[go: up one dir, main page]

WO2023003339A1 - 세포 내부에 침투하여 표적단백질을 분해하여 제거하는 세포침투 분해항체 및 이의 용도 - Google Patents

세포 내부에 침투하여 표적단백질을 분해하여 제거하는 세포침투 분해항체 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2023003339A1
WO2023003339A1 PCT/KR2022/010589 KR2022010589W WO2023003339A1 WO 2023003339 A1 WO2023003339 A1 WO 2023003339A1 KR 2022010589 W KR2022010589 W KR 2022010589W WO 2023003339 A1 WO2023003339 A1 WO 2023003339A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
inbc2
cell
catenin
penetrating
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2022/010589
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김용성
이다솜
서지수
권혜진
김대성
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ajou University Industry Academic Cooperation Foundation
Original Assignee
Ajou University Industry Academic Cooperation Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajou University Industry Academic Cooperation Foundation filed Critical Ajou University Industry Academic Cooperation Foundation
Priority to US18/290,613 priority Critical patent/US20240352100A1/en
Priority to EP22846209.9A priority patent/EP4375294A1/en
Priority to CN202280060417.XA priority patent/CN117916258A/zh
Publication of WO2023003339A1 publication Critical patent/WO2023003339A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/80—Immunoglobulins specific features remaining in the (producing) cell, i.e. intracellular antibodies or intrabodies
    • C07K2317/82—Immunoglobulins specific features remaining in the (producing) cell, i.e. intracellular antibodies or intrabodies functional in the cytoplasm, the inner aspect of the cell membrane, the nucleus or the mitochondria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/95—Fusion polypeptide containing a motif/fusion for degradation (ubiquitin fusions, PEST sequence)

Definitions

  • the present invention relates to a cell-penetrating degrading antibody (referred to as A cell-penetrating degrading antibody or Degrobody) that penetrates the cytosol of living cells to specifically recognize, degrade, and remove target proteins inside the cytosol, and compositions containing the same, and It's about its use.
  • a cell-penetrating degrading antibody or Degrobody a cell-penetrating degrading antibody that penetrates the cytosol of living cells to specifically recognize, degrade, and remove target proteins inside the cytosol, and compositions containing the same, and It's about its use.
  • the present invention specifically mimics the mechanism and function of the ubiquitin-proteasome system (UPS), an intracellular protein degradation system, to specifically degrade target proteins recognized by antibodies. It relates to a cell-penetrating decomposition antibody that can be used, a composition containing the antibody, and a use thereof.
  • UPS ubiquitin-proteasome system
  • the present invention relates to a cell/tissue-specific cytosol-penetrating interfering antibody (iMab) that penetrates into the cytoplasm of living cells and specifically recognizes a target protein. It relates to a cell penetrating decomposition antibody fused with U-Box of E3 (ubiquitin ligase enzyme) that can bind to (ubiquitin conjugating enzyme), a composition containing the same, and its use.
  • iMab cell/tissue-specific cytosol-penetrating interfering antibody
  • U-Box of E3 ubiquitin ligase enzyme
  • the present invention connects the U-Box of E3 capable of binding to E2 of UPS, an intracellular protein degradation system, to a cell penetrating interference antibody that penetrates into the cytoplasm of living cells and specifically recognizes a target protein, and then connects to E2. It relates to a cell penetrating degrading antibody that induces poly-ubiquitination (poly-Ub) on a target protein to which the cell penetrating interference antibody binds, ultimately inducing target protein degradation by UPS.
  • poly-Ub poly-ubiquitination
  • the present invention is a fusion of an E3 recruiter (E3 recruiting ligand) that can bind to E3 of the intracellular proteolysis system, the UPS, to a cell penetrating interference antibody that penetrates the cytoplasm of living cells and specifically recognizes a target protein.
  • E3 recruiter E3 recruiting ligand
  • a cell penetrating interference antibody that penetrates the cytoplasm of living cells and specifically recognizes a target protein.
  • Antibodies and compositions comprising them and uses thereof.
  • the present invention specifically binds to membrane protein receptors on the cell surface that are overexpressed in tumor cells or tissues in the form of complete immunoglobulin and is internalized (endocytosis) by the ability of endosome escape (endosomal escape) It relates to a cell penetrating decomposition antibody fused with U-Box or E3 recruiter to a cell penetrating interference antibody that is located in the cytoplasm of a cell and binds to a cytoplasmic target protein.
  • U-Box binds to E2 and is close to the target protein position to poly-Ub the target protein
  • the E3 recruiter binds to E3 (recruiting) and places it close to the target protein to induce poly-Ubization in the target protein, ultimately forming the ubiquitin-proteasome system (UPS)
  • UPS ubiquitin-proteasome system
  • the present invention relates to the search and improvement of the U-box capable of binding (recruiting) to the optimal degradation E2 according to the cytoplasmic target protein of the cell penetrating degradation antibody.
  • the present invention relates to the search and improvement of an E3 recruiter for optimal degradation E3 according to a cytoplasmic target protein of a cell penetrating degradation antibody and recruiting.
  • the present invention relates to optimizing the fusion site and linker of U-Box or E3 recruiter in a cell penetrating decomposition antibody.
  • cells referred to as inBC2- E4B 1227-1302 or inBC2-E3 recruiter in the form of linking E3 recruiter which is a form in which E4B 1227-1302 , a U-Box, is linked to anti- ⁇ -catenin cell penetration interference antibody (inBC2) It relates to the development of permeation degradation antibodies.
  • the present invention is an anti- ⁇ -catenin cell penetration interference antibody (inBC2) that penetrates into the cytoplasm by endosome escape ability after being internalized through a receptor membrane protein on the surface of cancer cells and binds to the target protein ⁇ -catenin Anti- ⁇ -catenin cell penetration degradation antibody (inBC2- E4B 1227-1302 ) linked to E4B 1227-1302 , a U-Box, or anti- ⁇ -catenin cell penetration degradation antibody (inBC2-E3 recruiter) linked to E3 recruiter It is about.
  • inBC2 anti- ⁇ -catenin cell penetration interference antibody
  • inBC2- E4B 1227-1302 binds to E2 (recruiting) and places it close to the target protein to poly-Ub ⁇ -catenin in the target protein
  • inBC2-E3 recruiter binds to E3 (recruiting) to E3.
  • a cell-penetrating decomposition antibody that has the function of poly-Ubizing ⁇ -catenin, which is a target protein, by positioning the bound E2 close to the target protein, eventually inducing the degradation of poly-Ubized ⁇ -catenin, and a composition containing the same and its It's about use.
  • Intracellular protein degradation is accomplished through two pathways: lysosome and proteasome, and about 80% of cellular proteins are labeled by ubiquitin (Ub) and then cytoplasmic by proteasome. It is degraded in the nucleus, and this process is called the ubiquitin-proteasome system (UPS).
  • Ub ubiquitin-proteasome system
  • the ubiquitin-based protein degradation control system not only maintains cell homeostasis by removing damaged or unnecessary proteins, but also participates in cell cycle processes and transcriptional control processes that must be precisely controlled over time.
  • a problem with the UPS can lead to various diseases, including cancer. Conversely, it has been suggested that the removal of disease-causing proteins using the activation of the UPS pathway can be a fundamental treatment.
  • Ubiquitin is a protein composed of 76 amino acids and is present in almost all eukaryotic cells.
  • a series of enzyme systems namely ubiquitin activating enzyme (E1), ubiquitin conjugating enzyme (E2), and ubiquitin ligase enzyme (E3), are involved in the process by which ubiquitin is selectively labeled for protein degradation in the UPS (ubiquitination).
  • E1 ubiquitin activating enzyme
  • E2 ubiquitin conjugating enzyme
  • E3 ubiquitin ligase enzyme
  • UPS is a system composed of three types of enzymes, E1, E2, and E3.
  • E1 activates Ub
  • E2 receives it to form E2-Ub (E2-ubiquitin conjugate)
  • E3 activates E2-Ub and substrate. It binds to the substrate and poly-Ubizes it, and the poly-Ubized substrate is degraded in the proteasome.
  • the binding of Ub to the protein substrate occurs through the formation of an isopeptide bond between the Lys (lysine) residue of the substrate molecule and the Gly (glycine) residue of the C-terminus of Ub, and the C-terminus of Ub bonded to the substrate protein.
  • Another Ub can be linked to the terminal Lys.
  • E1 activates Ub
  • E2 receives it, forming E2-Ub
  • E3 binds to the matrix protein and E2-Ub to position the matrix protein close to E2-Ub, thereby inducing poly-Ub conversion of the matrix protein.
  • E3 is divided into RING (Really Interesting New Gene) E3s, HECT (homologous to the E6AP carboxyl terminus) E3s, and RBR (RING-Between-RING) E3s according to the existence of a characteristic domain structure and the difference in Ub transfer mechanism. .
  • E3 binds to both E2-Ub and matrix proteins, providing specificity for recognizing matrix proteins to be labeled with Ub. That is, the process of poly-Ub conversion of the protein to be degraded is determined by the E3 enzyme, and at this time, all substrate proteins have a specific E3 recognition site and a Ub linking site. Considering about 100,000 proteins in a cell, each E3 has specificity for a substrate, but at the same time, it has redundancy and multiplicity.
  • RING E3 which is used for substrate protein degradation, takes the method of directly transferring Ub from E2-Ub to substrate protein without passing through E3 after arranging E2-Ub and substrate protein (substrate) spatially close together.
  • RING E3 is 1) Monomeric RING (eg, c-CBL), Homodimeric RING (eg, cIAP), Heterodimeric RING (eg, Mdm2-MdmX) in a cullin-independent form (with E3 activity only as a single protein) ), monomeric U-box (eg, E4B), homodimeric U-box (eg, CHIP, Prp19) and 2) cullin-RING E3 ubiquitin ligases (CRLs) that function in a complex with the cullin protein as a scaffold, as shown in Figure 1b It is divided into [Morreale and Walden (2016).
  • the cullin-independent form of RING E3 binds to E2-Ub through either the RING subunit protein or the U-Box subunit protein.
  • the RING-box protein is a subunit protein that binds to E2-Ub (FIGS. 1a and 1b).
  • CRLs are the largest family of E3, and according to the cullin (CUL) type, CRL1 (CUL1), 2 (CUL2), 3 (CUL3), 4A (CUL4A), 4B (CUL4B), 5 (CUL5), 7 ( CUL7) and 9 (CUL9), which are divided into eight types, which are specified in Figure 1c.
  • the CRL complex basically consists of 1) Cullin, which serves as a scaffold, 2) RING domain to which E2-Ub binds, 3) substrate receptor that determines substrate specificity, and 4) adapter that connects cullin and substrate receptor.
  • substrate receptors are composed of a substrate protein-binding domain that binds to a target protein (substrate protein) and an adapter binding domain that binds to an adapter protein. Therefore, the matrix receptor composed of two domains serves to position the matrix protein close to E3.
  • substrate receptors present in humans are divided into families, which include 69 F-boxes, 17 VHL (von Hippel-Lindau), and 180 BTB (Bric-a-brac, Tramtrack, Broad-complex), 90 DCAFs (DDB1-CUL4-associated factors), and 39 SOCS (suppressors of cytokine signaling).
  • a technology that degrades a target protein using the intracellular protein degradation system UPS is called a targeted protein degrader.
  • Small molecule compound-based PROTAC Proteolysis-targeting chimera, PROTAC
  • AUTOTAC Autophagy-targeting chimera
  • protein-based bioPROTAC BioPROTAC
  • PROTAC is a hetero-bifunctional small molecule drug composed of three parts: E3 binding module-connector-target protein binding module. That is, a small molecule that binds to a target protein, a small molecule that binds to E3, and a linker molecule that connects two types of small molecules are synthesized and used as a single compound.
  • AUTOTAC is a small molecule compound composed of three parts: autophagy-targeting ligand (ATL) - linker - target protein binding module (TBL). It binds to the target through TBL, and ATL It binds to p62, an autophagy receptor, and induces degradation by lysosomes.
  • ATL autophagy-targeting ligand
  • TBL target protein binding module
  • ATL autophagy-targeting ligand
  • ATL linker - target protein binding module
  • AUTOTAC also has a fundamental limitation of small molecule compounds like PROTAC, namely, because it is a small molecule drug, it has a hydrophobic binding site (pocket) that can bind to the protein surface.
  • E3 used in PROTAC technology is representative of 5 types of ⁇ -TrCP, MDM2, cIAP/XIAP, VHL, and CRBN, among which ⁇ -TrCP and MDM2 have weak efficacy.
  • BioPROTAC a biological equivalent of PROTAC, is being studied as a protein-based target proteolytic agent.
  • bioPROTAC is a fusion protein constructed with a binder that binds to a target protein and an E3 binding module. That is, the target protein binding module uses an antibody fragment (nanobody, single chain variable fragment (scFv)), etc., and the E3 binding module uses the substrate receptor domain of CRLs.
  • BioPROTAC typically includes ubiqutibodies, antibody RING-mediated destruction (ARMeD), and affinity-directed protein missile (AdPROM) technologies.
  • bioPROTAC has a disadvantage in that it is difficult to apply in vivo for the purpose of treatment because it lacks cytoplasmic penetration by itself and requires the use of artificial expression systems such as DNA and mRNA transfection to deliver into cells.
  • ADC antibody-drug conjugate
  • antibody-PROTAC conjugate technology has been reported.
  • the antibody-PROTAC conjugate technology also has a limitation of PROTAC technology for difficult target proteins because PROTAC development must be premised.
  • CMC chemistry, manufacturing, control
  • ⁇ -catenin one of the representative transcription factors, is present in cells and is a cancer-causing protein that is difficult to target with small molecules due to its flat surface without a deep binding pocket site to which small molecules can bind.
  • ⁇ -catenin interacts with its binding partner, TCF4 (transcription factor 4), with very high affinity and a large area, making it difficult to inhibit its activity with small molecule inhibitors.
  • TCF4 transcription factor 4
  • the most representative strategy for treating these tumor-inducing proteins is to use an antibody having a large surface area capable of binding to an antigen.
  • An antibody is a therapeutic protein capable of binding to an antigen with high specificity and affinity, acting as an activator or inhibitor, and finally treating tumors.
  • Antibody technology for directly targeting a target protein in the cytoplasm outside the cell includes cell/tissue-specific cytosol-penetrating interfering antibody (iMab) technology (KR10-1602870, KR10-1602876, KR10-1732553, KR10- 2000000, KR10-2091195; US10787487B2, US10851177B2, US20200385428A1, US20200339681A1, US20190144566A1).
  • iMab cell/tissue-specific cytosol-penetrating interfering antibody
  • Cell penetrating interference antibodies in the form of complete immunoglobulins, specifically bind to membrane protein receptors on the cell surface that are overexpressed in tumor cells or tissues, are internalized (endocytosis), and then cell by endosomal escape ability It is located in the cytoplasm of the cell and has the function of binding to the target protein of the cytoplasm.
  • a cell-penetrating interference antibody that inhibits the activity of tumor-derived variant Ras by specifically binding to activated Ras (Ras ⁇ GTP) bound to GTP in the cytoplasm has been reported (KR10-2163305; Shin SM et al. 2020, Science Advances, 6(3):eaay2174;Shin SM et al.
  • the present invention is a complete immunoglobulin antibody-based target protein component that specifically penetrates the cytoplasm of living target cells/tissues to specifically recognize, degrade, and remove target proteins inside the cytoplasm.
  • the present invention specifically mimics the mechanism and function of the Ubiquitin-Proteasome System (UPS), an intracellular protein degradation system, to specifically degrade target proteins recognized by antibodies.
  • UPS Ubiquitin-Proteasome System
  • the present invention specifically permeates the cytoplasm of living cells and fuses a protein capable of utilizing the intracellular protein degradation system UPS to a cell penetrating interference antibody that specifically recognizes the target protein, thereby poly-ubiquitinating the target protein.
  • poly-ubiquitination, poly-Ub was induced, and a cell penetrating degradation antibody that degrades and removes it was attempted to be developed.
  • the present invention is fused to the N-terminus or C-terminus of the heavy chain of the antibody, or to the N-terminus or C-terminus of the light chain of the cell-penetrating interference antibody at the location where the U-Box or E3 recruiter is fused. Explore and provide the best location.
  • the present invention provides a U-Box variant or E3 recruiter variant with improved expression, physicochemical properties, and/or biological function when U-Box or E3 recruiter is fused to a cell penetrating interference antibody.
  • the present invention fused the anti- ⁇ -catenin cell-penetrating degradation antibody with an E3 recruiter to degrade ⁇ -catenin present in the cytoplasm of target cells to induce cell growth inhibition and death, and cell-penetrating degradation antibody and its preparation It aims to present methods and uses.
  • an object of the present invention is to provide a method for preparing a cell-penetrating degradation antibody with improved ⁇ -catenin degradation ability and cytotoxicity by optimizing the fusion position and linker of the E3 recruiter in the anti- ⁇ -catenin cell-penetrating degradation antibody.
  • the present invention provides a composition for preventing and/or treating cancer, autoimmune disease or infectious disease comprising the cell-penetrating antibody.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer, autoimmune disease or infectious disease, comprising administering the cell penetrating degradation antibody to a patient.
  • the present invention relates to the use of the cell-penetrating antibody for the preparation of an agent for preventing or treating cancer, autoimmune disease or infectious disease.
  • the present invention provides a polynucleotide encoding the cell penetrating degradation antibody.
  • the present invention provides the light chain CDR1 of SEQ ID NO: 1, the light chain CDR2 of SEQ ID NO: 2, the light chain CDR3 of SEQ ID NO: 3 or 4 and the heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 5, the heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 6 or 7, and the sequence Provided is an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to ⁇ -catenin, including the heavy chain CDR3 of number 8 or 9.
  • the present invention also includes an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to ⁇ -catenin, specifically binds to a membrane protein receptor on the cell surface overexpressed in tumor cells or tissues, and is internalized (endocytosis) to escape endosomes ( Provides a cytosol-penetrating interfering antibody that binds to ⁇ -catenin, which is located in the cytoplasm of cells due to endosomal escape ability.
  • the present invention also provides a cell-penetrating degrading antibody Degrobody in which a U-Box or an E3 recruiter is further fused to a cell-penetrating interfering antibody.
  • the present invention also provides a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention also provides a nucleic acid encoding the cell penetrating interference antibody.
  • the present invention also provides a nucleic acid encoding the cell-penetrating degradation antibody.
  • the present invention also provides an expression vector containing the nucleic acid.
  • the present invention also provides a recombinant cell transformed with the expression vector.
  • the present invention also provides a method for producing an anti- ⁇ -catenin antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the following steps: (a) culturing the cells to produce an antibody or antigen-binding fragment thereof; and (b) recovering the produced antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention also provides a method for producing the cell-penetrating degradation antibody: (1) the heavy chain variable region (VH) and heavy chain constant region (CH1-hinge-CH2-CH3) of a human antibody having ⁇ -catenin targeting ability Preparing an anti- ⁇ -catenin heavy chain expression vector by cloning the included heavy chain and a nucleic acid (Nucleic acids) linked to an antibody and a U-Box or E3 recruiter to the N-terminus or C-terminus of the heavy chain; (2) A light chain containing a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL) of a human antibody having cytoplasmic penetration ability, and a nucleic acid linked to the antibody and U-Box or E3 recruiter to the N-terminus or C-terminus of the light chain.
  • VH heavy chain variable region
  • CH1-hinge-CH2-CH3 heavy chain constant region
  • the present invention also provides a conjugate comprising a bioactive molecule linked to the antibody or antigen-binding fragment thereof, the cell penetrating interference antibody, and the cell penetrating decomposition antibody.
  • the present invention also provides a bispecific or multispecific antibody comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof, the cell-penetrating interference antibody, and the cell-penetrating decomposition antibody.
  • the present invention also provides a composition for preventing or treating tumor or cancer comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof, the cell penetrating interference antibody and the cell penetrating decomposition antibody.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer comprising administering the antibody or antigen-binding fragment thereof, the cell penetrating interference antibody and the cell penetrating decomposition antibody to a patient.
  • the present invention relates to the use of the antibody or antigen-binding fragment thereof, the cell-penetrating interfering antibody, and the cell-penetrating and degrading antibody for preparing a preparation for preventing or treating cancer.
  • Figure 1a is a schematic diagram explaining the monomeric U-box and homodimeric U-box types and structures of E3 and the ubiquitination mechanism.
  • Figure 1b is a schematic diagram explaining the substrate receptor type and structure and ubiquitination mechanism according to the type of CRLs.
  • Figure 2a is a schematic diagram of the development of a cell penetrating interfering antibody (Degrobody) in which a U-Box is fused to a cell penetrating interfering antibody in order to induce poly-Ub conversion to a target protein of the cell penetrating interfering antibody.
  • Degrobody cell penetrating interfering antibody
  • Figure 2b shows that after the cell penetrating degradation antibody (Degrobody), which is a fusion of U-Box to the cell penetrating interference antibody, is internalized through a cancer cell-specifically expressed receptor, it escapes from the endosome to the cytoplasm and POI (target protein) in the cytoplasm -
  • a schematic diagram showing the mechanism of action in which POI is degraded through the 26S proteasome after the formation of the ternary complex of Degrobody-E2-Ub.
  • Figure 2c is a schematic diagram of the development of a cell penetration decomposition antibody (Degrobody) in which an E3 recruiter is fused to a cell penetration interference antibody in order to induce poly-Ub conversion to a target protein of the cell penetration interference antibody.
  • Degrobody cell penetration decomposition antibody
  • Figure 2d is a cell penetrating decomposition antibody (Degrobody) fused with an E3 recruiter to a cell penetrating interference antibody is internalized through a cancer cell-specifically expressed receptor, and then escapes from the endosome to the cytoplasm and POI (target protein)-Degrobody in the cytoplasm -
  • POI target protein
  • Figure 2e is a schematic diagram showing an E3 recruiter search strategy for optimal E3 utilization according to the target protein.
  • 3a is a schematic diagram of an E3 recruiter search strategy according to a target protein.
  • 3B is a schematic structural diagram emphasizing the adapter binding domain (E3 recruiter) portion in the tertiary structure of the substrate receptor.
  • Figure 4 is to evaluate the binding ability of anti- ⁇ -catenin cell penetration interference antibody inBC0 and inBC2 to ⁇ -catenin, 200, 100, 50, 25, 12.5 and 0Nm of ⁇ -catenin using the Octet BLI-based Systems system. The affinity of inBC0 and inBC2 for ⁇ -catenin was compared and analyzed under catenin concentration conditions.
  • Figure 5a is a schematic diagram explaining the construction of an anti- ⁇ -catenin cell-penetrating decomposition antibody (inBC2-E2-Ub recruiter or inBC2-E3 recruiter) in which an E2-Ub recruiter or an E3 recruiter is connected to the C-terminus of the light chain of inBC2 and inBC2. .
  • Figure 5b shows the analysis through 12% SDS-PAGE under reducing or non-reducing conditions after purification of the antibodies of Figure 5a.
  • Figure 5c shows the results of analyzing the antibodies of Figure 5a using size exclusion chromatography.
  • FIG. 5d shows the evaluation of the ⁇ -catenin degradation ability of the inBC2-VHL152-213 linker variant in HCT116, a colorectal cancer cell line in which ⁇ -catenin is overexpressed, by Western blotting.
  • FIG. 5e is a result of in vitro evaluation of the degree of cell growth inhibition of the antibodies of FIG. 5a in the colorectal cancer cell line HCT116.
  • 6a is a schematic diagram of inBC2-VHL 152-213 and control antibodies constructed to identify the specific mechanism of action of inBC2-VHL 152-213 .
  • Figure 6b is a view showing the results of analyzing the antibodies of Figure 6a using size exclusion chromatography.
  • FIG. 6c is a result of confirming the binding ability of the antibodies of FIG. 6a to Cul2 and ⁇ -catenin by immunoprecipitation.
  • FIG. 7a shows the evaluation of ⁇ -catenin degradation ability of inBC2-VHL 152-213 by Western blot as compared to a control antibody in three colon cancer cell lines.
  • Figure 7b is a Western blot evaluation of the ⁇ -catenin degradation ability of inBC2-VHL 152-213 according to its concentration in the colon cancer cell line DLD-1.
  • Figure 7c is a Western blot evaluation of the ⁇ -catenin degradation ability of inBC2-VHL 152-213 over time in the colon cancer cell line DLD-1.
  • FIG. 8a is a view showing the results of Western blotting comparing the proteasome-dependent ⁇ -catenin degradation ability of inBC2-VHL 152-213 using a Cullin activity inhibitor and a proteasome activity inhibitor.
  • 8B is a Western blot analysis result of immunoprecipitation of ⁇ -catenin Ub of inBC2-VHL 152-213 using a proteasome activity inhibitor and then analysis using an anti-K-48 poly-Ub antibody.
  • Figure 8c is a Western blot evaluation of poly-Ubization of ⁇ -catenin using a control antibody in the same manner as in Figure 8b.
  • 10a is an experimental result comparing the tumor growth inhibitory effect of a control antibody and inBC2-VHL 152-213 by intravenous injection at a concentration of 20 mg/kg in mice xenotransplanted with the integrin-overexpressing colorectal cancer cell line SW480.
  • FIG. 10B is a graph showing the weight of tumors obtained after treatment with a tumor tissue integrin-specific control antibody and inBC2-VHL 152-213 .
  • 10c is a photograph showing the size of the excised tumor of FIG. 6b.
  • Figure 10d is a graph of the body weight of mice to confirm non-specific side effects of tumor tissue integrin-specific inBC2-VHL 152-213 .
  • 10E is a Western blot evaluation of the ⁇ -catenin degradation ability of inBC2-VHL 152-213 in the extracted tumors of FIG. 6B.
  • 11a is a view showing the results of analyzing inBC2, inBC2-VHL 152-213 , and inBC2-SOCS2 153-198 using size exclusion chromatography.
  • Figure 11b is a view showing the results of Western blotting in three colorectal cancer cell lines to compare the ⁇ -catenin degradation ability of inBC2-VHL 152-213 and inBC2-SOCS2 153-198 .
  • Figure 11c shows the results of in vitro evaluation of the degree of cell growth inhibition of inBC2-VHL 152-213 and inBC2-SOCS2 153-198 in three colorectal cancer cell lines.
  • Figure 12a lists the primary structures of 12 inBC2-SOCS2s designed to improve the physical properties and expression of inBC2-SOCS2 153-198 in Figure 11a.
  • 15a shows that in order to efficiently screen the ⁇ -catenin degradation ability of inBC2-SOCS2s, a cell line transduced with a ⁇ -catenin-nanoluciferase fusion reporter protein into HEK293T cells belonging to a Wnt-independent cell line was constructed, and inBC2-SOCS2s It shows a schematic diagram of analyzing the luminescence value of ⁇ -catenin-nanoluciferase according to antibody treatment.
  • 15b shows the evaluation of the ⁇ -catenin degradation ability of inBC2-SOCS2s using the HEK293T cell line expressing the ⁇ -catenin-nanolluciferase fusion reporter protein in order to efficiently screen the ⁇ -catenin degradation ability of inBC2-SOCS2s.
  • 15c shows the ⁇ -catenin degradation ability of SW480, a colon cancer cell line treated with inBC2-SOCS2s, in order to evaluate the ⁇ -catenin degradation ability of inBC2-SOCS2s through Western blotting.
  • Figure 16a shows the ⁇ -catenin degradation ability of inBC2-SOCS2 153-198 -7 selected from the inBC2-SOCS2s according to treatment conditions at concentrations of 0.5, 1, 2, and 4 ⁇ M in the colorectal cancer cell line LoVo through Western blot analysis. will be.
  • Figure 16b is to evaluate the proteasome-dependent ⁇ -catenin degradation ability of inBC2-SOCS2 153-198-7 , the ⁇ -catenin degradation ability according to the presence or absence of treatment with 26S proteasome inhibitor bortezomib and MG132 in the colorectal cancer cell line DLD-1 and LoVo were evaluated by Western blot.
  • the present invention develops a cell penetrating decomposition antibody fused with U-box or E3 recruiter to the cell penetrating interfering antibody as shown in FIGS. 2a and c.
  • the U-Box binds to the cytoplasmic E2-Ub (E2-ubiquitin conjugate) (recruiting) so that E2-Ub is located close to the target protein to poly-Ub the target protein, and the E3 recruiter By binding (recruiting), E3 is positioned close to the target protein to induce poly-Ubization of the target protein, ultimately inducing degradation of the target protein labeled with poly-Ub by UPS. 2a and 2c).
  • E2-Ub E2-ubiquitin conjugate
  • the present invention provides a cell penetrating and degrading antibody obtained by fusing an anti- ⁇ -catenin cell penetrating interference antibody with a U-Box or E3 recruiter. More specifically, as shown in FIG. 2b, d, the mechanism of the anti- ⁇ -catenin cell penetration degradation antibody is 1) internalized through the receptor membrane protein on the surface of cancer cells, and then penetrated into the cytosol by the endosome escape function.
  • E2-Ub or E3 in the cytoplasm is located close to ⁇ -catenin by fused U-Box or E3 recruiter, inducing poly-Ub conversion of ⁇ -catenin, 3) poly It was confirmed that the ⁇ -catenin target protein labeled with -Ub was degraded by the proteasome and exhibited anticancer activity, thereby completing the present invention (FIGS. 2c and 2d).
  • the present invention is a variety of E2-Ub recruiters (e.g., E4B, CHIP, etc.) that can position E2-Ub or E3 close to the target protein, which induces optimal degradation according to the cytoplasmic target protein of the cell-penetrating degradation antibody. or to search for E3 recruiters.
  • E2-Ub recruiters e.g., E4B, CHIP, etc.
  • the search for the optimal E3 recruiter according to the target protein suggests that utilization is important (Fig. 2e).
  • the present invention relates to the light chain CDR1 of SEQ ID NO: 1, the light chain CDR2 of SEQ ID NO: 2, the light chain CDR3 of SEQ ID NO: 3 or 4, the heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 5, the heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 6 or 7, and the heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 8 or 9. It relates to an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to ⁇ -catenin, including a.
  • Antibody means an anti- ⁇ -catenin antibody that specifically binds to ⁇ -catenin.
  • the scope of the present invention includes complete antibody forms as well as antigen-binding fragments of the antibody molecules.
  • a complete antibody is a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, each light chain linked to the heavy chain by disulfide bonds.
  • the term “heavy chain” refers to a full-length heavy chain comprising a variable region domain VH comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequence for imparting specificity to an antigen and three constant region domains CH1, CH2 and CH3. and fragments thereof.
  • the term “light chain” refers to a full-length light chain and fragments thereof comprising a variable region domain VL and a constant region domain CL comprising an amino acid sequence having a sufficient variable region sequence to impart specificity to an antigen. I mean everything.
  • the whole antibody includes subtypes of IgA, IgD, IgE, IgM and IgG, and in particular, IgG includes IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4.
  • the heavy chain constant region has gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ), and epsilon ( ⁇ ) types, and subclasses include gamma 1 ( ⁇ 1), gamma 2 ( ⁇ 2), and gamma 3 ( ⁇ 3). ), gamma 4 ( ⁇ 4), alpha 1 ( ⁇ 1) and alpha 2 ( ⁇ 2).
  • the constant region of the light chain has kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ) types.
  • An antigen-binding fragment of an antibody or antibody fragment refers to a fragment having an antigen-binding function, and includes Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, and the like.
  • Fab has a structure having variable regions of light and heavy chains, constant regions of light chains, and a first constant region (CH1) of heavy chains, and has one antigen-binding site.
  • Fab' is different from Fab in that it has a hinge-region containing one or more cysteine residues at the C-terminus of the heavy chain CH1 domain.
  • F(ab')2 is produced when a cysteine residue in the hinge region of Fab' forms a disulfide bond.
  • Double-chain Fv two-chain Fv
  • single-chain Fv single-chain Fv
  • scFv single-chain Fv
  • the regions are covalently linked or directly linked at the C-terminus, so that a dimer-like structure can be achieved, such as in double-chain Fv.
  • antibody fragments can be prepared using proteolytic enzymes (for example, Fab can be obtained by restriction digestion of intact antibodies with papain, and F(ab')2 can be obtained by digestion with pepsin), or by genetic recombination technology. can be made using .
  • proteolytic enzymes for example, Fab can be obtained by restriction digestion of intact antibodies with papain, and F(ab')2 can be obtained by digestion with pepsin
  • genetic recombination technology can be made using .
  • Fv fragment is an antibody fragment that contains the complete antibody recognition and binding site. This region is a dimer of one heavy chain variable domain and one light chain variable domain.
  • the “Fab” fragment comprises the variable and constant domains of the light chain and the variable and first constant domains (CH1) of the heavy chain.
  • F(ab')2 antibody fragments generally include a pair of Fab' fragments covalently linked by cysteines in the hinge region present at the C-terminus of the Fab' fragments.
  • a "single-chain Fv (scFv)" antibody fragment is a construct consisting of a single polypeptide chain comprising the VH and VL domains of an antibody.
  • a polypeptide linker may further be included between the VH and VL domains to allow the scFv to form a desired structure for antigen binding.
  • an antibody of the invention is a monoclonal antibody, a multispecific antibody, a human antibody, a humanized antibody, a modified antibody, a scFv, a Fab fragment, an F(ab')2 fragment, a disulfide-linked Fvs (sdFv) and anti-idiotypic (anti-Id) antibodies, or epitope-binding fragments of the antibodies, and the like, but are not limited thereto.
  • the heavy chain constant region may be selected from any one isotype of gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ), or epsilon ( ⁇ ).
  • the constant region is gamma 1 (IgG1), gamma 2 (IgG2), gamma 3 (IgG3) or gamma 4 (IgG4).
  • Light chain constant regions can be of the kappa or lambda type.
  • the monoclonal antibody refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, ie, the same thing except for possible naturally occurring mutations that may be present in minor amounts in the individual antibodies comprising the population. Monoclonal antibodies are highly specific, directed against a single antigenic site. In contrast to conventional (polyclonal) antibodies, which typically include different antibodies for different determinants (epitopes), each monoclonal antibody is directed against a single determinant on the antigen.
  • monoclonal antibodies useful in the present invention may be made by hybridoma methods, or may be made using recombinant DNA methods in bacterial, eukaryotic animal or plant cells.
  • monoclonal antibodies can be isolated from phage antibody libraries.
  • affinity refers to the ability of an antibody to specifically recognize and bind to a specific site of an antigen, and a high degree of affinity together with specificity of an antibody to an antigen is an important factor in an immune response.
  • the affinity constant (KD) may be determined using surface plasmon resonance (SPR), for example, BIAcore or bio-layer interferometry. Through the surface plasmon resonance data, a 1:1 Langmuir binding model (k on , k off simultaneously) and the affinity constant (KD) calculated from the ratio of the rate constant k off /k on are obtained.
  • the binding affinity of the anti- ⁇ -catenin antibody to ⁇ -catenin is in the range of 10 ⁇ 5 M to 10 ⁇ 12 M.
  • the binding affinity is 10 -6 M to 10 -12 M, 10 -7 M to 10 -12 M, 10 -8 M to 10 -12 M, 10 -9 M to 10 -12 M, 10 -5 M to 10 -11 M, 10 -6 M to 10 -11 M, 10 -7 M to 10 -11 M, 10 -8 M to 10 -11 M, 10 -9 M to 10 -11 M, 10 -10 M to 10 -11 M, 10 -5 M to 10 -10 M, 10 -6 M to 10 -10 M, 10 -7 M to 10 -10 M, 10 -8 M to 10 -10 M, 10 -9 M to 10 -10 M, 10 -5 M to 10 -9 M, 10 -6 M to 10 -9 M, 10 -7 M to 10 -9 M, 10 -8 M to 10 -9 M, 10 -5 M to 10 -8 M, 10 -6 M to 10 -8 M, 10
  • variable region of an antibody refers to the light and heavy chain portions of an antibody molecule that include the amino acid sequences of the complementarity determining regions (CDRs; ie CDR1, CDR2, and CDR3) and framework regions (FR).
  • CDRs complementarity determining regions
  • FR framework regions
  • VH refers to the variable domain of the heavy chain.
  • VL refers to the variable domain of the light chain.
  • CDR complementarity determining region
  • a “Framework Region (FR)” is a variable domain residue other than a CDR residue.
  • Each variable domain typically has four FRs, FR1, FR2, FR3 and FR4.
  • It may include a heavy chain variable region selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 17 to 19 and/or a light chain variable region of SEQ ID NO: 20 or 21.
  • it may include:
  • Antibodies or antigen-binding fragments thereof in which a portion of an amino acid sequence is substituted through conservative substitutions are also included.
  • “conservative substitution” refers to a modification of a polypeptide that involves substituting one or more amino acids with amino acids having similar biochemical properties that do not result in loss of biological or biochemical function of the polypeptide.
  • a “conservative amino acid substitution” is a substitution in which an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain.
  • Classes of amino acid residues with similar side chains have been defined in the art and are well known. These classes include amino acids with basic side chains (e.g. lysine, arginine, histidine), amino acids with acidic side chains (e.g. aspartic acid, glutamic acid), and amino acids with uncharged polar side chains (e.g. glycine).
  • antibodies of the present invention may have conservative amino acid substitutions and still retain activity.
  • the antibody or antigen-binding fragment of the present invention may include not only the sequences of the antibodies described herein, but also biological equivalents thereof within the range of maintaining the desired function.
  • additional changes may be made to the amino acid sequence of the antibody to further improve its binding affinity and/or other biological properties.
  • Such modifications include, for example, deletions, insertions and/or substitutions of residues in the amino acid sequence of the antibody. That is, as described above, it is made based on the relative similarity of amino acid side chain substituents, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, and the like.
  • arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar shapes. Accordingly, based on these considerations, arginine, lysine and histidine; alanine, glycine and serine; And phenylalanine, tryptophan and tyrosine are biologically functional equivalents.
  • the antibodies of the present invention or the nucleic acid molecules encoding them are construed to include sequences showing substantial identity with the sequences described in SEQ ID NOs.
  • the above substantial identity is at least 90% when the sequence of the present invention and any other sequence described above are aligned so as to correspond as much as possible, and the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art. It refers to sequences exhibiting homology, most preferably at least 95% homology, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more homology. Alignment methods for sequence comparison are known in the art.
  • BLAST The NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) is accessible from NBCI, etc., and can be used in conjunction with sequence analysis programs such as blastp, blasm, blastx, tblastn, and tblastx on the Internet.
  • BLAST is accessible at www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.
  • a sequence homology comparison method using this program can be found at www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html.
  • an antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% as compared to the specified sequence described herein or entirely. , 99%, or greater homology.
  • homology can be determined by sequence comparison and/or alignment by methods known in the art. For example, a sequence comparison algorithm (ie, BLAST or BLAST 2.0), manual alignment, or visual inspection can be used to determine the percent sequence homology of a nucleic acid or protein of the invention.
  • Nucleic acid has the meaning of comprehensively including DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules, and nucleotides, which are basic structural units in nucleic acids, include not only natural nucleotides, but also analogs in which sugar or base sites are modified. .
  • the sequences of nucleic acids encoding the heavy and light chain variable regions of the present invention may be modified. Such modifications include additions, deletions, or non-conservative or conservative substitutions of nucleotides.
  • DNA encoding the antibody can be easily isolated or synthesized using conventional molecular biological techniques (eg, by using oligonucleotide probes capable of specifically binding to DNA encoding the antibody and heavy and light chains).
  • the nucleic acid is isolated and inserted into a replicable vector for further cloning (amplification of DNA) or further expression. Based on this, the present invention relates to a recombinant expression vector comprising the nucleic acid in another aspect.
  • the term "vector” refers to a means for expressing a gene of interest in a host cell, and includes a viral vector such as a plasmid vector, a cosmid vector, a bacteriophage vector, an adenovirus vector, a retrovirus vector, and an adeno-associated virus vector. Include etc.
  • Components of a vector generally include, but are not limited to, one or more of the following: a signal sequence, an origin of replication, one or more antibiotic resistance marker genes, an enhancer element, a promoter, and a transcription termination sequence. Nucleic acids encoding antibodies are operably linked, such as promoters and transcription termination sequences.
  • operably linked means a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence (e.g., a promoter, signal sequence, or array of transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence, whereby the control sequence is the other nucleic acid sequence. to regulate transcription and/or translation of a nucleic acid expression control sequence (e.g., a promoter, signal sequence, or array of transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence, whereby the control sequence is the other nucleic acid sequence. to regulate transcription and/or translation of a nucleic acid expression control sequence (e.g., a promoter, signal sequence, or array of transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence, whereby the control sequence is the other nucleic acid sequence. to regulate transcription and/or translation of a nucleic acid expression control sequence (e.g., a promoter, signal sequence, or array of transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence, whereby the control sequence is the other nucleic acid sequence. to regulate transcription and
  • a strong promoter capable of promoting transcription e.g., tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL ⁇ promoter, pR ⁇ promoter, rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.
  • a ribosome binding site for initiation of translation e.g., amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.
  • a promoter derived from the genome of a mammalian cell e.g., metallotionine promoter, ⁇ -actin promoter, human hemoglobin promoter, and human muscle creatine promoter
  • mammalian Promoters derived from viruses e.g., adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, tk promoter of HSV, mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter, LTR promoter of HIV, Moloney virus promoter, Epstein Barr virus (EBV) promoter and Rouss sarcoma virus (RSV) promoter
  • viruses e.g., adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, tk promoter of HSV, mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter, LTR promoter of HIV, Moloney virus promote
  • vectors may be fused with other sequences to facilitate purification of antibodies expressed therefrom.
  • Sequences to be fused include, for example, glutathione S-transferase (Pharmacia, USA), maltose binding protein (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) and 6x His (hexahistidine; Qiagen, USA).
  • the vector contains an antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selectable marker, for example, for ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin and tetracycline. There is a resistance gene.
  • the present invention relates to a host cell transfected with the recombinant expression vector.
  • Host cells used to generate the antibodies of the present invention may be prokaryotic, yeast or higher eukaryotic cells, but are not limited thereto.
  • Strains of the genus Bacillus such as Escherichia coli, Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis, Streptomyces, Pseudomonas (e.g., Pseudomonas putida ( Prokaryotic host cells such as Pseudomonas putida), Proteus mirabilis and Staphylococcus (eg, Staphylocus carnosus) may be used.
  • Pseudomonas e.g., Pseudomonas putida
  • Proteus mirabilis Proteus mirabilis
  • Staphylococcus eg, Staphylocus carnosus
  • animal cells are of greatest interest, and examples of useful host cell lines are COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0 , U20S, or HT1080, but is not limited thereto.
  • culturing the host cells to produce antibodies relates to a method for preparing an antibody or an antigen-binding fragment thereof, comprising separating and purifying the produced antibody.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof may be recovered by, for example, centrifugation or ultrafiltration to remove impurities, and the resultant may be purified using, for example, affinity chromatography. Additional other purification techniques may be used, such as anion or cation exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, hydroxylapatite chromatography, and the like.
  • the present invention relates to a conjugate in which the antibody or antigen-binding fragment thereof and a bioactive molecule selected from the group consisting of peptides, proteins, small molecule drugs, nucleic acids, nanoparticles, and liposomes are fused.
  • the proteins include antibodies, antibody fragments, immunoglobulins, peptides, enzymes, growth factors, cytokines, transcription factors, toxins, antigenic peptides, hormones, transport proteins, motor function proteins, receptors, and signals. (signaling) protein, storage protein, membrane protein, transmembrane protein, internal protein, external protein, secreted protein, viral protein, glycoprotein, truncated protein, protein complex, or chemically modified proteins, etc.
  • the small molecule drug is used broadly herein to refer to an organic, inorganic or organometallic compound having a molecular weight of less than about 1000 daltons and having activity as a therapeutic agent for a disease.
  • Small molecule drugs herein include oligopeptides and other biomolecules with a molecular weight of less than about 1000 Daltons.
  • the nanoparticle means a particle made of materials having a diameter of 1 to 1000 nm, and the nanoparticle is a metal / metal core-shell composite composed of a metal nanoparticle, a metal nanoparticle core, and a metal shell surrounding the core, It may be a metal/non-metal core-shell composed of a metal nanoparticle core and a non-metal shell surrounding the core, or a non-metal/metal core-shell composite composed of a non-metal nanoparticle core and a metal shell surrounding the core.
  • the metal may be selected from gold, silver, copper, aluminum, nickel, palladium, platinum, magnetic iron, and oxides thereof, but is not limited thereto, and the non-metal is silica, polystyrene, latex, and acrylic. It may be selected from late-based materials, but is not limited thereto.
  • the liposomes consist of one or more lipid bilayer membranes surrounding an aqueous inner compartment, capable of self-association.
  • Liposomes can be characterized by membrane type and size.
  • Small unilamellar vesicles SUVs
  • Large unilamellar vesicles LUVs
  • Oligolamellar vesicles and multilamellar vesicles have multiple, usually concentric, membrane layers and can be greater than 100 nm in diameter. Liposomes with multiple non-concentric membranes, ie several small vesicles contained within a larger vesicle, are called multivesicular vesicles.
  • fusion refers to integrating two molecules having different or identical functions or structures, and by any physical, chemical or biological method capable of binding the tumor penetrating peptide to the protein, small molecule drug, nanoparticle or liposome.
  • the fusion may preferably be performed by a linker peptide, and the linker peptide may relay the fusion with the bioactive molecule at various positions of the antibody light chain variable region, antibody, or fragment thereof of the present invention.
  • effector function refers to the type of biological activity associated with the Fc region of an antibody (wild-type sequence of the Fc region or a variant of the amino acid sequence of the Fc region) and depends on the isotype of the antibody.
  • antibody effector functions include C1q binding, complement dependent cytotoxicity (CDC); Fc receptor binding, antibody dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC), phagocytosis, downregulation of cell surface receptors (eg B-cell receptor, BCR) and B-cell activation.
  • ADCC antibody-dependent cell cytotoxicity
  • effector cells eg T-cells, NK-cells
  • NK-cells effector cells
  • ADCC is also independent of the immune complement system, which lyses the target but does not require other cells.
  • ADCC typically requires effector cells known to be natural killer (NK) cells that interact with immunoglobulin G (IgG) antibodies.
  • NK natural killer
  • IgG immunoglobulin G
  • macrophages, neutrophils and eosinophils can also mediate ADCC, such as eosinophils that kill certain parasitic worms known as parasites via IgE antibodies.
  • Bioactive molecules that can be conjugated to antibodies according to the present invention may include small molecule drugs.
  • the present invention provides a bispecific antibody or multispecific antibody comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • bispecific antibody refers to a protein capable of binding to two different types of antigens (target proteins). Specifically, it does not exist naturally, and is preferably in the form of genetic engineering or prepared by any method.
  • the "bispecific antibody” of the present invention may be used interchangeably with “dual target antibody”, “dual antibody” or “dual antibody protein”.
  • the bispecific antibody refers to a molecule capable of forming a heterodimer by linking antigen-binding sites directly or through a linker or by electrostatic interaction.
  • Value refers to the presence of a specified number of binding sites specific to an antigen in a molecule.
  • the terms “monovalent”, “bivalent”, “tetravalent”, and “hexavalent” refer to the presence of 1, 2, 4, and 6 binding sites, respectively, specific for an antigen in a molecule. do.
  • a multispecific antibody refers to an antibody that has binding specificities for at least three different antigens.
  • a multi-specific antibody is a tri-specific or higher antibody, for example, a tri-specific antibody, a tetra-specific antibody, or one that targets a higher target. may contain antibodies.
  • E3 E3 ubiquitin ligase
  • E2-Ub E2-ubiquitin conjugate
  • E3 recruiter E3 recruiting ligand
  • UPS Ubiquitin-Proteasome System
  • the "cell/tissue-specific cytosol-penetrating interfering antibody (iMab)” is in the form of an immunoglobulin, preferably a complete immunoglobulin, on the surface of a target cell such as a tumor tissue. It refers to an antibody that binds to a membrane protein receptor overexpressed and is internalized (endocytosis), located in the cytoplasm by endosomal escape ability, and specifically binds to a target protein in the cytoplasm.
  • the “Ubiquitin-Proteasome System (UPS)” is a system that degrades and removes cellular proteins by converting them to poly-ubiquitination (poly-Ub), which is E1 ( It is composed of ubiquitin-activating enzyme), E2 (ubiquitin-conjugating enzyme), and E3 (ubiquitin ligase enzyme). After E1 activates ubiquitin and forms an E2-ubiquitin complex (E2-Ub), E3 combines with E2-Ub and the substrate to poly-Ub the substrate, thereby degrading the poly-Ubized substrate through the proteasome. have a mechanism of action.
  • poly-Ub poly-ubiquitination
  • E1 It is composed of ubiquitin-activating enzyme
  • E2 ubiquitin-conjugating enzyme
  • E3 ubiquitin ligase enzyme
  • Target proteins that are difficult to target with small molecules
  • ⁇ -catenin one of the representative disease-causing proteins, is a protein encoded by the CTNNB1 gene and functions as a transcription factor in the Wnt signaling pathway.
  • Wnt protein the first substance of Wnt signal transduction, initiates signal transduction by binding to a receptor called Frizzled on the cell surface.
  • GSK-3 Glycogen Synthase Kinase-3
  • Axin and APC Adenomatous polyposis coli
  • ⁇ -TrCP E3 belonging to phosphorylated ⁇ -catenin Cullin-RING E3 ubiquitin ligases (CRLs) and cleaved in the proteasome via UPS, resulting in low levels of ⁇ -catenin in the cytoplasm.
  • CTLs Cullin-RING E3 ubiquitin ligases
  • TCF4 Transcription factor 4
  • Wnt target genes such as cyclin D1, myc, and matrix metalloproteinase-7 (MMP-7).
  • Increased transcriptional activity of ⁇ -catenin due to abnormal activation of Wnt signaling is associated with cancer.
  • the cause is 1 Axin involved in ⁇ -catenin degradation, when mutations occur in genes encoding Axin and/or APC proteins in the APC protein complex, phosphorylation of ⁇ -catenin by GSK-3 does not occur, resulting in ⁇ -TrCP , leading to accumulation of ⁇ -catenin in the cytoplasm. 2 Mutations in the gene encoding ⁇ -catenin occur, similarly, phosphorylation by GSK-3 does not occur, leading to accumulation of ⁇ -catenin in the cytoplasm, and as a result, transcription of Wnt target genes and Wnt signaling are continuously promoted. .
  • the present invention includes an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to ⁇ -catenin, and a substance targeting a tumor cell or tissue-specific antigen, and specifically binds to the antigen to internalize (endocytosis) It includes a cytosol-penetrating interfering antibody that binds to ⁇ -catenin, which is located in the cytoplasm of cells due to its endosomal escape ability after being treated.
  • Anti- ⁇ -catenin cell penetration interference antibody specifically binds to membrane protein receptors on the cell surface overexpressed in tumor cells or tissues and is internalized (endocytosis), then located in the cytoplasm of cells by endosomal escape ability , It is an antibody that binds to ⁇ -catenin, a cytoplasmic target protein, and inhibits its function.
  • the anti- ⁇ -catenin cell-penetrating interference antibody is a tumor cell or tissue-specific antigen, for example, any one selected from epithelial cellular adhesion molecule (EpCAM) and epidermal growth factor receptor (EGFR) integrin ⁇ v ⁇ 3/ ⁇ v ⁇ 5 overexpressed in tumor cells. It may be a specific recognition of an abnormality.
  • EpCAM epithelial cellular adhesion molecule
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • the tumor cell line may overexpress at least one selected from EpCAM, EGFR, and integrin ⁇ v ⁇ 3/ ⁇ v ⁇ 5.
  • the substance targeting the tumor cell or tissue-specific antigen may be, for example, a ligand, an oligopeptide, an antibody, or a fragment thereof or an app capable of specifically binding to the antigen. It may be an aptamer or the like, but is not limited thereto.
  • the "cell penetrating interference antibody” includes the antibody light chain variable region (VL-CDR3) described in the prior patent (Korean Patent Registration No. 10-2000000) corresponding to SEQ ID NO: 3 shown in Table 1, and VL -CDR3 contains an endosome escape structure motif.
  • VL-CDR3 causes a change in the characteristics of the antibody under acidic pH conditions in endosomes, and thus the antibody exhibits the ability to escape from endosomes to the cytoplasm.
  • anti- ⁇ -catenin cell penetration interference antibody includes an antibody heavy chain variable region (VH-CDR3) corresponding to SEQ ID NO: 8, and includes a sequence recognizing ⁇ -catenin as an antigen in VH-CDR3 are doing
  • the cell penetrating interference antibody according to the present invention is characterized in that a cyclic peptide targeting a receptor overexpressed in tumor tissue is fused for tumor tissue-specific cytoplasmic penetration, and the prototype fused to the cell penetrating interference antibody
  • the peptide may be the circular peptide in4 (DGVRQCRGDCFDGPL) targeting Integrin ⁇ v ⁇ 3/ ⁇ v ⁇ 5 (Shin, et al., (2020), Sci Adv, 6, eaay2174).
  • the circular peptide may be directly bonded to the N or C-terminus of the antibody or bonded through a linker.
  • the linker may be a peptide having various sequences and lengths, and GGGGS, (GGGGS) 2 , ASTKGP, or ASTKGPSVFPLAP sequence linkers that impart structural flexibility without being cleaved by proteolytic enzymes may be used.
  • the cell-penetrating interference antibody may specifically have an antigen-binding site shown in Table 1 below.
  • U-Box is a U-Box in monomeric U-box or homodimeric U-Box among RING E3s, and has a function of binding to E2-Ub.
  • the monomeric U-box has E4B (E4 poly-ubiquitin chain elongation factorB), and the homodimeric U-box has U- There is a Box.
  • U-Box can bind to E2-Ub and label poly-Ub on the matrix protein bound to monomeric U-box or E3 of homodimeric U-Box.
  • E4B belonging to the monomeric U-box, it binds to E2-Ub through the catalytic domain called the U-box domain located at the C-terminus, and mediates the poly-Ub conversion of the target protein by linkage/multiple labeling. play a role
  • E2-Ub and E3 recruiters are shown in Table 2 below, and the partially fragmented amino acid sequence of the U-box domain capable of binding to E2-Ub in the E4B is SEQ ID No. 15 in Table 2 below.
  • E3 recruiter refers to the adapter-binding domain in the substrate receptor of RING E3s, particularly CRLs. That is, the substrate receptor consists of two domains, a substrate protein-binding domain and an adapter-binding domain, and serves to bind the substrate protein to E3 and position it closely. In CRLs, another protein subunit, RING-Box protein, binds to E2-Ub to poly-Ub the matrix protein bound to CRLs.
  • the adapter binding domain excluding the matrix protein binding domain among matrix receptors is defined as “E3 recruiter”.
  • the role of the substrate recognition domain can be replaced by a cell penetrating interference antibody in the form of a complete immunoglobulin capable of binding to a target protein. Therefore, when a cell-penetrating interference antibody having antigen-targeting ability and E3 recruiter are fused and delivered to the cytoplasm, various desired proteins present in the cytoplasm are labeled with poly-Ub and then degraded by the proteasome to induce cytotoxicity.
  • substrate receptors according to each CRL include 69 F-boxes, 17 VHLs, 180 BTBs, 90 DCAFs, 39 SOCSs, etc.
  • adapter binding domain as an E3 recruiter, it was fused to the Degrobody through structural analysis and rational design to search for the optimal E3 recruiter for each target protein and construct the Degrobody.
  • Figure 3b shows an adapter binding domain (E3 recruiter) part in the tertiary structure of the substrate receptor.
  • the present inventors attempted to complete a cell penetrating degradation antibody by binding the fragmented E3 recruiter selected in FIG. 3a to a cell penetrating interference antibody, which is ⁇ TrCP 142-255 and VHL 152-213 corresponding to E3 recruiters belonging to CRL1 to 5, respectively. , SPOP 167-374 , DDB2 61-114 , and SOCS2 153-198 .
  • a cell penetrating interference antibody which is ⁇ TrCP 142-255 and VHL 152-213 corresponding to E3 recruiters belonging to CRL1 to 5, respectively.
  • SPOP 167-374 a cell penetrating interference antibody
  • DDB2 61-114 corresponding to E3 recruiters belonging to CRL1 to 5, respectively.
  • SOCS2 153-198 SOCS2 153-198 .
  • the E3 recruiter may be one or more selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 12 to 16 and 23 to 34 as a SOCS2 153-198 mutant with improved expression level
  • the U-Box or E3 recruiter uses a non-cleavable linker at the N-terminus or C-terminus of the heavy chain and the N-terminus or C-terminus of the light chain of the cell penetrating interference antibody. It is characterized by fusion.
  • the "fusion" according to the present invention is to integrate two molecules having different or identical functions or structures, and any physical, chemical or It may be fusion by a biological method.
  • the fusion may preferably be performed by a linker peptide, and the linker peptide may relay the fusion with the bioactive molecule at various positions of each domain, antibody, or fragment thereof of the antibody of the present invention.
  • the linker peptide means that it is used to genetically fuse the cell penetrating interference antibody and the U-Box or E3 recruiter.
  • the linker peptide may have various sequences and lengths, and may have structurally different flexibility and rigidity, or may have random loop or helical secondary structural characteristics [ Chen, et al., (2013), Adv Drug Deliv Rev, 65, 1357-1369].
  • the linker peptide may use GGGGS, (GGGGS) 2 , ASTKGP, or ASTKGPSVFPLAP sequence linkers that impart structural flexibility without being cut by proteolytic enzymes.
  • the "cell penetrating degrading antibody” is in the form of an immunoglobulin, preferably a complete immunoglobulin, and binds to a membrane protein receptor overexpressed on the surface of a target cell such as a tumor tissue to be internalized (endocytosis) and then endosome It is located in the cytoplasm due to its endosomal escape ability, binds specifically to the target protein in the cytoplasm, and E2-Ub or E3 is located close to the target protein to which the antibody is bound by the fused U-Box or E3 recruiter, thereby increasing the efficiency of the target protein. Poly-Ub is induced, and the target protein labeled with poly-Ub is degraded and removed by the proteasome.
  • the present invention provides a polynucleotide of the cell penetrating decomposition antibody in a form in which the cell penetrating interference antibody and the U-Box or E3 recruiter are connected.
  • polynucleotide is a polymer of deoxyribonucleotides and ribonucleotides that exist in single-stranded or double-stranded form. It encompasses RNA genomic sequences, DNA (gDNA and cDNA) and RNA sequences transcribed therefrom, and includes analogs of natural polynucleotides unless otherwise specified.
  • the polynucleotide includes not only the nucleotide sequence encoding the above-described cell penetrating interference antibody and the U-Box or E3 recruiter-linked cell penetrating decomposition antibody, but also a sequence complementary to the sequence.
  • the complementary sequences include sequences that are substantially complementary as well as sequences that are perfectly complementary. This refers to a sequence capable of hybridizing with a nucleotide sequence encoding any one of SEQ ID NOs: 6 to 25 under stringent conditions known in the art.
  • polynucleotide may be modified. Such modifications include additions, deletions or non-conservative or conservative substitutions of nucleotides.
  • a polynucleotide encoding the amino acid sequence is also construed to include a nucleotide sequence exhibiting substantial identity to the nucleotide sequence. The substantial identity is at least 80% when the nucleotide sequence and any other sequence are aligned to the maximum correspondence and the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art. Sequences exhibiting homology, more preferably 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% homology, most preferably 96%, 97%, 98%, 99% homology. it means.
  • the anti- ⁇ -catenin cell-penetrating interference antibody specifically binds to a membrane protein receptor on the cell surface overexpressed in tumor cells or tissues, is internalized (endocytosis), and then escapes from endosomes (endosomal escape) ), it is an antibody that is located in the cytoplasm of cells and inhibits its function by binding to ⁇ -catenin, a cytoplasmic target protein.
  • Anti- ⁇ -catenin cell penetration and degradation antibody (cell penetration interference antibody + U-box or E3 recruiter) constructed by fusing U-Box or E3 recruiter to the anti- ⁇ -catenin cell penetration interference antibody By positioning E2-Ub or E3 close to ⁇ -catenin, poly-Ub is induced to induce degradation by the proteasome.
  • an example of a method for producing a cell-penetrating decomposition antibody in which a complete immunoglobulin type antibody penetrates into cells and is distributed in the cytoplasm and an E2-Ub recruiter or an E3 recruiter is linked is as follows .
  • a heavy chain containing a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH1-hinge-CH2-CH3) of a human antibody having ⁇ -catenin targeting ability and an antibody and an N-terminus or C-terminus of the heavy chain Preparing an anti- ⁇ -catenin heavy chain expression vector cloned with U-Box or E3 recruiter-linked nucleic acids;
  • VL light chain variable region
  • CL light chain constant region
  • the vector may be either a vector system in which the light chain and the heavy chain are simultaneously expressed in one vector or a system in which the light chain and the heavy chain are expressed in separate vectors. In the latter case, both vectors can be introduced into a host cell through co-transformation and targeted transformation.
  • the light chain variable region (VL), light chain constant region (CL), heavy chain variable region (VH), heavy chain constant region (CH1-hinge-CH2-CH3), and human RNA degrading enzyme provided in the present invention are can be operably linked to a promoter.
  • the term "operatively linked” refers to a functional linkage between a nucleotide expression control sequence (eg, a promoter sequence) and another nucleotide sequence. Accordingly, the regulatory sequence may thereby regulate the transcription and/or translation of the other nucleotide sequence.
  • the recombinant vector can typically be constructed as a vector for cloning or a vector for expression.
  • the expression vector conventional ones used in the art to express foreign proteins in plants, animals, or microorganisms may be used.
  • the recombinant vector may be constructed through various methods known in the art.
  • the recombinant vector may be constructed using a prokaryotic or eukaryotic cell as a host.
  • a prokaryotic cell when the vector used is an expression vector and a prokaryotic cell is used as a host, a strong promoter capable of promoting transcription (eg, pL ⁇ promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, T7 promoter, etc.) , a ribosome binding site for initiation of translation and a transcription/translation termination sequence.
  • a strong promoter capable of promoting transcription eg, pL ⁇ promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, T7 promoter, etc.
  • the origin of replication operating in the eukaryotic cell included in the vector is the f1 origin of replication, the SV40 origin of replication, the pMB1 origin of replication, the adeno origin of replication, the AAV origin of replication, the CMV origin of replication, and the BBV origin of replication. Including, but not limited to.
  • promoters derived from the genome of mammalian cells eg, metallotionine promoter
  • promoters derived from mammalian viruses eg, adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, The cytomegalovirus (CMV) promoter and the tk promoter of HSV
  • CMV cytomegalovirus
  • tk promoter of HSV can be used, and usually have a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.
  • Another aspect of the present invention may provide a host cell transformed with the recombinant vector.
  • Any host cell known in the art may be used as the host cell, and prokaryotic cells include, for example, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, strains of the genus Bacillus, such as E. coli X 1776, E.
  • yeast Sacharomyce cerevisiae
  • insect cells such as SP2/0, CHO (Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138 , BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN and MDCK cell lines and the like can be used.
  • Insertion of the recombinant vector into the host cell may use an insertion method widely known in the art.
  • a delivery method for example, when the host cell is a prokaryotic cell, a CaCl2 method or an electroporation method may be used, and when the host cell is a eukaryotic cell, a microinjection method, a calcium phosphate precipitation method, an electroporation method, or a liposome method. -mediated transfection and gene bombardment may be used, but are not limited thereto.
  • productivity is higher than that of animal cells. Production using microorganisms is not suitable for production of intact immunoglobulin-type antibodies due to glycosylation problems, but can be used for production of antigen-binding fragments such as Fab and Fv.
  • the method for selecting the transformed host cell can be easily performed according to a method widely known in the art using a phenotype expressed by a selection marker.
  • the selection marker is a specific antibiotic resistance gene
  • the transformant can be easily selected by culturing the transformant in a medium containing the antibiotic.
  • fusion refers to the integration of two molecules having different or identical functions or structures, and any physical, chemical or biological means that the tumor penetrating peptide can bind to the protein, small molecule drug, nucleic acid, nanoparticle or liposome. It may be fusion by the method. The fusion may preferably be performed by a linker peptide, and the linker peptide may relay the fusion with the bioactive molecule at various positions of each domain, antibody, or fragment thereof of the antibody of the present invention.
  • the present invention is a cell penetrating degradation antibody fused to the U-box or E3 recruiter, or a bioactive molecule selected from the group consisting of peptide proteins, small molecule drugs, nucleic acids, nanoparticles, and liposomes fused thereto. Prevention of cancer Or it provides a pharmaceutical composition for treatment.
  • One aspect of the present invention provides a method for inhibiting the growth of cancer or tumor cells and a method for treating cancer or tumors using the U-box or E3 recruiter-fused cell penetrating decomposition antibody.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or tumor may be administered orally or parenterally.
  • parenteral administration intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, intradermal administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, intrarectal administration, etc. may be administered.
  • oral compositions must be formulated to coat the active agent or protect it from degradation in the stomach.
  • the composition may be administered by any device capable of transporting an active substance to a target cell.
  • the composition may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the composition are those commonly used in formulation, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, fine crystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like, but are not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like, in addition to the above components.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or tumor may be administered orally or parenterally.
  • parenteral administration intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, intradermal administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, intrarectal administration, etc. may be administered.
  • oral compositions must be formulated to coat the active agent or protect it from degradation in the stomach.
  • the composition may be administered by any device capable of transporting an active substance to a target cell.
  • a suitable dose of the pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or tumor is determined by factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, morbid condition, food, administration time, route of administration, excretion rate and reaction sensitivity. can be prescribed in a variety of ways.
  • a preferred dosage of the composition is in the range of 0.001-100 mg/kg per adult.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to prevent or treat cancer or tumor.
  • Example 1 Design of cell penetrating interference antibody that specifically binds intracellular ⁇ -catenin
  • anti- ⁇ -catenin iMab in order to develop an anti- ⁇ -catenin cell-penetrating interference antibody (anti- ⁇ -catenin iMab), the human antibody heavy chain variable region (VH) that specifically recognizes human ⁇ -catenin was first developed by Y Biologics (Y biologics). Company, located in Daejeon, Republic of Korea) for development. Y Biogics selected ⁇ -catenin as an antigen from the human VH library presented on the surface of phage through bio-panning to select anti- ⁇ -catenin VH.
  • Y Biologics Y biologics
  • this anti- ⁇ -catenin VH was substituted with anti-RAS VH of cell penetrating interference antibody (inRas37) targeting the activated form of RAS (Shin, et al., (2020), Sci Adv, 6, eaay2174) to construct inBC0.
  • inRas37 cell penetrating interference antibody
  • the return displacement of inBC0 to have the same sequence as the conserved region of framework (FR)4 of human immunoglobulin antibody ( The doubling yield (43.2 ⁇ 5.6 mg/L of transfected cells) was increased by preparing inBC2 antibody that induced back-mutaion.
  • the anti- ⁇ -catenin cell penetrating interfering antibodies are the following Table 2 (sequences of heavy chain variable region of cell penetrating interfering antibodies and cell penetrating antibodies) and Table 3 (light chain variable region of cell penetrating interfering antibodies and cell penetrating antibodies) Region sequence), the protein was expressed and purified by transient transfection of the heavy chain and light chain expression vectors disclosed in the above.
  • inBC0 was expressed using a heavy chain expression plasmid having a heavy chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 17 in Table 3 and a light chain expression plasmid corresponding to SEQ ID NO: 20 in Table 4 above.
  • expression was performed using a heavy chain expression plasmid having a heavy chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 18 in Table 3 and a light chain expression plasmid corresponding to SEQ ID NO: 20 in Table 4 above.
  • HEK293-F cells Invitrogen, HEK293-F cells (Invitrogen) growing suspended in serum-free FreeStyle 293 expression medium (Invitrogen) were transfected with a mixture of the above plasmid and polyethylenimine (PEI) (Polyscience). Upon transfection in 200 ml shake flask (Corning), HEK293-F cells were seeded in 100 ml medium at a density of 2.0 ⁇ 10 6 cells/ml, and cultured at 150 rpm, 8% CO 2 , and 37 degrees.
  • PKI polyethylenimine
  • the appropriate heavy and light chain plasmids were diluted in 10ml FreeStyle 293 expression medium to a total of 250 ⁇ g (2.5 ⁇ g/ml) of 125 ⁇ g heavy chain and 125 ⁇ g light chain, and filtered to dilute 750 ⁇ g (7.5 ⁇ g/ml) of PEI. It was mixed with 10 ml of medium and reacted at room temperature for 10 minutes. Thereafter, the reacted mixed medium was put into the previously seeded cells in 100 ml and cultured at 150 rpm, 8% CO 2 , 37 degrees for 4 hours, and then the remaining 100 ml of FreeStyle 293 expression medium was added and cultured for 6 days.
  • Proteins were purified from cell culture supernatants collected by referring to standard protocols.
  • the antibody was applied to a Protein A Sepharose column (GE healthcare) and washed with PBS (pH 7.4). After eluting the antibody at pH 3.0 with 0.1 M glycine buffer, the sample was immediately neutralized with 1 M Tris buffer. The eluted antibody fraction was concentrated by exchanging the buffer with Histidine (pH6.5) through dialysis.
  • the purified protein was quantified using absorbance and extinction coefficient at a wavelength of 280 nm.
  • Figure 4 analyzes the binding ability of inBC0 and inBC2 to anti- ⁇ -catenin. Specifically, it was measured using an Octet QKe (ForteBio, USA) device according to the protocol suggested by the manufacturer. Specifically, prepare 1x kinetic buffer by diluting 10x kinetic buffer (ForteBio, 18-1105) in PBS. Antibodies were prepared by diluting to a concentration of 1 ⁇ g/ml in 1x kinetic buffer, and purified ⁇ -catenin was sequentially diluted in 1x kinetic buffer at concentrations of 200, 100, 50, 25, 12.5, and 0 nM, respectively. 200 ⁇ l each was put into an opaque 96-well plate through which light does not pass.
  • Octet QKe Octet QKe
  • AHC anti-human immunoglobulin Fc capture
  • 1x kinetic buffer As the AHC (anti-human immunoglobulin Fc capture) sensor chip moved in the order of 1x kinetic buffer, antibody dilution solution, 1x kinetic buffer, antigen dilution solution, and 1x kinetic buffer, the antibody bound to the antigen.
  • the antigen affinity of the antibody was analyzed through the change in refractive index that occurs when .
  • Affinity was calculated with Octet Data Analysis software 11.0 in a 1:1 binding model.
  • InBC2 antibody is a cell-penetrating interference antibody with improved expression level compared to inBC0 antibody, and since there is no change in ⁇ -catenin antigen binding ability, inBC2 was used as a template for cell-penetrating degradation antibody in the present invention.
  • SBCA SB medium
  • the pre-culture was inoculated into 250 ml of LB liquid medium containing 34 ⁇ g/ml of chloramphenicol and 100 ⁇ g/ml of ampicillin at an initial inoculation concentration of OD 0.05, followed by main culture, and the spectrophotometer ( Measure the OD600 value with Thermo ScientificTM, #51119200), and when the OD600 reaches 0.8, add 0.5 mM IPTG (Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) and 50 ⁇ M D-Biotin to a concentration, and then 4 hours at 20°C and 150 rpm Expression was induced by culturing for a period of time. Thereafter, E.
  • coli cells were harvested by centrifugation at 4°C and 8000 rpm for 15 minutes, and resuspension was performed with 20ml of Tris-HCl pH8.0 buffer (50mM Tris, 300mM NaCl, 1mM 2-mercaptoethatnol) to sonicate cells. Cells were disrupted using a grinder (SONICS, #VCX 750). Thereafter, centrifugation was performed at 4° C. and 15,000 xg for 20 minutes, and the supernatant was filtered using a 0.45 ⁇ m SFCA syringe filter (Sartorius, #16533-K) to obtain a culture supernatant containing secreted proteins.
  • Tris-HCl pH8.0 buffer 50mM Tris, 300mM NaCl, 1mM 2-mercaptoethatnol
  • Cells were disrupted using a grinder (SONICS, #VCX 750). Thereafter, centrifugation was performed at 4° C. and 15,000 x
  • Imidazole was dialyzed against purified biotinylated ⁇ -catenin with final buffer (2 mM DTT containing PBS, pH 7.4) using Centrifugal Filters (Satorious, #VS2022). Proteins purified through the above process were quantified using absorbance and extinction coefficient at a wavelength of 280 nm.
  • Example 2 Construction of anti- ⁇ -catenin cell penetration degradation antibody (inBC2-E3 recruiter) in which U-Box or E3 recruiter is fused.
  • a cell-penetrating interference antibody that penetrates into the cytoplasm of cells and specifically recognizes ⁇ -catenin, U-Box of E3 or E3 that can bind to E2-Ub E2-ubiquitin conjugate of UPS, an intracellular protein degradation system
  • E3 recruiter E3 recruiting ligand
  • U-Box binds to cytoplasmic E2-Ub, bringing E2-Ub closer to the target protein, and converting the target protein to poly-Ub.
  • E3 recruiter E3 recruiting ligand
  • U-box that can bind to E2-Ub or E3 recruiter for binding to E3 are searched for and improved, and then selected U-Box or The fusion site and linker were optimized for the E3 recruiter.
  • 5A is a schematic diagram illustrating construction of inBC2, inBC2-E2-Ub recruiters ( E4B 1227-1302 , IpaH 254-545 ), and inBC2-E3 recruiters (VHL 152-213 ).
  • inBC2-E2-Ub recruiters E4B 1227-1302 , IpaH 254-545
  • inBC2-E3 recruiters VHL 152-213
  • a total of three types of E2-Ub recruiter and E3 recruiter were selected and fused to the C-terminus of the light chain of inBC2 using a (G4S)2 linker (G10).
  • G4S G4 linker
  • the sequence of the heavy chain variable region is SEQ ID NO: 18
  • sequence of the light chain variable region is SEQ ID NO: 20.
  • inBC2-(G10)-E4B 1227-1302 is a form in which the modified U-box domain of SEQ ID NO: 10 is fused to the C-terminus of the light chain of inBC2.
  • inBC2-(G10)-IpaH 254-545 is a fusion of the modified IpaH 254-545 of SEQ ID NO: 11, which fragments only the active domain binding to the E2-ubiquitin complex derived from Shigella spp., to the C-terminus of the light chain of inBC2.
  • inBC2-(G10)-VHL 152-213 is a form in which the E3 recruiter of SEQ ID NO: 12 is fused to the C-terminus of the light chain of inBC2.
  • an E2-Ub recruiter or an E3 recruiter was fused to the C-terminus of the light chain of inBC2 to induce ⁇ -catenin degradation, thereby expressing and purifying a cell-penetrating decomposition antibody capable of exhibiting an inhibitory effect on tumor growth.
  • a secretion signal peptide is encoded at the 5' end.
  • GGGGSGGGGS linker G10 is used at the C-terminus of the light chain including the cytoplasmic penetrating light chain variable region (hT4-59 VL, SEQ ID NO: 20) and the light chain constant region (CL) in which DNA is fused and the integrin receptor-targeting circular peptide is fused.
  • E2-Ub recruiter and E3 recruiter were fused, and the DNA encoding them was cloned into pcDNA3.4 (Invitrogen) vector with NotI/HindIII, respectively.
  • pcDNA3.4 Invitrogen
  • BCO-VH heavy chain variable region
  • CH1-hinge-CH2- CH3 heavy chain constant region
  • HEK293-F cells Invitrogen
  • serum-free FreeStyle 293 expression medium Invitrogen
  • PEI polyethylenimine
  • HEK293-F cells Upon transfection in 200 ml shake flask (Corning), HEK293-F cells were seeded in 100 ml medium at a density of 2.0 ⁇ 10 6 cells/ml and cultured at 150 rpm, 8% CO 2 , and 37 degrees.
  • the appropriate heavy and light chain plasmids were diluted in 10ml FreeStyle 293 expression medium to a total of 250 ⁇ g (2.5 ⁇ g/ml) of 125 ⁇ g heavy chain and 125 ⁇ g light chain, and filtered to dilute 750 ⁇ g (7.5 ⁇ g/ml) of PEI. It was mixed with 10 ml of medium and reacted at room temperature for 10 minutes. Thereafter, the reacted mixed medium was put into the previously seeded cells in 100 ml and cultured at 150 rpm, 8% CO 2 , 37 degrees for 4 hours, and then the remaining 100 ml of FreeStyle 293 expression medium was added and cultured for 6 days.
  • Proteins were purified from cell culture supernatants collected by referring to standard protocols.
  • the antibody was applied to a Protein A Sepharose column (GE healthcare) and washed with PBS (pH 7.4). After eluting the antibody at pH 3.0 with 0.1 M glycine buffer, the sample was immediately neutralized with 1 M Tris buffer. The eluted antibody fraction was concentrated by exchanging the buffer with Histidine (pH6.5) through dialysis.
  • the purified protein was quantified using absorbance and extinction coefficient at a wavelength of 280 nm.
  • Example 3 Evaluation of physical properties of anti- ⁇ -catenin cell penetration degradation antibody.
  • FIG. 5B is an analysis by 12% SDS-PAGE under reducing or non-reducing conditions after purification of three types of inBC2, inBC2-E2-Ub recruiter, and inBC2-E3 recruiter of FIG. 5A.
  • inBC2 showed a molecular weight of about 150 kDa under non-reducing conditions, and showed molecular weights of 50 kDa for the heavy chain and 25 kDa for the light chain under reducing conditions.
  • BC2-(G10)-E4B 1227-1302 in which E4B 1227-1302 was connected using the (G 4 S) 2 linker bands were observed in the heavy chain of 50 kDa and the light chain of 34 kDa.
  • 5C is a graph showing mAU values at 280 nm using size exclusion chromatography of inBC2, inBC2-E2-Ub recruiter, and inBC2-E3 recruiter.
  • inBC2-(G10)-E4B 1227-1302 After preparing 45 ⁇ l of inBC2, inBC2-(G10)-E4B 1227-1302 , inBC2-(G10)-IpaH 254-545 , and inBC2-(G10)-VHL 152-213 at a concentration of 1 mg/ml, put them into the insert.
  • a sample was prepared. 150mM sodium phosphate, 137Mm NaCl pH 7.0 buffer was flowed at a flow rate of 1.0ml/min and waited until the pressure and mAU value at 280nm were stabilized.
  • Example 4 Construction, expression and purification of the inBC2-VHL 152-213 linker variant.
  • Antibody structure (PDB ID: 5UR8), ⁇ -catenin structure (PDB ID: 1JPW), and E3 structure (PDB ID: 5N4W, 4WQO) composed of VHL, EloBC, Cul2, and Rbx1, which have already been identified, are used as samples and predicted by the Chimera program did
  • VHL was fused to the C-terminus of the antibody light chain using a linker of about 13 ⁇ length, it was confirmed that the distance between the active domain Rbx1 and the target protein ⁇ -catenin was about 50 ⁇ , which is known to be advantageous for Ub delivery. .
  • inBC2-VHL 152-213 connected using a flexible 15 ⁇ long loop consisting of 152-158 amino acids (TLPVYTL) inherent in VHL 152-213 as a linker without an additional linker has optimal beta-catenin degradation ability. predicted that it would
  • InBC2- (G5)-VHL 152-213 in which VHL 152-213 was connected to the C-terminus of the light chain with a GGGGS linker showed a slight decrease in production yield compared to the conventional inBC2.
  • inBC2- (A6)-VHL 152-213 in which VHL 152-213 was fused to the light chain C-terminus with an ASTKGP linker formed an oligomer through a non-natural disulfide bond.
  • Example 5 Evaluation of ⁇ -catenin resolution of inBC2-VHL 152-213 linker variants.
  • a colorectal cancer cell line in which ⁇ -catenin is accumulated in a 12-well plate was diluted in 1ml at a concentration of 1.0x10 per well and cultured at 37°C and 5 % CO2 for 24 to 48 hours, then inBC2-VHL 152- 213 and four control antibodies (inBC2, inCT-VHL, inBC2(AAA)-VHL, inBC2-VHL 152-213 (V181G, D187K)) in an amount of 2 ⁇ M each for 12 hours at 37°C and 5% CO2.
  • InBC2-VHL 152-213 in which VHL 152-213 was linked to the C-terminus of the antibody light chain with the highest stiffness without an additional linker, had a relatively high ⁇ -catenin degrading activity of 36% compared to inBC2. It was confirmed that the resolution of ⁇ -catenin may vary depending on the type of different linkers. In addition, as predicted through modeling in one embodiment of the present invention, inBC2 connecting VHL using a flexible 15 ⁇ long loop consisting of 152-158 amino acids (TLPVYTL) inherent in VHL 152-213 as a linker without an additional linker. - It was confirmed that VHL 152-213 has the optimal ⁇ -catenin degradation ability.
  • TLPVYTL 152-158 amino acids
  • the degree of cell growth inhibition was evaluated to determine whether it could inhibit the growth of ⁇ -catenin-accumulated colon cancer cell lines in vitro.
  • FIG. 5e shows that four inBC2 and inBC2-VHL 152-213 linker variants and iCRT14 (inhibitor of ⁇ -catenin-responsive transcription 14), which inhibits the transcriptional activity of ⁇ -catenin by acting on the Wnt signaling pathway, were applied to the colorectal cancer cell line HCT116. It was treated as a positive control and the degree of cell growth inhibition was evaluated in vitro and graphed. Specifically, 1 ⁇ 10 3 HCT116 cells per well in a 96-well plate were diluted in 0.1 ml of medium containing 10% FBS, and cultured for 48 hours at 37 degrees and 5% CO 2 conditions.
  • inBC2 and inBC2-VHL 152-213 linker variants and iCRT14 were treated at 2 ⁇ M and 20 ⁇ M, respectively, at 37 degrees and 5% CO 2 conditions for 48 hours. Changes in cell number were measured by CellTiter Glo (CTG) assay. Specifically, after treatment for 48 hours, 70 ⁇ l of a CTG solution (Promega, #G7572) was added to each well and reacted at room temperature for 10 minutes to lyse the cells. The luminescence of the cell lysate was measured, and the cell viability was calculated as a percentage value for the vehicle group.
  • CTG CellTiter Glo
  • inBC2-VHL 152-213 had the highest cell growth inhibitory effect at about 30%. showed Therefore, among the four inBC2-VHL 152-213 linker variants, inBC2-VHL 152-213 with a VHL-linked inBC2-VHL 152-213 without an additional linker having production yield and properties similar to those of inBC2 and having the highest ⁇ -catenin degradation and cell growth inhibitory ability was finalized. was selected.
  • Example 7 Construction and evaluation of physical properties of a control antibody to identify the mechanism of action of inBC2-VHL 152-213 .
  • FIG. 6a is a schematic diagram of inBC2-VHL 152-213 and necessary control antibodies to investigate the specific mechanism of action of inBC2-VHL 152-213 .
  • InCT-VHL 152-213 which has the same components as inBC2-VHL 152-213 except for the heavy chain variable region (SEQ ID NO: 19) without ⁇ -catenin targeting ability, was constructed as a ⁇ -catenin targeting control.
  • inBC2(AAA)-VHL 152-213 is a control antibody that cannot be located in the cytoplasm due to loss of endosomes escape ability by replacing the endosomes escape motif 92 WYW 94 amino acids located in the light chain variable region with 92 AAA 94 .
  • VHL 152-213 The sequence of the light chain variable region in inBC2(AAA)-VHL 152-213 is shown in SEQ ID NO: 21.
  • VHL 152-213 fusion control inBC2-VHL 152-213 (V181G, D187K) fused with VHL mutants (V181G, D187K) was used. Since two single mutants, VHL (V181G) and VHL (D187K), have been reported to have reduced interactions with Cul2 [Nguyen, et al., (2015), Structure, 23, 441-449], two mutants were selected.
  • VHL V181G
  • D187K VHL mutants
  • inBC2-VHL 152-213 (V181G, D187K) was expected to be unable to recruit Cul2-based E3 to ⁇ -catenin.
  • the E3 recruiter of inBC2-VHL152-213 152-213 and the variant inBC2-VHL152-213 152-213 (V181G, D187K) was fused to the C-terminus of the light chain of inBC2, and the specific sequence of the E3 recruiter is shown in Table 7 below. was
  • Figure 6b is a graph showing the mAU value at 280 nm using size exclusion chromatography for four control antibodies and inBC2-VHL152-213 in the same manner as in Example 2. All four control antibodies and inBC2-VHL 152-213 showed a single peak, and it was confirmed that duplexes or oligomers were not formed.
  • Example 8 Evaluation of specific binding of inBC2-VHL 152-213 to intracellular ⁇ -catenin and Cul2.
  • inBC2-VHL 152-213 is actually located in cells to target ⁇ -catenin and can also bind to Cul2-based E3 using fused VHL to clarify the mechanism of action of inBC2-VHL 152-213 . This is the result of confirming by immunoprecipitation method.
  • the colorectal cancer cell line SW480 in which ⁇ -catenin is accumulated in a 100 mm 3 plate was diluted in 10 ml of 5x10 6 cells and incubated for 24 hours at 37 degrees and 5% CO 2 conditions, and then inBC2-VHL 152-213 and control antibodies inCT-VHL 152-213 and inBC2-VHL 152-213 (V181G, D187K) at 2 ⁇ M, respectively, at 37°C and 5% CO2 for 12 hours. Thereafter, the medium was removed, proteins attached to the cell surface were removed with a weakly acidic solution (200 Mm Glycine, 150 mM NaCl, pH 3.0), and washed with PBS.
  • a weakly acidic solution 200 Mm Glycine, 150 mM NaCl, pH 3.0
  • Cells were lysed using a cell lysis buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 0.05% SDS, 1 mM EDTA, protease inhibitors), and cell debris was precipitated and removed. Thereafter, Protein A agarose reacted with an anti-human Fc antibody (Sigma, #A9544) was added to the cell lysate, reacted for 2 hours, and then the antibody was precipitated.
  • a cell lysis buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 0.05% SDS, 1 mM EDTA, protease inhibitors
  • anti- ⁇ -catenin antibody Cell signaling, #9582S
  • anti-Cul2 antibody Santa cruz, #sc-166506
  • anti-human Fc antibody anti-beta-actin antibody
  • anti-beta-actin antibody Santa cruz, #sc-69879
  • Example 9 Evaluation of ⁇ -catenin degrading ability of inBC2-VHL 152-213 cells.
  • inBC2-VHL 152-213 in three colorectal cancer cell lines had an average 20% level of ⁇ -catenin degrading activity compared to inBC2.
  • inCT-VHL 152-213 a control antibody that cannot target ⁇ -catenin, did not show ⁇ -catenin degrading activity similar to inBC2.
  • inBC2-(AAA)-VHL 152-213 a control antibody that cannot be located in the cytoplasm due to loss of endosome escape function, ⁇ -catenin degrading activity was not shown.
  • Example 10 Evaluation of intracellular ⁇ -catenin degradation ability of inBC2-VHL 152-213 according to concentration and time.
  • Figure 7b shows four types of control antibodies and inBC2-VHL 152-213 in the amount of 0.5 ⁇ M and 2 ⁇ M, respectively, in the colorectal cancer cell line DLD-1 in which ⁇ -catenin is accumulated, treated for 12 hours at 37 degrees and 5% CO2 conditions.
  • the experiment was conducted in the same manner as in Example 5 above. About 15% of ⁇ -catenin degrading activity was confirmed only in samples treated with 2 ⁇ M of inBC2-VHL 152-213 .
  • Figure 7c is a Western blot result confirming the amount of ⁇ -catenin after treatment with 2 ⁇ M of inBC2 and inBC2-VHL 152-213 in the colon cancer cell line DLD-1 at 37 degrees and 5% CO2 conditions for 4, 8, and 12 hours, respectively. .
  • the experiment was conducted in the same manner as in Example 5 above. It was confirmed that inBC2-VHL 152-213 was present in the cytoplasm for 4 to 12 hours and could have ⁇ -catenin degrading activity at an average level of 25%.
  • Example 11 Evaluation of ⁇ -catenin poly-Ubization of inBC2-VHL 152-213 .
  • inBC2-VHL 152-213 mobilizes Cul2-based E3, thereby degrading ⁇ -catenin. Therefore, in the present invention, Western blotting was performed to confirm whether inBC2-VHL 152-213 acts by poly-Ubizing ⁇ -catenin through mobilized E3 and degrading it by the proteasome.
  • HCT116 was treated with 0.5 ⁇ M of the cullin activity inhibitor MLN4924 (Sigma, #5.05477.0001) or 5 ⁇ M of the proteasome activity inhibitor Bortezomib (Sigma, #5.04314.0001) for 30 minutes, and then the solution was removed and washed with the medium. . Thereafter, inBC2 and inBC2-VHL 152-213 were treated in an amount of 2 ⁇ M at 37°C and 5% CO2 for 12 hours. After that, the experiment was conducted in the same manner as in Example 5.
  • the present invention attempted to confirm poly-Ubization of ⁇ -catenin among the action mechanisms of inBC2-VHL 152-213 using immunoprecipitation.
  • 5x10 5 of DLD-1 was diluted in 10 ml in a 100 mm 3 plate and cultured for 24 hours at 37 degrees and 5% CO 2 conditions. Thereafter, after treatment with 5 ⁇ M of the proteasome activity inhibitor Bortezomib for 30 minutes, the solution was removed and washed with a medium.
  • InBC2-VHL 152-213 or the control antibody was treated in an amount of 2 ⁇ M, respectively, at 37 degrees and 5% CO2 for 12 hours. The experimental process until cell lysis was performed in the same manner as in Example 5 above.
  • Protein A agarose reacted with anti- ⁇ -catenin antibody was added to the cell lysate, reacted for 2 hours, and then ⁇ -catenin was precipitated. Then, Western blotting was performed using an anti-K-48 polyubiquitin antibody (sigma, #05-1307) and an anti- ⁇ -catenin antibody.
  • 8B is a Western blot analysis result of four samples treated with and without Bortezomib and inBC2-VHL 152-213 , respectively, using an anti-K-48 polyubiquitin antibody. It was confirmed that the K-48 polyubiquitinated ⁇ -catenin band appeared only in the group treated with both Bortezomib and inBC2-VHL 152-213 .
  • inBC2-VHL 152-213 shows anti-K-catenin poly- Ubization of inBC2-VHL 152-213 including two types of control antibodies (inBC2, inBC2-VHL 152-213 (V181G, D187K)) under the condition of both Bortezomib treatment.
  • This is a Western blot result evaluated using 48 poly-Ub antibody.
  • the K-48 poly-ub chain-labeled ⁇ -catenin was most present in the sample treated with inBC2-VHL 152-213 compared to the two control antibodies. Confirmed.
  • inBC2-VHL 152-213 recruits Cul2-based E3 to ⁇ -catenin and transfers Ub to ⁇ -catenin to form a K-48 poly-Ub chain to form a proteasome.
  • the mechanism of action of degradation by inBC2-VHL 152-213 recruits Cul2-based E3 to ⁇ -catenin and transfers Ub to ⁇ -catenin to form a K-48 poly-Ub chain to form a proteasome.
  • Example 12 Evaluation of cell growth inhibition of inBC2-VHL 152-213 .
  • control antibodies inBC2, inCT-VHL 152-213 , inBC2(AAA)-VHL 152-213 , inBC2-VHL 152-213 (V181G, D187K)
  • inBC2-VHL 152-213 V181G, D187K
  • inBC2-VHL 152-213 V181G, D187K
  • Example 12 Evaluation of tumor growth inhibitory ability of tumor tissue integrin-specific inBC2-VHL 152-213 .
  • inBC2-VHL 152-213 using mice xenotransplanted with integrin-overexpressing colorectal cancer cell line SW480 The ability to inhibit tumor growth was evaluated.
  • SW480 an integrin-overexpressing human colorectal cancer cell line
  • BALB/c nude mice at a rate of 5x10 6 cells per mouse
  • the tumor volume reached about 100-120 mm 3
  • the same volume of control inBC2 , inBC2(AAA)-VHL 152-213 , inBC2-VHL 152-213 (V181G, D187K), and experimental group inBC2-VHL 152-213 were intravenously injected at 20 mg/kg.
  • Intravenous injection was performed twice a week for a total of 6 times, and the tumor volume was measured using a caliper, and the size and the like were observed.
  • FIG. 10a it was confirmed that inBC2-VHL 152-213 inhibited cancer cell growth significantly compared to the four control antibodies.
  • Figure 10b shows that inBC2-VHL 152-213 significantly inhibits tumor growth through the weight of the excised tumor.
  • FIG. 10c shows that inBC2-VHL 152-213 significantly inhibits tumor growth through the size of the extracted tumor.
  • FIG. 10D it was confirmed that there was no change in body weight of the mice in the inBC2-VHL 152-213 experimental group, and accordingly, it was confirmed that there was no non-specific toxicity.
  • Figure 10e is a Western blot result confirming the ⁇ -catenin degradation ability of inBC2-VHL 152-213 in the extracted tumor.
  • tumors were extracted from each mouse in the control group 3 (inBC2, inBC2(AAA)-VHL 152-213 , inBC2-VHL 152-213 (V181G, D187K)) and inBC2-VHL 152-213 experimental group.
  • the extracted tumor was cut into pieces with a diameter of about 1-2 mm, and the tumor tissue was homogenized by adding 3-400 ⁇ l of cell lysis buffer. Thereafter, Western blotting was performed in the same manner as in Example 5.
  • Example 13 Expression and purification of inBC2-E3 recruiters fused with E3 recruiters belonging to various types of CRLs.
  • inBC2-VHL 152-213 showed about 25% of ⁇ -catenin degradation ability.
  • an inBC2-E3 recruiter in which four other E3 recruiters belonging to CRLs are combined was newly constructed.
  • inBC2- ⁇ TrCP 142-255 , inBC2-SPOP 167-374 , inBC2-DDB2 61-114 , and inBC2-SOCS2 153-198 are fused E3 recruiters of SEQ ID NOs: 13 to 16, respectively, to the C-terminus of the light chain of inBC2. It is a form.
  • inBC2 and the five inBC2-E3 recruiters were expressed and purified in the same manner as in Example 1 above. The specific production yields of the inBC2 and the five inBC2-E3 recruiters are shown in Table 8 below.
  • Example 14 Evaluation of physical properties of inBC2-VHL152-213 152-213 and inBC2-SOCS2 153-198 .
  • 11a is a graph showing mAU values at 280 nm using size exclusion chromatography for two types of inBC2 and inBC2-E3 recruiters (inBC2-VHL 152-213 and inBC2-SOCS2 153-198 ). Specifically, the analysis was performed in the same manner as in Example 3 above. As SOCS2 153-198 was fused, the molecular weight increased and the peak was observed at a faster time than the monoclonal antibody inBC2. Unlike inBC2-VHL 152-213 showing a normal single peak, slight tailing and oligomerization were observed in inBC2-SOCS2 153-198 .
  • Example 15 Evaluation of ⁇ -catenin resolution of inBC2-VHL152-213 152-213 and inBC2-SOCS2 153-198 .
  • inBC2-SOCS2 153-198 showed a similar or about 20% higher ⁇ -catenin degrading activity compared to the existing inBC2-VHL 152-213 , and on average about 40% of ⁇ -catenin degradation activity. It was confirmed that it had catenin resolution.
  • Example 16 Evaluation of cell growth inhibition of inBC2-VHL152-213 152-213 , inBC2-SOCS2 153-198 .
  • 11C is a graph showing the degree of cell growth inhibition evaluated in vitro by treating three colorectal cancer cell lines with inBC2 and inBC2-E3 recruiters (inBC2- VHL152-213 , inBC2-SOCS2 153-198 ). Specifically, the experiment was conducted in the same manner as in Example 6. As shown in FIG. 11c , inBC2-SOCS2 153-198 showed a significant cell growth inhibitory effect of about 35% on average compared to inBC2 in three colorectal cancer cell lines, similar to the positive control iCRT14.
  • Example 17 Design of inBC2-SOCS2s in which variant SOCS2 153-198 is fused.
  • inBC2-SOCS2 153-198 -WT which has high binding and resolution to ⁇ -catenin
  • inBC2-SOCS2s in which the mutant SOCS2 153-198 was fused were designed to improve physical properties and expression level.
  • the mutant SOCS2 The sequences of inBC2- SOCS2s fused with 153-198 are shown in Table 9 below.
  • Figure 12a shows a newly fused mutant SOCS2 in consideration of conserved sequences of E3 complex-forming proteins (e.g., SOCS 1-8, VHL, Vif (Virion infectivity factor)) having a SOCS box and EloBC-cullin binding sites.
  • This is the primary structure of 153-198 .
  • 12b shows intra- and inter-bond changes observed after minimization of the tertiary structure of the variant SOCS2 153-198 using bioluminate 4.0 (Schr ⁇ dinger, Inc.) at pH 7.4.
  • inBC2-SOCS2 153-198-1 of SEQ ID NO: 23 has A177N, I178Y, and W179R mutations in the SOCS2 sequence, and is hydrophobic with A177 (Ala, alanine), I178 (Ile, isoleucine), and W179 (Trp, tryptophan).
  • inBC2-SOCS2 153-198 -3 of SEQ ID NO: 25 has mutations of F196H and V198D in the SOCS2 sequence, and by replacing F196 (Phe, phenylalanine) forming a C-terminal loop with 196H (His, histidine), H165, It was engineered to maintain the pi-pi bond formed by F196 and Y194 while strengthening the hydrogen bond with water molecules.
  • inBC2-SOCS2 153-198 -4 of SEQ ID NO: 26 has A177N, I178Y, W179R, and V198D mutations in the SOCS2 sequence, and A177N, I178Y, W179R and the polar amino acid D198 present at the C-terminus of the mutant helix2 sequence ( Asp, aspartic acid) and neighboring residues such as N172, L191 and E192 were engineered to strengthen the internal bonds.
  • inBC2-SOCS2s corresponding to SEQ ID NOs: 27 to 34 were designed based on inBC2-SOCS2 153-198 -4 of SEQ ID NO: 26 including A177N, I178Y, W179R, and V198D mutations in the SOCS2 sequence.
  • inBC2-SOCS2 153-198 -5 of SEQ ID NO: 27 has A177N, I178Y, W179R, Y157R, and V198D mutations in the SOCS2 sequence, and was engineered to enhance the electrostatic interaction between D198 and R157.
  • inBC2-SOCS2 153-198 -6 of SEQ ID NO: 28 has A177N, I178Y, W179R, F196H, and V198D mutations in the SOCS2 sequence, and was engineered to have a synergistic effect of SOCS2 153-198 -1 and SOCS2 153-198 -2 .
  • inBC2-SOCS2 153-198 -7 of SEQ ID NO: 29 has A177N, I178Y, W179R, V198D, H165D, Y194K, F196D mutations, and the pi interaction of weak binding energy formed by H165 of helix1 and Y194, F196 of helix3 ( edge to face), hydrogen bonding and electrostatic interaction with adjacent R168, V198D are designed to be enhanced.
  • inBC2-SOCS2 153-198 -8 of SEQ ID NO: 30 has A177N, I178Y, W179R, V198D, Q164K, Y190D mutations, and based on inBC2-SOCS2 153-198 -4, Q164 (Gln, glutamine) and Y190 constituting helix3.
  • inBC2-SOCS2 153-198 -9 of SEQ ID NO: 31 has A177N, I178Y, W179R, V198D, and C167M mutations, and unbound C167 (Cys, cysteine) present at the N-terminus of helix1 is converted to methionine (M).
  • inBC2-SOCS2 153-198-10 of SEQ ID NO: 32 has A177N, I178Y, W179R, V198D, and C174M mutations, and by substituting unbound C174 present at the C-terminus of helix1 with methionine, it becomes hydrophobic at the interface with EloB. Designed to enhance interaction.
  • inBC2-SOCS2 153-198-11 of SEQ ID NO: 33 has A177N, I178Y, W179R, V198D, and C174Q mutations, and unbound C174 is modified to glutamine.
  • inBC2-SOCS2 153-198 -12 of SEQ ID NO: 34 has I178Y, W179R, V198D, H165D, Y194K, F196D, Q164K, Y190D mutations, inBC2-SOCS2 153-198 -7 and inBC2-SOCS2 153-198 -8 It is a fusion of mutations possessed by
  • Example 18 Construction of inBC2-SOCS2s in which variant SOCS2 153-198 is fused.
  • InBC2-SOCS2s fused with mutant SOCS2 were constructed, expressed, and purified in the same manner as the anti- ⁇ -catenin cell-penetrating degradation antibody (inBC2-SOCS2 153-198 ) fused with wild-type SOCS2 described in Example 1, and inBC2 -Specific production yields of SOCS2s are shown in Table 10 below.
  • InBC2-SOCS2s corresponding to SEQ ID NOs: 23 to 34 showed a minimum 3-fold to maximum 22-fold increase in yield compared to the production yield (1.2 ⁇ 0.3 mg/L) of wild-type SOCS2 fused inBC2-SOCS2 153-198 . Confirmed. The production yield of inBC2-SOCS2 153-198 -4 was 6.4 ⁇ 0.3 mg/L, a five-fold increase compared to inBC2-SOCS2 153-198 .
  • inBC2- SOCS2s of SEQ ID NOs: 27 to 34 constructed based on inBC2-SOCS2 153-198-4, inBC2-SOCS2 153-198-7 , inBC2-SOCS2 153-198-8 , and inBC2-SOCS2 153-198-11 , inBC2-SOCS2 153-198 -12, inBC2-SOCS2 153-198 -8 had the highest production yields in the order, and the yield of inBC2-SOCS2 153-198 -7 was 26.7 ⁇ 10.7 mg/L, with inBC2-SOCS2 153-198 The production increased by 22 times compared to that of 12 types of inBC2-SOCS2s, and it was produced with the highest yield.
  • Example 19 Evaluation of physical properties of inBC2-SOCS2s in which variant SOCS2 153-198 is fused.
  • Example 13 is a graph showing mAU values at 280 nm using size exclusion chromatography for inBC2-SOCS2s produced corresponding to SEQ ID NOs: 21 to 33, and the analysis was performed in the same manner as in Example 3.
  • inBC2-SOCS2 153-198 Compared to inBC2-SOCS2 153-198 , as the variant SOCS2 153-198 is fused, inBC2-SOCS2 153-198 -4, inBC2-SOCS2 153-198 -7, inBC2-SOCS2 153-198 -8, inBC2-SOCS2 153
  • inBC2-SOCS2 153-198 In the case of -198 -11 and inBC2-SOCS2 153-198 -12, unlike inBC2-SOCS2 153-198 , there is no tailing and oligomer, and a single peak with a high mAU value at 280 nm was shown, confirming that protein aggregation was improved.
  • Example 20 Analysis of binding ability of inBC2-SOCS2s to which mutant SOCS2 153-198 was fused to ⁇ -catenin and EloBC complexes.
  • inBC2-SOCS2s After penetrating into the cytoplasm, inBC2-SOCS2s recognizes cytoplasmic ⁇ -catenin, and at the same time, the adapter binding domain SOCS2 153-198 fused to the C-terminus of inBC2 recruits the adapter proteins EloBC and cullin5 to form a CRL5 complex and then to the UPS. Since it was designed to induce ⁇ -catenin degradation by ⁇ -catenin, the EloBC binding ability of inBC2-SOCS2s was evaluated in an extracellular environment by ELISA.
  • FIG. 14 shows the binding ability of inBC2-SOCS2s to ⁇ -catenin and E3-complex (SOCS2-EloBC-Cullin5) by ELISA to determine the binding ability of 100 nM ⁇ -catenin and 100 nM and 1 ⁇ M EloBC complex, respectively. is the result of the analysis.
  • the antigen ⁇ -catenin used in this Example was purified in the same manner as in Example 1 above.
  • SBCA SB medium
  • the pre-culture was inoculated into 100 ml of LB liquid medium containing 34 ⁇ g/ml of chloramphenicol and 100 ⁇ g/ml of ampicillin at an initial inoculation concentration of OD 0.05, followed by main culture, and the spectrophotometer ( When the OD 600 value was measured with Thermo Scientific TM , #51119200) and the OD 600 reached 0.4, IPTG (Isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranosid), an expression-inducing material, was added at a concentration of 0.5 mM, followed by 18 °C at 150 rpm at 20 ° C. Expression was induced by culturing for a period of time.
  • inBC2-SOCS2s including inBC2 at a concentration of 5 ⁇ g/ml in a 96-well EIA/RIA plate for 1 hour at room temperature
  • 0.1% PBST PBS, pH 7.4, 0.1% Tween20
  • 2% PBSB PBS, pH 7.4, 2% BSA
  • 100 nM of ⁇ -catenin and EloBC complex protein were diluted with 2% PBSB at a concentration of 100 nM and 1 ⁇ M, allowed to bind at room temperature for 1 hour, and washed three times with 0.1% PBST for 10 minutes.
  • HRP-conjugated anti-GST antibody HRP-conjugated anti-GST mAb, santa cruz, #sc-138
  • HRP-conjugated anti-His antibody HRP-conjugated anti-His mAb, Invitrogen, #MA1 -21315-HRP.
  • 450nm absorbance was quantified by reacting with TMB ELISA solution.
  • inBC2-SOCS2s showed a similar level of ⁇ -catenin binding ability compared to inBC2.
  • inBC2-SOCS2 153-198 showed little binding capacity to 100 nM of EloBC complex
  • inBC2-SOCS2 153-198 -4 and inBC2-SOCS2 with improved yield and physical properties and specific binding ability to ⁇ -catenin and E3-complex than inBC2-SOCS2 153-198 Further experiments were conducted using inBC2 -SOCS2 153-198 -8, inBC2-SOCS2 153-198 -11, and inBC2-SOCS2 153-198 -12.
  • Example 21 Evaluation of ⁇ -catenin degradation ability of inBC2-SOCS2s fused with mutant SOCS2 153-198 .
  • 15a is a schematic diagram of a cell-based screening system constructed to efficiently evaluate ⁇ -catenin degradation ability. Specifically, HEK293T cells belonging to the Wnt independent cell line were constructed using the 3rd generation lentiviral system to stably transduce beta-catenin-nanoluck fusion protein, and then 1.5x10 4 cells per well were placed in a 96-well plate.
  • HEK293T- ⁇ -catenin-nanorock-expressing cells were each diluted in 0.1 ml of medium containing 10% FBS and cultured for 16 to 18 hours at 37 degrees and 5% CO 2 conditions. Thereafter, the control antibody and the wild type and mutant SOCS2 fusion anti- ⁇ -catenin cytoplasmic penetration degradation antibody were treated in an amount of 2 ⁇ M and incubated at 37 degrees and 5% CO 2 conditions. After 6 hours, 25 ⁇ l of the substrate Endurazine (Promega, #N2571) was added to each well and reacted for 2 hours to measure the luminescence value using a luminometer. The luminescence value for each antibody-treated group was obtained as a percentage value for the vehicle group.
  • inBC2-SOCS2 153-198 -4 and inBC2-SOCS2 153-198 -7 had a significant ⁇ -catenin degrading effect of about 60 to 70% compared to the control antibody inBC2 to which SOCS2 was not fused.
  • the wild-type SOCS2 fragment had an increased degradation effect by about 10 to 20%, respectively, compared to the fused inBC2-SOCS2 153-198 .
  • inBC2-SOCS2s in colon cancer cell lines The intracellular ⁇ -catenin degrading activity of inBC2-SOCS2s in colon cancer cell lines was confirmed by Western blotting in the same manner as in Example 5 above. As shown in Figure 15c, it was confirmed that inBC2-SOCS2 153-198 -7 in the colorectal cancer cell line SW480 in which ⁇ -catenin was accumulated had 30% to 70% of ⁇ -catenin degrading activity compared to inBC2. It showed the highest ⁇ -catenin degrading activity among 5 types of inBC2-SOCS2s.
  • Example 22 Evaluation of ⁇ -catenin degradation ability of colon cancer cell lines of inBC2-SOCS2 153-198 -7 according to concentration and time.
  • inBC2- SOCS2 153-198-7 is actually located in cells to target ⁇ -catenin and at the same time, in order to clearly identify the mechanism of action of inBC2-SOCS2 153-198-7, Cul5-based analysis is performed using a fused SOCS2 fragment. This is the result of confirming by immunoprecipitation whether E3 of E3 can bind to EloB, an adapter protein.
  • 1x10 6 of LoVo a colorectal cancer cell line in which ⁇ -catenin is accumulated in a 100 mm 3 plate, was diluted in 10 ml and incubated for 36 hours at 37 degrees and 5% CO 2 conditions, followed by inBC2-SOCS2 153-198 -7 and inBC2, a control antibody, were treated in an amount of 2 ⁇ M each at 37 degrees and 5% CO2 for 12 hours. Thereafter, the medium was removed, proteins attached to the cell surface were removed with a weakly acidic solution (200 Mm Glycine, 150 mM NaCl, pH 3.0), and washed with PBS.
  • a weakly acidic solution 200 Mm Glycine, 150 mM NaCl, pH 3.0
  • Cells were lysed using a cell lysis buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 0.05% SDS, 1 mM EDTA, protease inhibitors), and cell debris was precipitated and removed. Thereafter, Protein A agarose reacted with an anti-human kappa-type light chain antibody (Abcam, # ab1050) was added to the cell lysate, reacted for 2 hours, and then the antibody was precipitated.
  • a cell lysis buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 0.05% SDS, 1 mM EDTA, protease inhibitors
  • Western blot was performed using anti- ⁇ -catenin antibody (Cell signaling, #9582S), anti-Cul5 antibody (Origene, #AP07576SU-N), anti-EloB antibody (Santa cruz, #sc-133090), and anti-human kappa-type light chain antibody. was performed.
  • 16b shows that 0.5, 1, 2, 4 ⁇ M of inBC2-SOCS2 153-198 -7 and control antibodies inBC2, inBC2(AAA) -SOCS2 153-198 -7 were administered to LoVo, a colorectal cancer cell line in which ⁇ -catenin is accumulated, at 4 ⁇ M After treatment with sheep for 12 hours, it is a Western blot result confirming the amount of ⁇ -catenin.
  • inBC2-SOCS2 153-198 -7 exhibited ⁇ -catenin degradation that was proportional to the antibody treatment concentration under 2 ⁇ M or higher antibody treatment conditions.
  • 16c shows the effects of ⁇ -catenin after treatment with inBC2-SOCS2 153-198-7 and control antibodies inBC2, inBC2(AAA)-SOCS2 153-198-7 in the colon cancer cell line LoVo for 6, 12, 24, and 36 hours. It is a Western blot result confirming the amount. It was confirmed that inBC2-SOCS2 153-198 -7 did not regenerate ⁇ -catenin present in the cytoplasm for 12 to 36 hours and had 50-60% degradation activity.
  • Example 23 Evaluation of ⁇ -catenin poly-Ubization of inBC2-SOCS2 153-198 -7.
  • K-48 polyubiquitinated ⁇ -catenin bands appeared only in the group treated with both Bortezomib and inBC2-SOCS2 153-198 -7, and at the same time, ⁇ -catenin was detected in Western blot using whole cell lysates. It was confirmed that the amount of did not decrease. On the other hand, in the group treated with inBC2-SOCS2 153-198 -7 without Bortezomib, it was confirmed that the K-48 polyubiquitinated ⁇ -catenin band did not accumulate and the ⁇ -catenin present in the cells was reduced by about 18%.
  • inBC2-SOCS2 153-198 -7 recruits Cul5-based E3 to ⁇ -catenin and transfers Ub to ⁇ -catenin to form a K-48 poly-Ub chain The mechanism of degradation by the proteasome was identified.
  • Example 24 Evaluation of cell growth inhibition of inBC2-SOCS2 153-198-7 .
  • inBC2-SOCS2 153-198 -7 In order to determine whether inBC2-SOCS2 153-198 -7 can inhibit the growth of colorectal cancer cell lines in vitro according to ⁇ -catenin degradation, the degree of cell growth inhibition was evaluated. Specifically, for 5 colorectal cancer cell lines (COLO320DM. SW403, LoVo, SW620, HCT-116) with ⁇ -catenin-dependent cell growth and 1 control cell line Huh-7 without ⁇ -catenin-dependent cell growth Two types of control antibodies (inBC2, inBC2(AAA)-SOCS2 153-198 -7) and inBC2-SOCS2 153-198 -7 were treated to evaluate the degree of cell growth inhibition in vitro and graphed. Specifically, it was performed in the same manner as in Example 6.
  • inBC2-SOCS2 153-198 -7 in all five colon cancer cell lines showed a significant cell growth inhibitory effect that was not observed with the two control antibodies, especially COLO320DM and HCT-116 cell lines. showed a cell growth inhibitory effect of more than 40%.
  • the control cell line Huh-7 which does not have ⁇ -catenin-dependent cell growth, no cell growth inhibitory effect derived from inBC2-SOCS2 153-198 -7 was observed.
  • inBC2-SOCS2 153-198 -7 specifically induced growth inhibition of colon cancer cell lines according to ⁇ -catenin degradation.
  • FIG. 18B shows HCT-116 colorectal cancer cell line treated with two control antibodies (inBC2, inBC2(AAA)-SOCS2 153-198 -7) and inBC2-SOCS2 153-198 -7 at concentrations of 1, 2, and 4 ⁇ M,
  • the concentration-dependent cell growth inhibition pattern of inBC2-SOCS2 153-198 -7 was observed. Specifically, it was performed in the same manner as in Example 6.
  • inBC2-SOCS2 153-198 -7 showed significant cell growth inhibitory effects of 40% and 52% compared to inBC2 under 2 and 4 ⁇ M treatment conditions, and an IC 50 value of 4.6 ⁇ 0.5 ⁇ M was confirmed.
  • inBC2-SOCS2 153-198 -7 specifically inhibited the growth of colon cancer cell lines by degrading ⁇ -catenin accumulated in the cytoplasm of colon cancer cell lines.
  • ⁇ -catenin accumulated in the cytoplasm migrates into the nucleus and combines with the transcription factor TCF4 to promote the transcription of Wnt target genes such as cyclin D1 and myc, which is involved in cancer development.
  • Wnt target genes such as cyclin D1 and myc
  • inBC2-SOCS2 153-198 -7 unlike inBC2 and inBC2(AAA)-SOCS2 153-198 -7, showed a ⁇ -catenin degradation rate of 50%, and expressed the Wnt target genes c-myc and cyclin D1. It was confirmed that the amount was reduced by more than 70%.
  • inBC2-SOCS2 153-198 -7 specifically degrades ⁇ -catenin accumulated in colorectal cancer cell lines, thereby lowering the amount of Wnt target genes involved in colorectal cancer development, thereby reducing ⁇ -catenin in colorectal cancer cell lines. It was confirmed that the sub-signaling induced by can be negatively regulated.
  • the anti- ⁇ -catenin cell-penetrating interfering antibody (iMab) binds to the active site of the target protein ⁇ -catenin and inhibits protein-protein interactions. In many cases, it does not exhibit sufficient effects such as cytotoxicity alone.
  • anti- ⁇ -catenin cell penetrating degrading antibody referred to as A cell-penetrating degrading antibody or Degrobody
  • U-box or E3 recruiter is fused to the anti- ⁇ -catenin cell penetrating interference antibody is It can induce cell growth inhibition and cytotoxicity by degrading the target protein ⁇ -catenin present in the cytoplasm.
  • the cell penetrating degradation antibody according to the present invention remodels and fuses U-box or E3 recruiter to the cell penetrating interference antibody in the form of a complete immunoglobulin, E3 (ubiquitin ligase enzyme), which is a limitation in existing target protein degradation strategies , low bioavailability, and limited intracellular delivery can be avoided.
  • E3 ubiquitin ligase enzyme
  • the target cell-specific anti- ⁇ -catenin cell-penetrating decomposition antibody has improved physical properties and affinity for E2-Ub (E2-ubiquitin conjugate) or E3, and U- through an optimized fusion site and linker Box or E3 recruiter-linked cell-penetrating and degrading antibodies are easy to develop as therapeutic drugs through high production yields, and proteases are specifically labeled on ⁇ -catenin in the cytoplasm through poly-Ub (poly-ubiquitination) labeling. Effective anticancer activity can be expected by inducing degradation by moths.
  • the concept of the anti- ⁇ -catenin cell penetrating decomposition antibody according to the present invention is to deliver a protein showing high cytotoxicity when fused to a cell penetrating interference antibody, in addition to U-box or E3 recruiter, into cells for treatment and prevention of various diseases. It can be used as a pharmaceutical composition.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 살아있는 세포의 세포질에 침투하여 표적단백질을 특이적으로 인식하는 세포침투 간섭항체에 세포 내 단백질 분해 시스템인 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(ubiquitin-proteasome system, UPS)의 E2에 결합할 수 있는 E3의 U-Box을 융합하거나 UPS의 E3와 결합할 수 있는 E3 recruiter(E3 recruiting ligand)를 융합한 세포침투 분해항체 및 이를 포함하는 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

세포 내부에 침투하여 표적단백질을 분해하여 제거하는 세포침투 분해항체 및 이의 용도
본 발명은 살아있는 세포의 세포질(cytosol)에 침투하여 세포질 내부의 표적단백질을 특이적으로 인식하고 분해하여 제거하는 세포침투 분해항체(A cell-penetrating degrading antibody 또는 Degrobody라 칭함) 및 이를 포함하는 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 구체적으로 세포 내 단백질 분해 시스템인 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(ubiquitin-proteasome system, UPS)의 기작(mechanism) 및 기능(function)을 모방하여, 항체가 인식하는 표적단백질을 특이적으로 분해할 수 있는 세포침투 분해항체 및 이를 포함하는 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 살아있는 세포의 세포질에 침투하여 표적단백질을 특이적으로 인식하는 세포침투 간섭항체(cell/tissue-specific cytosol-penetrating interfering antibody, iMab)에 세포 내 단백질 분해 시스템인 UPS의 일련의 효소 중 E2(ubiquitin conjugating enzyme)에 결합할 수 있는 E3(ubiquitin ligase enzyme)의 U-Box을 융합한 세포침투 분해항체 및 이를 포함하는 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
보다 구체적으로 본 발명은 살아있는 세포의 세포질에 침투하여 표적단백질을 특이적으로 인식하는 세포침투 간섭항체에 세포 내 단백질 분해 시스템인 UPS의 E2에 결합할 수 있는 E3의 U-Box을 연결하여 E2에 의해 세포침투 간섭항체가 결합한 표적단백질에 폴리-유비퀴틴네이션(poly-ubiquitination, poly-Ub)을 유도하여, 궁극적으로 UPS에 의해서 표적단백질 분해를 유도하는 세포침투 분해항체에 관한 것이다.
본 발명은 살아있는 세포의 세포질에 침투하여 표적단백질을 특이적으로 인식하는 세포침투 간섭항체에 세포 내 단백질 분해 시스템인 UPS의 E3와 결합할 수 있는 E3 recruiter(E3 recruiting ligand)를 융합한 세포침투 분해항체 및 이를 포함하는 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
보다 구체적으로 본 발명은 완전한 이뮤노글로불린(immunoglobulin) 형태로 종양 세포 또는 조직에 과발현되는 세포 표면의 막단백질 수용체에 특이적으로 결합하여 내재화(endocytosis) 된 후에 엔도좀 탈출(endosomal escape) 능력에 의해 세포의 세포질에 위치하고, 세포질의 표적단백질에 결합하는 세포침투 간섭항체에 U-Box 또는 E3 recruiter을 융합한 세포침투 분해항체에 관한 것으로, U-Box는 E2와 결합하여(recruiting) 표적단백질에 가깝게 위치하도록 하여 표적단백질을 poly-Ub화 시키고, E3 recruiter는 E3와 결합하여(recruiting) 표적단백질에 가깝게 위치하도록 하여 표적단백질에 poly-Ub화을 유도하여, 궁극적으로 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(UPS)에 의해서 poly-Ub 표지된 표적단백질 분해를 유도하는 세포침투 분해항체에 관한 것이다.
본 발명은 세포침투 분해항체의 세포질의 표적단백질에 따른 최적의 분해 E2와 결합(recruiting)할 수 있는 U-box 탐색 및 개량에 관한 것이다.
본 발명은 세포침투 분해항체의 세포질의 표적단백질에 따른 최적의 분해 E3와 결합(recruiting)을 위한 E3 recruiter 탐색 및 개량에 관한 것이다.
또한 본 발명은 세포침투 분해항체에서, U-Box 또는 E3 recruiter의 융합 위치 및 연결 linker를 최적화에 관한 것이다.
본 발명은 항-β-catenin 세포침투 간섭항체(inBC2)에 U-Box인 E4B1227-1302를 연결한 형태인 inBC2-E4B1227-1302 또는 E3 recruiter를 연결한 형태의 inBC2-E3 recruiter라 일컫는 세포침투 분해항체의 개발에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 암 세포 표면의 수용체 막단백질을 통해 내재화 된 후에 엔도좀 탈출능에 의해 세포질로 침투하여 표적단백질인 β-catenin과 결합하는 항-β-catenin 세포침투 간섭항체 (inBC2)에 U-Box인 E4B1227-1302를 연결한 항-β-catenin 세포침투 분해항체 (inBC2-E4B1227-1302) 또는 E3 recruiter을 연결한 항-β-catenin 세포침투 분해항체 (inBC2-E3 recruiter)에 관한 것이다. 구체적으로 inBC2-E4B1227-1302는 E2와 결합하여(recruiting) 표적단백질에 가깝게 위치하도록 하여 표적단백질을 β-catenin를 poly-Ub화 시키고, inBC2-E3 recruiter는 E3와 결합하여(recruiting) E3에 결합하는 E2가 표적단백질에 가깝게 위치하도록 하여 표적단백질인 β-catenin를 poly-Ub화 시키는 기능을 가져, 결국 poly-Ub화된 β-catenin 분해를 유도하는 세포침투 분해항체 및 이를 포함하는 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
세포 내 단백질 분해는 라이소좀(lysosome)과 프로테아좀(proteasome)에 의한 두 가지 경로를 통해 이뤄지고, 80% 가량의 세포 단백질은 유비퀴틴(ubiquitin, Ub)에 의해 표지된 후 프로테아좀에 의해 세포질과 핵에서 분해되며, 이 과정을 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(ubiquitin-proteasome system, UPS)이라 한다. 유비퀴틴에 의한 단백질 분해 조절 시스템은 손상된 단백질이나 불필요한 단백질을 제거하여 세포의 항상성을 유지하는 기능을 담당할 뿐 아니라, 시간에 따라 정교하게 조절되어야 하는 세포주기 과정이나 전사 조절 과정에도 참여한다. UPS에 문제가 생긴다면 암을 비롯한 다양한 질환이 생길 수도 있다. 반대로 UPS 경로의 활성화를 이용한 질환 유발 단백질 제거가 근본적인 치료법이 될 수 있음이 제시되고 있다.
유비퀴틴은 76개의 아미노산으로 구성된 단백질로, 거의 모든 진핵세포에 존재한다. UPS에서 유비퀴틴이 선택적으로 단백질을 분해하기 위하여 표지되는 과정(ubiquitination)에는 일련의 효소계, 즉 ubiquitin activating enzyme(E1), ubiquitin conjugating enzyme(E2), 및 ubiquitin ligase enzyme(E3)가 관여하며, 기질단백질(substrate protein, substrate)을 유비퀴틴 사슬로 연쇄/다중 표지되는 폴리-유비퀴틴네이션(poly-ubiquitination, poly-Ub)화를 유도하고, 이러한 poly-Ub화된 표적단백질은 ATP-의존성 단백질 분해효소 복합체인 26S 프로테아좀(26S proteasome)에 전달되고, 접힘이 풀리며 분해가 된다. 즉, UPS는 E1, E2, E3 3종류의 효소로 구성된 시스템이며, E1이 Ub을 activation시키고, E2가 이를 받아 E2-Ub(E2-ubiquitin conjugate)가 형성되고, E3는 E2-Ub와 기질과 결합하여 기질을 poly-Ub화 시키고, poly-Ub화된 기질은 프로테아좀에서 분해된다. Ub과 단백질 기질의 결합은 기질분자의 Lys(lysine) residue와 Ub의 C-말단(C-terminus)의 Gly(glycine) residue 사이의 isopeptide bond 형성을 통해 일어나며, 기질단백질에 결합된 Ub의 C-말단 Lys에 또 다른 Ub이 연결될 수 있다. 이러한 과정을 반복하여, 기질단백질에 여러 개의 Ub 분자가 연쇄적으로 연결되어 poly-Ub을 표지하면, 그 단백질은 26S proteasome에 인식되어 선택적으로 분해된다.
사람의 UPS에는 E1은 2개, E2는 40여개, E3는 600 여개 종류가 있다고 추산된다. E1이 Ub을 activation시키고, E2가 이를 받아 E2-Ub가 형성된다. E3는 기질단백질과 E2-Ub에 결합하여 기질단백질이 E2-Ub에 가깝게 위치하게 함으로써 기질단백질의 poly-Ub화를 유도한다. 특히 E3는 특징적 도메인 구조 존재여부와 Ub을 전달하는 기작의 차이에 따라 RING(Really Interesting New Gene) E3s, HECT (homologous to the E6AP carboxyl terminus) E3s, RBR (RING-Between-RING) E3s로 나뉘어진다. 중요한 점은 E3는 E2-Ub와 기질단백질에 모두 결합하여, Ub으로 표지될 기질단백질을 인지하는 특이성을 제공한다. 즉, 분해할 단백질의 poly-Ub화 과정은 E3 효소에 의하여 결정되는데, 이때 모든 기질단백질에는 특정 E3에 의한 인식 부위와 Ub 연결부위가 존재한다. 세포 내의 약 10 만종의 단백질을 고려하면, 각 E3는 기질에 대한 특이성도 있지만, 동시에 중복성(redundancy)과 다중성(multiplicity)을 지닌다.
기질단백질 분해에 활용되는 RING E3는 E2-Ub과 기질단백질(substrate protein, substrate)을 공간적으로 가깝게 배치한 후 E2-Ub의 Ub을 E3로의 경유 없이 바로 기질단백질로 전달하는 방식을 취한다. RING E3는 도1a에서와 같이 1) cullin 비의존적 형태(단일 단백질만으로 E3 활성을 갖는)의 Monomeric RING (예, c-CBL), Homodimeric RING (예, cIAP), Heterodimeric RING (예, Mdm2-MdmX), Monomeric U-box (예, E4B), Homodimeric U-box (예, CHIP, Prp19)와 도1b에서와 같이 2) cullin 단백질을 scaffold로 복합체를 이루어 기능하는 cullin-RING E3 ubiquitin ligases (CRLs)로 나뉜다 [Morreale and Walden (2016). Cell, 165:248-248 e241]. cullin 비의존적 형태 RING E3에서 E2-Ub와의 결합은 RING subunit 단백질 또는 U-Box subunit 단백질을 통한다. CRLs의 경우는 RING-box protein이 E2-Ub와 결합하는 subunit 단백질이다(도 1a 및 도 1b).
인간에서 CRLs은 E3 중 가장 큰 family이며, cullin(CUL) 타입에 따라 CRL1 (CUL1), 2(CUL2), 3(CUL3), 4A(CUL4A), 4B(CUL4B), 5(CUL5), 7(CUL7), 9(CUL9)의 8가지로 나뉘며, 이는 도1c에 명시되어 있다. CRL 복합체는 기본적으로 scaffold 역할을 하는 1) Cullin, 2) E2-Ub가 결합하는 RING 도메인, 3) 기질 특이성을 결정하는 기질수용체(substrate receptor), 4) cullin과 기질수용체를 연계하는 어댑터(adaptor)로 구성되어 있다. 특히, 기질수용체는 표적단백질인 기질(기질단백질)에 결합하는 도메인(substrate protein-binding domain)과 어댑터 단백질에 결합하는 어댑터 결합 도메인(adaptor binding domain)으로 구성되어 있다. 따라서 2개의 도메인으로 구성된 기질수용체는 기질단백질을 E3에 가깝게 위치하도록 하는 역할을 한다. 인간에 존재하는 300 여개의 기질수용체는 family로 나누는데, 이는 도 1b에 나타낸 바와 같이, 69종 F-box, 17 종의 VHL(von Hippel-Lindau), 180종의 BTB(Bric-a-brac, Tramtrack, Broad-complex), 90 종의 DCAF(DDB1-CUL4-associated factors), 39종의 SOCS(suppressors of cytokine signaling) 등을 대표적인 family로 하여 구성되어 있다.
세포내 단백질 분해시스템인 UPS를 활용하여 표적단백질을 분해하는 기술을 표적단백질분해제(Targeted Protein Degrader)라 한다. 소분자화합물 기반의 PROTAC(Proteolysis-targeting chimera, PROTAC)과 AUTOTAC(Autophagy- targeting chimera)기술 및 단백질 기반의 bioPROTAC(Biological PROTAC, BioPROTAC)이 대표적이다. PROTAC은 E3 결합 모듈-연결체-표적단백질 결합 모듈의 3가지 파트로 구성된 헤테로-2기능성(homo-bifunctional) 소분자 의약품이다. 즉 표적단백질에 결합하는 소분자, E3에 결합하는 소분자, 두 종류의 소분자를 연결하는 링커(linker)분자가 하나의 화합물로 합성되어 쓰인다. PROTAC은 표적단백질과 E3를 동시에 서로 가까이 유도하여 표적단백질의 poly-Ub화 및 분해를 일으킨다. AUTOTAC은 autophagy 유도 분자 결합 모듈(Autophagy-Targeting Ligand, ATL)-연결체-표적단백질 결합 모듈(Target-Binding Ligand (TBL)의 3가지 파트로 구성된 소분자화합물로, TBL을 통하여 타겟에 결합하고 ATL은 오토파지 리셉터(autophagy receptor)인 p62에 결합하여 리소좀에 의한 분해를 유도한다. AUTOTAC도 PROTAC과 같은 소분자 화합물의 근본적인 한계를 갖는다. 즉 소분자 의약품이기 때문에 단백질 표면에 결합할 수 있는 소수성 결합부위(pocket)가 없어 소분자로 표적하기 어려운 타겟(undruggable) 단백질 표적에 한계를 지니며, 종양 세포 특이성이 부재하여 부작용이 수반될 수 있다. 또한, 항체의약품과 비교하여 반감기가 낮아 생체이용률(bioavailability)이 낮다는 한계점도 갖고 있다. 또한, PROTAC 기술에 활용된 E3는 대표적으로 β-TrCP, MDM2, cIAP/XIAP, VHL, CRBN의 5종이며, 그 중 β-TrCP 및 MDM2의 경우 효능이 미약하다.
단백질 기반의 표적단백질분해제로 연구되는 것은 PROTAC의 생물학적 등가물인 bioPROTAC이다. bioPROTAC은 표적단백질 결합하는 바인더(binder)와 E3결합 모듈을 구축한 융합 단백질이다. 즉, 표적단백질 결합 모듈은 항체절편 (nanobody, single chain variable fragment(scFv)) 등을 이용하고, E3 결합 모듈은 CRLs의 기질수용체 도메인을 이용한다. bioPROTAC은 대표적으로 ubiqutibodies, antibody RING-mediated destruction(ARMeD), affinity-directed protein missile (AdPROM) 기술이 있다. 그러나, bioPROTAC은 스스로 세포질 침투능의 결여로, 세포 내로 전달하기 위해 DNA, mRNA transfection 등의 인위적인 발현 시스템을 사용해야 하므로, 치료 등의 목적으로 생체 내 적용이 어렵다는 단점이 있다. 최근에 항체-약물결합체 (antibody-drug conjugate, ADC)처럼, 항체-PROTAC 결합체(antibody-PROTAC conjugate) 기술이 보고되었다. 하지만, 항체-PROTAC 결합체 기술도 PROTAC 개발이 전제되어야 하므로, 난제 표적단백질에 대한 PROTAC 기술의 한계를 지닌다. 또한 위치 특이적 결합, 제조 등의 CMC(chemistry, manufacturing, control) 문제를 해결해야 하는 단점이 있다.
종양 생물학에 대한 많은 연구에도 불구하고, 암은 여전히 흔히 발생하고 치명적인 질병이다. 암은 전사 인자(transcription factor), 수용체 탈인산화효소(receptor phosphatase), 라스 단백질(Ras) 등에서 생성되는 수많은 단백질의 돌연변이에 의해 발생하고 악화된다. 특히, 대표적인 전사 인자 중 하나인 β-catenin은 세포 내에 존재하며, 소분자가 결합할 수 있는 깊은 결합 포켓 부위 없이 평평한 표면으로 인해 소분자로 표적하기 어려운 암 유발 단백질이다. 또한, β-catenin은 결합 파트너인 TCF4(transcription factor 4)와 매우 높은 친화도와 넓은 면적으로 상호 작용하고 있어 소분자 저해제로는 활성을 억제하기 어려운 단백질이다. 이러한 종양 유발 단백질을 치료하기 위한 가장 대표적인 전략은 항원과 결합할 수 있는 넓은 표면적을 가진 항체(antibody)를 이용하는 것이다. 항체는 항원에 높은 특이성 및 친화성으로 결합하여, 활성물질 또는 억제물질로서 작용하고, 최종적으로 종양을 치료할 수 있는 치료용 단백질이다.
세포 밖에서 세포질 내의 표적단백질을 직접 표적하기 위한 항체 기술은 세포침투 간섭항체(cell/tissue-specific cytosol-penetrating interfering antibody, iMab)기술이 있다(KR10-1602870, KR10-1602876, KR10-1732553, KR10-2000000, KR10-2091195; US10787487B2, US10851177B2, US20200385428A1, US20200339681A1, US20190144566A1). 세포침투 간섭항체(iMab)는 완전한 이뮤노글로불린 형태로 종양 세포 또는 조직에 과발현되는 세포 표면의 막단백질 수용체에 특이적으로 결합하여 내재화(endocytosis) 된 후에 엔도좀 탈출(endosomal escape) 능력에 의해 세포의 세포질에 위치하고, 세포질의 표적단백질에 결합하는 기능이 있다. 예를 들어, 세포질 내의 GTP와 결합한 활성화된 Ras(Ras·GTP)에 특이적으로 결합하여 종양 유래 변이형 Ras의 활성을 억제하는 세포침투 간섭항체가 보고되었다(KR10-2163305; Shin SM et al. 2020, Science Advances, 6(3):eaay2174; Shin SM et al. 2017, Nature Communications, 8:15090). 그러나, 표적 항원의 활성 부위에 결합하여 단백질-단백질 상호 작용을 저해하는 세포침투 간섭항체만으로는 충분한 효과를 나타내지 못하는 경우가 많다. 이를 극복하기 위한 새로운 전략으로, 항체의 높은 특이성을 기반으로 보다 높은 활성을 위해 표적단백질을 분해할 수 있는 세포침투 분해항체 개발 필요성이 크다. 현재까지 독성분자, 효소 등을 융합한 세포침투 항체는 보고된 바가 있지만, 세포질 표적단백질을 분해하는 항체 기술은 보고된 바가 없다.
선행기술문헌
특허문헌
국내 등록특허 제10-1602870호
국내 등록특허 제10-1602876호
국내 등록특허 제10-1732553호
국내 등록특허 제10-2000000호
국내 등록특허 제10-2091195
미국 등록특허 제10787487B2
미국 등록특허 제10851177B2
발명의 요약
상기 한계를 극복하기 위하여, 본 발명은 살아있는 타겟 세포/조직 특이적으로 세포질에 침투하여 세포질 내부의 표적단백질을 특이적으로 인식하여 분해하여 제거하는 완전 이뮤노글로불린(immunoglobulin) 항체 기반의 표적단백질분해제(Targeted Protein Degrader)인 세포침투 분해항체(A cell-penetrating degrading antibody, Degrobody)을 개발하고자 하였다.
본 발명은 구체적으로 세포 내 단백질 분해 시스템인 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(Ubiquitin-Proteasome System, UPS)의 기작(mechanism) 및 기능(function)을 모방하여, 항체가 인식하는 표적단백질을 특이적으로 분해할 수 있는 세포침투 분해항체를 개발하고자 하였다.
본 발명은 구체적으로 살아있는 세포의 세포질에 침투하여 표적단백질을 특이적으로 인식하는 세포침투 간섭항체에 세포 내 단백질 분해 시스템인 UPS을 활용할 수 있는 단백질을 융합하여(fusion) 표적단백질에 폴리-유비퀴틴네이션(poly-ubiquitination, poly-Ub)화를 유도하여, 이를 분해하고 제거하는 세포침투 분해항체를 개발하고자 하였다.
본 발명은 세포침투 간섭항체에 U-Box 또는 E3 recruiter를 융합시키는 위치를 항체 중쇄(heavy chain)의 N-말단 또는 C-말단, 경쇄(light chain)의 N-말단 또는 C-말단에 융합하여 탐색하고 최적의 위치를 제공한다.
본 발명은 세포침투 간섭항체에 U-Box 또는 E3 recruiter 융합 시, 발현 양 물리화학적 특성, 및/또는 생물학적 기능을 향상시킨 U-Box 변이체(variant) 또는 E3 recruiter 변이체를 제공한다.
구체적으로 본 발명은 항-β-catenin 세포침투 분해항체에 E3 recruiter를 융합하여, 표적하는 세포의 세포질에 존재하는 β-catenin을 분해하여 세포 성장 억제 및 사멸을 유도하는 세포침투 분해항체와 이의 제조 방법 및 용도를 제시하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 항-β-catenin 세포침투 분해항체에서 E3 recruiter의 융합 위치 및 연결 linker를 최적화하여 β-catenin 분해능 및 세포독성이 향상된 세포침투 분해항체의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 세포침투 분해항체를 포함하는 암, 자가면역질환 또는 감염성 질환의 예방 및/또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명은 상기 세포침투 분해항체를 환자에 투여하는 것을 포함하는 포함하는 암, 자가면역질환 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다. 본 발명은 상기 세포침투 분해항체를 암, 자가면역질환 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 제제의 제조에 사용하기 위한 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 세포침투 분해항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제시한다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1의 경쇄 CDR1, 서열번호 2의 경쇄 CDR2, 서열번호 3 또는 4의 경쇄 CDR3 및 서열번호 5의 중쇄 CDR1, 서열번호 6 또는 7의 중쇄 CDR2, 서열번호 8 또는 9의 중쇄 CDR3를 포함하는, β-catenin에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한, β-catenin에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 종양 세포 또는 조직에 과발현되는 세포 표면의 막단백질 수용체에 특이적으로 결합하여 내재화(endocytosis) 된 후에 엔도좀 탈출(endosomal escape) 능력에 의해 세포의 세포질에 위치하는, β-catenin에 결합하는 세포침투 간섭항체(cytosol-penetrating interfering antibody)를 제공한다.
본 발명은 또한, 세포침투 간섭항체에 U-박스 (U-Box) 또는 E3 리쿠르터 (E3 recruiter)가 추가로 융합된, 세포침투 분해항체 (cell-penetrating degrading antibody Degrobody)를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 세포침투 간섭항체를 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 세포침투 분해항체를 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산을 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 발현벡터로 형질전환된 재조합 세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 항-β-catenin 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다: (a) 상기 세포를 배양하여 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생산된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계.
본 발명은 또한, 상기 세포침투 분해항체의 제조방법을 제공한다: (1) β-catenin 표적능을 가지는 인간 항체의 중쇄가변영역(VH) 및 중쇄불변영역(CH1-hinge-CH2-CH3)이 포함된 중쇄와 상기 중쇄의 N-말단 또는 C-말단에 항체와 U-Box 또는 E3 recruiter가 연결된 핵산(Nucleic acids)을 클로닝한 항-β-catenin 중쇄 발현 벡터를 제조하는 단계; (2) 세포질 침투능을 가지는 인간 항체의 경쇄가변영역(VL) 및 경쇄불변영역(CL)이 포함된 경쇄와 상기 경쇄의 N-말단 또는 C-말단에 항체와 U-Box 또는 E3 recruiter가 연결된 핵산(Nucleic acids)을 클로닝한 엔도좀 탈출 경쇄 발현 벡터를 제조하는 단계; (3) 상기 제조된 중쇄, 경쇄 발현벡터를 단백질 발현용 동물세포에 동시 형질전환 하여 완전한 이뮤노글로불린 형태의 세포침투 분해항체를 발현하는 단계; 및 (4) 상기 발현된 세포침투 분해항체를 정제 및 회수하는 단계.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편, 상기 세포침투 간섭항체 및 상기 세포침투 분해항체에 연결된 생체활성분자를 포함하는 접합체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편, 상기 세포침투 간섭항체 및 상기 세포침투 분해항체를 포함하는 이중 또는 다중특이항체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편, 상기 세포침투 간섭항체 및 상기 세포침투 분해항체를 포함하는 종양 또는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편, 상기 세포침투 간섭항체 및 상기 세포침투 분해항체를 환자에 투여하는 것을 포함하는 포함하는 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다. 본 발명은 상기 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편, 상기 세포침투 간섭항체 및 상기 세포침투 분해항체를 암의 예방 또는 치료용 제제의 제조에 사용하기 위한 용도에 관한 것이다.
도 1a은 E3의 monomeric U- box 및 homodimeric U-box 종류 및 구조와 유비퀴틴화 기작을 설명하는 모식도이다.
도 1b는 CRLs 종류에 따른 기질수용체(Substrate receptor) 종류 및 구조와 유비퀴틴화 기작을 설명하는 모식도이다.
도 2a는 세포침투 간섭항체의 표적단백질에 poly-Ub화를 유도하기 위해, 세포침투 간섭항체에 U-Box를 융합한 세포침투 분해항체(Degrobody)의 개발 모식도이다.
도 2b는 세포침투 간섭항체에 U-Box를 융합한 세포침투 분해항체(Degrobody)가 암세포 특이적으로 발현된 수용체를 통해 내재화 된 후, 엔도좀에서 세포질로 탈출하여 세포질 내 POI(표적 단백질)-Degrobody-E2-Ub의 삼성분복합체 형성 후, POI가 26S proteasome을 통해 분해되는 작용기전을 나타내는 모식도이다.
도 2c는 세포침투 간섭항체의 표적단백질에 poly-Ub화를 유도하기 위해, 세포침투 간섭항체에 E3 recruiter를 융합한 세포침투 분해항체(Degrobody)의 개발 모식도이다.
도 2d는 세포침투 간섭항체에 E3 recruiter를 융합한 세포침투 분해항체(Degrobody)가 암세포 특이적으로 발현된 수용체를 통해 내재화 된 후, 엔도좀에서 세포질로 탈출하여 세포질 내 POI(표적 단백질)-Degrobody-E3의 삼성분복합체 형성 후, POI가 26S proteasome을 통해 분해되는 작용기전을 나타내는 모식도이다.
도 2e는 표적 단백질에 따른 최적의 E3 활용을 위한 E3 recruiter 탐색 전략을 나타낸 모식도이다.
도 3a는 표적 단백질에 따른 E3 recruiter 탐색 전략 모식도이다.
도 3b는 기질수용체의 3차구조에서 어댑터 결합 도메인(E3 recruiter) 부분을 강조한 구조 모식도이다.
도 4는 항-β-catenin 세포침투 간섭항체 inBC0와 inBC2의 β-catenin에 대한 결합능을 평가하기 위해, Octet BLI-based Systems 시스템을 이용하여 200, 100, 50, 25, 12.5 및 0Nm의 β-catenin 농도조건에서 inBC0와 inBC2의 β-catenin에 대한 친화도를 비교 분석한 것이다.
도 5a는 inBC2 및 inBC2의 경쇄 C-말단에 E2-Ub recruiter 또는 E3 recruiter를 연결한 항-β-catenin 세포침투 분해항체(inBC2-E2-Ub recruiter 또는 inBC2-E3 recruiter)의 구축을 설명한 모식도이다.
도 5b는 상기 도 5a의 항체들을 정제 후 환원성 또는 비환원성 조건에서 12% SDS-PAGE를 통해 분석한 것이다.
도 5c는 상기 도 5a의 항체들을 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5d는 β-catenin이 과발현된 대장암 세포주 HCT116에서 inBC2-VHL152-213 링커 변이체의 β-catenin 분해능을 웨스턴 블랏을 통해 평가한 것이다.
도 5e는 대장암 세포주 HCT116에서 상기 도 5a의 항체들의 세포성장 저해 정도를 in vitro에서 평가한 결과이다.
도 6a는 inBC2-VHL152-213의 구체적인 작용 기전을 규명하기 위해 구축한 대조군 항체들과 inBC2-VHL152-213의 모식도이다.
도 6b는 상기 도 6a의 항체들을 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 도면이다
도 6c는 상기 도 6a의 항체들의 Cul2와 β-catenin에 대한 결합능을 면역침강법으로 확인한 결과이다.
도 7a는 대장암 세포주 3종에서 대조군 항체와 비교하여 inBC2-VHL152-213의 β-catenin 분해능을 웨스턴 블랏을 통해 평가한 것이다.
도 7b는 대장암 세포주 DLD-1에서 농도에 따른 inBC2-VHL152-213의 β-catenin 분해능을 웨스턴 블랏을 통해 평가한 것이다.
도 7c는 대장암 세포주 DLD-1에서 시간에 따른 inBC2-VHL152-213의 β-catenin 분해능을 웨스턴 블랏을 통해 평가한 것이다.
도 8a는 Cullin 활성 저해제와 프로테아좀 활성 억제제를 이용하여 inBC2-VHL152-213의 프로테아좀 의존적 β-catenin 분해능을 비교하는 웨스턴 블랏을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8b는 프로테아좀 활성 억제제를 이용하여 inBC2-VHL152-213의 β-catenin Ub화를 면역침강 후 항 K-48 poly-Ub 항체를 이용하여 분석한 웨스턴 블랏 결과이다.
도 8c는 상기 도 8b와 동일한 방법으로 대조군 항체를 이용하여 β-catenin의 poly-Ub화를 웨스턴 블랏을 통해 평가한 것이다.
도 9는 대장암 세포주 3종에서 대조군 항체들과 inBC2-VHL152-213의 세포성장 저해 정도를 in vitro에서 평가한 것이다.
도 10a는 integrin 과발현 대장암 세포주 SW480을 이종이식한 쥐에서 대조군 항체와 inBC2-VHL152-213의 종양 성장 억제 효과를 20mg/kg의 농도로 정맥주사하여 비교한 실험 결과이다.
도 10b는 종양 조직 integrin 특이적 대조군 항체 및 inBC2-VHL152-213 처리 이후 종양을 적출하여 종양의 무게를 측정한 그래프이다.
도 10c는 상기 도 6b의 적출된 종양의 크기를 나타낸 사진이다.
도 10d는 종양 조직 integrin 특이적 inBC2-VHL152-213의 비특이적 부작용을 확인하기 위해 쥐의 몸무게를 측정한 그래프이다.
도 10e는 상기 도 6b의 적출된 종양에서 inBC2-VHL152-213의 β-catenin 분해능을 웨스턴 블랏을 통해 평가한 것이다.
도 11a는 inBC2와 inBC2-VHL152-213, inBC2-SOCS2153-198를 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11b는 inBC2-VHL152-213과 inBC2-SOCS2153-198의 β-catenin 분해능을 비교하기 위해 대장암 세포주 3종에서 웨스턴 블랏을 수행한 결과를 나타낸 도면이다
도 11c는 대장암 세포주 3종에서 inBC2-VHL152-213, inBC2-SOCS2153-198의 세포성장 저해 정도를 in vitro에서 평가한 결과이다
도 12 a는 도11a는 inBC2-SOCS2153-198의 물성 및 발현양 개선을 위해 고안한 inBC2-SOCS2s 12종의 일차구조를 나열한 것이다.
도 12 b는 inBC2-SOCS2153-198의 물성 및 발현양 개선을 위해 bioluminate 4.0 (Schrφdinger, Inc.)을 이용하여 변이형 inBC2-SOCS2s의 삼차구조를 모델링 한 후, intra-, inter- bond 변화를 관찰한 것이다.
도 13는 inBC2, inBC2-SOCS2s항체의 크기배제 크로마토그래피 분석을 통해 물성을 평가한 것이다.
도 14은 inBC2, inBC2-SOCS2s에 대하여 β-catenin 및 EloBC 복합체에 대한 결합능을 평가하기 위해, ELISA를 통해 β-catenin 100nM과 EloBC 복합체 단백질을 100nM, 1μM 농도에 대하여 결합능을 평가한 것이다.
도 15a는 inBC2-SOCS2s에 대하여 β-catenin 분해능을 효율적으로 스크리닝하기 위하여, β-catenin-나노루시퍼레이즈 융합 리포터 단백질을 Wnt 비의존성 세포주에 속하는 HEK293T 세포 내에 형질도입한 세포주를 구축하고, inBC2-SOCS2s항체 처리에 따른 β-catenin-나노루시퍼레이즈의 발광값을 분석하는 모식도를 나타낸 것이다.
도 15b는 inBC2-SOCS2s에 대하여 β-catenin 분해능을 효율적으로 스크리닝하기 위하여, β-catenin-나노루시퍼레이즈 융합 리포터 단백질을 발현하는 HEK293T 세포주를 이용해 inBC2-SOCS2s의 β-catenin 분해능을 평가한 것이다.
도 15c는 inBC2-SOCS2s의 β-catenin 분해능을 평가하기 위해, 대장암 세포주 SW480에 대하여 inBC2-SOCS2s처리에 따른 β-catenin 분해능을 웨스턴 블랏을 통해 평가한 것이다.
도 16a는 상기 inBC2-SOCS2s에서 선별된 inBC2-SOCS2153-198-7의 0.5, 1, 2, 4μM의 농도 별 처리 조건에 따른 β-catenin 분해능을 대장암 세포주 LoVo에 대하여 웨스턴 블랏을 통해 평가한 것이다.
도 16b는 inBC2-SOCS2153-198-7의 프로테아좀 의존적 β-catenin 분해능을 평가하기 위해, 26S 프로테아좀 inhibitor인 bortezomib과 MG132의 처리 유무에 따른 β-catenin 분해능을 대장암 세포주 DLD-1과 LoVo에서 웨스턴 블랏을 통해 평가한 것이다.
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
β-catenin에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편
본 발명은 구체적으로 세포침투 간섭항체의 표적단백질에 poly-Ub화를 유도하기 위해, 도 2a, c에서와 같이 세포침투 간섭항체에 U-box 또는 E3 recruiter를 융합한 세포침투 분해항체를 개발하여, 세포질 침투 후에 U-Box는 세포질의 E2-Ub(E2-ubiquitin conjugate)와 결합하여(recruiting) E2-Ub가 표적단백질에 가깝게 위치하도록 하여 표적단백질을 poly-Ub화 시키고, E3 recruiter는 E3와 결합하여(recruiting) E3가 표적단백질에 가깝게 위치하도록 하여 표적단백질에 poly-Ub화을 유도하여, 궁극적으로 UPS에 의해서 poly-Ub으로 표지된 표적단백질 분해를 유도하는 세포침투 분해항체를 개발하고자 하였다(도 2a 및 도 2c).
본 발명은 항-β-catenin 세포침투 간섭항체에 U-Box 또는 E3 recruiter를 융합한 세포침투 분해항체를 제공한다. 더욱 구체적으로 도 2b,d에서 제시하는 바와 같이 항-β-catenin 세포침투 분해항체의 기작은 1) 암 세포 표면의 수용체 막단백질을 통해 내재화 된 후에 엔도좀 탈출능에 의해 세포질 (cytosol)로 침투하여 β-catenin과 특이적으로 결합, 2) 융합된 U-Box 또는 E3 recruiter에 의해 세포질 내의 E2-Ub 또는 E3가 β-catenin에 가깝게 위치하여 β-catenin의 poly-Ub화를 유도, 3) poly-Ub으로 표지된 β-catenin 표적단백질은 프로테아좀에 의해 분해되어 항암 활성을 보이는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하였다(도 2c 및 도 2d).
본 발명은 세포침투 분해항체의 세포질의 표적단백질에 따른 최적의 분해를 유도하는 E2-Ub 또는 E3를 표적단백질에 가깝게 위치시킬 수 있는 다양한 E2-Ub recruiter(예를 들면, E4B, CHIP 등.) 또는 E3 recruiter를 탐색하고자 하였다. 구체적으로, 본 발명에서는 동일한 표적에 대해 다른 E3 recruiter을 융합한 세포침투 분해항체의 경우, E2-Ub recruiter 또는 E3 recruiter에 따라 표적단백질 분해능에 차이를 보여, 표적단백질에 따른 최적의 E3 recruiter 탐색 및 활용이 중요함을 제시한다(도 2e).
본 발명은 서열번호 1의 경쇄 CDR1, 서열번호 2의 경쇄 CDR2, 서열번호 3 또는 4의 경쇄 CDR3 및 서열번호 5의 중쇄 CDR1, 서열번호 6 또는 7의 중쇄 CDR2, 서열번호 8 또는 9의 중쇄 CDR3를 포함하는, β-catenin에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
"항체(antibody)"는 β-catenin에 특이적으로 결합하는 항-β-catenin 항체를 의미한다. 본 발명의 범위에는 완전한 항체 형태뿐 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG의 아형(subtype)을 포함하며, 특히 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge-region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다.
Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각에 해당한다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고, 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용하거나 (예를 들어, 완전한 형태의 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2를 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 이용하여 제작할 수 있다.
"Fv" 단편은 완전한 항체 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이 결합된 이량체이다.
"Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인과, 중쇄의 가변 및 제1 불변 도메인(CH1)을 포함한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 Fab'단편 C-말단에 존재하는 힌지 영역의 시스테인에 의해 공유적으로 연결된 한 쌍의 Fab' 단편을 포함한다.
"단일쇄 Fv (scFv)" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄로 이루어진 구조체이다. scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 폴리펩티드 링커를 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 추가로 포함할 수 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 변형 항체, scFv, Fab 단편, F(ab')2 단편, 다이설파이드-결합 Fvs (sdFv) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변영역은 감마1 (IgG1), 감마 2 (IgG2), 감마 3 (IgG3) 또는 감마 4 (IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.
상기 단일클론 항체는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체와는 대조적으로, 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다.
예를 들어, 본 발명에서 유용한 단일클론항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 박테리아, 진핵 동물 또는 식물 세포에서 재조합 DNA 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 또한, 단일클론항체는 파지항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
용어 "친화도"는 항원의 특정부위를 특이적으로 인식하고 결합하는 능력으로, 항체의 항원에 대한 특이성과 함께 고도의 친화도는 면역 반응에서 중요한 요소이다. 상기 친화도 상수(KD)는 표면 플라스몬 공명(SPR), 예를 들어 BIAcore, bio-layer interferometry를 사용하여 결정될 수 있다. 표면 플라스몬 공명 데이터를 통해 1:1 랑뮈어 결합 모델 (동시에 kon, koff) 및 속도 상수 koff/kon의 비율에서 산출된 친화도 상수(KD)를 얻는다.
항-Β-catenin 항체의 Β-catenin에 대한 결합 친화성은 10-5M 내지 10-12　M 범위 내에 있다. 예를 들어, 결합 친화성은 10-6　M 내지 10-12　M, 10-7　M 내지 10-12　M, 10-8　M 내지 10-12　M, 10-9　M 내지 10-12　M, 10-5　M 내지 10-11　M, 10-6　M 내지 10-11　M, 10-7　M 내지 10-11　M, 10-8　M 내지 10-11　M, 10-9　M 내지 10-11　M, 10-10　M 내지 10-11　M, 10-5　M 내지 10-10　M, 10-6　M 내지 10-10　M, 10-7　M 내지 10-10　M, 10-8　M 내지 10-10　M, 10-9　M 내지 10-10　M, 10-5　M 내지 10-9　M, 10-6　M 내지 10-9　M, 10-7　M 내지 10-9　M, 10-8　M 내지 10-9　M, 10-5　M 내지 10-8　M, 10-6　M 내지 10-8　M, 10-7　M 내지 10-8　M, 10-5　M 내지 10-7　M, 10-6　M 내지 10-7　M 또는 10-5　M 내지 10-6　M이다.
항체의 "가변영역"은 상보성 결정 영역 (CDR; 즉 CDR1, CDR2, 및 CDR3) 및 골격 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 의미한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 의미한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 의미한다.
"상보성 결정 영역(complement determining region, CDR)"은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 의미한다. 각 가변 도메인은 전형적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다.
서열번호 1의 경쇄 CDR1, 서열번호 2의 경쇄 CDR2, 서열번호 3의 경쇄 CDR3 및 서열번호 5의 중쇄 CDR1, 서열번호 6의 중쇄 CDR2, 서열번호 8의 중쇄 CDR3;
서열번호 1의 경쇄 CDR1, 서열번호 2의 경쇄 CDR2, 서열번호 3의 경쇄 CDR3 및 서열번호 5의 중쇄 CDR1, 서열번호 7의 중쇄 CDR2, 서열번호 9의 중쇄 CDR3; 또는
서열번호 1의 경쇄 CDR1, 서열번호 2의 경쇄 CDR2, 서열번호 4의 경쇄 CDR3 및 서열번호 5의 중쇄 CDR1, 서열번호 6의 중쇄 CDR2, 서열번호 8의 중쇄 CDR3.
"골격 영역(Framework Region, FR)"은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4의 4개의 FR을 갖는다.
서열번호 17 내지 19로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 가변영역 및/또는 서열번호 20 또는 21의 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 구체적 실시예에서, 다음을 포함할 수 있다:
서열번호 17의 중쇄 가변영역 및 서열번호 20의 경쇄 가변영역;
서열번호 18의 중쇄 가변영역 및 서열번호 20의 경쇄 가변영역; 또는
서열번호 19의 중쇄 가변영역 및 서열번호 21의 경쇄 가변영역.
보존적 치환을 통해 아미노산 서열의 일부가 치환된 항체 또는 이의 항원 결합 단편도 포함된다.
본 명세서에서 "보존적 치환"이란 1개 이상의 아미노산을 해당 폴리펩티드의 생물학적 또는 생화학적 기능의 손실을 야기하지 않는 유사한 생화학적 특성을 갖는 아미노산으로 치환하는 것을 포함하는 폴리펩티드의 변형을 의미한다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체시키는 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 부류는 해당 기술분야에 규정되어 있으며, 잘 알려져 있다. 이들 부류는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 대전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비-극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 본 발명의 항체가 보존적 아미노산 치환을 갖고 여전히 활성을 보유할 수 있음이 예상된다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 목적하는 기능을 유지하는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 즉, 앞서 본 바와 같이 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_ help.html에서 확인할 수 있다.
이에 기초하여, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 명세서에 기재된 명시된 서열 또는 전체와 비교하여 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 이러한 상동성은 당업계에 공지된 방법에 의한 서열 비교 및/또는 정렬에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교 알고리즘(즉, BLAST 또는 BLAST 2.0), 수동 정렬, 육안 검사를 이용하여 본 발명의 핵산 또는 단백질의 퍼센트 서열 상동성을 결정할 수 있다.
"핵산"은 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
상기 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 분자생물학적 수법을 사용하여 (예를 들어, 항체와 중쇄와 경쇄를 암호화하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성할 수 있으며, 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나(DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 벡터의 성분으로는 일반적으로 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 항생제 내성 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터, 전사 종결 서열. 항체를 코딩하는 핵산은 프로모터 및 전사 종결 서열 등과 같이 작동적으로 연결되어 있다.
"작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 따라 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤모글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터, 엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Qiagen, USA) 등이 있다.
상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 재조합 발현 벡터로 형질감염된 숙주세포에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용된 숙주세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis 및 바실러스 투링기엔시스 (Bacillus thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas, 예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 프로테우스미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다.
다만, 동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주 세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 숙주세포를 배양하여 항체를 생성하는 단계; 및 생성된 항체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합단편의 제조방법에 관한 것이다.
상기 숙주세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 통상의 기술자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편 및 펩타이드, 단백질, 소분자 약물, 핵산, 나노입자 및 리포좀으로 구성된 군으로부터 선택된 생체활성분자가 융합된 접합체에 관한 것이다.
상기 단백질은 항체, 항체의 단편, 면역 글로불린, 펩타이드, 효소, 성장인자 (growth factor), 사이토카인 (cytokine), 전사인자, 독소, 항원성 펩티드, 호르몬, 운반 단백질, 운동 기능 단백질, 수용체, 신호(signaling) 단백질, 저장 단백질, 막 단백질, 막횡단(transmembrane) 단백질, 내부(internal) 단백질, 외부(external) 단백질, 분비 단백질, 바이러스 단백질, 당 단백질, 절단된 단백질, 단백질 복합체, 또는 화학적으로 개질된 단백질 등일 수 있다.
상기 소분자 약물은 약 1000 달톤 미만의 분자량을 지니며 질병의 치료제로서 활성도를 지니는 유기 화합물, 무기 화합물 또는 유기금속 화합물을 나타내는 것으로 본원에서 광범위하게 사용된다. 본원에서 소분자 약물은 올리고펩티드 및 약 1000 달톤 미만의 분자량을 지니는 그 밖의 바이오분자(biomolecule)를 포함한다.
상기 나노입자는 직경 1 내지 1000 nm 크기를 갖는 물질들로 이루어진 입자를 의미하며, 상기 나노 입자는 금속 나노 입자, 금속 나노 입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 금속 쉘로 구성되는 금속/금속 코어쉘 복합체, 금속 나노 입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 비금속 쉘로 구성되는 금속/비금속 코어쉘 또는 비금속 나노 입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 금속 쉘로 구성되는 비금속/금속 코어쉘 복합체일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 금속은 금, 은, 구리, 알루미늄, 니켈, 팔라듐, 백금, 자성철 및 그의 산화물로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않으며, 상기 비금속은 실리카, 폴리스티렌, 라텍스 및 아크릴레이트 계열의 물질로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 리포좀은 자기 스스로 회합할 수 있는, 수성 내부 구획을 둘러싸는 하나 이상의 지질 이중층 막으로 구성된다. 리포좀은 막 타입 및 그 크기에 의하여 특정 수 있다. 작은 유니라멜라 소포(SUV)는 단일막을 갖고 20nm 내지 50nm의 직경을 가질 수 있다. 큰 유니라멜라 소포(LUV)는 50nm이상의 직경을 가질 수 있다. 올리고라멜라 큰 소포 및 멀티라멜라 큰 소포는 다중, 일반적으로 동심원, 막 층을 가지고 직경이 100nm 이상일 수 있다. 여러 비동심원 막을 가진 리포좀, 즉 더 큰 소포 내에서 포함된 여러 작은 소포는 멀티소포성 소포(multivesicular vesicle)라고 한다.
본 명세서에서 “융합”은 기능 또는 구조가 다르거나 같은 두 분자를 일체화하는 것으로, 상기 단백질, 소분자 약물, 나노입자 또는 리포좀에 상기 종양 침투성 펩타이드가 결합할 수 있는 모든 물리, 화학적 또는 생물학적 방법에 의한 융합일 수 있다. 상기 융합은 바람직하게는 연결자 펩타이드에 의할 수 있으며, 이 연결자 펩타이드는 본 발명의 항체 경쇄 가변 영역, 항체, 또는 이의 절편의 다양한 위치에서 상기 생체 활성 분자와의 융합을 중계할 수 있다.
본 명세서에서 "이펙터 기능 (effector function)"은 항체의 Fc 영역 (Fc 영역의 야생형 서열 또는 Fc 영역의 아미노산 서열의 변이체)과 관련된 생물학적 활성의 유형을 말하며, 항체의 이소 타입에 따라 달라진다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q결합, 보체 의존적 세포 독성 (CDC); Fc 수용체 결합, 항체 의존적 세포-매개 세포 독성 (ADCC), 식균 작용 (phagocytosis), 세포 표면 수용체 (예를 들어, B- 세포 수용체, BCR)의 하향 조절 및 B- 세포 활성화가 있다.
"항체-의존적 세포 세포 독성" 또는 "ADCC"는 특정 항체에 의해 표지된 표적 세포를 이펙터 세포가 (예를 들어 T-cell, NK-cell) 용해시키는 반응을 지칭한다. ADCC는 또한 표적을 용해시키지만 다른 세포를 필요로 하지 않는 면역 보체 시스템과는 독립적이다. ADCC는 전형적으로 면역 글로불린 G (IgG) 항체와 상호 작용하는 자연 살해 (NK) 세포 인 것으로 알려진 이펙터 세포를 필요로 한다. 그러나 대식세포 (macrophages), 호중구 (neutrophils) 및 호산구 (eosinophils)는 ADCC를 매개할 수 있는데, 예를 들어 IgE 항체를 통해 기생충으로 알려진 특정 기생충 벌레를 죽이는 호산구와 같은 ADCC도 중재할 수 있다.
본 발명에 따른 항체에 접합될 수 있는 생체활성분자는 소분자 약물을 포함할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 이중특이항체 또는 다중특이항체를 제공한다.
본 발명에서 용어, "이중특이항체"이란 서로 다른 두 종류의 항원(표적 단백질)에 결합할 수 있는 단백질을 의미한다. 구체적으로는 자연적으로는 존재하지 않으며, 유전공학 또는 임의의 방법에 의해 제조된 형태임이 바람직하다. 본 발명의 "이중특이항체"는 "이중표적항체", "이중 항체" 또는 "이중 항체 단백질" 등과 혼용될 수 있다.
상기 이중특이항체는 직접적으로 또는 링커 (linker)를 통해 항원 결합 부위가 연결되거나 정전기적 상호작용에 의해 이종이중체 (heterodimer)를 이룰 수 있는 분자를 지칭한다.
"결합가 (valent)"는 분자 내의 항원에 특이적인 명시된 숫자의 결합 부위의 존재를 지칭한다. 그렇기 때문에, 용어 "1가", "2가", "4가", 및 "6가"는 분자 내의 항원에 특이적인 각각 1개, 2개, 4개, 및 6개의 결합 부위의 존재를 지칭한다.
다중특이적 항체는 적어도 3 이상의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 가지는 항체를 의미한다. 다중특이적(multi-specific) 항체는 삼중특이적(Tri-specific) 이상의 항체, 예를 들어 삼중특이적(Tri-specific) 항체, 사중특이적(Tetra-specific) 항체 또는 그 이상의 타겟을 표적하는 항체를 포함할 수 있다.
세포침투 간섭항체 및 분해항체
살아있는 세포 또는 조직 특이적으로 세포질에 침투하여 표적단백질을 특이적으로 인식하는 세포침투 간섭항체에 E2-Ub(E2-ubiquitin conjugate)와 결합할 수 있는 U-Box 또는 E3(E3 ubiquitin ligase)에 결합할 수 있는 E3 recruiter(E3 recruiting ligand)가 융합된 형태의 세포침투 분해항체를 제조하여, 세포 내 표적단백질을 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(Ubiquitin-Proteasome System, UPS)에 의해 분해되도록 하는 세포침투 분해항체를 제공한다.
본 발명에 따른 “세포침투 간섭항체(cell/tissue-specific cytosol-penetrating interfering antibody, iMab)”는 이뮤노글로불린(immunoglobulin) 형태, 바람직하게는 완전한 이뮤노글로불린 형태로, 종양 조직 등의 표적 세포 표면에 과발현 되는 막단백질 수용체 등에 결합하여 내재화(endocytosis)된 후에 엔도좀 탈출(endosomal escape) 능력에 의해 세포질에 위치하고, 세포질 내에서 표적단백질 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다.
본 발명에 따른 “유비퀴틴-프로테아좀 시스템(Ubiquitin-Proteasome System, UPS)”은 세포의 단백질을 폴리-유비퀴틴네이션(poly-ubiquitination, poly-Ub)화 시켜서 분해하고 제거하는 시스템으로, 이는 E1 (ubiquitin-activating enzyme), E2 (ubiquitin-conjugating enzyme), E3 (ubiquitin ligase enzyme)로 구성된다. E1이 유비퀴틴을 활성화하고, E2-유비퀴틴 복합체(E2-Ub)를 형성한 후, E3는 E2-Ub 및 기질과 결합하여 기질을 poly-Ub시킴으로써 poly-Ub화된 기질을 프로테아좀을 통해 분해하는 작용기전을 갖는다.
소분자로 표적하기 어려운 표적단백질
세포 내부에 위치하고 소분자가 결합할 수 있는 소수성 포켓(Hydrophobic pocket)이 없는 단백질은 소분자로 표적하기 어려운 타겟(undruggable target)이며 수많은 돌연변이에 의해 암, 면역질환 등의 다양한 질환을 유발한다. 대표적인 질환 유발 단백질 중 하나인 β-catenin은 CTNNB1 유전자에 의해 암호화되는 단백질이며 Wnt 신호전달경로에서 전사인자의 기능을 한다. Wnt 신호 전달의 최초 물질인 Wnt 단백질은 세포 표면의 Frizzled라는 수용체에 결합하여 신호 전달을 개시한다. Wnt 단백질에 의해 자극이 되지 않을 때에는, 세포질 내의 β-catenin은 Axin과 APC(Adenomatous polyposis coli) 단백질 복합체 내에서 GSK-3(Glycogen Synthase Kinase-3)라는 효소에 의해 인산화(phosphorylation)된다. 인산화된 β-catenin Cullin-RING E3 ubiquitin ligases(CRLs)에 속하는 β-TrCP E3에 의해 인식되고 UPS를 통해 프로테아좀에서 분해되어, 결과적으로 세포질 내의 β-catenin 양이 낮게 유지된다. Wnt가 Frizzled와 결합하면 세포 내의 GSK-3가 불활성화 되는데, 불활성화된 GSK-3는 β-catenin을 인산화하지 못하고 결과적으로 분해시킬 수 없게 되어 세포질 내에 β-catenin의 축적을 유도한다. 축적된 β-catenin은 핵 내로 이동해 TCF4(Transcription factor 4)라는 전사인자와 결합하여 사이클린 D1, myc, 세포 기질 금속 단백질 분해 효소(matrix metalloproteinase-7, MMP-7) 등의 Wnt 타겟 유전자의 전사를 촉진한다.
Wnt 신호전달의 비정상적인 활성화로 인한 β-catenin의 전사 활성 증가는 암의 발생과 관련이 있다. 그 원인으로는 ①β-catenin 분해에 관여하는 Axin, APC 단백질 복합체에서 Axin 및/또는 APC 단백질을 암호화하는 유전자 상에 돌연변이가 일어날 경우, GSK-3에 의한 β-catenin의 인산화가 일어나지 않아 β-TrCP에 의해 인식되지 못하여 세포질 내에 β-catenin의 축적을 유도한다. ②β-catenin을 암호화하는 유전자 상에 돌연변이가 일어나 마찬가지로 GSK-3에 의한 인산화가 일어나지 않아 세포질 내에 β-catenin의 축적을 유도하고, 결과적으로 Wnt 타겟 유전자의 전사 및 Wnt 신호전달을 지속적으로 촉진하게 된다.
항-β-catenin 세포침투 간섭항체
본 발명의 일 실시예에 따르면, β-catenin에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 종양 세포 또는 조직 특이적 항원을 표적하는 물질을 포함하고, 상기 항원에 특이적으로 결합하여 내재화(endocytosis)된 후에 엔도좀 탈출(endosomal escape) 능력에 의해 세포의 세포질에 위치하는, β-catenin에 결합하는 세포침투 간섭항체(cytosol-penetrating interfering antibody)를 포함한다.
항-β-catenin 세포침투 간섭항체는 종양 세포 또는 조직에 과발현되는 세포 표면의 막단백질 수용체에 특이적으로 결합하여 내재화(endocytosis) 된 후에 엔도좀 탈출(endosomal escape) 능력에 의해 세포의 세포질에 위치하고, 세포질의 표적단백질인 β-catenin에 결합하여 이의 기능을 저해하는 항체이다.
상기 항-β-catenin 세포침투 간섭항체는 종양 세포 또는 조직 특이적 항원, 예를 들어 종양세포에서 과발현된 EpCAM (epithelial cellular adhesion molecule), EGFR(epidermal growth factor receptor, integrin αvβ3/αvβ5 중 선택된 어느 하나 이상을 특이적으로 인식하는 것일 수 있다.
상기 종양 세포주는 EpCAM, EGFR, integrin αvβ3/αvβ5 중 선택된 어느 하나 이상이 과발현된 것일 수 있다.
상기 종양 세포 또는 조직 특이적 항원을 표적하는 물질은 예를 들어, 상기 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드(ligand), 올리고펩타이드(oligopeptide), 항체(antibody) 또는 이의 단편(fragment) 또는 앱타머(aptamer) 등일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명에 있어서 “세포침투 간섭항체”는 표 1에서 제시된 서열번호 3에 해당하는 선행 특허 (국내 등록특허 제10-2000000호)에 기술된 항체 경쇄가변영역(VL-CDR3)을 포함하며, VL-CDR3에 엔도좀 탈출 구조 모티프를 포함하고 있다. VL-CDR3의 서열에 의해 엔도좀 산성 pH 조건에서 항체의 특성변화가 일어나고, 항체가 그로 인해 엔도좀에서 세포질로의 탈출능을 나타내는 것을 특징으로 하는 모든 항체를 나타낸다.
본 발명에 있어서 “항-β-catenin 세포침투 간섭항체”는 서열번호 8에 해당하는 항체 중쇄가변영역(VH-CDR3)을 포함하며, VH-CDR3에 β-catenin을 항원으로 인식하는 서열을 포함하고 있다.
또한 본 발명에 의한 세포침투 간섭항체는 종양 조직 특이적인 세포질 침투를 위해 종양 조직에 과발현되는 수용체를 표적하는 원형펩타이드 (cyclic peptide)가 융합된 것을 특징으로 하며, 상기 세포침투 간섭항체에 융합한 원형 펩타이드는 Integrin αvβ3/αvβ5를 표적하는 원형 펩타이드 in4 (DGVRQCRGDCFDGPL)일 수 있다(Shin, et al., (2020), Sci Adv, 6, eaay2174).
상기 원형펩타이드는 항체의 N 또는 C-말단에 직접 결합 또는 링커를 통해 결합될 수 있다. 상기 링커는 다양한 서열과 길이를 가지는 펩타이드일 수 있으며, 단백질 가수분해 효소에 의해 잘리지 않으면서 구조적 유연성을 부여하는 GGGGS, (GGGGS)2, ASTKGP, ASTKGPSVFPLAP 서열 링커를 사용할 수 있다.
상기 세포침투 간섭 항체는 구체적으로는 하기 표 1에 나타낸 항원 결합 부위를 가질 수 있다.
Figure PCTKR2022010589-appb-img-000001
U-Box
본 발명에 따른 “U-Box”는 RING E3s중에 monomeric U-box 또는 Homodimeric U-Box에 있는 U-Box로 E2-Ub와 결합하는 기능이 있다. 구체적으로, monomeric U-box에는 E4B(E4 poly-ubiquitin chain elongation factorB)가 있고, Homodimeric U-Box에는 CHIP(Carboxyl terminus of Hsp70-interacting protein), Prp19(Precursor-mRNA splicing factor 19)와 같은 U-Box가 있다. 즉 U-Box는 E2-Ub과 결합하여 monomeric U-box 또는 Homodimeric U-Box의 E3에 결합한 기질단백질에 poly-Ub을 표지할 수 있다.
상기 monomeric U-box에 속하는 E4B의 경우 C-말단에 위치한 U-box 도메인이라 일컫는 활성 도메인(Catalytic domain)을 통해 E2-Ub와 결합하고, 표적단백질의 연쇄/다중 표지되는 poly-Ub화를 매개하는 역할을 한다.
상기 homodimeric U-box에 속하는 CHIP의 경우 helical 도메인을 통해 비 대칭적인 homodimer 형태가 유도된 뒤, C-말단에 U-box 도메인을 통해 특정 E2-Ub와 결합, 기질단백질에 poly-Ub화를 매개하는 역할을 한다.
상기 E2-Ub 및 E3 recruiter의 서열은 하기 표 2에 나타낸 바와 같으며, 상기 E4B에서 E2-Ub와 결합할 수 있는 U-box 도메인의 일부 단편화한 아미노산 서열은 하기의 표 2의 서열번호 15일 수 있다.
Figure PCTKR2022010589-appb-img-000002
E3 recruiter
본 발명에 따른 “E3 recruiter”는 RING E3s, 특히 CRLs의 기질 수용체(substrate receptor)에 있는 어댑터 결합 도메인(adaptor-binding domain)을 의미한다. 즉 기질수용체는 기질단백질 결합 도메인(substrate protein-binding domain)과 어댑터 결합 도메인의 2개의 도메인으로 구성되어 기질단백질을 E3에 결합하여 가깝게 위치하도록 하는 역할을 한다. CRLs에서는 또다른 단백질 subunit인 RING-Box protein이 E2-Ub와 결합하여 CRLs에 결합한 기질단백질에 poly-Ub화를 시킬 수 있다. 본 발명에서는 기질수용체 중에서 기질단백질 결합도메인은 제외한 어댑터 결합 도메인을 “E3 recruiter”로 정의한다.
이때, 기질 인식 도메인의 역할을 표적단백질 결합능이 있는 완전 이뮤노글로불린 형태의 세포침투 간섭항체가 대체할 수 있다. 따라서 항원 표적능을 가진 세포침투 간섭항체와 E3 recruiter를 융합하여 세포질로 전달하면, 세포질에 존재하는 다양한 원하는 단백질을 poly-Ub 표지 후, 프로테아좀에 의해 분해시켜 세포독성을 유도할 수 있다.
상기 E3 recruiter는 도3a의 표적 단백질에 따른 E3recruiter 탐색 전략 모식도에 따라 각 CRL에 따른 기질수용체는 69종 F-box, 17 종의 VHL, 180종의 BTB, 90 종의 DCAF, 39종의 SOCS 등이 있는데, 어댑터 결합도메인 만을 E3 recruiter로 이용하고자 이의 구조분석 및 rational design을 통해 Degrobody에 융합하여 각 표적 단백질별로 최적의 E3 recruiter를 탐색하여 Degrobody를 구축하고자 하였다. 도 3b는 기질수용체의 3차구조에서 어댑터 결합 도메인(E3 recruiter) 부분을 강조하여 나타낸 것이다.
본 발명자는 도3a에서 선택한 단편화된 E3 recruiter를 세포침투 간섭항체에 결합함으로써, 세포침투 분해항체를 완성하고자 하였으며, 이는 각각 CRL1 내지 5에 속하는 E3 recruiter에 해당하는 βTrCP 142-255, VHL152-213, SPOP 167-374, DDB2 61-114, SOCS2153-198로부터 선택된 것일 수 있다. 본 발명에서는 상기 CRLs에 속하며 "E3 recruiter"라 정의한 어댑터 결합 도메인의 일부 단편화한 아미노산 서열을 제공한다 (표 2 및 표 9 참조). 구체적으로, 상기 E3 recruiter는 발현양이 향상된 SOCS2153-198 변이체로서 서열번호 12 내지 16, 23 내지 34로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
링커 펩타이드
본 발명에 있어서 상기 U-Box 또는 E3 recruiter는 세포침투 간섭항체의 중쇄(heavy chain)의 N-말단 또는 C-말단, 경쇄(light chain)의 N-말단 또는 C-말단에 비절단 링커를 이용하여 융합되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 상기“융합”은 기능 또는 구조가 다르거나 같은 두 분자를 일체화하는 것으로, 상기 단백질, 소분자 약물, 핵산, 나노입자 또는 리포좀에 상기 종양 침투성 펩타이드가 결합할 수 있는 모든 물리, 화학적 또는 생물학적 방법에 의한 융합일 수 있다. 상기 융합은 바람직하게는 링커 펩타이드에 의할 수 있으며, 이 링커 펩타이드는 본 발명의 항체 각 도메인, 항체, 또는 이의 절편의 다양한 위치에서 상기 생체 활성 분자와의 융합을 중계할 수 있다.
본 발명에 있어서 링커 펩타이드는 세포침투 간섭항체와 U-Box 또는 E3 recruiter를 유전적으로 융합하는데 쓰이는 것을 의미한다. 상기 링커 펩타이드는 다양한 서열과 길이를 가질 수 있으며, 구조적으로 유연성 (flexibility) 및 단단함 (rigidity)이 다르거나, 무작위 (random loop) 또는 나선구조 (helical structure)의 2차 구조적 특징을 가질 수 있다 [Chen, et al., (2013), Adv Drug Deliv Rev, 65, 1357-1369]. 상기 링커 펩타이드는 단백질 가수분해 효소에 의해 잘리지 않으면서 구조적 유연성을 부여하는 GGGGS, (GGGGS)2, ASTKGP, ASTKGPSVFPLAP 서열 링커를 사용할 수 있다.
세포침투 분해항체
본 발명에 따른 “세포침투 분해항체”는 이뮤노글로불린 형태, 바람직하게는 완전한 이뮤노글로불린 형태로, 종양 조직 등의 표적 세포 표면에 과발현 되는 막단백질 수용체 등에 결합하여 내재화(endocytosis)된 후에 엔도좀 탈출(endosomal escape) 능력에 의해 세포질에 위치하고, 세포질 내에서 표적단백질 특이적으로 결합, 융합된 U-Box 또는 E3 recruiter에 의해 항체가 결합한 표적단백질에 E2-Ub 또는 E3가 가깝게 위치하여 표적단백질의 poly-Ub화를 유도하고, poly-Ub로 표지된 표적단백질은 프로테아좀에 의해 분해되어 제거한다.
또한 본 발명은 상기 세포침투 간섭항체와 U-Box 또는 E3 recruiter가 연결된 형태의 세포침투 분해항체의 폴리뉴클레오티드(Polynucleotide)를 제공한다.
상기 “폴리뉴클레오티드”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또한 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 기술한 세포침투 간섭항체와 U-Box 또는 E3 recruiter가 연결된 형태의 세포침투 분해항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(Complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함한다. 이는 당업계에 공지된 가혹 조건(Stringent conditions) 하에서, 예를 들어, 서열번호 6 내지 25 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다.
또한 상기 폴리뉴클레오티드는 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80 %의 상동성, 보다 바람직하게는 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %의 상동성, 가장 바람직하게는 96 %, 97 %, 98 %, 99 %의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.
항-β-catenin 세포침투 분해항체
본 발명의 일 실시예에 따르면, 항-β-catenin 세포침투 간섭항체는 종양 세포 또는 조직에 과발현되는 세포 표면의 막단백질 수용체에 특이적으로 결합하여 내재화(endocytosis) 된 후에 엔도좀 탈출(endosomal escape) 능력에 의해 세포의 세포질에 위치하고, 세포질의 표적단백질인 β-catenin에 결합하여 이의 기능을 저해하는 항체이다.
상기 항-β-catenin 세포침투 간섭항체에 U-Box 또는 E3 recruiter를 융합하여 구축한 “항-β-catenin 세포침투 분해항체”(세포침투 간섭항체 + U-box 또는 E3 recruiter)는 표적단백질인 β-catenin에 E2-Ub 또는 E3를 가깝게 위치하게 하여 poly-Ub화 시켜서 프로테아좀에 의해서 분해를 유도하게 한다.
세포침투 분해항체의 제조 방법
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 세포 내부로 침투하여 세포질에 분포하는 완전 이뮤노글로불린 형태의 항체와 E2-Ub recruiter 또는 E3 recruiter가 연결된 형태의 세포침투 분해항체의 제조방법의 예는 아래와 같다.
(1) β-catenin 표적능을 가지는 인간 항체의 중쇄가변영역(VH) 및 중쇄불변영역(CH1-hinge-CH2-CH3)이 포함된 중쇄와 상기 중쇄의 N-말단 또는 C-말단에 항체와 U-Box 또는 E3 recruiter가 연결된 핵산(Nucleic acids)을 클로닝한 항-β-catenin 중쇄 발현 벡터를 제조하는 단계;
(2) 세포질 침투능을 가지는 인간 항체의 경쇄가변영역(VL) 및 경쇄불변영역(CL)이 포함된 경쇄와 상기 경쇄의 N-말단 또는 C-말단에 항체와 U-Box 또는 E3 recruiter가 연결된 핵산(Nucleic acids)을 클로닝한 엔도좀 탈출 경쇄 발현 벡터를 제조하는 단계;
(3) 상기 제조된 중쇄, 경쇄 발현벡터를 단백질 발현용 동물세포에 동시 형질전환 하여 완전한 이뮤노글로불린 형태의 세포침투 분해항체를 발현하는 단계;
(4) 상기 발현된 세포침투 분해항체를 정제 및 회수하는 단계.
상기 벡터는 경쇄와 중쇄를 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환(co-transformation) 및 표적 형질전환(targeted transformation)을 통하여 숙주 세포로 도입될 수 있다.
상기 재조합 벡터에서 본 발명에서 제공하는 경쇄가변영역(VL), 및 경쇄불변영역(CL), 중쇄가변영역(VH), 중쇄불변영역(CH1-hinge-CH2-CH3), 및 인간 RNA 분해효소는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 “작동적으로 연결된(operatively linked)”은 뉴클레오티드 발현 조절 서열(예를 들면, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 따라서, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예를 들어, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점, CMV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공할 수 있다. 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, SP2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.
상기 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 삽입은, 당업계에 널리 알려진 삽입 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. E. coli 등의 미생물을 이용하는 경우 생산성은 동물세포 등에 비하여 높은 편이다. 미생물을 이용한 생산은 당화(glycosylation) 문제로 인해 인택트(intact)한 이뮤노글로불린 형태의 항체 생산에는 적당하지 않지만, Fab 및 Fv와 같은 항원 결합 단편의 생산에는 사용될 수 있다.
상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
본 발명에 있어서 “융합”은 기능 또는 구조가 다르거나 같은 두 분자를 일체화하는 것으로, 상기 단백질, 소분자 약물, 핵산, 나노입자 또는 리포좀에 상기 종양 침투성 펩타이드가 결합할 수 있는 모든 물리, 화학적 또는 생물학적 방법에 의한 융합일 수 있다. 상기 융합은 바람직하게는 링커 펩타이드에 의할 수 있으며, 이 링커 펩타이드는 본 발명의 항체 각 도메인, 항체, 또는 이의 절편의 다양한 위치에서 상기 생체 활성 분자와의 융합을 중계할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 U-box 또는 E3 recruiter가 융합된 세포침투 분해항체, 또는 이에 융합된 펩타이드 단백질, 소분자 약물, 핵산, 나노입자 및 리포좀으로 이루어진 군으로부터 선택된 생체활성분자를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 양상에서는 상기 U-box 또는 E3 recruiter가 융합된 세포침투 분해항체를 이용하여 암 또는 종양 세포의 성장을 억제시키는 방법 및 암 또는 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 암 또는 종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 조성물이 암 또는 종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 제조되는 경우, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 암 또는 종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 암 또는 종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 용어 "약학적 유효량"은 암 또는 종양을 예방 또는 치료하는 데, 충분한 양을 의미한다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 세포내부의 β-catenin을 특이적으로 결합하는 세포침투 간섭항체의 고안
본 발명에서는 항-β-catenin 세포침투 간섭항체(anti-β-catenin iMab) 개발을 위해 먼저 인간 β-catenin을 특이적으로 인지하는 인간 항체 중쇄가변영역(VH)을 Y바이오직스 (Y biologics사, 대한민국 대전 소재)에 비용을 지불하여 개발을 위탁하였다. Y바이오직스사는 파지(phage) 표면에 제시된 인간 VH 라이브러리에서 β-catenin을 항원으로 bio-panning을 통해 항-β-catenin VH를 선별하였다. 본 발명에서는 이 항-β-catenin VH를 활성화된 RAS 형태를 표적하는 세포침투 간섭항체(inRas37)의 (Shin, et al., (2020), Sci Adv, 6, eaay2174) 항-RAS VH와 치환하여 inBC0을 구축하였다. 하지만, inBC0의 동물세포 HEK293F시스템에서의 발현양(25.4 ±4.6 mg/L of transfected cells)이 낮아, inBC0의 인간 이뮤노글로불린항체의 framework(FR)4의 보존 영역과 동일한 서열을 갖도록 복귀 변위(back-mutaion)를 유도한 inBC2 항체를 제작함으로써 두 배가량 수율(43.2±5.6 mg/L of transfected cells)을 증가시켰다.
상기 항-β-catenin 세포침투 간섭항체(inBC0, inBC2)는 하기의 표2(세포 침투간섭항체 및 세포 침투 항체의 중쇄 가변영역 서열) 및 표3(세포 침투간섭항체 및 세포 침투 항체의 경쇄 가변영역 서열)에서 개시하고 있는 중쇄, 경쇄 발현 벡터를 일시적 트랜스팩션(Transient transfection)하여 단백질을 발현 및 정제하였다.
Figure PCTKR2022010589-appb-img-000003
Figure PCTKR2022010589-appb-img-000004
구체적으로 inBC0의 경우, 상기 표 3의 서열번호 17에 해당하는 중쇄가변 영역을 가지는 중쇄 발현 플라스미드와 상기 표 4의 서열번호 20에 해당하는 경쇄 발현 플라스미드를 이용하여 발현하였다. 또한 inBC2의 경우, 상기 표 3의 서열번호 18에 해당하는 중쇄가변 영역을 가지는 중쇄 발현 플라스미드와 상기 표 4의 서열번호 20에 해당하는 경쇄 발현 플라스미드를 이용하여 발현하였다. 진탕 플라스크에서, 무혈청 FreeStyle 293 발현 배지 (Invitrogen)에서 부유 성장하는 HEK293-F 세포 (Invitrogen)를 상기의 플라스미드 및 폴리에틸렌이민 (Polyethylenimine, PEI) (Polyscience)의 혼합물로 트랜스펙션하였다. 진탕 플라스크 (Corning)에 200ml 트랜스펙션 시, HEK293-F 세포를 2.0 Х 106 세포/ml의 밀도로 배지 100ml에 파종하여, 150rpm, 8% CO2, 37도에서 배양하였다. 항체를 생산하기 위해 알맞은 중쇄와 경쇄 플라스미드를 10ml FreeStyle 293 발현 배지에 중쇄 125 μg, 경쇄 125 μg 총 250 μg (2.5 μg/ml)으로 희석 및 필터하여, PEI 750 μg (7.5 μg/ml)을 희석한 10ml의 배지와 혼합하여 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후, 반응시킨 혼합배지를 앞서 100ml로 파종한 세포에 넣어 4시간 동안 150 rpm, 8% CO2, 37도에서 배양 후, 나머지 100ml의 FreeStyle 293 발현 배지를 추가하여 6일 동안 배양하였다.
표준 프로토콜을 참조하여 채취한 세포 배양 상등액으로부터 단백질을 정제하였다. 단백질 A 세파로오스 컬럼 (Protein A Sepharose column) (GE healthcare)에 항체를 적용하고 PBS (pH 7.4)로 세척하였다. 0.1 M 글라이신 완충액을 이용하여 pH 3.0에서 항체를 용리한 후 1 M Tris 완충액을 이용하여 샘플을 즉시 중화하였다. 용리한 항체 분획은 투석방법을 통해 Histidine (pH6.5)로 완충액을 교환하며 농축을 진행하였다. 정제된 단백질은 280nm 파장에서 흡광도와 흡광계수를 이용하여 정량하였다.
inBC2항체의 항-β-catenin에 대한 결합능을 평가하기 위해, Bio-Layer Interferometry (BLI) 시스템을 이용하여 분자간 결합을 정량적으로 측정하였다.
도 4는 inBC0와 inBC2의 항-β-catenin에 대한 결합능을 분석한 것이다. 구체적으로는 Octet QKe (ForteBio, USA) 기기를 사용하여 제조사가 제안한 프로토콜에 의하여 측정하였다. 구체적으로는, 10x 카이네틱 버퍼 (ForteBio, 18-1105)를 PBS에 희석하여 1x 카이네틱 버퍼를 준비한다. 항체를 1x 카이네틱 버퍼에 1μg/ml의 농도로 희석하여 준비하고, 정제한 β-catenin을 200, 100, 50, 25, 12.5 및 0nM의 농도로 1x 카이네틱 버퍼에 순차적으로 희석하여 각 200μl씩 빛이 통과하지 않는 불투명한 96-웰 플레이트에 넣어주었다. AHC (anti-human 이뮤노글로불린 Fc capture) 센서 칩이 1x 카이네틱 버퍼, 항체 희석 용액, 1x 카이네틱 버퍼, 항원 희석 용액, 1x 카이네틱 버퍼의 순서로 옮겨가면서 항체에 항원이 결합했다가 떨어질 때 발생하는 굴절률의 변화를 통해 항체의 항원 친화도(affinity)를 분석하였다. 친화도는 1:1 결합 모델로 Octet Data Analysis software 11.0으로 계산하였다.
Octet QKe를 이용하여 β-catenin에 대한 항-β-catenin 항체들의 친화도 분석 결과, β-catenin에 대한 inBC0의 친화도(KD)는 5.75nM로 나타났으며, inBC2의 친화도는 4.92nM로 나타났다. inBC2항체는 inBC0항체에 비해 발현양이 향상된 세포침투 간섭항체로써, β-catenin 항원 결합력의 변화가 없으므로, 본 발명에서는 inBC2를 세포침투 분해항체의 주형으로 이용하였다.
해당 실시예에서 사용된 재조합 항원단백질 β-catenin을 생산하기 위해 pET23m 벡터(Addgene)에 His8 - Avi-tag - β-catenin을 발현하도록 BamHⅠ, NotⅠ를 이용하여 클로닝하였다. 상기 pET23m His8 - Avi - β-catenin 발현 플라스미드와 pBirAcm(Avidity, USA) 플라스미드를 E. coli BL21(DE3)에 함께 형질전환 시킨 후, 34 μg/ml의 클로로암페니콜(chloramphenicol)과 100 μg/ml의 암피실린(ampicillin)이 포함된 LB 아가(agar) 고체 배지(LBCA)에 도말하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 형질전환체의 단일 콜로니를 채집 후, 34 μg/ml의 클로로암페니콜(chloramphenicol)과 100 μg/ml의 암피실린(ampicillin)이 포함된 SB 배지(SBCA) 5mL에 접종하고 18시간 배양하였다. 전배양액을 250ml의 34 μg/ml의 클로로암페니콜(chloramphenicol)과 100 μg/ml의 암피실린(ampicillin)이 포함된 LB 액체 배지에 OD 0.05의 초기접종 농도로 접종하여 본배양하고, 분광광도계(Thermo Scientific™, #51119200)로 OD600값을 측정하여 OD600 0.8에 도달한 시점에 0.5 mM IPTG(Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid), 50μM D-Biotin 농도가 되도록 첨가 후 20℃, 150 rpm에서 4시간동안 배양하여 발현을 유도하였다. 이후 4℃, 8000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 대장균 세포를 추출(harvest)하고, 20ml의 Tris-HCl pH8.0 버퍼(50mM Tris, 300mM NaCl, 1mM 2-mercaptoethatnol)로 현탁(resuspension)하여 초음파 세포 분쇄기(SONICS, #VCX 750)를 이용해 세포를 분쇄하였다. 이후 4℃, 15,000 x g에서 20분간 원심 분리하고, 0.45μm SFCA syringe filter(Sartorius, #16533-K)를 이용해 상층액을 여과(filtration)하여 분비된 단백질을 함유하는 배양 상층액을 얻었다. 50ml의 배양 상층액과 Ni-NTA 레진(GE healthcare, #)을 4℃, 1h 동안 결합시킨 후, 상기 혼합액을 컬럼(Thermo Scientific™, #29924)에 주입하였다. 혼합액을 여과한 후, 해당 칼럼에 30mM의 이미다졸(imidazole)이 포함된 Tris-HCl pH8.0 버퍼를 주입하여 비선택적으로 칼럼에 잔존해 있는 단백질을 용리시킨 후, 300mM의 이미다졸(imidazole)을 포함하는 elution buffer를 칼럼에 주입하고, 1분간 정치 후, 비오티닐화된 β-catenin 단백질을 용리시켰다. 정제된 비오티닐화된 β-catenin 대하여 Centrifugal Filters (Satorious, #VS2022)을 이용해 최종 완충액(2mM DTT containing PBS, pH 7.4)으로 이미다졸을 투석하였다. 상기 과정을 통해 정제된 단백질은 280nm 파장에서 흡광도와 흡광계수를 이용하여 정량하였다.
실시예 2. U-Box 또는 E3 recruiter가 융합된 항-β-catenin 세포침투 분해항체 (inBC2-E3 recruiter)의 구축.
세포의 세포질에 침투하여 β-catenin을 특이적으로 인식하는 세포침투 간섭항체inBC2에 세포 내 단백질 분해 시스템인 UPS의 E2-Ub E2-ubiquitin conjugate)에 결합할 수 있는 E3의 U-Box 또는 E3와 결합할 수 있는 E3 recruiter(E3 recruiting ligand)를 융합함으로써, 세포질 침투 후에 U-Box는 세포질의 E2-Ub와 결합하여(recruiting) E2-Ub가 표적단백질에 가깝게 위치하도록 하여 표적단백질을 poly-Ub화 시키고, E3 recruiter는 E3와 결합하여(recruiting) E3가 표적단백질에 가깝게 위치하도록 하여 표적단백질에 poly-Ub화을 유도하여, 궁극적으로 UPS에 의해서 표적단백질 분해를 유도하는 세포침투 분해항체를 개발하고자 하였다.
구체적으로는 inBC2의 세포질 내 β-catenin의 최적의 분해를 위하여 E2-Ub와 결합할 수 있는 U-box 또는 E3와의 결합을 위한 E3 recruiter에 대하여 탐색과 개량을 거친 후, 선별된 U-Box 또는 E3 recruiter에 대하여 융합 위치 및 연결 linker를 최적화하였다.
도 5a는 inBC2와 inBC2-E2-Ub recruiter(E4B1227-1302, IpaH254-545) 및 inBC2-E3 recruiter(VHL152-213)의 구축을 설명한 모식도이다. 본 발명은 총 3종의 E2-Ub recruiter 및 E3 recruiter를 선정하여 inBC2의 경쇄 C-말단에 (G4S)2 링커(G10)를 이용하여 융합하였다. inBC2에서 중쇄가변영역의 서열은 서열번호 18이고, 경쇄가변영역의 서열은 서열번호 20이다. 또한 inBC2-(G10)-E4B1227-1302는 상기 inBC2의 경쇄 C-말단에 서열번호 10의 개조된 U-box 도메인이 융합된 형태이다. inBC2-(G10)-IpaH254-545는 상기 inBC2의 경쇄 C-말단에 Shigella spp.에서 유래된 E2-유비퀴틴 복합체와 결합하는 활성 도메인만을 단편화한 서열번호 11의 개조된 IpaH254-545가 융합된 형태이다. inBC2-(G10)-VHL152-213은 상기 inBC2의 경쇄 C-말단에 서열번호 12의 E3 recruiter가 융합된 형태이다. 상기 방법으로 inBC2의 경쇄 C-말단에 E2-Ub recruiter 또는 E3 recruiter를 융합하여, β-catenin 분해를 유도하여 종양 성장 억제 효과를 나타낼 수 있는 세포침투 분해항체를 발현 및 정제하였다.
구체적으로는, 완전 이뮤노글로불린 형태의 단일클론항체 경쇄 C-말단에 E2-Ub recruiter 또는 E3 recruiter를 융합한 형태로 생산하기 위한 경쇄 발현벡터를 구축하기 위해 5’말단에 분비 시그널 펩타이드를 코딩하는 DNA가 융합된 integrin 수용체 표적 원형펩타이드가 융합된 세포질 침투 경쇄 가변영역(hT4-59 VL, 서열번호 20)과 경쇄 불변영역(CL)을 포함하는 경쇄의 C-말단에 GGGGSGGGGS 링커(G10)를 이용하여 총 3종의 E2-Ub recruiter 및 E3 recruiter를 융합하고 이를 코딩하는 DNA를 각각 pcDNA3.4 (Invitrogen)벡터에 NotI/HindIII로 클로닝하였다. 또한, 중쇄를 발현하는 벡터를 구축하기 위해 5’말단에 분비 시그널 펩타이드를 코딩하는 DNA가 융합된 항체의 중쇄 가변영역(BCO-VH, 서열번호 17)과 중쇄 불변영역 (CH1-hinge-CH2-CH3)를 포함하는 중쇄를 코딩하는 DNA를 각각 pcDNA3.4 (Invitrogen) 벡터에 클로닝하였다.
상기 경쇄, 중쇄 발현 벡터를 일시적 트랜스팩션(Transient transfection)을 이용하여 단백질을 발현 및 정제하였다. 진탕 플라스크에서, 무혈청 FreeStyle 293 발현 배지 (Invitrogen)에서 부유 성장하는 HEK293-F 세포 (Invitrogen)를 플라스미드 및 폴리에틸렌이민 (Polyethylenimine, PEI) (Polyscience)의 혼합물로 트랜스펙션하였다. 진탕 플라스크 (Corning)에 200ml 트랜스펙션 시, HEK293-F 세포를 2.0 × 106 세포/ml의 밀도로 배지 100ml에 파종하여, 150rpm, 8% CO2, 37도에서 배양하였다. 항체를 생산하기 위해 알맞은 중쇄와 경쇄 플라스미드를 10ml FreeStyle 293 발현 배지에 중쇄 125 μg, 경쇄 125 μg 총 250 μg (2.5 μg/ml)으로 희석 및 필터하여, PEI 750 μg (7.5 μg/ml)을 희석한 10ml의 배지와 혼합하여 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후, 반응시킨 혼합배지를 앞서 100ml로 파종한 세포에 넣어 4시간 동안 150 rpm, 8% CO2, 37도에서 배양 후, 나머지 100ml의 FreeStyle 293 발현 배지를 추가하여 6일 동안 배양하였다.
표준 프로토콜을 참조하여 채취한 세포 배양 상등액으로부터 단백질을 정제하였다. 단백질 A 세파로오스 컬럼 (Protein A Sepharose column) (GE healthcare)에 항체를 적용하고 PBS (pH 7.4)로 세척하였다. 0.1 M 글라이신 완충액을 이용하여 pH 3.0에서 항체를 용리한 후 1 M Tris 완충액을 이용하여 샘플을 즉시 중화하였다. 용리한 항체 분획은 투석방법을 통해 Histidine (pH6.5)로 완충액을 교환하며 농축을 진행하였다. 정제된 단백질은 280nm 파장에서 흡광도와 흡광계수를 이용하여 정량하였다. 구체적인 inBC2, inBC2-E2-Ub recruiter 및 inBC2-E3 recruiter 3종의 생산 수율은 하기 표 5에 나타내었으며, 구체적인 실험을 통해 상기 3종의 생산 수율이 inBC2와 비교하여 소폭 감소하거나 유지되는 결과를 확인하였다.
Figure PCTKR2022010589-appb-img-000005
실시예 3. 항-β-catenin 세포침투 분해항체의 물성 평가.
도 5b는 상기 도 5a의 inBC2와 inBC2-E2-Ub recruiter 및 inBC2-E3 recruiter 3종의 정제 후 환원성 또는 비환원성 조건에서 12% SDS-PAGE를 통해서 분석한 것이다. 구체적으로는, inBC2는 비환원성 조건에서 약 150kDa의 분자량을 확인하였으며, 환원성 조건에서 중쇄 50kDa의 분자량 및 경쇄 25kDa의 분자량을 보여주었다. (G4S)2 링커를 이용하여 E4B1227-1302를 연결한 inBC2-(G10)-E4B1227-1302는 50kDa의 중쇄, 34kDa의 경쇄에서 밴드가 관찰되었다. (G4S)2 링커를 이용하여 IpaH 254-545를 연결한 inBC2-(G10)-IpaH 254-545는 50kDa의 중쇄, 58kDa의 경쇄에서 밴드가 관찰되었다. (G4S)2 링커를 이용하여 VHL152-213을 연결한 inBC2-(G10)-VHL152-213는 50kDa의 중쇄, 33kDa의 경쇄에서 밴드가 관찰되었다. 이는 상기 3종의 항체가 용액 상태에서 단일체로 존재하며, 비자연적 이황화 결합을 통해 이중체 또는 올리고머를 형성하지 않음을 보여준다.
도 5c는 inBC2와 inBC2-E2-Ub recruiter 및 inBC2-E3 recruiter 3종의 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 280nm에서의 mAU 값을 나타낸 그래프이다. 구체적으로, inBC2, inBC2-(G10)-E4B 1227-1302, inBC2-(G10)-IpaH 254-545, inBC2-(G10)-VHL152-213을 1mg/ml의 농도로 45μl 준비한 후 인서트에 넣어 샘플을 준비하였다. 150mM sodium phosphate, 137Mm NaCl pH 7.0 버퍼를 1.0ml/min의 유속으로 흘려 주어 압력과 280nm에서의 mAU 값이 안정화될 때까지 기다려 준비하였다. 이후 준비된 샘플을 동일 유속으로 20μl 로딩하여 30분 동안의 280nm 에서의 mAU 값을 측정하였다. IpaH254-545 또는 U-box 또는 E3 recruiter가 융합됨에 따라 분자량이 증가하여 inBC2보다 빠른 시간에 피크가 관찰되었다. inBC2-(G10)-VHL152-213, inBC2-(G10)-IpaH254-545 순으로 올리고머 및 태일링 없이 단일 피크가 관찰되었지만, inBC2-(G10)-E4B1227-1302는 그렇지 않았다. 따라서, inBC2-E2-Ub recruiter 및 inBC2-E3 recruiter 3종 중 inBC2와 유사한 생산 수율[표 5] 및 물성을 갖는 inBC2-(G10)-VHL152-213을 선정하여 이후 실험을 진행하였다.
실시예 4. inBC2-VHL152-213 링커 변이체의 구축 및 발현, 정제.
최종 E3 recruiter로 선정된 VHL을 상기 경쇄 C-말단에 (G4S)2 링커를 이용하여 융합한 것과 달리 다른 펩타이드 링커를 사용하여 새로운 inBC2-VHL152-213 링커 변이체 3종을 구축하였다. inBC2-VHL152-213 링커 변이체 4종 중 어떤 클론이 E3를 β-catenin에 가깝게 위치하도록 하여 Ub을 잘 전달할 수 있을지의 여부를 구조 모델링을 통해 예측하였다. 이미 밝혀진 항체 구조(PDB ID: 5UR8), β-catenin 구조(PDB ID: 1JPW), VHL, EloBC, Cul2, Rbx1으로 구성된 E3 구조(PDB ID: 5N4W, 4WQO)를 견본으로 하여 Chimera 프로그램을 통해 예측하였다. 모델링 결과 약 13Å 정도 길이의 링커를 사용하여 항체 경쇄 C-말단에 VHL을 융합하였을 때 활성 도메인인 Rbx1과 표적 단백질인 β-catenin 사이의 거리가 Ub전달에 유리하다고 알려진 50Å 정도가 되는 것을 확인하였다. 따라서, 추가적인 링커 없이 VHL152-213에 내재된 152-158 아미노산(TLPVYTL)으로 이루어진 유연성이 있는 15Å 길이의 루프를 링커로 사용하여 연결한 inBC2-VHL152-213이 최적의 베타-카테닌 분해능을 가질 것이라고 예측하였다.
inBC2-VHL152-213 링커 변이체 4종을 상기 실시예 2와 동일하게 발현 및 정제하였다. 상기 4종의 inBC2-VHL152-213 링커 변이체의 구체적인 생산 수율은 하기 표 6에 나타내었다.
Figure PCTKR2022010589-appb-img-000006
경쇄 C-말단에 GGGGS 링커로 VHL152-213을 연결한 inBC2-(G5)-VHL152-213는 기존의 inBC2와 비교하여 생산 수율이 소폭 감소하는 결과를 확인하였다. 또한 경쇄 C-말단에 ASTKGP 링커로 VHL152-213을 융합한 inBC2-(A6)-VHL152-213는 비자연적 이황화 결합을 통한 올리고머를 형성하는 것을 확인하였다.
실시예 5. inBC2-VHL152-213 링커 변이체의 β-catenin 분해능 평가.
inBC2-VHL152-213 링커 변이체 4종이 세포 내에서 특이적으로 Cul5 기반의 E3를 β-catenin으로 동원하여 β-catenin 분해 활성을 나타내어 β-catenin의 양이 감소하는지를 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 구체적으로, 12웰 플레이트에 β-catenin이 축적되어있는 대장암 세포주를 웰 당 1.0x105 개를 1ml에 희석하여 24~48시간 37도, 5% CO2 조건에서 배양한 후, inBC2-VHL152-213과 대조군 항체 4종 (inBC2, inCT-VHL, inBC2(AAA)-VHL, inBC2-VHL152-213(V181G, D187K))을 각각 2μM의 양으로 37도, 5% CO2 조건에서 12시간 동안 처리하였다. 이후 배지를 제거하고 약산성용액(200Mm Glycine, 150mM NaCl, pH 3.0)으로 세포 표면에 붙은 단백질들을 제거하고 PBS로 세척하였다. 세포 용해 버퍼 (10mM Tris-HCl pH 7.4, 100mM NaCl, 1% SDS, 1mM EDTA, protease inhibitors)를 이용하여 세포를 용해시킨다. 세포 용해물을 정량한 후 항 β-catenin 항체와 항 베타-액틴 항체를 이용해 웨스턴 블랏을 수행하였다. 이후 각 샘플 밴드를 Image J software(National Institutes of Health, USA)를 이용하여 정량화하였다. 각 샘플의 β-catenin 정도/베타-액틴 정도 비율을 계산하고, 비히클 샘플에 대해 백분율 값으로 정상화(normalization)하였다.
그 결과, 도 5d에 나타난 바와 같이, 약 35Å 길이의 링커를 사용하여 VHL을 융합한 항체(inBC2-(G10)-VHL152-213)는 기존 항-β-catenin 항체(inBC2)와 비교하여 8%의 낮은 β-catenin 분해능을 나타냈다. 약 18Å 길이의 유연성이 높은 링커를 사용한 inBC2-(G5)-VHL152-213은 inBC에 비해 5%의 가장 낮은 β-catenin 분해 활성이 나타나는 것을 확인하였다. 약 17Å 길이와 강직성(rigidity)을 가질 것으로 생각되는 링커를 사용한 inBC2-(A6)-VHL152-213은 inBC2와 비교하여 25%의 상대적으로 높은 β-catenin 분해능을 나타냈다. 추가적인 링커 없이 가장 높은 강직성으로 VHL152-213이 항체 경쇄 C-말단에 연결된 inBC2-VHL152-213은 inBC2에 비해 36%의 상대적으로 높은 β-catenin 분해 활성을 가졌다. 서로 다른 링커의 종류에 따라 β-catenin에 대한 분해능이 달라질 수 있음을 확인하였다. 또한 본 발명의 일 실시예에서 모델링을 통해 예측한대로, 추가적인 링커 없이 VHL152-213에 내재된 152-158 아미노산(TLPVYTL)으로 이루어진 유연성이 있는 15Å 길이의 루프를 링커로 사용하여 VHL을 연결한 inBC2-VHL152-213이 최적의 β-catenin 분해능을 가짐을 확인하였다.
실시예 6. inBC2-VHL152-213 링커 변이체의 세포 성장 억제 평가.
inBC2-VHL152-213 링커 변이체의 β-catenin 분해능에 따라 in vitro 상에서 β-catenin이 축적된 대장암 세포주의 성장을 억제할 수 있는지 확인하기 위해 세포 성장 저해 정도를 평가하였다.
도 5e는 대장암 세포주 HCT116에 inBC2 및 inBC2-VHL152-213 링커 변이체 4종 및 Wnt 신호전달경로에 작용해 β-catenin의 전사 활성을 억제하는 iCRT14(inhibitor of β-catenin-responsive transcription 14)을 양성 대조군(positive control)으로 처리하여 세포 성장 저해 정도를 in vitro에서 평가하여 그래프로 도식화한 것이다. 구체적으로, 96웰 플레이트에 웰 당 1x103 개의 HCT116 세포를 각각 10% FBS가 포함된 배지 0.1ml에 희석하여 37도, 5% CO2 조건에서 48시간동안 배양하였다. 이후 inBC2 및 inBC2-VHL152-213 링커 변이체 4종, iCRT14을 각각 2μM, 20μM의 양으로 37도, 5% CO2 조건에서 48시간동안 처리하였다. 세포 수 변화는 CellTiter Glo (CTG) assay를 통해 측정하였다. 구체적으로는 48시간 처리 후, CTG 용액 (Promega, #G7572) 70μl를 각 웰에 첨가하고 실온에서 10분간 반응하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해물의 luminescence를 측정하고, 비히클 군에 대한 백분율 값으로 세포 생존율을 구하였다 inBC2-VHL152-213 링커 변이체 4종 중 inBC2-VHL152-213이 약 30% 수준의 가장 높은 세포 성장 억제 효과를 보였다. 따라서, inBC2-VHL152-213 링커 변이체 4종 중 inBC2와 유사한 생산 수율 및 물성을 가지며, 가장 높은 β-catenin 분해능 및 세포 성장 억제능을 갖는 추가적인 링커 없이 VHL이 연결된 inBC2-VHL152-213를 최종 포맷으로 선정하였다.
실시예 7. inBC2-VHL152-213의 작용 기전을 규명하기 위한 대조군 항체의 구축 및 물성 평가.
도 6a는 inBC2-VHL152-213의 구체적인 작용 기전을 규명하기 위해 inBC2-VHL152-213과 필요한 대조군 항체들의 모식도이다. β-catenin 표적 능이 없는 중쇄가변영역(서열번호 19)을 갖는 것을 제외하고는 inBC2-VHL152-213과 동일한 성분을 갖는 inCT-VHL152-213을 β-catenin 표적화 대조군으로서 구축하였다. inBC2(AAA)-VHL152-213은 경쇄가변영역에 위치한 엔도좀 탈출 모티프 92WYW94 아미노산을 92AAA94로 대체하여 엔도좀 탈출능을 상실하여 세포질에 위치할 수 없는 대조군 항체이다. inBC2(AAA)-VHL152-213에서 경쇄가변영역의 서열은 서열번호 21과 같다. VHL152-213 융합 대조군으로서 VHL 돌연변이체(V181G, D187K)를 융합한 inBC2-VHL152-213(V181G, D187K)를 사용하였다. VHL(V181G)과 VHL(D187K) 단일 돌연변이체 2종이 Cul2와의 상호 작용이 감소되는 것으로 보고되어 있기 때문에 [Nguyen, et al., (2015), Structure, 23, 441-449] 돌연변이체 2종을 융합하여 새로운 VHL 돌연변이체(V181G, D187K)를 구축하여 항체 경쇄 C-말단에 융합하였다. inBC2-VHL152-213(V181G, D187K)는 Cul2를 기반의 E3를 β-catenin으로 동원할 수 없을 것으로 예상하였다. inBC2-VHL152-213152-213 및 변이형인 inBC2-VHL152-213152-213 (V181G, D187K)의 E3 recruiter는 inBC2의 경쇄 C-말단에 융합되었으며, 구체적인 상기 E3 recruiter의 서열은 하기 표 7에 나타내었다.
Figure PCTKR2022010589-appb-img-000007
도 6b는 대조군 항체 4종과 inBC2-VHL152-213을 상기 실시예 2와 동일한방법으로 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 280nm에서의 mAU 값을 나타낸 그래프이다. 대조군 항체 4종과 inBC2-VHL152-213 모두 단일 피크를 나타냈고, 이중체나 올리고머를 형성하지 않음을 확인하였다.
실시예 8. inBC2-VHL152-213의 세포 내의 β-catenin과 Cul2와의 특이적 결합 평가.
도 6c는 inBC2-VHL152-213의 작용 기전을 명확히 규명하기 위해 inBC2-VHL152-213이 실제로 세포 내로 위치하여 β-catenin을 표적함과 동시에 융합된 VHL을 이용하여 Cul2 기반의 E3와도 결합할 수 있는지를 면역침강법으로 확인한 결과이다. 구체적으로는, 100mm3 플레이트에 β-catenin이 축적되어있는 대장암 세포주 SW480을 5x106 개를 10ml에 희석하여 24시간, 37도, 5% CO2 조건에서 배양한 후, inBC2-VHL152-213과 대조군 항체인 inCT-VHL152-213, inBC2-VHL152-213(V181G, D187K)를 각각 2μM의 양으로 37도, 5% CO2 조건에서 12시간 동안 처리하였다. 이후 배지를 제거하고 약산성용액(200Mm Glycine, 150mM NaCl, pH 3.0)으로 세포 표면에 붙은 단백질들을 제거하고 PBS로 세척하였다. 세포 용해 버퍼 (20mM Tris-HCl pH 7.4, 150mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 0.05% SDS, 1mM EDTA, protease inhibitors)를 이용하여 세포를 용해시킨 후, 세포 잔해물을 침전시켜 제거한다. 이후 세포 용해물에 항 인간 Fc 항체(Sigma, #A9544)와 반응시킨 Protein A 아가로스를 첨가하여 2시간 반응시킨 후, 항체를 침강시킨다. 이후 항 β-catenin 항체(Cell signaling, #9582S), 항 Cul2 항체(Santa cruz, #sc-166506), 항 인간 Fc 항체, 항 베타-액틴 항체(Santa cruz, #sc-69879)를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과, 도 6c에 나타난 바와 같이, inBC2-VHL152-213에서만 β-catenin과 Cul2가 모두 관찰된 반면, inCT-VHL152-213은 Cul2만, inBC2-VHL152-213(V181G, D187K)는 β-catenin만 관찰되었다. 상기 실험 결과로 대조군 항체들과 달리 inBC2-VHL152-213만 세포 내의 β-catenin과 Cul2와 동시에 결합하는 것을 확인하였다.
실시예 9. inBC2-VHL152-213의 세포 내의 β-catenin 분해능 평가.
inBC2-VHL152-213이 특이적으로 세포 내의 β-catenin 분해 활성을 나타내는지 확인하기 위해 대조군 항체 4종을 포함하여 β-catenin의 양의 감소를 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 구체적으로는 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 실험을 진행하였다.
그 결과, 도 7a에서 나타난 바와 같이, 대장암 세포주 3종 (SW480, DLD-1, HCT116)에서 inBC2-VHL152-213은 inBC2에 비해 평균적으로 20% 수준의 β-catenin 분해 활성을 가짐을 확인하였다. 반면, β-catenin을 표적화 할 수 없는 대조군 항체인 inCT-VHL152-213의 경우 기존 inBC2와 유사하게 β-catenin 분해 활성을 보이지 않았다. 또한, 엔도좀 탈출능을 상실하여 세포질에 위치할 수 없는 대조군 항체인 inBC2-(AAA)-VHL152-213의 경우에도 β-catenin 분해 활성을 보이지 않았다.
실시예 10. 농도와 시간에 따른 inBC2-VHL152-213의 세포 내의 β-catenin 분해능 평가.
inBC2-VHL152-213의 β-catenin 분해 활성을 더 자세히 규명하기 위해 농도 및 시간 조건에 따라 웨스턴 블랏을 진행하였다. 도 7b는 β-catenin이 축적되어 있는 대장암 세포주 DLD-1에서 대조군 항체 4종과 inBC2-VHL152-213을 각각 0.5μM과 2μM의 양으로 37도, 5% CO2 조건에서 12시간 동안 처리하여 β-catenin의 양을 확인한 웨스턴 블랏 결과이다. 구체적으로는 상기 실시예 5와 같은 방법으로 실험을 진행하였다. inBC2-VHL152-213 2μM을 처리한 샘플에서만 15% 정도의 β-catenin 분해 활성을 확인하였다.
도 7c는 대장암 세포주 DLD-1에서 inBC2와 inBC2-VHL152-213 2μM을 각각 4,8,12시간 동안 37도, 5% CO2 조건에서 처리한 후 β-catenin의 양을 확인한 웨스턴 블랏 결과이다. 구체적으로는 상기 실시예 5와 같은 방법으로 실험을 진행하였다. inBC2-VHL152-213이 4~12시간 동안 세포질 내부에 존재하여 평균적으로 25% 수준의 β-catenin 분해 활성을 가질 수 있음을 확인하였다.
실시예 11. inBC2-VHL152-213의 β-catenin poly-Ub화 평가.
상기 실시예 8 내지 10을 통해 inBC2-VHL152-213이 Cul2 기반의 E3를 동원하고, 이를 통해 β-catenin이 분해되는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 inBC2-VHL152-213의 작용 기전으로, 동원된 E3를 통해 β-catenin을 poly-Ub화하여 프로테아좀에 의해 분해시키는지를 확인하고자 웨스턴 블랏을 수행하였다. 구체적으로, HCT116에 Cullin 활성 저해제 MLN4924(Sigma, #5.05477.0001) 0.5μM 또는 프로테아좀 활성 저해제 Bortezomib(Sigma, #5.04314.0001) 5μM을 30분간 처리한 후, 용액을 제거하고 배지로 세척하였다. 이후, inBC2와 inBC2-VHL152-213을 2μM의 양으로 37도, 5% CO2 조건에서 12시간 동안 처리하였다. 이후 과정은 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 실험을 진행하였다.
그 결과, 도 8a에서 나타난 바와 같이, Cullin 활성 저해제, 프로테아좀 활성 저해제 없이 inBC2-VHL152-213을 단독으로 처리한 군에서만 평균적으로 30%의 β-catenin 양 감소를 확인하였다. 활성 저해제를 처리하고, inBC2-VHL152-213을 처리한 샘플에서는 β-catenin의 양이 감소하지 않았다. 상기 실험 결과를 통해 inBC2-VHL152-213이 Cul2 기반의 E3를 동원하여 β-catenin을 프로테아좀을 통해 분해시키는 것을 확인하였다.
다음으로, 본 발명은 면역침강법을 이용해 inBC2-VHL152-213의 작용 기전 중 β-catenin의 poly-Ub화를 확인하고자 하였다. 구체적으로는, 100mm3 플레이트에 DLD-1을 5x105 개를 10ml에 희석하여 37도, 5% CO2 조건에서 24시간동안 배양하였다. 이후, 프로테아좀 활성 저해제 Bortezomib 5μM을 30분간 처리한 후, 용액을 제거하고 배지로 세척하였다. inBC2-VHL152-213 또는 대조군 항체를 각각 2μM의 양으로 37도, 5% CO2 조건에서 12시간 처리하였다. 세포 용해까지의 실험 과정은 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 수행하였다. 이후 세포 용해물에 항 β-catenin 항체와 반응시킨 Protein A 아가로스를 첨가하여 2시간 반응시킨 후, β-catenin을 침강시킨다. 이후 항 K-48 폴리 유비퀴틴 항체(sigma, #05-1307)와 항 β-catenin 항체를 이용해 웨스턴 블랏을 수행하였다.
도 8b는 Bortezomib과 inBC2-VHL152-213을 각각 처리한 것과 처리하지 않은 4가지 샘플을 항 K-48 폴리 유비퀴틴 항체를 이용하여 분석한 웨스턴 블랏 결과이다. Bortezomib과 inBC2-VHL152-213을 모두 처리한 군에서만 K-48 폴리유비퀴틴화된 β-catenin 밴드가 나타나는 것을 확인하였다.
도 8c는 Bortezomib을 모두 처리한 조건에서 대조군 항체 2종 (inBC2, inBC2-VHL152-213(V181G, D187K))을 포함하여 inBC2-VHL152-213의 β-catenin poly-Ub화를 항 K-48 poly- Ub 항체를 이용하여 평가한 웨스턴 블랏 결과이다. 웨스턴 블랏으로 관찰되는 전체 밴드 세기를 정량하여 비교 시, 대조군 항체 2종에 비해 inBC2-VHL152-213을 처리한 샘플에서 K-48 poly-ub chain이 표지된 β-catenin이 가장 많이 존재함을 확인하였다.
본 발명은 상기 도 8a 내지 c를 통해 inBC2-VHL152-213이 Cul2 기반의 E3를 β-catenin으로 동원하고, β-catenin으로 Ub을 전달하여 K-48 poly-Ub chain을 형성해 프로테아좀에 의해 분해되는 작용 기전을 규명하였다.
실시예 12. inBC2-VHL152-213의 세포 성장 억제 평가.
inBC2-VHL152-213의 β-catenin 분해능에 따라 in vitro 상에서 대장암 세포주의 성장을 억제할 수 있는지 확인하기 위해 세포 성장 저해 정도를 평가하였다.
구체적으로, 3종의 대장암 세포주에 대조군 항체 4종(inBC2, inCT-VHL152-213, inBC2(AAA)-VHL152-213, inBC2-VHL152-213(V181G, D187K))과 inBC2-VHL152-213을 처리하여 세포 성장 저해 정도를 in vitro에서 평가하여 그래프로 도식화한 것이다. 구체적으로는 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 대장암 세포주 3종에서 모두 대조군 항체 4종과 비교하여 inBC2-VHL152-213만 inBC2 대비하여 약 25% 수준의 유의미한 세포 성장 억제 효과를 보였다.
실시예 12. 종양 조직 integrin 특이적 inBC2-VHL152-213의 종양 성장 저해능 평가.
도 9를 통해 확인한 in vitro 상에서의 세포 성장 억제 효과가 생체 내에서도 종양 성장 억제를 통해 나타날 수 있는지 확인하기 위해, integrin이 과발현된 대장암 세포주 SW480을 이종이식한 쥐를 이용하여 inBC2-VHL152-213의 종양 성장 저해능을 평가하였다.
구체적으로, BALB/c 누드 마우스에 integrin 과발현 인간 대장암 세포주인 SW480을 마우스 당 5x106 개의 세포를 피하주사로 주입시켰고, 종양의 부피가 약 100~120mm3 정도가 되었을 때, 동일 부피의 대조군 inBC2, inBC2(AAA)-VHL152-213, inBC2-VHL152-213(V181G, D187K), 실험군 inBC2-VHL152-213을 20mg/kg으로 정맥 주사하였다. 일주일에 2번 총 6회 정맥 주사하였고, 캘리퍼(Caliper)를 이용하여 종양 부피를 측정하였으며, 크기 등을 관찰하였다.
그 결과, 도 10a에 나타난 바와 같이, 대조군 항체 4종에 비해 inBC2-VHL152-213이 암세포 성장을 유의미하게 억제하는 것을 확인하였다. 도 10b는 적출된 종양의 무게를 통해 inBC2-VHL152-213이 종양 성장을 유의미하게 억제하는 것을 나타낸다. 또한, 도 10c는 적출된 종양의 크기를 통해 inBC2-VHL152-213이 종양 성장을 유의미하게 억제하는 것을 나타낸다. 도 10d에서 나타난 바와 같이, inBC2-VHL152-213 실험군 마우스의 체중 변화가 없는 것을 확인하였으며, 이에 따라 비 특이적 독성은 없음을 확인하였다. 도 10e는 적출된 종양에서 inBC2-VHL152-213의 β-catenin 분해능을 확인한 웨스턴 블랏 결과이다.
구체적으로는 대조군 3그룹(inBC2, inBC2(AAA)-VHL152-213, inBC2-VHL152-213(V181G, D187K))과 inBC2-VHL152-213실험군의 각 마우스에서 종양을 적출하였다. 적출된 종양을 약 1-2 mm 직경의 조각으로 자르고, 세포 용해 버퍼를 3-400μl를 넣어 종양 조직을 분쇄하였다(homogenized). 이후 웨스턴 블랏 실험은 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 진행하였다.
도 10e에 나타난 바와 같이, 대조군 그룹과 비교하여 inBC2-VHL152-213을 처리한 마우스의 종양을 분석한 샘플에서 평균적으로 약 26%의 β-catenin 분해능을 확인하였다.
실시예 13. 여러 종류의 CRLs에 속하는 E3 recruiter를 융합한 inBC2-E3 recruiter의 발현 및 정제.
상기 실험 결과들을 종합하여 inBC2-VHL152-213이 약 25%의 β-catenin 분해능을 나타내는 것을 확인하였다. 본 발명은 보다 향상된 β-catenin 분해능을 갖는 E3 recruiter 탐색을 위해, CRLs에 속하는 또다른 E3 recruiter 4종이 결합된 inBC2-E3 recruiter를 새롭게 구축하였다. inBC2-βTrCP142-255, inBC2-SPOP167-374, inBC2-DDB261-114, inBC2-SOCS2153-198는 상기 inBC2의 경쇄 C-말단에 각각 서열번호 13 내지 16의 개조된 E3 recruiter가 융합된 형태이다. 구체적으로는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 inBC2 및 상기 5종의 inBC2-E3 recruiter의 발현 및 정제를 진행하였다. 상기 inBC2 및 상기 5종의 inBC2-E3 recruiter의 구체적인 생산 수율을 하기 표 8에 나타내었다.
Figure PCTKR2022010589-appb-img-000008
상기 inBC2-E3 recruiter 4종의 생산 수율이 inBC2와 inBC2-VHL152-213과 비교하여 감소하는 결과를 확인하였다. 특히 생산 수율이 5mg/1L로 대폭 감소한 클론 3종(inBC2-βTrCP142-255, inBC2-SPOP167-374, inBC2-DDB261-114)은 이후 실험에서 제외하였다.
실시예 14. inBC2-VHL152-213152-213, inBC2-SOCS2153-198의 물성 평가.
도 11a는 inBC2 및 inBC2-E3 recruiter 2종(inBC2-VHL152-213, inBC2-SOCS2153-198)을 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 280nm에서의 mAU 값을 나타낸 그래프이다. 구체적으로는 상기 실시예 3와 동일한 방법으로 분석을 진행하였다. SOCS2153-198가 융합됨에 따라 분자량이 커져 단일클론항체 inBC2보다 빠른 시간에 피크가 관찰되었다. 정상적인 단일 피크를 나타내는 inBC2-VHL152-213과 달리, inBC2-SOCS2153-198는 약간의 태일링과 올리고머가 관찰되었다.
실시예 15. inBC2-VHL152-213152-213, inBC2-SOCS2153-198의 β-catenin 분해능 평가.
inBC2-SOCS2153-198가 Cul5 기반의 E3를 β-catenin으로 동원하여 세포 내의 β-catenin 분해 활성을 나타내는지를 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다. 구체적으로는 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 실험을 진행하였다.
도 11b에 나타난 바와 같이, inBC2-SOCS2153-198는 기존 inBC2-VHL152-213과 비교하여 비슷하거나 약 20% 수준의 더 높은 β-catenin 분해 활성을 나타내었고, 평균적으로 약 40%의 β-catenin 분해능을 가짐을 확인하였다.
실시예 16. inBC2-VHL152-213152-213, inBC2-SOCS2153-198의 세포 성장 억제 평가.
inBC2-SOCS2153-198의 β-catenin 분해능에 따라 in vitro 상에서 대장암 세포주의 성장을 억제할 수 있는지 확인하기 위해 세포 성장 저해 정도를 평가하였다. 도 11c는 3종의 대장암 세포주에 inBC2와 inBC2-E3 recruiter(inBC2-VHL152-213, inBC2-SOCS2153-198)를 처리하여 세포 성장 저해 정도를 in vitro에서 평가하여 그래프로 도식화한 것이다. 구체적으로는 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 실험을 진행하였다. 도 11c에서 나타난 바와 같이, 대장암 세포주 3종에서 inBC2와 비교하여 inBC2-SOCS2153-198가 양성 대조군 iCRT14와 유사하게 평균 약 35% 수준의 유의미한 세포 성장 억제 효과를 보였다.
실시예 17. 변이형 SOCS2153-198이 융합된 inBC2-SOCS2s의 고안.
β-catenin에 대하여 높은 결합능과 분해능을 갖는 inBC2-SOCS2153-198-WT을 기반으로 물성 및 발현량 향상을 위해 변이형 SOCS2153-198이 융합된 inBC2-SOCS2s를 고안하였고, 구체적인 상기 변이형 SOCS2153-198이 융합된 inBC2-SOCS2s의 서열을 하기 표 9에 명시하였다.
Figure PCTKR2022010589-appb-img-000009
도12a는 SOCS box를 갖는 E3 complex 형성 단백질(예를 들어, SOCS 1-8, VHL, Vif(Virion infectivity factor))의 보존서열 및 EloBC와 cullin 결합 위치 등을 고려하여, 새롭게 융합될 변이형 SOCS2153-198의 일차구조를 나열한 것이다. 도 12b는 변이형 SOCS2153-198의 삼차구조를 bioluminate 4.0 (Schrφdinger, Inc.)을 이용하여 ph7.4에서 minimization후, intra-, inter- bond 변화를 관찰한 것이다.
서열번호 23의 inBC2-SOCS2153-198-1는 SOCS2서열 내에A177N, I178Y, W179R의 돌연변이를 가지며, 소수성을 가지는 A177(Ala, 알라닌), I178(Ile, 이소류신), W179(Trp, 트립토판)으로 구성된 SOCS2의 helix2 서열을 VHL의 N174(Asn, 아스파라긴), Y175(Tyr, 타이로신), R176(Arg, 아르기닌)으로 구성된 helix2 서열로 변형시킴으로써, 분자내 상호작용 및 물분자와의 상호작용을 강화하고자 고안되었다. 서열번호 24의 inBC2-SOCS2153-198-2는 SOCS2서열 내에 Y157R, P161D, V198D의 돌연변이를 가지며, N-말단 loop를 형성하는 아미노산 Y157, P161(Pro, 프롤린)과 C-말단 loop에 존재하는 소수성 아미노산 V198(Val, 발린)을 극성 아미노산으로 치환함으로써 분자내 정전기적 상호작용을 강화하는 방향으로 엔지니어링 되었다. 서열번호 25의 inBC2-SOCS2153-198-3는 SOCS2서열 내에 F196H, V198D의 돌연변이를 가지며, C-말단 loop를 형성하는 F196(Phe, 페닐알라닌)을 196H(His, 히스티딘)으로 치환함으로써, H165, F196, Y194가 형성하는 pi-pi 결합을 유지하는 동시에 물분자와의 수소결합을 강화하는 방향으로 엔지니어링 되었다. 서열번호 26의 inBC2-SOCS2153-198-4는 SOCS2서열 내에 A177N, I178Y, W179R, V198D의 돌연변이를 가지며, 변이형 helix2의 서열의 A177N, I178Y, W179R과 C-말단에 존재하는 극성 아미노산 D198(Asp, 아스파트산) 및 N172, L191, E192와 같은 주변 잔기들 간의 내부 결합이 강화되도록 엔지니어링 되었다.
서열번호 27 내지 34에 해당하는 inBC2-SOCS2s는 SOCS2서열 내에 A177N, I178Y, W179R, V198D의 돌연변이를 포함하는 서열번호 26의 inBC2-SOCS2153-198-4를 기반으로 고안되었다. 구체적으로, 서열번호 27의 inBC2-SOCS2153-198-5는 SOCS2서열 내에 A177N, I178Y, W179R, Y157R, V198D의 돌연변이를 가지며, D198과 과 R157간의 정전기적 상호작용을 강화하는 방향으로 엔지니어링 되었다. 서열번호 28의 inBC2-SOCS2153-198-6는 SOCS2서열 내에 A177N, I178Y, W179R, F196H, V198D의 돌연변이를 가지며, SOCS2153-198-1과 SOCS2153-198-2의 상승효과를 갖도록 엔지니어링 되었다. 서열번호 29의 inBC2-SOCS2153-198-7는 A177N, I178Y, W179R, V198D, H165D, Y194K, F196D의 돌연변이를 가지며, helix1의 H165와 helix3의 Y194, F196이 형성하는 약한 결합에너지의 pi interaction(edge to face)을 제거하고, 수소 결합 및 인접한 R168, V198D와의 정전기적 상호작용이 강화되도록 고안되었다. 서열번호 30의 inBC2-SOCS2153-198-8은 A177N, I178Y, W179R, V198D, Q164K, Y190D의 돌연변이를 가지며, inBC2-SOCS2153-198-4를 기반으로 하여, helix1을 구성하는 Q164(Gln, 글루타민)과 helix3을 구성하는 Y190간의 정전기적 상호작용을 갖도록 엔지니어링 되었다. 서열번호 31의 inBC2-SOCS2153-198-9은 A177N, I178Y, W179R, V198D, C167M의 돌연변이를 가지며, helix1의 N-말단에 존재하는 비결합형 C167(Cys, 씨스테인)을 메티오닌(M)으로 변형시킨 것으로, EloC의 소수성 아미노산과의 상호작용을 강화하고, 단백질의 접힘 과정에서 비 선택적 응집을 유도할 수 있는 비결합형 씨스테인이 제거되도록 고안되었다. 서열번호 32의 inBC2-SOCS2153-198-10은 A177N, I178Y, W179R, V198D,C174M의 돌연변이를 가지며, helix1의 C-말단에 존재하는 비결합형 C174을 메티오닌으로 치환함으로써, EloB와의 계면에서 소수성 상호작용이 강화되도록 고안되었다. 서열번호 33의 inBC2-SOCS2153-198-11은 A177N, I178Y, W179R, V198D, C174Q의 돌연변이를 가지며, 비결합형 C174을 글루타민으로 변형시킨 것이다. 서열번호 34의 inBC2-SOCS2153-198-12은 I178Y, W179R, V198D, H165D, Y194K, F196D, Q164K, Y190D의 돌연변이를 가지며, inBC2-SOCS2153-198-7과 inBC2-SOCS2153-198-8가 갖는 돌연변이를 융합한 것이다.
실시예 18. 변이형 SOCS2153-198이 융합된 inBC2-SOCS2s의 구축.
변이형 SOCS2가 융합된 inBC2-SOCS2s은 상기 일 실시예에서 설명한 야생형 SOCS2가 융합된 항-β-catenin 세포침투 분해항체(inBC2-SOCS2153-198)와 동일한 방법으로 구축 및 발현, 정제하였고, inBC2-SOCS2s의 구체적인 생산 수율을 하기 표 10에 나타내었다.
Figure PCTKR2022010589-appb-img-000010
서열번호 23 내지 34에 해당하는 inBC2-SOCS2s은 야생형 SOCS2 융합된 inBC2-SOCS2153-198의 생산수율(1.2±0.3 mg/L)과 대비하여, 최소 3배에서 최대 22배가량 수율이 증가함을 확인하였다. inBC2-SOCS2153-198-4의 생산 수율은 inBC2-SOCS2153-198 대비 5배 증가하여 6.4±0.3 mg/L로 생산되었다. inBC2-SOCS2153-198-4를 기반으로 구축된 서열번호 27내지 34의 inBC2-SOCS2s 중에서, inBC2-SOCS2153-198-7, inBC2-SOCS2153-198-8, inBC2-SOCS2153-198-11, inBC2-SOCS2153-198-12, inBC2-SOCS2153-198-8 순으로 생산 수율이 높았으며, inBC2-SOCS2153-198-7의 수율은 26.7± 10.7 mg/L로 inBC2-SOCS2153-198 대비 22배가량 생산량이 증가하여 12종의 inBC2-SOCS2s 중에서 가장 높은 수율로 생산되었다.
실시예 19. 변이형 SOCS2153-198이 융합된 inBC2-SOCS2s의 물성 평가.
도 13는 서열번호 21 내지 33에 해당하는 생산된 inBC2-SOCS2s를 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 280nm에서의 mAU 값을 나타낸 그래프이며, 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 분석을 진행하였다.
inBC2-SOCS2153-198와 대비하여 변이형 SOCS2153-198가 융합됨에 따라 inBC2-SOCS2153-198-4, inBC2-SOCS2153-198-7, inBC2-SOCS2153-198-8, inBC2-SOCS2153-198-11, inBC2-SOCS2153-198-12의 경우, inBC2-SOCS2153-198와 달리 태일링과 올리고머가 없고, 280nm에서 높은 mAU 값을 지닌 단일 피크를 나타내어 단백질 응집성이 개선됨을 확인하였다.
실시예 20. 변이형 SOCS2153-198이 융합된 inBC2-SOCS2s의 β-catenin 및 EloBC 복합체에 대한 결합능 분석.
inBC2-SOCS2s는 세포질로 침투 후, 세포질의 β-catenin을 인지함과 동시에 inBC2 C-말단에 융합된 어댑터 결합 도메인 SOCS2153-198가 어댑터 단백질인 EloBC, cullin5를 동원함으로써 CRL5 복합체 형성 후, UPS에 의한 β-catenin 분해를 유도하도록 고안되었으므로, inBC2-SOCS2s의 EloBC 결합능을 세포 외부 환경에서 ELISA를 통해 평가하고자 하였다.
도 14는 inBC2-SOCS2s의 β-catenin과 E3-복합체(SOCS2-EloBC-Cullin5)에 대한 특이적 결합을 확인하기 위해, 각각 100nM의 β-catenin과 100nM, 1μM의 EloBC 복합체와의 결합능을 ELISA로 분석한 결과이다.
해당 실시예에서 사용된 항원 β-catenin은 상기 실시예1과 동일한 방법으로 정제되었다.
EloBC 복합체의 경우, Elo B-flag tag 또는 Elo C-His8 tag을 코딩하도록 각각 pET23m과 pET28a 벡터에 제한효소 NotⅠHindⅢ를 이용하여 클로닝 후, pET23m-Elo B-flag 플라스미드와 pET28a-Elo C-His8 플라스미드를 E. coli BL21 (DE3)에 함께 형질전환 후, 34 μg/ml의 클로로암페니콜(chloramphenicol)과 100 μg/ml의 암피실린(ampicillin)이 포함된 LB 아가(agar) 고체 배지에 도말하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 단일 콜로니 채집 후, 형질전환체의 단일 콜로니를 채집 후, 34 μg/ml의 클로로암페니콜(chloramphenicol)과 100 μg/ml의 암피실린(ampicillin)이 포함된 SB 배지(SBCA) 5mL에 접종하고 18시간 배양하였다. 전배양액을 100ml의 34 μg/ml의 클로로암페니콜(chloramphenicol)과 100 μg/ml의 암피실린(ampicillin)이 포함된 LB 액체 배지에 OD 0.05의 초기접종 농도로 접종하여 본배양하고, 분광광도계(Thermo ScientificTM, #51119200)로 OD600값을 측정하여 OD600 0.4에 도달한 시점에 발현유도물질인 IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid)를 0.5 mM의 농도로 첨가 후 20℃ 150 rpm에서 18시간동안 배양하여 발현을 유도하였다. EloBC 복합체 단백질에 대한 정제는 상기 실시예1의 항원 β-catenin 정제방식과 동일한 방법으로 진행되었다. 상기 과정을 통해 정제된 단백질은 280nm 파장에서 흡광도와 흡광계수를 이용하여 정량 후, β-catenin과 함께 ELISA 실험의 항원 단백질로 이용되었다.
구체적으로, inBC2를 포함하여 inBC2-SOCS2s를 96웰 EIA/RIA 플레이트의 각각 5μg/ml의 농도로 1시간동안 상온에서 결합시킨 후, 0.1% PBST (PBS, pH 7.4, 0.1% Tween20)로 10분간 3회 세척한다. 이후 2% PBSB (PBS, pH 7.4, 2% BSA)로 1시간 동안 결합한 후 0.1% PBST로 10분간 3회 세척한다. β-catenin 100nM과 EloBC 복합체 단백질을 100nM, 1μM 농도로 2% PBSB로 희석하여 상온에서 1시간 동안 결합시킨 후 0.1% PBST로 10분간 3회 세척한다. 표지항체로 HRP가 접합된 항-GST 항체(HRP-conjugated anti-GST mAb, santa cruz, #sc-138)와 HRP가 접합된 항-His 항체(HRP-conjugated anti-His mAb, Invitrogen, #MA1-21315-HRP)로 결합시킨다. TMB ELISA solution으로 반응시켜 450nm 흡광도를 정량하였다.
상기 ELISA 분석을 통해 inBC2-SOCS2s에서 inBC2 대비 유사한 수준의 β-catenin 결합능을 보였다. 또한, 100nM의 EloBC 복합체에 대하여 inBC2-SOCS2153-198의 경우 결합능이 거의 나타나지 않은 반면, inBC2-SOCS2153-198-9를 제외한 9종의 inBC2-SOCS2s은 최대 4배가량 향상된 결합능을 보이는 것을 확인하였다.
상기 실시예 18 내지 20의 실험 결과들을 바탕으로 inBC2-SOCS2153-198보다 수율과 물성, β-catenin 및 E3-복합체에 대한 특이적 결합능이 개선된 inBC2-SOCS2153-198-4, inBC2-SOCS2153-198-7, inBC2-SOCS2153-198-8, inBC2-SOCS2153-198-11, inBC2-SOCS2153-198-12를 이용하여 추후 실험을 진행하였다.
실시예 21. 변이형 SOCS2153-198이 융합된 inBC2-SOCS2s의 β-catenin 분해능 평가.
inBC2-SOCS2s의 세포 내 β-catenin 분해 활성을 β-catenin 나노럭 리포터 시스템을 이용한 어세이와 웨스턴 블랏을 통하여 확인하였다. 도 15a는 β-catenin 분해능을 효율적으로 평가하기 위해 구축한 세포 기반의 스크리닝 시스템의 모식도를 나타낸 것이다. 구체적으로는 Wnt independent cell line에 속하는 HEK293T cell에 3세대 렌티바이러스 시스템을 이용하여 베타카테닌-나노럭 융합 단백질이 안정적으로 형질 도입된 개별 세포주를 구축한 후에, 96웰 플레이트에 웰 당 1.5x104 개의 HEK293T-β-catenin-나노럭 발현 세포를 각각 10% FBS가 포함된 배지 0.1ml에 희석하여 37도, 5% CO2 조건에서 16~18시간동안 배양하였다. 이후, 컨트롤 항체와 야생형 및 변이형 SOCS2 융합 항-β-catenin 세포질 침투 분해 항체를 2μM의 양으로 처리하고 37도, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 6시간 경과 후, 각 웰에 기질 Endurazine(Promega, #N2571) 25μl를 첨가하고 2시간 반응하여 luminometer를 이용해 발광 값을 측정하였다. 각 항체 처리군에 대한 발광값을 비히클 군에 대한 백분율 값으로 구하였다. 도 15b를 통해 inBC2-SOCS2153-198-4, inBC2-SOCS2153-198-7은 SOCS2가 융합되지 않은 컨트롤 항체 inBC2와 비교하여 60 내지 70%가량의 유의미한 β-catenin 분해 효과를 가지는 것을 확인하였으며, 특히 야생형의 SOCS2 단편이 융합된 inBC2-SOCS2153-198보다 각각 10 내지 20%가량의 증가된 분해효과를 가짐을 확인하였다.
inBC2-SOCS2s의 대장암 세포주에서의 세포 내 β-catenin 분해 활성을 상기 실시예 5와 같은 방법으로 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다. 도 15c에 나타난 바와 같이, β-catenin이 축적된 대장암 세포주 SW480에서 inBC2-SOCS2153-198-7은 inBC2에 비해 30% 내지 70% 수준의 β-catenin 분해 활성을 가지는 것을 확인하였으며, 선별된 5종의 inBC2-SOCS2s 중에서 가장 높은 β-catenin 분해 활성을 나타냈다.
상기 실시예 18 내지 20과 해당 실시예 실험 결과들을 바탕으로 물성과 항원 결합능, β-catenin 분해능에서 가장 큰 개선 효과를 보인 inBC2-SOCS2153-198-7을 이용하여 추후 실험을 진행하였다.
실시예 22. 농도와 시간에 따른 inBC2-SOCS2153-198-7의 대장암 세포주 β-catenin 분해능 평가.
도 16a는 inBC2-SOCS2153-198-7의 작용 기전을 명확히 규명하기 위해 inBC2-SOCS2153-198-7이 실제로 세포 내로 위치하여 β-catenin을 표적함과 동시에 융합된 SOCS2 단편을 이용하여 Cul5 기반의 E3와 어댑터 단백질인 EloB와 결합할 수 있는지를 면역침강법으로 확인한 결과이다. 구체적으로는, 100mm3 플레이트에 β-catenin이 축적되어있는 대장암 세포주 LoVo를 1x106 개를 10ml에 희석하여 36시간, 37도, 5% CO2 조건에서 배양한 후, inBC2-SOCS2153-198-7과 대조군 항체인 inBC2를 각각 2μM의 양으로 37도, 5% CO2 조건에서 12시간 동안 처리하였다. 이후 배지를 제거하고 약산성용액(200Mm Glycine, 150mM NaCl, pH 3.0)으로 세포 표면에 붙은 단백질들을 제거하고 PBS로 세척하였다. 세포 용해 버퍼 (20mM Tris-HCl pH 7.4, 150mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 0.05% SDS, 1mM EDTA, protease inhibitors)를 이용하여 세포를 용해시킨 후, 세포 잔해물을 침전시켜 제거한다. 이후 세포 용해물에 항 인간 kappa형 경쇄 항체(Abcam, # ab1050)와 반응시킨 Protein A 아가로스를 첨가하여 2시간 반응시킨 후, 항체를 침강시킨다. 이후 항 β-catenin 항체(Cell signaling, #9582S), 항 Cul5 항체(Origene, #AP07576SU-N), 항 EloB 항체(Santa cruz, #sc-133090), 항 인간 kappa형 경쇄 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과, 도 16a에 나타난 바와 같이, inBC2-SOCS2153-198-7처리 군에서는 β-catenin과 Cul5, EloB와의 결합이 모두 관찰된 반면, inBC2는 β-catenin에 대한 결합만이 관찰되었다. 상기 실험 결과로 inBC2-SOCS2153-198-7가 세포 내의 β-catenin과 Cul5 기반의 E3 복합체에 동시에 결합하는 것을 확인하였다.
도 16b는 β-catenin이 축적되어 있는 대장암 세포주 LoVo에 0.5, 1, 2, 4μM의 inBC2-SOCS2153-198-7과 대조군 항체 inBC2, inBC2(AAA)-SOCS2153-198-7를 4μM의 양으로 12시간동안 처리한 후, β-catenin의 양을 확인한 웨스턴 블랏 결과이다. inBC2-SOCS2153-198-7은 2μM 이상의 항체 처리 조건에서 항체 처리 농도에 비례하는 β-catenin 분해능을 나타냈다. 도 16c는 대장암 세포주 LoVo에서 inBC2-SOCS2153-198-7와 대조군 항체 inBC2, inBC2(AAA)-SOCS2153-198-7를 6, 12, 24, 36시간동안 처리한 후, β-catenin의 양을 확인한 웨스턴 블랏 결과이다. inBC2-SOCS2153-198-7이 12시간 내지 36시간 동안 세포질 내부에 존재하는 β-catenin이 재 생성되지 않고,50~60%의 분해 활성을 가짐을 확인하였다
실시예 23. inBC2-SOCS2153-198-7의 β-catenin poly-Ub화 평가.
도 17에서는 inBC2-SOCS2153-198-7의 작용 기전을 규명하기 위한 목적으로, 동원된 Cullin E3를 통해 β-catenin을 poly-Ub화하여 프로테아좀에 의해 분해시키는지를 확인하고자 웨스턴 블랏을 수행하였다. 구체적으로, LoVo에 Cullin 활성 저해제 MLN4924(Sigma, #5.05477.0001) 0.5μM 또는 프로테아좀 활성 저해제 Bortezomib(Sigma, #5.04314.0001) 5μM을 30분간 처리한 후, 용액을 제거하고 배지로 세척하였다. 이후, inBC2와 inBC2-SOCS2153-198-7을 2μM의 양으로 37도, 5% CO2 조건에서 12시간 동안 처리하였다. 이후 과정은 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 실험을 진행하였다.
그 결과, 도 17a 및 도 17b에 나타난 바와 같이, Cullin 활성 저해제, 프로테아좀 활성 저해제 없이 inBC2-SOCS2153-198-7을 단독으로 처리한 군에서만 평균적으로 40%의 β-catenin 양의 감소를 확인하였다. 상기 실험 결과를 통해 inBC2-SOCS2153-198-7이 Cul5 E3를 동원한 후, β-catenin에 대하여 프로테아좀 의존적인 분해를 유도하는 것을 확인하였다.
다음으로, 도 17c에서는 면역침강법을 이용해 inBC2-SOCS2153-198-7의 작용 기전 중 β-catenin의 poly-Ub화를 확인하고자 하였다. 구체적으로는, 100mm3 플레이트에 COLO320DM을 5x105 개를 10mL에 희석하여 37도, 5% CO2 조건에서 24시간동안 배양하였다. 이후, 프로테아좀 활성 저해제 Bortezomib 5μM을 30분간 처리한 후, 용액을 제거하고 배지로 세척하였다. 이후, inBC2-SOCS2153-198-7 와 대조군 항체 inBC2를 각각 2μM의 양으로 37도, 5% CO2 조건에서 12시간 처리하였다. 세포 용해와 β-catenin에 대한 아가로스 침강 후, K-48 폴리 유비퀴틴 항체를 이용한 웨스턴 블랏까지의 실험 과정은 상기 실시예 10과 동일한 방법으로 수행하였다.
도 17c에서 Bortezomib과 inBC2-SOCS2153-198-7을 모두 처리한 군에서만 K-48 폴리유비퀴틴화된 β-catenin 밴드가 나타나고, 동시에 세포 용해물(Whole cell lysates)을 이용한 웨스턴 블랏에서는 β-catenin의 양이 감소하지 않음을 확인하였다. 반면에, Bortezomib 없이 inBC2-SOCS2153-198-7을 처리한 군에서는 K-48 폴리유비퀴틴화된 β-catenin 밴드가 축적되지 않고, 세포에 존재하는 베타카테닌을 18%가량 감소시키는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 상기 도 17a 내지 c를 통해 inBC2-SOCS2153-198-7이 Cul5 기반의 E3를 β-catenin에 동원하고, β-catenin으로 Ub을 전달하여 K-48 poly-Ub chain을 형성해 프로테아좀에 의해 분해되는 작용 기전을 규명하였다.
실시예 24. inBC2-SOCS2153-198-7의 세포 성장 억제 평가.
inBC2-SOCS2153-198-7의 β-catenin 분해에 따른 in vitro 상에서 대장암 세포주의 성장을 억제할 수 있는지 확인하기 위해 세포 성장 저해 정도를 평가하였다. 구체적으로, β-catenin 의존적 세포 성장을 갖는 5종의 대장암 세포주(COLO320DM. SW403, LoVo, SW620, HCT-116)와 β-catenin 의존적 세포 성장을 갖지 않는 1종의 대조군 세포주 Huh-7에 대하여 대조군 항체 2종(inBC2, inBC2(AAA)- SOCS2153-198-7)과 inBC2-SOCS2153-198-7을 처리하여 세포 성장 저해 정도를 in vitro에서 평가하여 그래프로 도식화한 것이다. 구체적으로는 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 18a에 나타낸 바와 같이, 대장암 세포주 5종 모두에서 inBC2-SOCS2153-198-7는 2종의 대조군 항체에서 관찰되지 않는 유의미한 세포 성장 억제 효과를 보였고, 특히 COLO320DM과 HCT-116 세포주에서 40%이상의 세포 성장 억제효과를 보였다. 반면에, β-catenin 의존적 세포 성장을 갖지 않는 대조군 세포주 Huh-7에서는 inBC2-SOCS2153-198-7에서 비롯된 세포 성장 억제 효과가 관찰되지 않았다. 이를 통해 inBC2-SOCS2153-198-7가 β-catenin 분해에 따른 대장암 세포주의 성장 억제를 특이적으로 유도함을 확인하였다.
도 18b는 HCT-116 대장암 세포주에 대조군 항체 2종(inBC2, inBC2(AAA)- SOCS2153-198-7)과 inBC2-SOCS2153-198-7을 1, 2, 4μM의 농도로 처리하여, inBC2-SOCS2153-198-7의 농도 의존적인 세포 성장 저해 양상을 관찰한 것이다. 구체적으로는 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 수행하였다. 실험 결과, inBC2-SOCS2153-198-7는 2, 4μM 처리조건에서 inBC2대비 40%, 52%의 유의미한 세포 성장 억제 효과를 보였으며, 4.6 ± 0.5μM의 IC50 값을 확인하였다.
상기 실시예 22 내지 24를 통해 inBC2-SOCS2153-198-7가 대장암 세포주의 세포질에 축적된 β-catenin을 분해하여, 대장암 세포주의 성장을 특이적으로 억제함을 확인하였다. 세포질에 축적된 β-catenin은 핵 내로 이동해 전사인자 TCF4와 결합하여 사이클린 D1, myc 등의 Wnt 타겟 유전자의 전사를 촉진시켜 암발생에 관여하므로, inBC2-SOCS2153-198-7가 β-catenin을 비롯해 Wnt 타겟 유전자의 발현양에도 영향을 주는지 확인하기 위해, 도 18c에 해당하는 웨스턴 블랏을 HCT-116 세포주에 수행하였다. 구체적으로는, 대조군 항체 2종(inBC2, inBC2(AAA)- SOCS2153-198-7)과 inBC2-SOCS2153-198-7을 2μM의 농도로 처리 후, 세포 용해까지의 과정은 상기 실시예 5와 같이 진행하고, 이후 항 β-catenin 항체(Cell signaling, #9582S), 항 c-myc 항체(Cell signaling, #9402S), 항 사이클린 D1 항체(Cell signaling, #2978S)를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 그 결과, inBC2-SOCS2153-198-7는 inBC2, inBC2(AAA)- SOCS2153-198-7와 달리 50%의 β-catenin분해율을 보였으며, Wnt 타겟 유전자 c-myc, 사이클린 D1에 대하여 발현양을 70% 이상 감소시키는 것을 확인하였다.
따라서, inBC2-SOCS2153-198-7가 대장암 세포주에 축적된 β-catenin을 특이적으로 분해하여, 대장암 발생에 관여하는 Wnt 타겟 유전자의 양을 낮춤으로써, 대장암 세포주에서 β-catenin에 의해 유도되는 하위 시그널링을 음성적으로 조절할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 따른 항-β-catenin 세포침투 간섭항체(cell/tissue-specific cytosol-penetrating interfering antibody, iMab)는 표적단백질 β-catenin의 활성 부위에 결합하여 단백질-단백질 상호 작용을 저해하는 기능을 하여 단독으로는 세포 독성 등의 충분한 효과를 나타내지 못하는 경우가 많다. 이를 극복하기 위한 새로운 전략으로, 상기 항-β-catenin 세포침투 간섭항체에 U-box 또는 E3 recruiter가 융합된 항-β-catenin 세포침투 분해항체(A cell-penetrating degrading antibody 또는 Degrobody라 칭함)는 세포질에 존재하는 표적단백질 β-catenin을 분해하여 세포 성장억제 및 세포 독성을 유도할 수 있다.
본 발명에 따른 세포침투 분해항체는 완전한 이뮤노글로불린(immunoglobulin) 형태로 세포침투 간섭항체에 U-box 또는 E3 recruiter를 개조 및 융합하여, 기존 표적단백질 분해 전략에서의 한계점인 E3(ubiquitin ligase enzyme)의 제한성, 낮은 생체이용률, 제한적인 세포 내 전달성을 회피할 수 있다.
본 발명에 따른 타겟세포 특이적 항-β-catenin 세포침투 분해항체에서, 개량된 물성 및 E2-Ub(E2-ubiquitin conjugate)또는 E3에 대한 친화도를 가지며 최적화된 융합 위치 및 linker를 통해 U-box 또는 E3 recruiter가 연결된 세포침투 분해항체는 높은 생산 수율을 통해 치료 약물로 개발이 용이하며, 종양조직 특이적으로 세포질 내부의 β-catenin 상에 poly-Ub(poly-ubiquitination) 표지를 통해 프로테아좀에 의한 분해를 유도하여 효과적인 항암 활성을 기대할 수 있다.
본 발명에 따른 항-β-catenin 세포침투 분해항체의 개념은 U-box 또는 E3 recruiter 외에도, 세포침투 간섭항체에 융합되었을 때 높은 세포 독성을 보이는 단백질을 세포 내로 전달하여 다양한 질병 치료 및 예방을 위한 약학 조성물로 활용될 수 있다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (24)

  1. 서열번호 1의 경쇄 CDR1, 서열번호 2의 경쇄 CDR2, 서열번호 3 또는 4의 경쇄 CDR3 및 서열번호 5의 중쇄 CDR1, 서열번호 6 또는 7의 중쇄 CDR2, 서열번호 8 또는 9의 중쇄 CDR3를 포함하는, β-catenin에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 17 내지 19로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 가변영역을 포함하는 β-catenin에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 20 또는 21의 경쇄 가변영역을 포함하는 β-catenin에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 β-catenin에 의해 유도되는 Wnt 신호전달경로에 존재하는 Wnt 타겟 유전자의 발현을 감소시키는, β-catenin에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항의 β-catenin에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 종양 세포 또는 조직 특이적 항원을 표적하는 물질을 포함하고, 상기 항원에 특이적으로 결합하여 내재화(endocytosis)된 후에 엔도좀 탈출(endosomal escape) 능력에 의해 세포의 세포질에 위치하는, β-catenin에 결합하는 세포침투 간섭항체(cytosol-penetrating interfering antibody).
  6. 제5항에 있어서, 상기 종양 세포 또는 조직 특이적 항원은 EpCAM (epithelial cellular adhesion molecule), EGFR(epidermal growth factor receptor, integrin αvβ3/αvβ5로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인, 세포침투 간섭항체.
  7. 제5항의 세포침투 간섭항체에 U-박스 (U-Box) 또는 E3 리쿠르터 (E3 recruiter)가 추가로 융합된, 세포침투 분해항체 (cell-penetrating degrading antibody Degrobody).
  8. 제7항에 있어서, 상기 U-박스는 E4B(E4 poly-ubiquitin chain elongation factorB)를 포함하는 모노머 U-박스, 또는 CHIP(Carboxyl terminus of Hsp70-interacting protein) 또는 Prp19(Precursor-mRNA splicing factor 19)를 포함하는 호모다이머 U-박스인, 세포침투 분해항체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 U-박스는 서열번호 10 또는 11의 서열을 포함하는, 세포침투 분해항체.
  10. 제7항에 있어서, 상기 E3 리쿠르터는 βTrCP 142-255, VHL152-213, SPOP 167-374, DDB2 61-114, SOCS2153-198로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인, 세포침투 분해항체.
  11. 제7항에 있어서, 상기 E3 리쿠르터는 발현양이 향상된 SOCS2153-198 변이체로서 서열번호 12 내지 16, 23 내지 34로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인, 세포침투 분해항체.
  12. 제7항에 있어서, 상기 U-박스 또는 E3 리쿠르터는 항-β-catenin 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 또는 경쇄의 N 말단 또는 C 말단에 융합되는 것을 특징으로 하는, 세포침투 분해항체.
  13. 제12항에 있어서, 상기 U-박스 또는 E3 리쿠르터는 링커를 통해 항-β-catenin 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 연결되는 것을 특징으로 하는, 세포침투 분해항체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 링커는 GGGGS, (GGGGS)2, ASTKGP, ASTKGPSVFPLAP로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인, 세포침투 분해항체.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합단편을 코딩하는 핵산.
  16. 제5항 또는 제6항의 세포침투 간섭항체를 코딩하는 핵산.
  17. 제5항 내지 제14항 중 어느 한 항의 세포침투 분해항체를 코딩하는 핵산.
  18. 제15항 내지 제7 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는 발현벡터.
  19. 제17항의 발현벡터로 형질전환된 재조합 세포.
  20. 다음 단계를 포함하는 항-β-catenin 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법:
    (a) 제18항의 세포를 배양하여 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 단계; 및
    (b) 상기 생산된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계.
  21. 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항의 세포침투 분해항체의 제조방법:
    (1) β-catenin 표적능을 가지는 인간 항체의 중쇄가변영역(VH) 및 중쇄불변영역(CH1-hinge-CH2-CH3)이 포함된 중쇄와 상기 중쇄의 N-말단 또는 C-말단에 항체와 U-박스 또는 E3 리쿠르터가 연결된 핵산(Nucleic acids)을 클로닝한 항-β-catenin 중쇄 발현 벡터를 제조하는 단계;
    (2) 세포질 침투능을 가지는 인간 항체의 경쇄가변영역(VL) 및 경쇄불변영역(CL)이 포함된 경쇄와 상기 경쇄의 N-말단 또는 C-말단에 항체와 U-박스 또는 E3 리쿠르터가 연결된 핵산(Nucleic acids)을 클로닝한 엔도좀 탈출 경쇄 발현 벡터를 제조하는 단계;
    (3) 상기 제조된 중쇄, 경쇄 발현벡터를 단백질 발현용 동물세포에 동시 형질전환 하여 완전한 이뮤노글로불린 형태의 세포침투 분해항체를 발현하는 단계; 및
    (4) 상기 발현된 세포침투 분해항체를 정제 및 회수하는 단계.
  22. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합단편, 제5항 또는 제6항의 세포침투 간섭항체 또는 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항의 세포침투 분해항체에 연결된 생체활성분자를 포함하는 접합체.
  23. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합단편, 제5항 또는 제6항의 세포침투 간섭항체 또는 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항의 세포침투 분해항체를 포함하는 이중 또는 다중특이항체.
  24. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합단편, 제5항 또는 제6항의 세포침투 간섭항체 또는 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항의 세포침투 분해항체를 포함하는 종양 또는 암 예방 또는 치료용 조성물.
PCT/KR2022/010589 2021-07-20 2022-07-20 세포 내부에 침투하여 표적단백질을 분해하여 제거하는 세포침투 분해항체 및 이의 용도 Ceased WO2023003339A1 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18/290,613 US20240352100A1 (en) 2021-07-20 2022-07-20 Cell-penetrating degrading antibody that penetrates into cells to degrade and remove target protein and use thereof
EP22846209.9A EP4375294A1 (en) 2021-07-20 2022-07-20 Cell-penetrating degrading antibody that penetrates into cells to degrade and remove target protein and use thereof
CN202280060417.XA CN117916258A (zh) 2021-07-20 2022-07-20 穿透进细胞以降解和去除靶蛋白的细胞穿透降解抗体及其用途

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2021-0094792 2021-07-20
KR20210094792 2021-07-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023003339A1 true WO2023003339A1 (ko) 2023-01-26

Family

ID=84979456

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2022/010589 Ceased WO2023003339A1 (ko) 2021-07-20 2022-07-20 세포 내부에 침투하여 표적단백질을 분해하여 제거하는 세포침투 분해항체 및 이의 용도

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20240352100A1 (ko)
EP (1) EP4375294A1 (ko)
KR (1) KR102623211B1 (ko)
CN (1) CN117916258A (ko)
WO (1) WO2023003339A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2025127633A1 (ko) * 2023-12-14 2025-06-19 아주대학교산학협력단 고효율 세포질 침투 능을 갖는 세포질 침투 항체 및 이의 용도

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100045683A (ko) * 2008-10-24 2010-05-04 아주대학교산학협력단 핵산가수분해 능 및 암세포내 침투능력을 갖는 인간화된 항체 및 그 용도
KR20160011598A (ko) * 2014-07-22 2016-02-01 아주대학교산학협력단 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체를 세포막을 투과하여 세포질에 위치시키는 방법 및 그의 이용
KR101602876B1 (ko) 2014-07-22 2016-03-11 아주대학교산학협력단 완전한 이뮤노글로불린 형태의 세포질 침투능을 갖는 항체를 이용하여 세포내 활성화된 ras를 억제하는 방법 및 그의 이용
US20190144566A1 (en) 2016-05-27 2019-05-16 Orum Therapeutics Inc. Cytosol-penetrating antibody and use thereof
KR20190080809A (ko) * 2017-12-28 2019-07-08 오름테라퓨틱 주식회사 세포질 침투 항체에 융합된 rna 분해효소를 포함하는 면역독소
KR102000000B1 (ko) 2016-05-27 2019-07-12 오름테라퓨틱 주식회사 항체에 엔도좀 탈출능을 부여하는 엔도좀 탈출 구조 모티프 및 이의 활용
KR20190143826A (ko) * 2018-06-21 2019-12-31 오름테라퓨틱 주식회사 세포/조직 특이적 세포 침투 항체
KR102091195B1 (ko) 2019-11-21 2020-03-19 오름테라퓨틱 주식회사 세포질 침투 항체 및 이의 용도
KR102163305B1 (ko) 2017-11-16 2020-10-08 오름테라퓨틱 주식회사 세포의 세포질에 침투하여 세포내 활성화된 Ras를 억제하는 항체 및 이의 용도

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0119136D0 (en) 2001-08-06 2001-09-26 Clariant Int Ltd Phenolfree stabilizaton of polyolefins

Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100045683A (ko) * 2008-10-24 2010-05-04 아주대학교산학협력단 핵산가수분해 능 및 암세포내 침투능력을 갖는 인간화된 항체 및 그 용도
KR20160011598A (ko) * 2014-07-22 2016-02-01 아주대학교산학협력단 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체를 세포막을 투과하여 세포질에 위치시키는 방법 및 그의 이용
KR101602876B1 (ko) 2014-07-22 2016-03-11 아주대학교산학협력단 완전한 이뮤노글로불린 형태의 세포질 침투능을 갖는 항체를 이용하여 세포내 활성화된 ras를 억제하는 방법 및 그의 이용
KR101602870B1 (ko) 2014-07-22 2016-03-21 아주대학교산학협력단 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체를 세포막을 투과하여 세포질에 위치시키는 방법 및 그의 이용
KR101732553B1 (ko) 2014-07-22 2017-05-08 오름테라퓨틱 주식회사 활성화된 ras 특이적인 항체의 중쇄가변영역 및 그의 이용
US10851177B2 (en) 2014-07-22 2020-12-01 Orum Therapeutics Inc. Method for inhibiting intracellular activated RAS using intact immunoglobulin-type antibody having cytosol-penetrating ability and use thereof
US20190144566A1 (en) 2016-05-27 2019-05-16 Orum Therapeutics Inc. Cytosol-penetrating antibody and use thereof
KR102000000B1 (ko) 2016-05-27 2019-07-12 오름테라퓨틱 주식회사 항체에 엔도좀 탈출능을 부여하는 엔도좀 탈출 구조 모티프 및 이의 활용
KR102163305B1 (ko) 2017-11-16 2020-10-08 오름테라퓨틱 주식회사 세포의 세포질에 침투하여 세포내 활성화된 Ras를 억제하는 항체 및 이의 용도
US20200339681A1 (en) 2017-11-16 2020-10-29 Orum Therapeutics Inc. Antibody inhibiting activated ras in cell by internalizing into cytosol of cell, and use thereof
KR20190080809A (ko) * 2017-12-28 2019-07-08 오름테라퓨틱 주식회사 세포질 침투 항체에 융합된 rna 분해효소를 포함하는 면역독소
US10787487B2 (en) 2018-06-21 2020-09-29 Orum Therapeutics Inc. Cell/tissue-specific cell-penetrating antibodies
KR20190143826A (ko) * 2018-06-21 2019-12-31 오름테라퓨틱 주식회사 세포/조직 특이적 세포 침투 항체
US20200385428A1 (en) 2018-06-21 2020-12-10 Orum Therapeutics Inc. Cell/tissue-specific cell-penetrating antibodies
KR102091195B1 (ko) 2019-11-21 2020-03-19 오름테라퓨틱 주식회사 세포질 침투 항체 및 이의 용도

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN ET AL., ADV DRUG DELIV REV, vol. 65, 2013, pages 1357 - 1369
MORREALEWALDEN, CELL, vol. 165, 2016, pages 248 - 248
NGUYEN ET AL., STRUCTURE, vol. 23, 2015, pages 441 - 449
SHIN ET AL., SCI ADV, vol. 6, 2020
SHIN SM ET AL., NATURE COMMUNICATIONS, vol. 8, 2017, pages 15090
SHIN SM ET AL., SCIENCE ADVANCES, vol. 6, no. 3, 2020

Also Published As

Publication number Publication date
KR20230016154A (ko) 2023-02-01
CN117916258A (zh) 2024-04-19
KR102623211B1 (ko) 2024-01-11
EP4375294A1 (en) 2024-05-29
US20240352100A1 (en) 2024-10-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2016013870A1 (ko) 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체를 세포막을 투과하여 세포질에 위치시키는 방법 및 그의 이용
WO2014077648A1 (ko) 인간 및 마우스 ｌ１ｃａｍ 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
WO2016137108A1 (en) Novel antibody binding to tfpi and composition comprising the same
WO2010056043A2 (en) Cell-penetrating, sequence-specific and nucleic acid-hydrolyzing antibody, method for preparing the same and pharmaceutical composition comprising the same
WO2021071319A1 (ko) 다중 특이적 융합 단백질 및 이의 용도
WO2019107812A1 (ko) 세포의 세포질에 침투하여 세포내 활성화된 ras를 억제하는 항체 및 이의 용도
WO2024025343A1 (ko) 항-ror1 항체 및 이의 용도
WO2022035201A1 (ko) Il-12 및 항-fap 항체를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도
WO2018174544A2 (ko) Muc1에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
WO2019190206A1 (ko) 클라우딘 3의 ecl-2에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 단편 및 이들의 용도
AU2021327599A1 (en) Anti-b7-h4/anti-4-1bb bispecific antibodies and use thereof
WO2021101346A1 (en) Anti-ror1/anti-4-1bb bispecific antibodies and uses thereof
WO2022149837A1 (ko) 항-fgfr3 항체 및 이의 용도
WO2022055299A1 (ko) 인터루킨-4 수용체 알파 서브유닛과 인터루킨-5 수용체 알파 서브유닛에 동시에 결합하는 이중특이항체 및 이의 용도
WO2021101349A1 (ko) Ror1 및 b7-h3에 결합하는 항체, 이를 포함하는 항체-약물 접합체 및 그 용도
WO2023003339A1 (ko) 세포 내부에 침투하여 표적단백질을 분해하여 제거하는 세포침투 분해항체 및 이의 용도
WO2016013871A1 (ko) 완전한 이뮤노글로불린 형태의 세포질 침투능을 갖는 항체를 이용하여 세포내 활성화된 ras를 억제하는 방법 및 그의 이용
WO2023224429A1 (ko) Light 단백질 및 항-fap 항체를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도
WO2019125070A1 (ko) 악성 b 세포를 특이적으로 인지하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이를 포함하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도
WO2018026249A1 (ko) 프로그램화된 세포 사멸 단백질 리간드-1 (pd-l1)에 대한 항체 및 이의 용도
WO2022085905A1 (ko) SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
WO2020209645A1 (ko) 프로그램화된 세포 사멸 단백질 리간드-1 (pd-l1)에 대한 항체 및 이의 용도
WO2019132579A2 (ko) 세포질 침투 항체에 융합된 rna 분해효소를 포함하는 면역독소
WO2023239228A1 (ko) 항-tigit 항체, 인터류킨-15, 및 인터류킨-15 수용체 알파 스시 도메인을 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도
WO2023224412A1 (ko) Pd-l1 및 cd47에 대한 이중특이적 인간화 단일 도메인 항체 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22846209

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 18290613

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2022846209

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022846209

Country of ref document: EP

Effective date: 20240220

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202280060417.X

Country of ref document: CN