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WO2023068818A1 - 두개의 fc 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

두개의 fc 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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WO2023068818A1
WO2023068818A1 PCT/KR2022/015981 KR2022015981W WO2023068818A1 WO 2023068818 A1 WO2023068818 A1 WO 2023068818A1 KR 2022015981 W KR2022015981 W KR 2022015981W WO 2023068818 A1 WO2023068818 A1 WO 2023068818A1
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WO
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seq
antigen
antibody
cancer
domain
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/KR2022/015981
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English (en)
French (fr)
Inventor
최은식
박현규
배지선
양기혁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centenaire Biosciences Inc
Original Assignee
Centenaire Biosciences Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to CA3236173A priority patent/CA3236173A1/en
Priority to EP22884040.1A priority patent/EP4421093A4/en
Priority to JP2024548337A priority patent/JP2024539509A/ja
Priority to AU2022372527A priority patent/AU2022372527A1/en
Priority to US18/703,321 priority patent/US20250236682A1/en
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    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
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    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
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    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Definitions

  • the present invention relates to a novel antibody construct having an antigen binding site that specifically binds to a cancer surface antigen and two Fc domains.
  • Antibody-based therapeutics and Fc fusion proteins are a group of clinically important drugs for patients with cancer, immune disorders, infectious and inflammatory diseases.
  • ADCC Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity
  • ADCP Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis
  • CDC Complement-Dependent Cytotoxicity
  • the present inventors studied to improve the function of the antibody and solve the problems of the existing antibody structure designed to include multiple Fc domains in series as described above.
  • natural human immunoglobulin G IgG
  • Compared to natural human antibodies despite having a similar molecular weight (about 150 kDa), improved novel antibody constructs were developed that allow up to four times the Fc domain to be present on cell surface antigens.
  • One aspect of the present invention comprises an antigen-binding site, a first Fc domain linked to the first linking position of the antigen-binding site or a variant thereof, and a second Fc domain linked to the second linking position of the antigen-binding site or a variant thereof. It is to provide a fusion protein comprising
  • Another aspect of the present invention is two antigen-binding regions connected in series (tandem two antigen-binding regions), a first Fc domain linked to the first linking position of the tandem 2 antigen-binding region or a variant thereof, and the tandem 2 It is to provide a fusion protein comprising a second Fc domain linked to a second linking position of an antigen binding site or a variant thereof.
  • each of the two antigen-binding sites constituting the tandem 2 antigen-binding site binds to different epitopes of the same antigen or binds to different antigens, respectively CDR sequences or variable regions (comprising) Or it may be a sequence consisting of a variable region (consisting of).
  • the first Fc domain and the second Fc domain may or may not be linked to each other through a covalent bond, a non-covalent bond, or a linker. there is. In a preferred embodiment, the first Fc domain and the second Fc domain are not linked to each other.
  • the Fc domain may be a wild-type immunoglobulin Fc domain, and modulates the Fc ⁇ receptor (Fc ⁇ R) reactivity or ADCC of the Fc domain, or multimer formation of undesirable Fc domains. Modifications to minimize , such as amino acid substitutions, may be included.
  • the Fc domain includes the CH2 and CH3 regions, may include the CH4 region and/or the hinge region, and should be interpreted as including Fc domain fragments representing the functions of the Fc domain.
  • binding between the antigen-binding site and the Fc domain or variant may be direct binding or binding through a linker.
  • binding of the antigen-binding site to the Fc domain or variant may be binding between the N-terminus and the C-terminus, the N-terminus and the N-terminus, or the C-terminus and the C-terminus of each peptide molecule. .
  • 13c shows the result of sensorgram analysis of binding of H01Fv4, a purified Fv-(Fc)2 construct, to human HER2.
  • 17a is a result of measuring the amount of Fc domain present on the surface of NCI-N87 gastric cancer cell line upon treatment with 50 nM HER2 antibody.
  • 17b shows the results of measuring the amount of Fc domain present on the surface of BT474 breast cancer cell line upon treatment with 50 nM HER2 antibody.
  • 17c shows the results of measuring the amount of Fc domain present on the surface of SK-OV3 ovarian cancer cell line upon treatment with 50 nM HER2 antibody.
  • 17e is a result of measuring the amount of Fc domain present on the surface of SNU-5 gastric cancer cell line upon treatment with 50 nM HER2 antibody.
  • 18a is a result of measuring the amount of Fc domain present on the surface of NCI-N87 gastric cancer cell line upon treatment with various concentrations of HER2 antibody.
  • 19a is a schematic structural diagram of H01DE4 in which S239D and I332E mutations were introduced using H01 as a template.
  • 19B is a schematic structural diagram of P01DE4 in which S239D and I332E mutations were introduced using P01 as a template.
  • 20a to 20d are sensorgrams showing the binding characteristics and affinity of H01, H01DE4, P01, and P01DE4 to human HER2.
  • 21a to 21h are sensorgrams showing the binding characteristics and affinity of H01, P01, H01DE4, P01DE4, Human IgG1, Trastuzumab, Pertuzumab, and Margetuximab to Fc ⁇ receptor 1.
  • 23a to 23h are sensorgrams showing binding characteristics and affinity of H01, P01, H01DE4, P01DE4, Human IgG1, Trastuzumab, Pertuzumab, and Margetuximab to Fc ⁇ receptor 3A (176V isoform).
  • 25 is a structural schematic diagram of HP501, an improved HER2 biparatopic antibody.
  • 26 is a structural schematic diagram of HER2 biparatopic modified antibodies, HP501 to HP516.
  • 28a is a sensorgram of affinity analysis of HP503 to HER2 protein using Bio-Layer Interferometry analysis.
  • 28B is a sensorgram of affinity analysis of HP507 for HER2 protein using Bio-Layer Interferometry.
  • 28c is a sensorgram of affinity analysis of HP511 to HER2 protein using Bio-Layer Interferometry.
  • 29a is a graph showing the results of analyzing the binding characteristics and affinity of HP503 to Fc ⁇ receptor 1, Fc ⁇ receptor 2A (131R isoform), and Fc ⁇ receptor 3A (176V isoform).
  • 29B is a graph showing the results of analyzing the binding characteristics and affinity of HP507 to Fc ⁇ receptor 1, Fc ⁇ receptor 2A (131R isoform), and Fc ⁇ receptor 3A (176V isoform).
  • 30A is a graph showing the results of analyzing the binding characteristics and affinity of HP503, HP507, HP511 and HP515 to the neonatal Fc receptor (FcRn).
  • 30B is a graph showing the results of analyzing the binding characteristics and affinity of human IgG1, Trastuzumab, Pertuzumab, and Margetuximab to the neonatal Fc receptor (FcRn).
  • 31a shows the results of analyzing the CDC effects of each HER2 antibody in the BT474 breast cancer cell line.
  • 32a is a result of analyzing the ADCC effect by the HER2 antibody in the NCI-N87 gastric cancer cell line.
  • Figure 32b is the result of analyzing the ADCC effect by HER2 antibody in MDA-MB-453 breast cancer cell line.
  • Figure 32c is the result of analyzing the ADCC effect by HER2 antibody in SNU-601 gastric cancer cell line.
  • Figure 32d is the result of analyzing the ADCC effect by HER2 antibody in SNU-5 gastric cancer cell line.
  • Figure 33a shows the results of anticancer activity analysis in SNU-5 gastric cancer cell line xenograft mouse model (C.B-17 SCID).
  • 33b shows the results of anticancer activity analysis in SNU-5 gastric cancer cell line xenograft mouse model (BALB/c-nu).
  • 36 is a vector capable of expressing human HER2 protein in mammalian cells.
  • FIG. 39 compares the relative human HER2 expression level of CT26-HER2 cell line (Clone name: #2-60) compared to human cancer cell lines and confirms that H01 binds a larger amount of Fc domain to the surface of CT26-HER2 cells compared to Trastuzumab. This is the result.
  • 40 is an analysis result of anticancer efficacy in an allogeneic mouse model transplanted with CT26-HER2.
  • 41a is a schematic diagram of a monovalent engineered mAb according to one embodiment.
  • 41B is a schematic diagram of a Biparatopic engineered mAb according to one embodiment.
  • FIG. 42 is a sensorgram result of analyzing the target-binding ability of a fusion protein, which is an embodiment.
  • FIG. 42a is a sensorgram result of analyzing the binding ability of GPM01, a monovalent engineered mAb targeting GPC-3, to human GPC-3.
  • Figure 42b is a sensorgram result of analyzing the binding ability of GPM02, a monovalent engineered mAb targeting GPC-3, to human GPC-3.
  • 42c is a sensorgram result of analyzing the binding ability of GPM04, a monovalent engineered mAb targeting GPC-3, to human GPC-3.
  • 42D is a sensorgram result of analyzing the binding ability of GPB01, a biparatopic engineered mAb targeting GPC-3, to human GPC-3.
  • 42E is a sensorgram result of analyzing the binding ability of GPB03, a biparatopic engineered mAb targeting GPC-3, to human GPC-3.
  • 42f is a sensorgram result of analyzing the binding ability of GPB04, a biparatopic engineered mAb targeting GPC-3, to human GPC-3.
  • 42g is a sensorgram result of analyzing the binding ability of GPB06, a biparatopic engineered mAb targeting GPC-3, to human GPC-3.
  • MEM01 and MEM06 are monovalent engineered mAbs targeting MET, to human MET.
  • 49 is a sensorgram result of analyzing the binding ability of monovalent engineered mAbs targeting EGFR to human EGFR.
  • Figure 50 is a sensorgram for analyzing the binding ability to human CD33 of monovalent engineered mAbs 33-1, 33-2, 33-3 and biparatopic engineered mAbs 33-4, 33-5, 33-6, 33-7 targeting CD33 This is the result.
  • FIG. 52 is a sensorgram result of analyzing the target-binding ability of a fusion protein, which is an embodiment.
  • FIG. 52a is a sensorgram result of analyzing the binding ability of T01, a monovalent engineered mAb targeting TROP2, to human TROP2.
  • 52B is a sensorgram result of analyzing the binding ability of MSM01, a monovalent engineered mAb targeting mesothelin, to human mesothelin.
  • 52c is a sensorgram result of analyzing the binding ability of LIMO1, a monovalent engineered mAb targeting LIV-1, to human LIV-1.
  • fusion protein having two Fc or "antibody having two Fc” refers to a fusion protein in which two Fc domains are independently linked to two polypeptide chains constituting an antigen binding site. do.
  • the two polypeptide chains constituting the antigen binding site may differ from one another.
  • one of the two polypeptide chains constituting the antigen binding site may be a sequence comprising or consisting of the light chain CDR sequence or light chain variable region of an antibody, or may be a scFv, and the other may be an antibody heavy chain CDR sequence or It may be a sequence comprising or consisting of a heavy chain variable region or a scFv.
  • the fusion protein having the two Fc regions may include a “humanized” form of a non-human antibody, which is a chimeric antibody containing human immunoglobulin including natural CDRs.
  • the fusion protein may include a "fully human antibody” or a part of a "human antibody”.
  • the multi-specific fusion protein or antigen binding domain may be a "monoclonal antibody” or part thereof.
  • the term "heavy chain” refers to a polypeptide chain between about 50 kDa and about 70 kDa.
  • the N-terminal portion includes a variable region of about 120 to 130 or more amino acids
  • the C-terminal portion includes a constant region.
  • a constant region can be one of five types: alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ), epsilon ( ⁇ ), gamma ( ⁇ ), and mu ( ⁇ ).
  • ⁇ , ⁇ and ⁇ contain about 450 amino acids and ⁇ and ⁇ contain about 550 amino acids.
  • the term "light chain” refers to a polypeptide chain of about 25 kDa.
  • the N-terminal portion includes a variable region of about 100 to about 110 or more amino acids
  • the C-terminal portion includes a constant region.
  • the constant region of the light chain is referred to as "CL”.
  • Heavy chain C domains (CH domains) are numbered from N-terminus to C-terminus (eg, CH 1 , CH 2 , CH 3 , etc.).
  • CL and CH 1 regions of any of these antibody classes may be used in the present disclosure.
  • CL and CH 1 regions provided herein are of the IgG type (eg, IgG1).
  • Fc refers to the C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain, including native Fc regions, recombinant Fc regions and variant Fc regions.
  • Fc refers to the last two constant region immunoglobulin domains of IgA, IgD and IgG, the last three constant region immunoglobulin domains of IgE and IgM, and the hinge present at the N-terminal of these domains.
  • Fc may include a J chain.
  • Fc contains the immunoglobulin domains Cy2 (CH2) and Cy3 (CH3) and a hinge between Cy1 and Cy2.
  • a variant Fc region has at least one amino acid substitution relative to a native sequence Fc region; For example, from about 1 to about 10 amino acid substitutions, or from about 1 to about 5 amino acids may be substituted
  • the variant Fc region is at least about 80% homologous to the native sequence Fc region, and at least about 90% homology, or at least about 95% homology.
  • single-chain Fv or “scFv” refers to an antibody fragment comprising the VH and VL domains of an antibody to exist within a single polypeptide chain.
  • variable region refers to any of the VL (including Vkappa (VK) and Vlamda (VL)) and/or VH genes constituting the light chain (including kappa and lambda) and heavy chain immunoglobulin loci, respectively.
  • VL or VH means a region of an antibody comprising one or more immunoglobulin domains encoded by one.
  • the light or heavy chain variable region (VL or VH) consists of "framework" or "FR" regions comprising three hypervariable regions called “complementarity determining regions” or "CDRs".
  • the term "antigen” is a structure capable of selectively binding to an antibody.
  • a target antigen can be a polypeptide, carbohydrate, nucleic acid, lipid, hapten or other naturally occurring or synthetic compound. Specifically, the antigen is a polypeptide and may be a protein present on or within a cell.
  • epitope refers to an antigenic determinant and is a region on an antigen to which an antibody or polypeptide binds. Protein epitopes can include amino acid residues directly involved in binding as well as amino acid residues that are effectively blocked by specific antigen-binding antibodies or peptides. It is the simplest form or smallest structural region of a complex antigenic molecule capable of binding to an antibody or receptor. Epitopes can be linear or conformational/conformational.
  • vector refers to a material for transporting or expressing a nucleic acid sequence including a nucleic acid sequence encoding a multi-specific fusion protein (eg, antibody) described herein.
  • vectors include expression vectors, plasmids, phage vectors, viral vectors, episomes and artificial chromosomes.
  • One aspect of the present invention provides an antibody comprising a plurality of Fc domains, characterized in that the ratio of the antigen binding site and the Fc domain is 1:2 or 2:2.
  • the antibody may be a fusion protein comprising an antigen binding site, a first Fc domain or variant thereof, and a second Fc domain or variant thereof.
  • the antigen binding site may be composed of two different polypeptide chains.
  • each polypeptide may be linked to a first Fc domain or variant thereof and a second Fc domain or variant thereof.
  • the two Fc domains may be fusion proteins linked to the C-terminus of the CH1 region of the heavy chain and the C-terminus of the constant region of the light chain, respectively.
  • the Fc domain and Fab can be linked through a peptide linker.
  • the two Fc domains may be a fusion protein linked to the C-terminus of the heavy chain variable region and the C-terminus of the light chain variable region, respectively.
  • the Fc domain and Fv may be linked through a peptide linker.
  • This novel antibody construct has a molecular weight similar to that of human IgG.
  • the fusion protein may have an antigen binding affinity equal to that of a human IgG-based antibody.
  • the Fc domain may be present on the cell surface antigen up to 4 times that of natural human antibodies. Due to these characteristics, the fusion protein can increase Fc ⁇ receptor affinity and effector functions compared to wild-type antibodies.
  • Each Fc domain bound to the fusion protein may have a similar level of Fc receptor (Fc ⁇ receptor and FcRn) binding affinity to that of the Fc domain of an IgG-based antibody, but due to the avidity effect, the fusion
  • the protein's Fc receptor (Fc ⁇ receptor and FcRn) apparent affinity may have a significantly increased value compared to human IgG antibody.
  • the fusion protein has a similar level of thermal stability to IgG-based antibodies.
  • the fusion protein is composed of (a) a first polypeptide comprising at least one complementarity-determining region (CDR) sequence and a second polypeptide comprising at least one complementarity-determining region (CDR) sequence, wherein The first polypeptide and the second polypeptide form a dimer, an antigen-binding site capable of specifically binding to a target antigen, (b) a dimer composed of two polypeptide sequences, one of which is a polypeptide sequence A first Fc domain or a variant thereof linked to the first polypeptide of the antigen-binding site, and (c) a dimer of two polypeptide sequences, wherein one polypeptide sequence binds to the second polypeptide of the antigen-binding site. It may be a fusion protein comprising a second Fc domain or a variant thereof.
  • the first polypeptide of the antigen-binding portion may include CDR1, CDR2, and CDR3 of the antibody heavy chain
  • the second polypeptide of the antigen-binding portion may include CDR1, CDR2, and CDR3 of the antibody light chain
  • the first polypeptide of the antigen-binding site may further include a CH1 region of an antibody heavy chain
  • the second polypeptide of the antigen-binding site may further include a constant region of an antibody light chain.
  • the antigen binding site may specifically bind to a protein expressed on the cell surface.
  • the antigen binding site may specifically bind to a cancer antigen.
  • the antigen binding site is PD-L1, EGFR, EGFRvIII, BCMA, CD22, CD25, CD30, CD33, CD37, CD38, CD52, CD56, CD123, c-Met (MET), DLL3, DR4, DR5 , GD2, Nectin-4, RANKL, SLAMF7, Trop-2, LIV-1, Claudin 18.2, IL13 ⁇ 2, CD3, HER2, HER3, FGFR2, FGFR3, GPC3, ROR1, Fol ⁇ , CD20, CD19, CTLA-4, VEGFR, NCAM1, ICAM-1, ICAM-2, CEACAM5, CEACAM6, Carcinoembryonic antigen (CEA), CA-125, Alphafetoprotein (AFP), MUC-1, MUC-16, PSMA, PSCA, Epithelial tumor antigen (ETA), Melanoma- associated antigen (MAGE), Immature laminin receptor, TAG-72, HPV E6/E7, BING-4, Calcium-
  • the second antigen-binding site may also specifically bind to any one antigen selected from the above group.
  • the antigen to which the first antigen-binding site binds and the antigen to which the second antigen-binding site binds may be different.
  • the first antigen-binding site may include a sequence that specifically binds to HER2 and the second antigen-binding site may include a sequence that specifically binds to EGFR.
  • the first antigen-binding site may include a sequence that specifically binds to one epitope of an antigen and the second antigen-binding site may include a sequence that specifically binds to a different epitope of the same antigen.
  • the antigen binding site may include a variable region that specifically binds to the antigen.
  • the variable region is Cetuximab, Panitumumab, Necitumumab, Imgatuzumab, Depatuxizumab, Losatuxizumab, Etevritamab, AMG-595, Atezolizumab, Avelumab, Durvalumab, Trastuzumab, Pertuzumab, Onartuzumab, Emibetuzumab, Telisotuzumab, Datopotamab, Tarbalatamab, Belantamapituzumab, and Rovalamapituzumab.
  • Ladiratuzumab, Codrituzumab, Aprutumab, Bemarituzumab, Vofatamab, Ramucirumab, Rituximab, Obinutuzumab, Daratumumab, and 1C1 may include a heavy chain variable region and a light chain variable region of any one antibody, but are limited thereto It doesn't work.
  • Cetuximab may include a heavy chain variable region including H-CDR1 represented by SEQ ID NO: 175, H-CDR2 represented by SEQ ID NO: 176, and H-CDR3 represented by SEQ ID NO: 177, and SEQ ID NO: 178 It may include a light chain variable region including L-CDR1 represented by SEQ ID NO: 179, L-CDR2 represented by SEQ ID NO: 179, and L-CDR3 represented by SEQ ID NO: 180.
  • Another example may include a heavy chain variable region including H-CDR1 represented by SEQ ID NO: 181, H-CDR2 represented by SEQ ID NO: 182, and H-CDR3 represented by SEQ ID NO: 183 of Panitumumab, It may include a light chain variable region including L-CDR1 represented by 184, L-CDR2 represented by SEQ ID NO: 185, and L-CDR3 represented by SEQ ID NO: 186.
  • Necitumumab may include a heavy chain variable region including H-CDR1 represented by SEQ ID NO: 187, H-CDR2 represented by SEQ ID NO: 188, and H-CDR3 represented by SEQ ID NO: 189, It may include a light chain variable region including L-CDR1 represented by 190, L-CDR2 represented by SEQ ID NO: 191, and L-CDR3 represented by SEQ ID NO: 192.
  • H-CDR1 represented by SEQ ID NO: 193, H-CDR2 represented by SEQ ID NO: 194, and H-CDR3 represented by SEQ ID NO: 195 of Imgatuzumab, represented by SEQ ID NO: 196
  • It may include a light chain variable region including L-CDR1 represented by SEQ ID NO: 197, L-CDR2 represented by SEQ ID NO: 197, and L-CDR3 represented by SEQ ID NO: 198.
  • H-CDR1 represented by SEQ ID NO: 199
  • H-CDR2 represented by SEQ ID NO: 200
  • H-CDR3 represented by SEQ ID NO: 201 of Depatuxizumab
  • SEQ ID NO: 202 It may include a light chain variable region including L-CDR1 represented by SEQ ID NO: 203, L-CDR2 represented by SEQ ID NO: 203, and L-CDR3 represented by SEQ ID NO: 204.
  • H-CDR1 represented by SEQ ID NO: 199
  • H-CDR2 represented by SEQ ID NO: 205
  • H-CDR3 represented by SEQ ID NO: 206 of Losatuxizumab
  • SEQ ID NO: 202 It may include a light chain variable region including L-CDR1 represented by SEQ ID NO: 203, L-CDR2 represented by SEQ ID NO: 203, and L-CDR3 represented by SEQ ID NO: 204.
  • an antigen binding site that specifically binds to EGFRvIII may be included.
  • it may include a heavy chain variable region including H-CDR1 represented by SEQ ID NO: 207, H-CDR2 represented by SEQ ID NO: 208, and H-CDR3 represented by SEQ ID NO: 209 of Etevritamab, and SEQ ID NO: 210
  • It may include a light chain variable region including L-CDR1 represented by SEQ ID NO: 211, L-CDR2 represented by SEQ ID NO: 211, and L-CDR3 represented by SEQ ID NO: 212.
  • H-CDR1 represented by SEQ ID NO: 213 of AMG-595
  • H-CDR2 represented by SEQ ID NO: 214
  • H-CDR3 represented by SEQ ID NO: 215, and SEQ ID NO: 210
  • L-CDR1 represented by SEQ ID NO: 216
  • L-CDR2 represented by SEQ ID NO: 216
  • L-CDR3 represented by SEQ ID NO: 217.
  • an antigen binding site that specifically binds to PD-L1 may be included.
  • atezolizumab may include a heavy chain variable region including H-CDR1 represented by SEQ ID NO: 218, H-CDR2 represented by SEQ ID NO: 219, and H-CDR3 represented by SEQ ID NO: 220, and SEQ ID NO: 221 It may include a light chain variable region including L-CDR1 represented by SEQ ID NO: 222, L-CDR2 represented by SEQ ID NO: 222, and L-CDR3 represented by SEQ ID NO: 223.
  • H-CDR1 represented by SEQ ID NO: 224
  • H-CDR2 represented by SEQ ID NO: 225
  • H-CDR3 represented by SEQ ID NO: 226 of Avelumab, represented by SEQ ID NO: 227
  • L-CDR1 represented by SEQ ID NO: 228, L-CDR2 represented by SEQ ID NO: 228, and L-CDR3 represented by SEQ ID NO: 229.
  • an antigen binding site that specifically binds to HER2 may be included.
  • Trastuzumab may include a heavy chain variable region including H-CDR1 represented by SEQ ID NO: 21, H-CDR2 represented by SEQ ID NO: 22, and H-CDR3 represented by SEQ ID NO: 23, and SEQ ID NO: 24 It may include a light chain variable region including L-CDR1 represented by SEQ ID NO: 25, L-CDR2 represented by SEQ ID NO: 25, and L-CDR3 represented by SEQ ID NO: 26.
  • an antigen binding site that specifically binds to the CD20 may be included.
  • Rituximab may include a heavy chain variable region including H-CDR1 represented by SEQ ID NO: 314, H-CDR2 represented by SEQ ID NO: 315, and H-CDR3 represented by SEQ ID NO: 316, and SEQ ID NO: 317 It may include a light chain variable region including L-CDR1 represented by SEQ ID NO: 318, L-CDR2 represented by SEQ ID NO: 318, and L-CDR3 represented by SEQ ID NO: 319.
  • HER-2/neu human epidermal growth factor receptor 2
  • PI3K/AkT PI3K/AkT
  • Her2/neu target The anticancer agent may be Trastuzumab or Pertuzumab, but is not limited thereto.
  • FGFR Fibroblast growth factor receptor
  • FGF fibroblast growth factor
  • the FGFR gene is frequently mutated, and these variants are commonly observed in breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, cervical cancer, and the like.
  • Four FGFR genes are made of seven signaling receptors, among which FGFR2 and FGFR3 are highly cancer-specific antigens.
  • An antibody targeting FGFR2 or FGFR3 may be Aprutumab, Bemarituzumab, or Vofatamab, but is not limited thereto.
  • EphA2 (EPH receptor A2): It is overexpressed in cancer cells and has a great effect on the growth and metastasis of cancer cells, and an antibody targeting this may be 1C1, but is not limited thereto.
  • VH region comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 218 (VH-CDR1), SEQ ID NO: 219 (VH-CDR2) and SEQ ID NO: 220 (VH-CDR3) (SEQ ID NO: 350), and SEQ ID NO: 221 (VL-CDR1 ), the VL region (SEQ ID NO: 351) comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 222 (VL-CDR2) and SEQ ID NO: 223 (VL-CDR3);
  • VH region comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 236 (VH-CDR1), SEQ ID NO: 237 (VH-CDR2) and SEQ ID NO: 238 (VH-CDR3) (SEQ ID NO: 358), and SEQ ID NO: 239 (VL-CDR1)
  • VL region SEQ ID NO: 359 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 240 (VL-CDR2) and SEQ ID NO: 241 (VL-CDR3)
  • VH region comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 266 (VH-CDR1), SEQ ID NO: 267 (VH-CDR2) and SEQ ID NO: 268 (VH-CDR3) (SEQ ID NO: 368), and SEQ ID NO: 269 (VL-CDR1) ), the VL region (SEQ ID NO: 369) comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 270 (VL-CDR2) and SEQ ID NO: 271 (VL-CDR3);
  • VH region comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 99 (VH-CDR1), SEQ ID NO: 100 (VH-CDR2) and SEQ ID NO: 101 (VH-CDR3) (SEQ ID NO: 87), and SEQ ID NO: 102 (VL-CDR1)
  • VL region comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 103 (VL-CDR2) and SEQ ID NO: 104 (VL-CDR3)
  • VH region comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 302 (VH-CDR1), SEQ ID NO: 303 (VH-CDR2) and SEQ ID NO: 304 (VH-CDR3) (SEQ ID NO: 380), and SEQ ID NO: 305 (VL-CDR1)
  • VL region SEQ ID NO: 381 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 306 (VL-CDR2) and SEQ ID NO: 307 (VL-CDR3)
  • VEGFR2 VEGFR2
  • VH region comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 308 (VH-CDR1), SEQ ID NO: 309 (VH-CDR2) and SEQ ID NO: 310 (VH-CDR3) (SEQ ID NO: 382), and SEQ ID NO: 311 (VL-CDR1) ), the VL region (SEQ ID NO: 383) comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 312 (VL-CDR2) and SEQ ID NO: 313 (VL-CDR3);
  • VH region comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 314 (VH-CDR1), SEQ ID NO: 315 (VH-CDR2) and SEQ ID NO: 316 (VH-CDR3) (SEQ ID NO: 384), and SEQ ID NO: 317 (VL-CDR1) ), the VL region (SEQ ID NO: 385) comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 318 (VL-CDR2) and SEQ ID NO: 319 (VL-CDR3);
  • VH region comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 320 (VH-CDR1), SEQ ID NO: 321 (VH-CDR2) and SEQ ID NO: 322 (VH-CDR3) (SEQ ID NO: 386), and SEQ ID NO: 323 (VL-CDR1) ), the VL region (SEQ ID NO: 387) comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 324 (VL-CDR2) and SEQ ID NO: 325 (VL-CDR3);
  • VH region comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 326 (VH-CDR1), SEQ ID NO: 327 (VH-CDR2) and SEQ ID NO: 328 (VH-CDR3) (SEQ ID NO: 388), and SEQ ID NO: 329 (VL-CDR1) ), the VL region (SEQ ID NO: 389) comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 330 (VL-CDR2) and SEQ ID NO: 331 (VL-CDR3);
  • VH region comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 157 (VH-CDR1), SEQ ID NO: 158 (VH-CDR2) and SEQ ID NO: 159 (VH-CDR3) (SEQ ID NO: 143), and SEQ ID NO: 160 (VL-CDR1)
  • VL region SEQ ID NO: 145) comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 161 (VL-CDR2) and SEQ ID NO: 162 (VL-CDR3).
  • Table 2 shows nucleotide sequences and polypeptide sequences of exemplary signal sequences for efficiently expressing fusion proteins according to various embodiments.
  • SEQ ID NO: 333 may be used as a signal sequence, but is not limited thereto.
  • variable region polypeptide sequences of anticancer antibodies described as antigen binding sites of various fusion proteins described herein Fusion proteins according to exemplary embodiments may comprise (comprising) these variable region polypeptides or consist of these variable region polypeptides (consists of).
  • Table 4 shows the nucleotide sequences of the variable regions of anti-cancer antibodies described herein as antigen-binding sites of various fusion proteins.
  • each of the above-described first Fc domain and the second Fc domain may be an Fc region of an immunoglobulin.
  • the Fc region of the immunoglobulin may be a wild-type Fc domain as well as an Fc domain variant.
  • the Fc region may be an IgG, IgA, IgE, IgD or IgM Fc region.
  • Fc domain variant refers to a glycosylation pattern different from that of the wild-type Fc domain, increased sugar chains compared to the wild-type Fc domain, decreased sugar chains compared to the wild-type Fc domain, or deglycosylated sugar chains.
  • the Fc domain or variant may have sialic acid, fucosylation, and glycosylation of numbers adjusted through culture conditions or genetic manipulation of the host.
  • the sugar chain of the Fc domain of immunoglobulin can be modified by conventional methods such as chemical methods, enzymatic methods, and genetic engineering methods using microorganisms.
  • the Fc domain variant may be a mixed form of an Fc region of immunoglobulin IgG, IgA, IgE, IgD or IgM.
  • the Fc domain variant may be a form in which some amino acids of the Fc domain are substituted with other amino acids.
  • Amino acid introduced by the above substitution and/or addition is lysine (K), alanine (A), arginine (R), asparagine (N), aspartic acid (D), cysteine (C), glutamine (Q ), glutamic acid (E), glycine (G), histidine (H), isoleucine (I), leucine (L), methionine (M), phenylalanine (F), proline (P), serine (S), threonine (T ), it may be any one selected from the group consisting of tryptophan (W), tyrosine (Y) and valine (V).
  • Fc region may be a form in which amino acids 239 and/or 332 of the CH2 region are substituted with other amino acids (see Kabat numbering system).
  • S239 may be substituted with an amino acid other than S, and specifically, may be substituted with S239D.
  • I332 may be substituted with an amino acid other than I, and specifically, may be substituted with I332E.
  • the Fc region may include a knob structure or a hole structure.
  • the term "knob-into-hole” refers to antibodies that specifically bind to different regions, such as bispecific antibodies, multispecific antibodies, or heterodimeric antibodies. It is a design strategy for manufacturing. Generally, this technique involves placing a knob on the interface of a first polypeptide (e.g., the first CH3 domain of a first antibody heavy chain) and a knob on the interface of a second polypeptide (e.g., the second CH3 domain of a second antibody heavy chain). This may include introducing a corresponding hole, such that a knob is positioned within the hole to promote heterodimer formation and hinder homodimer formation.
  • a first polypeptide e.g., the first CH3 domain of a first antibody heavy chain
  • a knob on the interface of a second polypeptide e.g., the second CH3 domain of a second antibody heavy chain
  • a 'knob' is constructed by replacing small amino acid side chains from the interface of the first polypeptide (eg the first CH3 domain of the first antibody heavy chain) with larger side chains (eg arginine, phenylalanine, tyrosine or tryptophan).
  • Complementary 'holes' of the same or similar size in the knob may be formed at the interface of the second polypeptide (eg, the second CH3 domain of the second antibody heavy chain) by replacing the large amino acid side chains with smaller side chains (eg, alanine, serine, valine, or threonine).
  • the knobs and holes can be created by altering the nucleic acid encoding the polypeptide, eg, by site-directed mutagenesis or by peptide synthesis.
  • WO2014084607A1 is, for example, a CH3 domain (a-1) binding of tryptophan (W) substituted at Lys409 of one CH3 domain and valine (V) substituted at Asp399 of another CH3 domain and threonine (T) substituted at Phe405.
  • W tryptophan
  • V valine
  • T threonine
  • (a-2) a combination of serine (S) substituted at Tyr349 of one CH3 domain and tryptophan (W) substituted at Glu357 of another CH3 domain, and in addition (b-1) Lys360 of one CH3 domain.
  • the positions of the amino acid residues are according to the EU index.
  • WO2018059502A1 describes, for example, mutations in the Fc domain comprising one or more mutations selected from each of the following a) - e): a) L351G, L351Y, L351V, L351P, L351D, L351E, L351K, or L351W; b) T366L, T366P, T366W, or T366V;c) D399C, D399N, D399I, D399G, D399R, D399T, or D399Y, 0) Y407P, Y407F, Y407T, or Y407H; and e) K409C , K409P, K409S, K409F, K409V, K409Q, or K409R.
  • the positions of the amino acid residues are according to the EU index.
  • n and m are each independently 0 or 1
  • the X includes a heavy chain variable region or a light chain variable region of an antibody that specifically binds to an antigen
  • Y includes a light chain variable region or a heavy chain variable region of an antibody that specifically binds to an antigen
  • the X and Y combine with each other to form an antigen-binding site (a) that specifically binds to an antigen
  • polypeptides of (I), (II), (III) and (IV) may combine to form one antigen-binding site and two Fc domains.
  • the X is the first polypeptide sequence of the antigen-binding site, and is a sequence comprising the heavy chain CDR1, CDR2, or CDR3 sequence of an antibody that specifically binds to the first antigen, or a sequence that specifically binds to the first antigen. It includes a heavy chain variable region of an antibody; Y is the second polypeptide sequence of the antigen-binding site, and is a sequence comprising the light chain CDR1, CDR2, or CDR3 sequences of an antibody that specifically binds to the first antigen, or a light chain of an antibody that specifically binds to the first antigen. contains a variable region; The X and Y combine to form the antigen-binding site (a) that specifically binds to an antigen.
  • the CH3 region may be mutated so that interactions between A and B and C and D are minimized and heterodimeric Fc formation between A and C and B and D is promoted.
  • the Fc domain monomer comprises a knob structure or a hole structure that promotes the formation of an Fc heterodimer (heterodimeric Fc);
  • the Fc domain monomer may include a variant promoting heterodimer formation by an electrostatic steering mechanism.
  • X of Structural Formula (I) may additionally include a heavy chain CH1 region, and/or Y of Structural Formula (II) may additionally include a light chain constant region.
  • the fusion protein may include polypeptide chains represented by the following structural formulas (I'), (II'), (III) and (IV):
  • N' is the N-terminus of the polypeptide chain
  • C' is the C-terminus of the polypeptide chain
  • A, B, C and D are monomeric polypeptide sequences of an Fc domain comprising CH2 and CH3 regions of an immunoglobulin, optionally further comprising CH4 and/or a hinge sequence, wherein A is combined with one of C or D dimerize together to form the first Fc domain (b), and B dimerize with the remaining one of C or D to form the second Fc domain (c);
  • n, m, p and q are each independently 0 or 1
  • the VD1 is composed of an antibody heavy or light chain variable region or an antibody heavy or light chain CDR1, CDR2, and CDR3 that specifically binds to an antigen;
  • the VD2 is composed of a light chain or heavy chain variable region of an antibody that specifically binds to an antigen or an antibody heavy or light chain CDR1, CDR2, and CDR3;
  • the X includes an antibody heavy or light chain variable region or an antibody heavy or light chain CDR1, CDR2, and CDR3 that specifically bind to an antigen;
  • X and Y combine to form a first antibody variable region that specifically binds to the first antigen
  • the CH3 region may be mutated so that interactions between A and B and C and D are minimized and heterodimeric Fc formation between A and C and B and D is promoted.
  • the Fc domain monomer comprises a knob structure or a hole structure that promotes the formation of an Fc heterodimer (heterodimeric Fc);
  • the Fc domain monomer may include a variant promoting heterodimer formation by an electrostatic steering mechanism.
  • the heavy chain variable region may additionally include a heavy chain CH1 region.
  • the light chain variable region may additionally include a light chain constant region.
  • a hinge is an immunoglobulin-derived hinge region.
  • the antibody hinge region is an IgG hinge region.
  • An IgG hinge region provided herein can be selected from, for example, antibody hinge regions of various IgG subtypes. The table below lists exemplary IgG subtypes with core hinge sequences that can be included in the flexible peptide regions provided herein.
  • at least one Cys may exist in the hinge. Specifically, one, two, or three Cys may exist in the hinge.
  • the hinge can be modified to delete disulfide bonds or introduce additional disulfide bonds.
  • each of the linkers L1 and L2 may include 1 to about 70 amino acids.
  • the L1 and L2 may each include about 5 to about 60, about 10 to about 50, about 15 to about 40, and about 20 to about 30 amino acids.
  • L1 and L2 are each 1-70 amino acid residues, 2-60 amino acid residues, 2-50 amino acid residues, 2-40 amino acid residues, 2-30 amino acid residues, 3- 50 amino acid residues, 3-40 amino acid residues, 3-30 amino acid residues, 2-28 amino acid residues, 2-26 amino acid residues, 2-24 amino acid residues, 2-22 amino acid residues, 2-20 amino acid residues, 2-18 amino acids residues, 2-16 amino acid residues, 2-14 amino acid residues, 2-12 amino acid residues, 2-10 amino acid residues.
  • the L1 and L2 may include the amino acid sequence of (G4S)o (where o is an integer from 1 to 5) in Table 6 below, but is not limited thereto.
  • L1 and L2 may have different amino acid sequences.
  • L1 and L2 may include at least one Cys.
  • a disulfide bond may be formed through Cys present in L1 and L2.
  • each of L3 and L4 may include 1 to about 30 amino acids.
  • the L3 and L4 may each include about 5 to about 25, about 10 to about 20, and about 15 amino acids.
  • L3 and L4 are each 2-30 amino acid residues, 2-25 amino acid residues, 2-20 amino acid residues, 2-15 amino acid residues, 3-30 amino acid residues, 2-28 amino acid residues, 2-26 amino acid residues, 2-24 amino acid residues, 2-22 amino acid residues, 2-20 amino acid residues, 2-18 amino acid residues, 2-16 amino acid residues, 2-14 amino acid residues, 2-12 amino acid residues, 2- It can be a peptide consisting of 10 amino acid residues.
  • the L3 and L4 may include the amino acid sequence of (G4S) o (where o is an integer from 1 to 5) in Table 6, but is not limited thereto. Also, L3 and L4 may have different amino acid sequences.
  • Fusion protein containing one antigen binding site and two Fc
  • the fusion protein includes polypeptides of structural formulas (I), (II), (III) and (IV), wherein X is a heavy chain variable region and additionally includes CH1, and Y is As a light chain variable region, it includes a light chain constant region. In addition, it binds to the CH1 structure and Cys in the light chain variable region to form a Fab structure.
  • n is 0, CH1 is directly bonded to the hinge, m is 1, and L2 includes a peptide linker.
  • a and C combine to form a first Fc domain
  • B and D combine to form a second Fc domain.
  • a hole structure is included in the CH3 region of A and a knob structure is included in the CH3 region of C.
  • a hole structure is included in the CH3 region of B and a knob structure is included in the CH3 region of D.
  • the antigen-binding site, antigen, hinge, linker and Fc are as described above.
  • the fusion protein includes polypeptides of structural formulas (I), (II), (III) and (IV), wherein X is a heavy chain variable region and additionally includes CH1, and Y is As a light chain variable region, it includes a light chain constant region. In addition, it binds to the CH1 structure and Cys in the light chain variable region to form a Fab structure.
  • n is 0, CH1 is directly bonded to the hinge, m is 1, and L2 includes a peptide linker.
  • a and C combine to form a first Fc domain
  • B and D combine to form a second Fc domain.
  • X and Y combine to form a variable region of Pertuzumab
  • VD1 and VD2 combine to form a variable region of Trastuzumab.
  • the antigen-binding site, antigen, hinge, linker and Fc are as described above.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the fusion protein as an active ingredient.
  • the cancer is gastric cancer, liver cancer, lung cancer, colon cancer, breast cancer, prostate cancer, skin cancer, bone cancer, multiple myeloma, glioma, ovarian cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, thyroid cancer, laryngeal cancer, acute myelogenous leukemia, chronic myelogenous leukemia, acute It may be any one selected from the group consisting of lymphoblastic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, brain tumor, neuroblastoma, retinoblastoma, head and neck cancer, salivary gland cancer, and lymphoma.
  • Another aspect of the present invention provides a polynucleotide encoding a polypeptide of formula (I), (II), (III) and/or (IV) above.
  • Another aspect of the present invention provides a polynucleotide encoding a polypeptide of formula (I'), (II'), (III) and/or (IV) above.
  • the polynucleotide may additionally include a nucleic acid encoding a signal sequence or a leader sequence.
  • signal sequence refers to a signal peptide that directs the secretion of a target protein.
  • the signal peptide is cleaved after translation in the host cell.
  • the signal sequence is an amino acid sequence that initiates movement of a protein through an endoplasmic reticulum (ER) membrane.
  • the vector may include a polynucleotide encoding a polypeptide of structure (I), (II), (III) and/or (IV).
  • the vector may include a polynucleotide encoding a polypeptide of formula (I'), (II'), (III) and/or (IV).
  • the vector can be introduced into a host cell and recombine and integrate into the host cell genome.
  • the vector is understood to be a nucleic acid vehicle comprising a polynucleotide sequence capable of autonomous replication as an episome.
  • Such vectors include linear nucleic acids, plasmids, phagemids, cosmids, RNA vectors, viral vectors and analogues thereof.
  • examples of viral vectors include, but are not limited to, retroviruses, adenoviruses, and adeno-associated viruses.
  • the vector may be plasmid DNA, phage DNA, etc., commercially developed plasmids (pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP, etc.), Escherichia coli-derived plasmids (pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119, etc.), Bacillus subtilis plasmids derived from spp.
  • pUB110, pTP5, etc. yeast-derived plasmids (YEp13, YEp24, YCp50, etc.), phage DNA (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, ⁇ gt10, ⁇ gt11, ⁇ ZAP, etc.), animal virus vectors (retrovirus ), adenovirus, vaccinia virus, etc.), insect virus vector (Baculovirus, etc.). Since the expression level and modification of the protein of the vector appear differently depending on the host cell, it is preferable to select and use the host cell most suitable for the purpose.
  • Host cells of the transformed cells may include, but are not limited to, prokaryotic cells, eukaryotic cells, mammalian cells, plants, insects, fungi, or cells of cellular origin.
  • prokaryotic cell Escherichia coli may be used.
  • yeast may be used as an example of a eukaryotic cell.
  • CHO cells, F2N cells, CSO cells, BHK cells, Bowes melanoma cells, HeLa cells, 911 cells, AT1080 cells, A549 cells, HEK 293 cells, or HEK293T cells may be used as the mammalian cells.
  • any cell that can be used as a mammalian host cell known to those skilled in the art can be used.
  • the sugar chain pattern of the fusion protein eg, sialic acid, fucosylation, glycosylation.
  • Another aspect of the present invention i) culturing the transformed cells; and ii) recovering the produced fusion protein, providing a method for producing a fusion protein comprising an antigen binding site, a first Fc domain or variant thereof, and a second Fc domain or variant thereof.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition comprising the fusion protein as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition may be used to prevent or treat cancer, for example, gastric cancer, liver cancer, lung cancer, colon cancer, breast cancer, prostate cancer, gallbladder cancer, bladder cancer, kidney cancer, esophageal cancer, skin cancer, rectal cancer, osteosarcoma, multiple myeloma, glioma, and ovarian cancer.
  • cancer for example, gastric cancer, liver cancer, lung cancer, colon cancer, breast cancer, prostate cancer, gallbladder cancer, bladder cancer, kidney cancer, esophageal cancer, skin cancer, rectal cancer, osteosarcoma, multiple myeloma, glioma, and ovarian cancer.
  • pancreatic cancer cervical cancer, endometrial cancer, thyroid cancer, laryngeal cancer, testicular cancer, mesothelioma, acute myeloid leukemia, chronic myelogenous leukemia, acute lymphoblastic leukemia, chronic lymphoblastic leukemia, brain tumor, neuroblastoma, retinoblastoma, head and neck cancer, salivary gland It can be used for the prevention or treatment of cancer, which is any one selected from the group consisting of cancer and lymphoma.
  • the term “treatment” may be used to include both therapeutic treatment and prophylactic treatment. At this time, prevention may be used in the sense of alleviating or reducing the pathological condition or disease of the subject.
  • the term “treatment” includes any form of administration or application to treat a disease in a mammal, including humans. The term also includes inhibiting or slowing the progression of a disease; restoring or repairing a damaged or missing function, thereby partially or completely alleviating the disease; or stimulate inefficient processes; It includes the meaning of alleviating serious illness.
  • terapéuticaally effective amount or “pharmaceutically effective amount” is an amount of a compound or composition effective for preventing or treating a target disease, sufficient to treat the disease with a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment It means an amount that does not cause side effects.
  • the level of the effective amount is the patient's state of health, type of disease, severity, activity of the drug, sensitivity to the drug, method of administration, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, factors including drugs used in combination or concurrently, and It may be determined according to other factors well known in the medical field.
  • a therapeutically effective amount refers to an amount of a drug effective to treat cancer.
  • the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may be any carrier as long as it is a non-toxic material suitable for delivery to a patient. Distilled water, alcohol, fats, waxes and inert solids may be included as carriers. A pharmacologically acceptable adjuvant (buffer, dispersant) may also be included in the pharmaceutical composition.
  • the preferred dosage of the pharmaceutical composition is in the range of 0.01 ⁇ g/kg to 10 g/kg, or 0.01 mg/kg to 1 g/kg per day depending on the condition, weight, sex, age, severity of the patient, and route of administration of the patient. can be Administration can be done once a day or divided into several times. These dosages should not be construed as limiting the scope of the present invention in any respect.
  • compositions are mammals including dogs, cats, humans, etc., and humans are particularly preferred.
  • pharmaceutical composition of the present application may further include any compound or natural extract known to have a tumor treatment effect.
  • Another aspect of the present invention provides a method for treating or preventing cancer comprising administering to a subject a fusion protein comprising an antigen binding site, a first Fc domain or a variant thereof, and a second Fc domain or variant thereof. do.
  • the subject may be a subject suffering from cancer.
  • the subject may be a mammal, preferably a human.
  • the administration route, dosage and frequency of administration of the fusion protein can be administered to the subject in various ways and amounts depending on the condition of the patient and the presence or absence of side effects, and the optimal administration method, dosage and frequency of administration can be determined by those skilled in the art. range can be selected.
  • the fusion protein may be administered in combination with other drugs or physiologically active substances known to have therapeutic effects on the disease to be treated, or formulated in combination with other drugs.
  • Natural human immunoglobulin G is composed of two fragment antigen-binding (Fab) regions and one fragment crystallizable (Fc) region (FIG. 1a). Human IgG binds monovalently or bivalently to target antigens and, in some cases, has 0.5 to 1 Fc region per target antigen (FIGS. 1c, 1d, and 1e).
  • An object of the present invention is to improve effector function by increasing the amount of Fc region present per antigen while having a molecular weight similar to that of an antibody and having a homogeneous composition. Therefore, a novel antibody structure having two Fc regions similar to the molecular weight of human IgG antibody in nature (about 150 kDa) was devised (Fig. 1b), and this form binds to cancer cell surface antigen compared to existing antibodies, It has a maximum of 4 times the Fc region (Fig. 1b, Fig. 1f).
  • Trastuzumab was used as a template to implement the aforementioned novel antibody construct (FIG. 2a).
  • an artificial disulfide bond was introduced by substituting a specific amino acid with cysteine (FIGS. 2b, 2c, and 2d).
  • the position of the amino acid constituting the antibody follows the Kabat numbering rules.
  • Knob-into-hole mutation technology was applied to the Fc domain (SEQ ID NO: 3) of human immunoglobulin G1 (Immunoglobulin G1; IgG1) to , Knob mutation-bearing Fc (S354C, T366W; SEQ ID NO: 4) and Hole mutation-bearing Fc (Y349C, T366S, L368A, Y407V; SEQ ID NO: 5) polypeptides were designed.
  • the purified product was analyzed using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and size exclusion chromatography (SEC) (FIGS. 4 and 5a to 5d).
  • SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
  • SEC size exclusion chromatography
  • P01 is an expression vector composed of sequences corresponding to Fc-Hole (SEQ ID NO: 7), PerH-G44C-Knob (SEQ ID NO: 29), and PerL-Q100C-Knob (SEQ ID NO: 30), EXPICHO-S TM , Gibco, A29127) was co-transfected (Co-transfection), and purification and analysis were performed in the manner described in Example 1.
  • Papain digestion of H01 and P01 was performed.
  • Papain (Sigma, P3125) was used after being diluted to 0.1 mg/mL in digestion buffer (20 mM EDTA + 10 mM Cys-HCl in PBS pH 7.4). 200 ⁇ g of H01 and P01 were digested at 37° C. for 2 hours, followed by SDS-PAGE.
  • an abnormal (Fc) 2 at about 100 kDa was not confirmed (FIG. 8c, 8d).
  • Table 18 shows the nucleotide sequences encoding wtFc of HO1wt, TraH-G44C-wtFc, and TraL-Q100C-wtFc.
  • Table 20 shows the polypeptide sequences constituting H01Fv1 to H01Fv7.
  • Table 21 shows the nucleotide sequences encoding the polypeptides constituting H01Fv1 to H01Fv7.
  • An expression vector composed of sequences corresponding to Fc-Hole-RF (SEQ ID NO: 789), H01Fv1-HC (SEQ ID NO: 790), and H01Fv1-LC (SEQ ID NO: 791) was prepared by EXPICHO-S TM ; Gibco, A29127 ), when co-transfected, H01Fv1 is formed (FIG. 10, Table 20, Table 21). Then, it was purified through affinity chromatography using MABSELECT TM PrismA (Cytiva, 17549853).
  • the Fc-Hole (SEQ ID NO: 7) polypeptide can form an Fc-Hole/Fc-Hole dimer, and to prevent this, H435R and Y436F mutations are induced in the Fc-Hole (SEQ ID NO: 7) polypeptide sequence, -RF (SEQ ID NO: 789) polypeptide was prepared (FIG. 10, Table 20, Table 21). This prevents binding to Protein A resin and removes the mispaired Fc-Hole/Fc-Hole dimer (Figs. 10 and 11). As a result of SDS-PAGE analysis, the main product was confirmed near about 130 kDa under non-reducing conditions (NR) (FIG. 11), and monomer purity was confirmed through SEC (FIG. 12).
  • H01Fv3 mostly exists in the form of about 65 kDa in an unpaired form, and the fully assembled monomer purity was confirmed to be 14.66% (FIGS. 11 and 12c). It was confirmed that H01Fv1, H01Fv2, H01Fv4, H01Fv5, H01Fv6, and H01Fv7 had monomer purity of 71.24%, 61.25%, 68.55%, 73.05%, 67.73%, and 79.33%, respectively (FIG. 12).
  • H01Fv1, H01Fv2, H01Fv4, H01Fv5, H01Fv6, and H01Fv7 were analyzed using Bio-Layer Interferometry (BLI) analysis equipment Octet Red96e (Sartorius) (FIG. 13).
  • BBI Bio-Layer Interferometry
  • H01Fv1, H01Fv2, H01Fv4, H01Fv5, H01Fv6, and H01Fv7 were analyzed using Bio-Layer Interferometry (BLI) analysis equipment Octet Red96e (Sartorius) (FIG. 13).
  • Human Her2 recombinant protein R&D systems, 1129-ER
  • H01Fv5H01Fv6, and H01Fv7 are calculated (FIG. 13, Table 22).
  • the T m1 values were 68, 68, 66, and 66 ° C for Trastuzumab, Pertuzumab, H01, and P01, respectively, and the T m2 values were 81, 79, 83, and 83 ° C, respectively. It was confirmed (FIG. 14, Table 23).
  • the binding shift values of H01 + P01 bound to the HER2-loaded sensor and the binding shift values of Trastuzumab + Pertuzumab were 1.477 nm (y-axis value at 4140 s - y-axis value at 1260 s), 0.923 nm (y-axis value at 4140 s), respectively. axis value - y axis value of 1260 s).
  • the binding shift value increases, so it was confirmed that when H01 and P01 were bound to the same amount of HER2, a greater amount of antibody was bound than when Trastuzumab and Pertuzumab were bound ( Figure 15, Table 24).
  • P01DE4 is Fc-Hole-S239D-I332E (Table 26, Table 27, and SEQ ID NO: 42), PerH-G44C-Knob-S239D-I332E (Table 26, Table 27, and SEQ ID NO: 45), PerL-Q100C-Knob- A vector capable of expressing a polypeptide corresponding to S239D-I332E (Table 26, Table 27, and SEQ ID NO: 46) was co-transfected with EXPICHO-S TM (Gibco, A29127) manufactured.
  • K a and K d values were calculated through a 1:1 binding model in Octet analysis software (Sartorius), and based on this, the equilibrium dissociation constant (K D ) value was determined (FIGS. 21a to 21h, 22a to 22a). 22h, FIGS. 23A-23H, Table 29).
  • Standard quantitative samples of H01, P01 Trastuzumab, and Pertuzumab were prepared and used for quantification, and the concentration of the analyte at each time was quantified through a standard curve generated from naive rat serum containing each concentration.
  • Intravenous administration the half-lives of H01, P01, Trastuzumab, and Pertuzumab were confirmed to be about 11.8 days, 14.2 days, 7.3 days, and 11.6 days, respectively (FIGS. 24a and 24b, Table 30). It was confirmed that H01 and P01, the novel engineered constructs, had PK parameters similar to those of the humanized antibodies Trastuzumab and Pertuzumab.
  • a biparatopic antibody structure HP501 was designed in which the V domains of Trastuzumab and Pertuzumab were connected by a linker (FIG. 25).
  • the length of the linker connecting the V domains is changed, and at the same time, a Cys substitution mutation that can form a disulfide bond with the V domain is introduced to improve protein properties. 16 constructs were designed (FIG. 26, Table 31). According to the Kabat numbering standard, mutations were introduced only at position 44 for the heavy chain and position 100 for the light chain (Table 31).
  • VH linker with 6 amino acid residues is VH-S-Linker
  • VH linker with 13 amino acid residues is VH-L-Linker
  • VL linker with 6 amino acid residues is VL-S-Linker
  • 13 amino acid residues The VL linker has been named VL-L-Linker.
  • HP501 is an expression vector composed of sequences corresponding to Fc-Hole (SEQ ID NO: 7), TH-S-PH-Knob (SEQ ID NO: 51), and TL-S-PL-Knob (SEQ ID NO: 59) Expicho-S ( EXPICHO-S TM ; Gibco, A29127) was co-transfected (Tables 31, 32, 33, 34), and purified and analyzed in the manner described in Example 1. Expression and purification analysis were also performed for HP502 - HP516 in the same manner as described above, and the configuration of the expression vector is shown in detail in Tables 32 and 34.
  • the binding constants of the D2 and D4 regions of the HER2 protein of HP501, HP502, HP503, HP504, HP505, HP506, HP507, HP508, HP509, HP510, HP511, HP512, HP513, HP514, HP515, and HP516 were analyzed by Octet Red96e (Sartorius). was measured using For analysis of binding constants of 16 antibodies to the D2 region, human Her2 recombinant protein (R&D systems, 1129-ER) was loaded onto the Anti-Penta-HIS (HIS1K) biosensor (Sartorius, 18-5120), followed by D4 region. Blocking was induced using 100 nM Trastuzumab targeting .
  • binding reactions 300 seconds and dissociation reactions (600 seconds) were induced for 16 types of antibodies at a concentration of 100 nM, and based on this, the affinity for the D2 region was calculated (Table 36).
  • human Her2 recombinant protein R&D systems, 1129-ER
  • HIS1K Anti-Penta-HIS biosensor
  • binding reactions 300 seconds and dissociation reactions (600 seconds) were induced for 16 types of antibodies at a concentration of 100 nM, and based on this, the affinity for the D4 region was calculated (Table 36).
  • the binding constants of HP507, HP511, and HP515 to D2 were 2.285, 3.267, and 2.012 nM, respectively, showing excellent binding ability to the D2 region compared to other clones (Table 36).
  • HP503 has a binding constant of 8.098 nM to the D2 region and shows a relatively low binding capacity to the D2 region compared to HP507, HP511, and HP515. , It was confirmed that strong binding capacity was shown at 0.227 nM (Table 36).
  • HP503, HP507, HP511, and HP515 were measured using Octet Red96e (Sartorius) in the same manner as in Example 10 (FIGS. 29a to 29d, Table 38).
  • HP503, HP507, HP511, and HP515 had excellent binding ability to Fc ⁇ RI (CD64), Fc ⁇ RIIA (CD32A, 131R), and Fc ⁇ RIIIA (CD16A, 176V) compared to human IgG1, Trastuzumab, Pertuzumab, and Margetuximab (FIG. 21a to 21h, 22a to 22h, 23a to 23h, 29a to 29d, Table 29, Table 38).
  • the binding constant analysis of HP503, HP507, HP511 and HP515 to the neonatal Fc Receptor (FcRn) was measured using Octet Red96e (Sartorius).
  • Anti-Human Fab-CH1 2nd Generation (FAB2G) biosensor (Sartorius, 18-5126) was loaded with HP503, HP507, HP511, HP515, Human IgG1 (Bio X cell, BE0297), Trastuzumab, Pertuzumab, Margetuximab, and binding time and dissociation time was analyzed to be 120 seconds, respectively (Figs. 30a to 30b, Table 39).
  • Kinetics Buffer (Sartorius, 18-1105) was used adjusted to pH 6.0.
  • BT474 HER2 3+; High breast cancer cell line
  • NCI-N87 HER2 3+; High gastric cancer cell line
  • Cells were diluted and dispensed in a cell culture medium to 10,000 cells per well in a 96-well plate.
  • Cells, antibodies, and human serum were reacted at a volume ratio of 1:1:1, respectively.
  • Cell Titer Glo-Reagent Promega, G9243 previously melted at 4°C was dispensed into each well in the same volume of the mixed culture medium, and then cells were plated on a plate shaker (Allsheng, MX100-4A) at a rotation speed of 500 rpm for 2 minutes. lysis was induced. After incubation for 10 minutes at room temperature for stabilization of the luminescence signal, analysis was performed using a plate reader (Envision; PerkinElmer, 2105-0010) (FIGS. 31a to 31b). Complement-dependent cytotoxicity (CDC activity) was calculated as follows.
  • PBMCs Peripheral Blood Mononuclear Cells
  • H01 In NCI-N87 (HER2 3+; High) and MDA-MB-453 (HER2 2+; Mid) cancer cell lines, H01 exhibited superior cytotoxicity than Trastuzumab at a lower concentration (FIGS. 32a, 32b). As a result of cytotoxicity analysis performed on SNU-601 (HER2 1+; Low) and SNU-5 (HER2 1+; Low) cancer cell lines, H01 exhibited superior cytotoxicity compared to Trastuzumab (FIGS. 32c and 32d).
  • SNU-5 gastric cancer cell line-derived xenograft model was performed using 6-week-old female SCID mice (CB-17/NcrKoat-Prkdc scid , Koatech) ( Figure 33a).
  • the SNU-5 cancer cell line was diluted in PBS at 1 x 10 7 cells/100 ⁇ L, mixed 1:1 with MATRIGEL ® Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (Corning, 354230), and 100 ⁇ L of the mixture was transplanted subcutaneously in the right flank. and observed tumor growth.
  • Regroup was performed so that the average tumor volume was about 107 mm 3 , PBS (Vehicle), 5 mg/kg H01, 5 mg/kg H01 + 5 mg/kg P01, 5 mg/kg HP507, 5 mg/kg Trastuzumab, 5 mg/kg Trastuzumab + 5 mg/kg Pertuzumab was administered intravenously (IV) once a week for a total of 6 weeks (FIG. 33a).
  • IV intravenously
  • Regrouping was performed so that the average tumor volume was approximately 122 mm 3 , and 50 mg/kg intravenous immunoglobulin (IVIG; LIV-r, SK Plasma) was administered to all mice twice a week for 6 weeks (FIG. 33b).
  • IVIG intravenous immunoglobulin
  • PBS Vehicle
  • 1 mg/kg Trastuzumab, 1 mg/kg Pertuzumab 0.5 mg/kg Trastuzumab + 0.5 mg/kg Pertuzumab, 1 mg/kg H01, 1 mg/kg P01, 0.5 mg/kg H01 + 0.5 mg/kg P01 was administered intraperitoneally (IP) twice a week for a total of 6 weeks (FIG. 33B).
  • NCI-N87 gastric cancer cell line-derived xenograft model was performed using 6-week-old female SCID mice (CB-17/NcrKoat-Prkdc scid , Koatech).
  • the NCI-N87 cancer cell line was diluted in PBS at 5 x 10 6 cells/100 ⁇ L, mixed 1:1 with MATRIGEL ® Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (Corning, 354230), and 100 ⁇ L of the mixture was transplanted subcutaneously in the right flank. and observed tumor growth.
  • Regroup was performed so that the average tumor volume was approximately 146 mm 3 , and PBS (Vehicle), 0.2 mg/kg H01, 5 mg/kg H01, 0.2 mg/kg Trastuzumab, and 5 mg/kg Trastuzumab were intraperitoneally administered (IP). It was administered twice a week for a total of 6 weeks (FIG. 35). Since antibodies do not exist in the body of SCID mice, 50 mg/kg intravenous immunoglobulin (IVIG; LIV-r, SK Plasma) was administered to all mice twice a week for 6 weeks to mimic the actual human blood environment (Fig. 35). As a result of the analysis, H01 exhibited superior anticancer activity compared to Trastuzumab at doses of 5 mg/kg and 0.2 mg/kg (FIG. 35).
  • IVIG intravenous immunoglobulin
  • Nucleotides (SEQ ID NO: 566, Table 40) encoding human HER2 protein (SEQ ID NO: 567, Table 40) were cloned into a protein expression vector (ORIGENE, PS100020) containing a Neomycin resistance gene to obtain human HER2 expression vector pCMV6-AC-hHER2 was built (FIG. 36, Table 40).
  • the pCMV6-AC-hHER2 human HER2 expression vector was transfected into CT26 mouse colon cancer cells using lipofectamine 2000 transfection reagent (Invitrogen, 11668-019). Only cells transfected with the pCMV6-AC-hHER2 human HER2 expression vector were selected in a culture medium containing 1 mg/mL G418 (Invivogen, ant-gn-5) for 14 days. Using the SH800S Cell Sorter (SONY), the top 3% population of the expression level was sorted into a 96-well plate (ThermoFisher, 167008) so that one cell per well was entered.
  • GPM01 is an expression vector composed of sequences corresponding to Fc-Hole (SEQ ID NO: 7), GPM01 HC (SEQ ID NO: 67), and GPM01 LC (SEQ ID NO: 68) in EXPICHO-S TM (Gibco, A29127) Co-transfection (Co-transfection) was performed (Fig. 41a, Table 44), purification and analysis were performed in the manner described in Example 1. Expression and purification analysis of GPM02, GPM04, GPB01, GPB03, GPB04, and GPB06 was performed in the same manner as described above (FIG. 41a to FIG.
  • Table 46 below shows the polypeptide sequences of the modified antibody heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL) targeting GPC-3.
  • Table 47 below shows the nucleotide sequences of the heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL) of modified antibodies targeting GPC-3.
  • Table 48 below shows the modified antibody heavy and light chain CDR sequences targeting GPC-3.
  • Table 52 below shows the polypeptide sequences of the modified antibody heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL) targeting EphA2.
  • Table 53 below shows the nucleotide sequences of the heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL) of modified antibodies targeting EphA2.
  • PC-3 prostate cancer cell line was used for the analysis of EphA2 signal transduction inhibition ability. Lysates of PC-3 cancer cell lines treated with each antibody at a concentration of 50 nM for 30 minutes were analyzed by western blot. 1C1 human EphA2 target antibody was used as a positive control and was prepared based on a sequence published in the literature (Kinch et al., US 20090304721 A1).
  • Table 60 shows the modified antibody heavy and light chain CDR sequences targeting MET.
  • EGM01 is an expression vector composed of sequences corresponding to Fc-Hole (SEQ ID NO: 7), EGM01 HC (SEQ ID NO: 590), and EGF01 LC (SEQ ID NO: 591) in EXPICHO-S TM (Gibco, A29127) Co-transfection (Co-transfection) was carried out (Fig. 41a, Table 62), and purification and analysis were performed in the manner described in Example 1.
  • EGM02, EGM03, EGM04, EGM05, and EGM06 were also subjected to expression and purification analysis in the same manner as described above (Table 62).
  • Binding constants of EGM01 to EGM05 to the EGFR protein were measured using an Octet Red96e (Sartorius) analyzer.
  • Anti-Human Fab-CH1 2nd Generation (FAB2G) biosensor (Sartorius, 18-5125) was loaded with antibody to analyze the binding constant of the antibody, and human EGFR recombinant protein (Sino Biologicals, 10692-H08H) was bound at various concentrations A reaction (300 sec) and a dissociation reaction (600 sec) were induced (FIG. 49). Based on this, the affinity for EGFR was calculated (FIG. 49, Table 67). Table 67 below analyzes binding constants of modified antibodies targeting EGFR.
  • GPM01 is an expression vector composed of sequences corresponding to Fc-Hole (SEQ ID NO: 7), 33-1 HC (SEQ ID NO: 636), and 33-1 LC (SEQ ID NO: 637), EXPICHO-S TM ; Gibco , A29127) was co-transfected (Fig. 41a, Table 64), and purification and analysis were performed in the manner described in Example 1. 33-2, 33-3, 33-4, 33-5, 33-6, and 33-7 were also subjected to expression and purification analysis in the same manner as described above (FIGS. 41a to 41b, Tables 68 and 69) .
  • 33-1, 33-2, and 33-3 bind monovalently to different antigen epitopes and are composed of two Fc domains (FIG. 41a).
  • 33-4, 33-5, 33-6, and 33-7 are structures in which the variable region of the CD33 antibody is connected with a polypeptide linker (SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50), biparatopic binding to CD33, and composed of two Fc domains. This is the constructed structure (Fig. 41b).
  • Table 70 below shows the heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL) polypeptide sequences of modified antibodies targeting CD33.
  • Table 71 below shows the nucleotide sequences of the heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL) of modified antibodies targeting CD33.
  • Table 72 below shows the modified antibody heavy and light chain CDR sequences targeting CD33.
  • CD33 protein binding constants of 33-1, 33-2, 33-3, 33-4, 33-5, 33-6, and 33-7 were measured using an Octet Red96e (Sartorius) analyzer.
  • human CD33 recombinant protein (Sino Biologicals, 12238-H08H) was loaded onto the Anti-Penta-HIS (HIS1K) biosensor (Sartorius, 18-5120), and then the 7 antibodies were Association reactions (600 seconds) and dissociation reactions (1,200 seconds) were induced at various concentrations, and based on these, the affinity for CD33 was calculated (FIG. 50, Table 73). Table 73 below analyzes binding constants of modified antibodies targeting CD33.
  • Example 22 Design and manufacture and analysis of antibody constructs targeting CEACAM5
  • CEA01 is an expression vector composed of sequences corresponding to Fc-Hole (SEQ ID NO: 7), CEA01 HC (SEQ ID NO: 590), and CEA01 LC (SEQ ID NO: 591) in EXPICHO-S TM (Gibco, A29127) Co-transfection (Co-transfection) was performed (Fig. 41a, Table 74), purification and analysis were performed in the manner described in Example 1.
  • CEA02, CEA03, and CEA04 were also subjected to expression and purification analysis in the same manner as described above (Table 74).
  • Table 75 below shows the nucleotide sequences of modified antibody heavy and light chains targeting CEACAM5.
  • Table 76 shows the heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL) polypeptide sequences of modified antibodies targeting CEACAM5.
  • Table 77 shows the nucleotide sequences of the heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL) of modified antibodies targeting CEACAM5.
  • Table 78 shows the heavy and light chain CDR sequences of modified antibodies targeting CEACAM5.
  • human CEACAM5 recombinant protein (Sino Biologicals, 11077-H08H) was loaded onto the Anti-Penta-HIS (HIS1K) biosensor (Sartorius, 18-5120), and the antibodies were combined at various concentrations (600 seconds). and dissociation reactions (1,200 sec) were induced, and based on this, the affinity for human CEACAM5 was calculated (FIG. 51, Table 79). Table 79 below analyzes binding constants of modified antibodies targeting human CEACAM5.
  • Example 23 Design and manufacture and analysis of antibody constructs targeting TROP2 or Mesothelin or LIV-1
  • Table 80 shows the light and heavy chain variant polypeptide sequences of antibody T01 that specifically binds to the TROP2 protein.
  • T01 an expression vector composed of sequences corresponding to Fc-Hole (SEQ ID NO: 7), T01 HC (SEQ ID NO: 753), and T01 LC (SEQ ID NO: 754) was cotransformed into ExpiCHO-S TM (Gibco, A29127) (Co -transfection) (FIG. 41a, Table 80), and purification and analysis were performed in the manner described in Example 1.
  • Table 80 shows the light and heavy chain variant polypeptide sequences of antibody MSM01 that specifically binds to mesothelin protein.
  • MSM01 is an expression vector composed of sequences corresponding to Fc-Hole (SEQ ID NO: 7), MSM01 HC (SEQ ID NO: 755), and MSM01 LC (SEQ ID NO: 756) co-transformed into EXPICHO-S TM (Gibco, A29127) (Co -transfection) (FIG. 41a, Table 80), and purification and analysis were performed in the manner described in Example 1.
  • Table 80 shows the light and heavy chain variant polypeptide sequences of the antibody LIM01 that specifically binds to the LIV-1 protein.
  • LIM01 an expression vector composed of sequences corresponding to Fc-Hole (SEQ ID NO: 7), LIM01 HC (SEQ ID NO: 757), and LIM01 LC (SEQ ID NO: 758) was cotransformed into EXPICHO-S TM (Gibco, A29127) (Co -transfection) (FIG. 41a, Table 80), and purification and analysis were performed in the manner described in Example 1.
  • Table 81 shows the modified antibody heavy and light chain nucleotide sequences targeting TROP2 or Mesothelin or LIV-1.
  • Table 82 shows the heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL) polypeptide sequences of modified antibodies targeting TROP2 or Mesothelin or LIV-1.
  • Table 83 shows the nucleotide sequences of the heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL) of modified antibodies targeting TROP2 or Mesothelin or LIV-1.
  • Table 84 shows the heavy and light chain CDR sequences of modified antibodies targeting TROP2 or Mesothelin or LIV-1.
  • human TROP2 recombinant protein (Sino Biologicals, 10428-H08H) or human Mesothelin recombinant protein (Sino Biologicals, 13128-H08H) or human LIV-1 recombinant protein (Acro biosystems, LV1-H5223) was Anti-Penta- It was loaded onto the HIS (HIS1K) biosensor (Sartorius, 18-5120), and binding and dissociation reactions were induced at various concentrations, and based on this, the affinity of each antibody for the human antigen was calculated (Fig. 52, Table 85). Table 85 below analyzes binding constants of modified antibodies targeting TROP2 or Mesothelin or LIV-1.

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Abstract

본 발명은 1개의 항원 결합 부위 및 2개의 Fc 도메인을 포함하고 신규한 항체 구조체를 가지는 융합단백질을 제공한다. 이와 같은 신규한 항체 구조체는 인간 IgG와 유사한 분자량을 가짐에도 불과하고, 세포 표면항원에 Fc 도메인을 자연상의 인간 항체 대비 최대 4배 존재하게 할 수 있다. 따라서, 상기 융합단백질은 Fcγ수용체 친화도가 증가되며, effector functions도 증가되었다. 따라서, 상기 신규한 항체 구조체를 가지는 융합단백질은 새로운 항체 플랫폼으로 활용이 가능하다.

Description

두개의 FC 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질 및 이의 용도
본 발명은 암 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위 및 2개의 Fc 도메인을 가진 신규 항체 구조체에 관한 것이다.
항체 기반 치료제 및 Fc 융합단백질은 암, 면역질환, 감염증 및 염증성 질환이 있는 환자들에게 임상적으로 중요한 약물군이다. 항체 Fc 도메인과 선천면역체계(Innate immune system)의 상호작용에 의해 유도되는 ADCC(Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity), ADCP(Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis), CDC(Complement-Dependent Cytotoxicity)는 질환의 증상을 완화하거나 치료하는데 중요한 역할을 한다.
항체의 Bivalency를 유지하며 Fc 도메인 개수의 증가를 통해 Effector function을 향상시키고자 하는 시도가 이루어지고 있다(Claudio Sustmann et al., MAbs. 2019; Dennis R Goulet et al., Proteins, 2020). 이러한 플랫폼들을 통해 Fcγ 수용체에 대한 결합능 및 ADCC의 향상은 확인하였으나, 생산 및 정제의 복잡성으로 인해 균질한(Homogeneous) 항체를 얻기 힘든 측면이 있다. 항체의 Fc 도메인을 직렬로 연결하거나, 다량의 Fc 도메인으로 구성하는 형태로 Effector function을 향상시키고자 하는 시도도 현재 진행되고 있다(미국 공개특허 US 2020/0040084 A1). 이 경우 항체의 크기 혹은 분자량이 커짐으로 인해 조직으로의 투과성이 현저하게 낮아질 수 있다는 단점이 존재한다.
이에 본 발명자들은 항체의 기능을 향상시킴과 동시에 위에서 설명한 다중 Fc 도메인을 직렬로 포함하도록 디자인된 기존 항체 구조체의 문제점을 해소하기 위해 연구한 결과, 자연상의 인간 면역글로불린G(Immunoglobulin G, IgG)와 유사한 분자량(약 150 kDa)을 가짐에도, 자연상의 인간 항체 대비하여, 세포 표면항원에 Fc 도메인을 최대 4배 존재하게 하는 개량된 신규 항체 구조체를 개발하였다.
본 발명의 일 측면은, 항원 결합 부위, 상기 항원 결합 부위의 제1 연결 위치에 연결된 제1 Fc 도메인 또는 이의 변이체, 및 상기 항원 결합 부위의 제2 연결 위치에 연결된 제2 Fc 도메인 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은, 직렬로 연결된 2개의 항원 결합 부위(tandem two antigen-binding regions), 상기 tandem 2 항원 결합 부위의 제1 연결 위치에 연결된 제1 Fc 도메인 또는 이의 변이체, 및 상기 tandem 2 항원 결합 부위의 제2 연결 위치에 연결된 제2 Fc 도메인 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질을 제공하는 것이다. 일 구체예에 따르면 tandem 2 항원 결합 부위를 구성하는 두 개의 항원 결합 부위 중 각각은 동일한 항원의 서로 다른 에피토프에 결합하거나 혹은 상이한 항원에 각각 결합할 수 있는 CDR 서열 혹은 가변영역을 포함하는 (comprising) 혹은 가변영역으로 구성된 (consisting of) 서열 일수 있다.
본 개시에 기재된 융합단백질들에 있어서, 일 구체예에 따르면, 항원 결합 부위는 항체의 CDR 서열 혹은 가변영역을 포함하는(comprising) 또는 가변영역으로 구성된(consisting of) 서열 일 수 있다. 따라서, 항원 결합 부위는 항체의 경쇄 CDR 서열 혹은 경쇄 가변영역으로 구성되거나 포함하는 제1 펩티드와 항체의 중쇄 CDR 서열 중쇄 가변영역으로 구성되거나 포함하는 제2 펩티드를 포함할 수 있다. 제1 Fc 도메인과 제2 Fc 도메인은 각각 두 개의 펩티드 서열로 이루어진 dimer일 수 있다. 항원 결합 부위의 제1 펩티드는 제1 Fc 도메인 또는 이의 변이체에 결합되고 항원 결합 부위의 제2 펩티드는 제2 Fc 도메인 또는 이의 변이체에 결합된다.
본 개시에 기재된 융합단백질 들에 있어서, 또 다른 구체예에 따르면, 제1 Fc 도메인과 제2 Fc 도메인은 공유결합, 비공유결합, 혹은 링커를 통해 서로 연결되어 있을 수도 있고, 서로 결합되어 있지 않을 수도 있다. 바람직한 구체예에서는, 제1 Fc 도메인과 제2 Fc 도메인은 서로 결합되어 있지 않다.
본 개시의 구체예들에 따르면, Fc 도메인은 wild-type 면역글로불린의 Fc 도메인 일 수 있고, Fc 도메인의 Fcγ 수용체(FcγR)에 대한 반응성 혹은 ADCC를 조정하거나, 혹은 바람직하지 않은 Fc 도메인의 multimer 형성을 최소화하기 위한 변형(modification), 예를 들면 아미노산 치환을 포함할 수 있다. Fc 도메인은 CH2와 CH3 영역을 포함하며, CH4 영역 및/또는 hinge 영역을 포함할 수 있고, Fc 도메인의 기능을 나타내는 Fc domain fragments도 포함하는 것으로 해석해야 한다.
본 개시의 구체예에 따르면, 항원 결합 부위와 Fc 도메인 혹은 변이체와의 결합은 직접 결합이거나 혹은 링커를 통한 결합일 수 있다. 예를 들면, 항원 결합 부위와 Fc 도메인 혹은 변이체와의 결합은 각 펩티드 분자의 N-말단과 C-말단, N-말단과 N-말단, 혹은 C-말단과 C-말단 과의 결합일 수 있다.
본 개시의 구체예에 따르면, 항원 결합 부위와 Fc 도메인 혹은 변이체와의 결합이 링커를 통하여 이루어지는 경우, 링커로는 통상 펩티드-펩티드 결합에 사용되는 링커 일 수 있다. 예를 들면, 링커는 1-70 아미노산 잔기, 2-60 아미노산 잔기, 2-50 아미노산 잔기, 2-40 아미노산 잔기, 2-30 아미노산 잔기, 3-50 아미노산 잔기, 3-40 아미노산 잔기, 3-30 아미노산 잔기, 2-28 아미노산 잔기, 2-26 아미노산 잔기, 2-24 아미노산 잔기, 2-22 아미노산 잔기, 2-20 아미노산 잔기, 2-18 아미노산 잔기, 2-16 아미노산 잔기, 2-14 아미노산 잔기, 2-12 아미노산 잔기, 2-10 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드일 수 있다. 제1 Fc 도메인과 항원 결합 부위 사이의 결합 만, 제2 Fc 도메인과 항원 결합 부위 사이의 결합 만, 혹은 제1 Fc 도메인과 항원 결합 부위 사이의 결합 및 제2 Fc 도메인과 항원 결합 부위 사이의 결합 모두 링커를 통해 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 융합단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 및 이 뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 그리고 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 융합단백질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은, 암을 치료하기 위한 상기 융합단백질의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 신규한 항체 구조체를 가지는 융합단백질은 야생형의 항체와 달리 1개 혹은 2개의 항원 결합 부위 및 2개의 Fc 도메인을 포함하고 있다. 2개의 Fc 도메인은 서로 직접적으로 연결되어 있지 않으며, 항원 결합 부위를 구성하는 서로 다른 2개의 폴리펩티드 사슬에 각각의 Fc 도메인이 독립적으로 연결되어 있다. 이와 같은 신규한 항체 구조체는 인간 IgG와 유사한 크기 및 분자량을 가짐에도 불구하고, 세포 표면항원에 Fc 도메인을 자연상의 인간 항체 대비 최대 4배까지 존재하게 할 수 있다. 이러한 특성으로 인해, 신규한 항체 구조체를 가지는 융합단백질은 강화된 Fcγ 수용체 친화도(Avidity)를 가지며, effector functions의 강화를 유도할 수 있다. 따라서, 상기 신규한 항체 구조체를 가지는 융합단백질은 종래의 항체를 대체하여 다양한 용도로 활용될 수 있다.
도 1a는 자연상의 인간 면역글로불린(IgG)의 모식도이다.
도 1b는 개량된 신규 항체 구조체 모식도이다.
도 1c는 암항원에 암 특이적 인간 면역글로불린(IgG)이 모두 1가(Monovalent) 결합할 경우의 상태를 나타낸 모식도이다.
도 1d는 암항원에 암 특이적 인간 면역글로불린(IgG)이 1가(Monovalent) 또는 2가(Bivalent)결합할 경우의 상태를 나타낸 모식도이다.
도 1e는 암항원에 암 특이적 인간 면역글로불린(IgG)이 모두 2가(Bivalent) 결합할 경우의 상태를 나타낸 모식도이다.
도 1f는 암항원에 개량된 신규 항체 구조체가 결합할 경우의 상태를 나타낸 모식도이다.
도 2a는 Fc가 2개인 Monovalent 신규 항체 구조체(WT)의 모식도이다.
도 2b는 Fc가 2개인 Monovalent 신규 항체 구조체에 VH Q105C, VL A43C 치환한 항체(M1)의 모식도이다.
도 2c는 Fc가 2개인 Monovalent 신규 항체 구조체에 CH1 F122C, CL S121C 치환한 항체(M2)의 모식도이다.
도 2d는 Fc가 2개인 Monovalent 신규 항체 구조체에 VH G44C, VL Q100C 치환한 항체(M3)의 모식도이다.
도 3a는 Trastuzumab의 VH-CH1 도메인에 Cys 치환 위치를 표기한 서열정보이다. WT 서열은 서열번호 8이며, Mutant1의 서열은 서열번호 10이며, Mutant2의 서열은 서열번호 12이며, Mutant3의 서열은 서열번호 14이다.
도 3b는 Trastuzumab의 VL-CL 도메인에 Cys 치환 위치를 표기한 서열정보이다. WT 서열은 서열번호 9이며, Mutant1의 서열은 서열번호 11이며, Mutant2의 서열은 서열번호 13이며, Mutant3의 서열은 서열번호 15이다.
도 4는 WT, M1, M2, M3의 SDS-PAGE 결과이다.
도 5a는 WT의 크기배제크로마토그래피 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 5b는 M1의 크기배제크로마토그래피 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 5c는 M2의 크기배제크로마토그래피 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 5d는 M3의 크기배제크로마토그래피 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 6a는 CL 도메인과 힌지 영역(hinge region)을 15-mer peptide로 연결한 항체(M3)의 모식도이다.
도 6b는 CL 도메인과 힌지 영역을 10-mer peptide로 연결한 항체(V1)의 모식도이다.
도 6c는 CL 도메인과 힌지 영역을 5-mer peptide로 연결한 항체(V2)의 모식도이다.
도 6d는 CL 도메인과 힌지 영역을 linker없이 직접 연결한 항체(V3)의 모식도이다.
도 7은 M3, V1, V2, V3의 SDS-PAGE 결과이다.
도 8a는 H01, P01을 파파인(papain)으로 절단할 경우 생성되는 단편의 모식도이다.
도 8b는 힌지 영역의 이황화 결합(disulfide bond)이 비정상적으로 형성될 경우 H01, P01 파파인 절단에 의해 생성되는 단편의 모식도이다.
도 8c는 H01 파파인 절단 산물의 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 8d는 P01 파파인 절단 산물의 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 9는 H01wt와 H01의 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 10a는 Fv-(Fc)2 구조체인 H01Fv1의 모식도이다.
도 10b는 Fv-(Fc)2 구조체인 H01Fv2의 모식도이다.
도 10c는 Fv-(Fc)2 구조체인 H01Fv3의 모식도이다.
도 10d는 Fv-(Fc)2 구조체인 H01Fv4의 모식도이다.
도 10e는 Fv-(Fc)2 구조체인 H01Fv5의 모식도이다.
도 10f는 Fv-(Fc)2 구조체인 H01Fv6의 모식도이다.
도 10g는 Fv-(Fc)2 구조체인 H01Fv7의 모식도이다.
도 10h는 Fv-(Fc)2 구조체의 돌연변이된 위치를 나타낸 표이다.
도 11은 Fv-(Fc)2 구조체의 Protein A 정제 후 SDS-PAGE 결과이다.
도 12a 내지 도 12g는 Fv-(Fc)2 구조체의 Protein A 정제 후 SEC 분석 결과이다.
도 13a는 정제된 Fv-(Fc)2 구조체인 H01Fv1의 인간 HER2에 대한 binding sensorgram 분석 결과이다.
도 13b는 정제된 Fv-(Fc)2 구조체인 H01Fv2의 인간 HER2에 대한 binding sensorgram 분석 결과이다.
도 13c는 정제된 Fv-(Fc)2 구조체인 H01Fv4의 인간 HER2에 대한 binding sensorgram 분석 결과이다.
도 13d는 정제된 Fv-(Fc)2 구조체인 H01Fv5의 인간 HER2에 대한 binding sensorgram 분석 결과이다.
도 13e는 정제된 Fv-(Fc)2 구조체인 H01Fv6의 인간 HER2에 대한 binding sensorgram 분석 결과이다.
도 13f는 정제된 Fv-(Fc)2 구조체인 H01Fv7의 인간 HER2에 대한 binding sensorgram 분석 결과이다.
도 14는 H01, P01, Trastuzumab, Pertuzumab의 Melting temperature 측정 결과이다.
도 15는 Bio-Layer Interferometry를 통해 H01과 P01이 경쟁적으로 결합함을 보여주는 Sensorgram이다.
도 16a는 HER2 양성 암세포에 H01, P01 병용처리시 결합양상을 나타낸 모식도이다.
도 16b는 HER2 양성 암세포에 Trastuzumab, Pertuzumab 병용처리시 결합양상을 나타낸 모식도이다.
도 17a는 50 nM HER2 항체 처리 시 NCI-N87 위암세포주 표면에 존재하는 Fc 도메인의 양을 측정한 결과이다.
도 17b는 50 nM HER2 항체 처리 시 BT474 유방암세포주 표면에 존재하는 Fc 도메인의 양을 측정한 결과이다.
도 17c는 50 nM HER2 항체 처리 시 SK-OV3 난소암 세포주 표면에 존재하는 Fc 도메인의 양을 측정한 결과이다.
도 17d는 50 nM HER2 항체 처리 시 SNU-1 위암세포주 표면에 존재하는 Fc 도메인의 양을 측정한 결과이다.
도 17e는 50 nM HER2 항체 처리 시 SNU-5 위암세포주 표면에 존재하는 Fc 도메인의 양을 측정한 결과이다.
도 18a는 다양한 농도의 HER2 항체 처리 시 NCI-N87 위암세포주 표면에 존재하는 Fc 도메인의 양을 측정한 결과이다.
도 18b는 다양한 농도의 HER2 항체 처리 시 BT474 유방암세포주 표면에 존재하는 Fc 도메인의 양을 측정한 결과이다.
도 18c는 다양한 농도의 HER2 항체 처리 시 SK-OV3 난소암 세포주 표면에 존재하는 Fc 도메인의 양을 측정한 결과이다.
도 18d는 다양한 농도의 HER2 항체 처리 시 SNU-1 위암세포주 표면에 존재하는 Fc 도메인의 양을 측정한 결과이다.
도 18e는 다양한 농도의 HER2 항체 처리 시 SNU-5 위암세포주 표면에 존재하는 Fc 도메인의 양을 측정한 결과이다.
도 19a는 H01을 주형으로 S239D, I332E 돌연변이를 도입한 H01DE4의 구조 모식도이다.
도 19b는 P01을 주형으로 S239D, I332E 돌연변이를 도입한 P01DE4의 구조 모식도이다.
도 20a 내지 도 20d는 H01, H01DE4, P01, P01DE4의 인간 HER2에 대한 결합특성 및 친화도를 나타낸 Sensorgram이다.
도 21a 내지 도 21h는 H01, P01, H01DE4, P01DE4, Human IgG1, Trastuzumab, Pertuzumab, Margetuximab의 Fcγ 수용체 1에 대한 결합특성 및 친화도를 나타낸 Sensorgram이다.
도 22a 내지 도 22h는 H01, P01, H01DE4, P01DE4, Human IgG1, Trastuzumab, Pertuzumab, Margetuximab의 Fcγ 수용체 2A(131R isoform)에 대한 결합특성 및 친화도를 나타낸 Sensorgram이다.
도 23a 내지 도 23h는 H01, P01, H01DE4, P01DE4, Human IgG1, Trastuzumab, Pertuzumab, Margetuximab의 Fcγ 수용체 3A(176V isoform)에 대한 결합특성 및 친화도를 나타낸 Sensorgram이다.
도 24a는 Sprague-Dawley Rat에 H01, P01, Trastuzumab, Pertuzumab을 10 mg/kg 정맥 투여를 한 경우, 시간에 따른 혈중 항체 농도를 나타낸 그래프이다.
도 24b는 도 21a로부터 산출된, Sprague-Dawley Rat에 H01, P01, Trastuzumab, Pertuzumab을 10 mg/kg 정맥 투여를 한 경우의 PK parameter이다.
도 25는 HER2 biparatopic 개량항체인 HP501의 구조 모식도이다.
도 26은 HER2 biparatopic 개량항체인 HP501 내지 HP516의 구조 모식도이다.
도 27은 HER2 biparatopic 개량항체인 HP501 내지 HP516의 크기배제크로마토그래피 분석 결과이다.
도 28a는 Bio-Layer Interferometry 분석법을 이용한 HER2 단백질에 대한 HP503의 친화도 분석 Sensorgram이다.
도 28b는 Bio-Layer Interferometry 분석법을 이용한 HER2 단백질에 대한 HP507의 친화도 분석 Sensorgram이다.
도 28c는 Bio-Layer Interferometry 분석법을 이용한 HER2 단백질에 대한 HP511의 친화도 분석 Sensorgram이다.
도 28d는 Bio-Layer Interferometry 분석법을 이용한 HER2 단백질에 대한 HP515의 친화도 분석 Sensorgram이다.
도 29a는 HP503의 Fcγ 수용체 1, Fcγ 수용체 2A(131R isoform) 및 Fcγ 수용체 3A(176V isoform)에 대한 결합 특성 및 친화도를 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 29b는 HP507의 Fcγ 수용체 1, Fcγ 수용체 2A(131R isoform) 및 Fcγ 수용체 3A(176V isoform)에 대한 결합 특성 및 친화도를 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 29c는 HP511의 Fcγ 수용체 1, Fcγ 수용체 2A(131R isoform) 및 Fcγ 수용체 3A(176V isoform)에 대한 결합특성 및 친화도를 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 29d는 HP515의 Fcγ 수용체 1, Fcγ 수용체 2A(131R isoform) 및 Fcγ 수용체 3A(176V isoform)에 대한 결합 특성 및 친화도를 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 30a는 HP503, HP507, HP511 및 HP515의 신생아 Fc 수용체(Neonatal Fc receptor, FcRn)에 대한 결합 특성 및 친화도를 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 30b는 인간 IgG1, Trastuzumab, Pertuzumab 및 Margetuximab의 신생아 Fc 수용체(Neonatal Fc receptor, FcRn)에 대한 결합 특성 및 친화도를 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 31a는 BT474 유방암 세포주에서 각 HER2 항체에 의한 CDC 효과를 분석한 결과이다.
도 31b는 NCI-N87 위암 세포주에서 각 HER2 항체에 의한 CDC 효과를 분석한 결과이다.
도 32a는 NCI-N87 위암 세포주서 HER2 항체에 의한 ADCC 효과를 분석한 결과이다.
도 32b는 MDA-MB-453 유방암 세포주에서 HER2 항체에 의한 ADCC 효과를 분석한 결과이다.
도 32c는 SNU-601 위암 세포주에서 HER2 항체에 의한 ADCC 효과를 분석한 결과이다.
도 32d는 SNU-5 위암 세포주에서 HER2 항체에 의한 ADCC 효과를 분석한 결과이다.
도 33a는 SNU-5 위암세포주 이종이식 마우스 모델(C.B-17 SCID)에서 항암억제능 분석 결과이다.
도 33b는 SNU-5 위암세포주 이종이식 마우스 모델(BALB/c-nu)에서 항암억제능 분석 결과이다.
도 34는 SNU-601 위암세포주 이종이식 마우스 모델에서 항암억제능 분석 결과이다.
도 35는 NCI-N87 위암세포주 이종이식 마우스 모델에서 항암억제능 분석 결과이다.
도 36은 포유동물 세포에서 인간 HER2 단백질을 발현할 수 있는 벡터이다.
도 37은 인간 HER2를 발현하는 CT26 마우스 대장암 세포주(CT26-HER2) 클론에서 인간 HER2의 발현량 정량 결과이다.
도 38은 CT26-HER2 클론에서 인간 HER2 발현의 안정성 분석 결과이다.
도 39는 인간 암세포주들 대비 CT26-HER2 세포주(Clone name: #2-60)의 상대적 인간 HER2 발현량 비교 및 Trastuzumab 대비 H01이 CT26-HER2 세포 표면에 더 많은 양의 Fc 도메인을 결합시킴을 확인한 결과이다.
도 40은 CT26-HER2 이식 동종 마우스 모델에서 항암 효능 분석 결과이다.
도 41a는 일 구체예에 따른 Monovalent engineered mAb의 모식도이다.
도 41b는 일 구체예에 따른 Biparatopic engineered mAb의 모식도이다.
도 42는 일 구체예인 융합단백질의 타겟에 대한 결합능을 분석한 sensorgram 결과이다. 구체적으로, 도 42a는 GPC-3를 표적하는 Monovalent engineered mAb인 GPM01의 인간 GPC-3에 대한 결합능 분석 sensorgram 결과이다. 도 42b는 GPC-3를 표적하는 Monovalent engineered mAb인 GPM02의 인간 GPC-3에 대한 결합능 분석 sensorgram 결과이다. 도 42c는 GPC-3를 표적하는 Monovalent engineered mAb인 GPM04의 인간 GPC-3에 대한 결합능 분석 sensorgram 결과이다. 도 42d는 GPC-3를 표적하는 Biparatopic engineered mAb인 GPB01의 인간 GPC-3에 대한 결합능 분석 sensorgram 결과이다. 도 42e는 GPC-3를 표적하는 Biparatopic engineered mAb인 GPB03의 인간 GPC-3에 대한 결합능 분석 sensorgram 결과이다. 도 42f는 GPC-3를 표적하는 Biparatopic engineered mAb인 GPB04의 인간 GPC-3에 대한 결합능 분석 sensorgram 결과이다. 도 42g는 GPC-3를 표적하는 Biparatopic engineered mAb인 GPB06의 인간 GPC-3에 대한 결합능 분석 sensorgram 결과이다.
도 43은 100 nM GPC-3 항체 처리 시 HepG2 간암세포주 표면에 존재하는 Fc 도메인의 양을 측정한 결과이다.
도 44는 50 nM EphA2 항체 처리 시 PC-3 전립선암세포주의 AKT 인산화 억제 분석 결과이다.
도 45는 100 nM EphA2 항체 처리 시 PC-3 전립선암세포주 표면에 존재하는 Fc 도메인의 양을 측정한 결과이다.
도 46은 MET을 표적하는 Monovalent engineered mAb인 MEM01과 MEM06의 인간 MET에 대한 결합능 분석 sensorgram 결과이다.
도 47은 다양한 농도의 MET 항체 처리 시 MKN45 위암세포주 표면에 존재하는 Fc 도메인의 양을 측정한 결과이다.
도 48은 다양한 농도의 항체 처리 시 SNU5 위암세포주 표면에 존재하는 Fc 도메인의 양을 측정한 결과이다.
도 49는 EGFR을 표적하는 Monovalent engineered mAb들의 인간 EGFR에 대한 결합능 분석 sensorgram 결과이다.
도 50은 CD33을 표적하는 Monovalent engineered mAb인 33-1, 33-2, 33-3 및 Biparatopic engineered mAb인 33-4, 33-5, 33-6, 33-7의 인간 CD33에 대한 결합능 분석 sensorgram 결과이다.
도 51은 CEACAM5를 표적하는 Monovalent engineered mAb들의 인간 CEACAM5에 대한 결합능 분석 sensorgram 결과이다.
도 52는 일 구체예인 융합단백질의 타겟에 대한 결합능을 분석한 sensorgram 결과이다. 구체적으로, 도 52a는 TROP2을 표적하는 Monovalent engineered mAb인 T01의 인간 TROP2에 대한 결합능 분석 sensorgram 결과이다. 도 52b는 Mesothelin을 표적하는 Monovalent engineered mAb인 MSM01의 인간 Mesothelin에 대한 결합능 분석 sensorgram 결과이다. 도 52c는 LIV-1을 표적하는 Monovalent engineered mAb인 LIM01의 인간 LIV-1에 대한 결합능 분석 sensorgram 결과이다. A:T01, B:MSM01, C:LIM01
용어의 정의
본 명세서에서 사용된 용어, "2개의 Fc를 가진 융합단백질" 또는 "2개의 Fc를 가진 항체"는 항원 결합 부위를 구성하는 2개의 폴리펩티드 사슬에 2개의 Fc 도메인이 독립적으로 결합된 융합단백질을 의미한다. 항원 결합 부위를 구성하는 2개의 폴리펩티드 사슬은 서로 상이할 수 있다. 예를 들면, 항원 결합 부위를 구성하는 2개의 폴리펩티드 사슬 중 하나는 항체의 경쇄 CDR 서열 혹은 경쇄 가변 영역을 포함하거나 또는 이들로 구성된 서열 이거나 혹은 scFv일 수 있고, 다른 하나는 항체의 중쇄 CDR 서열 혹은 중쇄 가변 영역을 포함하거나 또는 이들로 구성된 서열 이거나 혹은 scFv일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 2개의 Fc 영역을 가지는 융합단백질은 천연 CDR을 포함하는 인간 면역글로불린을 포함하는 키메라 항체인 비인간 항체의 "인간화" 형태의 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 융합단백질은 "완전 인간 항체" 또는 "인간 항체"의 일부를 포함할 수 있다. 또한, 일 구체예에서, 다중 특이적 융합단백질 또는 항원 결합 도메인은 "단일 클론 항체" 또는 이의 일부일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "항체"는 항원에 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 의미한다. 또한, 항체는 면역글로불린이라고 지칭되기도 한다. 항체는 IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA에서 선택되는 어느 하나를 의미할 수 있으며, IgG의 하위 부류인 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2일 수 있다. 또한, 항체는 작용 항체 또는 길항 항체일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "Fab" 또는 "Fab 영역"은 항원에 결합하는 항체 영역을 지칭한다. 통상적인 IgG는 일반적으로 두 개의 Fab 영역을 포함한다. 각 Fab 영역은 전형적으로 각각의 중쇄 및 경쇄의 하나의 가변 영역 및 하나의 불변 영역으로 구성된다. 구체적으로, Fab 영역에서 중쇄의 가변 영역 및 불변 영역은 VH 및 CH1 영역이고, Fab 영역에서 경쇄의 가변 영역 및 불변 영역은 VL 및 CL 영역이다. Fab 영역의 VH, CH1, VL 및 CL은 본 개시 내용에 따른 항원 결합 능력을 부여하기 위해 다양한 방식으로 배열될 수 있으며, VH와 VL이 서로 치환된 배열을 가지는 CrossMab Fab 방식을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "중쇄"는 약 50 kDa 내지 약 70 kDa의 폴리펩티드 사슬을 지칭한다. 여기서 N-말단 부분은 약 120 내지 130 개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함하고, C-말단 부분은 불변 영역을 포함한다. 불변 영역은 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε), 감마(γ) 및 뮤(μ)의 5 가지 유형 중 하나일 수 있다. 이때, α, δ 및 γ는 약 450개의 아미노산을 포함하고 μ 및 ε은 약 550개의 아미노산을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "경쇄"는 약 25kDa의 폴리펩티드 사슬을 지칭한다. 여기서 N-말단 부분은 약 100 내지 약 110개 이상의 아미노산의 가변 영역 및 C-말단 부분은 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 도메인은 카파(κ) 또는 람다(λ) 두 가지 유형이 있다. 또한, 경쇄의 불변 영역을 "CL"이라고 한다. 중쇄 C 도메인(CH 도메인)은 N-말단에서 C-말단까지 번호가 매겨져 있다(예: CH1, CH2, CH3 등). 이들 항체 부류의 임의의 CL 및 CH1 영역이 본 개시 내용에 사용될 수 있다. 특정 구체 예에서, 본 명세서에 제공된 CL 및 CH1 영역은 IgG 유형(예를 들어, IgG1)이다.
본 명세서에서 사용된 용어, “Fc” 혹은 "Fc 영역"은 천연 Fc 영역, 재조합 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 의미한다. 따라서 Fc는 IgA, IgD 및 IgG의 마지막 2개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, IgE 및 IgM의 마지막 3개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, 및 이들 도메인의 N-terminal로 존재하는 힌지를 지칭한다. IgA 및 IgM의 경우 Fc는 J 사슬을 포함할 수 있다. IgG의 경우 Fc는 면역글로불린 도메인 Cy2(CH2) 및 Cy3(CH3) 및 Cy1과 Cy2 사이의 힌지를 포함한다. Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 C-말단에 잔기 C226, P230 또는 A231을 포함하는 것으로 정의되며, 여기서 넘버링은 EU 인덱스에 따른다. 본원에 사용된 “Fc 폴리펩티드" 또는 "Fc 유래 폴리펩티드"는 Fc 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 일 구체예에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환, 예를 들어 약 1개 내지 약 10개의 아미노산 치환, 또는 약 1개 내지 약 5개의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 또한. 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역과 적어도 약 80% 상동성, 적어도 약 90% 상동성, 적어도 약 95% 상동성을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “Fv” 또는 “Fv 단편” 혹은 “Fv 영역”은 단일 항체의 VL 및 VH 도메인을 포함하는 폴리펩티드이다.
본 명세서에서 사용된 용어, “단쇄 Fv” 또는 “scFv”는 항체의 VH와 VL 도메인을 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재하도록 포함하는 항체 단편을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "가변 영역"은 경쇄(카파 및 람다 포함) 및 중쇄 면역글로불린 유전자 좌를 각각 구성하는 VL(V카파(VK) 및 V람다(VL) 포함) 및/또는 VH 유전자 중 어느 하나에 의해 코딩된 면역글로불린 도메인 하나 또는 그 이상을 포함하는 항체 영역을 의미한다. 경쇄 또는 중쇄 가변 영역(VL 또는 VH)은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로 지칭되는 3개의 초가변 영역을 포함하는 "프레임워크" 또는 "FR" 영역으로 구성된다. 본 명세서에서 사용된 용어, "항원"은 항체에 선택적으로 결합할 수 있는 구조이다. 표적 항원은 폴리펩티드, 탄수화물, 핵산, 지질, 합텐 또는 기타 자연적으로 발생된 화합물이거나 합성된 화합물일 수 있다. 구체적으로, 항원은 폴리펩티드이며, 세포 상 또는 세포 내에 존재하는 단백질일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "에피토프"는 항원 결정기를 지칭하고, 항체 또는 폴리펩티드가 결합하는 항원 상의 영역이다. 단백질 에피토프는 결합에 직접 관여하는 아미노산 잔기 뿐만 아니라 특이적 항원 결합 항체 또는 펩티드에 의해 효과적으로 차단되는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 항체 또는 수용체와 결합할 수 있는 복잡한 항원 분자의 가장 단순한 형태 또는 가장 작은 구조적 영역이다. 에피토프는 선형 또는 구조적/구조형태학적일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "벡터"는 본 명세서에 기재된 다중 특이적 융합단백질(예를 들어, 항체)을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열을 운반하거나 발현시키기 위한 물질을 의미한다. 구체적으로, 벡터는 발현 벡터, 플라스미드, 파지 벡터, 바이러스 벡터, 에피솜 및 인공 염색체를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "폴리뉴클레오티드"는 "핵산"이라고도 지칭되며, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭한다. 구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다.
2개의 Fc를 포함하는 항체
본 발명의 일 측면은, 항원 결합 부위 및 Fc 도메인의 비율이 1:2 혹은 2:2인 것을 특징으로 하는 복수의 Fc 도메인을 포함하는 항체를 제공한다. 구체적으로, 상기 항체는 항원 결합 부위, 제1 Fc 도메인 또는 이의 변이체, 및 제2 Fc 도메인 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질일 수 있다.
이때, 상기 항원 결합 부위는 서로 다른 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성될 수 있다. 또한, 각각의 폴리펩티드는 제1 Fc 도메인 또는 이의 변이체 및 제2 Fc 도메인 또는 이의 변이체에 연결된 것일 수 있다.
이때, 상기 융합단백질의 일 구체예로, 상기 항원 결합 부위가 Fab을 포함할 경우, 2개의 Fc 도메인은 각각 중쇄의 CH1 영역의 C 말단 및 경쇄의 불변 영역 C 말단에 결합된 융합단백질일 수 있다. 또한, Fc 도메인과 Fab는 펩티드 링커를 통해 결합될 수 있다.
또한, 상기 융합단백질의 일 구체예로, 상기 항원 결합 부위는 Fv 일 경우, 2개의 Fc 도메인은 각각 중쇄 가변 영역 C 말단 및 경쇄의 가변 영역 C 말단에 결합된 융합단백질일 수 있다. 또한, Fc 도메인과 Fv는 펩티드 링커를 통해 결합될 수 있다.
이와 같은 신규한 항체 구조체는 인간 IgG와 유사한 분자량을 가진다. 또한, 상기 융합단백질은 인간 IgG 기반 항체와 동등한 항원 결합 친화도를 가질 수 있다. 그러나, 세포 표면항원에 Fc 도메인을 자연상의 인간 항체 대비 최대 4배 존재하게 할 수 있다. 이러한 특성으로 인해, 상기 융합단백질은 야생형 항체에 비해 Fcγ수용체 친화도를 증가시킬 수 있으며, effector functions을 증가시킬 수 있다. 상기 융합단백질에 결합된 각각의 Fc 도메인은 IgG 기반 항체의 Fc 도메인과 유사한 수준의 Fc receptor(Fcγ receptor 및 FcRn) 결합친화도(affinity)를 가질 수 있지만, 어비디티(avidity) 효과로 인하여 상기 융합단백질의 Fc receptor(Fcγ receptor 및 FcRn) 겉보기 결합친화도(apparent affinity)는 인간 IgG 항체 대비 현저하게 증가된 값을 가질 수 있다. 또한, 상기 융합단백질은 IgG 기반 항체와 유사한 수준의 열 안정성을 가진다.
구체적으로, 상기 융합단백질은 (a) 적어도 하나의 complementarity-determining region (CDR) 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드와 적어도 하나의 complementarity-determining region (CDR) 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드로 이루어지고, 상기 제1 폴리펩티드와 상기 제2 폴리펩티드가 이량체 (dimer)를 형성하고, 타겟 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위, (b) 두 개의 폴리펩티드 서열로 이루어진 이량체로서, 이중 하나의 폴리펩티드 서열이 상기 항원 결합 부위의 제1 폴리펩티드에 결합된 제1 Fc 도메인 또는 이의 변이체, 및 (c) 두 개의 폴리펩티드 서열로 이루어진 이량체로서, 이중 하나의 폴리펩티드 서열이 상기 항원 결합 부위의 제2 폴리펩티드에 결합된 제2 Fc 도메인 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질일 수 있다.
이때, 상기 항원 결합 부위의 제1 폴리펩티드는 항체 중쇄의 CDR1, CDR2, 및 CDR3를 포함하고, 상기 항원 결합 부위의 제2 폴리펩티드는 항체 경쇄의 CDR1, CDR2, 및 CDR3를 포함할 수 있다. 또한, 상기 항원 결합 부위의 제1 폴리펩티드는 항체 중쇄의 CH1 영역을 더 포함하고, 및/또는 상기 항원 결합 부위의 제2 폴리펩티드는 항체 경쇄의 불변 영역을 더 포함할 수 있다.
상기 융합단백질의 구체적인 구조에 대하여는 하기에 더 상세히 설명한다.
항원 결합 부위
이때, 상기 항원 결합 부위는 세포 표면에 발현되는 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다. 구체적으로, 상기 항원 결합 부위는 암 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.
일 구체예로, 상기 항원 결합 부위는 PD-L1, EGFR, EGFRvIII, BCMA, CD22, CD25, CD30, CD33, CD37, CD38, CD52, CD56, CD123, c-Met(MET), DLL3, DR4, DR5, GD2, Nectin-4, RANKL, SLAMF7, Trop-2, LIV-1, Claudin 18.2, IL13α2, CD3, HER2, HER3, FGFR2, FGFR3, GPC3, ROR1, Folα, CD20, CD19, CTLA-4, VEGFR, NCAM1, ICAM-1, ICAM-2, CEACAM5, CEACAM6, Carcinoembryonic antigen(CEA), CA-125, Alphafetoprotein(AFP), MUC-1, MUC-16, PSMA, PSCA, Epithelial tumor antigen(ETA), Melanoma-associated antigen(MAGE), Immature laminin receptor, TAG-72, HPV E6/E7, BING-4, Calcium-activated chloride channel 2, Cyclin-B1, 9D7, Ep-CAM, EphA2, EphA3, Mesothelin, SAP-1, Survivin 및 바이러스 유래 항원으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나에 특이적으로 결합할 수 있다.
제2 항원 결합 부위도 위 그룹에서 선택되는 어느 하나의 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 일 구체예에 따르면, 제1 항원 결합 부위가 결합하는 항원과 제2 항원 결합 부위가 결합하는 항원은 상이할 수 있다. 예를 들면, 제1 항원 결합 부위는 HER2에 특이적으로 결합하는 서열을 포함하고 제2 항원 결합 부위는 EGFR에 특이적으로 결합하는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서는, 제1 항원 결합 부위는 항원의 한 에피토프에 특이적으로 결합하는 서열을 포함하고 제2 항원 결합 부위는 동일한 항원의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 서열을 포함할 수 있다.
항원 결합 부위의 구체예
이때, 상기 항원 결합 부위는 상기 항원에 특이적으로 결합하는 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 가변영역은 Cetuximab, Panitumumab, Necitumumab, Imgatuzumab, Depatuxizumab, Losatuxizumab, Etevritamab, AMG-595, Atezolizumab, Avelumab, Durvalumab, Trastuzumab, Pertuzumab, Onartuzumab, Emibetuzumab, Telisotuzumab, Datopotamab, Sacituzumab, Rovalpituzumab, Tarlatamab, Belantamab, Ladiratuzumab, Codrituzumab, Aprutumab, Bemarituzumab, Vofatamab, Ramucirumab, Rituximab, Obinutuzumab, Daratumumab 및 1C1(Clone name)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 항체의 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 포함할 수 있으나, 이에 국한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예로, EGFR에 특이적으로 결합하는 항원결합부위를 포함할 수 있다. 예를 들면, Cetuximab의 서열번호 175로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 176으로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 177로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 178로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 179로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 180으로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또 다른 예로는, Panitumumab의 서열번호 181로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 182로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 183으로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 184로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 185로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 186으로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또 다른 예로는, Necitumumab의 서열번호 187로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 188로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 189로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 190으로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 191로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 192로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, Imgatuzumab의 서열번호 193으로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 194로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 195로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 196으로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 197로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 198로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, Depatuxizumab의 서열번호 199로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 200으로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 201로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 202로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 203으로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 204로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, Losatuxizumab의 서열번호 199로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 205로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 206으로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 202로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 203으로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 204로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, EGFRvIII에 특이적으로 결합하는 항원결합부위를 포함할 수 있다. 예를 들면, Etevritamab의 서열번호 207로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 208로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 209로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 210으로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 211로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 212로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, AMG-595의 서열번호 213으로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 214로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 215로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 210으로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 216으로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 217로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항원결합부위를 포함할 수 있다. 예를 들면, Atezolizumab의 서열번호 218로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 219로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 220으로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 221로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 222로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 223으로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, Avelumab의 서열번호 224로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 225로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 226으로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 227로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 228로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 229로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, Durvalumab의 서열번호 230으로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 231로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 232로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 233으로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 234로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 235로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, HER2에 특이적으로 결합하는 항원결합부위를 포함할 수 있다. 예를 들면, Trastuzumab의 서열번호 21로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 22로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 23으로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 24로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 25로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 26으로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, Pertuzumab의 서열번호 33으로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 34로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 35로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 36으로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 37로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 38로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 c-Met에 특이적으로 결합하는 항원결합부위를 포함할 수 있다. 예를 들면 Onartuzumab의 서열번호 236으로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 237로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 238로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 239로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 240으로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 241로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, Emibetuzumab의 서열번호 242로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 243으로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 244로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 245로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 246으로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 247로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, Telisotuzumab의 서열번호 248로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 249로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 250으로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 251로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 252로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 253으로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 Trop-2에 특이적으로 결합하는 항원결합부위를 포함할 수 있다. 예를 들면, Datopotamab의 서열번호 254로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 255로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 256으로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 257로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 258로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 259로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, Sacituzumab의 서열번호 260으로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 261로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 262로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 263으로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 264로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 265로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 DLL3에 특이적으로 결합하는 항원결합부위를 포함할 수 있다. 예를 들면, Rovalpituzumab의 서열번호 266으로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 267로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 268로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 269로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 270으로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 271로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, Tarlatamab의 서열번호 272로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 273으로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 274로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 275로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 276으로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 277로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 BCMA에 특이적으로 결합하는 항원결합부위를 포함할 수 있다. 예를 들면, Belantamab의 서열번호 278로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 279로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 280으로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 281로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 282로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 283으로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 LIV-1에 특이적으로 결합하는 항원결합부위를 포함할 수 있다. 예를 들면, Ladiratuzumab의 서열번호 284로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 285로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 286으로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 287로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 288로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 289로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 GPC-3에 특이적으로 결합하는 항원결합부위를 포함할 수 있다. 예를 들면, Codrituzumab의 서열번호 99로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 100으로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 101로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 102로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 103으로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 104로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 FGFR2에 특이적으로 결합하는 항원결합부위를 포함할 수 있다. 예를 들면, Aprutumab의 서열번호 290으로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 291로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 292로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 293으로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 294로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 295로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한 Bemarituzumab의 서열번호 296으로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 297로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 298로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 299로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 300으로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 301로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 FGFR3에 특이적으로 결합하는 항원결합부위를 포함할 수 있다. 예를 들면, Vofatamab의 서열번호 302로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 303으로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 304로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 305로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 306으로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 307로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 VEGFR2에 특이적으로 결합하는 항원결합부위를 포함할 수 있다. 예를 들면, Ramucirumab의 서열번호 308로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 309로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 310으로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 311로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 312로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 313으로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 CD20에 특이적으로 결합하는 항원결합부위를 포함할 수 있다. 예를 들면, Rituximab의 서열번호 314로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 315로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 316으로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 317로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 318로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 319로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 예를 들면, Obinutuzumab의 서열번호 320으로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 321로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 322로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 323으로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 324로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 325로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 CD38에 특이적으로 결합하는 항원결합부위를 포함할 수 있다. 예를 들면, Daratumumab의 서열번호 326으로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 327로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 328로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 329로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 330으로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 331로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 EphA2에 특이적으로 결합하는 항원결합부위를 포함할 수 있다. 예를 들면, 1C1의 서열번호 157으로 표시되는 H-CDR1, 서열번호 158로 표시되는 H-CDR2, 서열번호 159로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 서열번호 160로 표시되는 L-CDR1, 서열번호 161으로 표시되는 L-CDR2, 서열번호 162로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
하기 표 1은 본 발명의 구체예들에서 사용할 수 있는, 항암 효능을 가진 비제한적인 예시적인 (non-limiting exemplary) 항체들의 CDR 서열을 나타낸 것이다.
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항원
본 명세서에 기술된 항원 결합 부위가 특이적으로 결합할 수 있는 항원으로는, 다음의 비제한적인 (non-limiting) 물질 들을 예시할 수 있다.
"표피생장인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR)": 세포의 성장, 분열, 생존 및 사멸을 조절하는 세포막 수용체로서, 다양한 암에서 종양 조직 내에 EGFR의 발현이 증가되어 있다. 상기 EGFR이 증가된 종양조직은 침습, 전이 및 항암제 내성이 높은 것으로 알려져 있다. 상기 EGFR을 저해하는 물질은, 일 구체예로 Cetuximab, Panitumumab, Necitumumab, Imgatuzumab, Depatuxizumab, 또는 Losatuxizumab 일 수 있으나, 이에 국한되지 않는다.
"표피생장인자 수용체 변이체 3(epidermal growth factor receptor variant 3, EGFRvIII)": EGFR의 exon 2 - 7이 결실된 돌연변이로 교모세포종(Glioblastoma multiforme)에서 주로 보고되며, EGFRvIII 돌연변이를 가진 양성 환자는 대부분 예후가 나쁘다. 상기 EGFRvIII를 저해하는 물질은, 일 구체예로 Cetuximab, Panitumumab, Necitumumab, Imgatuzumab, Depatuxizumab, Losatuxizumab, Etevritamab, 또는 AMG-595 일 수 있으나, 이에 국한되지 않는다.
프로그램화된 세포 사멸 단백질 리간드-1(Programmed Death-Ligand 1, PD-L1)": 암세포 표면에 과발현되는 단백질로 T세포의 탈진(Exhaustion), 사멸(Apoptosis)을 유도하고, 암세포의 면역내성 획득에 중요한 역할을 하는 주요한 암 특이적 항원이다. PD-L1 표적 항암 항체의 일 구체예로, Atezolizumab, Avelumab, 및 Durvalumab 일 수 있으나, 이에 국한되지 않는다.
"HER-2/neu(human epidermal growth factor receptor 2): PI3K/AkT를 활성화를 통해 세포 증식을 조절한다. 전이성 유방암 및 난소암 등에서 과발현 되어 있고 항암제 내성을 유발하는 것으로 알려져 있다. Her2/neu 표적항암제는 Trastuzumab, 또는 Pertuzumab 일 수 있으나, 이에 국한되지 않는다.
"c-Met(Mesenchymal-epithelial transition factor)": 간세포성장인자수용체(Hepatocyte growth factor receptor)로 암세포에서 증폭 또는 변이가 빈번히 보고되며, 종양의 성장, 전이 및 악성화를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 구체적으로 상기 단백질의 억제제는 Onartuzumab, Emibetuzumab, 또는 Telisotuzumab일 수 있으나, 이에 국한되지 않는다.
"Trop-2(Tumor-associated calcium signal transducer 2)": 암세포 성장 및 증식과 관련된 세포당단백질로 비소세포성 폐암과 유방암에 특이적으로 과발현하는 것으로 알려져 있다. 구체적으로 상기 단백질의 표적항체는 Datopotamab, 또는 Sacituzumab일 수 있으나, 이에 국한되지 않는다.
"DLL3(Delta-like ligand 3)": 소세포폐암 환자의 약 85%에게서 발현되는 것으로 알려져 있는, 주요한 암 표적 항원이다. 구체적으로 상기 단백질의 표적항체는 Rovalpituzumab, 또는 Tarlatamab일 수 있으나, 이에 국한되지 않는다.
"BCMA(B-cell maturation antigen)": 골수종세포의 생존 및 증식에 중요한 인자로 임상적으로 검증된 다발성골수종 치료 표적이다. 구체적으로 상기 단백질의 표적항체는 Belantamab일 수 있으나, 이에 국한되지 않는다.
"LIV-1(Zinc transporter ZIP6)": 유방암에서 과발현되는 고도의 암 특이적 항원이다. 구체적으로 상기 단백질의 표적항체는 Ladiratuzumab일 수 있으나, 이에 국한되지 않는다.
"GPC-3(Glypican-3)": 간암에서 특이적 과발현되는 고도의 암 특이적 항원이다. 구체적으로 상기 단백질의 표적항체는 Codrituzumab 일 수 있으나, 이에 국한되지 않는다.
"FGFR(Fibroblast growth factor receptor)": 섬유아세포 성장인자(FGF)의 수용체로서, 세포성장, 분화 및 이동 등을 포함한 다양한 생물 과정들을 조절한다. FGFR 유전자는 돌연변이가 잘 일어나며, 이러한 변이체는 유방암, 자궁암, 난소암, 자궁경부암 등에서 흔히 관찰된다. 4개의 FGFR 유전자는 7개 신호전달 수용체로 만들어지고, 이 중 FGFR2, FGFR3는 고도의 암특이적 항원이다. FGFR2 또는 FGFR3을 표적으로 하는 항체는 Aprutumab, Bemarituzumab, 또는 Vofatamab 일 수 있으나, 이에 국한되지 않는다.
"혈관생성인자수용체(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGFR)": 혈관신생을 유도하는 혈관생성인자의 세포막 수용체로서, VEGFR 억제제는 상기 혈관신생을 저해하여 종양의 성장 및 전이를 억제한다. VEGFR 억제제의 일 구체예로, Ramucirumab일 수 있으나, 이에 국한되지 않는다.
"CD20(B lymphocyte antigen CD20)": B 세포 표면에 발현된 단백질로서 B 세포 림프종 치료를 위한 표적 단백질로 사용되고 있다. CD20 억제제는 Rituximab 또는 Obinutuzumab 일 수 있으나, 이에 국한되지 않는다.
"CD38(cluster of differentiation 38)": 면역세포에서 신호전달계 수용체 역할을 하면서 세포의 증식 및 사멸을 조절하는 단백질로서, 이를 표적으로 하는 억제제는 Daratumumab 일 수 있으나, 이에 국한되지 않는다.
"EphA2(EPH receptor A2)": 암세포에서 과발현되어 암세포의 성장 및 전이에 큰 영향을 끼치며, 이를 표적으로 하는 항체는 1C1 일 수 있으나, 이에 국한되지 않는다.
상기에서 예시한 항원 들에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위는 아래에 예시하는 것과 같은 CDR 서열들을 포함할 수 있다.
EGFR:
1) 서열번호 175(VH-CDR1), 서열번호 176(VH-CDR2) 및 서열번호 177(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 334), 및 서열번호 178(VL-CDR1), 서열번호 179(VL-CDR2) 및 서열번호 180(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 335);
2) 서열번호 181(VH-CDR1), 서열번호 182(VH-CDR2) 및 서열번호 183(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 336), 및 서열번호 184(VL-CDR1), 서열번호 185(VL-CDR2) 및 서열번호 186(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 337);
3) 서열번호 187(VH-CDR1), 서열번호 188(VH-CDR2) 및 서열번호 189(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 338), 및 서열번호 190(VL-CDR1), 서열번호 191(VL-CDR2) 및 서열번호 192(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 339);
4) 서열번호 193(VH-CDR1), 서열번호 194(VH-CDR2) 및 서열번호 195(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 340), 및 서열번호 196(VL-CDR1), 서열번호 197(VL-CDR2) 및 서열번호 198(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 341);
5) 서열번호 199(VH-CDR1), 서열번호 200(VH-CDR2) 및 서열번호 201(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 342), 및 서열번호 202(VL-CDR1), 서열번호 203(VL-CDR2) 및 서열번호 204(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 343);
6) 서열번호 199(VH-CDR1), 서열번호 205(VH-CDR2) 및 서열번호 206(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 344), 및 서열번호 202(VL-CDR1), 서열번호 203(VL-CDR2) 및 서열번호 204(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 345);
EGFRvIII:
7) 서열번호 207(VH-CDR1), 서열번호 208(VH-CDR2) 및 서열번호 209(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 346), 및 서열번호 210(VL-CDR1), 서열번호 211(VL-CDR2) 및 서열번호 212(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 347);
8) 서열번호 213(VH-CDR1), 서열번호 214(VH-CDR2) 및 서열번호 215(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 348), 및 서열번호 210(VL-CDR1), 서열번호 216(VL-CDR2) 및 서열번호 217(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 349);
PD-L1:
9) 서열번호 218(VH-CDR1), 서열번호 219(VH-CDR2) 및 서열번호 220(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 350), 및 서열번호 221(VL-CDR1), 서열번호 222(VL-CDR2) 및 서열번호 223(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 351);
10) 서열번호 224(VH-CDR1), 서열번호 225(VH-CDR2) 및 서열번호 226(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 352), 및 서열번호 227(VL-CDR1), 서열번호 228(VL-CDR2) 및 서열번호 229(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 353);
11) 서열번호 230(VH-CDR1), 서열번호 231(VH-CDR2) 및 서열번호 232(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 354), 및 서열번호 233(VL-CDR1), 서열번호 234(VL-CDR2) 및 서열번호 235(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 355);
HER2:
12) 서열번호 21(VH-CDR1), 서열번호 22(VH-CDR2) 및 서열번호 23(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 356), 및 서열번호 24(VL-CDR1), 서열번호 25(VL-CDR2) 및 서열번호 26(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 357);
13) 서열번호 33(VH-CDR1), 서열번호 34(VH-CDR2) 및 서열번호 35(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 27), 및 서열번호 36(VL-CDR1), 서열번호 37(VL-CDR2) 및 서열번호 38(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 28);
c-Met:
14) 서열번호 236(VH-CDR1), 서열번호 237(VH-CDR2) 및 서열번호 238(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 358), 및 서열번호 239(VL-CDR1), 서열번호 240(VL-CDR2) 및 서열번호 241(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 359);
15) 서열번호 242(VH-CDR1), 서열번호 243(VH-CDR2) 및 서열번호 244(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 360), 및 서열번호 245(VL-CDR1), 서열번호 246(VL-CDR2) 및 서열번호 247(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 361);
16) 서열번호 248(VH-CDR1), 서열번호 249(VH-CDR2) 및 서열번호 250(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 362), 및 서열번호 251(VL-CDR1), 서열번호 252(VL-CDR2) 및 서열번호 253(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 363);
Trop-2:
17) 서열번호 254(VH-CDR1), 서열번호 255(VH-CDR2) 및 서열번호 256(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 364), 및 서열번호 257(VL-CDR1), 서열번호 258(VL-CDR2) 및 서열번호 259(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 365);
18) 서열번호 260(VH-CDR1), 서열번호 261(VH-CDR2) 및 서열번호 262(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 366), 및 서열번호 263(VL-CDR1), 서열번호 264(VL-CDR2) 및 서열번호 265(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 367);
DLL3:
19) 서열번호 266(VH-CDR1), 서열번호 267(VH-CDR2) 및 서열번호 268(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 368), 및 서열번호 269(VL-CDR1), 서열번호 270(VL-CDR2) 및 서열번호 271(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 369);
20) 서열번호 272(VH-CDR1), 서열번호 273(VH-CDR2) 및 서열번호 274(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 370), 및 서열번호 275(VL-CDR1), 서열번호 276(VL-CDR2) 및 서열번호 277(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 371);
BCMA:
21) 서열번호 278(VH-CDR1), 서열번호 279(VH-CDR2) 및 서열번호 280(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 372), 및 서열번호 281(VL-CDR1), 서열번호 282(VL-CDR2) 및 서열번호 283(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 373);
LIV-1:
22) 서열번호 284(VH-CDR1), 서열번호 285(VH-CDR2) 및 서열번호 286(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 374), 및 서열번호 287(VL-CDR1), 서열번호 288(VL-CDR2) 및 서열번호 289(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 375);
GPC-3:
23) 서열번호 99(VH-CDR1), 서열번호 100(VH-CDR2) 및 서열번호 101(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 87), 및 서열번호 102(VL-CDR1), 서열번호 103(VL-CDR2) 및 서열번호 104(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 88);
FGFR2:
24) 서열번호 290(VH-CDR1), 서열번호 291(VH-CDR2) 및 서열번호 292(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 376), 및 서열번호 293(VL-CDR1), 서열번호 294(VL-CDR2) 및 서열번호 295(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 377);
25) 서열번호 296(VH-CDR1), 서열번호 297(VH-CDR2) 및 서열번호 298(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 378), 및 서열번호 299(VL-CDR1), 서열번호 300(VL-CDR2) 및 서열번호 301(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 379);
FGFR3:
26) 서열번호 302(VH-CDR1), 서열번호 303(VH-CDR2) 및 서열번호 304(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 380), 및 서열번호 305(VL-CDR1), 서열번호 306(VL-CDR2) 및 서열번호 307(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 381);
VEGFR2:
27) 서열번호 308(VH-CDR1), 서열번호 309(VH-CDR2) 및 서열번호 310(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 382), 및 서열번호 311(VL-CDR1), 서열번호 312(VL-CDR2) 및 서열번호 313(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 383);
CD20:
28) 서열번호 314(VH-CDR1), 서열번호 315(VH-CDR2) 및 서열번호 316(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 384), 및 서열번호 317(VL-CDR1), 서열번호 318(VL-CDR2) 및 서열번호 319(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 385);
29) 서열번호 320(VH-CDR1), 서열번호 321(VH-CDR2) 및 서열번호 322(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 386), 및 서열번호 323(VL-CDR1), 서열번호 324(VL-CDR2) 및 서열번호 325(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 387);
CD38:
30) 서열번호 326(VH-CDR1), 서열번호 327(VH-CDR2) 및 서열번호 328(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 388), 및 서열번호 329(VL-CDR1), 서열번호 330(VL-CDR2) 및 서열번호 331(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 389);
EphA2:
31) 서열번호 157(VH-CDR1), 서열번호 158(VH-CDR2) 및 서열번호 159(VH-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역(서열번호 143), 및 서열번호 160(VL-CDR1), 서열번호 161(VL-CDR2) 및 서열번호 162(VL-CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역(서열번호 145).
하기 표 2는 여러 구체예에 따른 융합단백질을 효율적으로 발현하기 위한 예시적인 Signal sequence의 뉴클레오티드 서열과 폴리펩티드 서열이다. 위 항체들을 포유세포에서 발현할 경우 Signal sequence로 서열번호 333이 사용될 수 있으나, 이에 국한되지 않는다.
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000004
하기 표 3은 본 명세서에서 기술한 여러 융합단백질 들의 항원 결합 부위로 설명한, 항암 항체들의 가변영역 폴리펩티드 서열을 나타낸 것이다. 예시적인 구체예에 따른 융합 단백질들은 이들 가변영역 폴리펩티드를 포함하거나(comprising) 혹은 이들 가변영역 폴리펩티드로 구성(consists of)될 수 있다.
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Figure PCTKR2022015981-appb-img-000007
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000008
하기 표 4는 본 명세서에서 여러 융합단백질 들의 항원결합 부위로 설명한, 항암 항체들의 가변영역 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다.
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000009
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Fc 영역 또는 이의 단편
이때, 상술한 제1 Fc 도메인 및 상기 제2 Fc 도메인은 각각 면역글로불린의 Fc 영역일 수 있다. 상기 면역글로불린의 Fc 영역은 야생형 Fc 도메인뿐만 아니라, Fc 도메인 변이체일 수 있다. 이때, 상기 Fc 영역은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM의 Fc 영역일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "Fc 도메인 변이체"는 야생형 Fc 도메인의 당쇄 형태(glycosylation pattern)와 다르거나, 야생형 Fc 도메인에 비해 증가된 당쇄, 야생형 Fc 도메인에 비해 감소한 당쇄, 또는 당쇄가 제거된(deglycosylated) 형태일 수 있다. 또한 무당쇄(aglycosylated) Fc 도메인도 포함된다. Fc 도메인 혹은 변이체는 배양조건 혹은 호스트의 유전자 조작을 통해 조정된 숫자의 시알산(sialic acid), 퓨코실화(fucosylation), 당화(glycosylation)를 갖도록 한 것일 수 있다.
또한, 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같이 통상적인 방법으로 면역글로불린의 Fc 도메인의 당쇄를 변형시킬 수 있다. 또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 면역글로불린 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM의 Fc 영역이 혼합된 형태일 수 있다. 또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 상기 Fc 도메인의 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 형태일 수 있다.
상기 치환 및/또는 부가에 의해 도입되는 "아미노산"은 라이신(K), 알라닌(A), 알지닌(R), 아스파라진(N), 아스파르트산(D), 시스테인(C), 글루타민(Q), 글루탐산(E), 글라이신(G), 히스티딘(H), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 프롤린(P), 세린(S), 트레오닌(T), 트립토판(W), 타이로신(Y) 및 발린(V)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 Fc 영역의 변이체로서 일 실시예는 CH2 영역의 239 및/또는 332의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 형태일 수 있다(Kabat numbering system 참조). 구체적으로, S239가 S 이외의 다른 아미노산으로 치환될 수 있으며, 구체적으로, S239D로 치환될 수 있다. 또한, I332가 I 이외의 다른 아미노산으로 치환될 수 있으며, 구체적으로, I332E로 치환될 수 있다.
또한, 상기 Fc 영역은 놉 구조 또는 홀 구조를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "놉-인투-홀(knob-into-hole)"은 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 또는 이종이량체 항체 등과 같이, 서로 다른 영역에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하기 위한 설계 전략이다. 일반적으로, 이러한 기술은 제1 폴리펩티드의 경계면(가령, 제1 항체 중쇄의 제1 CH3 도메인)에 놉(knob)을 그리고 제2 폴리펩티드의 경계면(가령, 제2 항체 중쇄의 제2 CH3 도메인)에 상응하는 홀(hole)을 도입하는 것을 포함하고, 그리하여 놉을 홀 내에 위치시켜 이종이량체 형성을 촉진시키고 동종이량체 형성을 방해하도록 할 수 있다.
'놉'은 제1 폴리펩티드의 경계면(가령, 제1 항체 중쇄의 제1 CH3 도메인)으로부터의 소형 아미노산 측쇄들을 보다 큰 측쇄들(예컨대, 알지닌, 페닐알라닌, 타이로신 또는 트립토판)로 대체함으로써 구축된다. 상기 놉에 동일하거나 유사한 크기의 상보적 '홀'은 제2 폴리펩티드의 경계면(가령, 제2 항체 중쇄의 제2 CH3 도메인)에서 대형 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄들(예컨대, 알라닌, 세린, 발린, 또는 트레오닌)로 대체함으로써 생성된다. 상기 놉 및 홀은 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을, 예컨대, 부위-특이적 돌연변이 유발에 의해, 또는 펩티드 합성에 의해 변경함으로써 생성될 수 있다.
Fc 영역이 heterodimer를 형성하도록 촉진하는 Fc 영역의 변이체 예로는 WO2014084607A1 및 WO2018059502A1 등에 기재된 변이 들을 예시할 수 있다. WO2014084607A1 및 WO2018059502A1의 개시내용은 본 명세서에 참고로 삽입한다 (incorporated by reference). WO2014084607A1는 예를 들면 CH3 도메인에 (a-1) 일 CH3 도메인의 Lys409에서 치환된 트립토판(W)과 다른 일 CH3 도메인의 Asp399에서 치환된 발린(V) 및 Phe405에서 치환된 트레오닌(T)의 결합; 및 (a-2) 일 CH3 도메인의 Tyr349에서 치환된 세린(S)과 다른 일 CH3 도메인의 Glu357에서 치환된 트립토판(W)의 결합을 포함하고, 이에 덧붙여 (b-1) 일 CH3 도메인의 Lys360에서 치환된 글루탐산(E)과 다른 일 CH3 도메인의 Gln347에서 치환된 아르지닌(R)의 결합; 및 (b-2) 일 CH3 도메인의 Gln347에서 치환된 글루탐산(E) 및 Lys360에서 치환된 글루탐산과 다른 일 CH3 도메인의 Gln347에서 치환된 아르지닌(R)의 결합을 더 포함할 수 있는 CH3 도메인의 변이를 기재하고 있다. 여기에서, 상기 아미노산 잔기의 위치는 EU index에 따른다. WO2018059502A1는 예를 들면, Fc 도메인의 변이는 하기 a) - e)에서 각각 선택된 하나 또는 그 이상의 변이를 포함하는 변이를 기재하고 있다: a)　L351G,　L351Y,　L351V,　L351P,　L351D, L351E, L351K, 또는　L351W； b)　T366L,　T366P,　T366W,　또는　T366V；c)　D399C,　D399N,　D399I,　D399G,　D399R,　D399T,　또는　D399A；d)　Y407L,　Y407A,　Y407P,　Y407F,　Y407T, 또는　Y407H；　및 e)　K409C,　K409P,　K409S,　K409F,　K409V,　K409Q,　또는　K409R. 여기에서, 상기 아미노산 잔기의 위치는 EU index에 따른다.
융합단백질의 구조
상기 융합단백질은 각각 하기 구조식 (I), (II), (III) 및 (IV)로 나타내지는 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다:
N'-X-(L1)n-A-C' (I);
N'-Y-(L2)m-B-C' (II);
N'-C-C' (III); 및
N'-D-C' (IV)
이때, 상기 구조식 (I), (II), (III) 및 (IV)에 있어서,
상기 N'은 각 폴리펩티드의 N-말단이고,
상기 C'은 각 폴리펩티드의 C-말단이며,
상기 - 는 결합을 의미하고,
상기 A, B, C 및 D는 각각 면역글로불린의 CH2 및 CH3 영역을 포함하여, 임의적으로 CH4 및/또는 힌지 서열을 더 포함하는 Fc 도메인의 단량체 폴리펩티드 서열이며,
상기 A는 C 또는 D중 하나와 함께 이량체를 형성하여 상기 제1 Fc 도메인 (b)를 형성하고,
상기 B는 C 또는 D중 남은 하나와 함께 이량체를 형성하여 상기 제2 Fc 도메인 (c)를 형성하며;
L1 및 L2는 펩티드 링커이며,
상기 n 및 m은 각각 독립적으로 0 또는 1이며,
상기 X는 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역을 포함하고;
상기 Y는 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 가변영역 또는 중쇄 가변영역을 포함하며;
상기 X 및 Y는 상호 결합하여 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위(a)를 형성하고,
상기 (I), (II), (III) 및 (IV)의 폴리펩티드는 결합하여 1개의 항원 결합 부위 및 2개의 Fc 도메인을 형성할 수 있다.
구체적으로, 상기 X는 상기 항원 결합 부위의 제 1 폴리펩티드 서열로서, 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하는 서열이거나 혹은 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변영역을 포함하고; 상기 Y는 상기 항원 결합 부위의 제 2 폴리펩티드 서열로서, 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하는 서열이거나 혹은 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 가변영역을 포함하며; 상기 X 및 Y는 결합하여 항원에 특이적으로 결합하는 상기 항원 결합 부위 (a)를 형성한다.
일 구체예에 따르면, A와 B, C와 D의 상호작용이 최소화되고 A와 C, B와 D의 이종이중체(heterodimeric Fc) 형성이 촉진되도록 CH3 영역이 변이된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 Fc 도메인 단량체는 Fc 이종이량체(heterodimeric Fc) 형성을 촉진하는 놉 구조 또는 홀 구조를 포함하는 것인; 또는 상기 Fc 도메인 단량체는 정전기 조향(electrostatic steering) 기작에 의한 이종이량체 형성을 촉진하는 변이체를 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 구조식 (I)의 X는 추가적으로 중쇄 CH1 영역을 포함하고, 및/또는 상기 구조식 (II)의 Y는 추가적으로 경쇄 불변영역을 포함할 수 있다.
또한, 상기 융합단백질은 하기 구조식 (I'), (II'), (III) 및 (IV)로 나타내지는 폴리펩티드 사슬들을 포함할 수 있다:
N'-VD1-(L3)p-X-(L1)n-A-C' (I');
N'-VD2-(L4)q-Y-(L2)m-B-C' (II');
N'-C-C' (III); 및
N'-D-C' (IV)
이때, 상기 구조식 (I'), (II'), (III) 및 (IV)에 있어서,
상기 N'은 폴리펩티드 사슬의 N-말단이고,
상기 C'은 폴리펩티드 사슬의 C-말단이며,
상기 - 는 결합을 의미하고,
상기 A, B, C 및 D는 각각 면역글로불린의 CH2 및 CH3 영역을 포함하여, 임의적으로 CH4 및/또는 힌지 서열을 더 포함하는 Fc 도메인의 단량체 폴리펩티드 서열이며, 상기 A는 C 또는 D중 하나와 함께 이량체를 형성하여 상기 제1 Fc 도메인 (b)를 형성하고, 상기 B는 C 또는 D중 남은 하나와 함께 이량체를 형성하여 상기 제2 Fc 도메인 (c)를 형성하며;
L1, L2, L3 및 L4는 펩티드 링커이며,
상기 n, m, p 및 q는 각각 독립적으로 0 또는 1이며,
상기 VD1은 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 혹은 경쇄 가변영역 혹은 항체 중쇄 혹은 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 구성되고;
상기 VD2는 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 혹은 중쇄 가변영역 혹은 항체 중쇄 혹은 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 구성되며;
상기 VD1과 VD2는 결합하여 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항체 가변 영역을 형성하며,
상기 X는 항원에 특이적으로 결합하는 항체 중쇄 혹은 경쇄 가변영역 혹은 항체 중쇄 혹은 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고;
상기 Y는 항원에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 혹은 중쇄 가변영역 혹은 항체 중쇄 혹은 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하며;
상기 X 및 Y는 결합하여 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항체 가변 영역을 형성하고,
상기 VD1-(L3)p-X는 상기 항원결합 부위(a)의 제1 폴리펩티드 서열을 형성하고, 상기 VD2-(L4)q-Y는 상기 항원결합 부위(a)의 제2 폴리펩티드 서열을 형성한다.
일 구체예에 따르면, A와 B, C와 D의 상호작용이 최소화되고 A와 C, B와 D의 이종이중체(heterodimeric Fc) 형성이 촉진되도록 CH3 영역이 변이된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 Fc 도메인 단량체는 Fc 이종이량체(heterodimeric Fc) 형성을 촉진하는 놉 구조 또는 홀 구조를 포함하는 것인; 또는 상기 Fc 도메인 단량체는 정전기 조향(electrostatic steering) 기작에 의한 이종이량체 형성을 촉진하는 변이체를 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 중쇄 가변영역은 추가적으로 중쇄 CH1 영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 경쇄 가변영역은 추가적으로 경쇄 불변영역을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 설명한 융합단백질들의 구조에 있어서, 상기 X 및 Y의 결합은 i) CH1 및 경쇄 불변영역에 존재하는 Cys에 의한 이황화 결합을 통해 이루어 지거나, ii) 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역에 존재하는 Cys에 의한 이황화 결합을 통해 이루어 지거나, iii) CH1 및 경쇄 불변영역에 존재하는 Cys에 의한 이황화 결합 및 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역에 존재하는 Cys에 의한 이황화 결합을 통해 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다.
구체적으로, 상기 X 및 Y의 결합은 Kabat numbering기준 CH1233와 CL214 사이에 존재하는 이황화 결합에 의해 형성될 수 있다. 또한, 상기 X 및 Y는 아미노산 치환을 통해 Cys이 더 포함될 수 있다. 이러한 변이체의 예로는 가변영역에서 변이를 포함할 수 있으며, 구체적으로, kabat 넘버링 시스템으로, VH의 105C 및 VL의 43C의 변이를 포함하거나, VH의 44C 및 VL의 100C의 변이를 포함할 수 있다. 일 구체예로, 상기 변이는 VH의 Q105C 및 VL의 A43 일 수 있다. 또한, 일 구체예로, 상기 변이는 VH의 G44C 및 VL의 Q100C 일 수 있다. 또한, 불변영역에서 변이체의 예로는 kabat 넘버링 시스템으로, CH1의 122C 및 CL의 121C의 변이를 포함할 수 있다. 일 구체예로, 상기 변이는 CH1의 F122C 및 CL의 S121C 일 수 있다.
링커 및 힌지
힌지는 면역글로불린 유래의 힌지 영역이다. 일 구체예에서, 항체 힌지 영역은 IgG 힌지 영역이다. 본원에 제공된 IgG 힌지 영역은, 예를 들어 다양한 IgG 서브 타입의 항체 힌지 영역으로부터 선택될 수 있다. 아래 표는 본원에서 제공되는 유연한 펩티드 영역에 포함될 수 있는 코어 힌지 서열을 가진 예시적인 IgG 하위 유형을 나열한다. 또한, 힌지 내에는 적어도 1개의 Cys이 존재할 수 있다. 구체적으로, 상기 힌지 내에는 1개, 2개, 3개의 Cys이 존재할 수 있다.
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000019
상기 힌지는 이황화 결합을 결실하거나 추가의 이황화 결합을 도입하도록 변형될 수 있다.
또한, 상기 링커 L1 및 L2은 각각 1 내지 약 70개의 아미노산을 포함할 수 있다. 일 예시적인 구체예에 따르면, 상기 L1 및 L2은 각각 약 5 내지 약 60개, 약 10 내지 약 50개, 약 15 내지 약 40개, 약 20 내지 약 30개의 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 예시적인 구체예에 따르면, 예를 들면, L1 및 L2은 각각 1-70 아미노산 잔기, 2-60 아미노산 잔기, 2-50 아미노산 잔기, 2-40 아미노산 잔기, 2-30 아미노산 잔기, 3-50 아미노산 잔기, 3-40 아미노산 잔기, 3-30 아미노산 잔기, 2-28 아미노산 잔기, 2-26 아미노산 잔기, 2-24 아미노산 잔기, 2-22 아미노산 잔기, 2-20 아미노산 잔기, 2-18 아미노산 잔기, 2-16 아미노산 잔기, 2-14 아미노산 잔기, 2-12 아미노산 잔기, 2-10 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드일 수 있다. 구체적으로, 상기 L1 및 L2는 하기 표 6의 (G4S)o(이때, o는 1 내지 5의 정수)의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 국한되지 않는다. 또한, L1 및 L2는 서로 다른 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 이때, L1 및 L2는 적어도 하나의 Cys을 포함할 수 있다. 또한, L1 및 L2에 존재하는 Cys을 통해 이황화 결합이 이루어질 수 있다.
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000020
또한, 상기 L3 및 L4는 각각 1 내지 약 30개의 아미노산을 포함할 수 있다. 예시적인 구체예에 따르면, 상기 L3 및 L4는각각 약 5 내지 약 25개, 약 10 내지 약 20개, 약 15개의 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 예시적인 구체예에 따르면, L3 및 L4는 각각 2-30 아미노산 잔기, 2-25 아미노산 잔기, 2-20 아미노산 잔기, 2-15 아미노산 잔기, 3-30 아미노산 잔기, 2-28 아미노산 잔기, 2-26 아미노산 잔기, 2-24 아미노산 잔기, 2-22 아미노산 잔기, 2-20 아미노산 잔기, 2-18 아미노산 잔기, 2-16 아미노산 잔기, 2-14 아미노산 잔기, 2-12 아미노산 잔기, 2-10 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드일 수 있다. 구체적으로, 상기 L3 및 L4는 상기 표 6의 (G4S)o(이때, o는 1 내지 5의 정수)의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 국한되지 않는다. 또한, L3 및 L4는 서로 다른 아미노산 서열을 가질 수 있다.
융합단백질의 구체예
1개의 항원 결합 부위 및 2개의 Fc를 포함하는 융합단백질
i) 항원 결합 부위가 Fab인 융합단백질
도 2a에 나타낸 바와 같이, 융합단백질은 구조식 (I), (II), (III) 및 (IV)의 폴리펩티드를 포함하며, 이때, X는 중쇄 가변영역으로, CH1을 추가적으로 포함하고 있으며, Y는 경쇄 가변영역으로, 경쇄 불변영역을 포함하고 있다. 또한, CH1 구조 및 경쇄 가변영역 내에 있는 Cys에 의해 결합하여, Fab 구조를 형성한다. 이때, n은 0으로서, CH1은 힌지와 직접 결합되며, m은 1로서, L2는 펩티드 링커를 포함한다. 이때, A 및 C는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하며, B 및 D는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성한다. 또한, A의 CH3 영역에는 홀 구조를, C의 CH3 영역에는 놉 구조를 포함한다. 또한, B의 CH3 영역에는 홀 구조를, D의 CH3 영역에는 놉 구조를 포함한다. 또한, 항원 결합 부위, 항원, 힌지, 링커 및 Fc는 상술한 바와 같다.
도 2b에 나타낸 바와 같이, 융합단백질은 구조식 (I), (II), (III) 및 (IV)의 폴리펩티드를 포함하며, 이때, X는 중쇄 가변영역으로, CH1을 추가적으로 포함하고 있으며, Y는 경쇄 가변영역으로, 경쇄 불변영역을 포함하고 있다. 또한, CH1 구조 및 경쇄 가변영역 내에 있는 Cys에 의해 결합하여, Fab 구조를 형성한다. 이때, n은 0으로서, CH1은 힌지와 직접 결합되며, m은 1로서, L2는 펩티드 링커를 포함한다. 이때, A 및 C는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하며, B 및 D는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성한다. 또한, A의 CH3 영역에는 홀 구조를, C의 CH3 영역에는 놉 구조를 포함한다. 또한, B의 CH3 영역에는 홀 구조를, D의 CH3 영역에는 놉 구조를 포함한다. 또한, X는 105C의 변이를 포함하며, Y는 43C의 변이를 포함하며, 상기 Cys간에 이황화 결합을 형성한다. 또한, 항원 결합 부위, 항원, 힌지, 링커 및 Fc는 상술한 바와 같다.
도 2c에 나타낸 바와 같이, 융합단백질은 구조식 (I), (II), (III) 및 (IV)의 폴리펩티드를 포함하며, 이때, X는 중쇄 가변영역으로, CH1을 추가적으로 포함하고 있으며, Y는 경쇄 가변영역으로, 경쇄 불변영역을 포함하고 있다. 또한, CH1 구조 및 경쇄 가변영역 내에 있는 Cys에 의해 결합하여, Fab 구조를 형성한다. 이때, n은 0으로서, CH1은 힌지와 직접 결합되며, m은 1로서, L2는 펩티드 링커를 포함한다. 이때, A 및 C는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하며, B 및 D는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성한다. 또한, A의 CH3 영역에는 홀 구조를, C의 CH3 영역에는 놉 구조를 포함한다. 또한, B의 CH3 영역에는 홀 구조를, D의 CH3 영역에는 놉 구조를 포함한다. 또한, CH1은 122C의 변이를 포함하며, 경쇄 불변영역은 121C의 변이를 포함하며, 상기 Cys간에 이황화 결합을 형성한다. 또한, 항원 결합 부위, 항원, 힌지, 링커 및 Fc는 상술한 바와 같다.
도 2d에 나타낸 바와 같이, 융합단백질은 구조식 (I), (II), (III) 및 (IV)의 폴리펩티드를 포함하며, 이때, X는 중쇄 가변영역으로, CH1을 추가적으로 포함하고 있으며, Y는 경쇄 가변영역으로, 경쇄 불변영역을 포함하고 있다. 또한, CH1 구조 및 경쇄 가변영역 내에 있는 Cys에 의해 결합하여, Fab 구조를 형성한다. 이때, n은 0으로서, CH1은 힌지와 직접 결합되며, m은 1로서, L2는 펩티드 링커를 포함한다. 이때, A 및 C는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하며, B 및 D는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성한다. 또한, A의 CH3 영역에는 홀 구조를, C의 CH3 영역에는 놉 구조를 포함한다. 또한, B의 CH3 영역에는 홀 구조를, D의 CH3 영역에는 놉 구조를 포함한다. 또한, X는 44C의 변이를 포함하며, Y는 100C의 변이를 포함하며, 상기 Cys간에 이황화 결합을 형성한다. 또한, 항원 결합 부위, 항원, 힌지, 링커 및 Fc는 상술한 바와 같다.
도 6a 내지 도 6d에 나타낸 바와 같이, 융합단백질은 구조식 (I), (II), (III) 및 (IV)의 폴리펩티드를 포함하며, 이때, X는 중쇄 가변영역으로, CH1을 추가적으로 포함하고 있으며, Y는 경쇄 가변영역으로, 경쇄 불변영역을 포함하고 있다. 또한, CH1 구조 및 경쇄 가변영역 내에 있는 Cys에 의해 결합하여, Fab 구조를 형성한다. 이때, n은 0으로서, CH1은 힌지와 직접 결합된다. 이때, A 및 C는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하며, B 및 D는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성한다. 또한, A의 CH3 영역에는 홀 구조를, C의 CH3 영역에는 놉 구조를 포함한다. 또한, B의 CH3 영역에는 홀 구조를, D의 CH3 영역에는 놉 구조를 포함한다. 또한, X는 44C의 변이를 포함하며, Y는 100C의 변이를 포함하며, 상기 Cys간에 이황화 결합을 형성한다. 이때, m은 0으로 경쇄 가변영역이 힌지와 직접 결합할 수 있다(도 6d). 또한, m은 1로서, L2는 15머(도 6a), 10머(도 6b), 5머(도 6c) 펩티드 링커를 포함할 수 있다. 또한, 항원 결합 부위, 항원, 힌지, 링커 및 Fc는 상술한 바와 같다.
도 19a에 나타낸 바와 같이, 융합단백질은 구조식 (I), (II), (III) 및 (IV)의 폴리펩티드를 포함하며, 이때, X는 중쇄 가변영역으로, CH1을 추가적으로 포함하고 있으며, Y는 경쇄 가변영역으로, 경쇄 불변영역을 포함하고 있다. 또한, CH1 구조 및 경쇄 가변영역 내에 있는 Cys에 의해 결합하여, Fab 구조를 형성한다. 이때, n은 0으로서, CH1은 힌지와 직접 결합되며, m은 1로서, L2는 펩티드 링커를 포함한다. 이때, A 및 C는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하며, B 및 D는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성한다. 또한, A의 CH3 영역에는 홀 구조를, C의 CH3 영역에는 놉 구조를 포함한다. 또한, B의 CH3 영역에는 홀 구조를, D의 CH3 영역에는 놉 구조를 포함한다. 또한, X는 44C의 변이를 포함하며, Y는 100C의 변이를 포함하며, 상기 Cys간에 이황화 결합을 형성한다. 이때, A, B, C 및 D의 모든 CH2에는 239D, 332E 변이를 포함한다. 또한, 항원 결합 부위, 항원, 힌지, 링커 및 Fc는 상술한 바와 같다.
ii) 항원 결합 부위가 Fv인 융합단백질
도 10에 나타낸 바와 같이, 융합단백질은 구조식 (I), (II), (III) 및 (IV)의 폴리펩티드를 포함하며, X 및 Y는 내부에 존재하는 적어도 하나의 Cys에 의해 결합하여, Fv 구조를 형성한다. 이때, A 및 C는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하며, B 및 D는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성한다. 또한, A의 CH3 영역에는 홀 구조를, C의 CH3 영역에는 놉 구조를 포함한다. 또한, B의 CH3 영역에는 홀 구조를, D의 CH3 영역에는 놉 구조를 포함한다. 상기 X에는 44C, 105C, 122C, 44C/105C, 44C/122C, 105C/126C 또는 44C/105C/126C 변이를 포함할 수 있으며, Y는 100C, 43C, 121C, 100C/43C, 100C/121C, 43C/121C, 또는 100C/43C/121C 변이를 포함할 수 있다. 또한, L1 및 L2에 존재하는 Cys에 의해 이황화 결합을 형성할 수 있다. 또한, 항원 결합 부위, 항원, 힌지, 링커 및 Fc는 상술한 바와 같다.
2개의 항원 결합 부위 및 2개의 Fc를 포함하는 융합단백질
iii) 항원 결합 부위가 Fab인 융합단백질
도 25에 나타낸 바와 같이, 융합단백질은 구조식 (I'), (II'), (III) 및 (IV)의 폴리펩티드를 포함하며, 이때, X는 중쇄 가변영역으로, CH1을 추가적으로 포함하고 있으며, Y는 경쇄 가변영역으로, 경쇄 불변영역을 포함하고 있다. 또한, CH1 구조 및 경쇄 가변영역 내에 있는 Cys에 의해 결합하여, Fab 구조를 형성한다. 이때, n은 0으로서, CH1은 힌지와 직접 결합되며, m은 1로서, L2는 펩티드 링커를 포함한다. 이때, A 및 C는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하며, B 및 D는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성한다. 또한, A의 CH3 영역에는 홀 구조를, C의 CH3 영역에는 놉 구조를 포함한다. 또한, B의 CH3 영역에는 홀 구조를, D의 CH3 영역에는 놉 구조를 포함한다. 또한, 구조식 (I')의 VD1은 중쇄가변영역이며, 구조식 (II')의 VD2는 경쇄가변영역으로, VD1 및 VD2는 결합하여 Fv를 형성한다. 또한, p 및 q는 각각 1로서, L3 및 L4는 펩티드 링커이다. 비제한적인 (non-limiting) 한 구체예를 예로 들면, X 및 Y는 결합하여 퍼투주맙(Pertuzumab)의 가변영역을 형성하며, VD1 및 VD2는 결합하여 트라스트주맙(Trastuzumab)의 가변영역을 형성할 수 있다. 또한, 항원 결합 부위, 항원, 힌지, 링커 및 Fc는 상술한 바와 같다.
도 26에 나타낸 바와 같이, 구조식 (I') 및 (II')의 L3 및 L4의 펩티드 링커는 다양한 길이로 존재할 있다. 또한, X 및 Y가 결합하여 생성하는 제1 항원 결합 부위, 및 VD1 및 VD2가 결합하여 생성하는 제2 항원 결합 부위는 동일하거나 상이할 수 있다. 또한, L1 및 L2도 다양한 펩티드 링커를 포함할 수 있다.
융합단백질의 용도
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
이때, 상기 암은 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 피부암, 골암, 다발성골수종, 신경교종, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프모구성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
본 발명의 다른 측면은, 상기 구조식 (I), (II), (III) 및/또는 (IV)의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 구조식 (I'), (II'), (III) 및/또는 (IV) 의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 신호서열(Signal sequence) 또는 리더 서열(Leader sequence)을 코딩하는 핵산을 추가적으로 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용한 용어 "신호서열"은 목적 단백질의 분비를 지시하는 신호펩티드를 의미한다. 상기 신호펩티드는 숙주 세포에서 번역된 후에 절단된다. 구체적으로, 상기 신호서열은 ER(Endoplasmic reticulum) 막을 관통하는 단백질의 이동을 개시하는 아미노산 서열이다.
상기 신호서열은 당업계에 그 특징이 잘 알려져 있으며, 통상 16 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하나, 그보다 더 많거나 적은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 통상적인 신호 펩티드는 기본 N-말단 영역, 중심의 소수성 영역, 및 보다 극성인(polar) C-말단 영역의 세 영역으로 구성된다. 중심 소수성 영역은 미성숙 폴리펩티드가 이동하는 동안 막지질 이중층을 통하여 신호서열을 고정시키는 4 내지 12개의 소수성 잔기를 포함한다.
개시 이후에, 신호서열은 흔히 신호 펩티다아제(Signal peptidase)로 알려진 세포 효소에 의하여 ER의 루멘(Lumen) 내에서 절단된다. 이때, 상기 신호서열은 tPa(Tissue Plasminogen Activation), HSV gDs(Signal sequence of Herpes simplex virus glycoprotein D), 또는 성장 호르몬(Growth hormone)의 분비신호서열일 수 있다. 바람직하게, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵 세포에서 사용되는 분비 신호서열을 사용할 수 있다. 또한, 상기 신호서열은 야생형 신호서열을 사용하거나, 숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환하여 사용할 수 있다.
폴리뉴클레오티드가 적재된 벡터
본 발명의 다른 측면은, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 벡터는 구조식 (I), (II), (III) 및/또는 (IV)의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 벡터는 구조식 (I'), (II'), (III) 및/또는 (IV)의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
상기 벡터는 숙주 세포에 도입되어 숙주 세포 유전체 내로 재조합 및 삽입될 수 있다. 또는 상기 벡터는 에피좀으로서 자발적으로 복제될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 수단으로 이해된다. 상기 벡터는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 및 이의 유사체들을 포함한다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 벡터는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있고, 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물 바이러스 벡터(레트로바이러스(Retrovirus), 아데노바이러스(Adenovirus), 백시니아 바이러스(Vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(Baculovirus) 등)이 될 수 있다. 상기 벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.
본 명세서에서 사용된 용어, 목적 단백질의 "유전자 발현" 또는 "발현"은, DNA 서열의 전사, mRNA 전사체의 번역 및 융합단백질 생산물 또는 이의 단편의 분비를 의미하는 것으로 이해된다. 유용한 발현 벡터는 RcCMV(Invitrogen, Carlsbad) 또는 이의 변이체일 수 있다. 상기 발현 벡터는 포유류 세포에서 목적 유전자의 연속적인 전사를 촉진하기 위한 인간 CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, 및 전사 후 RNA의 안정상태 수준을 높이기 위한 우태 성장 인자(Bovine growth hormone) 폴리아데닐레이션 신호서열을 포함할 수 있다.
융합단백질을 발현하는 형질전환 세포
본 발명의 다른 측면은, 상기 융합단백질을 발현하는 형질전환 세포를 제공한다. 구체적으로 상기 형질전환 세포는 상기 벡터가 도입된 것일 수 있다.
상기 형질전환 세포의 숙주세포로서, 원핵세포, 진핵세포, 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 상기 원핵세포의 일 예로는 대장균을 사용할 수 있다. 또한, 진핵세포의 일 예로는 효모를 사용할 수 있다. 또한, 상기 포유동물 세포로 CHO 세포, F2N 세포, CSO 세포, BHK 세포, 바우스(Bowes) 흑색종 세포, HeLa 세포, 911 세포, AT1080 세포, A549 세포, HEK 293 세포 또는 HEK293T 세포 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 알려진 포유동물 숙주세포로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
또한, 숙주세포로 발현벡터를 도입하는 경우, CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(Dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(Electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 융합단백질의 치료제로서의 특성을 최적하거나 기타 다른 목적을 위해 호스트 세포가 갖고 있는 당화(Glycosylation) 관련 유전자를 당업자에게 알려져 있는 방법을 통해 조작하여 융합단백질의 당쇄 패턴(예를 들어, 시알산, 퓨코실화, 당화)을 조정할 수 있다.
융합단백질의 생산방법
본 발명의 다른 측면은, i) 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계; 및 ii) 생산된 융합단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 항원 결합 부위, 제1 Fc 도메인 또는 이의 변이체, 및 제2 Fc 도메인 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질의 생산방법을 제공한다.
상기 형질전환 세포를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(Fed batch 또는 Repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.
융합단백질을 함유하는 조성물 또는 제제
본 발명의 다른 측면은, 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물은 암의 예방 혹은 치료, 예를 들면 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 담낭암, 방광암, 신장암, 식도암, 피부암, 직장암, 골육종, 다발성골수종, 신경교종, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 갑상선암, 후두암, 고환암, 중피종, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프모구성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 암의 예방 혹은 치료를 위해 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 종양 치료용 또는 예방용 약학 조성물에서 그 유효성분은 종양 치료 활성을 나타내거나, 특히, 암에 치료 효과를 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량% 내지 20.0 중량% 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 질환의 상태 개선 또는 치료(treatment) 효과, 특히 암의 상태 개선 또는 치료 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "치료"는 치료학적 처리 및 예방적 처리를 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있다. 이때, 예방은 개체의 병리학적 상태 또는 질환을 완화시키거나 감소시키는 의미로 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 용어 "치료"는 인간을 포함한 포유류에서 질환을 치료하기 위한 적용이나 어떠한 형태의 투약을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 질환의 진행을 억제하거나 늦추는 것을 포함하며; 손상되거나, 결손된 기능을 회복시키거나, 수리하여, 질환을 부분적이거나 완전하게 완화시키거나; 또는 비효율적인 프로세스를 자극하거나; 심각한 질환을 완화하는 의미를 포함한다.
생체이용률과 같은 약동학적 파라미터(Pharmacokinetic parameters) 및 클리어런스율(clearance rate)과 같은 기본적인 파라미터(underlying parameters)도 효능에 영향을 줄 수 있다. 따라서, "향상된 효능" (예를 들어, 효능의 개선)은 향상된 약동학적 파라미터 및 향상된 효능에 기인할 수 있으며, 시험 동물 또는 인간 대상체에서 클리어런스율 및 종양 치료 또는 개선과 같은 파라미터를 비교하여 측정될 수 있다.
여기서 "치료학적으로 유효한 양" 또는 "약학적으로 유효한 양"이란 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 화합물 또는 조성물의 양으로서, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 상기 유효량의 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일 구체예에서 치료학적으로 유효한 양은 암을 치료하는데 효과적인 약물의 양을 의미한다.
이때, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 환자에게 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약물학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제) 또한 약학 조성물에 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.
상기 약학 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주된다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.01 ㎍/㎏ 내지 10 g/㎏ 범위, 또는 0.01 ㎎/㎏ 내지 1 g/㎏ 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본원 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
상기 약학 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 개, 고양이, 사람 등을 포함한 포유동물이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다. 본원의 약학 조성물은 유효성분 이외에, 종양 치료 효과를 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
융합단백질을 이용한 치료방법
본 발명의 다른 측면은, 항원 결합 부위, 제1 Fc 도메인 또는 이의 변이체, 및 제2 Fc 도메인 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 암을 치료하기 위한, 항원 결합 부위, 제1 Fc 도메인 또는 이의 변이체, 및 제2 Fc 도메인 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질의 용도를 제공한다.
이때, 상기 개체는 암을 앓고 있는 개체일 수 있다. 또한 상기 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.
상기 융합단백질의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 융합단백질은 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
이하, 본원 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본원 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본원 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 2개의 Fc domain을 가진 신규 항체 구조체의 설계 및 제조 및 분석
자연상에 존재하는 인간 면역글로불린 G(Immunoglobulin G; IgG)는 2개의 Fragment antigen-binding(Fab) region과 1개의 Fragment crystallizable(Fc) region로 구성된다(도 1a). 인간 IgG는 표적항원에 1가(Monovalent) 또는 2가(Bivalent) 결합을 하고, 경우에 따라 표적 항원 당 0.5~1개의 Fc region을 가지게 한다(도 1c, 도 1d, 도 1e).
본 발명은 항체와 유사한 분자량을 가지며, 균질한(Homogeneous) 조성을 가짐과 동시에 항원 당 존재하는 Fc region의 양을 증가시켜 effector function을 향상시키는데 그 목적이 있다. 그래서 자연상 인간 IgG 항체의 분자량과 유사(약 150 kDa)하면서 2개의 Fc region를 가지는 신규 항체 구조체를 고안하였으며(도 1b), 이러한 형태는 기존 항체들 대비 암세포 표면 항원에 결합하여, 세포표면에 최대 4배의 Fc region을 가지게 한다(도 1b, 도 1f).
앞서 언급한 신규 항체 구조체를 구현하기 위해 Trastuzumab을 주형으로 사용하였다(도 2a). Trastuzumab Fab 영역의 VH-CH1 부위와 VL-CL 부위의 pairing을 향상시키고자 특정 아미노산을 Cysteine으로 치환하여, 인위적인 이황화 결합을 도입하였다(도 2b, 도 2c, 도 2d).
중쇄 105번 글루타민(Glutamine; Q)과 경쇄 43번 알라닌(Alanine, A)을 시스테인(Cysteine)으로 치환한 Fab, 중쇄 122번 페닐알라닌(Phenylalanine; F)과 경쇄 121번 세린(Serine; S)을 Cysteine으로 치환한 Fab, 중쇄 44번 글리신(Glycine; G)과 경쇄 100번 글루타민(Glutamine; Q)을 Cysteine으로 치환한 Fab을 디자인하였고, 각각을 Mutant1, Mutant2, Mutant3 이라 한다(도 2b, 도 2c, 도 2d, 도 3a, 도 3b). 이를 바탕으로 Trastuzumab을 골격으로 한 Fab-(Fc)2 구조체를 Wild type(WT)라 하고(도 2a), Mutant1~3에 해당하는 Fab을 가진 Fab-(Fc)2 구조체를 M1, M2, M3이라 칭한다(도 2b, 도 2c, 도 2d, 도 3a, 도 3b).
항체를 구성하는 아미노산의 위치에 대한 표기는 Kabat numbering 규칙을 따른다. 원하지 않는 Fc 관련 부산물을 최소화하기 위해, 인간 면역글로불린 G1(Immunoglobulin G1; IgG1)의 Fc 도메인(서열번호 3)에 Knob-into-hole 돌연변이 기술(Merchant et al, Nat. Biotechnol. 1998)을 적용하여, Knob 돌연변이 보유 Fc(S354C, T366W; 서열번호 4)와 Hole 돌연변이 보유 Fc(Y349C, T366S, L368A, Y407V; 서열번호 5)의 폴리펩티드를 디자인하였다. CL domain과 hinge region 사이에 추가적인 유연성(Flexibility)을 부여하기 위해 (G4S)3 linker를 도입하였다(서열번호 6; 도 2). WT의 발현은 Fc-Hole(서열번호 7), TraH-WT-Knob(서열번호 8), TraL-WT-Knob(서열번호 9)에 해당하는 폴리펩티드를 발현할 수 벡터를 엑스피초-에스(EXPICHO-STM; Gibco, A29127) 세포주에 동시형질전환(Co-transfection)하여 수행되었다.
M1은 Fc-Hole(서열번호 7), TraH-Q105C-Knob(서열번호 10), TraL-A43C-Knob(서열번호 11)로 구성되며, M2는 Fc-Hole(서열번호 7), TraH-F122C-Knob(서열번호 12), TraL-S121C-Knob(서열번호 13)으로 구성되며, M3는 Fc-Hole(서열번호 7), TraH-G44C-Knob(서열번호 14), TraL-Q100C-Knob(서열번호 15)로 구성되며, 모두 엑스피초-에스(EXPICHO-STM; Gibco, A29127) 세포주에서 발현되었다. CAPTURESELECTTM CH1-XL Pre-packed Column(Thermo Scientific, 494346205) 정제 컬럼이 장착된 AKTA pure 25(Cytiva) 또는 AKTA avant 150(Cytiva) 단백질 분리정제 시스템을 이용하여 정제된 정제 산물은 추가로 KappaSelect 수지(Cytiva, 17545801)를 이용한 친화도 크로마토그래피를 수행하였으며, Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit(Merck millipore)를 이용하여, 샘플은 농축되었다. 최종 정제완료 산물은 NanoDrop One 미량 분광광도계(Thermo Fisher Scientific)를 이용해 샘플의 280 nm에서의 흡광도(Absorbance)를 측정하고, 샘플 고유의 흡광계수(extinction coefficient)와 분자량을 바탕으로 농도가 정량 되었다.
정제 산물은 소듐도데실설페이트 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(SDS-PAGE)과 크기배제크로마토그래피(Size exclusion chromatography; SEC)를 이용하여 분석이 수행되었다(도 4 및 도 5a 내지 도 5d). SDS-PAGE 분석에는 바이오-래드(Bio-rad)의 전기영동용 젤 및 시스템을 사용하였고, 샘플들은 비환원(Non-reducing) 조건에서 분석되었으며, 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색을 통해 각 사이즈의 밴드를 확인하였다(도 4). 약 150 kDa에서 WT, M1, M2, M3가 확인이 되며, Fab interface에 추가적인 이황화 결합을 도입하지 않은 WT의 경우, 약 75 kDa에서 monomer가 확인이 된다(도 4). M1, M2의 경우 마찬가지로 75 kDa에서 미량의 monomer가 확인이 되고, M3는 대부분이 이황화 결합의 형성으로 인해 pairing이 잘 되어, monomer가 거의 확인되지 않는다(도 4).
크기배제크로마토그래피 분석에는 Agilent Bio SEC-3 HPLC 컬럼(Agilent, 5190-2511)이 장착된 Alliance ® HPLC - e2695 Separations Module(Waters, 2695)이 사용되었다. 분석 결과 8.6~8.8분의 정체시간에 main product가 확인이 되었다(도 5a, 도 5b, 도 5c, 도 5d).
M3 구조체를 바탕으로 CL domain과 hinge region을 연결하는 linker 길이에 따른 구조체의 특성을 분석하였다. M3은 (G4S)3로 구성된 15-mer polypeptide linker를 가지고, V1(서열번호 7, 14, 16), V2(서열번호 7, 14, 17)는 각각 (G4S)2, G4S polypeptide linker를 가지며, V3(서열번호 7, 14, 18)은 linker 없이 CL domain과 hinge region을 직접 연결하였다(도 6). SDS-PAGE를 이용한 분석 결과 약 150 kDa에서 main product가 확인되며, byproduct는 확인되지 않았다(도 7). CL domain과 hinge region 사이 Linker의 유무는 byproduct의 형성과 직접적인 상관관계가 없는 것으로 확인되었다.
이 결과를 바탕으로 Fab의 VH 44, VL 100 위치를 Cysteine으로 치환한 경우 Fab-(Fc)2 구조체가 안정적으로 형성됨을 확인하였다.
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하기 표 9는 H01 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL) 폴리펩티드 서열을 나타낸 것이다. 하기 표 10은 H01 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL) 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다.
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하기 표 11은 H01 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 나타낸 것이다.
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실시예 2. Pertuzumab을 주형으로 2개의 Fc domain을 가진 신규 항체 구조체 제조
M3은 VH G44C, VL Q100C의 돌연변이를 가진(Trastuzumab Fab)-(Fc)2 구조체로 이하 H01로 칭한다. 유사하게 Pertuzumab의 VH, VL 영역(서열번호 27, 28)을 바탕으로 VH G44C, VL Q100C의 돌연변이를 가진 (Pertuzumab Fab)-(Fc)2 구조체는 이하 P01로 칭한다. P01은 Fc-Hole(서열번호 7), PerH-G44C-Knob(서열번호 29), PerL-Q100C-Knob(서열번호 30)에 해당하는 서열로 구성된 발현벡터를 엑스피초-에스(EXPICHO-STM, Gibco, A29127)에 동시형질전환(Co-transfection)하고, 실시예 1에서 언급한 방식으로 정제 및 분석을 수행하였다.
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하기 표 14는 P01 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL) 폴리펩티드 서열을 나타낸 것이다. 하기 표 15는 P01 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL) 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다.
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하기 표 16은 P01 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 나타낸 것이다.
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000039
실시예 3. Papain digestion을 통한 H01, P01 부산물 분석
Papain은 힌지 영역의 특정 서열을 인식하여, 항체 digestion을 유도한다. Fab-(Fc)2 구조체의 경우 papain digestion을 수행하면 약 49.3 kDa의 Fab 부분과 약 50.4 kDa의 2개의 Fc로 cleavage 된다(도 8a). 하지만 힌지 영역의 비정상적인 이황화 결합의 형성으로 원하지 않는 inter-chain disulfide bond byproduct들이 형성될 수 있다(도 8b). 이 경우 약 49.3 kDa의 Fab fragment와 약 100.7 kDa의 비정상적인 (Fc)2가 형성이 된다(도 8b).
이를 검증하기 위해 H01과 P01의 papain digestion을 수행하였다. Papain(Sigma, P3125)은 digestion buffer(20 mM EDTA + 10 mM Cys-HCl in PBS pH 7.4)에 0.1 mg/mL로 희석하여 사용하였다. 200 μg H01, P01은 37℃에서 2시간 동안 digestion하였으며, 이후 SDS-PAGE를 수행하였다. 비환원조건에서 수행된 SDS-PAGE 결과 약 100 kDa에서 비정상적인 (Fc)2는 확인되지 않았다(도 8c, 8d).
실시예 4. H01wt 물성 분석
H01의 Fc domain은 Knob-into-hole 돌연변이에 의해 4개의 Fc 단량체가 어셈블리되어 2개의 Fc 이량체를 가지는 도 6a와 같은 구조를 형성한다. Knob-into-hole 돌연변이가 구조형성에 끼치는 영향을 분석하기 위해 2개의 Fc Hole 단량체 폴리펩티드(서열번호 7)를 야생형(Wild type) IgG1 Fc 단량체에 해당하는 폴리펩티드(서열번호 39)로 치환하였다(표 17). H01을 구성하는 2종의 Knob 폴리펩티드(서열번호 14, 15) 또한 야생형(Wild type) IgG1 Fc 단량체에 해당하는 폴리펩티드(서열번호 40, 41)로 Fc 부위를 치환하였다(표 17). 2개의 wtFc 폴리펩티드(서열번호 39)와 1개의 TraH-G44C-wtFc 폴리펩티드(서열번호 40)와 1개의 TraL-Q100C-wtFc 폴리펩티드(서열번호 41)로 구성된 신규 항체 구조체를 H01wt라 한다(도 9).
wtFc(서열번호 39)와 TraH-G44C-wtFc(서열번호 40) TraL-Q100C-wtFc(서열번호 41)에 해당하는 서열로 구성된 발현벡터를 엑스피초-에스(EXPICHO-STM; Gibco, A29127)에 동시형질전환(Co-transfection)하고, 실시예 1에서 언급한 방식으로 정제 및 분석을 수행하였다. SDS-PAGE 분석 결과 비환원조건(NR)에서 H01wt는 약 150 kDa 근처에 소량 존재하며, 대부분이 비정상적인 구조체로 발현되었다(도 9). Fc 부위에 Knob-into-hole 돌연변이가 존재하는 H01의 경우 각각의 폴리펩티드가 원활하게 어셈블리되어 약 150 kDa에서 존재함을 확인하였다(도 9).
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000040
하기 표 18은 HO1wt의 wtFc, TraH-G44C-wtFc, 및 TraL-Q100C-wtFc를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다.
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실시예 5. H01Fv 변이체 특성 분석
항체 Fv fragment에 2개의 Fc domain을 병렬로 융합시킨 Fv-(Fc)2의 모식도는 도 10a - 도10g와 같다. Fv는 VH domain과 VL domain으로 구성되며, domain interface의 상호작용을 향상시키기 위해 특정 위치를 Cysteine으로 치환하여 인위적인 disulfide bond를 생성하였다(도 10a 내지 도 10h, 표 19).
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000043
표 20은 H01Fv1 내지 H01Fv7을 구성하는 폴리펩티드 서열을 나타내었다.
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표 21은 H01Fv1 내지 H01Fv7을 구성하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
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Figure PCTKR2022015981-appb-img-000051
Fc-Hole-RF(서열번호 789)와 H01Fv1-HC(서열번호 790), H01Fv1-LC(서열번호 791)에 해당하는 서열로 구성된 발현벡터를 엑스피초-에스(EXPICHO-STM; Gibco, A29127)에 동시형질전환(Co-transfection)할 경우 H01Fv1이 형성된다(도 10, 표 20, 표 21). 이 후 MABSELECTTM PrismA(Cytiva, 17549853)를 이용한 affinity chromatography를 통해 정제하였다. Fc-Hole(서열번호 7) 폴리펩티드는 Fc-Hole/Fc-Hole dimer를 형성할 수 있으며, 이를 막기위해 Fc-Hole(서열번호 7) 폴리펩티드 서열에 H435R, Y436F 돌연변이화를 유도하여, Fc-Hole-RF(서열번호 789) 폴리펩티드를 제조하였다(도 10, 표 20, 표 21). 이로 인해 Protein A resin에 결합하지 못하도록 하여, mispairing 된 Fc-Hole/Fc-Hole dimer를 제거한다(도 10, 11). SDS-PAGE 분석 결과 비환원조건(NR)에서 약 130 kDa 근처에 main product를 확인하였고(도 11), SEC을 통해 monomer purity를 확인하였다(도 12). H01Fv3은 unpairing된 형태로 약 65 kDa 형태로 대부분 존재하며, 완전히 어셈블리된 monomer purity는 14.66%로 확인되었다(도 11, 도 12c). H01Fv1, H01Fv2, H01Fv4, H01Fv5, H01Fv6, H01Fv7은 각각 71.24%, 61.25%, 68.55%, 73.05%, 67.73%, 79.33%의 monomer purity를 가짐을 확인하였다(도 12). H01Fv1, H01Fv2, H01Fv4, H01Fv5, H01Fv6, H01Fv7의 결합특성 분석은 Bio-Layer Interferometry(BLI) 분석 장비인 Octet Red96e(Sartorius)를 사용하였다(도 13). 인간 Her2 재조합단백질(R&D systems, 1129-ER)은 Anti-Penta-HIS(HIS1K) 바이오센서(Sartorius, 18-5120)에 로딩 후, H01Fv1, H01Fv2, H01Fv4, H01Fv5, H01Fv6, H01Fv7의 결합상수를 산출하였다(도 13, 표 22).
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실시예 6. 열 안정성 분석
열 안정성(Thermal stability) 분석은 PROTEIN THERMAL SHIFTTM Dye Kit(Applied biosystems, 4461146)를 이용하여 제조사 매뉴얼에 따라 수행되었다. 간략하게, 키트에 포함된 5 μL 반응 버퍼와 2.5 μL Dye는 5 μg Trastuzumab 또는 Pertuzumab 또는 H01 또는 P01과 혼합되었으며, PBS를 이용해 최종부피가 20 μL 되도록 하였다.
CFX96 optical reaction module(Bio-Rad, 1845096)이 장착된 C1000 thermal cycler(Bio-Rad, 1841000)에서 20℃, 30초 인큐베이션 하고, 20℃에서 95℃까지 1℃/분으로 온도를 증가시키며, 플레이트의 형광 강도(Fluorescence Intensity)를 측정하고, 95℃, 30초 인큐베이션 후 반응을 정지시켰다. 반응 후 Relative fluorescence units(RFU) 값의 중간값을 취해, Melting temperature(Tm)의 분석을 수행하였다. Tm1 값은 Trastuzumab, Pertuzumab, H01, P01 각각 68, 68, 66, 66℃이며, Tm2 값은 81, 79, 83, 83℃으로 확인되었으며, 상용화된 항체와 유사한 수준의 Tm 값을 가짐을 확인하였다(도 14, 표 23).
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000053
실시예 7. H01, P01의 경쟁적 결합 확인
H01과 P01이 서로 다른 에피토프(epitope)에 결합하여, 경쟁적 결합이 되는지 확인하기 위해 Bio-Layer Interferometry(BLI) 분석 장비인 Octet Red96e(Sartorius)를 사용하였다.
인간 Her2 재조합단백질(R&D systems, 1129-ER)은 Anti-Penta-HIS(HIS1K) 바이오센서(Sartorius, 18-5120)에 로딩되었다. HER2 항원이 로딩된 각각의 바이오센서에 100 nM Human IgG1(Bio X cell, BE0297) 또는 100 nM H01 또는 100 nM Trastuzumab을 먼저 결합시키고, 연이어 100 nM Human IgG1 또는 100 nM P01 또는 100 nM Pertuzumab을 결합시켜 경쟁적으로 결합하는지 확인하였다(도 15). 0초 대비 Her2 재조합단백질 로딩 완료 후 평형상태에서 측정된 binding shift 값은 각각 0.620, 0.625, 0.672 nm였다(도 15, 표 24).
첫번째 분석물질과 두번째 분석물질들을 결합시간과 해리시간을 각각 900초로 연이어 결합을 시켰을 때, Human IgG1 항체를 연이어 결합시킬 경우 HER2에 결합하지 않음을 확인하였다(도 15, 표 24). H01과 P01의 연속적 결합 또는 Trastuzumab과 Pertuzumab의 연속적인 결합이 확인되었으며, 이는 서로 다른 Epitope에 결합한다는 것을 의미한다(도 15, 표 24). HER2가 로딩된 센서에 결합된 H01 + P01의 binding shift 값과 Trastuzumab + Pertuzumab의 binding shift 값은 각각 1.477 nm(4140 s의 y축 값 - 1260 s의 y축 값), 0.923 nm(4140 s의 y축 값 - 1260 s의 y축 값)으로 측정되었다. 바이오센서의 표면에 많은 단백질이 결합하면, Binding shift 값이 증가하므로, 동량의 HER2에 H01과 P01을 결합시킨 경우가 Trastuzumab과 Pertuzumab을 결합시킨 경우보다 더 많은 양의 항체가 결합함을 확인하였다(도 15, 표 24).
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실시예 8. 항체 Fc domain 정량
H01과 P01이 병용처리에 의해 암세포 표면에 존재하는 HER2에 결합할 경우에는 4개의 HER2에 총 16개의 Fc domain이 결합하게 된다(도 16a). Trastuzumab과 Pertuzumab이 병용처리에 의해 암세포 표면에 존재하는 HER2에 결합할 경우에는 1가(monovalent) 모드로 결합할 경우 4개의 HER2에 8개의 Fc domain이 결합하게 되고, 2가(bivalent) 모드로 결합할 경우 그 이하의 Fc domain이 결합하게 된다(도 16b). H01과 P01의 병용처리는 Trastuzumab과 Pertuzumab의 병용처리보다 실제 HER2 양성 암세포 표면에 더 많은 Fc를 존재하게 하고, 이는 더 강한 effector function을 유도하게 할 것이다.
HER2 발현 세포 표면에 결합하는 항체 Fc domain 정량을 위해 사용할 NCI-N87, BT474, SK-OV-3, SNU1, SNU5 암세포주들은 RPMI-1640 + 10% FBS 배지 내에서 배양되었다. 96-웰 플레이트에 암세포주와 50 nM Human IgG1(Bio X cell, BE0297), 50 nM Trastuzumab(TRA), 50 nM Trastuzumab + 50 nM Pertuzumab(TRA + PER), 50 nM H01, 50 nM H01 + 50 nM P01 항체를 4℃에서 30분 동안 결합시켰다. 이후 Alexa 488 형광이 접합된 항 인간 IgG Fcγ Fab 항체(Jackson ImmunoResearch, 109-547-008)를 처리하고 유세포분석기(BD biosciences, FACSverse)를 이용하여 세포에 결합된 항체 Fc를 정량하였다(도 17a - 도 17e, 표 25). 분석된 5종의 암세포주에서 50 nM Trastuzumab + 50 nM Pertuzumab(TRA + PER) 병용 그룹보다 50 nM H01 단독 그룹의 형광 값이 모두 우수함을 확인하였다(도 17a - 도 17e, 표 25). 50 nM H01과 50 nM P01을 병용처리 할 경우 50 nM H01 단독처리보다 암세포 표면에 결합한 Fc 개수의 추가적인 향상이 NCI-N87, BT474, SK-OV-3, SNU1, SNU5 암세포주에서 확인되었다(도 17a - 도17e, 표 25).
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세포 표면에 결합하는 항체 포화농도를 알기 위하여 각 테스트 항체를 최종 농도 20, 50, 100 nM로 결합시켰고 이후 샘플링 과정은 위 실험조건과 동일하게 진행되었다(도 18a - 도 18e). NCI-N87, BT474, SK-OV-3, SNU1, SNU5 암세포주에서 항체의 포화농도는 50 nM임을 확인하였다(도 18a - 도 18e). 5종의 세포주에서 50 nM의 H01 단독처리가 50 nM Trastuzumab + 50 nM Pertuzumab 병용처리보다 더 많은 Fc가 암세포 표면에 존재함이 확인되었다(도 18a - 도 18e).
실시예 9. HER2에 대한 항체 결합능 분석
항체 Fc domain의 S239D, I332E 돌연변이는 Fcγ receptors에 대한 항체의 친화도를 향상시키고, 이는 effector function의 강화를 유도한다(Greg A. Lazar et al., PNAS, 2006). H01과 P01 Fc domain의 S239D, I332E 돌연변이 도입을 통해 H01DE4, P01DE4의 구조체를 디자인하였다(도 19a, 도 19b). H01DE4는 Fc-Hole-S239D-I332E(표 26, 서열번호 42), TraH-G44C-Knob-S239D-I332E(표 26, 서열번호 43), TraL-Q100C-Knob-S239D-I332E(표 26, 서열번호 44)에 해당하는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 벡터를 엑스피초-에스(EXPICHO-STM; Gibco, A29127)에 동시형질전환(Co-transfection)하여 제조하였다. P01DE4는 Fc-Hole-S239D-I332E(표 26, 표 27, 및 서열번호 42), PerH-G44C-Knob-S239D-I332E(표 26, 표 27, 및 서열번호 45), PerL-Q100C-Knob-S239D-I332E(표 26, 표 27, 및 서열번호 46)에 해당하는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 벡터를 엑스피초-에스(EXPICHO-STM; Gibco, A29127)에 동시형질전환(Co-transfection)하여 제조하였다.
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결합특성분석은 Bio-Layer Interferometry(BLI) 분석 장비인 Octet Red96e(Sartorius)를 이용하여 25℃ 조건에서 분석되었다. 분석용 버퍼는 10X Kinetics Buffer(Sartorius, 18-1042)를 PBS pH 7.4(Gibco, 10010)에 희석하여 사용하였으며, 분석플레이트의 회전속도는 1,000 rpm으로 진행하였다. 인간 Her2 재조합단백질(R&D systems, 1129-ER)은 Anti-Penta-HIS(HIS1K) 바이오센서(Sartorius, 18-5120)에 로딩되었다. 1 - 32 nM H01, H01DE4, P01, P01DE4는 결합속도상수(Ka)를 측정하기 위해 결합시간은 300초로 진행되었으며, 연이어 Kinetics Buffer에서 해리시간을 600초로 진행하여 해리속도상수(Kd)를 결정하였다. Ka 와 Kd 값은 Octet 분석용 소프트웨어(Sartorius)에서 1:1 결합모델을 통해 측정되었고, 이를 바탕으로 평형해리상수(KD) 값이 결정되었다(도 20a 내지 도 20d, 표 28).
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실시예 10. Fcγ receptors에 대한 항체 결합능 분석
Fc gamma receptor 수용체에 대한 각 항체의 결합상수 측정은 Octet Red96e(Sartorius)를 이용하여 25℃ 조건에서 분석되었다. Anti-Penta-HIS(HIS1K) 바이오센서(Sartorius, 18-5120)가 사용되었으며, His tag을 포함하고 있는 인간 FcγRI(R&D systems, 1257-FC) 또는 인간 FcγIIA(R&D systems, 1330-CD) 또는 인간 FcγRIIIA(176V isoform, R&D systems, 4325-FC)를 바이오센서에 로딩하였다.
항원이 로딩된 바이오센서에 H01, P01, H01DE4, P01DE4, Human IgG1(Bio X cell, BE0297), Trastuzumab, Pertuzumab, Margetuximab의 결합속도상수(Ka)와 해리속도상수(Kd)의 측정이 수행되었다. Ka와 Kd 값은 Octet 분석용 소프트웨어(Sartorius)에서 1:1 결합모델을 통해 산출되었고, 이를 바탕으로 평형해리상수(KD) 값이 결정되었다(도 21a 내지 도 21h, 도 22a 내지 도 22h, 도 23a 내지 도 23h, 표 29).
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000061
실시예 11. Rat에서 Pharmacokinetic(PK) 분석
H01, P01 Trastuzumab, Pertuzumab은 정맥(i.v.) 투여 경로로 7주령 수컷 Sprague-Dawley Rat(오리엔트바이오)에 10 mg/kg 투여되었다. 투여 후 5분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 1일, 2일, 3일, 7일, 10일, 14일, 21일, 28일, 35일, 42일에 혈액 샘플들을 수집하였다. 이후 확보된 혈액은 혈청만 분리하여 분석을 진행하였다. 혈청 중의 항체 농도는 ELISA에 의해 측정되었다.
간단하게 96-웰 ELISA용 플레이트(Corning, 3590)에 인간 HER2 재조합단백질(R&D systems, 1129-ER)을 4℃ 밤샘보관을 통해 코팅이 진행되었으며, 각각의 시간에 확보된 혈청들은 적절하게 희석되어, 코팅된 인간 HER2에 결합반응을 유도하였다. H01, P01 Trastuzumab, Pertuzumab의 감지에는 퍼옥시다아제(Peroxidase)가 결합된 항-인간 Fab 염소항체(Invitrogen, 31482)가 사용되었다.
H01, P01 Trastuzumab, Pertuzumab의 표준정량시료를 제작하여 정량을 사용하였으며, 각 농도를 함유하는 나이브(naive) 랫드 혈청으로부터 생성된 표준 곡선을 통해, 각 시간 별 분석물질의 농도를 정량하였다. 정맥투여에서 H01, P01, Trastuzumab, Pertuzumab의 반감기는 각각 약 11.8일, 14.2일, 7.3일, 11.6일로 확인되었다(도 24a 및 도 24b, 표 30). Engineering된 신규 구조체인 H01과 P01은 인간화 항체인 Trastuzumab과 Pertuzumab과 유사한 수준의 PK 파라미터를 가짐을 확인하였다.
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실시예 12. HER2의 2개의 epitope을 인지하는 신규 항체 구조체의 설계 및 제조 및 분석
HER2 단백질의 2개의 epitope를 인지하는 항체를 구성하기 위해 Trastuzumab과 Pertuzumab의 V domain을 Linker로 연결한 biparatopic 항체 구조체 HP501을 디자인하였다(도 25). 서로 다른 V domain간의 간섭으로 인한 결합능의 저하를 최소화하기 위해 V domain을 연결하는 Linker의 길이에 변화를 주고, 동시에 단백질 물성 향상을 위해 V domain에 이황화 결합을 형성할 수 있는 Cys 치환 돌연변이를 도입한 16종의 구조체를 디자인하였다(도 26, 표 31). Kabat numbering 기준에 따라 중쇄의 경우 44번 위치와 경쇄의 경우 100번 위치에만 돌연변이를 도입하였다(표 31). 표 31에서, 6 아미노산 잔기를 갖는 VH linker는 VH-S-Linker, 13 아미노산 잔기를 갖는 VH linker는 VH-L-Linker, 6 아미노산 잔기를 갖는 VL linker는 VL-S-Linker, 13 아미노산 잔기를 갖는 VL linker는 VL-L-Linker로 명명하였다.
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HP501은 Fc-Hole(서열번호 7), TH-S-PH-Knob(서열번호 51), TL-S-PL-Knob (서열번호 59)에 해당하는 서열로 구성된 발현벡터를 엑스피초-에스(EXPICHO-STM; Gibco, A29127)에 동시형질전환(Co-transfection)하고(표 31, 32, 33, 34), 실시예 1에서 언급한 방식으로 정제 및 분석을 수행하였다. HP502 - HP516도 앞서 언급한 동일한 방식으로 발현, 정제 분석이 수행되었으며, 표 32 및 표 34에 발현벡터의 구성을 상세히 표기하였다.
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크기 배제 크로마토그래피를 통한 순도 분석은 실시예 1에 언급한 방식으로 수행되었다(도 27, 표 35). 분석 결과 첫번쨰 V domain 은 야생형(Wild type)이고, 두번째 V domain이 Cys 치환 돌연변이형(VH 44C, VL 100C)인 HP503, HP507, HP511, HP515의 순도가 우수함을 확인하였다(도 27, 표 35).
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HP501, HP502, HP503, HP504, HP505, HP506, HP507, HP508, HP509, HP510, HP511, HP512, HP513, HP514, HP515, HP516의 HER2 단백질 D2 영역과 D4 영역의 결합상수는 Octet Red96e(Sartorius) 분석장비를 이용해 측정되었다. D2영역에 대한 16종 항체의 결합상수 분석을 위해 인간 Her2 재조합단백질(R&D systems, 1129-ER)은 Anti-Penta-HIS(HIS1K) 바이오센서(Sartorius, 18-5120)에 로딩되었고, 연이어 D4 영역을 표적하는 100 nM Trastuzumab 이용해 blocking을 유도하였다. 이 후 16종의 항체는 100 nM 농도로 결합반응(300 초) 및 해리반응(600 초)이 유도되었으며 이를 바탕으로 D2 영역에 대한 친화도가 산출되었다(표 36). D4영역에 대한 16종 항체의 결합상수 분석을 위해 인간 Her2 재조합단백질(R&D systems, 1129-ER)은 Anti-Penta-HIS(HIS1K) 바이오센서(Sartorius, 18-5120)에 로딩되었고, 연이어 D2 영역을 표적하는 100 nM Pertuzumab 이용해 blocking을 유도하였다. 이 후 16종의 항체는 100 nM 농도로 결합반응(300 초) 및 해리반응(600 초)이 유도되었으며 이를 바탕으로 D4 영역에 대한 친화도가 산출되었다(표 36). HP507, HP511, HP515의 D2에 대한 결합상수는 각각 2.285, 3.267, 2.012 nM로 다른 클론 대비 D2 영역에 대해 우수한 결합능을 보였다(표 36). HP503은 D2 영역에 8.098 nM의 결합상수를 가지며 HP507, HP511, HP515 대비 D2 영역에 대해 상대적으로 낮은 결합능을 보이나, D4 영역 대한 결합상수 측정에서는 HP503, HP507, HP511, HP515가 각각 0.181, 0.228, 0.162, 0.227 nM로 강한 결합능을 보임을 확인하였다(표 36).
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HP503, HP507, HP511, HP515의 HER2 세포외영역(ECD)에 대한 결합상수는 Octet Red96e(Sartorius) 분석장비를 이용해 측정되었다. 인간 Her2 재조합단백질(R&D systems, 1129-ER)은 Anti-Penta-HIS(HIS1K) 바이오센서(Sartorius, 18-5120)에 로딩되었다. 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 nM의 HP503 또는 HP507 또는 HP511 또는 HP515는 HER2 단백질이 로딩된 센서에서 600초의 결합반응이 유도되고 1800초의 해리반응이 유도되었으며, 이를 바탕으로 결합상수가 산출되었다(도 28a 내지 도 28d, 표 37). 다음의 분석 조건에서 HP507, HP511, HP515는 장비의 측정 한계를 넘어서는 해리상수(<1.0E-07 1/s)를 가짐을 확인하였다(도 28a 내지 도 28d, 표 37).
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Fc gamma receptor 수용체에 대한 HP503, HP507, HP511, HP515의 결합상수 측정은 Octet Red96e(Sartorius)를 이용하여 실시예 10에서 언급한 방법과 동일하게 분석되었다(도 29a 내지 도 29d, 표 38). 분석 결과 인간 IgG1, Trastuzumab, Pertuzumab, Margetuximab 대비 HP503, HP507, HP511, HP515가 FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32A, 131R), FcγRIIIA(CD16A,176V)에 대해 우수한 결합능을 가짐을 확인하였다(도 21a 내지 도 21h, 도 22a 내지 도 22h, 도 23a 내지 도 23h, 도 29a 내지 도 29d, 표 29, 표 38).
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HP503, HP507, HP511, HP515의 Neonatal Fc Receptor(FcRn)에 대한 결합상수 분석은 Octet Red96e(Sartorius)를 이용해 측정되었다. Anti-Human Fab-CH1 2nd Generation(FAB2G) 바이오센서(Sartorius, 18-5126)에 HP503, HP507, HP511, HP515, Human IgG1(Bio X cell, BE0297), Trastuzumab, Pertuzumab, Margetuximab은 로딩되었으며, 결합시간과 해리시간은 각각 120초로 분석되었다(도 30a 내지 도 30b, 표 39). 분석에는 Kinetics Buffer(Sartorius, 18-1105)를 pH 6.0으로 맞춰 사용하였다.
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실시예 13. 보체 의존적 세포 독성 분석
보체 의존적 세포독성(Complement-dependent cytotoxicity) 분석을 위해 BT474(HER2 3+; High) 유방암 세포주와 NCI-N87(HER2 3+; High) 위암 세포주가 사용되었다. 96-웰 플레이트에 세포를 웰 당 10,000개가 되도록 세포 배양액에 희석하여 분주해주었다. 세포와 항체, 그리고 사람 혈청(Human serum; Sigma, H4522)은 각각 1:1:1의 부피비로 반응시켰다.
농도 의존적 반응을 보기 위해 Human IgG1, Trastuzumab(TRA), Trastuzumab + Pertuzumab(TRA + PER), H01, H01 + P01을 각각 1200 nM에서부터 2배씩 여섯 포인트 희석을 진행하고, 분주 시 1/3이 희석되어 400 nM에서부터 인큐베이팅 되게 하였다. 사람 혈청은 최종 농도가 25%가 되도록 배양액에 희석하여 분주하고 세포와 항체, 그리고 사람 혈청의 혼합물을 37℃, 5%(v/v) CO2 조건의 습윤배양기에서 5시간 동안 인큐베이팅 하였다.
미리 4℃에서 녹여둔 Cell Titer Glo-Reagent(Promega, G9243)를 혼합배양액 동량의 부피로 각 웰에 분주해준 후 플레이트 쉐이커(Allsheng, MX100-4A)를 이용하여 2분 동안 회전 속도 500 rpm으로 세포 용해를 유도하였다. 발광신호의 안정화를 위해 상온에서 10분 동안 인큐베이팅한 후 플레이트 리더기 장비(Envision; PerkinElmer, 2105-0010)를 이용하여 분석하였다(도 31a 내지 도 31b). 보체 의존적 세포 독성능(CDC activity)은 다음과 같이 계산되었다.
<수학식 1>
CDC activity (%) = 100 x [1-(luminescence with experimental antibody/luminiscence without antibody)]
Human IgG1, Trastuzumab(TRA), Trastuzumab + Pertuzumab(TRA + PER), H01의 경우 BT474와 NCI-N87 세포주에 대한 CDC 반응이 유도되지 않는다(도 31a 내지 도 31b). H01 + P01을 병용처리 할 경우에만 두 세포주에 대한 CDC가 유도되는 것을 확인하였다(도 31a 내지 도 31b).
실시예 14. 항체 의존성 세포 독성 분석
NCI-N87(HER2 3+; High), MDA-MB-453(HER2 2+; Mid), SNU-601(HER2 1+; Low), SNU-5(HER2 1+; Low) 암세포주들이 항체 의존성 세포독성(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) 분석을 위해 사용되었다(도 32a, 도 32b, 도 32c, 도 32d). 각 암세포주들은 96-well plate에 1.0 x 104 세포/웰로 seeding 되었다. 이 후 각 항체들은 적절한 농도로 배양액에 희석되어 처리되었다. 당일 분리된 말초 혈액 단핵세포(Peripheral Blood Mononuclear Cell; PBMC)를 효과 세포(Effector cell)로 하여 타겟 세포의 15배가 되도록(E:T ratio = 15:1) 1.5 x 105 세포/웰로 처리되었다.
처리 후, 37℃, 5%(v/v) CO2 조건의 습윤배양기에서 18시간 인큐베이팅 한 후 Cytotoxicity Detection Kit(LDH)(Roche, 11644793001)로 세포 독성이 측정되었다(도 32a, 도 32b, 도 32c, 도 32d). 항체 의존성 세포 독성은 다음 공식을 이용하여 세포독성(Cytotoxicity)을 계산하였다.
<수학식 2>
Cytotoxicity (%) = [(Test release-spontaneous release)/(Maximum release-spontaneous release)] x 100
NCI-N87(HER2 3+; High), MDA-MB-453(HER2 2+; Mid) 암세포주에서 H01은 Trastuzumab 보다 저농도에서 우수한 세포 독성을 나타내었다(도 32a, 도 32b). SNU-601(HER2 1+; Low), SNU-5(HER2 1+; Low) 암세포주에서 수행된 세포 독성 분석 결과 H01은 Trastuzumab 대비 우수한 세포 독성을 나타내었다(도 32c, 도 32d).
실시예 15. 이종이식 마우스 모델 효능 평가
SNU-5(HER2 1+; Low) 위암 세포주 유래 이종이식 모델(Cell line-derived xenograft model)에서 효능평가는 6주령 암컷 SCID Mouse(C.B-17/NcrKoat-Prkdcscid, Koatech)를 이용해 수행되었다(도 33a). SNU-5 암세포주는 1 x 107 cells/100 μL로 PBS에 희석되고, MATRIGEL® Growth Factor Reduced(GFR) Basement Membrane Matrix(Corning, 354230)와 1:1로 혼합하여, 혼합물 100 μL 우측 옆구리 피하 이식하고 종양의 성장을 관찰하였다. 평균 종양 부피가 약 107 mm3 되도록 regroup을 수행하고, PBS(Vehicle), 5 mg/kg H01, 5 mg/kg H01 + 5 mg/kg P01, 5 mg/kg HP507, 5 mg/kg Trastuzumab, 5 mg/kg Trastuzumab + 5 mg/kg Pertuzumab을 정맥 투여법(I.V.)으로 주 1회 총 6주간 투여하였다(도 33a). 분석 결과 Trastuzumab과 Trastuzumab + Pertuzumab 병용 투여 그룹 대비 H01 단독 투여가 우수한 항암 활성을 보였다(도 33a). H01과 P01을 병용 투여할 경우 H01 단독 투여 대비 항암 활성이 향상됨을 확인하였으며, HP507이 SNU-5 위암 이종이식 모델에서 가장 우수한 항암 활성을 나타내었다(도 33a).
추가로 SNU-5(HER2 1+; Low) 위암 세포주 유래 이종이식 모델(Cell line-derived xenograft model)에서 효능평가는 6주령 암컷 BALB/c-nu Mouse(Orientbio)를 이용해 수행되었다(도 33b). SNU-5 암세포주는 1 x 107 cells/100 μL로 PBS에 희석되고, MATRIGEL® Growth Factor Reduced(GFR) Basement Membrane Matrix(Corning, 354230)와 1:1로 혼합하여, 혼합물 100 μL 우측 옆구리 피하 이식하고 종양의 성장을 관찰하였다. 평균 종양 부피가 약 122 mm3 되도록 regroup을 수행하고, 50 mg/kg Intravenous Immunoglobulin(IVIG; LIV-r, SK Plasma)를 주 2회, 6주 동안 모든 마우스에 투여하였다(도 33b). PBS(Vehicle), 1 mg/kg Trastuzumab, 1 mg/kg Pertuzumab 0.5 mg/kg Trastuzumab + 0.5 mg/kg Pertuzumab, 1 mg/kg H01, 1 mg/kg P01, 0.5 mg/kg H01 + 0.5 mg/kg P01을 복강 투여법(I.P.)으로 주 2회 총 6주간 투여하였다(도 33b). 분석 결과 Trastuzumab, Pertuzumab, Trastuzumab + Pertuzumab 병용 투여 그룹 대비 H01, P01, H01 + P01 병용 투여 그룹에서 우수한 항암 활성을 보였다(도 33b).
SNU-601(HER2 1+; Low) 위암 세포주 유래 이종이식 모델(Cell line-derived xenograft model)에서 효능평가는 6주령 암컷 SCID Mouse(C.B-17/NcrKoat-Prkdcscid, Koatech)를 이용해 수행되었다. SNU-5 암세포주는 1 x 107 cells/100 μL로 PBS에 희석되고, MATRIGEL® Growth Factor Reduced(GFR) Basement Membrane Matrix(Corning, 354230)와 1:1로 혼합하여, 혼합물 100 μL 우측 옆구리 피하 이식하고 종양의 성장을 관찰하였다. 평균 종양 부피가 약 142 mm3 되도록 regroup을 수행하고, PBS(Vehicle), 5 mg/kg H01, 5 mg/kg Trastuzumab, 5 mg/kg Trastuzumab + 5 mg/kg Pertuzumab을 복강 투여법(I.P.)으로 주 2회 총 6주간 투여하였다(도 34). SCID Mouse의 체내에는 항체가 존재하지 않아 실제의 인간 혈액 환경을 모사하기 위해 50 mg/kg Intravenous Immunoglobulin(IVIG; LIV-r, SK Plasma)를 주 2회, 6주 동안 모든 마우스에 투여하였다(도 34). SNU-601 위암 이종이식 모델에서 H01 단독 투여가 가장 우수한 항암 활성을 나타내었다(도 34).
NCI-N87(HER2 3+; High) 위암 세포주 유래 이종이식 모델(Cell line-derived xenograft model)에서 효능평가는 6주령 암컷 SCID Mouse(C.B-17/NcrKoat-Prkdcscid, Koatech)를 이용해 수행되었다. NCI-N87 암세포주는 5 x 106 cells/100 μL로 PBS에 희석되고, MATRIGEL® Growth Factor Reduced(GFR) Basement Membrane Matrix(Corning, 354230)와 1:1로 혼합하여, 혼합물 100 μL 우측 옆구리 피하 이식하고 종양의 성장을 관찰하였다. 평균 종양 부피가 약 146 mm3 되도록 regroup을 수행하고, PBS(Vehicle), 0.2 mg/kg H01, 5 mg/kg H01, 0.2 mg/kg Trastuzumab, 5 mg/kg Trastuzumab을 복강 투여법(I.P.)으로 주 2회 총 6주간 투여하였다(도 35). SCID Mouse의 체내에는 항체가 존재하지 않아 실제의 인간 혈액 환경을 모사하기 위해 50 mg/kg Intravenous Immunoglobulin(IVIG; LIV-r, SK Plasma)를 주 2회, 6주 동안 모든 마우스에 투여하였다(도 35). 분석 결과 투여 용량 5 mg/kg 및 0.2 mg/kg에서 H01이 Trastuzumab 대비 우수한 항암 활성을 나타내었다(도 35).
실시예 16. CT26-HER2 이식 동종 마우스 모델에서 항암 활성 평가
인간 HER2 단백질(서열번호 567, 표 40)을 코딩하는 뉴클레오티드(서열번호 566, 표 40)를 Neomycin 저항 유전자가 포함된 단백질 발현벡터(ORIGENE, PS100020)에 클로닝하여 인간 HER2 발현벡터 pCMV6-AC-hHER2를 구축하였다(도 36, 표 40).
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마우스 대장암 세포인 CT26에 pCMV6-AC-hHER2 인간 HER2 발현벡터를 lipofectamine 2000 transfection reagent(Invitrogen, 11668-019)을 이용해 transfection 시켰다. 1 mg/mL G418(Invivogen, ant-gn-5)이 포함된 배양배지로 14일 동안 pCMV6-AC-hHER2 인간 HER2 발현벡터가 transfection된 세포만 선별하였다. SH800S Cell Sorter(SONY)를 이용해 발현량 상위 3% population을 96-well plate(ThermoFisher, 167008)에 웰 당 세포 1개가 들어가도록 sorting 진행하였다. 21일 동안 G418이 포함된 배지에서 선별을 진행하여, 총 8종의 인간 HER2를 발현하는 CT26 마우스 대장암세포주 clone을 확보하였고, 이들 세포들의 인간 HER2발현은 항 인간 HER2-BV421(BD, 744811)로 염색하고, 유세포분석기(BD Biosciences, FACSverse)를 이용해 측정하였다(도 37, 표 41).
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G418이 없는 환경에서 20일 동안 6번 계대 배양 후 항 인간 HER2-BV421(BD, 744811)로 염색하고, 인간 HER2 발현량을 측정하였다. G418 없이 키운 세포에서도 G418이 포함된 배지에서 배양한 세포 대비 인간 HER2 발현량이 감소되지 않음을 확인하였다(도 38, 표 42).
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Parental CT26, CT26-HER2 세포주(Clone #2-60) 및 인간 암세포주(SNU5, SNU601, NCI-N87)와의 세포 표면 Fc loading 값 비교를 위하여 96-웰 v-bottom 플레이트(Corning, 3363)에 각 세포와 100 nM Human IgG1(Bio X cell, BE0297), 100 nM Trastuzumab(TRA), 100 nM H01 항체를 4℃에서 30분 동안 결합시켰다. 이후 Alexa 488 형광이 접합된 항 인간 IgG Fcγ Fab 항체(Jackson ImmunoResearch, 109-547-008)를 처리하고 유세포분석기를 이용하여 세포에 결합된 항체 Fc를 loading 값을 정량하였다(도 39, 표 43). CT26-HER2 세포주(Clone #2-60)는 SNU5와 유사한 수준의 인간 HER2를 발현하는 것을 확인하였다(도 39, 표 43). 또한 CT26-HER2 세포주에서 100 nM Trastuzumab(TRA) 처리한 그룹보다 100 nM H01을 처리한 경우 세포 표면에 존재하는 Fc 개수의 증가를 확인하였다.
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CT26-HER2 세포주(Clone #2-60) 동종이식 마우스 모델(Syngeneic mouse model)에서 효능평가는 6주령 암컷 Balb/c Mouse(Orientbio)를 이용해 수행되었다. PBS(Vehicle), 5 mg/kg Trastuzumab, 5 mg/kg H01은 복강 투여법(I.P.)으로 주 2회 총 2주간 투여하였다(도 40). 분석 결과 H01이 Trastuzumab 대비 우수한 항암 활성을 나타내었다(도 40).
실시예 17. Glypican-3(GPC3)를 표적하는 신규 항체 구조체의 설계 및 제조 및 분석
Glypican-3(GPC-3) 단백질을 특이적으로 인지하는 항체의 경쇄와 중쇄 변이체 폴리펩티드 서열은 표 44에 나타내었다. GPM01은 Fc-Hole(서열번호 7), GPM01 HC(서열번호 67), GPM01 LC(서열번호 68)에 해당하는 서열로 구성된 발현벡터를 엑스피초-에스(EXPICHO-STM; Gibco, A29127)에 동시형질전환(Co-transfection)하고(도 41a, 표 44), 실시예 1에서 언급한 방식으로 정제 및 분석을 수행하였다. GPM02, GPM04, GPB01, GPB03, GPB04, GPB06도 앞서 언급한 동일한 방식으로 발현, 정제 분석이 수행되었다(도 41a 내지 도 41b, 표 44). GPM01, GPM02, GPM04는 항원의 서로 다른 epitope에 monovalent 결합을 하며, 2개의 Fc domain으로 구성된 구조이다(도 41a). GPB01, GPB03, GPB04, GPB06은 GPM01, GPM02, GPM04의 가변영역을 폴리펩티드 링커(서열번호 48, 서열번호 50)로 연결한 구조로 GPC-3에 biparatopic 결합을 하며, 2개의 Fc domain으로 구성된 구조이다(도 41b).
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하기 표 46은 GPC-3를 표적하는 변형 항체 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL) 폴리펩티드 서열을 나타낸 것이다. 하기 표 47은 GPC-3를 표적하는 변형 항체 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL) 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다.
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하기 표 48은 GPC-3를 표적하는 변형 항체 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 나타낸 것이다.
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GPM01, GPM02, GPM04, GPB01, GPB03, GPB04, GPB06의 GPC-3 단백질 결합상수는 Octet Red96e(Sartorius) 분석장비를 이용해 측정되었다. 7종 항체의 결합상수 분석을 위해 인간 GPC-3 재조합단백질(Sino Biologicals, 10088-H08H)은 Anti-Penta-HIS(HIS1K) 바이오센서(Sartorius, 18-5120)에 로딩되었고, 이 후 7종의 항체는 다양한 농도로 결합반응(300 초) 및 해리반응(1,200 초)이 유도되었으며 이를 바탕으로 GPC-3에 대한 친화도가 산출되었다(도 42, 표 49). 하기 표 49는 GPC-3를 표적하는 변형 항체 결합상수를 분석한 것이다.
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GPC-3 발현 세포 표면에 결합하는 항체 Fc domain 정량에 HepG2 간암세포주를 사용하였다. 100 nM human IgG1, GPM02, GPB01, GPB03, GC33은 4℃에서 30분 동안 HepG2 세포주에 결합이 유도되었고, Alexa 488 형광이 접합된 항 인간 IgG Fcγ Fab 항체(Jackson ImmunoResearch, 109-547-008)를 이용해 Fc domain의 양을 정량하였다(도 43). GC33은 GPC-3를 표적하는 인간화 항체로 양성 대조군으로 사용되었다(Nakano et al., US7,919,086 B2). GC33 대비 GPM02, GPB01, GPB03를 처리하였을 때 암세포 표면에 더 많은 Fc domain이 결합함을 확인하였다(도 43).
실시예 18. EPH Receptor A2(EphA2)를 표적하는 항체 구조체의 설계 및 제조 및 분석
EPH Receptor A2(EphA2) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄와 중쇄 변이체 폴리펩티드 서열은 표 46에 나타내었다. EPB01은 Fc-Hole(서열번호 7), EPB01 HC(서열번호 111), EPB01 LC(서열번호 112)에 해당하는 서열로 구성된 발현벡터를 엑스피초-에스(EXPICHO-STM; Gibco, A29127)에 동시형질전환(Co-transfection)하고(도 41b, 표 50), 실시예 1에서 언급한 방식으로 정제 및 분석을 수행하였다. EPB02, EPB03, EPB04, EPB05, EPB06, EPB07, EPB08, EPB09, EPB10, EPB11, EPB12도 앞서 언급한 동일한 방식으로 발현, 정제 분석이 수행되었다(표 50). 12종 항체들은 EphA2의 서로 다른 2개 epitope에 결합하는 가변영역을 폴리펩티드 링커(서열번호 48, 서열번호 50)로 연결한 구조로 biparatopic 결합을 하며, 2개의 Fc domain으로 구성된 구조이다(도 41b, 표 50).
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하기 표 52는 EphA2를 표적하는 변형 항체 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL) 폴리펩티드 서열을 나타낸 것이다. 하기 표 53는 EphA2를 표적하는 변형 항체 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL) 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다.
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하기 표 54은 EphA2를 표적하는 변형 항체 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 나타낸 것이다.
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EPB01, EPB02, EPB03, EPB04, EPB05, EPB06, EPB07, EPB08, EPB09, EPB10, EPB11, EPB12의 EphA2 단백질의 결합상수는 Octet Red96e(Sartorius) 분석장비를 이용해 측정되었다. 12종 biparatopic 항체의 결합상수 분석을 위해 인간 EphA2 재조합단백질(Sino Biologicals, 13926-H08H)은 Anti-Penta-HIS(HIS1K) 바이오센서(Sartorius, 18-5120)에 로딩되었고, 이 후 12종의 항체는 다양한 농도로 결합반응(300 초) 및 해리반응(1200 초)이 유도되었으며 이를 바탕으로 EphA2에 대한 친화도가 산출되었다(표 55). 하기 표 55는 EphA2를 표적하는 변형 항체 결합상수를 분석한 것이다.
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EphA2 신호전달 억제능 분석에는 PC-3 전립선암세포주가 사용되었다. 50 nM 농도의 각 항체를 30분 동안 처리한 PC-3 암세포주 용해액은 western blot을 통해 분석되었다. 1C1 인간 EphA2 표적항체는 양성 대조군으로 사용되었고 문헌에 공개된 서열을 바탕으로 제조하였다(Kinch et al., US 20090304721 A1). 분석을 위한 1차항체는 Akt Rabbit mAb(Cell Signaling Technology, 9272), Phospho-Akt(Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb(Cell Signaling Technology, 4060), β-Actin(13E5) Rabbit mAb(Cell Signaling Technology, 4970)이 사용되었고, 2차 항체로는 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody(Cell Signaling Technology, 7074)가 사용되었다. AKT 신호전달경로 억제능 분석에서 EPB02, EPB03, EPB05는 양성대조군인 1C1과 유사한 정도의 억제능을 보였다(도 44).
EphA2 발현 세포 표면에 결합하는 항체 Fc domain 정량에 PC-3 전립선암세포주를 사용하였다. 100 nM 각 항체들은 4℃에서 30분 동안 PC-3 세포주에 결합이 유도되었고, Alexa 488 형광이 접합된 항 인간 IgG Fcγ Fab 항체(Jackson ImmunoResearch, 109-547-008)를 이용해 Fc domain의 양을 정량하였다(도 44). EphA2를 표적하는 1C1 인간화 항체 대비 EPB02, EPB03, EPB05, EPB06, EPB07, EPB10를 처리하였을 때 암세포 표면에 더 많은 Fc domain이 결합함을 확인하였다(도 45).
실시예 19. MET을 표적하는 항체 구조체의 설계 및 제조 및 분석
MET 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄와 중쇄 변이체 폴리펩티드 서열은 표 56에 나타내었다. MEM01은 Fc-Hole(서열번호 7), MEM01 HC(서열번호 568), MEM01 LC(서열번호 569)에 해당하는 서열로 구성된 발현벡터를 엑스피초-에스(EXPICHO-STM; Gibco, A29127)에 동시형질전환(Co-transfection)하고(도 41a, 표 56), 실시예 1에서 언급한 방식으로 정제 및 분석을 수행하였다. MEM06도 앞서 언급한 동일한 방식으로 발현, 정제 분석이 수행되었다(표 56, 표 57).
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하기 표 58은 MET를 표적하는 변형 항체 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL) 폴리펩티드 서열을 나타낸 것이다. 하기 표 59는 MET를 표적하는 변형 항체 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL) 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다.
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하기 표 60은 MET을 표적하는 변형 항체 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 나타낸 것이다.
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MEM01, MEM06의 MET 단백질의 결합상수는 Octet Red96e(Sartorius) 분석장비를 이용해 측정되었다. 항체의 결합상수 분석을 위해 Anti-Human Fab-CH1 2nd Generation(FAB2G) 바이오센서(Sartorius, 18-5125)에 항체가 로딩되었고, 인간 MET 재조합단백질(Sino Biologicals, 10692-H08H)은 다양한 농도로 결합반응(300 초) 및 해리반응(600 초)이 유도되었다(도 46). 이를 바탕으로 MET에 대한 친화도가 산출되었다(도 46, 표 61). 하기 표 61는 MET을 표적하는 변형 항체 결합상수를 분석한 것이다.
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MET 발현 세포 표면에 결합하는 항체 Fc domain 정량에 MKN45, SNU-5 위암세포주를 사용하였다. Human IgG1 control, Onartuzumab(CHO 세포주 생산), Emibetuzumab, MEM01, MEM06 항체들은 4℃에서 30분 동안 세포주에 결합이 유도되었고, Alexa 488 형광이 접합된 항 인간 IgG Fcγ Fab 항체(Jackson ImmunoResearch, 109-547-008)를 이용해 Fc domain의 양을 정량하였다(도 47 및 도 48). MEM01을 처리하였을 때 MET을 표적하는 Onartuzumab, Emibetuzumab 대비 더 많은 Fc가 MET 발현 암세포 표면에 결합함을 확인하였다(도 47 및 도 48). MEM06의 경우 Emibetuzumab 대비 더 많은 Fc를 MET 발현 암세포 표면에 결합시킴을 확인하였으나, Onartuzumab과는 동등한 수준임을 확인하였다(도 47 및 도 48).
실시예 20. EGFR을 표적하는 항체 구조체의 설계 및 제조 및 분석
EGFR 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄와 중쇄 변이체 폴리펩티드 서열은 표 62에 나타내었다. EGM01은 Fc-Hole(서열번호 7), EGM01 HC(서열번호 590), EGF01 LC(서열번호 591)에 해당하는 서열로 구성된 발현벡터를 엑스피초-에스(EXPICHO-STM; Gibco, A29127)에 동시형질전환(Co-transfection)하고(도 41a, 표 62), 실시예 1에서 언급한 방식으로 정제 및 분석을 수행하였다. EGM02, EGM03, EGM04, EGM05, EGM06도 앞서 언급한 동일한 방식으로 발현, 정제 분석이 수행되었다(표 62).
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하기 표 63은 EGFR를 표적하는 변형 항체 중쇄 및 경쇄 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다.
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하기 표 64는 EGFR를 표적하는 변형 항체 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL) 폴리펩티드 서열을 나타낸 것이다. 하기 표 65는 EGFR를 표적하는 변형 항체 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL) 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다.
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000154
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000155
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000156
하기 표 66은 EGFR을 표적하는 변형 항체 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 나타낸 것이다.
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000157
EGM01 내지 EGM05의 EGFR 단백질에 대한 결합상수는 Octet Red96e(Sartorius) 분석장비를 이용해 측정되었다. 항체의 결합상수 분석을 위해 Anti-Human Fab-CH1 2nd Generation(FAB2G) 바이오센서(Sartorius, 18-5125)에 항체가 로딩되었고, 인간 EGFR 재조합단백질(Sino Biologicals, 10692-H08H)은 다양한 농도로 결합반응(300 초) 및 해리반응(600 초)이 유도되었다(도 49). 이를 바탕으로 EGFR에 대한 친화도가 산출되었다(도 49, 표 67). 하기 표 67은 EGFR을 표적하는 변형 항체 결합상수를 분석한 것이다.
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000158
실시예 21. CD33을 표적하는 신규 항체 구조체의 설계 및 제조 및 분석
CD33 단백질을 특이적으로 인지하는 항체의 경쇄와 중쇄 변이체 폴리펩티드 서열은 표 68에 나타내었다. GPM01은 Fc-Hole(서열번호 7), 33-1 HC(서열번호 636), 33-1 LC(서열번호 637)에 해당하는 서열로 구성된 발현벡터를 엑스피초-에스(EXPICHO-STM; Gibco, A29127)에 동시형질전환(Co-transfection)하고(도 41a, 표 64), 실시예 1에서 언급한 방식으로 정제 및 분석을 수행하였다. 33-2, 33-3, 33-4, 33-5, 33-6, 33-7도 앞서 언급한 동일한 방식으로 발현, 정제 분석이 수행되었다(도 41a 내지 도 41b, 표 68, 표 69). 33-1, 33-2, 33-3은 항원의 서로 다른 epitope에 monovalent 결합을 하며, 2개의 Fc domain으로 구성된 구조이다(도 41a). 33-4, 33-5, 33-6, 33-7은 CD33 항체의 가변영역을 폴리펩티드 링커(서열번호 48, 서열번호 50)로 연결한 구조로 CD33에 biparatopic 결합을 하며, 2개의 Fc domain으로 구성된 구조이다(도 41b).
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000159
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하기 표 70은 CD33을 표적하는 변형 항체 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL) 폴리펩티드 서열을 나타낸 것이다. 하기 표 71은 CD33을 표적하는 변형 항체 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL) 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다.
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하기 표 72는 CD33를 표적하는 변형 항체 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 나타낸 것이다.
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000174
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000175
33-1, 33-2, 33-3, 33-4, 33-5, 33-6, 33-7의 CD33 단백질 결합상수는 Octet Red96e(Sartorius) 분석장비를 이용해 측정되었다. 7종 항체의 결합상수 분석을 위해 인간 CD33 재조합단백질(Sino Biologicals, 12238-H08H)은 Anti-Penta-HIS(HIS1K) 바이오센서(Sartorius, 18-5120)에 로딩되었고, 이 후 7종의 항체는 다양한 농도로 결합반응(600 초) 및 해리반응(1,200 초)이 유도되었으며 이를 바탕으로 CD33에 대한 친화도가 산출되었다(도 50, 표 73). 하기 표 73은 CD33을 표적하는 변형 항체 결합상수를 분석한 것이다.
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000176
실시예 22. CEACAM5를 표적하는 항체 구조체의 설계 및 제조 및 분석
CEACAM5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄와 중쇄 변이체 폴리펩티드 서열은 표 74에 나타내었다. CEA01은 Fc-Hole(서열번호 7), CEA01 HC(서열번호 590), CEA01 LC(서열번호 591)에 해당하는 서열로 구성된 발현벡터를 엑스피초-에스(EXPICHO-STM; Gibco, A29127)에 동시형질전환(Co-transfection)하고(도 41a, 표 74), 실시예 1에서 언급한 방식으로 정제 및 분석을 수행하였다. CEA02, CEA03, CEA04도 앞서 언급한 동일한 방식으로 발현, 정제 분석이 수행되었다(표 74).
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000177
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000178
하기 표 75는 CEACAM5를 표적하는 변형 항체 중쇄 및 경쇄 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다.
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000179
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000180
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하기 표 76은 CEACAM5를 표적하는 변형 항체 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL) 폴리펩티드 서열을 나타낸 것이다. 하기 표 77는 CEACAM5를 표적하는 변형 항체 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL) 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다.
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000183
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000184
하기 표 78은 CEACAM5를 표적하는 변형 항체 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 나타낸 것이다.
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000185
결합상수 분석을 위해 인간 CEACAM5 재조합단백질(Sino Biologicals, 11077-H08H)은 Anti-Penta-HIS(HIS1K) 바이오센서(Sartorius, 18-5120)에 로딩되었고, 항체들은 다양한 농도로 결합반응(600 초) 및 해리반응(1,200 초)이 유도되었으며 이를 바탕으로 인간 CEACAM5에 대한 친화도가 산출되었다(도 51, 표 79). 하기 표 79은 인간 CEACAM5를 표적하는 변형 항체 결합상수를 분석한 것이다.
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000186
실시예 23. TROP2 또는 Mesothelin 또는 LIV-1을 표적하는 항체 구조체의 설계 및 제조 및 분석
TROP2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 T01의 경쇄와 중쇄 변이체 폴리펩티드 서열은 표 80에 나타내었다. T01은 Fc-Hole(서열번호 7), T01 HC(서열번호 753), T01 LC(서열번호 754)에 해당하는 서열로 구성된 발현벡터를 ExpiCHO-STM(Gibco, A29127)에 동시형질전환(Co-transfection)하고(도 41a, 표 80), 실시예 1에서 언급한 방식으로 정제 및 분석을 수행하였다. Mesothelin 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 MSM01의 경쇄와 중쇄 변이체 폴리펩티드 서열은 표 80에 나타내었다. MSM01은 Fc-Hole(서열번호 7), MSM01 HC(서열번호 755), MSM01 LC(서열번호 756)에 해당하는 서열로 구성된 발현벡터를 EXPICHO-STM(Gibco, A29127)에 동시형질전환(Co-transfection)하고(도 41a, 표 80), 실시예 1에서 언급한 방식으로 정제 및 분석을 수행하였다. LIV-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 LIM01의 경쇄와 중쇄 변이체 폴리펩티드 서열은 표 80에 나타내었다. LIM01은 Fc-Hole(서열번호 7), LIM01 HC(서열번호 757), LIM01 LC(서열번호 758)에 해당하는 서열로 구성된 발현벡터를 EXPICHO-STM(Gibco, A29127)에 동시형질전환(Co-transfection)하고(도 41a, 표 80), 실시예 1에서 언급한 방식으로 정제 및 분석을 수행하였다.
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000187
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000188
하기 표 81은 TROP2 또는 Mesothelin 또는 LIV-1을 표적하는 변형 항체 중쇄 및 경쇄 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다.
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하기 표 82는 TROP2 또는 Mesothelin 또는 LIV-1을 표적하는 변형 항체 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL) 폴리펩티드 서열을 나타낸 것이다. 하기 표 83은 TROP2 또는 Mesothelin 또는 LIV-1을 표적하는 변형 항체 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL) 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다.
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000192
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000193
하기 표 84는 TROP2 또는 Mesothelin 또는 LIV-1을 표적하는 변형 항체 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 나타낸 것이다.
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000194
결합상수 분석을 위해 인간 TROP2 재조합단백질(Sino Biologicals, 10428-H08H) 또는 인간 Mesothelin 재조합단백질(Sino Biologicals, 13128-H08H) 또는 인간 LIV-1 재조합단백질(Acro biosystems, LV1-H5223)은 Anti-Penta-HIS(HIS1K) 바이오센서(Sartorius, 18-5120)에 로딩되었고, 항체들은 다양한 농도로 결합반응 및 해리반응 이 유도되었으며 이를 바탕으로 인간 항원에 대한 각 항체의 친화도가 산출되었다(도 52, 표 85). 하기 표 85은 TROP2 또는 Mesothelin 또는 LIV-1을 표적하는 변형 항체 결합상수를 분석한 것이다.
Figure PCTKR2022015981-appb-img-000195

Claims (23)

  1. (a) 적어도 하나의 complementarity-determining region (CDR) 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드와 적어도 하나의 complementarity-determining region (CDR) 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드로 이루어지고, 상기 제1 폴리펩티드와 상기 제2 폴리펩티드가 이량체 (dimer)를 형성하고, 타겟 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위,
    (b) 두 개의 폴리펩티드 서열로 이루어진 이량체로서, 이중 하나의 폴리펩티드 서열이 상기 항원 결합 부위의 제1 폴리펩티드에 결합된 제1 Fc 도메인 또는 이의 변이체, 및
    (c) 두 개의 폴리펩티드 서열로 이루어진 이량체로서, 이중 하나의 폴리펩티드 서열이 상기 항원 결합 부위의 제2 폴리펩티드에 결합된 제2 Fc 도메인 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항원 결합 부위의 제1 폴리펩티드는 항체 중쇄의 CDR1, CDR2, 및 CDR3를 포함하고, 상기 항원 결합 부위의 제2 폴리펩티드는 항체 경쇄의 CDR1, CDR2, 및 CDR3를 포함하는 것인, 융합단백질.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 항원 결합 부위의 제1 폴리펩티드는 항체 중쇄의 CH1 영역을 더 포함하고, 및/또는 상기 항원 결합 부위의 제2 폴리펩티드는 항체 경쇄의 불변 영역을 더 포함하는 것인, 융합단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항원 결합 부위는 세포 표면에 발현되는 단백질에 특이적으로 결합하는 것인, 융합단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 항원 결합 부위는 암 항원에 특이적으로 결합하는 것인, 융합단백질.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 융합단백질은, 동일한 항원 결합 부위를 가지는 통상적 구조의 IgG 기반 항체 대비 향상된 종양억제능을 유도하는 것인, 융합단백질.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 항원 결합 부위는 PD-L1, EGFR, EGFRvIII, BCMA, CD22, CD25, CD30, CD33, CD37, CD38, CD52, CD56, CD123, c-Met, DLL3, DR4, DR5, GD2, Nectin-4, RANKL, SLAMF7, Trop-2, LIV-1, Claudin 18.2, IL13α2, CD3, HER2, HER3, FGFR2, FGFR3, GPC3, ROR1, Folα, CD20, CD19, CTLA-4, VEGFR, NCAM1, ICAM-1, ICAM-2, CEACAM5, CEACAM6, Carcinoembryonic antigen (CEA), CA-125, Alphafetoprotein (AFP), MUC-1, MUC-16, PSMA, PSCA, Epithelial tumor antigen (ETA), Melanoma-associated antigen (MAGE), Immature laminin receptor, TAG-72, HPV E6/E7, BING-4, Calcium-activated chloride channel 2, Cyclin-B1, 9D7, Ep-CAM, EphA2, EphA3, Mesothelin, SAP-1, Survivin 및 바이러스 유래 항원으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나에 특이적으로 결합하는 것인, 융합단백질.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 제1 Fc 도메인 및 상기 제2 Fc 도메인은 각각 야생형 Fc 도메인 또는 Fc 도메인 변이체인 것인, 융합단백질.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 Fc 영역은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM의 Fc 영역 또는 이의 변이체인 것인, 융합단백질.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 제1 Fc 도메인 변이체 및 제2 Fc 도메인 변이체는 각각 독립적으로 Fc 이종이량체(heterodimeric Fc) 형성을 촉진하는 놉 구조 또는 홀 구조를 포함하는 것인; 및/또는
    상기 제1 Fc 도메인 변이체 및 제2 Fc 도메인 변이체는 각각 독립적으로 정전기 조향(electrostatic steering) 기작에 의한 이종이량체 형성을 촉진하는 변이체를 포함하는 것인, 융합단백질.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 융합단백질은 하기 구조식 (I), (II), (III) 및 (IV)의 폴리펩티드를 포함하는 것인, 융합단백질:
    N'-X-(L1)n-A-C' (I);
    N'-Y-(L2)m-B-C' (II);
    N'-C-C' (III); 및
    N'-D-C' (IV)
    이때, 상기 구조식 (I), (II), (III) 및 (IV)에 있어서,
    상기 N'은 각 폴리펩티드의 N-말단이고,
    상기 C'은 각 폴리펩티드의 C-말단이며,
    상기 - 는 결합을 의미하고,
    상기 A, B, C 및 D는 각각 면역글로불린의 CH2 및 CH3 영역을 포함하여, 임의적으로 CH4 및/또는 힌지 서열을 더 포함하는 Fc 도메인의 단량체 폴리펩티드 서열이며, 상기 A는 C 또는 D중 하나와 함께 이량체를 형성하여 상기 제1 Fc 도메인 (b)를 형성하고, 상기 B는 C 또는 D중 남은 하나와 함께 이량체를 형성하여 상기 제2 Fc 도메인 (c)를 형성하며;
    L1 및 L2는각각 펩티드 링커이며,
    상기 n 및 m은 각각 독립적으로 0 또는 1이며,
    상기 X는 상기 항원 결합 부위의 제 1 폴리펩티드 서열로서, 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하는 서열이거나 혹은 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변영역을 포함하고;
    상기 Y는 상기 항원 결합 부위의 제 2 폴리펩티드 서열로서, 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하는 서열이거나 혹은 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 가변영역을 포함하며;
    상기 X 및 Y는 결합하여 항원에 특이적으로 결합하는 상기 항원 결합 부위 (a)를 형성한다.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 구조식 (I)의 X는 추가적으로 중쇄 CH1 영역을 포함하고, 및/또는
    상기 구조식 (II)의 Y는 추가적으로 경쇄 불변영역을 포함하는 것인, 융합단백질.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 융합단백질은 하기 구조식 (I'), (II'), (III) 및 (IV)의 폴리펩티드를 포함하는 것인, 융합단백질:
    N'-VD1-(L3)p-X-(L1)n-A-C' (I');
    N'-VD2-(L4)q-Y-(L2)m-B-C' (II');
    N'-C-C' (III); 및
    N'-D-C' (IV)
    이때, 상기 구조식 (I'), (II'), (III) 및 (IV)에 있어서,
    상기 N'은 각 폴리펩티드의 N-말단이고,
    상기 C'은 각 폴리펩티드의 C-말단이며,
    상기 - 는 결합을 의미하고,
    상기 A, B, C 및 D는 각각 면역글로불린의 CH2 및 CH3 영역을 포함하여, 임의적으로 CH4 및/또는 힌지 서열을 더 포함하는 Fc 도메인의 단량체 폴리펩티드 서열이며, 상기 A는 C 또는 D중 하나와 함께 이량체를 형성하여 상기 제1 Fc 도메인 (b)를 형성하고, 상기 B는 C 또는 D중 남은 하나와 함께 이량체를 형성하여 상기 제2 Fc 도메인 (c)를 형성하며;
    L1, L2, L3 및 L4는 펩티드 링커이며,
    상기 n, m, p 및 q는 각각 0 또는 1이며,
    상기 VD1은 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 혹은 경쇄 가변영역 혹은 항체 중쇄 혹은 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 구성되고;
    상기 VD2는 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 혹은 중쇄 가변영역 혹은 항체 중쇄 혹은 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 구성되며;
    상기 VD1과 VD2는 결합하여 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항체 가변 영역을 형성하며,
    상기 X는 항원에 특이적으로 결합하는 항체 중쇄 혹은 경쇄 가변영역 혹은 항체 중쇄 혹은 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하고;
    상기 Y는 항원에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 혹은 중쇄 가변영역 혹은 항체 중쇄 혹은 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하며;
    상기 X 및 Y는 결합하여 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항체 가변 영역을 형성하고,
    상기 VD1-(L3)p-X는 상기 항원결합 부위(a)의 제1 폴리펩티드 서열을 형성하고, 상기 VD2-(L4)q-Y는 상기 항원결합 부위(a)의 제2 폴리펩티드 서열을 형성한다.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 중쇄 가변영역은 추가적으로 중쇄 CH1 영역을 포함하고,
    상기 경쇄 가변영역은 추가적으로 경쇄 불변영역을 포함하는 것인, 융합단백질.
  15. 제11항 또는 제13항에 있어서,
    상기 Fc 도메인 단량체는 Fc 이종이량체(heterodimeric Fc) 형성을 촉진하는 놉 구조 또는 홀 구조를 포함하는 것인; 또는
    상기 Fc 도메인 단량체는 정전기 조향(electrostatic steering) 기작에 의한 이종이량체 형성을 촉진하는 변이체를 포함하는 것인, 융합단백질.
  16. 제12항 또는 제14항에 있어서,
    상기 X 및 Y의 결합은
    i) CH1 및 경쇄 불변영역에 존재하는 Cys에 의한 이황화 결합을 통해 이루어 지거나,
    ii) 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역에 존재하는 Cys에 의한 이황화 결합을 통해 이루어 지거나,
    iii) CH1 및 경쇄 불변영역에 존재하는 Cys에 의한 이황화 결합 및 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역에 존재하는 Cys에 의한 이황화 결합을 통해 이루어 지는 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 X 및 Y의 결합은 Kabat numbering기준 CH1233와 CL214 사이에 존재하는 이황화 결합 이외에 추가적으로,
    i) VH105와 VL43 사이에 존재하는 이황화 결합, 또는;
    ii) VH44와 VL100 사이에 존재하는 이황화 결합, 또는;
    iii) CH1122과 CL121 사이에 존재하는 이황화 결합을 포함하는 것인, 융합단백질.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 암은 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 담낭암, 방광암, 신장암, 식도암, 피부암, 직장암, 골육종, 다발성골수종, 신경교종, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 갑상선암, 후두암, 고환암, 중피종, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프모구성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 융합단백질을 발현하는 형질전환 세포.
  21. 제1항에 따른 융합단백질을 암 치료 혹은 암 예방이 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료 또는 예방하는 방법.
  22. 암을 치료하기 위한, 제1항에 따른 융합단백질의 용도.
  23. 암을 치료용 약물을 제조하는데 사용하기 위한, 제1항에 따른 융합단백질의 용도.
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