇ histone proteins ⁇ Ribonucleoproteins ⁇ Phospholipid- ⁇ -2 glycoprotein I complex ⁇ Poly (A
  • Myelin oligodendrotic glycoprotein or a peptide derived therefrom is preferable as the autoantigen.
  • Autoantigens that serve as targets for artificially inducing an immune response include proteins such as Amyloid ⁇ and Tau protein or peptides derived therefrom in Alzheimer's disease, and proteins such as ⁇ sinuclein or such in Parkinson's disease.
  • Peptides derived from arteriosclerosis include proteins such as cholesterol ester transfer protein, ApoB-100, protein convertase subtilisin/kexin type 9, and heat shock protein 60, or peptides derived therefrom.
  • RNKL receptor activator of NF-kappaB ligand
  • infectious disease antigens include antigens derived from infectious disease-causing viruses, bacteria, fungi and protozoa.
  • a viral antigen means a protein that constitutes a virus or a peptide derived therefrom.
  • Viral antigens include, but are not limited to, influenza virus, coronavirus, respiratory syncytial virus, adenovirus, poliovirus, coxsackievirus, echovirus, Japanese encephalitis virus, herpes virus, mumps virus, measles virus, rubella virus, norovirus, and rotavirus.
  • a bacterial antigen means a protein that constitutes a bacterium or a peptide derived therefrom.
  • Bacterial antigens include, but are not limited to, pertussis, diphtheria, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter, meningococcus, pseudomonas aeruginosa, pneumococcus, group A streptococcus, group B streptococcus, Staphylococcus aureus, and tetanus. Constituent proteins of bacteria such as bacteria, Legionella, tubercle bacillus, and mycoplasma, or peptides derived therefrom.
  • a fungal antigen means a protein that constitutes a fungus or its spores, or a peptide derived therefrom.
  • fungal antigens include fungi of the genus Aspergillus (e.g., Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus terreus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus ustus, etc.), fungi of the genus Blastomyces (e.g., Blastomyces dermatitidis), fungi of the genus Candida (e.g., Candida albicans, etc.). ), fungi of the genus Coccidioides (e.g. Coccidiodes immitis etc.), fungi of the genus Cryptococcus (e.g.
  • Aspergillus e.g., Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus terreus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus ustus
  • a protozoan antigen means a protein that constitutes a protozoan or a peptide derived therefrom.
  • Protozoan antigens include constituent proteins of protozoa such as Plasmodium, Leishmania, Cryptosporidium, Trypanosoma Gambia, Trypanosoma Rhodesia, Trypanosoma cruzi, Trichomonas, Toxoplasma, Babesia, Entamoeba histolytica, and Giardia, or peptides derived therefrom.
  • bacterial antigens, fungal antigens, or protozoan antigens are preferred as infectious disease antigens.
  • an allergen means a protein or a peptide derived therefrom that enters the body from the outside through inhalation, puncture, ingestion, or contact and causes a hypersensitivity reaction or an allergic reaction.
  • allergens include, but are not limited to, gramineous plant pollens (reeds, giant rockagaeri, giant sparrow, daffodil, sycamore, wheat, redwort, common millet, corn sorghum, long-legged grass, ragweed, broad-leaved fescue, mulberry, etc.); weed pollen (goldenia, Stinging nettle, giant ragweed, seagrass, white dandelion, wormwood, lesser sorrel, ragweed, ragweed, daisy, pear plantain, mugwort, etc.); cedar, cypress, juniper, beech, pine, willow, etc.); Penicillium, Helminthsporium, Malassezia, Mu
  • antigens include glutenin, gliadin protein, or peptides derived from gluten that constitutes gluten that causes celiac disease.
  • the method for obtaining the polynucleotide encoding the antigen of the present invention is not particularly limited, and it may be obtained by a conventional chemical synthesis method or genetic engineering method in the same manner as in the case of obtaining the polynucleotide encoding the SNARE protein described above. can be done.
  • a polynucleotide encoding an antigen may be a polynucleotide encoding the full-length antigen, or may be a polynucleotide encoding a partial polypeptide of the antigen as long as it functions as an antigen.
  • it may be a polynucleotide in which a plurality of polynucleotides encoding one antigen are linked so that they can be continuously expressed, or a polynucleotide in which polynucleotides encoding two or more antigens are linked so that they can be expressed.
  • At least one type of antigen is used in the nucleic acid construct of the present invention, and preferably 5 or less types, more preferably 3 or less types, and still more preferably 2 or less types.
  • 5, 4, 3, 2 or 1 antigens may be used in the nucleic acid construct of the present invention.
  • the nucleic acid construct of the present invention is a nucleic acid construct in which a polynucleotide encoding an antigen is linked downstream of a polynucleotide encoding a SNARE protein in an expressible manner, more preferably a polynucleotide encoding a SNARE protein.
  • nucleic acid construct in which a polynucleotide encoding an antigen downstream is linked so as to be expressible via a polynucleotide encoding a linker and/or a polynucleotide encoding a recognition sequence for a protein convertase, and more preferably , a nucleic acid construct in which a polynucleotide encoding an antigen is expressably linked downstream of a polynucleotide encoding a SNARE protein via a polynucleotide encoding a linker and a polynucleotide encoding a proprotein convertase recognition sequence.
  • the order of ligation is not particularly limited, and the proprotein convertase is downstream of the polynucleotide encoding the linker.
  • a polynucleotide encoding a recognition sequence may be ligated, or a polynucleotide encoding a linker may be ligated downstream of a polynucleotide encoding a proprotein convertase recognition sequence.
  • a sequence in which the proprotein convertase recognition sequence is repeated about 1 to 5 times may be linked, or a poly encoding the proprotein convertase recognition sequence sandwiched between multiple polynucleotides encoding linkers. Nucleotides may be linked.
  • a polynucleotide encoding a linker and a polynucleotide encoding a proprotein convertase recognition sequence should be placed between the polynucleotide encoding the SNARE protein and the polynucleotide encoding the antigen, as long as they do not impair the expression of both. Any polynucleotide may be included.
  • a linker refers to a peptide linker that connects two polypeptides.
  • the linker is not particularly limited as long as it allows the SNARE protein and the antigen to function normally.
  • the length of the linker is preferably 3 amino acid residues or more, more preferably 4 amino acid residues or more, still more preferably 5 amino acid residues or more, and preferably 30 amino acid residues or less, more preferably 25 amino acid residues. group or less, more preferably 20 amino acid residues or less.
  • the length of the linker is preferably 3 to 30 amino acid residues, more preferably 4 to 25 amino acid residues, still more preferably 5 to 20 amino acid residues.
  • Such linkers include linkers having G, GS, GGS, GGGS (SEQ ID NO:92), GGGGS (SEQ ID NO:93), EAAAK (SEQ ID NO:94), or XP as constituents.
  • X indicates any amino acid residue.
  • Specific examples include a linker consisting of a sequence in which each component is repeated 1 to 5 times, preferably 3 or 4 times, and a preferred specific example is a linker consisting of a sequence in which GGGGS is repeated 3 times. (SEQ ID NO: 20). If the sequence component is GGGGS, the amino acid residue S may be added before the repeat sequence, or if it is EAAAK, the amino acid residue A may be added before and after the repeat sequence.
  • the proprotein convertase recognition sequence refers to an amino acid sequence recognized by proprotein convertase, which is a serine protease that converts a proprotein into a physiologically active protein or peptide in the Golgi apparatus.
  • proprotein convertase which is a serine protease that converts a proprotein into a physiologically active protein or peptide in the Golgi apparatus.
  • X indicates any amino acid residue.
  • Proprotein convertases include furin, PC2, PC4, PC5/6, PC7, PACE4 and the like, and these enzymes commonly recognize the Arg-X-(Arg/Lys)-Arg motif well. known (Remacle AG, et al.
  • the proprotein convertase recognition sequence can be Arg-X-(Arg/Lys)-Arg.
  • X indicates any amino acid residue.
  • Proprotein convertase recognizes the above amino acid sequence and cleaves the C-terminal side of the C-terminal arginine residue.
  • the proprotein convertase is preferably furin, and the furin recognition sequence is the same as the proprotein convertase recognition sequence described above.
  • the method for obtaining the polynucleotide encoding the linker or the polynucleotide encoding the proprotein convertase recognition sequence is not particularly limited, and can be obtained by conventional chemical synthesis methods or genetic engineering techniques.
  • a polynucleotide encoding a SNARE protein, a polynucleotide encoding an antigen, a polynucleotide encoding a linker, or a polynucleotide encoding a proprotein convertase recognition sequence contained in the nucleic acid construct of the present invention may optionally be It may be codon-optimized for the species to which the construct is to be administered. Information on codons used by various organisms is available from the Codon Usage Database ([www.kazusa.or.jp/codon/]).
  • the nucleic acid construct of the present invention is an expression cassette and includes control regions for controlling the expression of a polynucleotide encoding a SNARE protein and a polynucleotide encoding an antigen.
  • the SNARE protein-encoding polynucleotide and the antigen-encoding polynucleotide are operably linked to regulatory regions. Examples of regulatory regions include promoters, terminators, enhancers, and the like.
  • the expression cassette comprises a promoter linked upstream of the SNARE protein-encoding polynucleotide and the antigen-encoding polynucleotide.
  • the nucleic acid construct of the present invention can have restriction enzyme recognition sites at one or both ends.
  • the restriction enzyme recognition site can be used to introduce the nucleic acid construct of the present invention into a vector.
  • a vector can be cleaved with a restriction enzyme, and the nucleic acid construct of the present invention having restriction enzyme recognition sites at its ends can be added thereto to introduce the nucleic acid construct into the vector.
  • the type of vector is not particularly limited, and may be any vector such as a plasmid vector, phage, phagemid, cosmid, or virus vector.
  • the vector into which the nucleic acid construct of the invention is to be integrated can be an expression vector, whereas if the nucleic acid construct to be integrated is an expression cassette, it need not be an expression vector.
  • the nucleic acid construct of the present invention is an expression cassette containing control regions and incorporated into any vector to construct an expression vector.
  • the nucleic acid construct of the present invention is incorporated into an expression vector containing a control region to construct the expression cassette of the present invention on the expression vector.
  • the nucleic acid construct of the present invention is a plasmid vector.
  • Plasmid vectors include, but are not limited to, plasmid vectors such as pVAX1.
  • a plasmid vector generally has a drug resistance gene incorporated within its sequence for the purpose of selectively retaining the plasmid vector during bacterial culture. and the activation and expression of the gene via mammalian promoters, a plasmid vector from which the gene sequence has been removed is more preferable.
  • the nucleic acid construct of the present invention is a viral vector.
  • Viral vectors include, but are not limited to, adenoviral vectors, adeno-associated viral vectors, lentiviral vectors, retroviral vectors, Sendai viral vectors, herpes viral vectors, and the like.
  • the nucleic acid construct of the invention is an mRNA construct.
  • mRNA construct For example, HiScribe T7 ARCA mRNA Kit (New England Biolabs), T7 mScript TM Standard mRNA Production System (CELLSCRIPT), and HighYield T7 SARCA mRNA using a DNA containing a polynucleotide encoding a SNARE protein and a polynucleotide encoding an antigen as templates.
  • the nucleic acid construct of the present invention can be obtained as mRNA by using a commercially available in vitro transcription kit such as Kit (Jena Bioscience).
  • a nucleic acid construct comprising a polynucleotide encoding a SNARE protein of the present invention and a polynucleotide encoding an antigen is immunogenic compared to a nucleic acid construct comprising only an antigen-encoding polynucleotide. It is highly potent and can induce or enhance an antigen-specific Th1-type immune response and induce or enhance an antigen-specific cellular immune response. This is because a nucleic acid construct taken up into cells is translated or transcribed and translated, expressed as an antigen protein, transported to intracellular vesicles, and a portion of the antigen binds to major histocompatibility complex (MHC) molecules.
  • MHC major histocompatibility complex
  • the nucleic acid construct of the present invention expresses the antigen protein as a fusion polypeptide of the SNARE protein and the antigen, thereby targeting the antigen protein to intracellular vesicles. It is presumed that the efficiency of antigen presentation was improved by increasing the probability of association with the MHC molecule. In addition, it has been reported that antigen-containing exosomes enhance antigen-specific Th1-type immune responses in vivo (Qazi KR, et al. Blood. 2009, 113(12): 2673-83 .). Therefore, by expressing the antigen protein as a fusion polypeptide of the SNARE protein and the antigen, it is possible that the antigen protein is targeted to exosomes and immunogenicity is improved.
  • the production amount of cytokines such as IFN ⁇ and IL-4 which can serve as indicators for determining whether the immune response is Th1-type or Th2-type, or whether it is a cell-mediated immune response or a humoral immune response.
  • cytokines such as IFN ⁇ and IL-4
  • a conventionally known method include, for example, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), ELISPOT (enzyme-linked immunosorbent spot) assay, immunohistochemical staining, in situ hybridization, RT-PCR, microarray, flow cytometry and the like.
  • Reagents and kits for measuring cytokine production such as the ELISPOT assay kit (C.T.L.) used in the examples below, are commercially available and may be used for measurement.
  • the production amount of each IgG subclass which can be another indicator for determining whether the immune response is Th1 type or Th2 type, or whether it is a cell-mediated immune response or a humoral immune response, It can be measured by a conventionally known method. Such methods include ELISA, immunoturbidimetry, and the like.
  • a Th1-type immune response and a cell-mediated immune response can be evaluated using the amount of cytokine production and/or the amount of IgG subclass production as an index. For example, if the production amount of IFN ⁇ or the ratio of IFN ⁇ production to IL-4 (IFN ⁇ /IL-4) increases, it can be evaluated that a Th1-type immune response and a cellular immune response are induced or enhanced.
  • the amount of production or IFN ⁇ /IL-4 decreases, it can be evaluated that the Th1-type immune response and cell-mediated immune response are attenuated.
  • the production amount of IgG2a and / or the production amount ratio of IgG2a to IgG1 increases, it can be evaluated that the Th1 type immune response and cellular immune response are induced or enhanced, while the production amount of IgG2a And/or if IgG2a/IgG1 is decreased, it can be evaluated that Th1-type immune response and cell-mediated immune response are attenuated.
  • the nucleic acid construct of the present invention can be an antigen-specific IFN ⁇ production enhancer, an IgG2a production enhancer, a Th1-type immune response inducer or enhancer, a cell-mediated immune response inducer or enhancer (hereinafter referred to as a cell-mediated immune response inducer or enhancer). agent, etc.), and the nucleic acid construct can be used to produce a cell-mediated immune response-inducing or enhancing agent, or the like.
  • the nucleic acid construct of the present invention can be used to enhance antigen-specific IFN ⁇ production, enhance IgG2a production, induce or enhance Th1-type immune response, or induce or enhance cellular immune response. can.
  • Non-therapeutic is a concept that does not include medical practice, that is, a concept that does not include methods of surgery, treatment, or diagnosis of humans, more specifically, a doctor or a person who receives instructions from a doctor It is a concept that does not include methods of performing surgery, therapy, or diagnosis.
  • the cell-mediated immune response inducer or enhancer, etc. of the present invention per se can be used for antigen-specific IFN ⁇ production enhancement, IgG2a production enhancement, Th1-type immune response induction or enhancement, cellular immune response induction or It can be a drug or quasi-drug for enhancement, or can be a material or preparation used by being blended with the drug or quasi-drug.
  • the pharmaceutical can be administered in any dosage form.
  • Dosage forms include, for example, oral administration such as tablets, capsules, granules, powders, and syrups, and parenteral administration such as injections, suppositories, inhalants, percutaneous absorption agents, and external preparations. is parenteral administration, more preferably parenteral administration by injection.
  • Pharmaceutical formulations of such various dosage forms may contain the nucleic acid construct of the present invention and other pharmaceutically acceptable excipients, binders, fillers, disintegrants, diluents, thickeners, emulsifiers and lubricants.
  • agents dispersants, coating agents, surfactants, coating agents, osmotic pressure adjusters, buffers, pH adjusters, preservatives, stabilizers, antioxidants, coloring agents, flavoring agents, corrigents, fragrances, etc. They can be prepared by appropriately combining them.
  • the content of the nucleic acid construct of the present invention in the above-mentioned pharmaceuticals varies depending on the target antigen, the subject to be administered, and the route of administration, so it is not particularly limited and can be appropriately selected from a wide range.
  • the composition may contain between 0.00001 and 100% by weight of the nucleic acid construct.
  • the dosage of the cell-mediated immune response inducer or enhancer, etc. of the present invention may vary according to the subject's species, body weight, sex, age, condition or other factors.
  • the dose, route, and interval of administration can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • the dosage is determined as the amount of the nucleic acid construct of the present invention between 1 ng and 10 mg per adult (60 kg body weight) per day.
  • the nucleic acid construct is a viral vector
  • the dosage can be, for example, 10 to 1 ⁇ 10 15 viral particles per day for an adult (60 kg body weight).
  • the cell-mediated immune response inducer or enhancer of the present invention can be administered to both humans and non-human animals.
  • Non-human animals include non-human mammals, such as apes, other primates, mice, rats, horses, cows, pigs, sheep, dogs, cats, hamsters, and companion animals. is mentioned.
  • the cell-mediated immune response inducer or enhancer, etc. of the present invention are administered to humans. More preferably, the cell-mediated immune response inducer or enhancer, etc. of the present invention is administered to cancer, autoimmune disease, or allergy patients, or to humans at risk of cancer, autoimmune disease, or allergy.
  • nucleic acid construct of the present invention can be a nucleic acid vaccine, and the nucleic acid construct can be used to produce a nucleic acid vaccine.
  • nucleic acid constructs of the present invention can be used to induce or enhance antigen-specific Th1-type immune responses and/or to induce or enhance antigen-specific cellular immune responses.
  • the use may be administration to a human or non-human animal, or use in a specimen derived therefrom, and may be therapeutic or non-therapeutic.
  • the nucleic acid vaccine of the present invention itself serves as a pharmaceutical for inducing or enhancing an antigen-specific Th1-type immune response and/or for inducing or enhancing an antigen-specific cellular immune response. It can be a material or formulation that is used in combination.
  • the nucleic acid vaccine is a DNA vaccine.
  • DNA vaccines include nucleic acid constructs of the invention that are plasmid vectors.
  • plasmid vectors include, but are not limited to, pVAX1 vectors. Among them, a plasmid vector containing no drug resistance gene is preferable from the viewpoint of safety.
  • the nucleic acid vaccine is an mRNA vaccine.
  • the mRNA vaccine contains the nucleic acid construct of the present invention which is mRNA, and the nucleic acid construct is mRNA treated to add a Cap structure or polyA in order to stabilize the mRNA, improve the translation efficiency, or prevent an excessive immune response. and/or may be an mRNA in which some bases are modified (for example, uridine is replaced with pseudouridine or 1-methylpseudouridine).
  • RNA containing the nucleic acid construct of the present invention and containing the sequence of the virus-derived RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) complex and its replication origin (5'CSE, 3'CSE), the nucleic acid construct of the present invention and Trans-amplifying RNA may be a mixture of RNA containing the replication origin of the RdRP complex and mRNA containing the sequence of the RdRP complex.
  • the mRNA vaccine preferably uses drug delivery such as liposomes or lipid nanoparticles containing lipid as a carrier for stabilizing and delivering mRNA, or polymeric nanoparticles such as PLGA nanoparticles containing high molecular weight polymers. It further comprises a bearing construct, more preferably the mRNA is enclosed in said construct.
  • the nucleic acid vaccine is a viral vector vaccine.
  • a viral vector vaccine comprises a nucleic acid construct of the invention that is a viral vector.
  • viral vectors include, but are not limited to, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, lentivirus vectors, retrovirus vectors, Sendai virus vectors, herpes virus vectors, and the like.
  • the nucleic acid vaccine of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier as appropriate in addition to the above nucleic acid construct and be formulated in a predetermined form.
  • the carrier includes carriers commonly used in the production of vaccines, specifically buffers, emulsifiers, preservatives (e.g., thimerosal), tonicity agents, pH adjusters, thickening agents, Examples include adjuvants or immunostimulators.
  • An adjuvant is a substance that enhances an immune response to an antigen when administered together with an antigen. Since the nucleic acid vaccine of the present invention itself can function as an adjuvant, the addition of an adjuvant is not necessarily required.
  • the composition may be adjuvant-free.
  • the nucleic acid vaccine of the present invention is preferably in liquid form and is appropriately formulated to be compatible with the intended route of administration.
  • the route of administration includes oral administration and parenteral administration, and includes, for example, intramuscular, intradermal, subcutaneous, transdermal, intranasal, sublingual, oral, inhalation and the like, preferably intramuscular, intradermal, or Subcutaneous administration.
  • Injectable preparations include, for example, liquids, emulsions, water-soluble or hydrophobic suspensions, and dry powders that are dissolved or suspended in a liquid and used.
  • the nucleic acid vaccine of the present invention can be administered as dendritic cells introduced with the nucleic acid vaccine of the present invention.
  • such administration involves collecting peripheral blood from a living body to be administered, separating dendritic cell progenitor cells, and inducing the differentiation of dendritic cells from the progenitor cells in the presence of appropriate cytokines. can be performed by introducing the nucleic acid vaccine of , causing dendritic cells to present an antigen, and administering the dendritic cells to the administration subject.
  • the dendritic cells to be administered are so-called dendritic cell vaccines.
  • Dendritic cell vaccines can improve the efficiency of antigen presentation and enhance the ability to induce immunity.
  • the content of the nucleic acid construct of the present invention in the nucleic acid vaccine of the present invention varies depending on the target antigen, the subject to be administered, and the route of administration, so it is not particularly limited and can be appropriately selected in a wide range.
  • the nucleic acid construct may be included between 0.00001 and 100% by mass of the total nucleic acid vaccine.
  • the dosage of the nucleic acid vaccines of the invention may vary according to the subject's species, weight, sex, age, condition or other factors.
  • the dose, route, and interval of administration can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • dosage is determined between 1 ng and 10 mg per dosage unit as the amount of the nucleic acid construct of the present invention.
  • the nucleic acid construct is a viral vector
  • the dosage can be, by way of example, 10-1 ⁇ 10 15 viral particles per dosage unit.
  • the nucleic acid vaccine of the present invention can be administered to both humans and non-human animals. Examples of non-human animals include those similar to those described above.
  • the nucleic acid vaccines of the invention are administered to humans. More preferably, the nucleic acid vaccines of the present invention are administered to patients with cancer, autoimmune diseases, or allergies, or to humans at risk of cancer, autoimmune diseases, or allergies.
  • the number of times of administration of the nucleic acid vaccine of the present invention may be appropriately set according to the application, and is at least once, but may be twice or more from the viewpoint of efficacy. Further administration is sometimes referred to as boosting and can provide more effective protection against infection or therapeutic effect. A booster interval of at least one week is recommended, with intervals of one to four weeks being preferred.
  • nucleic acid vaccines are not pathogenic and are considered to be safer than live and inactivated vaccines.
  • nucleic acid encoding the antigen it is possible to deal with a wide variety of antigens, and since it is a nucleic acid, it can be produced rapidly at a low cost.
  • the nucleic acid vaccine of the present invention is a cancer vaccine.
  • the cancer vaccine comprises a nucleic acid construct comprising a polynucleotide encoding the SNARE protein of the present invention and a polynucleotide encoding a cancer antigen as an antigen.
  • the cancer vaccine may be administered to a living body as it is, or may be administered as a dendritic cell vaccine. Such cancer vaccines are believed to induce or enhance cancer antigen-specific cellular immune responses and exert antitumor effects.
  • the nucleic acid vaccine of the present invention is an infectious disease vaccine.
  • the infectious disease vaccine comprises a nucleic acid construct comprising a polynucleotide encoding a SNARE protein of the present invention and a polynucleotide encoding a viral, bacterial, fungal or protozoal antigen as an antigen.
  • the infectious disease vaccine may be directly administered to a living body. It is believed that such infectious disease vaccines can exert preventive or therapeutic effects against infectious diseases by inducing or enhancing cell-mediated immune responses specific to viral antigens, bacterial antigens, fungal antigens, or protozoan antigens.
  • HIV human immunodeficiency virus
  • HBV hepatitis B virus
  • HCV hepatitis C virus
  • tuberculosis tuberculosis, etc.
  • the nucleic acid vaccine of the present invention is an allergy preventive or therapeutic vaccine, preferably an allergy immunotherapy vaccine.
  • the allergy preventive or therapeutic vaccine comprises a nucleic acid construct comprising a polynucleotide encoding the SNARE protein of the present invention and a polynucleotide encoding an allergen as an antigen.
  • the allergy preventive or therapeutic vaccine may be directly administered to a living body.
  • Such an allergy preventive or therapeutic vaccine induces or enhances allergen-specific Th1-type immune response and cell-mediated immune response, thereby exerting a suppressive effect on allergic response caused by excessive activation of Th2-type immune response. It is possible.
  • the nucleic acid vaccine of the present invention is a therapeutic vaccine for autoimmune diseases.
  • the autoimmune disease therapeutic vaccine comprises a nucleic acid construct comprising a polynucleotide encoding the SNARE protein of the present invention and a polynucleotide encoding an autoantigen as an antigen.
  • the autoimmune disease therapeutic vaccine may be directly administered to a living body.
  • Such therapeutic vaccines for autoimmune diseases are thought to be capable of exerting a suppressive effect on autoimmune reactions by inducing immune tolerance against the encoded autoantigens.
  • the polynucleotide encoding the SNARE protein and the polynucleotide encoding the antigen are a polynucleotide encoding a linker and/or a polynucleotide encoding a proprotein convertase recognition sequence, preferably a polynucleotide encoding a linker and the nucleic acid construct of [1] or [2] linked via a polynucleotide encoding a proprotein convertase recognition sequence.
  • the proprotein convertase recognition sequence is an amino acid sequence consisting of Arg-X-(Arg/Lys)-Arg (X represents any amino acid residue), preferably X-Arg-X-
  • the antigen is at least one selected from the group consisting of cancer antigens, autoantigens, viral antigens, bacterial antigens, fungal antigens, protozoan antigens and allergens, preferably cancer antigens, autoantigens, At least one selected from the group consisting of viral antigens, bacterial antigens, fungal antigens, and protozoan antigens, more preferably from the group consisting of cancer antigens, autoantigens, bacterial antigens, fungal antigens, and protozoan antigens
  • the nucleic acid construct according to any one of [1] to [5], which is at least one selected.
  • the polynucleotide encoding the SNARE protein is preferably selected from the group consisting of polynucleotides consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1-9 and 71-75, and polynucleotides having functions equivalent to these.
  • the SNARE protein is preferably any selected from the group consisting of VAMP7, GOSR2, STX10, STX18, BNIP1, STX7, VTI1A, STX16, STX5 and GOSR1, more preferably VAMP7, GOSR2 and STX10 , STX18, BNIP1, STX7, VTI1A, and GOSR1, more preferably any selected from the group consisting of VAMP7, GOSR2, STX10, and GOSR1, more preferably VAMP7
  • the nucleic acid construct according to any one of [1] to [8], which is
  • a pharmaceutical composition comprising the nucleic acid construct of any one of [1] to [9].
  • a nucleic acid vaccine comprising the nucleic acid construct of any one of [1] to [9] as an active ingredient.
  • the nucleic acid vaccine of [11] which induces or enhances an antigen-specific Th1-type immune response.
  • the nucleic acid vaccine of [11] which induces or enhances an antigen-specific cellular immune response.
  • the nucleic acid vaccine of any one of [11] to [13] which is a cancer vaccine, and wherein the antigen is at least one selected from the group consisting of cancer antigens.
  • nucleic acid vaccine any one of [11] to [13], which is an infectious disease vaccine, and wherein the antigen is at least one selected from the group consisting of a viral antigen, a bacterial antigen, a fungal antigen and a protozoan antigen; nucleic acid vaccine.
  • nucleic acid construct of any one of [1] to [9] for producing a nucleic acid vaccine.
  • nucleic acid vaccine is a cancer vaccine
  • the antigen is at least one selected from the group consisting of cancer antigens.
  • nucleic acid vaccine is an infectious disease vaccine
  • the antigen is at least one selected from the group consisting of viral antigens, bacterial antigens, fungal antigens and protozoan antigens.
  • nucleic acid vaccine is an allergy preventive or therapeutic vaccine, and the antigen is at least one selected from the group consisting of allergens.
  • nucleic acid vaccine is a vaccine for autoimmune disease treatment, and the antigen is at least one selected from the group consisting of autoantigens.
  • nucleic acid vaccine contains preferably 0.00001 to 100% by mass of the nucleic acid construct.
  • nucleic acid construct of any one of [1] to [9] for induction or enhancement of antigen-specific Th1-type immune response and/or induction or enhancement of antigen-specific cellular immune response .
  • nucleic acid vaccine of any one of [11] to [18] for induction or enhancement of antigen-specific Th1-type immune response and/or induction or enhancement of antigen-specific cellular immune response .
  • a method for treating cancer comprising administering an effective amount of the nucleic acid vaccine of [14] to a subject in need thereof.
  • a method for preventing or treating an infectious disease which comprises administering an effective amount of the nucleic acid vaccine of [15] to a subject in need thereof.
  • a method for preventing or treating allergy which comprises administering an effective amount of the nucleic acid vaccine of [16] to a subject in need thereof.
  • a method for treating an autoimmune disease comprising administering an effective amount of the nucleic acid vaccine of [17] to a subject in need thereof.
  • the dose of the nucleic acid vaccine is preferably 1 ng to 10 mg of the nucleic acid construct per administration unit, and the nucleic acid vaccine is a viral vector.
  • An antigen-specific IFN ⁇ production-enhancing agent comprising the nucleic acid construct of any one of [1] to [9] as an active ingredient.
  • An antigen-specific IgG2a production-enhancing agent comprising the nucleic acid construct of any one of [1] to [9] as an active ingredient.
  • An antigen-specific Th1-type immune response inducer or enhancer comprising the nucleic acid construct of any one of [1] to [9] as an active ingredient.
  • An antigen-specific cellular immune response inducer or enhancer comprising the nucleic acid construct of any one of [1] to [9] as an active ingredient.
  • the agent according to any one of [36] to [39] which preferably contains 0.00001 to 100% by mass of the nucleic acid construct.
  • nucleic acid construct of any one of [1] to [9] for producing an antigen-specific IFN ⁇ production-enhancing agent.
  • nucleic acid construct of any one of [1] to [9] for producing an antigen-specific IgG2a production-enhancing agent.
  • nucleic acid construct of any one of [1] to [9] for producing an antigen-specific Th1-type immune response inducer or enhancer.
  • nucleic acid construct of any one of [1] to [9] for producing an agent for inducing or enhancing an antigen-specific cellular immune response.
  • the use according to any one of [41] to [44], wherein the agent preferably contains 0.00001 to 100% by mass of the nucleic acid construct.
  • nucleic acid construct of any one of [1] to [9] for enhancing antigen-specific IFN ⁇ production.
  • nucleic acid construct of any one of [1] to [9] for use in enhancing antigen-specific IFN ⁇ production.
  • the nucleic acid construct of any one of [1] to [9] for use in inducing or enhancing an antigen-specific cellular immune response.
  • a method for enhancing antigen-specific IFN ⁇ production comprising administering an effective amount of the nucleic acid construct of any one of [1] to [9] to a subject in need thereof.
  • a method for enhancing antigen-specific IgG2a production comprising administering an effective amount of the nucleic acid construct of any one of [1] to [9] to a subject in need thereof.
  • a method of inducing or enhancing an antigen-specific Th1 immune response comprising administering the nucleic acid construct of any one of [1] to [9] to a subject in need thereof in an effective amount.
  • a method for inducing or enhancing an antigen-specific cellular immune response comprising administering an effective amount of the nucleic acid construct of any one of [1] to [9] to a subject in need thereof.
  • the dose of the nucleic acid construct is preferably 1 ng to 10 mg/60 kg body weight per day, and when the nucleic acid construct is a viral vector, preferably 10 to 1 ⁇ 10 15 viral particles per day. /60 kg body weight, the method of any one of [54] to [57].
  • the nucleic acid vaccine is administered orally or parenterally, preferably parenterally.
  • the subject in [27], [30], [35] and [54] to [58], the subject is a patient with cancer, an autoimmune disease, or an allergy, or a risk of cancer, an autoimmune disease, or an allergy It is a person with [61] In [31], the subject is a cancer patient or a human at risk of cancer. [62] In [33], the subject is an allergy sufferer or a human with a risk of allergy. [63] In [34], the subject is an autoimmune disease patient or a human at risk of autoimmune disease.
  • OVA ovalbumin
  • SEQ ID NO: 24 amino acid sequence: SEQ ID NO: 24
  • linker amino acid sequence: SEQ ID NO: 19, amino acid sequence: SEQ ID NO: 20
  • the amino acid sequence of OVA alone was generated.
  • the nucleotide sequence encoding the antigen or fusion polypeptide was codon-optimized and incorporated into plasmid DNA (pVAX1 vector, Thermo Fisher Scientific).
  • the nucleotide sequence of OVA integrated into the plasmid DNA is shown in SEQ ID NO:81, and the nucleotide sequences of the fusion polypeptides are shown in SEQ ID NOS:48-68.
  • SEQ ID NO: 23 shows the nucleotide sequence of OVA before codon optimization.
  • HiScribe T7 ARCA mRNA Kit New England Biolabs
  • in vitro mRNA was synthesized by T7 RNA polymerase using the DNA as a template, and the 5' end was capped by ARCA.
  • 1.0 ⁇ 10 6 cells of human CD4 + T cells (Lonza) derived from the same donor and 2.5 ⁇ 10 5 cells of transfected dendritic cells were co-cultured for a total of 7 days. Antigen presentation of OVA was performed. Thereafter, 1.0 ⁇ 10 6 CD4 + T cells co-cultured on the ELISPOT plate were co-cultured again with 1.0 ⁇ 10 5 cells of human CD14 + dendritic cells derived from the same donor, and 200 ⁇ g/mL OVA Antigen stimulation was performed by adding protein. After 24 hours, an ELISPOT assay was performed using an ELISPOT assay kit (CTL) according to the attached protocol to detect IFN ⁇ -producing CD4 + T cells.
  • CTL ELISPOT assay kit
  • Th1 immune response can be induced or enhanced by introducing a specific SNARE-OVA fusion protein according to the present invention into antigen-presenting cells such as dendritic cells.
  • the Empty (N.T.) group is a control group (Empty) that was not restimulated with the OVA protein.
  • Example 2 IgG, IgG1, IgG2a antibody titers VAMP7 was selected from the SNARE proteins that increased IFN ⁇ production in Example 1, and a fusion polypeptide (V7-OVA) was prepared by linking OVA to the C-terminal side of VAMP7 with a linker.
  • a plasmid vector (pVAX1 vector, Thermo Fisher Scientific) encoding only the amino acid sequence (SEQ ID NO: 25) or the OVA amino acid sequence (SEQ ID NO: 24) was prepared.
  • pVAX1 vector Thermo Fisher Scientific
  • SEQ ID NO: 25 amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 24 OVA amino acid sequence
  • an electroporator (NEPA21, Nepagene Co., Ltd.) was used to apply a voltage for gene transfer.
  • the animals were euthanized on day 35 and blood was collected. Serum was separated from the collected blood and antibody titer was measured.
  • antibody titer measurement 100 ⁇ L/well of a DPBS solution containing 10 ⁇ g/mL OVA (Merck) was added to a 96-well ELISA plate (IWAKI) to immobilize OVA.
  • Example 3 ELISPOT Assay An amino acid sequence of a fusion polypeptide (V7-OVA) in which OVA is linked to the C-terminal side of VAMP7 via a linker, or a plasmid vector (pVAX1 vector, Thermo Fisher Scientific) encoding only the amino acid sequence of OVA was prepared. bottom. An empty vector that does not encode an antigen (OVA) was used as a control. After intramuscularly administering 50 ⁇ g of each prepared vector into the thigh muscle of a female BALB/c mouse, an electroporator (NEPA21) was used to apply a voltage for gene transfer.
  • V7-OVA fusion polypeptide
  • pVAX1 vector Thermo Fisher Scientific
  • mice were euthanized on day 35 and spleens were collected.
  • the harvested spleen was ground on a 40 ⁇ m cell strainer with the addition of DPBS containing 2% FBS.
  • the resulting suspension was centrifuged at 200 xg for 5 minutes, and after removing the supernatant, Pharm Lyse TM solution (BD biosciences) was added and left to stand for 3 minutes to remove red blood cells contained in the suspension. hemolyzed. After centrifuging again at 200 ⁇ g for 5 minutes and removing the supernatant, washing was performed twice with DPBS, and CTL-Test TM Medium (CTL) was added to obtain splenocytes.
  • CTL-Test TM Medium CTL-Test TM Medium
  • a suspension was obtained. 100 ⁇ L/well of 1.0 ⁇ 10 7 cells/mL splenocytes were seeded on an ELISPOT plate and mixed with 100 ⁇ L of CTL-Test Medium containing OVA protein (Merck) to perform antigen stimulation at a final concentration of 50 ⁇ g/mL. rice field. As a negative control, a group (N.T) to which OVA protein was not added was prepared. After 24 hours, an ELISPOT assay was performed using an ELISPOT assay kit (CTL) according to the attached protocol to detect antigen (OVA)-specific IFN ⁇ and IL-4-producing cells. Since the spleen is a secondary lymphoid tissue and its constituent cells, splenocytes, contain abundant T cells, splenocytes were used in this experiment to detect T cells exhibiting antigen-specific immune responses.
  • CTL-Test Medium containing OVA protein (Merck) to perform antigen stimulation at a final concentration of 50 ⁇ g/mL. rice field
  • VAMP7-OVA V7-OVA
  • IL-4 is secreted by Th2 cells
  • IFN ⁇ is known to be secreted by Th1 cells or cytotoxic T cells (CD8 + T cells) involved in cell-mediated immunity.
  • n 10 in each group
  • p ⁇ 0.05 was determined when the Tukey test was performed in each group under non-stimulated conditions (NT) or OVA-stimulated conditions (OVA). was judged to be significant.
  • Example 4 IgG, IgG1, IgG2a antibody titer VAMP7, STX10, STX18, or fusion polypeptide (V7-OVA, STX10-OVA, STX18-OVA, GOSR1-OVA) in which OVA is linked to the C-terminal side of GOSR1 via a linker
  • a plasmid vector (pVAX1 vector, Thermo Fisher Scientific) encoding only the amino acid sequences (SEQ ID NOS: 25, 27, 28, 41) or the OVA amino acid sequence (SEQ ID NO: 24) was prepared.
  • An empty vector that does not encode an antigen (OVA) was used as a control.
  • an electroporator (NEPA21) was used to apply a voltage for gene transfer.
  • the animals were euthanized on day 35 and blood was collected. Serum was separated from the collected blood and antibody titer was measured.
  • antibody titer measurement 100 ⁇ L/well of a DPBS solution containing 10 ⁇ g/mL OVA (Merck) was added to a 96-well ELISA plate (IWAKI) to immobilize OVA.
  • Example 5 ELISPOT assay Amino acid sequences (SEQ ID NO: 25, 27, 28, 41), or a plasmid vector (pVAX1 vector, Thermo Fisher Scientific) encoding only the OVA amino acid sequence (SEQ ID NO: 24).
  • An empty vector that does not encode an antigen (OVA) was used as a control.
  • OVA antigen
  • an electroporator NEPA21 was used to apply a voltage for gene transfer. After the above treatments were performed on days 0, 7, and 14 from the start of the experiment, the mice were euthanized on day 35 and spleens were collected.
  • the harvested spleen was ground on a 40 ⁇ m cell strainer with the addition of DPBS containing 2% FBS.
  • the resulting suspension was centrifuged at 200 xg for 5 minutes, and after removing the supernatant, Pharm Lyse solution (BD biosciences) was added and allowed to stand for 3 minutes to hemolyze red blood cells contained in the suspension. bottom. After centrifuging again at 200 ⁇ g for 5 minutes and removing the supernatant, the cells were washed twice with DPBS, and splenocytes were suspended by adding CTL-Test Medium (CTL). A turbid liquid was obtained.
  • CTL-Test Medium CTL-Test Medium
  • splenocytes 100 ⁇ L/well of splenocytes of 1.0 ⁇ 10 7 cells were seeded on an ELISPOT plate and mixed with 100 ⁇ L of CTL-Test Medium containing OVA protein (Merck) to perform antigen stimulation at a final concentration of 50 ⁇ g/mL.
  • OVA protein Merk
  • a group (N.T) to which OVA protein was not added was prepared.
  • an ELISPOT assay was performed using an ELISPOT assay kit (CTL) according to the attached protocol to detect antigen (OVA)-specific IFN ⁇ and IL-4-producing cells. Since the spleen is a secondary lymphoid tissue and its constituent cells, splenocytes, contain abundant T cells, splenocytes were used in this experiment to detect T cells exhibiting antigen-specific immune responses.
  • Example 6 Antibody titer over time The amino acid sequence (SEQ ID NO: 25) of a fusion polypeptide (V7-OVA) in which OVA is linked to the C-terminal side of VAMP7 with a linker, and a proprotein is attached to the C-terminal side of the linker in the fusion polypeptide.
  • V7-OVA fusion polypeptide
  • the nucleotide sequence of V7-pc-OVA incorporated into the plasmid DNA is shown in SEQ ID NO:69, and the nucleotide sequence of LAMP[OVA] is shown in SEQ ID NO:70.
  • An empty vector that does not encode an antigen (OVA) was used as a control.
  • an electroporator NEPA21 was used to apply a voltage for gene transfer. The above treatments were performed on days 0, 7 and 14 from the start of the experiment. During the experimental period, blood was collected from the tail vein every week, and the animals were euthanized on the 35th day and blood was collected.
  • Serum was separated from the collected blood and antibody titer was measured.
  • antibody titer measurement 100 ⁇ L/well of a DPBS solution containing 10 ⁇ g/mL OVA (Merck) was added to a 96-well ELISA plate (IWAKI) to immobilize OVA. The next day, after washing the plate, blocking was performed for 1 hour with 100 ⁇ L/well of DPBS containing 1% BSA. Subsequently, after washing the plate, 100 ⁇ L/well of the separated serum was added while diluting it two-fold stepwise.
  • the serum was removed by washing, and 100 ⁇ L/well of 1 ⁇ g/mL anti-Mouse IgG, IgG1, or IgG2a antibody (abcam) was added and allowed to stand for 1 hour.
  • 50 ⁇ L/well of TMB solution (abcam) was added to carry out a coloring reaction.
  • 50 ⁇ L/well of Stop solution (abcam) was added to stop the coloring reaction, and absorbance was measured (450 nm).
  • the antibody titer of each sample was defined as the maximum dilution factor at which the absorbance value was two times or more compared with the absorbance value of the control to which DPBS was added instead of serum.
  • VAMP7-OVA and VAMP7-pc-OVA show superior production of antigen-specific IgG antibodies and enhanced antigen-specific Th1-type immune responses, even when compared with LAMP[OVA].
  • Example 7 ELISPOT assay Amino acid sequence (SEQ ID NO: 25) of a fusion polypeptide (V7-OVA) in which OVA is linked to the C-terminal side of VAMP7 with a linker, proprotein convertase is added to the C-terminal side of the linker in the fusion polypeptide
  • Plasmid vectors encoding only the amino acid sequence (SEQ ID NO: 46) of the fusion polypeptide (V7-pc-OVA) to which the recognition sequence was added or the amino acid sequence (SEQ ID NO: 24) of OVA were prepared. An empty vector that does not encode an antigen (OVA) was used as a control.
  • an electroporator (NEPA21) was used to apply a voltage for gene transfer.
  • the animals were euthanized on day 35 and spleens were collected.
  • the harvested spleen was ground on a 40 ⁇ m cell strainer with the addition of DPBS containing 2% FBS.
  • the resulting suspension was centrifuged at 200 xg for 5 minutes, and after removing the supernatant, Pharm Lyse solution (BD biosciences) was added and allowed to stand for 3 minutes to hemolyze red blood cells contained in the suspension. bottom.
  • an ELISPOT assay was performed using an ELISPOT assay kit (CTL) according to the attached protocol to detect antigen (OVA)-specific IFN ⁇ and IL-4-producing cells. Since the spleen is a secondary lymphoid tissue and its constituent cells, splenocytes, contain abundant T cells, splenocytes were used in this experiment to detect T cells exhibiting antigen-specific immune responses.
  • CTL ELISPOT assay kit
  • Example 8 IgG, IgG1, IgG2a antibody titer VAMP7 has a proprotein convertase recognition sequence and a cancer antigen, human Wilm Tumor 1 (WT1, amino acid sequence: SEQ ID NO: 84), or an autoantigen, mouse myelin oligodendrocyte, on the C-terminal side of VAMP7.
  • WT1 human Wilm Tumor 1
  • Amino acid sequences SEQ ID NO : 89, 91
  • a plasmid vector encoding only the amino acid sequence of WT1 or MOG 35-55 .
  • nucleotide sequence encoding the antigen or fusion polypeptide was codon-optimized and incorporated into plasmid DNA (pVAX1 vector, Thermo Fisher Scientific).
  • the nucleotide sequence of WT1 integrated into the plasmid DNA is SEQ ID NO: 83
  • nucleotide sequence of MOG 35-55 is SEQ ID NO: 86
  • nucleotide sequence of V7-pc-WT1 is SEQ ID NO: 88
  • V7-pc-MOG 35-55 is shown in SEQ ID NO:90.
  • nucleotide sequence of WT1 before codon optimization is shown in SEQ ID NO: 82
  • nucleotide sequence of MOG 35-55 before codon optimization is shown in SEQ ID NO: 85.
  • MOG 35-55 is a peptide in which the 35-55 residue portion of mouse MOG is repeated seven times.
  • an empty vector that does not encode an antigen was used as a control.
  • an electroporator was used to apply a voltage for gene transfer.
  • WT1-specific IgG was observed in both WT1 alone and VAMP7-pc-WT1 (V7-pc-WT1) groups, although no significant difference was observed compared to the group administered with empty vector. An increase in antibody titer was observed. On the other hand, WT1-specific IgG1 and IgG2a antibody titers were elevated in V7-pc-WT1 compared to Empty and WT1 alone, although no significant difference was observed.
  • IgG2a/IgG1 the ratio of WT1-specific IgG1 and IgG2a antibody titers in each individual was calculated, no change was observed between WT1 alone and V7-pc-WT1.
  • MOG-specific IgG antibody titer was measured, there was no change in both MOG 35-55 alone and VAMP7-pc-MOG 35-55 (V7-pc-MOG 35-55 ) groups compared to Empty. I was not able to admit.
  • MOG-specific IgG1 and IgG2a antibody titers were elevated in V7-pc-MOG 35-55 compared to Empty and MOG 35-55 alone, and only the IgG1 antibody titer was significantly changed.
  • Example 9 ELISPOT assay Fusion polypeptides (V7-pc-WT1, V7-pc-MOG 35-55 ) in which the proprotein convertase recognition sequence and human WT1 or mouse MOG 35-55 are linked to the C-terminal side of VAMP7 with a linker
  • a plasmid vector (pVAX1 vector, Thermo Fisher Scientific) encoding only the amino acid sequences of WT1 or MOG 35-55 (SEQ ID NOS: 84 and 87) was prepared.
  • pVAX1 vector Thermo Fisher Scientific
  • an electroporator (NEPA21) was used to apply a voltage for gene transfer.
  • the animals were euthanized on day 28 and spleens were collected.
  • the harvested spleen was ground on a 40 ⁇ m cell strainer with the addition of DPBS containing 2% FBS.
  • the resulting suspension was centrifuged at 200 xg for 5 minutes, and after removing the supernatant, Pharm Lyse solution (BD biosciences) was added and allowed to stand for 3 minutes to hemolyze red blood cells contained in the suspension. bottom.
  • CTL-Test Medium CTL-Test Medium
  • 1.0 ⁇ 10 7 cells of splenocytes are seeded on an ELISPOT plate at 100 ⁇ L/well and mixed with 100 ⁇ L of CTL-Test Medium supplemented with human WT1 peptide mix (Miltenyi Biotec) or mouse MOG 35-55 peptide (Merck).
  • antigen stimulation was performed at a final concentration of 1.2 nmol/mL or 5 ⁇ g/mL.
  • a group (NT) to which no antigen was added was prepared. After 24 hours, an ELISPOT assay was performed using an ELISPOT assay kit (CTL) according to the attached protocol to detect antigen (WT1 or MOG 35-55 )-specific IFN ⁇ and IL-4-producing cells. bottom. Since the spleen is a secondary lymphoid tissue and its constituent cells, splenocytes, contain abundant T cells, splenocytes were used in this experiment to detect T cells exhibiting antigen-specific immune responses.
  • CTL ELISPOT assay kit
  • V7-pc-WT1 significantly increased the number of T cells secreting IFN ⁇ in a WT1-specific manner.
  • V7-pc-MOG 35-55 significantly increased the number of T cells secreting IFN ⁇ specifically for MOG 35-55 compared to MOG 35-55 alone.
  • WT1 peptide mix stimulation conditions WT1
  • NT no stimulation
  • WT1 No change was observed in any of the groups in the IL-4 ratio calculated for each individual under each condition.
  • the number of T cells secreting MOG 35-55-specific IL-4 was also measured under non-stimulated conditions (NT) and MOG 35-55 peptide-stimulated conditions (MOG 35-55 ). Although a significant inter-group difference was observed in N.C. No change was observed in all groups in the IL-4 ratio calculated for each individual under each condition of T and MOG 35-55 . Furthermore, when the ratio of the number of T cells producing IFN ⁇ and IL-4 in each individual, IFN ⁇ /IL-4, was calculated, compared with each antigen alone at each antigen stimulation, V7-pc-WT1 or V7-pc-MOG 35 -55 had a significant increase in IFN ⁇ /IL-4.
  • Example 10 ELISPOT assay Amino acid sequence (SEQ ID NO: 25) of a fusion polypeptide (V7-OVA) in which OVA is linked to the C-terminal side of VAMP7 with a linker, proprotein convertase is added to the C-terminal side of the linker in the fusion polypeptide Amino acid sequence (SEQ ID NO: 46) of fusion polypeptide (V7-pc-OVA) with recognition sequence added, fusion polypeptide (LAMP [OVA] ) or the amino acid sequence of OVA (SEQ ID NO: 24). An empty vector that does not encode an antigen (OVA) was used as a control.
  • an electroporator (NEPA21) was used to apply a voltage for gene transfer.
  • Animals were euthanized and spleens harvested 7 days after the above treatment.
  • the harvested spleen was ground on a 40 ⁇ m cell strainer with the addition of DPBS containing 2% FBS.
  • the resulting suspension was centrifuged at 200 xg for 5 minutes, and after removing the supernatant, Pharm Lyse solution (BD biosciences) was added and allowed to stand for 3 minutes to hemolyze red blood cells contained in the suspension. bottom.
  • an ELISPOT assay was performed using an ELISPOT assay kit (CTL) according to the attached protocol to detect antigen (OVA)-specific IFN ⁇ and IL-4-producing cells. Since the spleen is a secondary lymphoid tissue and its constituent cells, splenocytes, contain abundant T cells, splenocytes were used in this experiment to detect T cells exhibiting antigen-specific immune responses.
  • CTL ELISPOT assay kit
  • VAMP7-pc-OVA showed a significant increase in the number of T cells that secrete IFN ⁇ specifically in OVA, even just one week after vector administration. confirmed.
  • the number of T cells secreting OVA-specific IL-4 was significantly different between groups under non-stimulated conditions (NT) and OVA-stimulated conditions (OVA).
  • NT non-stimulated conditions
  • OVA-stimulated conditions OVA
  • VAMP7-pc-OVA can selectively induce antigen-specific Th1-type immunity and cell-mediated immunity without triggering an antigen-specific Th2-type immune response from a relatively early period of 1 week. Furthermore, it has been shown that there is a superior immunity-inducing effect compared to conventional techniques.

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Abstract

抗原特異的な免疫応答を増強する核酸構築物の提供。ＶＡＭＰ７、ＧＯＳＲ２、ＳＴＸ１０、ＳＴＸ１８、ＢＮＩＰ１、ＳＴＸ７、ＶＴＩ１Ａ、ＳＴＸ１６、ＳＴＸ５、ＧＯＳＲ１、ＳＴＸ８、ＳＴＸ１２、ＶＡＭＰ８、及びＳＥＣ２２Ｂからなる群より選択されるいずれかのＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、抗原をコードするポリヌクレオチドとを含む、核酸構築物。

Description

ＳＮＡＲＥを活用した核酸構築物
　本発明は、ＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドと抗原をコードするポリヌクレオチドとを含む核酸構築物に関する。
　ワクチンは、抗原を投与し、抗原に対する獲得免疫を確立することにより、感染予防や疾患の治療を図る手段である。従来、弱毒化した細菌やウイルスをそのままワクチンとして用いる生ワクチン、細菌やウイルスをホルマリンや加熱などで処理し、感染力を失わせた不活化ワクチン、細菌の産生する毒素を分離精製し、ホルマリンなどで処理して不活化したトキソイドといったワクチンが主に皮下注射、筋肉内注射により投与されている。これら以外にも、効果、安全性、利便性の向上を目指して、投与部位を粘膜とする粘膜ワクチン、抗原成分を核酸とする核酸ワクチンなどの開発が進められている。なかでも、低コストで迅速に製造できる新モダリティとして、核酸ワクチンの開発が急速に進展している。
　核酸ワクチンの効果向上にあたっては、抗原の免疫原性の向上が重要な課題の１つであり、抗原を適切な組織や抗原提示細胞に誘導し、免疫応答を効率よく惹起することが求められている。特許文献１には、アレルゲンタンパク質（抗原）をリソソーム膜タンパク質（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ＬＡＭＰ）の細胞小器官内安定化ドメインと膜貫通ドメインの間に挿入した融合タンパク質をコードする核酸を用いることで、抗原に対する免疫応答が増強されたことが開示されている。一方で、ＬＡＭＰ内腔に抗原を付加すると、抗原特異的な抗体産生が著しく減弱してしまう場合があることが報告されている（非特許文献１）。また、特許文献２には、抗原、膜貫通領域及び主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子鎖の細胞質領域を含む融合分子をコードする核酸を用いることにより、抗原の免疫原性が増加したことが開示されている。特許文献２は、抗原とＳＮＡＲＥ（ｓｏｌｕｂｌｅ　Ｎ－ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｆａｃｔｏｒ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質の細胞質領域を含む融合分子にも言及しているが、該融合分子により、抗原の免疫原性がどのように変化するのかについては全く示されていない。
　ＳＮＡＲＥタンパク質は、２０～３０ｋＤａのＳＮＡＲＥモチーフを有するタンパク質ファミリーである。多くのＳＮＡＲＥタンパク質は、Ｃ末端の膜貫通ドメインを介して脂質二重膜上に係留されており、小胞が標的の細胞内小器官に融合する過程に関与する（非特許文献２及び３）。ＳＮＡＲＥタンパク質が関与する膜融合は、真核細胞において小胞輸送やオルガネラの膜形態形成、細胞外受容体のリサイクリングなども含めたエンドサイトーシス過程、ホルモン分泌やシナプス神経伝達物質の放出を含めたエキソサイトーシス過程など、細胞機能に不可欠な多くの重要な生命現象に必須である。また、ＳＮＡＲＥタンパク質による膜融合の分子機構は、単細胞である出芽酵母からヒトを含めた高等動物に至るまで、すべての真核生物で保存されていると考えられている。ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＳＮＡＲＥモチーフのアミノ酸残基の特徴から、更にＱＡ－ＳＮＡＲＥ、ＱＢ－ＳＮＡＲＥ、ＱＣ－ＳＮＡＲＥ、そしてＲ－ＳＮＡＲＥの４つのサブファミリーに分類される。各ＳＮＡＲＥタンパク質は、それぞれ特異的な細胞内膜画分（小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体、エンドソーム、液胞・リソソームなどのオルガネラ、分泌小胞、細胞質膜など）に局在し、特定の細胞内輸送経路における膜融合の過程で機能すると考えられている。また、ＳＮＡＲＥタンパク質は、エクソソームに含まれる可能性があることも知られている。
　　（特許文献１）特開２０１７－７９７４２号公報
　　（特許文献２）特表２００８－５０００１４号公報
　　（非特許文献１）Chen AC, et al. J Immunother Cancer. 2020; 8(1): e000258.
　　（非特許文献２）Jahn R, Scheller RH. Nat Rev Mol Cell Biol. 2006; 7(9): 631-643.
　　（非特許文献３）Hong W. Biochim Biophys Acta. 2005; 1744(2): 120-144.
　本発明は、以下の１）～４）を提供する。
１）ＶＡＭＰ７、ＧＯＳＲ２、ＳＴＸ１０、ＳＴＸ１８、ＢＮＩＰ１、ＳＴＸ７、ＶＴＩ１Ａ、ＳＴＸ１６、ＳＴＸ５、ＧＯＳＲ１、ＳＴＸ８、ＳＴＸ１２、ＶＡＭＰ８、及びＳＥＣ２２Ｂからなる群より選択されるいずれかのＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、抗原をコードするポリヌクレオチドとを含む、核酸構築物。
２）１）の核酸構築物を有効成分とする抗原特異的Ｔｈ１型免疫応答誘導又は増強剤。
３）１）の核酸構築物を有効成分とする抗原特異的細胞性免疫応答誘導又は増強剤。
４）１）の核酸構築物を有効成分とする核酸ワクチン。
ＳＮＡＲＥタンパク質－抗原融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの免疫原性の評価。ＩＦＮγの産生量を産生細胞数（ｓｐｏｔ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｃｅｌｌ；ＳＦＣ）で示す。Ｅｍｐｔｙはトランスフェクション試薬のみのコントロールを、Ｅｍｐｔｙ（Ｎ．Ｔ．）は抗原による再刺激を行わなかったコントロールを、ＳＮＡＲＥタンパク質－ＯＶＡはＳＮＡＲＥタンパク質－抗原（ＯＶＡ）融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを示す。 ＳＮＡＲＥタンパク質－抗原融合ポリペプチドをコードするプラスミドベクターをマウスに投与した際のＩｇＧサブクラスの抗体価。（Ａ）はＩｇＧ抗体価を、（Ｂ）はＩｇＧ１抗体価を、（Ｃ）はＩｇＧ２ａ抗体価を示す。Ｅｍｐｔｙは抗原（ＯＶＡ）をコードしない空プラスミドベクターを、ＯＶＡはＯＶＡをコードするプラスミドベクターを、Ｖ７－ＯＶＡはＶＡＭＰ７－ＯＶＡ融合ポリペプチドをコードするプラスミドベクターを示す。 ＳＮＡＲＥタンパク質－抗原融合ポリペプチドをコードするプラスミドベクターをマウスに投与した際の免疫応答の評価。（Ａ）はＩＦＮγの産生量を、（Ｂ）はＩＬ－４の産生量をＳＦＣで示す。（Ｃ）はＩＬ－４産生量に対するＩＦＮγ産生量の比（ＩＦＮγ／ＩＬ－４）を示す。Ｅｍｐｔｙは抗原（ＯＶＡ）をコードしない空プラスミドベクターを、ＯＶＡはＯＶＡをコードするプラスミドベクターを、Ｖ７－ＯＶＡはＶＡＭＰ７－ＯＶＡ融合ポリペプチドをコードするプラスミドベクターを示す。 ＳＮＡＲＥタンパク質－抗原融合ポリペプチドをコードするプラスミドベクターをマウスに投与した際のＩｇＧサブクラスの抗体価。（Ａ）はＩｇＧ抗体価を、（Ｂ）はＩｇＧ１抗体価を、（Ｃ）はＩｇＧ２ａ抗体価を、（Ｄ）はＩｇＧ１抗体価に対するＩｇＧ２ａ抗体価の比（ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１）を示す。Ｅｍｐｔｙは抗原（ＯＶＡ）をコードしない空プラスミドベクターを、ＯＶＡはＯＶＡをコードするプラスミドベクターを、Ｖ７－ＯＶＡ、ＳＴＸ１０－ＯＶＡ、ＳＴＸ１８－ＯＶＡ、ＧＯＳＲ１－ＯＶＡはそれぞれＶＡＭＰ７－ＯＶＡ、ＳＴＸ１０－ＯＶＡ、ＳＴＸ１８－ＯＶＡ、ＧＯＳＲ１－ＯＶＡ融合ポリペプチドをコードするプラスミドベクターを示す。 ＳＮＡＲＥタンパク質－抗原融合ポリペプチドをコードするプラスミドベクターをマウスに投与した際の免疫応答の評価。（Ａ）はＩＦＮγの産生量を、（Ｂ）はＩＬ－４の産生量をＳＦＣで示す。（Ｃ）は無刺激条件下に対する抗原刺激条件下のＩＬ－４産生量の比（ＩＬ－４　ｒａｔｉｏ）を示す。Ｅｍｐｔｙは抗原（ＯＶＡ）をコードしない空プラスミドベクターを、ＯＶＡはＯＶＡをコードするプラスミドベクターを、Ｖ７－ＯＶＡ、ＳＴＸ１０－ＯＶＡ、ＳＴＸ１８－ＯＶＡ、ＧＯＳＲ１－ＯＶＡはそれぞれＶＡＭＰ７－ＯＶＡ、ＳＴＸ１０－ＯＶＡ、ＳＴＸ１８－ＯＶＡ、ＧＯＳＲ１－ＯＶＡ融合ポリペプチドをコードするプラスミドベクターを示す。 ＳＮＡＲＥタンパク質－抗原融合ポリペプチド又はＬＡＭＰ内部に抗原を含む融合ポリペプチドをコードするプラスミドベクターをマウスに投与した際の経時的な抗体価。（Ａ）はＩｇＧ抗体価を、（Ｂ）はＩｇＧ１抗体価を、（Ｃ）はＩｇＧ２ａ抗体価を、（Ｄ）は５週目のＩｇＧ１抗体価に対するＩｇＧ２ａ抗体価の比（ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１）を示す。Ｅｍｐｔｙは抗原（ＯＶＡ）をコードしない空プラスミドベクターを、ＯＶＡはＯＶＡをコードするプラスミドベクターを、Ｖ７－ＯＶＡはＶＡＭＰ７－ＯＶＡ融合ポリペプチドをコードするプラスミドベクターを、Ｖ７－ｐｃ－ＯＶＡはプロタンパク質転換酵素認識配列を含むＶＡＭＰ７－ＯＶＡ融合ポリペプチドをコードするプラスミドベクターを、ＬＡＭＰ［ＯＶＡ］はＬＡＭＰ内部にＯＶＡを含む融合ポリペプチドをコードするプラスミドベクターを示す。 ＳＮＡＲＥタンパク質－抗原融合ポリペプチドをコードするプラスミドベクターをマウスに投与した際の免疫応答の評価。（Ａ）はＩＦＮγの産生量を、（Ｂ）はＩＬ－４の産生量をＳＦＣで示す。（Ｃ）は無刺激条件下に対する抗原刺激条件下のＩＬ－４産生量の比（ＩＬ－４　ｒａｔｉｏ）を示す。Ｅｍｐｔｙは抗原（ＯＶＡ）をコードしない空プラスミドベクターを、ＯＶＡはＯＶＡをコードするプラスミドベクターを、Ｖ７－ＯＶＡはＶＡＭＰ７－ＯＶＡ融合ポリペプチドをコードするプラスミドベクターを、Ｖ７－ｐｃ－ＯＶＡはプロタンパク質転換酵素認識配列を含むＶＡＭＰ７－ＯＶＡ融合ポリペプチドをコードするプラスミドベクターを示す。 ＳＮＡＲＥタンパク質－抗原融合ポリペプチドをコードするプラスミドベクターをマウスに投与した際のＩｇＧサブクラスの抗体価。（Ａ）～（Ｄ）は抗原としてＷＴ１を、（Ｅ）～（Ｈ）は抗原としてＭＯＧ35-55を用いた場合の結果を示す。（Ａ）及び（Ｅ）はＩｇＧ抗体価を、（Ｂ）及び（Ｆ）はＩｇＧ１抗体価を、（Ｃ）及び（Ｇ）はＩｇＧ２ａ抗体価を、（Ｄ）及び（Ｈ）はＩｇＧ１抗体価に対するＩｇＧ２ａ抗体価の比（ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１）を示す。Ｅｍｐｔｙは抗原（ＷＴ１又はＭＯＧ35-55）をコードしない空プラスミドベクターを、ＷＴ１、ＭＯＧ35-55はそれぞれＷＴ１、ＭＯＧ35-55をコードするプラスミドベクターを、Ｖ７－ｐｃ－ＷＴ１、Ｖ７－ｐｃ－ＭＯＧ35-55はそれぞれＶＡＭＰ７－プロタンパク質転換酵素認識配列－ＷＴ１、ＶＡＭＰ７－プロタンパク質転換酵素認識配列－ＭＯＧ35-55融合ポリペプチドをコードするプラスミドベクターを示す。 ＳＮＡＲＥタンパク質－抗原融合ポリペプチドをコードするプラスミドベクターをマウスに投与した際の免疫応答の評価。（Ａ）～（Ｄ）は抗原としてＷＴ１を、（Ｅ）～（Ｈ）は抗原としてＭＯＧ35-55を用いた場合の結果を示す。（Ａ）及び（Ｅ）はＩＦＮγの産生量を、（Ｂ）及び（Ｆ）はＩＬ－４の産生量をＳＦＣで示す。（Ｃ）及び（Ｇ）は無刺激条件下に対する抗原刺激条件下のＩＬ－４産生量の比（ＩＬ－４　ｒａｔｉｏ）を、（Ｄ）及び（Ｈ）はＩＬ－４産生量に対するＩＦＮγ産生量の比（ＩＦＮγ／ＩＬ－４）を示す。Ｅｍｐｔｙは抗原（ＷＴ１又はＭＯＧ35-55）をコードしない空プラスミドベクターを、ＷＴ１、ＭＯＧ35-55はそれぞれＷＴ１、ＭＯ35-55をコードするプラスミドベクターを、Ｖ７－ｐｃ－ＷＴ１、Ｖ７－ｐｃ－ＭＯＧ35-55はそれぞれＶＡＭＰ７－プロタンパク質転換酵素認識配列－ＷＴ１、ＶＡＭＰ７－プロタンパク質転換酵素認識配列－ＭＯＧ35-55融合ポリペプチドをコードするプラスミドベクターを示す。 ＳＮＡＲＥタンパク質－抗原融合ポリペプチド又はＬＡＭＰ内部に抗原を含む融合ポリペプチドをコードするプラスミドベクターをマウスに投与した際の免疫応答の評価。（Ａ）はＩＦＮγの産生量を、（Ｂ）はＩＬ－４の産生量をＳＦＣで示す。（Ｃ）は無刺激条件下に対する抗原刺激条件下のＩＬ－４産生量の比（ＩＬ－４　ｒａｔｉｏ）を、（Ｄ）はＩＬ－４産生量に対するＩＦＮγ産生量の比（ＩＦＮγ／ＩＬ－４）を示す。Ｅｍｐｔｙは抗原（ＯＶＡ）をコードしない空プラスミドベクターを、ＯＶＡはＯＶＡをコードするプラスミドベクターを、Ｖ７－ＯＶＡはＶＡＭＰ７－ＯＶＡ融合ポリペプチドをコードするプラスミドベクターを、Ｖ７－ｐｃ－ＯＶＡはプロタンパク質転換酵素認識配列を含むＶＡＭＰ７－ＯＶＡ融合ポリペプチドをコードするプラスミドベクターを、ＬＡＭＰ［ＯＶＡ］はＬＡＭＰ内部にＯＶＡを含む融合ポリペプチドをコードするプラスミドベクターを示す。
発明の詳細な説明
　本明細書において、「核酸」、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」と云う用語は、互換的に使用され、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれ、ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ　ＲＮＡ及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。中でもｍＲＮＡは、ｉｎ　ｖｉｖｏにおける翻訳反応の開始、ｍＲＮＡの安定化、分解の抑制等の理由から、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写反応によって合成された後、Ｃａｐ化酵素による５’Ｃａｐ（メチル化グアノシン）の付加、並びにＰｏｌｙ（Ａ）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによるｐｏｌｙ　Ａの付加が行われる。ｐｏｌｙ　Ａ配列はｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写反応に用いるテンプレートＤＮＡに組み込まれていても良い。この時、Ｃａｐ構造やｐｏｌｙＡが付加されたｍＲＮＡ及び一部の塩基が修飾（例えばウリジンがシュードウリジンや１メチルシュードウリジンに置換）されているＲＮＡも含まれる。
　本明細書において、「遺伝子」とは、ゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡの他、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）、当該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、及びこれらの断片を包含するものであって、ＤＮＡを構成する塩基の配列情報の中に、何らかの生物学的情報が含まれているものを意味する。
　また、当該「遺伝子」は特定のヌクレオチド配列で表される「遺伝子」だけではなく、これらの同族体（すなわち、ホモログもしくはオーソログ）、遺伝子多型等の変異体、及び誘導体をコードする核酸が包含される。
　本明細書中に開示される遺伝子の名称及びＧｅｎｅ　ＩＤは、ＮＣＢＩ（［ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／］）に記載のあるＯｆｆｉｃｉａｌ　Ｓｙｍｂｏｌ及びＧｅｎｅ　ＩＤに従う。
　本明細書において、「ペプチド」、「ポリペプチド」又は「タンパク質」と云う用語は、互換的に使用される。
　本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。
　本明細書において、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ－Ｗｉｎのホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ　ｓｉｚｅ　ｔｏ　ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
　本明細書において、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列に関する「少なくとも８０％の同一性」とは、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。
　本明細書において、別途定義されない限り、ヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入に関して使用される「１又は数個」とは、好ましくは１～１５個、より好ましくは１～９個、さらに好ましくは１～６個を意味し得る。また、本明細書において、別途定義されない限り、アミノ酸配列におけるアミノ酸残基の欠失、置換、付加又は挿入に関して使用される「１又は数個」とは、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個、さらに好ましくは１～２個を意味し得る。本明細書において、ヌクレオチド又はアミノ酸残基の「付加」には、配列の一末端及び両末端へのヌクレオチド又はアミノ酸残基の付加が含まれる。
　本明細書において、「ストリンジェントな条件」としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ　ＴＨＩＲＤ　ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｊｏｓｅｐｈ　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｄａｖｉｄ　Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，２００１）記載のサザンハイブリダイゼーション法の条件、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに４２℃で８～１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
　本明細書において、ポリヌクレオチドの「フラグメント」とは、該ポリヌクレオチドの部分ポリヌクレオチドを意味する。部分ポリヌクレオチドの長さは、全長のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドをコードする限りにおいて、特に限定されるものではない。例えば、部分ポリヌクレオチドは、全長のポリヌクレオチドに対し好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、かつ、好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下、さらに好ましくは７０％以下、さらにより好ましくは６０％以下の長さの連続するヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを意味し得る。また、本明細書において、ポリペプチドの「フラグメント」とは、該ポリペプチドの部分ポリペプチドを意味する。部分ポリペプチドの長さは、特に限定されるものではない。例えば、部分ポリペプチドは、全長のポリペプチドに対し好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、かつ、好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下、さらに好ましくは７０％以下、さらにより好ましくは６０％以下の長さの連続するアミノ酸残基からなるポリペプチドを意味し得る。
　本明細書において、「制御領域」とは、その下流に配置された遺伝子（例えばタンパク質をコードする領域）の発現を制御する機能を有する領域である。より具体的には、「制御領域」とは、遺伝子のコーディング領域の上流に存在し、ＲＮＡポリメラーゼと相互作用して該コーディング領域の転写を制御する機能を有する領域として定義され得る。制御領域は、転写開始制御領域及び／又は翻訳開始制御領域、あるいは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域を含む。転写開始制御領域はプロモーター及び転写開始点を含む領域であり、翻訳開始制御領域は開始コドンと共にリボソームに認識され翻訳開始に必要なＫｏｚａｋ配列に相当する部位である。
　本明細書において、制御領域と遺伝子のポリヌクレオチド（例えばタンパク質をコードするポリヌクレオチド）との「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
　本明細書において、第一の遺伝子のポリヌクレオチド（例えばタンパク質をコードするポリヌクレオチド）及び第二の遺伝子のポリヌクレオチド（例えばタンパク質をコードするポリヌクレオチド）との「発現可能な連結」とは、第一の遺伝子と第二の遺伝子とが、適切な発現ベクターに挿入され、該発現ベクターが適切な細胞に導入された場合に、該第一の遺伝子がコードするタンパク質と該第二の遺伝子がコードするタンパク質が融合タンパク質として生産されるように連結されることをいう。ここで、「連結」とは、第一の遺伝子と第二の遺伝子が直接結合している場合も、他のヌクレオチド配列を介して結合している場合も含む概念である。第一の遺伝子と第二の遺伝子との「発現可能な連結」の手順は当業者に周知である。
　本明細書において、遺伝子又はそのヌクレオチド配列に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、遺伝子の「上流配列」「下流配列」とは、それぞれＤＮＡセンス鎖において該遺伝子の５’側及び３’側に位置する配列をいう。
　本明細書において、「抗原」とは、生体に抗体の産生や細胞性免疫等の免疫応答を引き起こす分子を意味する。また、本明細書において、「免疫原性」とは、抗原が抗体の産生や細胞性免疫を誘導する性質を意味する。
　本明細書において、「核酸ワクチン」とは、抗原をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を生体に投与することで免疫を誘導するワクチンをいう。核酸ワクチンには、ＤＮＡワクチン、ｍＲＮＡワクチン、ウイルスベクターワクチンが包含され、いずれも液性免疫と細胞性免疫の両方を誘導すると考えられている。ＤＮＡワクチンは、抗原をコードするプラスミドを含む。生体に投与されたプラスミドが細胞に取り込まれて核内でｍＲＮＡに転写され、細胞質内でｍＲＮＡが抗原タンパク質に翻訳されて、抗原特異的な免疫応答が誘導される。ｍＲＮＡワクチンは、抗原をコードするｍＲＮＡを含む。生体に投与されたｍＲＮＡが細胞に取り込まれ、細胞質内でｍＲＮＡが抗原タンパク質に翻訳されて、抗原特異的な免疫応答が誘導される。ウイルスベクターワクチンは、抗原をコードするポリヌクレオチドを組み込んだ病原性がないもしくは弱毒性のウイルスベクターを含む。生体に投与されたウイルスが細胞に侵入し、細胞に抗原タンパク質を合成させて、抗原特異的な免疫応答が誘導される。
　本明細書において、「細胞性免疫」とは、生体に侵入した病原体、ウイルス感染細胞、がん細胞などの異物の排除に働く獲得免疫応答のうち、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞等をエフェクターとする免疫応答をいう。また、本明細書において、「液性免疫」とは、獲得免疫応答のうち、抗体をエフェクターとする免疫応答をいう。
　本明細書において、「Ｔｈ１型の免疫応答」とは、ヘルパーＴ細胞のサブセットのうち、Ｔｈ１細胞により促進される免疫応答を指す。Ｔｈ１細胞は、サイトカインとして主にＩＦＮγを産生し、Ｍ１マクロファージ、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞を主な標的細胞とし、主に細胞性免疫を誘導する。Ｔｈ１細胞は、Ｂ細胞を活性化してＩｇＧ２ａの産生を誘導することが知られている。また、本明細書において、「Ｔｈ２型の免疫応答」とは、ヘルパーＴ細胞のサブセットのうち、Ｔｈ２細胞により促進される免疫応答を指す。Ｔｈ２細胞は、サイトカインとして主にＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３を産生し、肥満細胞、Ｍ２マクロファージ、好酸球及び好塩基球を主な標的細胞とし、主に液性免疫を誘導する。Ｔｈ２細胞は、Ｂ細胞を活性化してＩｇＧ１の産生を誘導することが知られている。
　本発明は、抗原特異的な免疫応答を増強する核酸構築物を提供することに関する。
　本発明者らは、特定のＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドと抗原をコードするポリヌクレオチドとを含む核酸構築物を用いることで、抗原をコードするポリヌクレオチドのみを含む核酸構築物と比較して、抗原特異的なＴｈ１型免疫応答を誘導又は増強でき、また、抗原特異的な細胞性免疫応答を誘導又は増強できることを見出した。
　本発明の核酸構築物によれば、抗原特異的なＴｈ１型免疫応答を誘導又は増強でき、また、抗原特異的な細胞性免疫応答を誘導又は増強することができる。斯かる核酸構築物は、核酸ワクチンとして有用である。
　本発明は、ＶＡＭＰ７、ＧＯＳＲ２、ＳＴＸ１０、ＳＴＸ１８、ＢＮＩＰ１、ＳＴＸ７、ＶＴＩ１Ａ、ＳＴＸ１６、ＳＴＸ５、ＧＯＳＲ１、ＳＴＸ８、ＳＴＸ１２、ＶＡＭＰ８、及びＳＥＣ２２Ｂからなる群より選択されるいずれかのＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、抗原をコードするポリヌクレオチドとを含む、核酸構築物を提供する。
　本発明において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＳＮＡＲＥモチーフを有するタンパク質ファミリーに属するタンパク質であり、具体的には、ＶＡＭＰ７、ＧＯＳＲ２、ＳＴＸ１０、ＳＴＸ１８、ＢＮＩＰ１、ＳＴＸ７、ＶＴＩ１Ａ、ＳＴＸ１６、ＳＴＸ５、ＧＯＳＲ１、ＳＴＸ８、ＳＴＸ１２、ＶＡＭＰ８、及びＳＥＣ２２Ｂからなる群より選択されるいずれかのタンパク質である（以下、単にＳＮＡＲＥタンパク質と称することがある）。該ＳＮＡＲＥタンパク質としては、免疫誘導又は増強の点から、ＶＡＭＰ７、ＧＯＳＲ２、ＳＴＸ１０、ＳＴＸ１８、ＢＮＩＰ１、ＳＴＸ７、ＶＴＩ１Ａ、ＳＴＸ１６、ＳＴＸ５、及びＧＯＳＲ１からなる群より選択されるいずれかが好ましく、ＶＡＭＰ７、ＧＯＳＲ２、ＳＴＸ１０、ＳＴＸ１８、ＢＮＩＰ１、ＳＴＸ７、ＶＴＩ１Ａ、及びＧＯＳＲ１からなる群より選択されるいずれかがより好ましく、ＶＡＭＰ７、ＧＯＳＲ２、ＳＴＸ１０、及びＧＯＳＲ１からなる群より選択されるいずれかがさらに好ましく、ＶＡＭＰ７がさらに好ましい。該ＳＮＡＲＥタンパク質は、膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞に局在する。
　ＶＡＭＰ７（ｖｅｓｉｃｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　７）は、ＳＮＡＲＥタンパク質の１種であり、膜貫通ドメインを有し、後期エンドソーム、リソソーム及び細胞膜に局在すると予想されている。好ましい一例において、ＶＡＭＰ７は、哺乳動物のＶＡＭＰ７である。より好ましい一例において、ＶＡＭＰ７は、ヒトＶＡＭＰ７であり、配列番号１のヌクレオチド配列からなる遺伝子（Ｇｅｎｅ　ＩＤ：６８４５）にコードされる、配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質である。本発明で用いられるＶＡＭＰ７には、ＶＡＭＰ７及びこれと同等の機能を有するポリペプチドが包含される。
　ＧＯＳＲ２（ｇｏｌｇｉ　ＳＮＡＰ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｍｅｍｂｅｒ　２）は、ＳＮＡＲＥタンパク質の１種であり、膜貫通ドメインを有し、小胞体－ゴルジ体中間区間及びゴルジ体に局在すると予想されている。好ましい一例において、ＧＯＳＲ２は、哺乳類のＧＯＳＲ２である。より好ましい一例において、ＧＯＳＲ２は、ヒトＧＯＳＲ２であり、配列番号２のヌクレオチド配列からなる遺伝子（Ｇｅｎｅ　ＩＤ：９５７０）にコードされる、配列番号１１のアミノ酸配列からなるタンパク質である。本発明で用いられるＧＯＳＲ２には、ＧＯＳＲ２及びこれと同等の機能を有するポリペプチドが包含される。
　ＳＴＸ（ｓｙｎｔａｘｉｎ）１０は、ＳＮＡＲＥタンパク質の１種であり、膜貫通ドメインを有し、トランスゴルジネットワークに局在すると予想されている。好ましい一例において、ＳＴＸ１０は、哺乳類のＳＴＸ１０である。より好ましい一例において、ＳＴＸ１０は、ヒトＳＴＸ１０であり、配列番号３のヌクレオチド配列からなる遺伝子（Ｇｅｎｅ　ＩＤ：８６７７）にコードされる、配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質である。本発明で用いられるＳＴＸ１０には、ＳＴＸ１０及びこれと同等の機能を有するポリペプチドが包含される。
　ＳＴＸ１８は、ＳＮＡＲＥタンパク質の１種であり、膜貫通ドメインを有し、小胞体に局在すると予想されている。好ましい一例において、ＳＴＸ１８は、哺乳類のＳＴＸ１８である。より好ましい一例において、ＳＴＸ１８は、ヒトＳＴＸ１８であり、配列番号４のヌクレオチド配列からなる遺伝子（Ｇｅｎｅ　ＩＤ：５３４０７）にコードされる、配列番号１３のアミノ酸配列からなるタンパク質である。本発明で用いられるＳＴＸ１８には、ＳＴＸ１８及びこれと同等の機能を有するポリペプチドが包含される。
　ＢＮＩＰ１（ＢＣＬ２　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１）は、ＳＮＡＲＥタンパク質の１種であり、膜貫通ドメインを有し、小胞体に局在すると予想されている。好ましい一例において、ＢＮＩＰ１は、哺乳類のＢＮＩＰ１である。より好ましい一例において、ＢＮＩＰ１は、ヒトＢＮＩＰ１であり、配列番号５のヌクレオチド配列からなる遺伝子（Ｇｅｎｅ　ＩＤ：６６２）にコードされる、配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質である。本発明で用いられるＢＮＩＰ１には、ＢＮＩＰ１及びこれと同等の機能を有するポリペプチドが包含される。
　ＳＴＸ７は、ＳＮＡＲＥタンパク質の１種であり、膜貫通ドメインを有し、初期エンドソーム及び後期エンドソームに局在すると予想されている。好ましい一例において、ＳＴＸ７は、哺乳類のＳＴＸ７である。より好ましい一例において、ＳＴＸ７は、ヒトＳＴＸ７であり、配列番号６のヌクレオチド配列からなる遺伝子（Ｇｅｎｅ　ＩＤ：８４１７）にコードされる、配列番号１５のアミノ酸配列からなるタンパク質である。本発明で用いられるＳＴＸ７には、ＳＴＸ７及びこれと同等の機能を有するポリペプチドが包含される。
　ＶＴＩ１Ａ（ｖｅｓｉｃｌｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔ－ＳＮＡＲＥｓ　１Ａ）は、ＳＮＡＲＥタンパク質の１種であり、膜貫通ドメインを有し、トランスゴルジネットワークに局在すると予想されている。好ましい一例において、ＶＴＩ１Ａは、哺乳類のＶＴＩ１Ａである。より好ましい一例において、ＶＴＩ１Ａは、ヒトＶＴＩ１Ａであり、配列番号７のヌクレオチド配列からなる遺伝子（Ｇｅｎｅ　ＩＤ：１４３１８７）にコードされる、配列番号１６のアミノ酸配列からなるタンパク質である。本発明で用いられるＶＴＩ１Ａには、ＶＴＩ１Ａ及びこれと同等の機能を有するポリペプチドが包含される。
　ＳＴＸ１６は、ＳＮＡＲＥタンパク質の１種であり、膜貫通ドメインを有し、トランスゴルジネットワークに局在すると予想されている。好ましい一例において、ＳＴＸ１６は、哺乳類のＳＴＸ１６である。より好ましい一例において、ＳＴＸ１６は、ヒトＳＴＸ１６であり、配列番号８のヌクレオチド配列からなる遺伝子（Ｇｅｎｅ　ＩＤ：８６７５）にコードされる、配列番号１７のアミノ酸配列からなるタンパク質である。本発明で用いられるＳＴＸ１６には、ＳＴＸ１６及びこれと同等の機能を有するポリペプチドが包含される。
　ＳＴＸ５は、ＳＮＡＲＥタンパク質の１種であり、膜貫通ドメインを有し、ゴルジ体に局在すると予想されている。好ましい一例において、ＳＴＸ５は、哺乳類のＳＴＸ５である。より好ましい一例において、ＳＴＸ５は、ヒトＳＴＸ５であり、配列番号９のヌクレオチド配列からなる遺伝子（Ｇｅｎｅ　ＩＤ：６８１１）にコードされる、配列番号１８のアミノ酸配列からなるタンパク質である。本発明で用いられるＳＴＸ５には、ＳＴＸ５及びこれと同等の機能を有するポリペプチドが包含される。
　ＧＯＳＲ１は、ＳＮＡＲＥタンパク質の１種であり、膜貫通ドメインを有し、ゴルジ体及びトランスゴルジネットワークに局在すると予想されている。好ましい一例において、ＧＯＳＲ１は、哺乳動物のＧＯＳＲ１である。より好ましい一例において、ＧＯＳＲ１は、ヒトＧＯＳＲ１であり、配列番号７１のヌクレオチド配列からなる遺伝子（Ｇｅｎｅ　ＩＤ：９５２７）にコードされる、配列番号７６のアミノ酸配列からなるタンパク質である。本発明で用いられるＧＯＳＲ１には、ＧＯＳＲ１及びこれと同等の機能を有するポリペプチドが包含される。
　ＳＴＸ８は、ＳＮＡＲＥタンパク質の１種であり、膜貫通ドメインを有し、初期エンドソーム、後期エンドソーム、及び細胞膜に局在すると予想されている。好ましい一例において、ＳＴＸ８は、哺乳動物のＳＴＸ８である。より好ましい一例において、ＳＴＸ８は、ヒトＳＴＸ８であり、配列番号７２のヌクレオチド配列からなる遺伝子（Ｇｅｎｅ　ＩＤ：９４８２）にコードされる、配列番号７７のアミノ酸配列からなるタンパク質である。本発明で用いられるＳＴＸ８には、ＳＴＸ８及びこれと同等の機能を有するポリペプチドが包含される。
　ＳＴＸ１２は、ＳＮＡＲＥタンパク質の１種であり、膜貫通ドメインを有し、ゴルジ体、初期エンドソーム及びリサイクリングエンドソームに局在すると予想されている。好ましい一例において、ＳＴＸ１２は、哺乳動物のＳＴＸ１２である。より好ましい一例において、ＳＴＸ１２は、ヒトＳＴＸ１２であり、配列番号７３のヌクレオチド配列からなる遺伝子（Ｇｅｎｅ　ＩＤ：２３６７３）にコードされる、配列番号７８のアミノ酸配列からなるタンパク質である。本発明で用いられるＳＴＸ１２には、ＳＴＸ１２及びこれと同等の機能を有するポリペプチドが包含される。
　ＶＡＭＰ８は、ＳＮＡＲＥタンパク質の１種であり、膜貫通ドメインを有し、リソソーム、初期エンドソーム、後期エンドソーム及び細胞膜に局在すると予想されている。好ましい一例において、ＶＡＭＰ８は、哺乳動物のＶＡＭＰ８である。より好ましい一例において、ＶＡＭＰ８は、ヒトＶＡＭＰ８であり、配列番号７４のヌクレオチド配列からなる遺伝子（Ｇｅｎｅ　ＩＤ：８６７３）にコードされる、配列番号７９のアミノ酸配列からなるタンパク質である。本発明で用いられるＶＡＭＰ８には、ＶＡＭＰ８及びこれと同等の機能を有するポリペプチドが包含される。
　ＳＥＣ２２Ｂ（ＳＥＣ２２　ｈｏｍｏｌｏｇ　Ｂ，ｖｅｓｉｃｌｅ　ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）は、ＳＮＡＲＥタンパク質の１種であり、膜貫通ドメインを有し、小胞体、小胞体－ゴルジ体中間区間、ゴルジ体、シスゴルジネットワーク及びトランスゴルジネットワークに局在すると予想されている。好ましい一例において、ＳＥＣ２２Ｂは、哺乳動物のＳＥＣ２２Ｂである。より好ましい一例において、ＳＥＣ２２Ｂは、ヒトＳＥＣ２２Ｂであり、配列番号７５のヌクレオチド配列からなる遺伝子（Ｇｅｎｅ　ＩＤ：９５５４）にコードされる、配列番号８０のアミノ酸配列からなるタンパク質である。本発明で用いられるＳＥＣ２２Ｂには、ＳＥＣ２２Ｂ及びこれと同等の機能を有するポリペプチドが包含される。
　本発明において、ＳＮＡＲＥタンパク質と同等の機能を有するポリペプチドとは、該ＳＮＡＲＥタンパク質と同等の生物学的活性を有するポリペプチドを指す。斯かるポリペプチドとしては、例えば、膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（好ましくは対応するＳＮＡＲＥタンパク質が局在する細胞内小胞）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドが挙げられる。具体例としては、下記の（ｂ）～（ｅ）、又は下記の（ｂ）、（ｃ）及び（ｅ）のポリペプチドが挙げられる。
　ＶＡＭＰ７としては、具体的には以下が挙げられる。
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、後期エンドソーム又はリソソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、後期エンドソーム又はリソソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｄ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドのスプライシングバリアントにコードされるアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、後期エンドソーム又はリソソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｅ）上記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、後期エンドソーム又はリソソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド。
配列番号１のヌクレオチド配列からなるＶＡＭＰ７遺伝子のスプライシングバリアントとしては、ＮＣＢＩのＲｅｆＳｅｑ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）にＮＭ＿００１１８５１８３．２又はＮＭ＿００１１４５１４９．３として登録され、それぞれ、ＮＰ＿００１１７２１１２．１又はＮＰ＿００１１３８６２１．１として登録されるタンパク質をコードするバリアントが挙げられる。
　ＧＯＳＲ２としては、具体的には以下が挙げられる。
（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体－ゴルジ体中間区間又はゴルジ体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体－ゴルジ体中間区間又はゴルジ体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｄ）配列番号２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドのスプライシングバリアントにコードされるアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体－ゴルジ体中間区間又はゴルジ体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｅ）上記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体－ゴルジ体中間区間又はゴルジ体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド。
配列番号２のヌクレオチド配列からなるＧＯＳＲ２遺伝子のスプライシングバリアントとしては、ＮＣＢＩのＲｅｆＳｅｑにＮＭ＿０５４０２２．４、ＮＭ＿００４２８７．５、ＮＭ＿００１３５３１１４．２、ＮＭ＿００１０１２５１１．３、ＮＭ＿００１３６３８５１．２、ＮＭ＿００１３３０２５２．２、ＮＭ＿００１３５３１１６．２、ＮＭ＿００１３５３１１５．２、又はＮＭ＿００１３２１１３４．２として登録され、それぞれ、ＮＰ＿４７３３６３．１、ＮＰ＿００４２７８．２、ＮＰ＿００１３４００４３．１、ＮＰ＿００１０１２５２９．１、ＮＰ＿００１３５０７８０．１、ＮＰ＿００１３１７１８１．１、ＮＰ＿００１３４００４５．１、ＮＰ＿００１３４００４４．１、又はＮＰ＿００１３０８０６３．１として登録されるタンパク質をコードするバリアントが挙げられる。
　ＳＴＸ１０としては、具体的には以下が挙げられる。
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｄ）配列番号３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドのスプライシングバリアントにコードされるアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｅ）上記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド。
配列番号３のヌクレオチド配列からなるＳＴＸ１０遺伝子のスプライシングバリアントとしては、ＮＣＢＩのＲｅｆＳｅｑにＮＭ＿００１２７１６１０．２、ＮＭ＿１２７１６０９．２、又はＮＭ＿００１２７１６１１．２として登録され、それぞれ、ＮＰ＿００１２５８５３９．１、ＮＰ＿００１２５８５３８．１、又はＮＰ＿００１２５８５４０．１として登録されるタンパク質をコードするバリアントが挙げられる。
　ＳＴＸ１８としては、具体的には以下が挙げられる。
（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｄ）配列番号４のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドのスプライシングバリアントにコードされるアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｅ）上記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド。
配列番号４のヌクレオチド配列からなるＳＴＸ１８遺伝子のスプライシングバリアントとしては、ＮＣＢＩのＲｅｆＳｅｑにＮＭ＿００１３４６２８１．２、ＮＭ＿００１３４６２８２．２、又はＮＭ＿００１３４６３００．２として登録され、それぞれ、ＮＰ＿００１３３３２１０．１、ＮＰ＿００１３３３２１１．１、又はＮＰ＿００１３３３２２９．１として登録されるタンパク質をコードするバリアントが挙げられる。
　ＢＮＩＰ１としては、具体的には以下が挙げられる。
（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｄ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドのスプライシングバリアントにコードされるアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｅ）上記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド。
配列番号５のヌクレオチド配列からなるＢＮＩＰ１遺伝子のスプライシングバリアントとしては、ＮＣＢＩのＲｅｆＳｅｑにＮＭ＿０１３９８０．３、ＮＭ＿００１２０５．３、又はＮＭ＿０１３９７８．３として登録され、それぞれ、ＮＰ＿０５３５８３．２、ＮＰ＿００１１９６．２、又はＮＰ＿０５３５８１．２として登録されるタンパク質をコードするバリアントが挙げられる。
　ＳＴＸ７としては、具体的には以下が挙げられる。
（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｄ）配列番号６のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドのスプライシングバリアントにコードされるアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｅ）上記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド。
配列番号６のヌクレオチド配列からなるＳＴＸ７遺伝子のスプライシングバリアントとしては、ＮＣＢＩのＲｅｆＳｅｑにＮＭ＿００１３２６５７８．２、ＮＭ＿００１３２６５７９．２、又はＮＭ＿００１３２６５８０．２として登録され、それぞれ、ＮＰ＿００１３１３５０７．１、ＮＰ＿００１３１３５０８．１、又はＮＰ＿００１３１３５０９．１として登録されるタンパク質をコードするバリアントが挙げられる。
　ＶＴＩ１Ａとしては、具体的には以下が挙げられる。
（ａ）配列番号１６のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｄ）配列番号７のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドのスプライシングバリアントにコードされるアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｅ）上記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド。
配列番号７のヌクレオチド配列からなるＶＴＩ１Ａ遺伝子のスプライシングバリアントとしては、ＮＣＢＩのＲｅｆＳｅｑにＮＭ＿１４５２０６．４、ＮＭ＿００１３６５７１１．１、ＮＭ＿００１３６５７１０．２、ＮＭ＿００１３６５７１２．１、ＮＭ＿００１３６５７１３．１、ＮＭ＿００１３６５７１４．１、又はＮＭ＿００１３１８２０５．２として登録され、それぞれ、ＮＰ＿６６０２０７．２、ＮＰ＿００１３５２６４０．１、ＮＰ＿００１３５２６３９．１、ＮＰ＿００１３５２６４１．１、ＮＰ＿００１３５２６４２．１、ＮＰ＿００１３５２６４３．１、又はＮＰ＿００１３０５１３４．１として登録されるタンパク質をコードするバリアントが挙げられる。
　ＳＴＸ１６としては、具体的には以下が挙げられる。
（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｄ）配列番号８のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドのスプライシングバリアントにコードされるアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｅ）上記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド。
配列番号８のヌクレオチド配列からなるＳＴＸ１６遺伝子のスプライシングバリアントとしては、ＮＣＢＩのＲｅｆＳｅｑにＮＭ＿００１１３４７７２．３、ＮＭ＿１１３４７７３．３、ＮＭ＿００３７６３．６、又はＮＭ＿００１２０４８６８．２として登録され、それぞれ、ＮＰ＿００１１２８２４４．１、ＮＰ＿００１１２８２４５．１、ＮＰ＿００３７５４．２、又はＮＰ＿００１１９１７９７．１として登録されるタンパク質をコードするバリアントが挙げられる。
　ＳＴＸ５としては、具体的には以下が挙げられる。
（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｄ）配列番号９のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドのスプライシングバリアントにコードされるアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｅ）上記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド。
配列番号９のヌクレオチド配列からなるＳＴＸ５遺伝子のスプライシングバリアントとしては、ＮＣＢＩのＲｅｆＳｅｑにＮＭ＿００１２４４６６６．３、又はＮＭ＿００１３３０２９４．２として登録され、それぞれ、ＮＰ＿００１２３１５９５．１、又はＮＰ＿００１３１７２２３．１として登録されるタンパク質をコードするバリアントが挙げられる。
　ＧＯＳＲ１としては、具体的には以下が挙げられる。
（ａ）配列番号７６のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号７６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体又はトランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｃ）配列番号７６のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体又はトランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｄ）配列番号７１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドのスプライシングバリアントにコードされるアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体又はトランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｅ）上記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体又はトランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド。
配列番号７１のヌクレオチド配列からなるＧＯＳＲ１遺伝子のスプライシングバリアントとしては、ＮＣＢＩのＲｅｆＳｅｑにＮＭ＿００１００７０２５．２又はＮＭ＿００１００７０２４．２として登録され、それぞれ、ＮＰ＿００１００７０２６．１又はＮＰ＿００１００７０２５．１として登録されるタンパク質をコードするバリアントが挙げられる。
　ＳＴＸ８としては、具体的には以下が挙げられる。
（ａ）配列番号７７のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号７７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｃ）配列番号７７のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｅ）上記（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド。
　ＳＴＸ１２としては、具体的には以下が挙げられる。
（ａ）配列番号７８のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号７８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体、初期エンドソーム又はリサイクリングエンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｃ）配列番号７８のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体、初期エンドソーム又はリサイクリングエンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｅ）上記（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体、初期エンドソーム又はリサイクリングエンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド。
　ＶＡＭＰ８としては、具体的には以下が挙げられる。
（ａ）配列番号７９のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号７９のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、リソソーム、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｃ）配列番号７９のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、リソソーム、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｅ）上記（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、リソソーム、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド。
　ＳＥＣ２２Ｂとしては、具体的には以下が挙げられる。
（ａ）配列番号８０のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号８０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体、小胞体－ゴルジ体中間区間、ゴルジ体、シスゴルジネットワーク又はトランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｃ）配列番号８０のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体、小胞体－ゴルジ体中間区間、ゴルジ体、シスゴルジネットワーク又はトランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド；
（ｅ）上記（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体、小胞体－ゴルジ体中間区間、ゴルジ体、シスゴルジネットワーク又はトランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド。
　本発明で用いられるＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドには、ＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチド及びＳＮＡＲＥタンパク質と同等の機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが包含される。ＳＮＡＲＥタンパク質と同等の機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの具体例としては、下記の（ｇ）～（ｋ）及び（ｍ）～（ｏ）、又は下記の（ｇ）、（ｈ）、（ｊ）、（ｋ）及び（ｍ）～（ｏ）のポリヌクレオチドが挙げられる。
　ＶＡＭＰ７をコードするポリヌクレオチドとしては、具体的には以下が挙げられる。
（ｆ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、後期エンドソーム又はリソソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号１のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、後期エンドソーム又はリソソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドのスプライシングバリアントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、後期エンドソーム又はリソソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、後期エンドソーム又はリソソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）上記（ｆ）～（ｊ）のいずれかのポリヌクレオチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、後期エンドソーム又はリソソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｍ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、後期エンドソーム又はリソソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、後期エンドソーム又はリソソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）上記（ｌ）～（ｎ）のいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、後期エンドソーム又はリソソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド。
　ＧＯＳＲ２をコードするポリヌクレオチドとしては、具体的には以下が挙げられる。
（ｆ）配列番号２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体－ゴルジ体中間区間又はゴルジ体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号２のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体－ゴルジ体中間区間又はゴルジ体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドのスプライシングバリアントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体－ゴルジ体中間区間又はゴルジ体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体－ゴルジ体中間区間又はゴルジ体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）上記（ｆ）～（ｊ）のいずれかのポリヌクレオチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体－ゴルジ体中間区間又はゴルジ体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号１１のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｍ）配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体－ゴルジ体中間区間又はゴルジ体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号１１のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体－ゴルジ体中間区間又はゴルジ体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）上記（ｌ）～（ｎ）のいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体－ゴルジ体中間区間又はゴルジ体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド。
　ＳＴＸ１０をコードするポリヌクレオチドとしては、具体的には以下が挙げられる。
（ｆ）配列番号３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号３のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドのスプライシングバリアントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）上記（ｆ）～（ｊ）のいずれかのポリヌクレオチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｍ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号１２のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）上記（ｌ）～（ｎ）のいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド。
　ＳＴＸ１８をコードするポリヌクレオチドとしては、具体的には以下が挙げられる。
（ｆ）配列番号４のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号４のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号４のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドのスプライシングバリアントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号４のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）上記（ｆ）～（ｊ）のいずれかのポリヌクレオチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号１３のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｍ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号１３のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）上記（ｌ）～（ｎ）のいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド。
　ＢＮＩＰ１をコードするポリヌクレオチドとしては、具体的には以下が挙げられる。
（ｆ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号５のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドのスプライシングバリアントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）上記（ｆ）～（ｊ）のいずれかのポリヌクレオチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｍ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号１４のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）上記（ｌ）～（ｎ）のいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド。
　ＳＴＸ７をコードするポリヌクレオチドとしては、具体的には以下が挙げられる。
（ｆ）配列番号６のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号６のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号６のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドのスプライシングバリアントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号６のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）上記（ｆ）～（ｊ）のいずれかのポリヌクレオチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号１５のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｍ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号１５のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）上記（ｌ）～（ｎ）のいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド。
　ＶＴＩ１Ａをコードするポリヌクレオチドとしては、具体的には以下が挙げられる。
（ｆ）配列番号７のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号７のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号７のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドのスプライシングバリアントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号７のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）上記（ｆ）～（ｊ）のいずれかのポリヌクレオチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号１６のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｍ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号１６のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）上記（ｌ）～（ｎ）のいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド。
　ＳＴＸ１６をコードするポリヌクレオチドとしては、具体的には以下が挙げられる。
（ｆ）配列番号８のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号８のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号８のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドのスプライシングバリアントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号８のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）上記（ｆ）～（ｊ）のいずれかのポリヌクレオチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号１７のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｍ）配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号１７のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）上記（ｌ）～（ｎ）のいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、トランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド。
　ＳＴＸ５をコードするポリヌクレオチドとしては、具体的には以下が挙げられる。
（ｆ）配列番号９のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号９のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号９のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号９のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドのスプライシングバリアントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号９のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）上記（ｆ）～（ｊ）のいずれかのポリヌクレオチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｍ）配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号１８のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）上記（ｌ）～（ｎ）のいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド。
　ＧＯＳＲ１をコードするポリヌクレオチドとしては、具体的には以下が挙げられる。
（ｆ）配列番号７１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号７１のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体又はトランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号７１のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体又はトランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号７１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドのスプライシングバリアントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体又はトランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号７１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体又はトランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）上記（ｆ）～（ｊ）のいずれかのポリヌクレオチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体又はトランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号７６のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｍ）配列番号７６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体又はトランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号７６のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体又はトランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）上記（ｌ）～（ｎ）のいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体又はトランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド。
　ＳＴＸ８をコードするポリヌクレオチドとしては、具体的には以下が挙げられる。
（ｆ）配列番号７２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号７２のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号７２のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号７２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）上記（ｆ）～（ｈ）及び（ｊ）のいずれかのポリヌクレオチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号７７のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｍ）配列番号７７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号７７のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）上記（ｌ）～（ｎ）のいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド。
　ＳＴＸ１２をコードするポリヌクレオチドとしては、具体的には以下が挙げられる。
（ｆ）配列番号７３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号７３のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体、初期エンドソーム又はリサイクリングエンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号７３のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体、初期エンドソーム又はリサイクリングエンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号７３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体、初期エンドソーム又はリサイクリングエンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）上記（ｆ）～（ｈ）及び（ｊ）のいずれかのポリヌクレオチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体、初期エンドソーム又はリサイクリングエンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号７８のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｍ）配列番号７８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体、初期エンドソーム又はリサイクリングエンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号７８のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体、初期エンドソーム又はリサイクリングエンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）上記（ｌ）～（ｎ）のいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、ゴルジ体、初期エンドソーム又はリサイクリングエンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド。
　ＶＡＭＰ８をコードするポリヌクレオチドとしては、具体的には以下が挙げられる。
（ｆ）配列番号７４のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号７４のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、リソソーム、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号７４のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、リソソーム、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号７４のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、リソソーム、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）上記（ｆ）～（ｈ）及び（ｊ）のいずれかのポリヌクレオチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、リソソーム、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号７９のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｍ）配列番号７９のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、リソソーム、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号７９のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、リソソーム、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）上記（ｌ）～（ｎ）のいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、リソソーム、初期エンドソーム又は後期エンドソーム）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド。
　ＳＥＣ２２Ｂをコードするポリヌクレオチドとしては、具体的には以下が挙げられる。
（ｆ）配列番号７５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号７５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体、小胞体－ゴルジ体中間区間、ゴルジ体、シスゴルジネットワーク又はトランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号７５のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体、小胞体－ゴルジ体中間区間、ゴルジ体、シスゴルジネットワーク又はトランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号７５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体、小胞体－ゴルジ体中間区間、ゴルジ体、シスゴルジネットワーク又はトランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）上記（ｆ）～（ｈ）及び（ｊ）のいずれかのポリヌクレオチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体、小胞体－ゴルジ体中間区間、ゴルジ体、シスゴルジネットワーク又はトランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号８０のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｍ）配列番号８０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体、小胞体－ゴルジ体中間区間、ゴルジ体、シスゴルジネットワーク又はトランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号８０のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体、小胞体－ゴルジ体中間区間、ゴルジ体、シスゴルジネットワーク又はトランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）上記（ｌ）～（ｎ）のいずれかのポリペプチドのフラグメントであり、かつ膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞（例えば、小胞体、小胞体－ゴルジ体中間区間、ゴルジ体、シスゴルジネットワーク又はトランスゴルジネットワーク）又はエクソソームに局在することができるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド。
　本発明のＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドの取得方法としては、特に制限されず、通常の化学合成法又は遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１～９及び７１～７５のいずれかのヌクレオチド配列に基づいて、ＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドを人工合成することができる。人工合成には、例えば、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社等から提供される市販のＤＮＡ合成サービスを利用することができる。あるいは、例えば、ヒト由来の試料から、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ　ＴＨＩＲＤ　ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｊｏｓｅｐｈ　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｄａｖｉｄ　Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，２００１）記載の方法に従って、配列番号１～９及び７１～７５のいずれかのヌクレオチド配列をクローニングすることができる。
　本発明のＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、例えば、配列番号１～９及び７１～７５のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡに突然変異を導入することによって製造することができる。突然変異導入の手法としては、例えば、紫外線照射及び部位特異的変異導入法が挙げられる。部位特異的変異導入の手法としては、Ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＳＯＥ）ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ，７７，６１－６８，１９８９）を利用した方法、ＯＤＡ法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ－Ｇｏｔｏｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１５２，２７１－２７６，１９９５）、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８５，８２，４８８）等が挙げられる。あるいは、Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｍｕｔａｎ－ＳｕｐｅｒＥｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍキット（タカラバイオ）、ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒTM　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（東洋紡社）等の市販の部位特異的変異導入用キットを利用することもできる。突然変異導入したＤＮＡから、膜貫通ドメインを有し、細胞内小胞に局在し得るものを選択することによって、本発明のＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドを取得することができる。突然変異を導入したＤＮＡがコードするポリペプチドが膜貫通ドメインを有するか否かは、例えば、該ＤＮＡがコードするポリペプチドのアミノ酸配列を基にＳＯＳＵＩ（Ｈｉｒｏｋａｗａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１４（４）：３７８－３７９，１９９８）、ＴＭＨＭＭ（Ｋｒｏｇｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．３０５（３）：５６７－５８０，２００１）などの予測ツールを用いて判別することができる。
　あるいは、ヌクレオチド配列に対するヌクレオチドの欠失、置換、付加、又は挿入の方法は、例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂａｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，５８１－６２１，１９９５）に記載されている。
　あるいは、本発明のＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１～９及び７１～７５のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工ＤＮＡ切断酵素（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ＤＮＡ　ｎｕｃｌｅａｓｅｓ又はＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　ｎｕｃｌｅａｓｅ）を用いたゲノム編集に供することによっても得ることが出来る。
　本発明において、抗原としては、任意のものを用いることができる。具体的には、がん抗原、自己抗原、感染症抗原、アレルゲンなどが挙げられる。
　本発明において、がん抗原は、免疫システムによるがんの攻撃の際にがん細胞と正常細胞とを区別するための目印となる、がん細胞には発現しているが正常細胞には発現していないか発現していても発現量が少ないタンパク質又はそれに由来するペプチドを意味する。がん抗原としては、特に制限されないが、ＭＡＧＥＡ１－４、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ２、ＣＴ８３、ＣＤ１９、ＧＰ１００、ＭＡＲＴ１、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、チロシナーゼ、ＷＴ１、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、ＣＥＡ、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、サイクリンＢ１、ＥＧＦＲ、メソテリン、テロメラーゼ、ＭＵＣ１Ｔ、ＬＳＰ１、ＢＣＲ－ＡＢＬ１、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳなどのがん患者に共通して認められるタンパク質又はそれに由来するペプチド、がん細胞における遺伝子変異に伴い新たに生じたがん抗原であり、免疫原性が高いと考えられているネオアンチゲンなどが挙げられる。このうち、がん抗原として、ＷＴ１、ネオアンチゲン、又はそれらに由来するペプチドが好ましく、ＷＴ１又はそれに由来するペプチドがより好ましい。
　本発明において、自己抗原は、本来正常な身体構成成分であるにも関わらず、宿主で自己免疫反応を誘発し自己免疫疾患の原因となるタンパク質若しくはそれに由来するペプチド、又は宿主における特定の疾患原因となる抗原であって、当該抗原に対して人為的に免疫応答を誘発することで疾患治療が期待できる標的タンパク質若しくはそれに由来するペプチドを意味する。自己免疫疾患の原因となる自己抗原としては、特に制限されないが、例えばＩ型糖尿病では、Ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ　Ｈ、Ｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ　Ａ、Ｇｌｕｔａｍａｔｅ　ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ、Ｉｍｏｇｅｎ－３８、Ｉｎｓｕｌｉｎ、Ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａ　ａｎｔｉｇｅｎ－２、Ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａ　ａｎｔｉｇｅｎ－２Ｂ、Ｉｓｌｅｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｓｕｂｕｎｉｔ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎなどのタンパク質又はそれに由来するペプチドが挙げられ、多発性硬化症では、α－ｅｎｏｌａｓｅ、Ａｑｕａｐｏｒｉｎ－４、β－ａｒｒｅｓｔｉｎ、Ｍｙｅｌｉｎ　ｂａｓｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｍｙｅｌｉｎ　ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｉｃ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、Ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｓ１００－βなどのタンパク質又はそれに由来するペプチドが挙げられ、関節リウマチでは、Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ＩＩ、Ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｈｕｍａｎ　ｃａｒｔｉｌａｇｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　３９などのタンパク質又はそれに由来するペプチドが挙げられ、全身性エリテマトーデスでは、Ｌａ　ａｎｔｉｇｅｎ、ｈｉｓｔｏｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ－β－２　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｉ　ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｐｏｌｙ　（ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ）　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｓｍ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｏｆ　Ｕ－Ｉ　ｓｍａｌｌ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｘなどのタンパク質又はそれに由来するペプチドが挙げられ、シェーグレン症候群では、ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＲＯ６０、Ｌｕｐｕｓ　Ｌａ　ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｍｕｓｃａｒｉｎｉｃ　ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｍ３、Ａｑｕａｐｏｒｉｎ－５、Ｓａｌｉｖａｒｙ　Ｇｌａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　１、Ｃａｒｂｏｎｉｃ　ａｎｈｙｄｒａｓｅ　６、Ｐａｒｏｔｉｄ　ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ－１１などのタンパク質又はそれに由来するペプチドが挙げられ、多発性筋炎／皮膚筋炎では、Ａｍｉｎｏａｃｙｌ－ｔＲＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、Ｈｉｓｔｉｄｙｌ－ｔＲＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、Ｔｈｒｅｏｎｙｌ－ｔＲＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、Ａｌａｎｙｌ－ｔＲＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、Ｉｓｏｌｅｕｃｙｌ－ｔＲＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、Ｇｌｙｃｙｌ－ｔＲＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、Ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌ－ｔＲＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ－ｔＲＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、Ｔｙｒｏｓｙｌ－ｔＲＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、Ｓｉｇｎａｌ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｐａｒｔｉｃｌｅ、Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　１α、ＮｕＲＤ　ｈｅｌｉｃａｓｅ、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｒｙ　ｆａｃｔｏｒ－１－γ、ＰＭＳ１　ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｎｕｃｌｅａｒ　ｍａｔｒｉｘ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＮＸＰ２、ＳＵＭＯ－１　ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ　Ａなどのタンパク質又はそれに由来するペプチドが挙げられ、バゼドウ氏病では、Ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒなどのタンパク質又はそれに由来するペプチドが挙げられる。このうち、自己抗原として、Ｍｙｅｌｉｎ　ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｉｃ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ又はそれに由来するペプチドが好ましい。
　人為的に免疫応答を誘発する標的となる自己抗原としては、アルツハイマー型認知症では、Ａｍｙｌｏｉｄ　β、Ｔａｕ　ｐｒｏｔｅｉｎなどのタンパク質又はそれに由来するペプチドが挙げられ、パーキンソン病では、α　ｓｉｎｕｃｌｅｉｎなどのタンパク質又はそれに由来するペプチドが挙げられ、動脈硬化症では、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ　ｅｓｔｅｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ＡｐｏＢ－１００、Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ　ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ　ｔｙｐｅ　９、Ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　６０などのタンパク質又はそれに由来するペプチドが挙げられ、高血圧症では、Ｔｙｐｅ－１　ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　ＩＩ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ａｌｐｈａ　１Ｄ－Ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒなどのタンパク質又はそれに由来するペプチドが挙げられ、２型糖尿病では、Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ　ｐｅｐｔｉｄａｓｅ　４などのタンパク質又はそれに由来するペプチドが挙げられ、肥満症では、Ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ－１、Ｇｈｒｅｌｉｎ、Ｐｅｐｔｉｄｅ　ＹＹなどのタンパク質又はそれに由来するペプチドが挙げられ、骨粗しょう症では、ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ＮＦ－ｋａｐｐａＢ　ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）などのタンパク質又はそれに由来するペプチドが挙げられる。
　本発明において、感染症抗原としては、感染症の原因となるウイルス、細菌、真菌及び原生動物に由来する抗原が挙げられる。ウイルス抗原は、ウイルスを構成するタンパク質又はそれに由来するペプチドを意味する。ウイルス抗原としては、特に限定されないが、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、ＲＳウイルス、アデノウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、日本脳炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ノロウイルス、ロタウイルス、ジカウイルス、サイトメガロウイルス、パピローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、成人Ｔ細胞白血病ウイルスなどのウイルスの構成タンパク質又はそれに由来するペプチドが挙げられる。
　細菌抗原は、細菌を構成するタンパク質又はそれに由来するペプチドを意味する。細菌抗原としては、特に限定されないが、百日咳菌、ジフテリア菌、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクター、髄膜炎菌、緑膿菌、肺炎球菌、Ａ群連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、破傷風菌、レジオネラ菌、結核菌、マイコプラズマなどの細菌の構成タンパク質又はそれに由来するペプチドが挙げられる。
　真菌抗原としては、真菌やその胞子を構成するタンパク質又はそれに由来するペプチドを意味する。真菌抗原としては、アスペルギルス属真菌（例えばAspergillus fumigatus、Aspergillus flavus、Aspergillus terreus、Aspergillus nidulans、Aspergillus niger、Aspergillus ustus等)、ブラストミセス属真菌（例えば、Blastomyces dermatitidis等）、カンジダ属真菌（例えばCandida albicans等）、コクシジオイデス属真菌（例えばCoccidiodes immitis等）、クリプトコッカス属真菌（例えばCryptococcus neoformans、Cryptococcus gattii等）、ヒストプラズマ属真菌（例えばHistoplasma capsulatum等）、パラコクシジオイデス属真菌（例えばParacoccidioides brasiliensis等）、スポロトリクス属真菌（例えばSporothrix schenckii等）などの真菌やその胞子の構成タンパク質又はそれに由来するペプチドが挙げられる。
　原生動物抗原としては、原生動物を構成するタンパク質又はそれに由来するペプチドを意味する。原生動物抗原としては、マラリア原虫、リーシュマニア、クリプトスポリジウム、ガンビアトリパノソーマ、ローデシアトリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、トリコモナス、トキソプラズマ、バベシア、赤痢アメーバ、ジアルジアなどの原生動物の構成タンパク質又はそれに由来するペプチドが挙げられる。
　このうち、感染症抗原として、細菌抗原、真菌抗原、又は原生動物抗原が好ましい。
　本発明において、アレルゲンは、吸入、刺入、摂取又は接触により外部から生体に入り、過敏反応やアレルギー反応を惹起するタンパク質又はそれに由来するペプチドを意味する。アレルゲンとしては、特に限定されないが、イネ科植物花粉（アシ、オオアワガエリ、オオスズメノテッポウ、カモガヤ、ギョウギシバ、小麦、コヌカグサ、スズメノヒエ、セイバンモロコシ、ナガハグサ、ハルガヤ、ヒロハウシノケグサ、ホソムギなど）；雑草花粉（アキノキリンソウ、イラクサ、オオブタクサ、カナムグラ、シロザタンポポ、ニガヨモギ、ヒメスイバ、ブタクサ、ブタクサモドキ、フランスギク、ヘラオオバコ、ヨモギなど）；樹木花粉（アカシア、オリ一ブ、カエデ、クルミ、クワ、コナラ、シラカンバ、スギニレ、ハンノキ、スギ、ヒノキ、ビャクシン、ブナ、マツ、ヤナギなど）；真菌又は細菌類（アスペルギルス、アルテルナリア、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＡ、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、カンジダ、クラドスポリウム、トリコフィトン、ピティロスポリウム、ペニシリウム、ヘルミントスポリウム、マラセチア、ムコールなど）；動物表皮（アヒル羽毛、猫皮屑、犬皮屑、牛皮屑、馬皮屑、家兎上皮、ハムスター上皮、モルモット上皮、羊上皮、豚上皮、ヤギ上皮、ニワトリ羽毛、ガチョウ羽毛、セキセイインコ羽毛、セキセイインコのふん、マウス、ラットなど）；昆虫（アシナガバチ、ガ、ゴキブリ、スズメバチ、ミツバチ、ヤブカ、ユスリカ(成虫)など）；寄生虫（アニサキス、回虫など）；ダニ（アシブトコナダニ、ケナガコナダニ、コナヒョウダニ、サヤアシニクダニ、ヤケヒョウダニなど）；食物（卵、乳、小麦、そば、落花生、えび、かに、アーモンド、あわび、いか、いくら、オレンジ、カシューナッツ、キウイフルーツ、牛肉、くるみ、ごま、さけ、さば、大豆、鶏肉、バナナ、豚肉、まつたけ、もも、やまいも、りんご、ゼラチンなど）；ヒトインシュリンなどに含まれるタンパク質又はそれに由来するペプチドが挙げられる。このうち、アレルゲンとして、食物に含まれるタンパク質又はそれに由来するペプチドが好ましく、卵に含まれるタンパク質又はそれに由来するペプチドがより好ましい。
　その他の抗原としては、セリアック病の原因となるグルテンを構成するグルテニンやグリアジンタンパク質又はそれに由来するペプチドが挙げられる。
　本発明の抗原をコードするポリヌクレオチドの取得方法としては、特に制限されず、上述のＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドを取得する場合と同様に、通常の化学合成法又は遺伝子工学的手法により得ることができる。抗原をコードするポリヌクレオチドとしては、抗原の全長をコードするポリヌクレオチドであってもよいし、抗原として機能する限りにおいて、抗原の部分ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってもよい。また、１つの抗原をコードするポリヌクレオチドを複数連続して発現可能に連結させたポリヌクレオチドであってもよいし、２種以上の抗原をコードするポリヌクレオチドを発現可能に連結させたポリヌクレオチドであってもよい。本発明の核酸構築物に用いる抗原は、少なくとも１種類であり、かつ、好ましくは５種類以下、より好ましくは３種類以下、さらに好ましくは２種類以下である。また、本発明の核酸構築物に用いる抗原は、５種類、４種類、３種類、２種類又は１種類であり得る。
　好ましくは、本発明の核酸構築物は、ＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドの下流に抗原をコードするポリヌクレオチドが発現可能に連結された核酸構築物であり、より好ましくは、ＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドの下流に抗原をコードするポリヌクレオチドがリンカーをコードするポリヌクレオチド及び／又はプロタンパク質転換酵素（ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ）認識配列をコードするポリヌクレオチドを介して発現可能に連結された核酸構築物であり、さらに好ましくは、ＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドの下流に抗原をコードするポリヌクレオチドがリンカーをコードするポリヌクレオチド及びプロタンパク質転換酵素認識配列をコードするポリヌクレオチドを介して発現可能に連結された核酸構築物である。本発明の核酸構築物にリンカーをコードするポリヌクレオチド及びプロタンパク質転換酵素認識配列をコードするポリヌクレオチドを含む場合、その連結順序は特に制限されず、リンカーをコードするポリヌクレオチドの下流にプロタンパク質転換酵素認識配列をコードするポリヌクレオチドが連結されていてもよいし、プロタンパク質転換酵素認識配列をコードするポリヌクレオチドの下流にリンカーをコードするポリヌクレオチドが連結されていてもよい。また、プロタンパク質転換酵素認識配列が１～５回程度繰り返された配列が連結されていてもよいし、リンカーをコードする複数のポリヌクレオチドに挟まれる形でプロタンパク質転換酵素認識配列をコードするポリヌクレオチドが連結されていてもよい。尚、ＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドと抗原をコードするポリヌクレオチドの間には、両者の発現を損ねない限りにおいて、リンカーをコードするポリヌクレオチド及びプロタンパク質転換酵素認識配列をコードするポリヌクレオチド以外の任意のポリヌクレオチドを含んでいてもよい。
　本発明において、リンカーとは、２種のポリペプチドを連結するペプチドリンカーを指す。リンカーとしては、ＳＮＡＲＥタンパク質と抗原を正常に機能させることができるものであればよく、特に制限されない。リンカーの長さは、好ましくは３アミノ酸残基以上、より好ましくは４アミノ酸残基以上、さらに好ましくは５アミノ酸残基以上であり、かつ、好ましくは３０アミノ酸残基以下、より好ましくは２５アミノ酸残基以下、さらに好ましくは２０アミノ酸残基以下である。また、リンカーの長さは、好ましくは３～３０アミノ酸残基、より好ましくは４～２５アミノ酸残基、さらに好ましくは５～２０アミノ酸残基である。斯かるリンカーとしては、Ｇ、ＧＳ、ＧＧＳ、ＧＧＧＳ（配列番号９２）、ＧＧＧＧＳ（配列番号９３）、ＥＡＡＡＫ（配列番号９４）、またはＸＰを構成要素として有するリンカーが挙げられる。ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。具体例としては、それぞれの構成要素が１～５回、好ましくは３もしくは４回繰り返された配列からなるリンカーが挙げられ、好ましい具体例としては、ＧＧＧＧＳが３回繰り返された配列からなるリンカーが挙げられる（配列番号２０）。配列の構成要素がＧＧＧＧＳの場合、繰り返し配列の前にアミノ酸残基Ｓが付加されてもよく、又はＥＡＡＡＫの場合、繰り返し配列の前後にアミノ酸残基Ａが付加されてもよい。
　本発明において、プロタンパク質転換酵素認識配列とは、ゴルジ体などでプロタンパク質を生理学的に活性なタンパク質又はペプチドに転換するセリンプロテアーゼであるプロタンパク質転換酵素が認識するアミノ酸配列を指し、具体的には、Ｘ－Ａｒｇ－Ｘ－（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）－Ａｒｇからなるアミノ酸配列（例えば、配列番号２２）である。ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。プロタンパク質転換酵素としては、ｆｕｒｉｎ、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＣ５／６、ＰＣ７、ＰＡＣＥ４などが挙げられ、これらの酵素が共通してＡｒｇ－Ｘ－（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）－Ａｒｇモチーフをよく認識することが知られている（Remacle AG, et al. Journal of Biological Chemistry 2008, 283(30): 20897-20906）。よって、プロタンパク質転換酵素認識配列は、Ａｒｇ－Ｘ－（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）－Ａｒｇであり得る。ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。プロタンパク質転換酵素は、上記アミノ酸配列を認識し、Ｃ末端のアルギニン残基のＣ末端側を切断する。本発明において、好ましくは、プロタンパク質転換酵素はｆｕｒｉｎであり、ｆｕｒｉｎ認識配列は上記のプロタンパク質転換酵素認識配列と同じである。
　リンカーをコードするポリヌクレオチド又はプロタンパク質転換酵素認識配列をコードするポリヌクレオチドの取得方法としては、特に制限されず、通常の化学合成法又は遺伝子工学的手法により得ることができる。
　本発明の核酸構築物に含まれるＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチド、抗原をコードするポリヌクレオチド、リンカーをコードするポリヌクレオチド又はプロタンパク質転換酵素認識配列をコードするポリヌクレオチドは、必要に応じて、該核酸構築物の投与対象の種にあわせて、コドン最適化されてもよい。各種生物が使用するコドンの情報は、Ｃｏｄｏｎ　Ｕｓａｇｅ　Ｄａｔａｂａｓｅ（[www.kazusa.or.jp/codon/]）から入手可能である。
　好ましい一例において、本発明の核酸構築物は、発現カセットであり、ＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチド及び抗原をコードするポリヌクレオチドの発現を制御するための制御領域を含む。発現カセットにおいて、ＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチド及び抗原をコードするポリヌクレオチドは、制御領域と作動可能に連結されている。制御領域の例としては、プロモーター、ターミネーター、エンハンサーなどが挙げられる。好ましくは、発現カセットは、ＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチド及び抗原をコードするポリヌクレオチドの上流に連結されたプロモーターを含む。
　本発明の核酸構築物は、一端又は両端に、制限酵素認識部位を有することができる。該制限酵素認識部位を使用して、本発明の核酸構築物をベクターに導入することができる。例えば、ベクターを制限酵素で切断し、そこに、制限酵素認識部位を端部に有する本発明の核酸構築物を添加することによって、該核酸構築物をベクターに導入することができる。
　ベクターの種類は特に限定されず、プラスミドベクター、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター等の任意のベクターであってよい。一例において、本発明の核酸構築物を組み込むべきベクターは発現ベクターであり得るが、一方、組み込まれる核酸構築物が発現カセットである場合は、発現ベクターである必要はない。一例においては、本発明の核酸構築物は制御領域を含む発現カセットであり、任意のベクターに組み込まれて発現ベクターを構築する。別の一例においては、制御領域を含む発現ベクターに本発明の核酸構築物を組み込むことで、該発現ベクター上に本発明の発現カセットが構築される。
　好ましい一例において、本発明の核酸構築物はプラスミドベクターである。プラスミドベクターとしては、これらに限定されるものではないが、ｐＶＡＸ１などのプラスミドベクターが挙げられる。ここで、プラスミドベクターには、一般的に、細菌培養中にプラスミドベクターを選択的に保持することを目的として薬剤耐性遺伝子が配列内に組み込まれているが、生体内の細菌叢への当該遺伝子の伝播や哺乳類プロモーターを介した当該遺伝子の活性化並びに発現の危険性があることから、当該遺伝子配列を除去したプラスミドベクターがより好ましい。
　好ましい一例において、本発明の核酸構築物はウイルスベクターである。ウイルスベクターとしては、これらに限定されるものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターなどが挙げられる。
　好ましい一例において、本発明の核酸構築物はｍＲＮＡ構築物である。例えば、ＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチド及び抗原をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡを鋳型として、ＨｉＳｃｒｉｂｅ　Ｔ７　ＡＲＣＡ　ｍＲＮＡ　Ｋｉｔ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｔ７　ｍＳｃｒｉｐｔTM　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｍＲＮＡ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ）、ＨｉｇｈＹｉｅｌｄ　Ｔ７　ＡＲＣＡ　ｍＲＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｊｅｎａ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）等の市販のｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写用キットを利用することで、本発明の核酸構築物をｍＲＮＡとして得ることができる。
　後記実施例に示すように、本発明のＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドと抗原をコードするポリヌクレオチドとを含む核酸構築物は、抗原をコードするポリヌクレオチドのみを含む核酸構築物と比較して、免疫原性が高く、抗原特異的なＴｈ１型の免疫応答を誘導又は増強し、抗原特異的な細胞性免疫応答を誘導又は増強することができる。これは、細胞内に取り込まれた核酸構築物が翻訳又は転写及び翻訳されて抗原タンパク質として発現し、細胞内小胞に輸送されて抗原の一部が主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子と結合し、細胞表面に輸送される抗原提示プロセスにおいて、本発明の核酸構築物では、抗原タンパク質がＳＮＡＲＥタンパク質と抗原の融合ポリペプチドとして発現することで、抗原タンパク質の細胞内小胞への標的化が図られＭＨＣ分子との会合確率が上昇することにより、抗原提示の効率が向上したためと推測される。加えて、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、抗原を含有したエクソソームが抗原特異的なＴｈ１型の免疫応答を増強することが報告されている（Qazi KR, et al. Blood. 2009, 113(12): 2673-83.）。よって、抗原タンパク質がＳＮＡＲＥタンパク質と抗原の融合ポリペプチドとして発現することで、抗原タンパク質のエクソソームへの標的化が図られ、免疫原性が向上した可能性も考えられる。
　尚、免疫応答がＴｈ１型であるかＴｈ２型であるか、あるいは細胞性免疫応答であるか液性免疫応答であるかを判定するための指標となり得るＩＦＮγ、ＩＬ－４などのサイトカインの産生量は、従来公知の方法で測定することができる。そのような方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ）、ＥＬＩＳＰＯＴ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ｓｐｏｔ）アッセイ、免疫組織染色、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＲＴ－ＰＣＲ、マイクロアレイ、フローサイトメトリーなどが挙げられる。後記実施例で用いているＥＬＩＳＰＯＴアッセイキット（Ｃ．Ｔ．Ｌ．）など、サイトカイン産生測定のための試薬やキットは市販されており、これを用いて測定してもよい。
　また、免疫応答がＴｈ１型であるかＴｈ２型であるか、あるいは細胞性免疫応答であるか液性免疫応答であるかを判定するための別の指標となり得るＩｇＧのサブクラス別の産生量は、従来公知の方法で測定することができる。そのような方法としては、ＥＬＩＳＡ、免疫比濁法などが挙げられる。
　Ｔｈ１型免疫応答及び細胞性免疫応答は、サイトカインの産生量及び／又はＩｇＧサブクラスの産生量を指標として、評価することができる。例えば、ＩＦＮγの産生量又はＩＬ－４に対するＩＦＮγの産生量比率（ＩＦＮγ／ＩＬ－４）が増加すれば、Ｔｈ１型免疫応答及び細胞性免疫応答が誘導又は増強されたと評価でき、一方、ＩＦＮγの産生量又はＩＦＮγ／ＩＬ－４が低下すれば、Ｔｈ１型免疫応答及び細胞性免疫応答が減弱したと評価できる。あるいは、ＩｇＧ２ａの産生量及び／又はＩｇＧ１に対するＩｇＧ２ａの産生量比率（ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１）が増加すれば、Ｔｈ１型免疫応答及び細胞性免疫応答が誘導又は増強されたと評価でき、一方、ＩｇＧ２ａの産生量及び／又はＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１が低下すれば、Ｔｈ１型免疫応答及び細胞性免疫応答が減弱したと評価できる。
　したがって、本発明の核酸構築物は、抗原特異的なＩＦＮγ産生増強剤、ＩｇＧ２ａ産生増強剤、Ｔｈ１型免疫応答誘導又は増強剤、細胞性免疫応答誘導又は増強剤（以下、細胞性免疫応答誘導又は増強剤等と称する）となり得、該核酸構築物は、細胞性免疫応答誘導又は増強剤等を製造するために使用できる。
　また、本発明の核酸構築物は、抗原特異的なＩＦＮγ産生を増強するため、ＩｇＧ２ａ産生を増強するため、Ｔｈ１型免疫応答を誘導又は増強するため、細胞性免疫応答を誘導又は増強するために使用できる。ここで、当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物への投与、又はそれらに由来する検体における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。尚、「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。
　本発明の細胞性免疫応答誘導又は増強剤等は、それ自体で、抗原特異的なＩＦＮγ産生増強のため、ＩｇＧ２ａ産生増強のため、Ｔｈ１型免疫応答誘導又は増強のため、細胞性免疫応答誘導又は増強のための医薬品、医薬部外品となり、また当該医薬品、医薬部外品に配合して使用される素材又は製剤となり得る。
　本発明の細胞性免疫応答誘導又は増強剤等を医薬品（医薬部外品を含む）として用いる場合、当該医薬品は任意の投与形態で投与され得る。投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与又は注射剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、外用剤等による非経口投与が挙げられるが、好ましくは非経口投与であり、より好ましくは注射剤による非経口投与である。
　このような種々の剤型の医薬製剤は、本発明の核酸構築物と他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤、増粘剤、乳化剤、滑沢剤、分散剤、被膜剤、界面活性剤、被膜剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、嬌味剤、矯臭剤、香料等を適宜組み合わせて調製することができる。
　上記医薬品（医薬部外品を含む）における本発明の核酸構築物の含有量は、対象とする抗原や投与される対象、投与経路によって変動するため、特に限定されず広範囲に適宜選択される。一例として、組成物全体の０．００００１～１００質量％の間で当該核酸構築物を含み得る。
　本発明の細胞性免疫応答誘導又は増強剤等の投与量は、対象の種、体重、性別、年齢、状態又はその他の要因に従って変動し得る。投与の用量、経路、間隔は、当業者によって適宜決定され得る。例えば、投与量は、本発明の核酸構築物の量として、成人（体重６０ｋｇ）１人、１日あたり、１ｎｇ～１０ｍｇの間で決定される。核酸構築物がウイルスベクターの場合、投与量は、一例として成人（体重６０ｋｇ）１人、１日あたり、１０～１×１０15ウイルス粒子であり得る。
　本発明の細胞性免疫応答誘導又は増強剤等は、ヒト及び非ヒト動物のいずれに対しても投与することができる。非ヒト動物としては、非ヒト哺乳動物が挙げられ、非ヒト哺乳動物としては、例えば類人猿、その他霊長類、マウス、ラット、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ハムスター、及びコンパニオン動物等が挙げられる。好ましくは、本発明の細胞性免疫応答誘導又は増強剤等は、ヒトに投与される。より好ましくは、本発明の細胞性免疫応答誘導又は増強剤等は、がん、自己免疫疾患、もしくはアレルギーの患者、又はがん、自己免疫疾患、もしくはアレルギーの恐れのあるヒトに投与される。
　また、本発明の核酸構築物は、核酸ワクチンとなり得、該核酸構築物は、核酸ワクチンを製造するために使用できる。
　さらに、本発明の核酸構築物は、抗原特異的なＴｈ１型免疫応答を誘導もしくは増強するため及び／又は抗原特異的な細胞性免疫応答を誘導もしくは増強するために使用できる。ここで、当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物への投与、又はそれらに由来する検体における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。
　本発明の核酸ワクチンは、それ自体で、抗原特異的なＴｈ１型免疫応答を誘導もしくは増強するため及び／又は抗原特異的な細胞性免疫応答を誘導もしくは増強するための医薬品となり、また当該医薬品に配合して使用される素材又は製剤となり得る。
　一実施形態において、核酸ワクチンは、ＤＮＡワクチンである。ＤＮＡワクチンは、プラスミドベクターである本発明の核酸構築物を含む。プラスミドベクターとしては、特に限定されないが、例えば、ｐＶＡＸ１ベクターが挙げられる。なかでも、安全性の点から、薬剤耐性遺伝子を含まないプラスミドベクターが好ましい。
　別の一実施形態において、核酸ワクチンは、ｍＲＮＡワクチンである。ｍＲＮＡワクチンは、ｍＲＮＡである本発明の核酸構築物を含み、該核酸構築物は、ｍＲＮＡの安定化、翻訳効率向上或いは過剰な免疫応答を防ぐため、Ｃａｐ構造やｐｏｌｙＡを付加する処理を施したｍＲＮＡ、及び／又は一部の塩基が修飾（例えばウリジンがシュードウリジンや１メチルシュードウリジンに置換）されているｍＲＮＡであってもよい。また、本発明の核酸構築物を含み、ウイルス由来ＲＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＲｄＲＰ）　ｃｏｍｐｌｅｘの配列及びその複製起点（５’ＣＳＥ、３’ＣＳＥ）を含むＳｅｌｆ－ａｍｐｌｙｆｉｎｇ　ＲＮＡや、本発明の核酸構築物及びＲｄＲＰ　ｃｏｍｐｌｅｘの複製起点を含むＲＮＡとＲｄＲＰ　ｃｏｍｐｌｅｘの配列を含むｍＲＮＡを混合したＴｒａｎｓ－ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ　ＲＮＡであってもよい。ｍＲＮＡワクチンは、好ましくはｍＲＮＡの安定化と送達のためのキャリアとして脂質を構成成分とするリポソーム又は脂質ナノ粒子、高分子ポリマーを構成成分とするＰＬＧＡナノ粒子等のポリマーナノ粒子などのドラッグデリバリーを担う構築物をさらに含み、より好ましくはｍＲＮＡが当該構築物に封入されている。
　さらに別の一実施形態において、核酸ワクチンは、ウイルスベクターワクチンである。ウイルスベクターワクチンは、ウイルスベクターである本発明の核酸構築物を含む。ウイルスベクターとしては、特に限定されないが、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターなどが挙げられる。
　本発明の核酸ワクチンは、上記核酸構築物の他に、適宜、薬学的に許容され得る担体を含有し、所定の形態で製剤化され得る。
　ここで、担体としては、ワクチンの製造に通常用いられる担体が挙げられ、具体的には、緩衝剤、乳化剤、保存剤（例えば、チメロサール）、等張化剤、ｐＨ調整剤、粘稠剤、アジュバント若しくは免疫刺激剤等が例示される。アジュバントとは、抗原と共に投与することで、当該抗原に対する免疫応答を増強させる物質であるが、本発明の核酸ワクチンは、自身がアジュバントとして機能し得ることから、アジュバントの添加は必ずしも必要とせず、アジュバントを含有しない組成物としてもよい。
　本発明の核酸ワクチンは、好ましくは液体形態で、意図する投与経路に適合するように適当に製剤される。投与経路としては経口投与と非経口投与があり、例えば、筋肉内、皮内、皮下、経皮、鼻腔内、舌下、経口、吸入等が挙げられるが、好ましくは筋肉内、皮内、又は皮下投与である。注射投与製剤としては、例えば、液剤、エマルジョン剤、水溶性又は疎水性の懸濁剤や、液体を添加して溶解あるいは懸濁させて使用する乾燥粉末の剤型が挙げられる。あるいは、本発明の核酸ワクチンは、本発明の核酸ワクチンを導入した樹状細胞として投与することもできる。斯かる投与は、具体的には、投与対象の生体より末梢血を採取して樹状細胞前駆細胞を分離し、適当なサイトカイン存在下で該前駆細胞より樹状細胞を分化誘導し、本発明の核酸ワクチンを導入して樹状細胞に抗原を提示させ、該樹状細胞を該投与対象に投与することにより行うことができる。投与される樹状細胞は、いわゆる樹状細胞ワクチンと称されるものである。樹状細胞ワクチンにより、抗原提示の効率を向上し、免疫誘導能を高めることが可能である。
　本発明の核酸ワクチンにおける本発明の核酸構築物の含有量は、対象とする抗原や投与される対象、投与経路によって変動するため、特に限定されず広範囲に適宜選択される。一例として、核酸ワクチン全体の０．００００１～１００質量％の間で当該核酸構築物を含み得る。
　本発明の核酸ワクチンの投与量は、対象の種、体重、性別、年齢、状態又はその他の要因に従って変動し得る。投与の用量、経路、間隔は、当業者によって適宜決定され得る。例えば、投与量は、本発明の核酸構築物の量として、１投与単位あたり、１ｎｇ～１０ｍｇの間で決定される。核酸構築物がウイルスベクターの場合、投与量は、一例として１投与単位あたり、１０～１×１０15ウイルス粒子であり得る。
　本発明の核酸ワクチンは、ヒト及び非ヒト動物のいずれに対しても投与することができる。非ヒト動物としては、上記同様のものが挙げられる。好ましくは、本発明の核酸ワクチンは、ヒトに投与される。より好ましくは、本発明の核酸ワクチンは、がん、自己免疫疾患、もしくはアレルギーの患者、又はがん、自己免疫疾患、もしくはアレルギーの恐れのあるヒトに投与される。
　本発明の核酸ワクチンの投与回数は、用途に応じて適宜設定すればよく、少なくとも１回であるが、有効性の観点から、２回以上としてもよい。更なる投与を時に追加免疫といい、これにより、より効果の高い感染防御あるいは治療効果を奏することができる。追加免疫の間隔は、少なくとも１週間が推奨され、１～４週間の間隔が好ましい。
　核酸ワクチンは、細菌やウイルスそのものとは異なり病原性がなく、生ワクチンや不活化ワクチンと比べて安全性が高いと考えられる。また、抗原をコードする核酸を変更することにより多種多様な抗原に対応でき、核酸であることから低コストで迅速な製造が可能となる。
　好ましい一実施形態において、本発明の核酸ワクチンは、がんワクチンである。具体的には、該がんワクチンは、本発明のＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、抗原としてがん抗原をコードするポリヌクレオチドとを含む、核酸構築物を含む。該がんワクチンは、そのまま生体に投与するか、樹状細胞ワクチンとして投与すればよい。斯かるがんワクチンは、がん抗原特異的な細胞性免疫応答を誘導又は増強し、抗腫瘍効果を発揮できると考えられる。
　別の好ましい一実施形態において、本発明の核酸ワクチンは、感染症ワクチンである。具体的には、該感染症ワクチンは、本発明のＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、抗原としてウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、又は原生動物抗原をコードするポリヌクレオチドとを含む、核酸構築物を含む。該感染症ワクチンは、そのまま生体に投与すればよい。斯かる感染症ワクチンは、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、又は原生動物抗原特異的な細胞性免疫応答を誘導又は増強することで、感染症に対する予防又は治療効果を発揮できると考えられる。特に、従来のワクチンでは十分な予防又は治療効果が得られないヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、結核などを原因とする慢性感染症の予防又は治療ワクチンとして期待される。
　別の好ましい一実施形態において、本発明の核酸ワクチンは、アレルギー予防又は治療用ワクチン、好ましくはアレルギー免疫療法用ワクチンである。具体的には、該アレルギー予防又は治療用ワクチンは、本発明のＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、抗原としてアレルゲンをコードするポリヌクレオチドとを含む、核酸構築物を含む。該アレルギー予防又は治療用ワクチンは、そのまま生体に投与すればよい。斯かるアレルギー予防又は治療用ワクチンは、アレルゲン特異的なＴｈ１型免疫応答並びに細胞性免疫応答を誘導又は増強することで、Ｔｈ２型免疫応答の過剰な活性化によって引き起こされるアレルギー応答に対する抑制効果を発揮できると考えられる。
　別の好ましい一実施形態において、本発明の核酸ワクチンは、自己免疫疾患治療用ワクチンである。具体的には、該自己免疫疾患治療用ワクチンは、本発明のＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、抗原として自己抗原をコードするポリヌクレオチドとを含む、核酸構築物を含む。該自己免疫疾患治療用ワクチンは、そのまま生体に投与すればよい。斯かる自己免疫疾患治療用ワクチンは、コードされた自己抗原に対する免疫寛容を誘導することにより、自己免疫反応に対する抑制効果を発揮できると考えられる。
　本発明の例示的実施形態として、以下の物質、製造方法、用途、方法等をさらに本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
〔１〕ＶＡＭＰ７、ＧＯＳＲ２、ＳＴＸ１０、ＳＴＸ１８、ＢＮＩＰ１、ＳＴＸ７、ＶＴＩ１Ａ、ＳＴＸ１６、ＳＴＸ５、ＧＯＳＲ１、ＳＴＸ８、ＳＴＸ１２、ＶＡＭＰ８、及びＳＥＣ２２Ｂからなる群より選択されるいずれかのＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、抗原をコードするポリヌクレオチドとを含む、核酸構築物。
〔２〕前記ＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドの下流に前記抗原をコードするポリヌクレオチドが連結されている、〔１〕記載の核酸構築物。
〔３〕前記ＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチド及び前記抗原をコードするポリヌクレオチドが、リンカーをコードするポリヌクレオチド及び／又はプロタンパク質転換酵素認識配列をコードするポリヌクレオチド、好ましくはリンカーをコードするポリヌクレオチド及びプロタンパク質転換酵素認識配列をコードするポリヌクレオチドを介して連結されている、〔１〕又は〔２〕記載の核酸構築物。
〔４〕前記該プロタンパク質転換酵素認識配列が、Ａｒｇ－Ｘ－（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）－Ａｒｇからなるアミノ酸配列（Ｘは任意のアミノ酸残基を示す）であり、好ましくはＸ－Ａｒｇ－Ｘ－（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）－Ａｒｇからなるアミノ酸配列（Ｘは任意のアミノ酸残基を示す）であり、より好ましくは配列番号２２で示されるアミノ酸配列である、〔３〕記載の核酸構築物。
〔５〕プラスミドベクター、ｍＲＮＡ、又はウイルスベクターである、〔１〕～〔４〕のいずれか１項記載の核酸構築物。
〔６〕前記抗原が、がん抗原、自己抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生動物抗原及びアレルゲンからなる群より選択される少なくとも１種であり、好ましくはがん抗原、自己抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、及び原生動物抗原からなる群より選択される少なくとも１種であり、より好ましくはがん抗原、自己抗原、細菌抗原、真菌抗原、及び原生動物抗原からなる群より選択される少なくとも１種である、〔１〕～〔５〕のいずれか１項記載の核酸構築物。
〔７〕前記ＳＮＡＲＥタンパク質が、好ましくは哺乳動物のＳＮＡＲＥタンパク質であり、より好ましくはヒトＳＮＡＲＥタンパク質である、〔１〕～〔６〕のいずれか１項記載の核酸構築物。
〔８〕前記ＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、好ましくは配列番号１～９及び７１～７５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及びこれらと同等の機能を有するポリヌクレオチドからなる群より選択されるいずれかのポリヌクレオチドであり、より好ましくは配列番号１～９及び７１～７５のいずれかのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである、〔１〕～〔７〕のいずれか１項記載の核酸構築物。
〔９〕前記ＳＮＡＲＥタンパク質が、好ましくはＶＡＭＰ７、ＧＯＳＲ２、ＳＴＸ１０、ＳＴＸ１８、ＢＮＩＰ１、ＳＴＸ７、ＶＴＩ１Ａ、ＳＴＸ１６、ＳＴＸ５、及びＧＯＳＲ１からなる群より選択されるいずれかであり、より好ましくはＶＡＭＰ７、ＧＯＳＲ２、ＳＴＸ１０、ＳＴＸ１８、ＢＮＩＰ１、ＳＴＸ７、ＶＴＩ１Ａ、及びＧＯＳＲ１からなる群より選択されるいずれかであり、さらに好ましくはＶＡＭＰ７、ＧＯＳＲ２、ＳＴＸ１０、及びＧＯＳＲ１からなる群より選択されるいずれかであり、さらに好ましくはＶＡＭＰ７である、〔１〕～〔８〕のいずれか１項記載の核酸構築物。
〔１０〕〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の核酸構築物を含む医薬組成物。
〔１１〕〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の核酸構築物を有効成分とする核酸ワクチン。
〔１２〕抗原特異的Ｔｈ１型免疫応答を誘導又は増強するものである、〔１１〕記載の核酸ワクチン。
〔１３〕抗原特異的細胞性免疫応答を誘導又は増強するものである、〔１１〕記載の核酸ワクチン。
〔１４〕がんワクチンであり、前記抗原ががん抗原からなる群より選択される少なくとも１種である、〔１１〕～〔１３〕のいずれか１項記載の核酸ワクチン。
〔１５〕感染症ワクチンであり、前記抗原がウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原及び原生動物抗原からなる群より選択される少なくとも１種である、〔１１〕～〔１３〕のいずれか１項記載の核酸ワクチン。
〔１６〕アレルギー予防又は治療用ワクチンであり、前記抗原がアレルゲンからなる群より選択される少なくとも１種である、〔１１〕～〔１３〕のいずれか１項記載の核酸ワクチン。
〔１７〕自己免疫疾患治療用ワクチンであり、前記抗原が自己抗原からなる群より選択される少なくとも１種である、〔１１〕～〔１３〕のいずれか１項記載の核酸ワクチン。
〔１８〕前記核酸ワクチンが、前記核酸構築物を、好ましくは０．００００１～１００質量％含有する、〔１１〕～〔１７〕のいずれか１項記載の核酸ワクチン。
〔１９〕核酸ワクチンを製造するための、〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の核酸構築物の使用。
〔２０〕前記核酸ワクチンががんワクチンであり、前記抗原ががん抗原からなる群より選択される少なくとも１種である、〔１９〕記載の使用。
〔２１〕前記核酸ワクチンが感染症ワクチンであり、前記抗原がウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原及び原生動物抗原からなる群より選択される少なくとも１種である、〔１９〕記載の使用。
〔２２〕前記核酸ワクチンがアレルギー予防又は治療用ワクチンであり、前記抗原がアレルゲンからなる群より選択される少なくとも１種である、〔１９〕記載の使用。
〔２３〕前記核酸ワクチンが自己免疫疾患治療用ワクチンであり、前記抗原が自己抗原からなる群より選択される少なくとも１種である、〔１９〕記載の使用。
〔２４〕前記核酸ワクチンが、前記核酸構築物を、好ましくは０．００００１～１００質量％含有する、〔１９〕～〔２３〕のいずれか１項記載の使用。
〔２５〕抗原特異的Ｔｈ１型免疫応答の誘導もしくは増強及び／又は抗原特異的細胞性免疫応答の誘導もしくは増強のための、〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の核酸構築物の使用。
〔２６〕抗原特異的Ｔｈ１型免疫応答の誘導もしくは増強及び／又は抗原特異的細胞性免疫応答の誘導もしくは増強に使用するための、〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の核酸構築物。
〔２７〕〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の核酸構築物を、それを必要とする対象に有効量で投与する、抗原特異的Ｔｈ１型免疫応答の誘導もしくは増強及び／又は抗原特異的細胞性免疫応答の誘導もしくは増強方法。
〔２８〕抗原特異的Ｔｈ１型免疫応答の誘導もしくは増強及び／又は抗原特異的細胞性免疫応答の誘導もしくは増強のための、〔１１〕～〔１８〕のいずれか１項記載の核酸ワクチンの使用。
〔２９〕抗原特異的Ｔｈ１型免疫応答の誘導もしくは増強及び／又は抗原特異的細胞性免疫応答の誘導もしくは増強に使用するための、〔１１〕～〔１８〕のいずれか１項記載の核酸ワクチン。
〔３０〕〔１１〕～〔１８〕のいずれか１項記載の核酸ワクチンを、それを必要とする対象に有効量で投与する、抗原特異的Ｔｈ１型免疫応答の誘導もしくは増強及び／又は抗原特異的細胞性免疫応答の誘導もしくは増強方法。
〔３１〕〔１４〕記載の核酸ワクチンを、それを必要とする対象に有効量で投与する、がんの治療方法。
〔３２〕〔１５〕記載の核酸ワクチンを、それを必要とする対象に有効量で投与する、感染症の予防又は治療方法。
〔３３〕〔１６〕記載の核酸ワクチンを、それを必要とする対象に有効量で投与する、アレルギーの予防又は治療方法。
〔３４〕〔１７〕記載の核酸ワクチンを、それを必要とする対象に有効量で投与する、自己免疫疾患治療方法。
〔３５〕前記核酸ワクチンの投与量が、該核酸ワクチンがＤＮＡワクチン又はｍＲＮＡワクチンの場合に、１投与単位あたり、前記核酸構築物の量として、好ましくは１ｎｇ～１０ｍｇであり、該核酸ワクチンがウイルスベクターワクチンの場合に、１投与単位あたり、好ましくは１０～１×１０15ウイルス粒子である、〔３０〕～〔３４〕のいずれか１項記載の方法。
〔３６〕〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の核酸構築物を有効成分とする抗原特異的ＩＦＮγ産生増強剤。
〔３７〕〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の核酸構築物を有効成分とする抗原特異的ＩｇＧ２ａ産生増強剤。
〔３８〕〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の核酸構築物を有効成分とする抗原特異的Ｔｈ１型免疫応答誘導又は増強剤。
〔３９〕〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の核酸構築物を有効成分とする抗原特異的細胞性免疫応答誘導又は増強剤。
〔４０〕前記剤が、前記核酸構築物を、好ましくは０．００００１～１００質量％含有する、〔３６〕～〔３９〕のいずれか１項記載の剤。
〔４１〕抗原特異的ＩＦＮγ産生増強剤を製造するための、〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の核酸構築物の使用。
〔４２〕抗原特異的ＩｇＧ２ａ産生増強剤を製造するための、〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の核酸構築物の使用。
〔４３〕抗原特異的Ｔｈ１型免疫応答誘導又は増強剤を製造するための、〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の核酸構築物の使用。
〔４４〕抗原特異的細胞性免疫応答誘導又は増強剤を製造するための、〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の核酸構築物の使用。
〔４５〕前記剤が、前記核酸構築物を、好ましくは０．００００１～１００質量％含有する、〔４１〕～〔４４〕のいずれか１項記載の使用。
〔４６〕抗原特異的ＩＦＮγ産生増強のための、〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の核酸構築物の使用。
〔４７〕抗原特異的ＩｇＧ２ａ産生増強のための、〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の核酸構築物の使用。
〔４８〕抗原特異的Ｔｈ１型免疫応答誘導又は増強のための、〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の核酸構築物の使用。
〔４９〕抗原特異的細胞性免疫応答誘導又は増強のための、〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の核酸構築物の使用。
〔５０〕抗原特異的ＩＦＮγ産生増強に使用するための、〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の核酸構築物。
〔５１〕抗原特異的ＩｇＧ２ａ産生増強に使用するための、〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の核酸構築物。
〔５２〕抗原特異的Ｔｈ１型免疫応答誘導又は増強に使用するための、〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の核酸構築物。
〔５３〕抗原特異的細胞性免疫応答誘導又は増強に使用するための、〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の核酸構築物。
〔５４〕〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の核酸構築物を、それを必要とする対象に有効量で投与する、抗原特異的ＩＦＮγ産生増強方法。
〔５５〕〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の核酸構築物を、それを必要とする対象に有効量で投与する、抗原特異的ＩｇＧ２ａ産生増強方法。
〔５６〕〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の核酸構築物を、それを必要とする対象に有効量で投与する、抗原特異的Ｔｈ１型免疫応答誘導又は増強方法。
〔５７〕〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の核酸構築物を、それを必要とする対象に有効量で投与する、抗原特異的細胞性免疫応答誘導又は増強方法。
〔５８〕前記核酸構築物の投与量が、１日あたり、好ましくは１ｎｇ～１０ｍｇ／６０ｋｇ体重であり、該核酸構築物がウイルスベクターの場合に、１日あたり、好ましくは１０～１×１０15ウイルス粒子／６０ｋｇ体重である、〔５４〕～〔５７〕のいずれか１項記載の方法。
〔５９〕〔１１〕～〔２４〕及び〔２８〕～〔３５〕において、核酸ワクチンは経口又は非経口、好ましくは非経口により投与されるものである。
〔６０〕〔２７〕、〔３０〕、〔３５〕及び〔５４〕～〔５８〕において、対象はがん、自己免疫疾患、もしくはアレルギーの患者、又はがん、自己免疫疾患、もしくはアレルギーの恐れのあるヒトである。
〔６１〕〔３１〕において、対象はがん患者又はがんの恐れのあるヒトである。
〔６２〕〔３３〕において、対象はアレルギー患者又はアレルギーの恐れのあるヒトである。
〔６３〕〔３４〕において、対象は自己免疫疾患患者又は自己免疫疾患の恐れのあるヒトである。
　以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１　ＳＮＡＲＥタンパク質の検討
　２１種類の各ヒトＳＮＡＲＥタンパク質のＣ末端側にアレルゲンであるオボアルブミン（ＯＶＡ、アミノ酸配列：配列番号２４）をリンカー（ヌクレオチド配列：配列番号１９、アミノ酸配列：配列番号２０）で連結した融合ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２５～４５）又はＯＶＡのみのアミノ酸配列をコードしたｍＲＮＡを作製した。この時、抗原又は融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列はコドン最適化を施したうえでプラスミドＤＮＡ（ｐＶＡＸ１　ｖｅｃｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）へ組み込んだ。プラスミドＤＮＡに組み込んだＯＶＡのヌクレオチド配列を配列番号８１に、融合ポリペプチドのヌクレオチド配列を配列番号４８～６８に示す。また、ＯＶＡのコドン最適化前のヌクレオチド配列を配列番号２３に示す。ｍＲＮＡの作製にはＨｉＳｃｒｉｂｅ　Ｔ７　ＡＲＣＡ　ｍＲＮＡ　Ｋｉｔ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いた。具体的には、各配列を組み込んだプラスミドＤＮＡについて制限酵素を用いて線形化した後、当該ＤＮＡを鋳型としてＴ７　ＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによるｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍＲＮＡ合成並びにＡＲＣＡによる５’末端のＣａｐ化を行った。続いて、ＤＮａｓｅを添加することで鋳型として用いたＤＮＡを分解した後、Ｐｏｌｙ（Ａ）ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによるポリＡ鎖の付加を行った。得られたｍＲＮＡをＲＮｅａｓｙ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製し、以降の操作に用いた。精製したｍＲＮＡをＴｒａｎｓＩＴ－ｍＲＮＡ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ　Ｂｉｏ）を用いて添付のプロトコルに従い、成熟したヒトＣＤ１４+樹状細胞（Ｌｏｎｚａ）にトランスフェクションした。コントロールとして、ｍＲＮＡを含まないトランスフェクション試薬のみを樹状細胞に添加した。トランスフェクションの翌日から、同ドナー由来のヒトＣＤ４+Ｔ細胞（Ｌｏｎｚａ）１．０×１０6ｃｅｌｌｓとトランスフェクションした樹状細胞２．５×１０5ｃｅｌｌｓについて共培養を計７日間行い、ｍＲＮＡ由来ＯＶＡの抗原提示を行った。その後、ＥＬＩＳＰＯＴプレート上で共培養したＣＤ４+Ｔ細胞１．０×１０6ｃｅｌｌｓを同ドナー由来のヒトＣＤ１４+樹状細胞１．０×１０5ｃｅｌｌｓと再度共培養すると共に、２００μｇ／ｍＬのＯＶＡタンパク質を添加して抗原刺激を行った。２４時間後、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイキット（Ｃ．Ｔ．Ｌ．）を用い、添付のプロトコルに従ってＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行い、ＩＦＮγを産生するＣＤ４+Ｔ細胞を検出した。
　結果を図１に示す。特定のＳＮＡＲＥタンパク質（ＶＡＭＰ７、ＧＯＳＲ２、ＳＴＸ１０、ＳＴＸ１８、ＢＮＩＰ１、ＳＴＸ７、ＶＴＩ１Ａ、ＳＴＸ１６、ＳＴＸ５、ＧＯＳＲ１、ＳＴＸ８、ＳＴＸ１２、ＶＡＭＰ８、又はＳＥＣ２２Ｂ）とＯＶＡの融合タンパク質を樹状細胞で発現させることで、ＯＶＡ特異的にＩＦＮγを産生するＣＤ４+Ｔ細胞の数が有意に上昇した。一般的に、ＣＤ４+Ｔ細胞は抗原提示を受けるとＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｒｅｇ等様々な細胞種に分化し特定のサイトカインを放出するが、ＩＦＮγはＴｈ１細胞で特徴的に分泌されるサイトカインである。以上の点から、本発明に係る特定のＳＮＡＲＥ－ＯＶＡ融合タンパク質を樹状細胞等の抗原提示細胞に導入することにより、Ｔｈ１免疫応答を誘導又は増強できることが示された。本実験は、各群ｎ＝３で行い、ＯＶＡタンパク質による再刺激を行ったコントロール群（Ｅｍｐｔｙ）を対照として、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ　ｔｅｓｔを行った際にｐ＜０．０５と判定された群を有意差があると判断した。また、Ｅｍｐｔｙを対照として、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔを行った際にｐ＜０．１と判定された群も有意差があると判断した。なお、Ｅｍｐｔｙ（Ｎ．Ｔ．）群はＯＶＡタンパク質による再刺激を行わなかったコントロール群（Ｅｍｐｔｙ）である。
実施例２　ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ抗体価
　実施例１でＩＦＮγの産生を増加させたＳＮＡＲＥタンパク質からＶＡＭＰ７を選択し、ＶＡＭＰ７のＣ末端側にＯＶＡをリンカーで連結した融合ポリペプチド（Ｖ７－ＯＶＡ）のアミノ酸配列（配列番号２５）、又はＯＶＡのアミノ酸配列（配列番号２４）のみをコードしたｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒ（ｐＶＡＸ１　ｖｅｃｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を作製した。コントロールとしては、抗原（ＯＶＡ）をコードしていないＥｍｐｔｙ　ｖｅｃｔｏｒを用いた。作製したそれぞれのｖｅｃｔｏｒ５０μｇを雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの大腿筋内部へ筋肉内投与した後、エレクトロポレーター（ＮＥＰＡ２１、ネッパジーン株式会社）を用いて電圧を負荷し遺伝子導入を行った。上記処置を実験開始から０、７、１４日目に行った後、３５日目に安楽死させ血液を採取した。採取した血液から血清を分離し、抗体価測定を行った。抗体価測定では、１０μｇ／ｍＬのＯＶＡ（Ｍｅｒｃｋ）を溶解したＤＰＢＳ溶液を９６　ｗｅｌｌ　ＥＬＩＳＡ　ｐｌａｔｅ（ＩＷＡＫＩ）に対し１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、ＯＶＡの固相化を行った。翌日、ｐｌａｔｅを洗浄した後、１００μＬ／ｗｅｌｌの１％ＢＳＡ含有ＤＰＢＳでブロッキングを１時間行った。続いて、ｐｌａｔｅを洗浄した後、分離した血清を段階的に２倍希釈しながら１００μＬ／ｗｅｌｌ添加した。２時間後、血清を洗浄して除き、１μｇ／ｍＬのａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ、ＩｇＧ１、又はＩｇＧ２ａ抗体（ａｂｃａｍ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し１時間静置した。その後、ＴＭＢ溶液（ａｂｃａｍ）を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し発色反応を行った。１０分後、Ｓｔｏｐ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ａｂｃａｍ）を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、発色反応を停止させ、吸光度測定（４５０ｎｍ）を行った。この時、血清の代わりにＤＰＢＳを添加したコントロールの吸光度と比較して、２倍以上の吸光度値が測定された最大希釈倍率の値を各サンプルの抗体価と定義した。
　結果を図２に示す。ＯＶＡ単独と比較して、ＶＡＭＰ７－ＯＶＡ（Ｖ７－ＯＶＡ）では、ＯＶＡ特異的なＩｇＧ１抗体価の有意な低下が認められた。一方で、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａについては、コントロール群（Ｅｍｐｔｙ）と比較してＶＡＭＰ７－ＯＶＡのみで有意な抗体価の上昇が認められた。ＯＶＡ特異的なＩｇＧ全体の抗体価については、ＯＶＡ単独とＶＡＭＰ７－ＯＶＡとの間で有意な差はなかった。一般的には、Ｔｈ１型免疫応答によってＢ細胞からＩｇＧ２ａ抗体が産生される一方、Ｔｈ２型免疫応答ではＢ細胞からＩｇＧ１抗体が産生されることが知られている。そのため、抗原特異的なＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ抗体の抗体価を測定することで、生体内で引き起こされている免疫応答のＴｈ１／Ｔｈ２バランスを推定することができる。本結果では、ＯＶＡ単独と比較してＶＡＭＰ７－ＯＶＡではＯＶＡ特異的ＩｇＧ１抗体価は低下し、ＩｇＧ２ａ抗体価は上昇していることから、ＶＡＭＰ７－ＯＶＡがｉｎ　ｖｉｖｏにおいてもＴｈ１型免疫応答を誘導又は増強できることが示された。本実験は、各群ｎ＝１０で行い、各群でＴｕｋｅｙ　ｔｅｓｔを行った際にｐ＜０．０５と判定された場合、有意差があると判断した。
実施例３　ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
　ＶＡＭＰ７のＣ末端側にＯＶＡをリンカーで連結した融合ポリペプチド（Ｖ７－ＯＶＡ）のアミノ酸配列、又はＯＶＡのアミノ配列のみをコードしたｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒ（ｐＶＡＸ１　ｖｅｃｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を作製した。コントロールとしては抗原（ＯＶＡ）をコードしていないＥｍｐｔｙ　ｖｅｃｔｏｒを用いた。作製したそれぞれのｖｅｃｔｏｒ５０μｇを雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの大腿筋内部へ筋肉内投与した後、エレクトロポレーター（ＮＥＰＡ２１）を用いて電圧を負荷し遺伝子導入を行った。上記処置を実験開始から０、７、１４日目に行った後、３５日目に安楽死させ脾臓を採取した。採取した脾臓を、２％ＦＢＳ含有ＤＰＢＳを添加しながら４０μｍセルストレーナー上ですりつぶした。得られた懸濁液について２００×ｇで５分間遠心を行い、上清を除いた後、Ｐｈａｒｍ　ＬｙｓｅTM　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加し３分間静置することで懸濁液に含まれる赤血球を溶血した。再度、２００×ｇで５分間遠心を行い、上清を除いた後、ＤＰＢＳで２回洗浄を行い、ＣＴＬ－ＴｅｓｔTM　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃ．Ｔ．Ｌ．）を添加することで脾細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）懸濁液を得た。１．０×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍＬのｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅをＥＬＩＳＰＯＴプレート上に１００μＬ／ｗｅｌｌ播種し、ＯＶＡタンパク質（Ｍｅｒｃｋ）を添加したＣＴＬ－Ｔｅｓｔ　Ｍｅｄｉｕｍ　１００μＬと混合することで終濃度５０μｇ／ｍＬで抗原刺激を行った。ネガティブコントロールとしてはＯＶＡタンパク質を添加していない群（Ｎ．Ｔ）を用意した。２４時間後、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイキット（Ｃ．Ｔ．Ｌ．）を用い、添付のプロトコルに従ってＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行い、抗原（ＯＶＡ）特異的にＩＦＮγ、ＩＬ－４を産生する細胞を検出した。脾臓は２次リンパ組織であり、その構成細胞であるＳｐｌｅｎｏｃｙｔｅはＴ細胞を豊富に含有することから、抗原特異的な免疫応答を示すＴ細胞を検出するため本実験ではＳｐｌｅｎｏｃｙｔｅを用いた。
　結果を図３に示す。ＶＡＭＰ７－ＯＶＡ（Ｖ７－ＯＶＡ）を用いた場合、ＯＶＡ単独と比較して、ＯＶＡ特異的にＩＬ－４を分泌するＴ細胞の数は変わらない一方で、ＯＶＡ特異的にＩＦＮγを分泌するＴ細胞の数は有意に増大した。一般的に、ＩＬ－４はＴｈ２細胞によって分泌され、ＩＦＮγはＴｈ１細胞、または細胞性免疫に関与する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８+Ｔ細胞）によって分泌されることが知られているため、本結果はＶＡＭＰ７を抗原と融合することで、抗原特異的なＴｈ２型免疫応答は引き起こさず、選択的に抗原特異的なＴｈ１型免疫応答並びに細胞性免疫を誘導又は増強できることを示している。本実験は、各群ｎ＝１０で行い、無刺激条件下（Ｎ．Ｔ）、またはＯＶＡ刺激条件下（ＯＶＡ）における各群でＴｕｋｅｙ　ｔｅｓｔを行った際にｐ＜０．０５と判定された場合、有意差があると判断した。
実施例４　ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ抗体価
　ＶＡＭＰ７、ＳＴＸ１０、ＳＴＸ１８、若しくはＧＯＳＲ１のＣ末端側にＯＶＡをリンカーで連結した融合ポリペプチド（Ｖ７－ＯＶＡ、ＳＴＸ１０－ＯＶＡ、ＳＴＸ１８－ＯＶＡ、ＧＯＳＲ１－ＯＶＡ）のアミノ酸配列（配列番号２５、２７、２８、４１）、又はＯＶＡのアミノ酸配列（配列番号２４）のみをコードしたｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒ（ｐＶＡＸ１　ｖｅｃｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を作製した。コントロールとしては抗原（ＯＶＡ）をコードしていないＥｍｐｔｙ　ｖｅｃｔｏｒを用いた。作製したそれぞれのｖｅｃｔｏｒ５０μｇを雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの大腿筋内部へ筋肉内投与した後、エレクトロポレーター（ＮＥＰＡ２１）を用いて電圧を負荷し遺伝子導入を行った。上記処置を実験開始から０、７、１４日目に行った後、３５日目に安楽死させ血液を採取した。採取した血液から血清を分離し、抗体価測定を行った。抗体価測定では、１０μｇ／ｍＬのＯＶＡ（Ｍｅｒｃｋ）を溶解したＤＰＢＳ溶液を９６　ｗｅｌｌ　ＥＬＩＳＡ　ｐｌａｔｅ（ＩＷＡＫＩ）に対し１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、ＯＶＡの固相化を行った。翌日、ｐｌａｔｅを洗浄した後、１００μＬ／ｗｅｌｌの１％ＢＳＡ含有ＤＰＢＳで１時間ブロッキングを行った。続いて、ｐｌａｔｅを洗浄した後、分離した血清を段階的に２倍希釈しながら１００μＬ／ｗｅｌｌ添加した。２時間後、血清を洗浄して除き、１μｇ／ｍＬのａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ、ＩｇＧ１、又はＩｇＧ２ａ抗体（ａｂｃａｍ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し１時間静置した。その後、ＴＭＢ溶液（ａｂｃａｍ）を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し発色反応を行った。１０分後、Ｓｔｏｐ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ａｂｃａｍ）を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、発色反応を停止させ、吸光度測定（４５０ｎｍ）を行った。この時、血清の代わりにＤＰＢＳを添加したコントロールの吸光度と比較して、２倍以上の吸光度値が測定された最大希釈倍率の値を各サンプルの抗体価と定義した。
　結果を図４に示す。ベクターの投与から５週目において、Ｅｍｐｔｙ　ｖｅｃｔｏｒを投与した群と比較して、ＯＶＡ単独及び各ＳＮＡＲＥ配列をＯＶＡと連結した群全てにおいてＯＶＡ特異的ＩｇＧ抗体価の有意な上昇が認められた。中でも、ＯＶＡ単独と比較してＶＡＭＰ７－ＯＶＡ（Ｖ７－ＯＶＡ）及びＧＯＳＲ１－ＯＶＡはＯＶＡ特異的ＩｇＧ抗体価に変化は認められなかった一方で、ＳＴＸ１０－ＯＶＡ及びＳＴＸ１８－ＯＶＡはＯＶＡ単独と比較しＯＶＡ特異的ＩｇＧ抗体価の有意な低下が認められた。ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１抗体価については、ＯＶＡ単独と比較して各ＳＮＡＲＥ配列をＯＶＡと連結した群全てにおいて有意な低下が認められた。また、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａ抗体価については、Ｅｍｐｔｙ　ｖｅｃｔｏｒを投与した群と比較してＶ７－ＯＶＡのみ有意な上昇が認められた。前記のＯＶＡ特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体価の各個体における比率を算出したＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１については、有意差は認められなかったもののＯＶＡ単独と比較して各ＳＮＡＲＥ配列をＯＶＡと連結した群全てにおいて上昇していた。ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１のグラフにおいて各群のドットプロット上部に平均値を示している。本結果は、ＶＡＭＰ７以外のＳＴＸ１０、ＳＴＸ１８、ＧＯＳＲ１といったＳＮＡＲＥ　ｆａｍｉｌｙにおいても、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１抗体価が低下し、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１の比率が上昇していることから、これらのＳＮＡＲＥ配列を抗原と連結した場合、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいても抗原特異的Ｔｈ１型免疫応答を誘導又は増強できることを示している。本実験は、各群ｎ＝５で行い、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ　ｔｅｓｔを行った際にｐ＜０．０５と判定された場合、有意差があると判断した。Ｅｍｐｔｙ群との比較の場合は＊、ＯＶＡ群との比較の場合は†で有意差を表示している。
実施例５　ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
　ＶＡＭＰ７、ＳＴＸ１０、ＳＴＸ１８、若しくはＧＯＳＲ１のＣ末端側にＯＶＡをリンカーで連結した融合ポリペプチド（Ｖ７－ＯＶＡ、ＳＴＸ１０－ＯＶＡ、ＳＴＸ１８－ＯＶＡ、ＧＯＳＲ１－ＯＶＡ）のアミノ酸配列（配列番号２５、２７、２８、４１）、又はＯＶＡのアミノ酸配列（配列番号２４）のみをコードしたｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒ（ｐＶＡＸ１　ｖｅｃｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を作製した。コントロールとしては抗原（ＯＶＡ）をコードしていないＥｍｐｔｙ　ｖｅｃｔｏｒを用いた。作製したそれぞれのｖｅｃｔｏｒ５０μｇを雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの大腿筋内部へ筋肉内投与した後、エレクトロポレーター（ＮＥＰＡ２１）を用いて電圧を負荷し遺伝子導入を行った。上記処置を実験開始から０、７、１４日目に行った後、３５日目に安楽死させ脾臓を採取した。採取した脾臓を、２％ＦＢＳ含有ＤＰＢＳを添加しながら４０μｍセルストレーナー上ですりつぶした。得られた懸濁液について２００×ｇで５分間遠心を行い、上清を除いた後、Ｐｈａｒｍ　Ｌｙｓｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加し３分間静置することで懸濁液に含まれる赤血球を溶血した。再度、２００×ｇで５分間遠心を行い、上清を除いた後、ＤＰＢＳで２回洗浄を行い、ＣＴＬ－Ｔｅｓｔ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃ．Ｔ．Ｌ．）を添加することで脾細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）懸濁液を得た。１．０×１０7ｃｅｌｌｓのｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅをＥＬＩＳＰＯＴプレート上に１００μＬ／ｗｅｌｌ播種し、ＯＶＡタンパク質（Ｍｅｒｃｋ）を添加したＣＴＬ－Ｔｅｓｔ　Ｍｅｄｉｕｍ　１００μＬと混合することで終濃度５０μｇ／ｍＬで抗原刺激を行った。ネガティブコントロールとしてはＯＶＡタンパク質を添加していない群（Ｎ．Ｔ）を用意した。２４時間後、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイキット（Ｃ．Ｔ．Ｌ．）を用い、添付のプロトコルに従ってＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行い、抗原（ＯＶＡ）特異的にＩＦＮγ、ＩＬ－４を産生する細胞を検出した。脾臓は２次リンパ組織であり、その構成細胞であるＳｐｌｅｎｏｃｙｔｅはＴ細胞を豊富に含有することから、抗原特異的な免疫応答を示すＴ細胞を検出するため本実験ではＳｐｌｅｎｏｃｙｔｅを用いた。
　結果を図５に示す。ＯＶＡ単独と比較して、各ＳＮＡＲＥ配列をＯＶＡと連結した群全てにおいてＯＶＡ特異的にＩＦＮγを分泌するＴ細胞の数が有意に増大した。一方でＯＶＡ特異的なＩＬ－４を分泌するＴ細胞の数については、無刺激条件下（Ｎ．Ｔ）及びＯＶＡ刺激条件下（ＯＶＡ）の各条件下において有意な群間差が認められたものの、Ｎ．Ｔ及びＯＶＡの各条件下で各個体における比率を算出したＩＬ－４　ｒａｔｉｏにおいては全ての群で変化が認められなかった。本結果は、ＶＡＭＰ７以外のＳＴＸ１０、ＳＴＸ１８、ＧＯＳＲ１といったＳＮＡＲＥ　ｆａｍｉｌｙにおいても抗原と連結することにより、抗原特異的Ｔｈ２型免疫応答は引き起こさず、選択的に抗原特異的Ｔｈ１型免疫応答並びに細胞性免疫を誘導又は増強できることを示している。本実験は、各群ｎ＝５で行い、無刺激条件下、またはＯＶＡ刺激条件下における各群でＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ　ｔｅｓｔを行った際にｐ＜０．０５と判定された場合、有意差があると判断した。Ｅｍｐｔｙ群との比較の場合は＊、ＯＶＡ群との比較の場合は†で有意差を表示している。
実施例６　経時的抗体価
　ＶＡＭＰ７のＣ末端側にＯＶＡをリンカーで連結した融合ポリペプチド（Ｖ７－ＯＶＡ）のアミノ酸配列（配列番号２５）、該融合ポリペプチド中のリンカーのＣ末端側にプロタンパク質転換酵素認識配列（ヌクレオチド配列：配列番号２１、アミノ酸配列：配列番号２２）を付加した融合ポリペプチド（Ｖ７－ｐｃ－ＯＶＡ）のアミノ酸配列（配列番号４６）、リソソーム結合タンパク質ＬＡＭＰ（特許文献１）内にＯＶＡのアミノ酸配列を挿入した融合ポリペプチド（ＬＡＭＰ［ＯＶＡ］）のアミノ酸配列（配列番号４７）又はＯＶＡのアミノ酸配列（配列番号２４）のみをコードしたｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒを作製した。プラスミドＤＮＡに組み込んだＶ７－ｐｃ－ＯＶＡのヌクレオチド配列を配列番号６９に、ＬＡＭＰ［ＯＶＡ］のヌクレオチド配列を配列番号７０に示す。コントロールとしては抗原（ＯＶＡ）をコードしていないＥｍｐｔｙ　ｖｅｃｔｏｒを用いた。作製したそれぞれのｖｅｃｔｏｒ５０μｇを雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの大腿筋内部へ筋肉内投与した後、エレクトロポレーター（ＮＥＰＡ２１）を用いて電圧を負荷し遺伝子導入を行った。上記処置を実験開始から０、７、１４日目に行った。実験期間中、１週間毎に尾静脈から採血を行い、３５日目に安楽死させ血液を採取した。採取した血液から血清を分離し、抗体価測定を行った。抗体価測定では、１０μｇ／ｍＬのＯＶＡ（Ｍｅｒｃｋ）を溶解したＤＰＢＳ溶液を９６　ｗｅｌｌ　ＥＬＩＳＡ　ｐｌａｔｅ（ＩＷＡＫＩ）に対し１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、ＯＶＡの固相化を行った。翌日、ｐｌａｔｅを洗浄した後、１００μＬ／ｗｅｌｌの１％ＢＳＡ含有ＤＰＢＳでブロッキングを１時間行った。続いて、ｐｌａｔｅを洗浄した後、分離した血清を段階的に２倍希釈しながら１００μＬ／ｗｅｌｌ添加した。２時間後、血清を洗浄して除き、１μｇ／ｍＬのａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ、ＩｇＧ１、又はＩｇＧ２ａ抗体（ａｂｃａｍ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し１時間静置した。その後、ＴＭＢ溶液（ａｂｃａｍ）を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し発色反応を行った。１０分後、Ｓｔｏｐ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ａｂｃａｍ）を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、発色反応を停止させ、吸光度測定（４５０ｎｍ）を行った。この時、血清の代わりにＤＰＢＳを添加したコントロールの吸光度と比較して、２倍以上の吸光度値が測定された最大希釈倍率の値を各サンプルの抗体価と定義した。
　結果を図６に示す。実施例２と同様にＯＶＡ単独と比較して、ＶＡＭＰ７－ＯＶＡ（Ｖ７－ＯＶＡ）及びＶＡＭＰ７－ｐｃ－ＯＶＡ（Ｖ７－ｐｃ－ＯＶＡ）では、ＯＶＡ特異的なＩｇＧ１抗体価の有意な低下が認められた。一方で、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａ抗体価については、ＶＡＭＰ７－ｐｃ－ＯＶＡでより抗体価の上昇が認められた。ＯＶＡ特異的なＩｇＧ全体については、３週目、４週目においてＯＶＡ単独でより抗体価が上昇する傾向があったものの、５週目時点では特にＶＡＭＰ７－ｐｃ－ＯＶＡでＯＶＡ単独と比較して遜色ない抗体価の上昇が認められた。また、ＬＡＭＰ［ＯＶＡ］ではＯＶＡ特異的な抗体価の上昇がほとんど認められなかった。５週目のＯＶＡ特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体価の各個体における比率を算出したＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１については、有意差は認められなかったもののＯＶＡ単独やＬＡＭＰ［ＯＶＡ］と比較してＶＡＭＰ７－ＯＶＡやＶＡＭＰ７－ｐｃ－ＯＶＡにおいて上昇していた。本結果は、プロタンパク質転換酵素認識配列を導入することによってＩｇＧ２ａ抗体の産生が更に促進され、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて抗原特異的Ｔｈ１型免疫応答が誘導又は増強されていることを示している。また、ＬＡＭＰ［ＯＶＡ］と比較しても、ＶＡＭＰ７－ＯＶＡやＶＡＭＰ７－ｐｃ－ＯＶＡにおける抗原特異的ＩｇＧ抗体産生が優れ、かつ抗原特異的Ｔｈ１型免疫応答が増強されることを示している。本実験は、各群ｎ＝５で行い、各週において各群でＴｕｋｅｙ　ｔｅｓｔを行った際にｐ＜０．０５と判定された場合、有意差があると判断した。Ｅｍｐｔｙ群との比較の場合は＊、ＯＶＡ群との比較の場合は†で有意差を表示している。
実施例７　ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
　ＶＡＭＰ７のＣ末端側にＯＶＡをリンカーで連結した融合ポリペプチド（Ｖ７－ＯＶＡ）のアミノ酸配列（配列番号２５）、該融合ポリペプチド中のリンカーのＣ末端側にプロタンパク質転換酵素認識配列を付加した融合ポリペプチド（Ｖ７－ｐｃ－ＯＶＡ）のアミノ酸配列（配列番号４６）、又はＯＶＡのアミノ酸配列（配列番号２４）のみをコードしたｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒを作製した。コントロールとしては抗原（ＯＶＡ）をコードしていないＥｍｐｔｙ　ｖｅｃｔｏｒを用いた。作製したそれぞれのｖｅｃｔｏｒ５０μｇを雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの大腿筋内部へ筋肉内投与した後、エレクトロポレーター（ＮＥＰＡ２１）を用いて電圧を負荷し遺伝子導入を行った。上記処置を実験開始から０、７、１４日目に行った後、３５日目に安楽死させ脾臓を採取した。採取した脾臓を、２％ＦＢＳ含有ＤＰＢＳを添加しながら４０μｍセルストレーナー上ですりつぶした。得られた懸濁液について２００×ｇで５分間遠心を行い、上清を除いた後、Ｐｈａｒｍ　Ｌｙｓｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加し３分間静置することで懸濁液に含まれる赤血球を溶血した。再度、２００×ｇで５分間遠心を行い、上清を除いた後、ＤＰＢＳで２回洗浄を行い、ＣＴＬ－Ｔｅｓｔ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃ．Ｔ．Ｌ．）を添加することで脾細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）懸濁液を得た。１．０×１０7ｃｅｌｌｓのｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅをＥＬＩＳＰＯＴプレート上に１００μＬ／ｗｅｌｌ播種し、ＯＶＡタンパク質（Ｍｅｒｃｋ）を添加したＣＴＬ－Ｔｅｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　１００μＬと混合することで終濃度５０μｇ／ｍＬで抗原刺激を行った。ネガティブコントロールとしてはＯＶＡタンパク質を添加していない群（Ｎ．Ｔ）を用意した。２４時間後、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイキット（Ｃ．Ｔ．Ｌ．）を用い、添付のプロトコルに従ってＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行い、抗原（ＯＶＡ）特異的にＩＦＮγ、ＩＬ－４を産生する細胞を検出した。脾臓は２次リンパ組織であり、その構成細胞であるＳｐｌｅｎｏｃｙｔｅはＴ細胞を豊富に含有することから、抗原特異的な免疫応答を示すＴ細胞を検出するため本実験ではＳｐｌｅｎｏｃｙｔｅを用いた。
　結果を図７に示す。プロタンパク質転換酵素認識配列を導入することによって、ＯＶＡ特異的にＩＦＮγを分泌するＴ細胞の数が更に増大した。一方でＯＶＡ特異的なＩＬ－４を分泌するＴ細胞の数については、無刺激条件下（Ｎ．Ｔ）及びＯＶＡ刺激条件下（ＯＶＡ）の各条件下において有意な群間差が認められたものの、Ｎ．Ｔ及びＯＶＡの各条件の各個体における比率を算出したＩＬ－４　ｒａｔｉｏにおいては全ての群で変化が認められなかった。本結果は、プロタンパク質転換酵素認識配列の導入が抗原特異的Ｔｈ１型免疫応答や細胞性免疫を更に増強できることを示唆している。プロタンパク質転換酵素はプロテアーゼの一種であり、細胞内の前駆型・未成熟型タンパク質を切断して、成熟型・活性型に変換する役割を担っている。プロタンパク質転換酵素はゴルジ体やエンドソームに局在するため、生体内で細胞内小胞に輸送されたＶＡＭＰ７－ｐｃ－ＯＶＡ融合タンパク質を切断することで、小胞内にＯＶＡを遊離させより効率的にＭＨＣ分子との会合を誘導したと考えられる。加えて、遊離したＯＶＡがエクソソーム内に封入されて分泌されることで免疫応答の増強が誘導された可能性も考えられる。本実験は、各群ｎ＝５で行い、無刺激条件下（Ｎ．Ｔ）、またはＯＶＡ刺激条件下における各群でＴｕｋｅｙ　ｔｅｓｔを行った際にｐ＜０．０５と判定された場合、有意差があると判断した。
実施例８　ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ抗体価
　ＶＡＭＰ７のＣ末端側にプロタンパク質転換酵素認識配列とがん抗原であるヒトＷｉｌｍ　Ｔｕｍｏｒ　１（ＷＴ１、アミノ酸配列：配列番号８４）若しくは自己抗原であるマウスｍｙｅｌｉｎ　ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎペプチドの繰り返し配列（ＭＯＧ35-55、アミノ酸配列：配列番号８７）をリンカーで連結した融合ポリペプチド（Ｖ７－ｐｃ－ＷＴ１、Ｖ７－ｐｃ－ＭＯＧ35-55）のアミノ酸配列（配列番号８９、９１）、又はＷＴ１若しくはＭＯＧ35-55のアミノ酸配列のみをコードしたｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒを作製した。この時、抗原又は融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列はコドン最適化を施したうえでプラスミドＤＮＡ（ｐＶＡＸ１　ｖｅｃｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）へ組み込んだ。プラスミドＤＮＡに組み込んだＷＴ１のヌクレオチド配列を配列番号８３に、ＭＯＧ35-55のヌクレオチド配列を配列番号８６に、Ｖ７－ｐｃ－ＷＴ１のヌクレオチド配列を配列番号８８に、Ｖ７－ｐｃ－ＭＯＧ35-55のヌクレオチド配列を配列番号９０に示す。また、ＷＴ１のコドン最適化前のヌクレオチド配列を配列番号８２に、ＭＯＧ35-55のコドン最適化前のヌクレオチド配列を配列番号８５に示す。ここで、ＭＯＧ35-55とは、マウスＭＯＧの３５～５５残基部分を７回繰り返したペプチドである。コントロールとしては、抗原（ＷＴ１又はＭＯＧ35-55）をコードしていないＥｍｐｔｙ　ｖｅｃｔｏｒを用いた。作製したそれぞれのｖｅｃｔｏｒ５０μｇを雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの大腿筋内部へ筋肉内投与した後、エレクトロポレーター（ＮＥＰＡ２１）を用いて電圧を負荷し遺伝子導入を行った。上記処置を実験開始から０、７、１４日目に行った後、２８日目に安楽死させ血液を採取した。採取した血液から血清を分離し、抗体価測定を行った。抗体価測定では、１μｇ／ｍＬのヒトＷＴ１（Ｃｕｓａｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＬＬＣ）又は１０μｇ／ｍＬのマウスＭＯＧ35-55　ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｍｅｒｃｋ）を溶解したＤＰＢＳ溶液を９６　ｗｅｌｌ　ＥＬＩＳＡ　ｐｌａｔｅ（Ｉｗａｋｉ）に対し１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、各抗原の固相化を行った。翌日、ｐｌａｔｅを洗浄した後、１００μＬ／ｗｅｌｌの１％ＢＳＡ含有ＤＰＢＳでブロッキングを１時間行った。続いて、ｐｌａｔｅを洗浄した後、分離した血清を段階的に２倍希釈しながら１００μＬ／ｗｅｌｌ添加した。２時間後、血清を洗浄して除き、１μｇ／ｍＬのａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ、ＩｇＧ１、又はＩｇＧ２ａ抗体（ａｂｃａｍ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し１時間静置した。その後、ＴＭＢ溶液（ａｂｃａｍ）を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し発色反応を行った。１０分後、Ｓｔｏｐ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ａｂｃａｍ）を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、発色反応を停止させ、吸光度測定（４５０ｎｍ）を行った。この時、血清の代わりにＤＰＢＳを添加したコントロールの吸光度と比較して、２倍以上の吸光度値が測定された最大希釈倍率の値を各サンプルの抗体価と定義した。
　結果を図８に示す。ベクターの投与から４週目において、Ｅｍｐｔｙ　ｖｅｃｔｏｒを投与した群と比較して、有意差は認められないもののＷＴ１単独及びＶＡＭＰ７－ｐｃ－ＷＴ１（Ｖ７－ｐｃ－ＷＴ１）の両群においてＷＴ１特異的ＩｇＧ抗体価の上昇が認められた。一方でＷＴ１特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体価については、有意差は認められないもののＥｍｐｔｙおよびＷＴ１単独と比較してＶ７－ｐｃ－ＷＴ１では上昇が認められた。前記のＷＴ１特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体価の各個体における比率を算出したＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１については、ＷＴ１単独とＶ７－ｐｃ－ＷＴ１の間に変化は認められなかった。また、ＭＯＧ特異的ＩｇＧ抗体価を測定した実験では、Ｅｍｐｔｙと比較して、ＭＯＧ35-55単独及びＶＡＭＰ７－ｐｃ－ＭＯＧ35-55（Ｖ７－ｐｃ－ＭＯＧ35-55）の両群で変化は認められなかった。一方でＭＯＧ特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体価については、ＥｍｐｔｙおよびＭＯＧ35-55単独と比較してＶ７－ｐｃ－ＭＯＧ35-55では上昇が認められ、ＩｇＧ１抗体価のみ有意な変化だった。前記のＭＯＧ35-55特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体価の各個体における比率を算出したＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１については、ＭＯＧ35-55単独とＶ７－ｐｃ－ＭＯＧ35-55の間に有意な変化は認められなかった。本実験は、各群ｎ＝５で行い、Ｔｕｋｅｙ　ｔｅｓｔを行った際にｐ＜０．０５と判定された場合、有意差があると判断した。
実施例９　ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
　ＶＡＭＰ７のＣ末端側にプロタンパク質転換酵素認識配列とヒトＷＴ１若しくはマウスＭＯＧ35-55をリンカーで連結した融合ポリペプチド（Ｖ７－ｐｃ－ＷＴ１、Ｖ７－ｐｃ－ＭＯＧ35-55）のアミノ酸配列（配列番号８９、９１）、又はＷＴ１若しくはＭＯＧ35-55のアミノ酸配列（配列番号８４、８７）のみをコードしたｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒ（ｐＶＡＸ１　ｖｅｃｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を作製した。コントロールとしては、抗原（ＷＴ１又はＭＯＧ35-55）をコードしていないＥｍｐｔｙ　ｖｅｃｔｏｒを用いた。作製したそれぞれのｖｅｃｔｏｒ５０μｇを雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの大腿筋内部へ筋肉内投与した後、エレクトロポレーター（ＮＥＰＡ２１）を用いて電圧を負荷し遺伝子導入を行った。上記処置を実験開始から０、７、１４日目に行った後、２８日目に安楽死させ脾臓を採取した。採取した脾臓を、２％ＦＢＳ含有ＤＰＢＳを添加しながら４０μｍセルストレーナー上ですりつぶした。得られた懸濁液について２００×ｇで５分間遠心を行い、上清を除いた後、Ｐｈａｒｍ　Ｌｙｓｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加し３分間静置することで懸濁液に含まれる赤血球を溶血した。再度、２００×ｇで５分間遠心を行い、上清を除いた後、ＤＰＢＳで２回洗浄を行い、ＣＴＬ－Ｔｅｓｔ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃ．Ｔ．Ｌ．）を添加することで脾細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）懸濁液を得た。１．０×１０7ｃｅｌｌｓのｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅをＥＬＩＳＰＯＴプレート上に１００μＬ／ｗｅｌｌ播種し、ヒトＷＴ１　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｍｉｘ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）、又はマウスＭＯＧ35-55　ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｍｅｒｃｋ）を添加したＣＴＬ－Ｔｅｓｔ　Ｍｅｄｉｕｍ　１００μＬと混合することで各終濃度が１．２ｎｍｏｌ／ｍＬ、又は５μｇ／ｍＬで抗原刺激を行った。ネガティブコントロールとしては抗原を添加していない群（Ｎ．Ｔ）を用意した。２４時間後、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイキット（Ｃ．Ｔ．Ｌ．）を用い、添付のプロトコルに従ってＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行い、抗原（ＷＴ１又はＭＯＧ35-55）特異的にＩＦＮγ、ＩＬ－４を産生する細胞を検出した。脾臓は２次リンパ組織であり、その構成細胞であるＳｐｌｅｎｏｃｙｔｅはＴ細胞を豊富に含有することから、抗原特異的な免疫応答を示すＴ細胞を検出するため本実験ではＳｐｌｅｎｏｃｙｔｅを用いた。
　結果を図９に示す。ＷＴ１単独と比較して、Ｖ７－ｐｃ－ＷＴ１ではＷＴ１特異的にＩＦＮγを分泌するＴ細胞の数が有意に増大した。同様に、ＭＯＧ35-55単独と比較して、Ｖ７－ｐｃ－ＭＯＧ35-55ではＭＯＧ35-55特異的にＩＦＮγを分泌するＴ細胞の数が有意に増大した。一方で、ＷＴ１特異的なＩＬ－４を分泌するＴ細胞の数については、ＷＴ１　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｍｉｘ刺激条件下（ＷＴ１）において有意な群間差が認められたものの、無刺激（Ｎ．Ｔ）及びＷＴ１の各条件下で各個体における比率を算出したＩＬ－４　ｒａｔｉｏにおいては全ての群で変化が認められなかった。同様に、ＭＯＧ35-55特異的なＩＬ－４を分泌するＴ細胞の数についても、無刺激条件下（Ｎ．Ｔ）及びＭＯＧ35-55　ｐｅｐｔｉｄｅ刺激条件下（ＭＯＧ35-55）の各条件下において有意な群間差が認められたものの、Ｎ．Ｔ及びＭＯＧ35-55の各条件下で各個体における比率を算出したＩＬ－４　ｒａｔｉｏにおいては全ての群で変化が認められなかった。更に、各個体においてＩＦＮγとＩＬ－４を産生するＴ細胞数の比率ＩＦＮγ／ＩＬ－４を算出すると、各抗原刺激時に各抗原単独と比較し、Ｖ７－ｐｃ－ＷＴ１又はＶ７－ｐｃ－ＭＯＧ35-55ではＩＦＮγ／ＩＬ－４が有意に増大していた。実施例８においてＩｇＧ２ａ優位なＴｈ１型の抗体応答は認められなかったが、本結果がＴ細胞の抗原特異的免疫応答を直接検出できるＥＬＩＳＰＯＴ解析を行ったものであることを考慮すると、ＶＡＭＰ７をはじめとした特定のＳＮＡＲＥ　ｆａｍｉｌｙに対してＯＶＡと異なる抗原と連結した場合においても、抗原特異的Ｔｈ２型免疫応答は引き起こさず、選択的に抗原特異的Ｔｈ１型免疫応答並びに細胞性免疫を誘導又は増強できることを示している。本実験は、各群ｎ＝５で行い、無刺激条件下、または抗原刺激条件下における各群でＴｕｋｅｙ　ｔｅｓｔを行った際にｐ＜０．０５と判定された場合、有意差があると判断した。
実施例１０　ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
　ＶＡＭＰ７のＣ末端側にＯＶＡをリンカーで連結した融合ポリペプチド（Ｖ７－ＯＶＡ）のアミノ酸配列（配列番号２５）、該融合ポリペプチド中のリンカーのＣ末端側にプロタンパク質転換酵素認識配列を付加した融合ポリペプチド（Ｖ７－ｐｃ－ＯＶＡ）のアミノ酸配列（配列番号４６）、リソソーム結合タンパク質ＬＡＭＰ（特許文献１）内にＯＶＡのアミノ酸配列を挿入した融合ポリペプチド（ＬＡＭＰ［ＯＶＡ］）のアミノ酸配列（配列番号４７）、又はＯＶＡのアミノ酸配列（配列番号２４）のみをコードしたｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒを作製した。コントロールとしては抗原（ＯＶＡ）をコードしていないＥｍｐｔｙ　ｖｅｃｔｏｒを用いた。作製したそれぞれのｖｅｃｔｏｒ５０μｇを雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの大腿筋内部へ筋肉内投与した後、エレクトロポレーター（ＮＥＰＡ２１）を用いて電圧を負荷し遺伝子導入を行った。上記処置から７日目に安楽死させ脾臓を採取した。採取した脾臓を、２％ＦＢＳ含有ＤＰＢＳを添加しながら４０μｍセルストレーナー上ですりつぶした。得られた懸濁液について２００×ｇで５分間遠心を行い、上清を除いた後、Ｐｈａｒｍ　Ｌｙｓｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加し３分間静置することで懸濁液に含まれる赤血球を溶血した。再度、２００×ｇで５分間遠心を行い、上清を除いた後、ＤＰＢＳで２回洗浄を行い、ＣＴＬ－Ｔｅｓｔ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃ．Ｔ．Ｌ．）を添加することで脾細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）懸濁液を得た。１．０×１０7ｃｅｌｌｓのｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅをＥＬＩＳＰＯＴプレート上に１００μＬ／ｗｅｌｌ播種し、ＯＶＡタンパク質（Ｍｅｒｃｋ）を添加したＣＴＬ－Ｔｅｓｔ　Ｍｅｄｉｕｍ　１００μＬと混合することで終濃度５０μｇ／ｍＬで抗原刺激を行った。ネガティブコントロールとしてはＯＶＡタンパク質を添加していない群（Ｎ．Ｔ）を用意した。２４時間後、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイキット（Ｃ．Ｔ．Ｌ．）を用い、添付のプロトコルに従ってＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行い、抗原（ＯＶＡ）特異的にＩＦＮγ、ＩＬ－４を産生する細胞を検出した。脾臓は２次リンパ組織であり、その構成細胞であるＳｐｌｅｎｏｃｙｔｅはＴ細胞を豊富に含有することから、抗原特異的な免疫応答を示すＴ細胞を検出するため本実験ではＳｐｌｅｎｏｃｙｔｅを用いた。
　結果を図１０に示す。ｖｅｃｔｏｒの投与からわずか１週目でも、ＶＡＭＰ７－ＯＶＡやＬＡＭＰ［ＯＶＡ］と比較して、ＶＡＭＰ７－ｐｃ－ＯＶＡではＯＶＡ特異的にＩＦＮγを分泌するＴ細胞の数が有意に増大していることが確認された。一方でＯＶＡ特異的なＩＬ－４を分泌するＴ細胞の数については、無刺激条件下（Ｎ．Ｔ）及びＯＶＡ刺激条件下（ＯＶＡ）の各条件下において有意な群間差が認められたものの、Ｎ．Ｔ及びＯＶＡの各条件下で各個体における比率を算出したＩＬ－４　ｒａｔｉｏにおいては全ての群で変化が認められなかった。更に、各個体においてＩＦＮγとＩＬ－４を産生するＴ細胞数の比率ＩＦＮγ／ＩＬ－４を算出すると、ＯＶＡ刺激時にＶ７－ＯＶＡやＬＡＭＰ［ＯＶＡ］と比較し、Ｖ７－ｐｃ－ＯＶＡではＩＦＮγ／ＩＬ－４が有意に増大していた。本結果は、ＶＡＭＰ７－ｐｃ－ＯＶＡが１週目という比較的早期から、抗原特異的Ｔｈ２型免疫応答は引き起こさず、選択的に抗原特異的なＴｈ１型免疫や細胞性免疫を誘導することができ、更には従来の技術と比較しても優越した免疫誘導効果があることを示している。本実験は、各群ｎ＝５で行い、無刺激条件下（Ｎ．Ｔ）、またはＯＶＡ刺激条件下における各群でＴｕｋｅｙ　ｔｅｓｔを行った際にｐ＜０．０５と判定された場合、有意差があると判断した。

Claims (13)

  1. 　ＶＡＭＰ７、ＧＯＳＲ２、ＳＴＸ１０、ＳＴＸ１８、ＢＮＩＰ１、ＳＴＸ７、ＶＴＩ１Ａ、ＳＴＸ１６、ＳＴＸ５、ＧＯＳＲ１、ＳＴＸ８、ＳＴＸ１２、ＶＡＭＰ８、及びＳＥＣ２２Ｂからなる群より選択されるいずれかのＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、抗原をコードするポリヌクレオチドとを含む、核酸構築物。
  2. 　前記ＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドの下流に前記抗原をコードするポリヌクレオチドが連結されている、請求項１記載の核酸構築物。
  3. 　前記ＳＮＡＲＥタンパク質をコードするポリヌクレオチド及び前記抗原をコードするポリヌクレオチドが、リンカーをコードするポリヌクレオチド及び／又はプロタンパク質転換酵素認識配列をコードするポリヌクレオチドを介して連結されている、請求項１又は２記載の核酸構築物。
  4. 　プラスミドベクター、ｍＲＮＡ、又はウイルスベクターである、請求項１～３のいずれか１項記載の核酸構築物。
  5. 　前記抗原ががん抗原、自己抗原、細菌抗原、真菌抗原、及び原生動物抗原からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１～４のいずれか１項記載の核酸構築物。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項記載の核酸構築物を有効成分とする抗原特異的Ｔｈ１型免疫応答誘導又は増強剤。
  7. 　請求項１～５のいずれか１項記載の核酸構築物を有効成分とする抗原特異的細胞性免疫応答誘導又は増強剤。
  8. 　請求項１～５のいずれか１項記載の核酸構築物を有効成分とする核酸ワクチン。
  9. 　抗原特異的Ｔｈ１型免疫応答を誘導又は増強するものである、請求項８記載の核酸ワクチン。
  10. 　抗原特異的細胞性免疫応答を誘導又は増強するものである、請求項８記載の核酸ワクチン。
  11. 　がんワクチンであり、前記抗原ががん抗原からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項８～１０のいずれか１項記載の核酸ワクチン。
  12. 　自己免疫疾患治療用ワクチンであり、前記抗原が自己抗原からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項８～１０のいずれか１項記載の核酸ワクチン。
  13. 　経口又は非経口により投与される、請求項８～１２のいずれか１項記載の核酸ワクチン。
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