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WO2023013755A1 - がんペプチドワクチンカクテル製剤、及びその製造方法 - Google Patents

がんペプチドワクチンカクテル製剤、及びその製造方法 Download PDF

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WO2023013755A1
WO2023013755A1 PCT/JP2022/030039 JP2022030039W WO2023013755A1 WO 2023013755 A1 WO2023013755 A1 WO 2023013755A1 JP 2022030039 W JP2022030039 W JP 2022030039W WO 2023013755 A1 WO2023013755 A1 WO 2023013755A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
seq
peptides
cancer
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2022/030039
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
孝行 吉森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BrightPath Biotherapeutics Co Ltd
Original Assignee
BrightPath Biotherapeutics Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by BrightPath Biotherapeutics Co Ltd filed Critical BrightPath Biotherapeutics Co Ltd
Publication of WO2023013755A1 publication Critical patent/WO2023013755A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a cancer peptide vaccine cocktail preparation and a method for producing the same.
  • immune checkpoint inhibitors targeting immune checkpoint molecules typified by CTLA-4, PD-1, and PD-L1 have been developed (Patent Documents 1 and 2). Immunotherapy using these inhibitors has been shown to be able to obtain excellent clinical effects that could not be achieved by conventional treatment methods, and development of various immune checkpoint inhibitors and treatment methods using these is being actively developed.
  • immune checkpoint inhibitors do not produce effective clinical effects in all patients, and approximately 20 to 50% of patients do not respond to immune checkpoint inhibitors, and clinical effects are not obtained.
  • cancer types that do not have Therefore, in order to increase the response rate of immune checkpoint inhibitors, combination therapy of such inhibitors and drugs such as chemotherapeutic agents and molecular-targeted drugs is being actively studied.
  • Cancer vaccines using tumor antigen peptides which are also used for immunotherapy, are one of the candidate drugs to be used in combination with immune checkpoint inhibitors.
  • Cell-mediated immunity especially cytotoxic T cells (CTLs) play an important role in the elimination of tumor cells by the body.
  • CTLs cytotoxic T cells
  • Precursor T cells that recognize a complex with an antigen (HLA) class I antigen are differentiated and proliferated to attack cancer cells. Therefore, by using a tumor antigen peptide as a drug to induce CTL activity against cancer cells to attack cancer cells, clinical effects such as tumor reduction effects can be obtained.
  • tumor antigen peptides for example, peptides derived from tumor-specific antigens such as the MAGE-A3 antigen discovered at the Ludwig Institute, EGFRvIII, and gp100, and peptides derived from tumor-associated antigens have been investigated (Patent Documents 3-7, Non-Patent Documents 1-26).
  • cancer vaccines containing these peptides alone cannot obtain sufficient clinical effects, and even now there are no cancer vaccines that have been approved.
  • a combination trial of a cancer vaccine containing an anti-CTLA-4 antibody and a gp100 peptide was also conducted, but the effect of the combination therapy was not proven. (Non-Patent Document 27).
  • Noguchi, M., et al. Phase I trial of patient-oriented vaccination in HLA-A2-positive patients with metastatic hormone-refractory prostate cancer. Cancer Sci, 2004. 95(1): p. 77-84.
  • Noguchi, M., et al. Immunological monitoring during combination of patient-oriented peptide vaccination and estramustine phosphate in patients with metastatic hormone refractory prostate cancer. Prostate, 2004. 60(1): p.32-45.
  • Noguchi, M., et al. Combination therapy of personalized peptide vaccination and low-dose estramustine phosphate for metastatic hormone refractory prostate cancer patients: an analysis of prognostic factors in the treatment. Oncol Res, 2007. 16(7): p. 341-9.
  • Yamada, A., et al. Phase I clinical study of a personalized peptide vaccination available for six different human leukocyte antigen (HLA-A2, -A3, -A11, -A24, -A31 and -A33)-positive patients with advanced cancer. Exp Ther Med, 2011. 2(1): p. 109-117.
  • Yamamoto, K., et al. Immunological evaluation of personalized peptide vaccination for patients with pancreatic cancer. Oncol Rep, 2005.13(5): p. 875-83.
  • Yanagimoto, H., et al. Immunological evaluation of personalized peptide vaccination with gemcitabine for pancreatic cancer. Cancer Sci, 2007.98(4): p. 605-11.
  • Peptide formulations for vaccines are usually formulated (for example, freeze-dried) for each type of peptide and stored in a container.
  • a cocktail administration solution by adding water for injection to each container of multiple types of peptide preparations, dissolving them, and mixing the obtained multiple types of peptide-containing liquids to prepare a cocktail administration solution.
  • an adjuvant is added to such a cocktail administration solution in order to improve the vaccine effect, and the preparation of such a cocktail administration solution becomes more complicated in some cases.
  • An object of the present invention is to provide a cancer peptide that facilitates the preparation of a vaccine administration solution, reduces wasteful disposal of the peptide-containing solution during preparation of the vaccine administration solution, and improves the solubility of the peptide in a solvent.
  • An object of the present invention is to provide a vaccine cocktail preparation, a method for producing the same, and the like.
  • each of the four peptides consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 has an effect as a cancer peptide vaccine by itself. known until now (Patent Document 6).
  • the present inventors continued to conduct intensive studies on suitable methods for producing cancer peptide vaccine cocktail formulations containing the four types of peptides of the present invention. Furthermore, among the four types of peptides of the present invention, the peptide of SEQ ID NO: 1, in particular, has low solubility in a solvent, and the present inventors diligently studied the conditions of a solvent capable of dissolving such a peptide. As a result of these earnest studies, the present inventors have found the following matters (i) to (iii) and completed the present invention. (i) The four peptides of the present invention can be dissolved by adding a solvent of pH 2.5 to 4 to the four peptides of the present invention.
  • the present invention (1) peptide of Asn-Val-Leu-His-Phe-Phe-Asn-Ala-Pro-Leu (SEQ ID NO: 1); A peptide of Ala-Ser-Leu-Asp-Ser-Asp-Pro-Trp-Val (SEQ ID NO: 2); a peptide of Lys-Leu-Lys-His-Tyr-Gly-Pro-Gly-Trp-Val (SEQ ID NO: 3); and the peptide Leu-Leu-Gln-Ala-Glu-Ala-Pro-Arg-Leu (SEQ ID NO: 4); Step (A) of adding a solvent of pH 2.5 to 4 to the composition comprising A method for producing a cancer peptide vaccine cocktail formulation comprising; (2) adding a solvent of pH 2.5 to 4 in an amount such that the concentration of the peptides of SEQ ID NOS: 1 to 4 in the solution obtained in step (A) is 20 mg/mL or less, respectively
  • preparation of a vaccine administration solution is simple, wasteful disposal of a peptide-containing solution during preparation of a vaccine administration solution is reduced, and the solubility of the peptide in a solvent is improved.
  • a vaccine cocktail formulation, a method for producing the same, and the like can be provided.
  • cancer peptide vaccine cocktail formulations can be produced at lower manufacturing costs and quality test costs than when the four types of peptides of the present invention are separately formulated. .
  • FIG. 1 shows a photograph of the tip of the tube after drying the peptide mixture (200 ⁇ L) prepared under condition 1 (glycine buffer, with pH adjustment) under reduced pressure.
  • FIG. 2 shows a photograph of the tip of the tube after drying the peptide mixture (200 ⁇ L) prepared under condition 2 (hydrochloric acid, with pH adjustment) under reduced pressure.
  • FIG. 3 shows a photograph of the tip of the tube after drying the peptide mixture (200 ⁇ L) prepared under condition 3 (hydrochloric acid, no pH adjustment) under reduced pressure.
  • FIG. 4 shows a photograph of the tip of the tube after drying the peptide mixture (200 ⁇ L) prepared under condition 1 (glycine buffer, with pH adjustment) under reduced pressure, then adding 200 ⁇ L of water and stirring.
  • FIG. 1 shows a photograph of the tip of the tube after drying the peptide mixture (200 ⁇ L) prepared under condition 1 (glycine buffer, with pH adjustment) under reduced pressure.
  • FIG. 5 shows a photograph of the tip of the tube after drying the peptide mixture (200 ⁇ L) prepared under condition 2 (hydrochloric acid, pH adjustment) under reduced pressure, adding 200 ⁇ L of water, and stirring.
  • FIG. 6 shows a photograph of the tip of the tube after drying the peptide mixture (200 ⁇ L) prepared under condition 3 (hydrochloric acid, no pH adjustment) under reduced pressure, adding 200 ⁇ L of water, and stirring.
  • FIG. 7 shows that the peptide mixture (200 ⁇ L) prepared under condition 1 (glycine buffer, with pH adjustment) was dried under reduced pressure, then 200 ⁇ L of water was added, stirred, left to stand for 24 hours, and then the tip of the tube was removed. Observed photographs are shown.
  • FIG. 1 glycine buffer, with pH adjustment
  • FIG. 8 shows that the peptide mixture (200 ⁇ L) prepared under condition 1 (glycine buffer, with pH adjustment) was dried under reduced pressure, then 200 ⁇ L of water was added, stirred, allowed to stand for 24 hours, and then vortexed. The photograph which observed the tip of a tube is shown.
  • FIG. 9 shows that the peptide mixture (200 ⁇ L) prepared under condition 2 (hydrochloric acid, with pH adjustment) was dried under reduced pressure, then 200 ⁇ L of water was added, stirred, left to stand for 24 hours, and then the tip of the tube was observed. Shows a photo of FIG.
  • FIG. 10 shows that the peptide mixture (200 ⁇ L) prepared under condition 2 (hydrochloric acid, with pH adjustment) was dried under reduced pressure, then 200 ⁇ L of water was added, stirred, allowed to stand for 24 hours, and then vortexed. The photograph which observed the tip of is shown.
  • FIG. 11 shows that the peptide mixture (200 ⁇ L) prepared under condition 3 (hydrochloric acid, no pH adjustment) was dried under reduced pressure, then 200 ⁇ L of water was added, stirred, left to stand for 24 hours, and the tip of the tube was observed. Shows a photo of FIG.
  • FIG. 12 shows that the peptide mixture (200 ⁇ L) prepared under condition 3 (hydrochloric acid, no pH adjustment) was dried under reduced pressure, then 200 ⁇ L of water was added, stirred, allowed to stand for 24 hours, and then vortexed. The photograph which observed the tip of is shown.
  • FIG. 13 shows a photograph observed after freeze-drying the peptide mixture in the vial in Test 4 of Example.
  • FIG. 14 shows a photograph observed after adding ultrapure water to the freeze-dried powder in the vial and stirring in Test 4 of Example.
  • the cancer peptide vaccine cocktail preparation of the present invention (hereinafter also referred to as “the cocktail preparation of the present invention” or simply “the cocktail preparation”) is a composition containing four peptides of the present invention with a pH of 2.5 to 4. is a cancer peptide vaccine cocktail preparation produced by a production method comprising the step (A) of adding a solvent (hereinafter also referred to as “the production method of the present invention”).
  • the four types of peptides in the present invention are the four types of peptides of SEQ ID NOs: 1 to 4 shown below.
  • Asn-Val-Leu-His-Phe-Phe-Asn-Ala-Pro-Leu (SEQ ID NO: 1) Ala-Ser-Leu-Asp-Ser-Asp-Pro-Trp-Val (SEQ ID NO: 2) Lys-Leu-Lys-His-Tyr-Gly-Pro-Gly-Trp-Val (SEQ ID NO: 3) Leu-Leu-Gln-Ala-Glu-Ala-Pro-Arg-Leu (SEQ ID NO: 4)
  • These peptides are peptides derived from tumor antigen proteins expressed by cancer cells (herein also referred to as tumor antigen peptides), are recognized by CTLs restricted to HLA class I, and are cytotoxic to cancer cells.
  • a cancer peptide vaccine is synonymous with a peptide vaccine for treating cancer, and uses a tumor antigen peptide as an active ingredient to treat cancer by inducing an immune response against cancer cells. Means medicine.
  • the term "peptide" is used to include pharmaceutically acceptable salts thereof, unless the context is inappropriate.
  • “Pharmaceutically acceptable salts” as used herein include acetate, hydrochloride, hydrobromide, sulfate, hydroiodide, nitrate, phosphate, citrate, oxalate , formate, propionate, benzoate, trifluoroacetate, maleate, tartrate, methanesulfonate, benzenesulfonate, p-toluenesulfonate, sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salts, ammonium salts, triethylammonium salts, triethanolammonium salts, pyridinium salts, diisopropylammonium salts and the like.
  • Peptides can be produced by conventional methods, for example, Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vo1.2, Academic Press Inc, New York, 1976; ) 1985; Pharmaceutical Development Series Vol. 14: Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten, 1991; Purification and recovery of peptides can be performed by known methods such as chromatography such as gel chromatography, ion column chromatography, affinity chromatography, and fractionation means based on solubility differences using ammonium sulfate, alcohol, or the like. .
  • polyclonal antibodies or monoclonal antibodies specific to these peptides based on information on the amino acid sequences of the peptides, and to specifically adsorb and recover the peptides using the antibodies.
  • the produced peptide is usually recovered as a salt with counterions such as acetic acid, hydrochloric acid, sodium and trifluoroacetic acid in addition to the peptide.
  • Such salts can be used as drug substances in the preparation of cancer peptide vaccine cocktail formulations.
  • mass of a peptide herein, it is meant the mass of the peptide in free form, not the salt.
  • composition containing four types of peptides of the present invention may be a composition consisting of only four types of peptides of the present invention, or, as described later, a composition containing four types of peptides of the present invention and optional ingredients. It may be a composition containing the peptides, or a composition consisting of the four types of peptides and optional ingredients in the present invention. Such a composition may be solid or liquid, but from the viewpoint of peptide stability, it is preferably solid, and more preferably dried.
  • the mass ratio of the four peptides contained in the composition containing the four peptides of the present invention is not particularly limited.
  • the mass of the peptide of SEQ ID NO: 4 is 0.7 to 1.3: 0.7 to 1.3: 0.7 to 1.3: 0.7 to 1.3, and 0 0.8-1.2: 0.8-1.2: 0.8-1.2: 0.8-1.2: 0.9-1.1: 0.9-1. 1:0.9-1.1:0.9-1.1: is more preferred.
  • the content of the four types of peptides contained in the above composition may be the same mass for all four types, or may be different.
  • the "solvent having a pH of 2.5 to 4" in the step (A) of the present specification is not particularly limited as long as it is a solvent having a pH of 2.5 to 4.
  • Inorganic acids such as hydrochloric acid, nitric acid, sulfuric acid, and aqueous phosphoric acid Aqueous solution; Organic acid aqueous solution such as citric acid aqueous solution, acetic acid aqueous solution, trifluoroacetic acid aqueous solution, succinic acid aqueous solution; boric acid buffer, citrate buffer, acetate buffer, glycine buffer, sodium carbonate buffer, potassium carbonate buffer, sodium acetate buffer, acetic acid Buffers such as potassium buffer; and from the viewpoint of the solubility of the four types of peptides (especially the peptide of SEQ ID NO: 1) in the present invention, hydrochloric acid is preferred.
  • the pH 2.5-4 solvent is a pH 2.5-4 solvent other than a citrate buffer
  • the pH 2.5-4 solvent is a pH 2.5-4 solvent other than a glycine buffer
  • It is a solvent with a pH of 2.5-4.
  • the solvent is a pharmaceutically acceptable pH 2.5 to 4. solvent.
  • the pH of the "solvent with pH 2.5-4" is not particularly limited as long as it is 2.5-4. 0.5 to 3.5 are preferred.
  • the amount of the "solvent with pH 2.5 to 4" to be added is not particularly limited.
  • the concentration of each of the four peptides of the present invention in the solution obtained by the method is 20 mg/mL or less, preferably 3 mg to 20 mg/mL, more preferably 3 mg to 10 mg/mL, and still more preferably 3 mg to 5 mg/mL. It is preferable that the addition amount is such that The concentrations of the four peptides of the present invention in such a solution may be the same or different.
  • a suitable amount of the "solvent having a pH of 2.5 to 4" is such that the pH of the solution in which the composition containing the four peptides of the present invention is dissolved is adjusted to 2.5.
  • step (A) a solvent of pH 2.5 to 4 is added to the composition containing the four types of peptides of the present invention to dissolve the peptides, and the pH 2.5 to 4.5 obtaining a solution (preferably pH 2.5 to 4.3).
  • step (A) after adding the "solvent having a pH of 2.5 to 4", the mixture is preferably stirred, and more preferably stirred using a vortex mixer.
  • step (A) a solution having a pH of 6.5 to 14 is added to the solution obtained in the step (A), mixed, and the pH of the mixed solution is adjusted to 5. It may further include a step (B) of adjusting to 5 to 8, and when used in combination with an adjuvant whose optimum pH is in the neutral range, while maintaining the function of such an adjuvant for a longer period of time, in the present invention From the viewpoint of maintaining the dissolved state of the four types of peptides, it is preferable that the above step (B) is further included.
  • the dissolution state of the peptide must be maintained while maintaining the function of the adjuvant even if the dosing solution is stored for a certain period of time after the preparation of the dosing solution. is preferred.
  • the production method of the present invention includes steps (A) and (B), even the difficult-to-dissolve peptide of SEQ ID NO: 1 is dissolved once by adding a solvent of pH 2.5 to 4. Therefore, even if the pH is adjusted to 5.5 to 8 in the step (B), it is excellent in that the dissolved state of the four peptides of the present invention can be maintained.
  • the "solvent having a pH of 6.5 to 14" in the step (B) is not particularly limited as long as it is a solvent having a pH of 6.5 to 14.
  • sodium acetate aqueous solution potassium acetate aqueous solution
  • basic amino acid aqueous solution preferably an aqueous solution of a basic amino acid selected from histidine, lysine, arginine and tryptophan, more preferably an aqueous solution of histidine
  • histidine buffer HEPES buffer
  • buffers such as sodium phosphate buffer, potassium phosphate buffer, bicarbonate buffer, Tris-HCl buffer
  • the pH of the "solvent having a pH of 6.5 to 14" is not particularly limited as long as it is 6.5 to 14, and may be 6.5 to 13 or 6.5 to 12.
  • step (C) of drying the obtained solution may be further included, and from the viewpoint of storage stability of the cancer peptide vaccine cocktail preparation, it is preferable to further include the above-described step (C).
  • a conventional method for drying a peptide solution can be used, including drying under reduced pressure and freeze-drying. Freeze-drying is preferred from the viewpoint of ease of dissolution in a solvent (eg, purified water or water for injection).
  • a solvent eg, purified water or water for injection.
  • the production method of the present invention may include any steps other than step (A), steps (A) and (B), or steps (A) to (C).
  • the drying step (C) may be performed after the filling step (E), or the drying step (C ) may be followed by the filling step (E), but it is preferable to perform the drying step (C) after the filling step (E).
  • optional steps include the step (F) of adding optional ingredients.
  • optional ingredients include buffers, antioxidants, preservatives, excipients, suspending agents, tonicity agents, chelating agents, surfactants, etc.
  • phosphoric acid, citric acid , and other organic acids antioxidants such as ascorbic acid and methionine; preservatives such as octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride, hexamethonium chloride, benzalkonium chloride, and benzethonium chloride
  • proteins such as , gelatin, and immunoglobulins
  • hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone
  • amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine, and lysine
  • monosaccharides, disaccharides, and others including glucose, mannose, and dextrin phosphoric acid, citric acid , and other organic acids
  • antioxidants such as ascor
  • trehalose and sucrose are suitable as cryoprotectants and osmotic pressure regulators.
  • the content of trehalose and/or sucrose is not particularly limited, but the mass ratio of each peptide to the total mass of trehalose and/or sucrose is 0.01. ⁇ 1 or 0.02-0.3 is preferred.
  • the weight of trehalose or sucrose herein, it means the weight of anhydrous trehalose or anhydrous sucrose.
  • step (F) when the production method of the present invention has step (F), the order of each step does not matter, and the steps may be performed simultaneously with other steps, but step (A) or step (B) or after step (A) or step (B) and before step (C). Moreover, the step (F) may be performed before the step (A), and for example, the above optional components may be added to the composition containing the four types of peptides of the present invention.
  • the cocktail preparation produced by the production method of the present invention contains at least four specific peptides (peptides consisting of amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4, respectively).
  • the dosage form of the cocktail formulation is not particularly limited, but an aqueous solution formulation or a dry formulation is preferable. From the viewpoint of peptide stability, a dry formulation is preferable. Dry formulations are more preferred.
  • the cocktail formulation in the present invention is administered in the form of an aqueous solution.
  • the cocktail formulation is an aqueous solution formulation, it can be administered to the patient as it is, and when it is a dry formulation, it can be dissolved in a pharmaceutically acceptable solvent (e.g., purified water or water for injection) and administered as an aqueous solution.
  • a pharmaceutically acceptable solvent e.g., purified water or water for injection
  • each of the four peptides of the present invention in the aqueous solution (i.e., administration solution) at the time of administration of the cocktail preparation of the present invention is not particularly limited, but for example, each is 20 mg/mL or less, preferably 3 mg to 20 mg. /mL, more preferably 3 mg to 10 mg/mL, more preferably 3 mg to 5 mg/mL. Concentrations of the aforementioned four types of peptides in such an administration solution may be the same for all four types, or may be different.
  • the pH of the aqueous solution (i.e., administration solution) at the time of administration of the cocktail preparation in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include pH 2.5 to 8.0.
  • the pH of the above-mentioned administration liquid is 5.5 to 8.0; 5.5 to 7.5; 6.0 to 8.0; and 6.0 to 7.5; and the like are preferred.
  • the pH may be adjusted by adding a pH adjuster. More preferably, the administration solution can be prepared by adding and stirring a pharmaceutically acceptable solvent (eg, purified water or water for injection) without adding an adjusting agent.
  • the cocktail preparation produced by the production method of the present invention including steps (A) to (C) can be prepared using a pharmaceutically acceptable solvent even if no pH adjuster is added when preparing the administration solution.
  • a pharmaceutically acceptable solvent eg, purified water or water for injection
  • the cocktail preparation produced by the production method of the present invention is excellent in that it can maintain the dissolved state of the four peptides of the present invention even when the pH of the administration solution is 5.5 to 8.
  • the turbidity (OD600) of the liquid for administration of the cocktail preparation in the present invention is not particularly limited, but is preferably 0.2 or less, more preferably 0.1 or less, and even more preferably 0.08 or less.
  • a conventional method can be used to measure the turbidity (OD600) of the administration solution.
  • cancers include prostate cancer, pancreatic cancer, colon cancer, lung cancer (including non-small cell lung cancer), hematopoietic tumor, brain tumor, uterine cancer, cervical cancer, stomach cancer, melanoma (malignant including melanoma), thyroid cancer, liver cancer, and esophageal cancer.
  • the cocktail formulation is used for melanoma (including malignant melanoma) or lung cancer (including non-small cell lung cancer).
  • the cocktail preparation in the present invention may further contain an adjuvant and may be administered together with the adjuvant.
  • adjuvants include incomplete Freund's adjuvant (e.g., ISA-51, SEPPIC), polysaccharides such as pullulan, complete Freund's adjuvant, and BCG, which enhance retention of the peptide at the site of administration by emulsifying an aqueous solution of the peptide.
  • alum, GM-CSF, IL-2, CpG, and the like can be used.
  • the optimum pH of GM-CSF is in the neutral region (pH 6-8), and it is particularly suitable as an adjuvant used in the cocktail formulation of the present invention.
  • the cocktail preparation in the present invention is usually administered intradermally or subcutaneously to the patient. This is because peptides are rapidly degraded when administered, for example, by intravenous injection, and cannot sufficiently induce an immune response.
  • antigen-presenting cells that capture antigens, present them on the cell surface via HLA molecules, and activate T cells such as CTLs are present intradermally or subcutaneously. This is because CTLs and the like exhibiting cytotoxic activity can be efficiently activated by doing so.
  • the site of administration is not particularly limited, but it is preferably near the lymph node as close to the cancer lesion as possible from the start of administration, such as the upper arm and thigh.
  • administration may be performed at other sites (abdomen, etc.).
  • the cocktail preparation in the present invention is administered to the patient in an amount capable of exhibiting the desired effect (also referred to herein as an "effective amount").
  • the dosage is not particularly limited as long as intradermal or subcutaneous administration is allowed, but it is preferably 0.1 mg or more, preferably 0.1 mg in terms of mass of dry powder of peptide per peptide. ⁇ 3 mg, more preferably 1 mg to 3 mg.
  • the doses of the four types of peptides in the present invention may be the same for all four types, or may be different.
  • the administration frequency of the cocktail preparation in the present invention may be any frequency as long as an immune response is obtained. Dosing may be once every 2, 3, 4, 5, or 6 weeks, and the dosing frequency may be changed along the way. For example, administration may be performed once a week for 4 times, followed by administration once every 3 to 4 weeks.
  • the number of administrations of the cocktail formulation is, for example, at least 8 times, preferably 16 times or more. There is no upper limit to the number of administrations as long as the patient can tolerate the administration, but there is a track record of up to 84 administrations in clinical trials, and at least this number of administrations is possible.
  • cocktail preparation of the present invention When the cocktail preparation of the present invention is administered to a patient, CTLs against the administered peptide are activated in the patient's body, cancer cells are eliminated, and clinical effects can be obtained.
  • the cocktail preparation in the present invention may be used in combination with one or more other antitumor agents or treatment methods. Cancer cells in each patient are a heterogeneous population, and there are cells that cannot be eliminated by immune responses and cells that are resistant to antitumor drugs, hormone therapy, etc. Therefore, the cocktail preparations of the present invention and other Clinical effects such as reduction of cancer lesions and prolongation of survival can be enhanced by combined use of these antitumor drugs and treatment methods.
  • the antineoplastic agent is an immune checkpoint inhibitor.
  • Immune checkpoint inhibitors block the immunosuppressive effects of cancer cells and antigen-presenting cells.
  • Immune checkpoint inhibitors include, for example, agents (e.g., antibodies) against the following molecules: CTLA-4 (ipilimumab, tremelimumab, etc.), PD-1 (nivolumab, pembrolizumab, AMP-224, AMP-514 ( MEDI0680), pidilizumab (CT-011), etc.), LAG-3 (IMP-321, BMS-986016, etc.), BTLA, KIR (IPH2101, etc.), TIM-3, PD-L1 (Durvalumab (MEDI4736), MPDL3280A, BMS -936559, avelumab (MSB0010718C, etc.), PD-L2, B7-H3 (MGA-271, etc.), B7-H4, HVEM, GAL9, CD
  • the immune checkpoint inhibitor is an agent against PD-1, such as an anti-PD-1 antibody (nivolumab, pembrolizumab, AMP-514 (MEDI0680), pidilizumab (CT-011), etc.).
  • an anti-PD-1 antibody nivolumab, pembrolizumab, AMP-514 (MEDI0680), pidilizumab (CT-011), etc.
  • Antitumor agents further include alkylating agents, antimetabolites, plant alkaloids, topoisomerase inhibitors, microtubule polymerization inhibitors, molecular targeting agents, etc. Specifically, 5-FU, estramustine, Docetaxel, temozolomide, cisplatin, gemzar, rituximab and the like. Treatment methods include surgery, radiation therapy, and hormone therapy (steroids such as dexamethasone, mitoxantrone, presonisolone, estrogen, progesterone, and analogues such as luprin).
  • hormone therapy steroids such as dexamethasone, mitoxantrone, presonisolone, estrogen, progesterone, and analogues such as luprin).
  • the term “combination” includes simultaneous or sequential use for the treatment of cancer in the same patient, regardless of the order.
  • the cocktail preparation of the present invention activates blood cells such as CTLs and exerts its effect, so it is effective in activating the hematopoietic system and immune response. It is preferable to use other antitumor drugs and treatment methods within the range that does not affect them.
  • administering the cocktail preparation of the present invention after the lymphocyte count recovers after administration of the antitumor agent, or other antitumor drugs after administering the cocktail preparation of the present invention
  • lymphocyte count e.g., 1,000 cells/mL or more
  • Methods such as using drugs or therapeutic methods, or using other anti-tumor drugs or therapeutic methods within the range that does not cause a decrease in white blood cell count or lymphocyte count during the period of administration of the cocktail preparation of the present invention are conceivable.
  • the invention provides a method for treating cancer comprising the peptide of Asn-Val-Leu-His-Phe-Phe-Asn-Ala-Pro-Leu (SEQ ID NO: 1), Ala-Ser - peptide of Leu-Asp-Ser-Asp-Pro-Trp-Val (SEQ ID NO:2), peptide of Lys-Leu-Lys-His-Tyr-Gly-Pro-Gly-Trp-Val (SEQ ID NO:3), and A method comprising administering to a patient a cancer peptide vaccine cocktail formulation comprising the peptide Leu-Leu-Gln-Ala-Glu-Ala-Pro-Arg-Leu (SEQ ID NO: 4).
  • the present invention provides peptides of Asn-Val-Leu-His-Phe-Phe-Asn-Ala-Pro-Leu (SEQ ID NO: 1), Ala-Ser - peptide of Leu-Asp-Ser-Asp-Pro-Trp-Val (SEQ ID NO:2), peptide of Lys-Leu-Lys-His-Tyr-Gly-Pro-Gly-Trp-Val (SEQ ID NO:3), and Concerning the use of the peptide Leu-Leu-Gln-Ala-Glu-Ala-Pro-Arg-Leu (SEQ ID NO: 4).
  • the present invention provides a peptide of Asn-Val-Leu-His-Phe-Phe-Asn-Ala-Pro-Leu (SEQ ID NO: 1), Ala-Ser-Leu, for use in the treatment of cancer.
  • - peptide of Asp-Ser-Asp-Pro-Trp-Val SEQ ID NO: 2
  • peptide of Lys-Leu-Lys-His-Tyr-Gly-Pro-Gly-Trp-Val SEQ ID NO: 3
  • Leu- It relates to the peptide Leu-Gln-Ala-Glu-Ala-Pro-Arg-Leu (SEQ ID NO: 4).
  • 150 ⁇ L of the glycine buffer solutions of the peptides of SEQ ID NOS: 1-4 were separated and mixed to prepare 600 ⁇ L of a peptide mixture containing the four types of peptides of SEQ ID NOS: 1-4.
  • the solubility of peptides in such a peptide mixture was evaluated by visually observing the appearance of the solution.
  • 150 ⁇ L of 1 mM hydrochloric acid solutions of the peptides of SEQ ID NOS: 1-4 were dispensed and mixed to prepare 600 ⁇ L of a peptide mixture containing the four types of peptides of SEQ ID NOS: 1-4.
  • the solubility of peptides in such a peptide mixture was evaluated by visually observing the appearance of the solution.
  • Table 2 shows the results of evaluating the solubility of peptides.
  • Condition 1 Peptide dissolution with glycine buffer and pH adjustment with histidine buffer
  • peptides of SEQ ID NOs: 1 to 4 were dissolved in 50 mM glycine buffer to prepare 600 ⁇ L of peptide mixture.
  • the total concentration of the peptides of SEQ ID NOS: 1-4 in this peptide mixture solution was 18 mg/mL, and the individual peptide concentrations of SEQ ID NOS: 1-4 were each 4.5 mg/mL.
  • 90 ⁇ L of 50% sucrose was added to the aforementioned peptide mixture, and the pH was measured.
  • the peptide mixture was adjusted to pH 6 by adding 200 mM histidine buffer (pH 6.5).
  • the pH of the prepared peptide mixture was measured, and the solubility of the peptide was evaluated by visually observing the appearance of the peptide mixture.
  • the peptide mixture was adjusted to pH 6 by adding 200 mM histidine buffer (pH 6.5). The pH of the prepared peptide mixture was measured, and the solubility of the peptide was evaluated by visually observing the appearance of the peptide mixture.
  • Table 3 shows the results of measuring the pH of the peptide mixture and the results of evaluating the solubility of the peptides.
  • the total concentration of the peptides of SEQ ID NOS: 1-4 in the 900 ⁇ L peptide mixture was 12 mg/mL, the individual peptide concentrations of SEQ ID NOS: 1-4 were 3.0 mg/mL, and sucrose was 5%. (w/v). 200 ⁇ L of this 900 ⁇ L peptide mixture was dispensed into three 1.5 mL capacity tubes.
  • the total concentration of the peptides of SEQ ID NOS: 1-4 in the 900 ⁇ L peptide mixture was 12 mg/mL, the individual peptide concentrations of SEQ ID NOS: 1-4 were 3.0 mg/mL, and sucrose was 5%. (w/v). 200 ⁇ L of this 900 ⁇ L peptide mixture was dispensed into three 1.5 mL capacity tubes.
  • FIGS. 1 to 3 show the results of visual observation of the appearance of each tube after drying under reduced pressure.
  • Table 5 and FIGS. 4 to 6 show the results of visual inspection of the appearance of each tube after reconstruction.
  • Table 5 shows the results of measuring the pH and OD600 of the reconstituted peptide mixture.
  • conditions 2 and 3 are more preferable than condition 1 because the dried peptides have higher solubility in water when water is added. .
  • the OD600 value of the solution was particularly low, indicating that the peptide was dissolved particularly well compared to the other cases.
  • the solubility of the peptide was slightly higher under condition 3, in which the pH was not adjusted to a neutral range. It was found that sufficient solubility was obtained.
  • the pH of the solution when water was added to reconstitute the peptide mixed solution was approximately the same as the pH of the solution before drying under reduced pressure.
  • the peptides are more compatible with water under conditions 2 and 3 than under condition 1, even after standing for 24 hours after the addition of water and after vortexing. It was found to be in a dissolved state, which was preferable.
  • Test 4 Examination of the effect on peptide solubility by increasing the pH of the peptide mixture 2
  • a 200 mM histidine buffer pH 6.5
  • the test was conducted by the following method. In this test, a 200 mM histidine aqueous solution (pH 7.75) was used as a pH adjuster for increasing pH.
  • the peptide drug substance of SEQ ID NO: 1 was added to 1 mM hydrochloric acid (pH about 3) and stirred so that the final concentration of the peptide of SEQ ID NO: 1 was 25 mg/mL.
  • the peptide drug substance of SEQ ID NO: 2 was added to 1 mM hydrochloric acid (pH about 3) and stirred so that the final concentration of the peptide of SEQ ID NO: 2 was 25 mg/mL.
  • the peptide drug substance of SEQ ID NO:3 was added to 1 mM hydrochloric acid (pH about 3) and stirred so that the final concentration of the peptide of SEQ ID NO:3 was 25 mg/mL.
  • the peptide drug substance of SEQ ID NO: 4 was added to 1 mM hydrochloric acid (pH about 3) and stirred so that the final concentration of the peptide of SEQ ID NO: 4 was 25 mg/mL.
  • hydrochloric acid pH about 3
  • the solubility of the peptide in these four types of peptide solutions was evaluated by visually observing the appearance of the solution, all of the peptide solutions were clear.
  • the vial was taken out from the freezer, and after removing the rubber stopper, it was placed in the dry chamber of the freeze dryer. After the dry chamber was closed with a cover, the pressure in the dry chamber was started by turning on the pump. The set temperature of the trap during freeze-drying was ⁇ 45° C. (ie, the initial set temperature of the trap in the freeze-dryer). About 20 hours after the start of depressurization, the pump was turned off and the pressure in the dry chamber was returned to normal pressure to complete freeze-drying. After lyophilization, mixed peptides were obtained in the vials as clumpy white lyophilized powder (white lyophilized cake; FIG. 13).

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Abstract

本発明の課題は、ワクチン投与液の調製が簡便であり、ワクチン投与液の調製時のペプチド含有液の無駄な廃棄が少なく、かつ、ペプチドの溶媒への溶解性が改善された、がんペプチドワクチンカクテル製剤、及びその製造方法等を提供することにある。　配列番号１のペプチド、配列番号２のペプチド、配列番号３のペプチド、及び、配列番号４のペプチドを含む組成物に、ｐＨ２．５～４の溶媒を添加する工程（Ａ）；を含む、がんペプチドワクチンカクテル製剤の製造方法。

Description

がんペプチドワクチンカクテル製剤、及びその製造方法
　本発明は、がんペプチドワクチンカクテル製剤、及びその製造方法に関する。
　世界では、年間約１，８００万人が新たにがんを発症し、うち約９６０万人が死亡している。日本では、２０１９年のがん罹患数予測は約１００万人であり、死亡数予測は約３８万人とされている（https://ganjoho.jp/reg_stat/statistics/stat/short_pred.html）。このようながんに対する主な治療方法としては、手術、放射線療法、化学療法、分子標的薬、抗体医薬、免疫療法、細胞治療等が開発されている。
　特に近年においては、ＣＴＬＡ－４やＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１に代表される免疫チェックポイント分子をターゲットとした免疫チェックポイント阻害剤が開発された（特許文献１または２）。これらの阻害剤を用いた免疫療法は、従来の治療方法では達成し得なかった優れた臨床効果を得ることができることが示され、様々な免疫チェックポイント阻害剤の開発ならびにこれらを用いた治療方法の開発が盛んにおこなわれている。しかし、免疫チェックポイント阻害剤は、すべての患者において有効な臨床効果が得られるわけではなく、免疫チェックポイント阻害剤に不応答の患者はおおよそ２～５割存在し、また、臨床効果が得られないがん種も存在している。このため、免疫チェックポイント阻害剤の奏効率を高めるために、当該阻害剤と化学療法剤や分子標的薬等の薬剤の併用療法も盛んに検討されている。
　免疫チェックポイント阻害剤と併用する薬剤の候補の一つとしては、同じく免疫療法に用いられる腫瘍抗原ペプチドを用いるがんワクチンが挙げられる。生体による腫瘍細胞の排除には、細胞性免疫、とりわけ細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬと称する）が重要な働きをしており、ＣＴＬは、腫瘍細胞上の抗原ペプチド、すなわち腫瘍抗原ペプチドとヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ抗原との複合体を認識した前駆体Ｔ細胞が分化増殖して生成されるものであり、がん細胞を攻撃する。よって、腫瘍抗原ペプチドを薬剤として用い、がん細胞に対するＣＴＬの活性を惹起し、がん細胞を攻撃させることにより、腫瘍縮小効果等の臨床効果を得ることができる。
　このような腫瘍抗原ペプチドとしては、例えば、ルドウィヒ研究所で発見されたＭＡＧＥ－Ａ３抗原やＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｇｐ１００等の腫瘍特異的抗原由来のペプチドや、腫瘍関連抗原由来のペプチドが検討されてきた（特許文献３～７、非特許文献１～２６）。しかしながら、これらのペプチドを含むがんワクチンは単独では十分な臨床効果を得ることができず、現在においても承認されたがんワクチンは存在しない。また、例えば、免疫チェックポイント阻害剤との併用療法として、抗ＣＴＬＡ－４抗体とｇｐ１００ペプチドを含むがんワクチンとの併用試験も実施されたが、併用療法による効果を証明するには至らなかった（非特許文献２７）。
国際公開第２０１１／０１１０２７号 国際公開第２００４／００４７７１号 国際公開第９９／６７２８８号 国際公開第００／１２７０１号 国際公開第０２／０１０３６９号 国際公開第２００９／０３８０２６号 国際公開第２０１４／１８１８０５号
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　ワクチン用のペプチド製剤は通常、ペプチドの種類ごとに製剤化（例えば凍結乾燥など）されて容器内に格納されていることが多いため、例えば複数種のペプチドを含むカクテル投与液とする場合は、医療機関にて、複数種のペプチド製剤の各容器に注射用水をそれぞれ添加して溶解し、得られた複数種のペプチド含有液を混合してカクテル投与液を調製するという煩雑な作業が必要であった。また、ワクチン効果を向上させるために、かかるカクテル投与液にアジュバントをさらに添加する場合もあり、かかるカクテル投与液の調製はさらに煩雑となる場合もあった。
　また、カクテル投与液を前述のように調製する際には、各ペプチド含有液の不足が生じないようにするなどの目的から、各ペプチド含有液を過剰量調製する必要があり、その結果、カクテル投与液を調製する際にペプチド含有液が余って無駄なロスが生じる場合があった。
　また、様々なペプチドの中には、溶媒への溶解性が低く、ワクチン投与液の調製が容易でないものがあり、そのようなペプチドについては溶媒への溶解性の改善が課題となる。従来、ペプチドの水溶液への溶解性の改善には、炭酸水素ナトリウムが用いられていたが、炭酸水素ナトリウムは、特にペプチド製剤が凍結乾燥製剤である場合、炭酸水素ナトリウムから水が生成することにより凍結乾燥製剤中の水分含量が正確に測定できないといった問題点や、水溶液にした場合にｐＨが塩基性になるためペプチドが酸化しやすいといった問題点があった。
　本発明の課題は、ワクチン投与液の調製が簡便であり、ワクチン投与液の調製時のペプチド含有液の無駄な廃棄が少なく、かつ、ペプチドの溶媒への溶解性が改善された、がんペプチドワクチンカクテル製剤、及びその製造方法等を提供することにある。
　それぞれ配列番号１～４に示されるアミノ酸配列からなる４種類のペプチド（以下、「本発明における４種類のペプチド」とも表示する。）がそれぞれ単独でがんペプチドワクチンとしての効果を有することはこれまでに知られている（特許文献６）。
　本発明者らは、引き続き、上記の本発明の課題を解決するべく、本発明における４種類のペプチドを含む、がんペプチドワクチンカクテル製剤の好適な製造方法について鋭意検討を行った。本発明者らはまた、本発明における４種類のペプチドのうち、特に、配列番号１のペプチドは溶媒への溶解性が低く、かかるペプチドを溶解し得る溶媒の条件について鋭意検討を行った。これらの鋭意検討の結果、本発明者らは、以下の（i）～（iii）の事項を見いだし、本発明を完成するに至った。
（i）本発明における４種類のペプチドにｐＨ２．５～４の溶媒を添加すると、本発明における４種類のペプチドを溶解することができること。
（ii）上記（i）で得られるペプチド溶液のｐＨを５．５～８に調整しても、ペプチドの溶解状態を保持することができること。
（iii）上記（ii）で得られるペプチド溶液を乾燥した後、水を添加すると、ペプチド溶液を再構成することができること。
　すなわち、本発明は、
（１）Asn-Val-Leu-His-Phe-Phe-Asn-Ala-Pro-Leu（配列番号１）のペプチド；
Ala-Ser-Leu-Asp-Ser-Asp-Pro-Trp-Val（配列番号２）のペプチド；
Lys-Leu-Lys-His-Tyr-Gly-Pro-Gly-Trp-Val（配列番号３）のペプチド；および、
Leu-Leu-Gln-Ala-Glu-Ala-Pro-Arg-Leu（配列番号４）のペプチド；
を含む組成物に、ｐＨ２．５～４の溶媒を添加する工程（Ａ）；
を含む、がんペプチドワクチンカクテル製剤の製造方法；や、
（２）工程（Ａ）で得られる溶液中の配列番号１～４のペプチドの濃度がそれぞれ２０ｍｇ／ｍＬ以下となるような量のｐＨ２．５～４の溶媒を添加する、上記（１）に記載の製造方法；や、
（３）工程（Ａ）で得られる溶液に、ｐＨ６．５～１４の溶液を添加、混合して、混合液のｐＨを５．５～８に調整する工程（Ｂ）をさらに含む、上記（１）又は（２）に記載の製造方法；や、
（４）工程（Ａ）で得られる溶液又は工程（Ｂ）で得られる溶液を、乾燥する工程（Ｃ）をさらに含む、上記（１）～（３）のいずれかに記載の製造方法；や、
（５）上記（１）～（３）のいずれかに記載の製造方法により製造されるがんペプチドワクチンカクテル製剤；や、
（６）上記（４）に記載の製造方法により製造されるがんペプチドワクチンカクテル製剤；や、
（７）上記（４）に記載の製造方法により製造されるがんペプチドワクチンカクテル製剤であって、水を添加することによってワクチン投与液を調製し、該ワクチン投与液を対象に投与することを特徴とする、前記がんペプチドワクチンカクテル製剤；
等に関する。
　本発明によれば、ワクチン投与液の調製が簡便であり、ワクチン投与液の調製時のペプチド含有液の無駄な廃棄が少なく、かつ、ペプチドの溶媒への溶解性が改善された、がんペプチドワクチンカクテル製剤、及びその製造方法等を提供することができる。
　また、本発明によれば、本発明における４種類のペプチドをそれぞれ別個に製剤とする場合と比較して、安価な製造コストや品質試験コストで、がんペプチドワクチンカクテル製剤を製造することができる。
図１は、条件１（グリシンバッファー、ｐＨ調整あり）で調製したペプチド混合液（２００μＬ）を減圧乾燥した後に、チューブの先端を観察した写真を示す。 図２は、条件２（塩酸、ｐＨ調整あり）で調製したペプチド混合液（２００μＬ）を減圧乾燥した後に、チューブの先端を観察した写真を示す。 図３は、条件３（塩酸、ｐＨ調整なし）で調製したペプチド混合液（２００μＬ）を減圧乾燥した後に、チューブの先端を観察した写真を示す。 図４は、条件１（グリシンバッファー、ｐＨ調整あり）で調製したペプチド混合液（２００μＬ）を減圧乾燥し、次いで、２００μＬの水を添加、撹拌した後に、チューブの先端を観察した写真を示す。 図５は、条件２（塩酸、ｐＨ調整あり）で調製したペプチド混合液（２００μＬ）を減圧乾燥し、次いで、２００μＬの水を添加、撹拌した後に、チューブの先端を観察した写真を示す。 図６は、条件３（塩酸、ｐＨ調整なし）で調製したペプチド混合液（２００μＬ）を減圧乾燥し、次いで、２００μＬの水を添加、撹拌した後に、チューブの先端を観察した写真を示す。 図７は、条件１（グリシンバッファー、ｐＨ調整あり）で調製したペプチド混合液（２００μＬ）を減圧乾燥し、次いで、２００μＬの水を添加、撹拌し、２４時間静置した後に、チューブの先端を観察した写真を示す。 図８は、条件１（グリシンバッファー、ｐＨ調整あり）で調製したペプチド混合液（２００μＬ）を減圧乾燥し、次いで、２００μＬの水を添加、撹拌し、２４時間静置してからvortexした後に、チューブの先端を観察した写真を示す。 図９は、条件２（塩酸、ｐＨ調整あり）で調製したペプチド混合液（２００μＬ）を減圧乾燥し、次いで、２００μＬの水を添加、撹拌し、２４時間静置した後に、チューブの先端を観察した写真を示す。 図１０は、条件２（塩酸、ｐＨ調整あり）で調製したペプチド混合液（２００μＬ）を減圧乾燥し、次いで、２００μＬの水を添加、撹拌し、２４時間静置してからvortexした後に、チューブの先端を観察した写真を示す。 図１１は、条件３（塩酸、ｐＨ調整なし）で調製したペプチド混合液（２００μＬ）を減圧乾燥し、次いで、２００μＬの水を添加、撹拌し、２４時間静置した後に、チューブの先端を観察した写真を示す。 図１２は、条件３（塩酸、ｐＨ調整なし）で調製したペプチド混合液（２００μＬ）を減圧乾燥し、次いで、２００μＬの水を添加、撹拌し、２４時間静置してからvortexした後に、チューブの先端を観察した写真を示す。 図１３は、実施例の試験４において、バイアル中のペプチド混合液を凍結乾燥した後、観察した写真を示す。 図１４は、実施例の試験４において、バイアル中の凍結乾燥粉体に超純水を添加し、撹拌した後、観察した写真を示す。
　本発明におけるがんペプチドワクチンカクテル製剤（以下、「本発明におけるカクテル製剤」又は単に「カクテル製剤」とも表示する。）は、本発明における４種類のペプチドを含む組成物に、ｐＨ２．５～４の溶媒を添加する工程（Ａ）を含む製造方法（以下、「本発明の製造方法」とも表示する。）で製造されるがんペプチドワクチンカクテル製剤である。
　本発明における４種類のペプチドは、以下に示す配列番号１～４の４種類のペプチドである。
Asn-Val-Leu-His-Phe-Phe-Asn-Ala-Pro-Leu（配列番号１）
Ala-Ser-Leu-Asp-Ser-Asp-Pro-Trp-Val（配列番号２）
Lys-Leu-Lys-His-Tyr-Gly-Pro-Gly-Trp-Val（配列番号３）
Leu-Leu-Gln-Ala-Glu-Ala-Pro-Arg-Leu（配列番号４）
　これらペプチドは、がん細胞が発現する腫瘍抗原タンパク質に由来するペプチド（本明細書中、腫瘍抗原ペプチドともいう）であり、ＨＬＡクラスＩに拘束されるＣＴＬに認識され、がん細胞に対する細胞傷害活性を誘導するペプチドである。本明細書において、がんペプチドワクチンとは、がんを治療するためのペプチドワクチンと同義であり、腫瘍抗原ペプチドを有効成分とし、がん細胞に対する免疫応答を誘導することによりがんを治療する医薬を意味する。本明細書において、「ペプチド」なる用語は、文脈上不適切でない限り、その医薬的に許容される塩を包含する意味で用いられる。
　本明細書における「医薬的に許容される塩」としては、酢酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、トリエチルアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、ピリジニウム塩、ジイソプロピルアンモニウム塩などが挙げられる。
　ペプチドは、常套的な方法で製造することができ、例えば、Peptide Synthesis, Interscience, NewYork, 1966；The Proteins, Vo1.2, Academic Press Inc, NewYork, 1976；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）１９８５；医薬品の開発続第十四巻・ペプチド合成、広川書店、1991などに記載の方法が挙げられるが、これらに限らず公知の方法が広く利用可能である。ペプチドの精製・回収は、ゲルクロマトグラフィー、イオンカラムクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等のクロマトグラフィーや、硫安やアルコール等を用いた溶解度差に基づく分画手段などの公知の方法により、行うことができる。ペプチドのアミノ酸配列の情報に基づき、これらに特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を作製し、当該抗体を用いて特異的に吸着回収する方法も利用可能である。製造されたペプチドは、通常、当該ペプチドに加え、酢酸、塩酸、ナトリウム、トリフルオロ酢酸などのカウンターイオンとの塩として回収される。かかる塩は、がんペプチドワクチンカクテル製剤の調製時の原薬として用いることができる。本明細書においてペプチドの質量に言及する場合、塩ではなく遊離形態のペプチドの質量を意味する。
　「本発明における４種類のペプチドを含む組成物」は、本発明における４種類のペプチドのみからなる組成物であってもよいし、後述するように、本発明における４種類のペプチドと任意成分を含む組成物であってもよいし、本発明における４種類のペプチドと任意成分からなる組成物であってもよい。また、かかる組成物は、固体であってもよいし、液体であってもよいが、ペプチドの安定性の観点から、固体であることが好ましく、乾燥物であることがより好ましい。
　本発明における４種類のペプチドを含む組成物に含まれる、かかる４種類のペプチドの質量比は特に制限されず、例えば、配列番号１のペプチドの質量：配列番号２のペプチドの質量：配列番号３のペプチドの質量：配列番号４のペプチドの質量が、０．７～１．３：０．７～１．３：０．７～１．３：０．７～１．３が挙げられ、０．８～１．２：０．８～１．２：０．８～１．２：０．８～１．２：が好ましく挙げられ、０．９～１．１：０．９～１．１：０．９～１．１：０．９～１．１：がより好ましく挙げられる。
　上記組成物に含まれる４種類のペプチドの含有量は、４種すべてで同質量であってもよいし、異なっていてもよい。
　本明細書の上記工程（Ａ）における「ｐＨ２．５～４の溶媒」としては、ｐＨ２．５～４の溶媒である限り特に制限されず、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸水溶液などの無機酸水溶液；クエン酸水溶液、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、コハク酸水溶液などの有機酸水溶液；ホウ酸バッファー、クエン酸バッファー、酢酸バッファー、グリシンバッファー、炭酸ナトリウムバッファー、炭酸カリウムバッファー、酢酸ナトリウムバッファー、酢酸カリウムバッファーなどのバッファー；が挙げられ、本発明における４種類のペプチド（特に配列番号１のペプチド）の溶解性の観点から、塩酸が好ましく挙げられる。ある実施形態において、ｐＨ２．５～４の溶媒は、クエン酸バッファー以外の、ｐＨ２．５～４の溶媒であり、別の実施形態において、ｐＨ２．５～４の溶媒は、グリシンバッファー以外の、ｐＨ２．５～４の溶媒である。
　なお、発明における４種類のペプチドを含む組成物に、ｐＨ２．５～４の溶媒を添加したものをそのままカクテル製剤とする場合は、前記溶媒として、医薬的に許容される、ｐＨ２．５～４の溶媒を用いる。
　「ｐＨ２．５～４の溶媒」のｐＨとしては、２．５～４である限り特に制限されないが、本発明における４種類のペプチド（特に配列番号１のペプチド）の溶解性の観点から、２．５～３．５が好ましい。
　工程（Ａ）において、「ｐＨ２．５～４の溶媒」を添加する量としては、特に制限されないが、本発明における４種類のペプチドを含む組成物に、ｐＨ２．５～４の溶媒を添加して得られる溶液における、本発明における４種類の各ペプチドの濃度が、それぞれ２０ｍｇ／ｍＬ以下、好ましくは３ｍｇ～２０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは３ｍｇ～１０ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは３ｍｇ～５ｍｇ／ｍＬとなるような添加量であることが好適に挙げられる。かかる溶液における本発明における４種類のペプチドの濃度は、４種すべて同じであってもよいし、異なっていてもよい。
　また、工程（Ａ）において、「ｐＨ２．５～４の溶媒」を添加する好適な量としては、かかる溶媒によって、本発明における４種類のペプチドを含む組成物を溶解した溶液のｐＨが２．５～４．５、好ましくは２．５～４．３となる量が挙げられる。したがって、上記工程（Ａ）として好適には、本発明における４種類のペプチドを含む組成物に、ｐＨ２．５～４の溶媒を添加して、前記ペプチドを溶解し、ｐＨ２．５～４．５（好ましくはｐＨ２．５～４．３）の溶液を得る工程、が挙げられる。
　また、工程（Ａ）において、「ｐＨ２．５～４の溶媒」を添加した後は、撹拌することが好ましく、vortexミキサーを用いて撹拌することがより好ましく挙げられる。
　本発明の製造方法としては、前述の工程（Ａ）に加えて、「工程（Ａ）で得られる溶液に、ｐＨ６．５～１４の溶液を添加、混合して、混合液のｐＨを５．５～８に調整する工程（Ｂ）」をさらに含んでいてもよく、至適ｐＨが中性領域のアジュバントと併用する場合には、かかるアジュバントの機能をより長時間維持しつつ、本発明における４種類のペプチドの溶解状態を保持する観点から、前述の工程（Ｂ）をさらに含んでいることが好ましい。カクテル製剤の投与液は、通常、複数人分をまとめて調製するため、投与液を調製後、投与液は一定時間保存しても、アジュバントの機能を維持しつつ、ペプチドの溶解状態が保持できることが好ましいからである。
　なお、本発明の製造方法が工程（Ａ）及び工程（Ｂ）を含んでいる場合、溶解しにくい配列番号１のペプチドについても、ｐＨ２．５～４の溶媒を添加して一度溶解していることで、その後、工程（Ｂ）においてｐＨを５．５～８に調整しても、本発明における４種類のペプチドの溶解状態を保持できる点で優れている。
　上記工程（Ｂ）における「ｐＨ６．５～１４の溶媒」としては、ｐＨ６．５～１４の溶媒である限り特に制限されず、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、酢酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム水溶液、塩基性アミノ酸水溶液（好ましくは、ヒスチジン、リシン、アルギニン及びトリプトファンから選択される塩基性アミノ酸の水溶液、より好ましくはヒスチジン水溶液）などの水溶液；ヒスチジンバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファー、重炭酸バッファー、トリス－ＨＣｌバッファーなどのバッファー；などが挙げられる。
　「ｐＨ６．５～１４の溶媒」のｐＨとしては、６．５～１４である限り特に制限されず、６．５～１３や、６．５～１２であってもよい。
　本発明の製造方法としては、前述の工程（Ａ）に加えて、あるいは、前述の工程（Ａ）及び工程（Ｂ）に加えて、「工程（Ａ）で得られる溶液又は工程（Ｂ）で得られる溶液を、乾燥する工程（Ｃ）」をさらに含んでいてもよく、がんペプチドワクチンカクテル製剤の保存安定性の観点から、前述の工程（Ｃ）をさらに含んでいることが好ましい。
　工程（Ａ）で得られる溶液又は工程（Ｂ）で得られる溶液を乾燥する方法としては、ペプチド溶液を乾燥する常法を用いることができ、減圧乾燥や凍結乾燥が挙げられ、医薬的に許容される溶媒（例えば、精製水または注射用水）への溶解しやすさの観点から、凍結乾燥が好ましく挙げられる。
　本発明の製造方法は、工程（Ａ）以外に、工程（Ａ）及び（Ｂ）以外に、又は、工程（Ａ）～（Ｃ）以外に、任意の工程を含んでいてもよい。
　かかる任意の工程として、具体的には、工程（Ａ）で得られる溶液又は工程（Ｂ）で得られる溶液を濾過滅菌する工程（Ｄ）；や、工程（Ａ）で得られる溶液、工程（Ｂ）で得られる溶液、又は、それらの溶液を濾過滅菌して得られる溶液を、ガラスバイアル等の容器に充填する工程（Ｅ）；などが挙げられる。ある実施形態において、本発明の製造方法が乾燥工程（Ｃ）及び充填工程（Ｅ）を含む場合、充填工程（Ｅ）の後に乾燥工程（Ｃ）を実施してもよいし、乾燥工程（Ｃ）の後に充填工程（Ｅ）を実施してもよいが、充填工程（Ｅ）の後に乾燥工程（Ｃ）を実施することが好ましい。
　他の任意の工程としては、任意成分を添加する工程（Ｆ）が挙げられる。かかる任意成分としては、緩衝剤、抗酸化剤、保存剤、賦形剤、懸濁剤、等張化剤、キレート剤、界面活性剤などが挙げられ、具体的には、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンなどの抗酸化剤；オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、および塩化ベンゼトニウムなどの保存剤；ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、および免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、およびリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、およびデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、およびソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；およびTWEEN（商標）、PLURONICS（商標）、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。なお、前述のトレハロースやスクロースは、凍結保護剤や浸透圧調節剤として好適に挙げられる。がんペプチドワクチンカクテル製剤が、トレハロース及び／又はスクロースを含有する場合、トレハロース及び／又はスクロースの含有量は特に制限されないが、トレハロース及び／又はスクロースの合計質量に対する各ペプチドの質量比が０．０１～１または０．０２～０．３であることが好ましい。本明細書においてトレハロースやスクロースの質量に言及する場合、トレハロース無水物やスクロース無水物の質量を意味する。
　ある実施形態において、本発明の製造方法が工程（Ｆ）を有する場合、各工程の順序は問わず、また、他の工程と同時であってもよいが、工程（Ａ）又は工程（Ｂ）の後に実施することや、工程（Ａ）又は工程（Ｂ）の後であって、工程（Ｃ）の前に実施することが挙げられる。また、工程（Ｆ）を工程（Ａ）より前に実施してもよく、例えば、本発明における４種類のペプチドを含む組成物に、上記任意成分を添加してもよい。
　本発明の製造方法により製造されるカクテル製剤は、少なくとも、特定の４種類のペプチド（それぞれ配列番号１～４に示されるアミノ酸配列からなるペプチド）を含む。カクテル製剤の剤型としては、特に制限はないが、水溶液製剤または乾燥製剤が好ましく、ペプチドの安定性の観点から、乾燥製剤が好ましく、溶媒を添加した際の溶解しやすさの観点から、凍結乾燥製剤がより好ましい。
　本発明におけるカクテル製剤は、水溶液の状態で投与される。カクテル製剤が水溶液製剤である場合、そのまま患者に投与することができ、乾燥製剤である場合、医薬的に許容される溶媒（例えば、精製水または注射用水）で溶解した水溶液を投与することができる。かかる溶解の方法としては、乾燥製剤に、前述の溶媒を添加した後、撹拌することが好ましく、vortexミキサーを用いて撹拌することがより好ましく挙げられる。
　本発明におけるカクテル製剤の投与時の水溶液（すなわち、投与液）中の、本発明における４種類の各ペプチドの濃度としては、特に制限されないが、例えば、それぞれ２０ｍｇ／ｍＬ以下、好ましくは３ｍｇ～２０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは３ｍｇ～１０ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは３ｍｇ～５ｍｇ／ｍＬが挙げられる。かかる投与液における、前述の４種類のペプチドの濃度は、４種すべて同じであってもよいし、異なっていてもよい。
　本発明におけるカクテル製剤の投与時の水溶液（すなわち、投与液）のｐＨは特に制限されず、例えばｐＨ２．５～８．０が挙げられるが、例えば、前述の投与液にアジュバントを含有させて用いる場合に、そのアジュバントの至適ｐＨが中性領域であるときは、前述の投与液のｐＨとして、５．５～８．０；５．５～７．５；６．０～８．０；及び、６．０～７．５；などが好ましく挙げられる。カクテル製剤の投与液を調製する際に、ｐＨ調整剤を添加してｐＨを調整してもよいが、簡便性の観点から、ｐＨ調整剤を添加せずに投与液を調整できることが好ましく、ｐＨ調整剤を添加せずに、医薬的に許容される溶媒（例えば、精製水または注射用水）を添加、撹拌することによって投与液を調整できることがより好ましい。
　工程（Ａ）～（Ｃ）を含む本発明の製造方法により製造されるカクテル製剤は、投与液を調製する際に、ｐＨ調整剤を添加しない場合であっても、医薬的に許容される溶媒（例えば、精製水または注射用水）を添加、撹拌することによって、ｐＨが５．５～８．０；５．５～７．５；６．０～８．０；及び、６．０～７．５；などの投与液を簡便に調製できる点で優れている。また、本発明の製造方法により製造されるカクテル製剤は、投与液のｐＨを５．５～８としても、本発明における４種類のペプチドの溶解状態を保持することができる点で優れている。
　本発明におけるカクテル製剤の投与液の濁度（ＯＤ６００）としては、特に制限されないが、例えば０．２以下が好ましく、０．１以下がより好ましく、０．０８以下がさらに好ましい。投与液の濁度（ＯＤ６００）の測定法は常法を用いることができる。
　本発明におけるカクテル製剤の対象となるがんの種類は特に限定されない。例えば、がんとしては、前立腺がん、膵臓がん、大腸がん、肺がん（非小細胞肺がんを含む）、造血器腫瘍、脳腫瘍、子宮がん、子宮頸がん、胃がん、黒色腫（悪性黒色腫を含む）、甲状腺がん、肝臓がん、食道がんが挙げられる。好ましくは、カクテル製剤は、黒色腫（悪性黒色腫を含む）または肺がん（非小細胞肺がんを含む）に用いられる。
　本発明におけるカクテル製剤は、さらにアジュバントを含んでもよく、アジュバントとともに投与されてもよい。アジュバントとしては、ペプチドの水溶液をエマルション化することでペプチドの投与局所への貯留性を高める不完全フロイントアジュバント（例えばＩＳＡ－５１等、ＳＥＰＰＩＣ社）やプルランなどの多糖類や、完全フロイントアジュバント、ＢＣＧ、アラム、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＣｐＧ等の免疫増強作用を有するものを使用することができる。ＧＭ－ＣＳＦの至適ｐＨは中性領域（ｐＨ６～８）であり、本発明におけるカクテル製剤で使用するアジュバントとして特に好適に挙げられる。
　本発明におけるカクテル製剤は、通常、患者の皮内または皮下へ投与される。ペプチドは、例えば静脈注射等により投与されると速やかに分解されてしまい、免疫応答を十分に引き起こすことができないためである。また、抗原を捕獲し、ＨＬＡ分子を介して細胞表面上に提示して、ＣＴＬ等のＴ細胞を活性化する抗原提示細胞が、皮内または皮下に存在することから、皮内または皮下へ投与することで細胞傷害活性を示すＣＴＬ等を効率よく活性化できるためである。投与部位は、特に制限はないが、投与開始時から可能な限りがんの病変に近いリンパ節付近とすることが好ましく、例えば上腕部、大腿部などが挙げられる。また、投与の副作用により投与部位に炎症等が発生して投与が困難になった場合は、他の部位（腹部など）に投与してもよい。
　本発明におけるカクテル製剤は、所望の効果を発揮しうる量（本明細書において「有効量」ともいう）で患者に投与される。投与量は、皮内または皮下投与が許容される量であれば特に制限はないが、好ましくは、１種類のペプチドにつきペプチドの乾燥粉末の質量で、０．１ｍｇ以上、好ましくは、０．１ｍｇ～３ｍｇ、より好ましく１ｍｇ～３ｍｇである。本発明における４種類のペプチドの投与量は４種すべてで同じであってもよいし、異なっていてもよい。
　本発明におけるカクテル製剤の投与頻度は、免疫応答が得られる頻度であればよく、１日、２日、３日、４日、５日、または６日に１回投与しても、１週、２週、３週、４週、５週、または６週に１回投与してもよく、途中で投与頻度を変更してもよい。例えば、１週１回の投与を４回行った後、３週～４週に１回の投与を継続してもよい。カクテル製剤の投与回数は、例えば、少なくとも８回、好ましくは１６回以上である。患者が投与に耐えうる限り投与回数に上限はないが、臨床試験では最大８４回まで投与した実績があり、少なくとも当該回数までは投与可能である。
　本発明におけるカクテル製剤を患者に投与すると、患者体内で投与されたペプチドに対するＣＴＬが活性化され、がん細胞が排除され、臨床効果を得ることができる。
　本発明におけるカクテル製剤は、１以上の他の抗腫瘍薬または治療方法と併用されてもよい。各患者のがん細胞はヘテロな集団であり、免疫応答では排除しきれない細胞や、抗腫瘍薬やホルモン療法等に耐性を持つ細胞が存在していることから、本発明におけるカクテル製剤と他の抗腫瘍薬や治療方法とを併用することによって、がん病変の縮小や生存期間の延長等の臨床効果を高めることができる。
　ある実施形態において、抗腫瘍薬は、免疫チェックポイント阻害剤である。免疫チェックポイント阻害剤は、がん細胞や抗原提示細胞による免疫抑制作用を阻害する。免疫チェックポイント阻害剤としては、例えば、以下の分子に対する薬剤（例えば、抗体）が挙げられる：CTLA-4（イピリムマブ、トレメリムマブなど）、PD-1（ニボルマブ、ペムブロリズマブ、AMP-224、AMP-514（MEDI0680）、ピディリズマブ（CT-011）など）、LAG-3（IMP-321、BMS-986016など）、BTLA、KIR（IPH2101など）、TIM-3、PD-L1（Durvalumab（MEDI4736）、MPDL3280A、BMS-936559、アベルマブ（MSB0010718C）など）、PD-L2、B7-H3（MGA-271など）、B7-H4、HVEM、GAL9、CD160、VISTA、BTNL2、TIGIT、PVR、BTN1A1、BTN2A2、BTN3A2、およびCSF1-R。好ましい実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、PD-1に対する薬剤、例えば抗PD-1抗体（ニボルマブ、ペムブロリズマブ、AMP-514（MEDI0680）、ピディリズマブ（CT-011）など）である。
　抗腫瘍薬としては、さらに、アルキル化剤、代謝拮抗剤、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害薬、微小管重合阻害薬、分子標的薬などが挙げられ、具体的には、5-FU、エストラムスチン、ドセタキセル、テモゾロミド、シスプラチン、ジェムザール、リツキシマブなどが挙げられる。治療方法としては、手術、放射線療法、ホルモン療法（デキサメタゾン、ミトキサントロン、プレゾニゾロン、エストロゲン、プロゲストロンなどのステロイドやリュープリンなどのアナログ剤）などが挙げられる。
　本明細書において、併用とは、同一の患者のがんの治療に同時にまたは逐次使用されることを含み、その順序は問わない。本発明におけるカクテル製剤と他の抗腫瘍薬や治療方法とを併用する場合、カクテル製剤がＣＴＬ等の血球系の細胞を活性化して効果を発揮することから、造血系や免疫応答の活性化に影響を及ぼさない範囲で他の抗腫瘍薬や治療方法を使用することが好ましい。例えば、抗腫瘍薬の投与後リンパ球数が（例えば、１，０００個／ｍＬ以上に）回復してから本発明におけるカクテル製剤を投与する、本発明におけるカクテル製剤を投与した後に他の抗腫瘍薬や治療方法を用いる、あるいは本発明におけるカクテル製剤の投与期間中に白血球数やリンパ球数の減少を起こさない範囲で他の抗腫瘍薬や治療方法を用いる、などの方法が考えられる。
　さらなる態様において、本発明は、がんを治療するための方法であって、Asn-Val-Leu-His-Phe-Phe-Asn-Ala-Pro-Leu（配列番号１）のペプチド、Ala-Ser-Leu-Asp-Ser-Asp-Pro-Trp-Val（配列番号２）のペプチド、Lys-Leu-Lys-His-Tyr-Gly-Pro-Gly-Trp-Val（配列番号３）のペプチド、およびLeu-Leu-Gln-Ala-Glu-Ala-Pro-Arg-Leu（配列番号４）のペプチドを含むがんペプチドワクチンカクテル製剤を患者に投与することを含む方法に関する。
　さらなる態様において、本発明は、がんペプチドワクチンカクテル製剤の製造のための、Asn-Val-Leu-His-Phe-Phe-Asn-Ala-Pro-Leu（配列番号１）のペプチド、Ala-Ser-Leu-Asp-Ser-Asp-Pro-Trp-Val（配列番号２）のペプチド、Lys-Leu-Lys-His-Tyr-Gly-Pro-Gly-Trp-Val（配列番号３）のペプチド、およびLeu-Leu-Gln-Ala-Glu-Ala-Pro-Arg-Leu（配列番号４）のペプチドの使用に関する。
　さらなる態様において、本発明は、がんの治療に使用するための、Asn-Val-Leu-His-Phe-Phe-Asn-Ala-Pro-Leu（配列番号１）のペプチド、Ala-Ser-Leu-Asp-Ser-Asp-Pro-Trp-Val（配列番号２）のペプチド、Lys-Leu-Lys-His-Tyr-Gly-Pro-Gly-Trp-Val（配列番号３）のペプチド、およびLeu-Leu-Gln-Ala-Glu-Ala-Pro-Arg-Leu（配列番号４）のペプチドに関する。
　以下に、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　がんペプチドワクチンのカクテル製剤の製造方法として、以下の表１の条件１～３の方法について、具体的な検討を行うこととした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［試験１］ペプチドの溶解性検討
　表１の（i）の工程を評価するために、Asn-Val-Leu-His-Phe-Phe-Asn-Ala-Pro-Leu（配列番号１）、Ala-Ser-Leu-Asp-Ser-Asp-Pro-Trp-Val（配列番号２）、Lys-Leu-Lys-His-Tyr-Gly-Pro-Gly-Trp-Val（配列番号３）およびLeu-Leu-Gln-Ala-Glu-Ala-Pro-Arg-Leu（配列番号４）のペプチド原薬（Lonza社に委託製造）を用いて、以下の方法にて、ペプチドの溶解性を検討した。
（条件１；グリシンバッファーによるペプチドの溶解）
　配列番号１のペプチドの最終濃度が１８ｍｇ／ｍＬとなるように、５０ｍＭのグリシンバッファー（グリシン－ＨＣｌ緩衝液）（ｐＨ３．５）に、配列番号１のペプチド原薬を添加し、撹拌した。得られたペプチド溶液におけるペプチドの溶解性を、溶液を外観目視することにより評価した。
　配列番号２～４のペプチドについてもそれぞれ同様の方法でグリシンバッファーに添加し、撹拌して、ペプチドの溶解性を評価した。
　なお、配列番号１のペプチドについては、グリシンバッファーに添加した後、数十秒程度vortexする必要があった。
　また、配列番号１～４のペプチドのグリシンバッファー溶液を、１５０μＬずつ分取して、混合し、配列番号１～４の４種類のペプチドを含むペプチド混合液６００μＬを調製した。かかるペプチド混合液におけるペプチドの溶解性を、溶液を外観目視することにより評価した。
（条件２、３；１ｍＭの塩酸によるペプチドの溶解）
　配列番号１のペプチドの最終濃度が１８ｍｇ／ｍＬとなるように、１ｍＭの塩酸（ｐＨ約３）に、配列番号１のペプチド原薬を添加し、撹拌した。得られたペプチド溶液におけるペプチドの溶解性を評価した。
　配列番号２～４のペプチドについてもそれぞれ同様の方法で１ｍＭの塩酸（ｐＨ約３）に添加し、撹拌して、ペプチドの溶解性を評価した。
　なお、配列番号１のペプチドについて、１ｍＭの塩酸を用いた場合は、グリシンバッファーを用いた場合よりも容易に溶解することができた。
　また、配列番号１～４のペプチドの１ｍＭの塩酸溶液を、１５０μＬずつ分取して、混合し、配列番号１～４の４種類のペプチドを含むペプチド混合液６００μＬを調製した。かかるペプチド混合液におけるペプチドの溶解性を、溶液を外観目視することにより評価した。
（結果）
　ペプチドの溶解性を評価した各結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２の結果から、ｐＨが３．５や３といった酸性溶媒であれば、配列番号１～４の個々のペプチドを溶解することができることが分かった。また、前述したように、１ｍＭ塩酸を用いた場合（条件２、３）は、５０ｍＭグリシンバッファーを用いた場合（条件１）よりも、短時間の撹拌でペプチドを溶解させることができたため、１ｍＭ塩酸の方が好ましいことが分かった。
　また、配列番号１～４のペプチドを混合した場合も、澄明な状態が保持されたことから、配列番号１～４のペプチドの混合物であっても、ｐＨが３．５や３といった酸性溶媒で溶解できると考えられた。
　すなわち、配列番号１～４のペプチドの混合物（乾燥物）を含むカクテル製剤を調製する際に、ｐＨが３．５や３といった酸性溶媒を用いればこれらのペプチドを容易かつ簡便に溶解することができ、カクテル製剤の投与液を容易かつ簡便に調製し得ることが示された。
［試験２］ペプチド混合液のｐＨを上昇させることによる、ペプチドの溶解性への影響の検討　１
　配列番号１～４のペプチドの混合物（乾燥物）を含むカクテル製剤を用いる場合に、かかるカクテル製剤のワクチン効果をより高めるために、アジュバントをさらに添加する場合がある。アジュバントには様々な種類のものがあり、中には、保存至適ｐＨが中性領域であるものもある。カクテル製剤の投与液は、通常、複数人分をまとめて調製するため、投与液を調製後、投与溶液は一定時間保存してもペプチドの溶解状態が保持できることが好ましい。
　そこで、ペプチド混合液のｐＨを中性領域に上昇させても（表１の（ii）の工程）、ペプチドの溶解状態が保持できるかを、以下の方法にて検討した。
（条件１；グリシンバッファーでペプチド溶解、及び、ヒスチジンバッファーでｐＨ調整）
　試験１の条件１に記載の方法で、配列番号１～４のペプチドを５０ｍＭのグリシンバッファーで溶解してペプチド混合液６００μＬを調製した。なお、このペプチド混合液における配列番号１～４のペプチドの合計濃度は１８ｍｇ／ｍＬであり、配列番号１～４の個々のペプチド濃度はそれぞれ４．５ｍｇ／ｍＬである。
　前述のペプチド混合液に、５０％スクロースを９０μＬ添加し、ｐＨを測定した。次いで、かかるペプチド混合液に、２００ｍＭヒスチジンバッファー（ｐＨ６．５）を添加してｐＨ６に調整した。調製後のペプチド混合液のｐＨを測定し、次いで、ペプチド混合液を外観目視することによりペプチドの溶解性を評価した。
（条件２；１ｍＭの塩酸でペプチド溶解、及び、ヒスチジンバッファーでｐＨ調整）
　試験１の条件２に記載の方法で、配列番号１～４のペプチドを１ｍＭの塩酸で溶解してペプチド混合液６００μＬを調製した。なお、このペプチド混合液における配列番号１～４のペプチドの合計濃度は１８ｍｇ／ｍＬであり、配列番号１～４の個々のペプチド濃度はそれぞれ４．５ｍｇ／ｍＬである。
　前述のペプチド混合液に、５０％スクロースを９０μＬ添加し、ｐＨを測定した。次いで、かかるペプチド混合液に、２００ｍＭヒスチジンバッファー（ｐＨ６．５）を添加してｐＨ６に調整した。調製後のペプチド混合液のｐＨを測定し、次いで、ペプチド混合液を外観目視することによりペプチドの溶解性を評価した。
（結果）
　ペプチド混合液のｐＨの測定結果、及び、ペプチドの溶解性を評価した各結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３の結果から、ペプチド混合液のｐＨを６に調整した場合であっても、配列番号１～４のペプチドは溶解状態が保持されることが分かった。
［試験３］ペプチド混合液の乾燥後、水を添加した際のペプチドの溶解性の確認
　ペプチド混合液を減圧乾燥した後、水を添加した際に、ペプチドが水に溶解するかを、以下の方法にて検討した。
（条件１；グリシンバッファーでペプチド溶解、及び、ヒスチジンバッファーでｐＨ調整）
　試験２の条件１に記載の方法で、配列番号１～４のペプチドを５０ｍＭのグリシンバッファーで溶解してペプチド混合液６００μＬを調製し、５０％スクロースを９０μＬ添加し、次いで、２００ｍＭヒスチジンバッファー（ｐＨ６．５）を添加してｐＨ６に調整した後、MilliQ水で液量を９００μＬに調整した。なお、かかる９００μＬのペプチド混合液における配列番号１～４のペプチドの合計濃度は１２ｍｇ／ｍＬであり、配列番号１～４の個々のペプチド濃度はそれぞれ３．０ｍｇ／ｍＬであり、スクロースは５％（w/v）である。
　かかる９００μＬのペプチド混合液を、２００μＬずつ３本の１．５ｍＬ容量チューブに分注した。
（条件２；１ｍＭの塩酸でペプチド溶解、及び、ヒスチジンバッファーでｐＨ調整）
　試験２の条件２に記載の方法で、配列番号１～４のペプチドを１ｍＭの塩酸で溶解してペプチド混合液６００μＬを調製し、５０％スクロースを９０μＬ添加し、次いで、２００ｍＭヒスチジンバッファー（ｐＨ６．５）を添加してｐＨ６に調整した後、MilliQ水で液量を９００μＬに調整した。なお、かかる９００μＬのペプチド混合液における配列番号１～４のペプチドの合計濃度は１２ｍｇ／ｍＬであり、配列番号１～４の個々のペプチド濃度はそれぞれ３．０ｍｇ／ｍＬであり、スクロースは５％（w/v）である。
　かかる９００μＬのペプチド混合液を、２００μＬずつ３本の１．５ｍＬ容量チューブに分注した。
（条件３；１ｍＭの塩酸でペプチド溶解するが、ヒスチジンバッファーでのｐＨ調整は行わない）
　試験１の条件３に記載の方法で、配列番号１～４のペプチドを１ｍＭの塩酸で溶解してペプチド混合液６００μＬを調製した。かかるペプチド混合液に５０％スクロースを９０μＬ添加した後、ｐＨ調整は行わずに、MilliQ水で液量を９００μＬに調整した。なお、かかる９００μＬのペプチド混合液における配列番号１～４のペプチドの合計濃度は１２ｍｇ／ｍＬであり、配列番号１～４の個々のペプチド濃度はそれぞれ３．０ｍｇ／ｍＬであり、スクロースは５％（w/v）である。
　かかる９００μＬのペプチド混合液を、２００μＬずつ３本の１．５ｍＬ容量チューブに分注した。
（減圧乾燥）
　シリカゲルを敷き詰めたデシケーター内の中板の上に、ペプチド混合液を含む前述のチューブ（計９本）を、蓋を開けたまま配置した。真空ポンプでデシケーター内を－０．０８Ｍｐａ程度まで減圧して１週間放置することにより、減圧乾燥を実施した。
（結果）
　減圧乾燥後の各チューブの外観を目視した結果を表４及び図１～３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４及び図１～３の結果から、条件１や条件２の場合は、減圧乾燥により、透明な塊がチューブの底にこびりついた状態となったのに対し、条件３の場合は、減圧乾燥により、白い塊がチューブの底にこびりついた状態となることが分かった。
　また、乾燥した前述の９本のチューブに、それぞれ２００μＬのMilliQ水を添加、撹拌して、ペプチド混合液の再構成を行った。再構成を行ったときの各チューブの外観を目視した結果を表５及び図４～６に示す。また、再構成したペプチド混合液のｐＨ及びＯＤ６００を測定した結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５及び図４～６の結果から、条件１と比較して、条件２、３の方が、水を添加した際の、ペプチド乾燥物の水への溶解性が高く、好ましいことが分かった。特に、条件２や条件３の場合は、溶液のＯＤ６００の値が特に低く、他の場合と比較してペプチドが特に良く溶解していることが分かった。また、条件２と条件３を比較すると、ｐＨを中性領域に調整しない条件３の方が、ペプチドの溶解性は多少高かったものの、ｐＨを中性領域に調整する条件２においても、ペプチドの十分な溶解性が得られることが分かった。
　なお、水を添加してペプチド混合液を再構成した場合の溶液のｐＨは、減圧乾燥前の溶液のｐＨとおおむね同程度であった。
　また、MilliQ水を添加、撹拌してから２４時間静置後の各チューブの外観を目視した。その結果を表６及び図７、９、１１に示す。また、それらの各チューブをvortexした後に、再度外観を目視した。これらの結果を表６及び図８、１０、１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６及び図７～１２の結果から、水を添加してから２４時間静置後や、さらにvortex後においても、条件１と比較して、条件２、３の方が、ペプチドが水によく溶解している状態であり、好ましいことが分かった。
［試験４］ペプチド混合液のｐＨを上昇させることによる、ペプチドの溶解性への影響の検討　２
　上記試験２では、ペプチド混合液のｐＨを上昇させるｐＨ調整剤として、２００ｍＭヒスチジンバッファー（ｐＨ６．５）を用いたが、その他のｐＨ調整剤を用いた場合でもペプチドの溶解状態が保持できるかを調べるために、以下の方法で試験を行った。なお、かかる試験では、ｐＨを上昇させるｐＨ調整剤として、２００ｍＭヒスチジン水溶液（ｐＨ７．７５）を用いた。
（各ペプチド溶液の調製）
　配列番号１のペプチドの最終濃度が２５ｍｇ／ｍＬとなるように、１ｍＭの塩酸（ｐＨ約３）に、配列番号１のペプチド原薬を添加し、撹拌した。
　また、配列番号２のペプチドの最終濃度が２５ｍｇ／ｍＬとなるように、１ｍＭの塩酸（ｐＨ約３）に、配列番号２のペプチド原薬を添加し、撹拌した。
　また、配列番号３のペプチドの最終濃度が２５ｍｇ／ｍＬとなるように、１ｍＭの塩酸（ｐＨ約３）に、配列番号３のペプチド原薬を添加し、撹拌した。
　また、配列番号４のペプチドの最終濃度が２５ｍｇ／ｍＬとなるように、１ｍＭの塩酸（ｐＨ約３）に、配列番号４のペプチド原薬を添加し、撹拌した。
　このようにして、４種類のペプチド溶液を調製した。これら４種類のペプチド溶液におけるペプチドの溶解性を、溶液を外観目視することにより評価したところ、いずれのペプチド溶液も澄明であった。
（ペプチド混合液の調製）
　これら４種類のペプチド溶液、５０％（ｗ／ｖ）スクロース水溶液、２００ｍＭヒスチジン水溶液（ｐＨ７．７５）、及び、超純水を、表７に記載の液量で混合して、配列番号１～４の４種類のペプチドを含むペプチド混合液１０００μＬ（ｐＨ約６）を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（ペプチド混合液の凍結乾燥）
　かかるペプチド混合液１０００μＬ（すなわち１ｍＬ）を、３ｍＬ容バイアルに添加した後、ゴム栓をして、フリーザーにて－８０℃で凍結した。
　凍結乾燥機のトラップの温度が－３０℃以下になった後、バイアルをフリーザーから取り出し、ゴム栓を外した後に凍結乾燥機のドライチャンバー内に静置した。ドライチャンバーにカバーを付けて密閉後、ポンプをオンにしてドライチャンバー内の減圧を開始した。なお、凍結乾燥中のトラップの設定温度は－４５℃（すなわち、凍結乾燥機におけるトラップの初期設定の温度）とした。減圧開始から約２０時間後にポンプをオフにしてドライチャンバー内を常圧に戻し、凍結乾燥を終了した。凍結乾燥後、バイアル内には、塊状の白い凍結乾燥粉体（白い凍結乾燥ケーキ；図１３）となった混合ペプチドが得られた。
（凍結乾燥物を用いた、ペプチド混合液の再構成）
　凍結乾燥後のバイアル内に、超純水を１ｍＬ添加した。白い凍結乾燥粉体は超純水に速やかに溶解し、溶液は澄明となった（図１４）。なお、溶解時に発泡は観察されなかった。
　以上より、ペプチド混合液のｐＨを上昇させる溶液として、２００ｍＭヒスチジン水溶液を用いた場合であっても、ペプチドの溶解状態が保持できることが示された。

Claims (7)

  1. 　Asn-Val-Leu-His-Phe-Phe-Asn-Ala-Pro-Leu（配列番号１）のペプチド；
    Ala-Ser-Leu-Asp-Ser-Asp-Pro-Trp-Val（配列番号２）のペプチド；
    Lys-Leu-Lys-His-Tyr-Gly-Pro-Gly-Trp-Val（配列番号３）のペプチド；および、
    Leu-Leu-Gln-Ala-Glu-Ala-Pro-Arg-Leu（配列番号４）のペプチド；
    を含む組成物に、ｐＨ２．５～４の溶媒を添加する工程（Ａ）；
    を含む、がんペプチドワクチンカクテル製剤の製造方法。
  2. 　工程（Ａ）で得られる溶液中の配列番号１～４のペプチドの濃度がそれぞれ２０ｍｇ／ｍＬ以下となるような量のｐＨ２．５～４の溶媒を添加する、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　工程（Ａ）で得られる溶液に、ｐＨ６．５～１４の溶液を添加、混合して、混合液のｐＨを５．５～８に調整する工程（Ｂ）をさらに含む、請求項１に記載の製造方法。
  4. 　工程（Ａ）で得られる溶液又は工程（Ｂ）で得られる溶液を、乾燥する工程（Ｃ）をさらに含む、請求項１～３のいずれかに記載の製造方法。
  5. 　請求項１～３のいずれかに記載の製造方法により製造されるがんペプチドワクチンカクテル製剤。
  6. 　請求項４に記載の製造方法により製造されるがんペプチドワクチンカクテル製剤。
  7. 　請求項４に記載の製造方法により製造されるがんペプチドワクチンカクテル製剤であって、水を添加することによってワクチン投与液を調製し、該ワクチン投与液を対象に投与することを特徴とする、前記がんペプチドワクチンカクテル製剤。
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