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WO2023058801A1 - 락토바실러스 애시도필러스 kbl402 또는 kbl409 균주를 포함하는 장 질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

락토바실러스 애시도필러스 kbl402 또는 kbl409 균주를 포함하는 장 질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Publication number
WO2023058801A1
WO2023058801A1 PCT/KR2021/013946 KR2021013946W WO2023058801A1 WO 2023058801 A1 WO2023058801 A1 WO 2023058801A1 KR 2021013946 W KR2021013946 W KR 2021013946W WO 2023058801 A1 WO2023058801 A1 WO 2023058801A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
strain
lactobacillus acidophilus
composition
accession number
kbl409
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2021/013946
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
강윤경
남태욱
박성준
장성재
김운기
장유진
고광표
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SNU R&DB Foundation
Kobiolabs Inc
Original Assignee
Seoul National University R&DB Foundation
Kobiolabs Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Seoul National University R&DB Foundation, Kobiolabs Inc filed Critical Seoul National University R&DB Foundation
Priority to PCT/KR2021/013946 priority Critical patent/WO2023058801A1/ko
Publication of WO2023058801A1 publication Critical patent/WO2023058801A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/23—Lactobacillus acidophilus

Definitions

  • the present invention relates to a composition for improving, preventing or treating intestinal diseases comprising Lactobacillus acidophilus strain KBL402 or KBL409 strain, and more particularly, a novel probiotic Lactobacillus acidophilus strain KBL402 strain or KBL409 strain. It relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating intestinal disorders, a composition for food, or a composition for animal feed, including at least one selected from the group consisting of strains, cultures thereof, lysates and extracts.
  • IBD Inflammatory bowel disease
  • inflammatory bowel disease is an incurable disease that recurs repeatedly and is difficult to treat, and a clear cause has not been identified, and a drug capable of fundamentally treating inflammatory bowel disease (IBD) has not yet been developed.
  • IBD inflammatory bowel disease
  • Immunosuppressants such as sulfasalazine, corticosteroids, and azatriopin or biological agents represented by anti-TNF- ⁇ antibodies can be used as a treatment for suppressing abnormal immune and inflammatory responses to inflammatory bowel disease.
  • many side effects related to these drugs may occur during long-term treatment, and the recurrence rate is also very high.
  • sulfasalazine can aggravate colitis, causing diarrhea, abdominal cramps, and abdominal discomfort.
  • Antibiotics are also one of the commonly used treatments for inflammatory bowel disease, but they have the side effect of killing not only pathogens but also intestinal beneficial bacteria that are very important to human health.
  • damage to intestinal microorganisms caused by antibiotics is not easily recovered even after several years, and side effects leading to chronic diseases such as hypertension, diabetes, and atopy may occur.
  • these drugs are difficult to take for a long time because they act as a mechanism to suppress the immune system, and when administered for a long time, nausea, vomiting, indigestion, anorexia, headache, as well as leukopenia due to hypersensitivity reactions, skin rash, fever, pancreatitis, Side effects such as hepatitis, hemolytic anemia, and bone marrow suppression may result.
  • Probiotics refer to microorganisms and products produced by gastric microorganisms that have antibacterial and enzymatic activities that help the balance of intestinal microorganisms.
  • probiotics are defined as live bacteria in the form of single or complex strains that are supplied to humans or animals in the form of dry cells or fermentation products to improve the intestinal flora.
  • the characteristics that probiotics should have are that the human intestine is their habitat, they are non-pathogenic and non-toxic, and they must survive while going to the intestine. Furthermore, they must retain viability and activity prior to consumption in delivered food, be sensitive to antibiotics used for prophylaxis, and not possess antibiotic-resistant plasmids. In addition, it must be resistant to acids, enzymes, and bile in the intestinal environment. Recently, as various health function improvement effects have been reported, probiotics have been spotlighted as major therapeutic substances that can replace existing compound-based treatments.
  • the present inventors have devoted themselves to research on probiotics for the treatment of intestinal diseases, including inflammatory bowel diseases, for which there is no conventional satisfactory treatment, and as a result, Lactobacillus Acidophilus strains are beneficial in reducing intestinal inflammation and in the intestine.
  • the present invention was completed by confirming that it exhibits an excellent effect in increasing the diversity of microorganisms and is useful for improving, preventing or treating intestinal diseases.
  • An object of the present invention is to provide a composition containing a Lactobacillus acidophilus strain showing excellent effects in improving, preventing or treating intestinal diseases.
  • One object of the present invention is the Lactobacillus acidophilus KBL402 strain with accession number KCTC 14640BP or the Lactobacillus acidophilus KBL409 strain with accession number KCTC 13518BP, a culture of the strain, a lysate of the strain, and an extract of the strain.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating intestinal diseases comprising at least one member selected from the group consisting of.
  • Another object of the present invention is the Lactobacillus acidophilus KBL402 strain with accession number KCTC 14640BP or the Lactobacillus acidophilus KBL409 strain with accession number KCTC 13518BP, the culture of the strain, the lysate of the strain, and the strain A food composition for improving or preventing intestinal diseases comprising at least one selected from the group consisting of extracts; Or to provide a food composition for improving intestinal health.
  • Another object of the present invention is the Lactobacillus acidophilus KBL402 strain with accession number KCTC 14640BP or the Lactobacillus acidophilus KBL409 strain with accession number KCTC 13518BP, the culture of the strain, the lysate of the strain, and the strain To provide a composition for animal feed containing at least one selected from the group consisting of extracts.
  • Lactobacillus acidophilus KBL402 (Accession No. KCTC 14640BP) and KBL409 (Accession No. KCTC 13518BP) strains according to the present invention can reduce intestinal inflammation and improve the diversity of the beneficial microbial layer in the intestine. Therefore, it can be usefully used for improvement, prevention or treatment of intestinal diseases.
  • 1 is a graph showing Rarefaction plots of an experimental group and a control group.
  • PCA principal component analysis
  • Figure 3 is a graph showing the taxonomic composition of caecal microorganisms in the experimental group and the control group.
  • 5 is a heat map of the Spearman correlation between the relative abundance of genus-level taxa and specific metabolites in experimental and control groups.
  • the present invention relates to the Lactobacillus Acidophilus KBL402 strain with Accession No. KCTC 14640BP or the Lactobacillus Acidophilus KBL409 strain with Accession No. KCTC 13518BP, the culture of the strain, the lysate of the strain, and the extract of the strain. It provides a composition for improving, preventing or treating intestinal diseases comprising at least one selected from the group consisting of.
  • the composition according to the present invention may include a pharmaceutical composition for preventing or treating intestinal disease, a food composition for improving or preventing intestinal disease, or a composition for animal feed.
  • composition of the present invention may further include strains other than the Lactobacillus acidophilus KBL402 strain or the Lactobacillus acidophilus KBL409 strain, and the Lactobacillus acidophilus KBL402 strain and the Lactobacillus acidophilus KBL409 strain Of course, all of them can be included.
  • strains may be included in the form of live cell cells, dead cell cells and dried strains, cultures thereof, lysates thereof, or extracts thereof.
  • the term "culture” refers to a product obtained by culturing a strain in a known medium, and the product may include the strain itself.
  • the medium may be selected from known liquid medium or solid medium, and may be, for example, MRS liquid medium, GAM liquid medium, MRS agar medium, GAM agar medium, and BL agar medium, but is not limited thereto.
  • the term “lysate” refers to any product obtained by disrupting a strain by enzyme treatment, homogenization, or ultrasonic treatment.
  • extract refers to a product obtained by extracting a strain with a known extraction solvent.
  • extract includes a water extract and/or an organic solvent extract of Lactobacillus acidophilus KBL402 strain and/or KBL409 strain.
  • the organic solvent extract of the KBL402 strain and/or the KBL409 strain may be an organic solvent extract having 1 or more and 10 or less carbon atoms.
  • a substituted or unsubstituted alcohol extract having 1 to 10 carbon atoms, 1 to 5 carbon atoms, or 1 to 3 carbon atoms may be used as the extraction solvent.
  • alcohol extracts such as, for example, methanol extracts, ethanol extracts, iso-propanol extracts, n-propanol extracts, n-butanol extracts, iso-butanol extracts, tert-butanol extracts and/or phenol extracts; ether extracts such as dialkyl ethers such as dimethyl ether, diethyl ether, and methyl ethyl ether; n-hexane, ethyl acetate, dichloromethane, chloroform and/or acetone extracts.
  • ether extracts such as dialkyl ethers such as dimethyl ether, diethyl ether, and methyl ethyl ether
  • n-hexane ethyl acetate, dichloromethane, chloroform and/or acetone extracts.
  • live cell refers to the strain itself of the present invention
  • dead cell refers to a strain sterilized by heating, pressurization, or drug treatment.
  • composition of the present invention may be provided as a composition capable of being further combined with pharmaceutically acceptable additives such as carriers or media.
  • the additives used in the present invention are solvents, dispersants, coatings, absorption accelerators, controlled release agents (i.e. sustained release agents), and one or more inactive excipients (starch, polyols, granules, microfine cellulose, microcrystalline cellulose). (including, for example, cellphere, cellphere beads, diluents, lubricants, binders, disintegrants, etc.), etc.
  • tablet formulations of the disclosed compositions may be standard aqueous or Non-limiting examples of excipients for use as pharmaceutically acceptable carriers and pharmaceutically acceptable inert carriers and the additional ingredients include binders, fillers, disintegrants, lubricants. , antimicrobial agents and coating agents.
  • the content of the additives included in the pharmaceutical composition is not particularly limited and may be appropriately adjusted within the range of content used in conventional formulations.
  • the term “improvement” is used to mean that the disease is not cured, but the severity of symptoms is reduced and certain functions are improved.
  • prevention is used to include delaying the onset of a disease, disorder or condition.
  • a treatment or treatment regimen for a disease in a subject in need thereof may include one or more of the following:
  • a subject in need of treatment may be an animal.
  • it is typically mammals that may benefit from using the compositions of the present invention.
  • Preferred examples of such subjects include primates such as humans.
  • such subjects include all subjects who have intestinal disease symptoms or are at risk of having similar symptoms.
  • composition of the present invention according to the conventional method according to each purpose of use, oral formulations such as solutions, suspensions, powders, granules, tablets, capsules, pills, extracts, emulsions, syrups, aerosols, injections of sterile injection solutions It can be formulated and used in various forms such as oral administration or parenteral administration through various routes including intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intradermal, intramuscular, spinal, intrathecal, or rectal topical administration or injection.
  • the dosage may vary depending on the patient's weight, age, sex, health condition, diet, administration time, administration method, administration period or interval, excretion rate, constitutional specificity, nature of the preparation, severity of the disease, etc. there is.
  • liquid formulation refers to a medicine to be taken in the form of a liquid medicine dissolved in water or an organic solvent. Compared to suspensions or solid formulations, liquid formulations have the advantage of more effective drug absorption from the intestinal tract to the systemic circulation, and the liquid formulations may contain additional solutes in addition to pharmaceuticals, and additives providing color, odor, sweetness, or stability. may also be included.
  • the term “suspending agent” refers to any agent capable of providing the desired solubility and/or dispersibility of an alginate-containing composition, i.e., an aqueous formulation that is substantially clear and free of sedimentation and lumps.
  • powder refers to finely divided drugs, chemicals, or a dry mixture of both. “Powder” may include a mixture in a lyophilized state.
  • powders may contain conventional additives used in lyophilized formulations such as lyophilized strains and lyophilized preservatives.
  • the term "granule” refers to a drug or a mixture of drugs in the form of granules, which usually passes through a sieve of 4.76 to 20 mm.
  • Granules are generally produced by wetting the powder or mixture of powders and passing the mass through a sieve or granulator of appropriate mesh size depending on the size of the granules required. Since granules, like powders, are granular, the degree of contact of the drug to the tongue is high, so when a drug having a bitter taste is used in the form of granules, it may cause discomfort to patients, especially children or the elderly.
  • tablette means a powdered medicine made easy to take by compressing it into a small disc shape. Tablets may include uncoated tablets, film-coated tablets, coated tablets, multilayer tablets, press-coated tablets, inner core tablets, orally disintegrating tablets, chewable tablets, effervescent tablets, dispersible tablets, and dissolving tablets.
  • capsule refers to a product made by filling a drug into a capsule in the form of a liquid, suspension, water, powder, granule, mini-tablet, or pellet, or encapsulated with a capsule base.
  • a pharmaceutical composition according to one embodiment may include a lyophilized strain.
  • the pharmaceutical composition of one embodiment may be formulated in the form of a capsule formulation of the lyophilized strain.
  • the storage period of the strain can be improved by minimizing the loss of the KBL693 strain that may occur due to heat.
  • the biological activity of the strain can be inactivated to improve formulation stability, and the strain can be more easily induced to rehydrate than other formulation methods, so that the original activity and growth ability can be quickly restored after supplying water to the dry strain.
  • the freeze-dried preparation is easy to formulate, such as tableting and encapsulation, and can be prepared in various dosage forms.
  • regeneration which is the most important feature of LBP (Live Biotherapeutic Products) such as strain preparations, can proceed very stably.
  • the strain when the strain is formulated by cryopreservation, skim milk, sugars (eg, trehalose, sucrose, maltose or glucose, etc.), sugar alcohols (eg, to prevent a rapid decrease in activity during freeze-drying of the strain)
  • sugars eg, trehalose, sucrose, maltose or glucose, etc.
  • sugar alcohols eg, to prevent a rapid decrease in activity during freeze-drying of the strain
  • mannitol, inositol or sorbitol, etc. may be mixed with conventional preservatives used in the art and then freeze-dried.
  • any lyophilization method commonly used in the art can be used without particular limitation.
  • pill is meant to encompass small, round solid dosage forms containing multiparticulates mixed with binders and other excipients.
  • the term "syrup" means a thick homemade sugar or sugar substitute.
  • the syrup is an easy-to-take medicine with an unpleasant taste, such as a bitter taste, in a liquid form, and is particularly suitable for use by children.
  • the syrup may include, in addition to purified water and extract, sugar or a substitute for sugar used to give sweetness and viscosity, an antibacterial preservative, a flavoring agent, or a coloring agent, but is not limited thereto.
  • sweeteners examples include, but are not limited to, white sugar, mannitol, sorbitol, xylitol, aspartame, stevioside, fructose, lactose, sucralose, saccharin, or menthol.
  • injection refers to an aseptic preparation applied to the body through the skin or mucous membrane, and in particular, any form of administration such as subcutaneous injection, intramuscular injection, intradermal injection, and intraperitoneal injection may be used as an injection route. It is possible, and the dosage form is selected according to the characteristics of each pharmacologically active substance.
  • the composition of the present invention may be a composition for oral administration.
  • oral administration means that the active substance is administered to the gastrointestinal tract through the oral route for absorption.
  • Non-limiting examples of the formulation for oral administration include tablets, troches, lozenges, aqueous suspensions, oily suspensions, prepared powders, granules, emulsions, hard capsules, soft capsules, syrups or elixirs, and the like.
  • a binder such as lactose, saccharose, sorbitol, mannitol, starch, amylopectin, cellulose or gelatin; excipients such as dicalcium phosphate and the like; disintegrants such as corn starch or sweet potato starch; Lubricants such as magnesium stearate, calcium stearate, sodium stearyl fumarate, or polyethylene glycol may be used, and sweeteners, aromatics, syrups, and the like may also be used.
  • a liquid carrier such as fatty oil may be additionally used in addition to the above-mentioned materials.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be provided as an enteric-coated, enteric-coated preparation, particularly as a unit dosage form for oral use.
  • Enteric coating in the present specification includes all types of pharmaceutically acceptable known coatings that are not decomposed by gastric acid and the coating is maintained, but sufficiently decomposed in the small intestine so that the active ingredient can be released into the small intestine. do.
  • the "enteric coating” of the present invention is maintained for at least 2 hours when artificial gastric juice such as an HCl solution of pH 1 is brought into contact at 36°C to 38°C, preferably after that, a KH 2 PO 4 buffer solution of pH 6.8. Refers to coatings that disintegrate within 30 minutes in artificial intestinal juices such as
  • the enteric coating of the present invention is coated in an amount of about 16 to 30, preferably 16 to 20 or 25 mg or less per core.
  • the thickness of the enteric coating of the present invention is 5 to 100 ⁇ m, preferably 20 to 80 ⁇ m, satisfactory results are obtained as an enteric coating.
  • the material of the enteric coating is appropriately selected from known high molecular materials. Suitable polymeric materials are described in a number of well-known literature (L. Lachman et al., The Theory and Practice of Industrial Pharmacy, 3rd edition, 1986, pp. 365-373 H. Sucker et al., Pharmazeutician Technologie, Thieme, 1991, pp. 355-359; Hagers Handbuchder pharmazeutician fürtechnik, 4th edition, Vol. 7, pp.
  • cellulose ester derivatives cellulose ethers, methyl acrylate copolymers of acrylic resins and copolymers of maleic acid and phthalic acid derivatives may be included therein.
  • the enteric coating of the present invention can be prepared using a conventional enteric coating method in which an enteric coating solution is sprayed onto a core.
  • Suitable solvents used in the enteric coating process include alcohols such as ethanol, ketones such as acetone, and halogenated hydrocarbon solvents such as dichloromethane (CH 2 Cl 2 ), and a mixed solvent of these solvents may be used.
  • An emollient such as di(di)-n-butylphthalate or triacetin is added to the coating solution in a ratio of 1 to about 0.05 to about 0.3 (coating material to softener). It is appropriate to carry out the spraying process continuously and it is possible to adjust the amount of spraying taking into account the conditions of the coating.
  • the spray pressure can be varied, and satisfactory results are generally obtained with spray pressures of about 1 to about 1.5 bar.
  • the composition of the present invention may be a composition for parenteral administration.
  • parenteral administration means intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intradermal, intramuscular, spinal, intrathecal or rectal topical administration or injection.
  • Parenteral administration is by injecting a suppository preparation, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection or intrathoracic injection.
  • the composition may be mixed in water with a stabilizer or a buffer to prepare a solution or suspension, which may be prepared in a unit dosage form in an ampoule or vial.
  • the preferred dosage of the composition of the present invention depends on the condition and weight of the patient, age, sex, health condition, dietary constitution specificity, the nature of the preparation, the severity of the disease, the administration time of the composition, the administration method, the administration period or interval, the excretion rate, And the range may vary depending on the type of drug, and may be appropriately selected by a person skilled in the art. For example, it may be in the range of about 0.1 to 10,000 mg/kg, but is not limited thereto, and may be divided and administered once or several times a day.
  • a food composition means a natural product or a processed product containing one or more nutrients, and preferably means a product that can be eaten directly through a certain degree of processing process, as a conventional meaning.
  • foods, food additives, health functional foods, and functional beverages are examples of the food.
  • the food may be a health functional food.
  • the food composition or composition for food additives may be included in food effective in improving or preventing intestinal diseases.
  • the food composition of the present invention can be easily utilized as a main ingredient, supplementary ingredient, food additive, health functional food or functional beverage of food.
  • Foods to which the food or food additive composition according to the present invention can be added include, for example, various foods, beverages, chewing gum, tea, vitamin complexes, and functional foods.
  • food includes special nutritional food (eg, formula milk, infant food, baby food, etc.), processed meat product, fish meat product, tofu, jelly, noodles (eg, ramen, noodles, etc.), bread, health supplement food, seasoning Foods (eg, soy sauce, soybean paste, gochujang, mixed paste, etc.), sauces, confectionery (eg, snacks), candies, chocolates, chewing gum, ice cream, dairy products (eg, fermented milk, cheese, etc.), other processed foods, kimchi, It includes, but is not limited to, pickled foods (various types of kimchi, pickled vegetables, etc.), beverages (eg, fruit drinks, vegetable drinks, soy milk, fermented beverages, etc.), and natural seasonings (eg, ramen soup, etc.).
  • the food, beverage or food includes, but
  • the term “health functional food” refers to a food group or food composition that has added value so that the function of the food acts for a specific purpose by using physical, biochemical, or bioengineering methods, etc. It refers to food designed and processed to fully express the body's regulatory functions related to disease prevention and recovery.
  • the functional food may include food additives that are acceptable in food science, and may further include appropriate carriers, excipients, and diluents commonly used in the manufacture of functional foods.
  • the food containing the food composition of the present invention is various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, colorants and fillers (cheese, chocolate, etc.), pectins acids and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonating agents used in carbonated beverages, etc. and can be used.
  • the amount of the composition according to the present invention may be 0.001% to 100% by weight of the total weight of the food, preferably 1% to 99% by weight. %, and in the case of beverages, it may be included in a ratio of 0.001 g to 10 g, preferably 0.01 g to 1 g based on 100 mL, but for health and hygiene purposes or health control purposes In the case of long-term ingestion, it may be less than the above range, and the active ingredient may be used in an amount above the above range because there is no problem in terms of safety.
  • the food or food additive composition of the present invention may be prepared by adding the Lactobacillus acidophilus KBL402 strain and/or KBL409 strain to a pharmaceutically acceptable carrier, or in a composition suitable for consumption by humans or animals. That is, it can be added to and used in foods that do not contain other probiotic bacteria and foods that already contain some probiotic bacteria.
  • the additive for animal feed of the present invention may be in the form of a dry or liquid preparation, and may further contain other non-pathogenic microorganisms in addition to the Lactobacillus acidophilus strain KBL402 and/or the strain KBL409.
  • feed raw materials include various grains and soybean proteins, including peanuts, peas, sugar beets, pulp, grain by-products, and animal intestines.
  • Flour and fish meal powder may be used, and unprocessed or processed ones may be used without limitation.
  • the Lactobacillus acidophilus KBL402 strain with accession number KCTC 14640BP or the Lactobacillus acidophilus KBL409 strain with accession number KCTC 13518BP, a culture of the strain, a lysate of the strain, and the strain There may be provided a method for preventing or treating intestinal diseases comprising administering a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one selected from the group consisting of an extract of.
  • the Lactobacillus acidophilus KBL402 strain with accession number KCTC 14640BP or the Lactobacillus acidophilus KBL409 strain with accession number KCTC 13518BP in the preparation of a drug for preventing or treating intestinal diseases, the Lactobacillus acidophilus KBL402 strain with accession number KCTC 14640BP or the Lactobacillus acidophilus KBL409 strain with accession number KCTC 13518BP, the above
  • a composition comprising at least one selected from the group consisting of a culture of a strain, a lysate of the strain, and an extract of the strain may be provided.
  • a pharmaceutical composition comprising at least one selected from the group consisting of extracts of the intestinal disease prevention or treatment may be provided.
  • the Lactobacillus acidophilus KBL402 strain with accession number KCTC 14640BP or the Lactobacillus acidophilus KBL409 strain with accession number KCTC 13518BP, a culture of the strain, a lysate of the strain, and the strain There may be provided a method for improving or preventing intestinal disease comprising administering a food composition comprising at least one selected from the group consisting of extracts of.
  • Lactobacillus acidophilus KBL402 strain with accession number KCTC 14640BP or Lactobacillus acidophilus KBL409 strain with accession number KCTC 13518BP in the manufacture of food for improving or preventing intestinal diseases, Lactobacillus acidophilus KBL402 strain with accession number KCTC 14640BP or Lactobacillus acidophilus KBL409 strain with accession number KCTC 13518BP, the above
  • a composition comprising at least one selected from the group consisting of a culture of a strain, a lysate of the strain, and an extract of the strain may be provided.
  • the Lactobacillus acidophilus KBL402 strain with accession number KCTC 14640BP or the Lactobacillus acidophilus KBL409 strain with accession number KCTC 13518BP, a culture of the strain, a lysate of the strain, and the strain Improvement or prevention of intestinal diseases of the food composition containing at least one selected from the group consisting of extracts of may be provided.
  • the probiotic Lactobacillus acidophilus KBL402 (accession number KCTC 14640BP) strain according to the present invention includes a 16s rDNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 below.
  • the probiotic Lactobacillus acidophilus KBL409 (accession number KCTC 13518BP) strain according to the present invention includes a 16s rDNA sequence represented by SEQ ID NO: 2 below.
  • composition according to one embodiment of the present invention can reduce intestinal inflammation.
  • it can reduce inflammation of the large intestine, including the colon.
  • composition according to one embodiment reduces the expression of pro-inflammatory cytokines, increases the expression of anti-inflammatory cytokines, reduces myeloperoxidase (MPO) expression, induces regulatory T cells, , it may be to increase miRNA-107 expression or to decrease miRNA-146a, miRNA-155 or miRNA-223 expression.
  • MPO myeloperoxidase
  • the composition according to one embodiment can down-regulate pro-inflammatory immunomodulators, including pro-inflammatory cytokines and pro-inflammatory chemokines, and reduce their expression.
  • pro-inflammatory cytokines include IFN- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-4, IL-6, IL-17A and/or TNF, and the like
  • pro-inflammatory chemokines include: and chemokine (C-C motif) ligand 2 (CCL2) and chemokine C-X-C motif ligand 1 (CXCL1).
  • composition according to one embodiment reduces intestinal inflammation by reducing the expression of pro-inflammatory immunomodulators such as IFN- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-4, IL-6, IL-17A, TNF, CCL2, and CXCL1.
  • pro-inflammatory immunomodulators such as IFN- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-4, IL-6, IL-17A, TNF, CCL2, and CXCL1.
  • composition according to one embodiment can up-regulate anti-inflammatory cytokines and reduce their expression.
  • the composition according to one embodiment can reduce intestinal inflammation by increasing the expression of anti-inflammatory cytokines such as IL-10.
  • composition according to one embodiment can reduce the expression of myeloid cell type peroxidase and reduce intestinal inflammation.
  • composition according to one embodiment may induce expression of regulatory T cells (Tregs).
  • Tregs regulatory T cells
  • it can reduce intestinal inflammation by inducing the expression of CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells (Tregs).
  • composition according to one embodiment can increase miRNA-107 expression, thereby down-regulating pro-inflammatory cytokines and reducing their expression.
  • it may reduce expression of IL-6, IFN- ⁇ , TNF- ⁇ and/or TGF- ⁇ and reduce intestinal inflammation.
  • composition according to one embodiment may improve the relative intestinal distribution of beneficial bacteria.
  • composition of one embodiment can enhance the diversity of beneficial microflora in the gut.
  • the composition can enhance the relative intestinal distribution of one or more bacteria of the genus Akkermansia and bacteria of the genus Prevotella .
  • the composition may reduce the relative intestinal distribution of one or more bacteria of the genus Bacteroides and bacteria of the genus Mucispirillum .
  • Bacteria of the genus Akkermansia can induce Foxp3+ regulatory T cells and increase the expression of anti-inflammatory cytokines such as IL-10. Bacteria of the genus Prevotella can induce T regulatory cells and regulate the secretion of cytokines.
  • the relative intestinal distribution of bacteria of the genus Akkermansia and/or of the genus Prevotella improves, the relative intestinal distribution of bacteria of the genus Bacteroides and one or more of the bacteria of the genus Musspirillum decreases, and the relative intestinal distribution of beneficial bacteria can be improved.
  • composition of one embodiment can improve intestinal inflammation by improving the relative intestinal distribution of one or more bacteria of the genus Akkermansia and bacteria of the genus Prevotella.
  • Administration of the composition of one embodiment may reduce the concentration of various amino acids such as aspartic acid, cysteine, glutamine, glycine, serine and/or threonine in the intestine of a subject.
  • concentration of short chain fatty acids such as acetate, butyrate and/or propionate may be increased. This seems to be because the administration of the Lactobacillus acidophilus KBL402 strain or the KBL409 strain improves the balance and diversity of the intestinal microflora, thereby affecting the increase in the concentration of short-chain fatty acids.
  • the short-chain fatty acids described above may exhibit excellent effects in improving, preventing, and treating intestinal diseases by contributing to epithelial cell differentiation related to intestinal homeostasis, stimulating and inducing regulatory T cells, or improving mucosal inflammation.
  • the intestinal disease may be an inflammatory disease occurring in the large intestine or small intestine.
  • intestinal diseases include inflammatory bowel disease (IBD), Crohn's disease, ulcerative colitis, irritable bowel syndrome, enteritis, ischemic colitis, intestinal Behçet's disease, hemorrhagic rectal ulcer and/or ileocystitis. (pouchitis) and the like.
  • the bowel disease of one embodiment may be inflammatory bowel disease.
  • composition according to one embodiment of the present invention may also improve intestinal function.
  • the composition of one embodiment can ameliorate reduced intestinal function by ameliorating intestinal inflammation.
  • Lactobacillus acidophilus strains KBL402 and KBL409 were isolated from feces of healthy Koreans and cultured as described in a previous study, and the two strains were identified by 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing.
  • rRNA ribosomal RNA
  • Lactobacillus acidophilus KBL402 and KBL409 strains were cultured in Lactobacilli MRS Agar (BD Difco, Sparks, MD, USA) supplemented with 0.05% L-cysteine hydrochloride at 37° C. for 24 hours under anaerobic conditions. Bacterial cells were collected by centrifugation at 3000 rpm and washed twice with 1 ⁇ Phosphate-buffered saline (PBS) before use. The bacterial concentration was measured by the culture method, and the bacterial community containing 1 ⁇ PBS containing 20% glycerol was stored at -80 ° C until use.
  • PBS Phosphate-buffered saline
  • Lysates of each of the Lactobacillus acidophilus KBL402 and KBL409 strains were obtained by the following method. 1 mL of cell solution was put in a tube containing 0.2 mm zirconia beads, and disrupted by bead-beating at a beat frequency of 1/30 3 times for 5 minutes. The whole tube containing the lysate was centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes. Thereafter, only the supernatant was transferred, filtered through a 40 ⁇ m cell strainer, and then filtered twice through a 0.2 ⁇ m syringe filter to prepare a lysate.
  • Extracts of each of the Lactobacillus acidophilus KBL402 and KBL409 strains were obtained by the following method. 20 g (wet weight) of microbial cells were prepared, and the prepared cells were resuspended in 140 mL of 0.1 M sodium citrate buffer (pH 4.5). Cells suspended in the buffer were sonicated for 60 minutes using a water bath type sonicator. 140 mL of n-butanol was added to the sonicated sample and stirred for 1 hour. The mixed solution was centrifuged for 20 minutes at 10,000 g and 4° C. to separate the phases.
  • the organic solvent layer and aqueous solution layer obtained by phase separation were collected separately, and each was subjected to dialysis against pure water (2 kDa dialysis membrane, 4° C., 7 days). After dialysis, the solution was lyophilized to evaporate all solvents. The dried sample obtained after lyophilization was dissolved using 30 mL of ultrapure water, and filtered through a 0.2 ⁇ m syringe filter to obtain a strain extract.
  • a mouse colitis model using DSS is a useful tool to elucidate the efficacy and mechanisms of probiotics for the improvement of acute IBD.
  • mice Eight mice were used in each experimental condition. Mice were housed in air-conditioned cages with free access to drinking water and food on a 12-h light/dark cycle. In order to induce colitis, DSS (Dextran Sodium Sulfate, MW 36 000-50,000 Da; MP Biomedicals, LLC, Santa Ana, CA, USA) was dissolved in water to prepare a 2% by weight DSS solution, which was then administered to mice for 7 days. supplied.
  • DSS Extran Sodium Sulfate, MW 36 000-50,000 Da; MP Biomedicals, LLC, Santa Ana, CA, USA
  • Approximately 1 ⁇ 10 9 colony forming units of strain Lactobacillus acidophilus KBL402 or KBL409 were administered simultaneously with 200 ⁇ L of 1 ⁇ PBS by daily oral gavage.
  • the body weight and disease activity indices (DAI) of the mouse including information on weight change (%), stool concentration and bloody stool, were measured three times at each time point, and are described in Table 1 to be described later.
  • mice After 8 days of Lactobacillus acidophilus treatment, all mice were sacrificed, and caecal weight and colon length of the mice were measured. Colon, feces and cecal samples were immediately stored at -80°C for future use.
  • the collected colon was divided into two parts: proximal and distal colon.
  • Distal segments were fixed with 10% formaldehyde and stained with hematoxylin and eosin. Histological scores of distal segments were examined using Panoramic Viewer (3DHISTECH, Ltd, Budapest, Hungary).
  • Histological scores were scored from 0 to 12 for the following four categories.
  • Colon samples were weighed using a MM 400 Mixer Mill homogenizer (Retsch, GmbH, Haan, Germany) in 1 ⁇ RIPA buffer (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) and Halt Protease Inhibitor Cocktail (Thermo Fisher Scientific). was homogenized.
  • Cytokines including IFN- ⁇ , IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A and tumor necrosis factor (TNF), were measured in BD cytometric bead array mouse Th1/Th2/Th17 cytokines. Measurements were made using the Cain kit (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • Cytokine IL-1 ⁇ in colon samples was measured using the Murine IL-1 ⁇ Mini ABTS ELISA development kit (#900-M47; PeproTech, RockyHill, NJ, USA).
  • C-C motif chemokine ligand 2 (CCL2) and C-X-C motif chemokine ligand 1 (CXCL1) were detected using JE/MCP-1 (CCL2) and CXCL1 Mini ABTS ELISA development kits (#900-M126 and #900-M127; PeproTech), respectively.
  • T regulatory cells Flow cytometric analysis of T regulatory cells (Tregs) was performed as follows. First, mesenteric lymph node (MLN) samples were carefully ground on wet slides to reduce friction and filtered using a cell strainer (70 ⁇ m pore size, SPL Life Science Co., Ltd, Pocheon-si, Gyeonggi-do, Korea). To confirm cell viability, T cells were stained using fixable viability stain 510 (FVS510; BD Biosciences).
  • RNA ( ⁇ 200 nucleotides) fractions were extracted from distal colon samples using the miRNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Germany) according to the manufacturer's instructions.
  • RNA samples were then quantified using the Nanodrop ® ND 1000 (Thermo Fisher Scientific), and 500 ng RNA samples were reverse transcribed using the miScript II RT kit (Qiagen).
  • miRNA-107 miRNA-107 (MS00023961), miRNA-146 (MS00001638), miRNA-155 (MS00001701) and miRNA-223 using QuantiTects SYBR green PCR master mix (Qiagen), miScript universal primers (Qiagen) and miScript primer assay (Qiagen) (MS00001960) complementary DNA (2 ng) was amplified.
  • PCR reactions were performed using a real-time PCR system (Applied Biosystems) under the following conditions: after initial denaturation at 95 °C for 15 min, followed by 94 °C for 15 sec, 55 °C for 30 sec and 72 °C for 30 sec. 40 cycles were performed. miRNA expression was normalized using small nuclear RNA (snRNA) and C/D box 95 (Qiagen).
  • snRNA small nuclear RNA
  • C/D box 95 Qiagen
  • Amino acids were identified using AA-S-19 assay standard mixture (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Data collection and quantification was performed using MassLynx software 4.1 (Waters Corporation).
  • Cecal samples were homogenized in distilled water and centrifuged at 13,000 g for 5 minutes. The supernatant was collected and 1% of 2-methylpentanoic acid was added to the supernatant as an internal standard. Ethyl ether was used as an extraction solvent.
  • the organic layer of the sample was measured using an Agilent 7890A gas chromatograph (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) under the following conditions: 1.5 kV capillary voltage, 600 L/h desolvation gas flow, 50 L/h cone ) gas flow, 170°C oven temperature and 225°C (flame ionization detector and injection port temperature). Nitrogen was used as a carrier gas. Retention times and peak areas of the samples were confirmed using standard mixtures.
  • the experimental group was administered KBL402 strain and KBL409 strain together with DDS, respectively, water and PBS were administered to the negative control group, and DSS and PBS were administered to the positive control group.
  • FIG. 1 is a graph showing Rarefaction plots of an experimental group and a control group.
  • 2 is a graph showing a principal component analysis (PCA) plot using the weighted UniFrac distances of the experimental group and the control group.
  • Figure 3 is a graph showing the taxonomic composition of caecal microorganisms in the experimental group and the control group.
  • 4 is a graph that clearly shows the significantly different microbial populations between the experimental and control groups using a linear discriminant analysis (LDA) effect size (LEfSe) analysis. (threshold > 3.0)
  • FIG. 5 is a heat map of the Spearman correlation between the relative abundance of genus-level taxa and specific metabolites in the experimental and control groups. In Fig. 5, the color of the matrix represents the degree of correlation between the taxon and the metadata variable, and * marks indicate statistical significance ( * , P ⁇ 0.05; ** , P ⁇ 0.01).
  • mice After 7 days of DSS treatment, the mice showed clinical symptoms such as weight loss, diarrhea and rectal bleeding, and it was confirmed that the colon was seriously damaged. However, referring to Table 1 and FIG. 4, it was confirmed that colitis symptoms of mice treated with Lactobacillus acidophilus KBL402 or KBL409 were significantly reduced. It is confirmed that the DAI score after 8 days of treatment in DSS + KBL402-treated and DSS + KBL409-treated mice is reduced compared to the DAI score after 8 days in DSS + PBS-treated mice.
  • DSS + KBL402 treated and DSS + KBL409 treated mice also showed significantly longer colon length and lower histological scores when compared to those of DSS + PBS treated mice.
  • mice with DSS-induced colitis are treated with Lactobacillus acidophilus strain KBL402 and KBL409, anti-inflammatory effects are achieved in intestinal diseases, which can be usefully used for improvement, prevention, and treatment of intestinal diseases explain in detail.
  • Lactobacillus acidophilus treatment was found to significantly affect the overall downregulation of Th1-, 2- and 17-related cytokines in mice with DSS induced colitis.
  • pro-inflammatory cytokines are up-regulated, but when mice with DSS-induced colitis are treated with Lactobacillus acidophilus KBL402 strain and KBL409 strain, it is confirmed that pro-inflammatory cytokines are down-regulated. From this, it can be confirmed that the treatment of the Lactobacillus acidophilus KBL402 strain and the KBL409 strain shows an excellent anti-inflammatory effect in a subject with intestinal disease by regulating the secretion of inflammatory cytokines and inflammation-related molecules.
  • CCL2 is an important pro-inflammatory chemokine mainly produced by macrophages
  • CXCL1 is a major chemokine involved in the recruitment and activation of neutrophils.
  • MPO is an important indicator of neutrophil infiltration. High levels of CCL2, CXCL1 and MPO were highly correlated with increased leukocyte infiltration.
  • mice with DSS-induced colitis showed a significant decrease in MPO levels. Therefore, it is confirmed that IBD can be improved, prevented and treated when treated with Lactobacillus acidophilus.
  • mice with DSS-induced colitis using Lactobacillus acidophilus treatment 2-3. Regulatory T cell differences in mice with DSS-induced colitis using Lactobacillus acidophilus treatment
  • mice with DSS-induced colitis were treated with Lactobacillus acidophilus, the effect of inducing T regulatory cells in mesenteric lymph nodes was confirmed.
  • CD4+ CD25+ Foxp3+ T regulatory cells are found to be significantly higher in the mesenteric lymph nodes of DSS + KBL409 treated mice than in the mesenteric lymph nodes of DSS + PBS treated mice. Through this, it was confirmed that when the Lactobacillus acidophilus KBL402 strain and the KBL409 strain are treated, T regulatory cells such as CD4+CD25+Foxp3+ are induced in the lymph nodes and can be usefully used for the improvement, prevention, and treatment of intestinal diseases.
  • miRNA expression is closely related to various important biological processes such as cell differentiation, proliferation, apoptosis, tumorigenesis, and apoptosis.
  • miRNA-107 is closely related to the downregulation of IL-6, IFN- ⁇ , TNF- ⁇ and TGF- ⁇ promotion, and miRNA-146a can inhibit various intestinal barrier or inflammatory genes within immune-related signaling pathways. there is.
  • miRNA-146a knockout mice show resistance to ulcerative colitis.
  • miRNA-155 or miRNA-223 is known to be a regulator of macrophages, various immune cells including Th1 and Th17 or inflammasome complex and IL-1 ⁇ production, and both miRNAs are increased in inflammatory conditions such as IBD. can do.
  • microRNA miRNA
  • miRNA-107 was significantly higher in DSS + KBL409 treated mice compared to DSS + PBS treated mice.
  • miRNA-146a expression was lower in DSS + KBL409 treated mice than in DSS + PBS treated mice.
  • the expression levels of miRNA-155 and miRNA-223 were significantly lower in DSS + KBL402 treated mice compared to DSS + PBS treated mice.
  • the KBL402 strain and the KBL409 strain show an effect in the treatment of colitis through the regulation of miRNAs closely related to host inflammation, and it was confirmed that they can be usefully used for the improvement, prevention, and treatment of intestinal diseases.
  • Lactobacillus acidophilus KBL402 strain and the KBL409 strain can be usefully used to improve, prevent, and treat intestinal diseases.
  • metabolites including amino acids and short chain fatty acids were identified in the caecum of mice with DSS-induced colitis.
  • the genus Lactobacillus in DSS + KBL402 treated mice showed a significant correlation with acetate, and the genus Prevotella in DSS + KBL409 treated mice also showed negative correlations with glycine and aspartic acid.
  • Amino acids are important precursors of short-chain fatty acids, mainly produced by the gut microbiota.
  • Short-chain fatty acids such as acetate, butyrate, and propionate contribute to various processes related to intestinal homeostasis, such as epithelial cell differentiation, regulatory T cell stimulation, and improvement of mucosal inflammation, while showing effects in preventing and treating IBD.
  • Butyrate is also a major energy source for the epithelium and can exert beneficial effects on intestinal diseases such as ulcerative colitis because it can extensively induce regulatory T cells.

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Abstract

본 발명은 기탁번호 KCTC 14640BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 또는 기탁번호 KCTC 13518BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL409 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하며, 장 질환의 개선, 예방 또는 치료에 우수한 효과를 나타내는 조성물을 제공한다.

Description

락토바실러스 애시도필러스 KBL402 또는 KBL409 균주를 포함하는 장 질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 또는 KBL409 균주를 포함하는 장 질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 대한 것으로, 더 상세하게는 신규한 프로바이오틱인 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 또는 KBL409 균주, 이의 배양물, 파쇄물 및 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 장 질환 개선 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 식품용 조성물 또는 동물 사료용 조성물에 관한 것이다.
염증성 장질환(Inflammatory bowel disease, IBD)은 대장 및 소장의 점막에서 만성적인 염증 또는 궤양이 발생하는 질병이다. 선진국에서 염증성 장질환의 발병률이 증가하고 있는데, 염증성 장질환을 가진 대상체에서는 통증, 구토, 설사 및 혈변과 같은 증상이 장기간 계속되어 대상체에게 큰 불편이 초래되며 삶의 질이 크게 떨어진다.
특히, 연간 염증성 장질환 환자의 0.5% 내지 20%에서 대장암의 위험이 증가하는 심각한 합병증이 동반된다. 따라서, 적기에 치료가 필수적이다. 그러나, 염증성 장 질환은 재발이 반복되고 치료가 어려운 난치병으로, 뚜렷한 발병 원인이 밝혀지지 않고 있으며, 아직까지 염증성 장질환(IBD)을 근본적으로 치료할 수 있는 약제는 개발되지 못한 실정이다.
염증성 장질환에 대해 비정상적인 면역 반응과 염증 반응을 억제하기 위한 치료법으로서 설파살라진, 코르티코 스테로이드, 아자트리오핀과 같은 면역억제제나 또는 항-TNF-α 항체로 대표되는 생물학적 제제를 사용할 수 있다. 그러나 장기간의 치료 기간 동안 이들 약제와 관련된 많은 부작용이 발생할 수 있고, 재발률 또한 매우 높다. 예를 들어 설파살라진은 대장염을 악화시켜 설사, 복부 경련 및 복부 불쾌감을 유발할 수 있다. 항생제 또한 염증성 장 질환에 일반적으로 사용되는 치료법 가운데 하나이지만, 이는 병원균 뿐만 아니라 인간의 건강에 매우 중요한 장내 유익균도 함께 사멸시키는 부작용이 있다. 또한, 항생제로 인한 장내 미생물의 피해는 수 년이 지나도 쉽게 회복되지 않고, 고혈압, 당뇨, 아토피 등 만성질환으로 이어지는 부작용이 발생할 수 있다.
또한, 이러한 약물들은 면역작용을 억제하는 기전으로 작용하기 때문에 장기복용도 어렵고, 장기간 투여 시 구역, 구토, 소화불량, 식욕부진, 두통 뿐만 아니라 과민 반응에 의한 백혈구 감소증, 피부 발진, 발열, 췌장염, 간염, 용혈성 빈혈, 골수 억제 등의 부작용이 초래될 수 있다.
특히, 약물치료 중에도 합병증에 의한 장 손상이 발생하여 70% 이상의 환자가 1회 이상 수술을 받고 있는 실정이다. 따라서, 부작용을 유발하지 않고, 효과적인 염증성 장질환의 치료를 위한 치료제의 개발이 요구되고 있다.
최근, 여러 가지 연구에서 장내 유익 미생물과 유해 미생물의 불균형이 염증성 장질환의 중요한 병인 가운데 하나로 인식되면서, 염증성 장질환에 대한 치료 효과를 향상시킬 수 있는 프로바이오틱 조성물을 개발하는데 많은 연구가 진행되고 있다.
프로바이오틱스(probiotics)는 장내 미생물 균형에 도움을 주는 항균 활성과 효소 활성을 가진 미생물 및 위 미생물이 생산하는 생산물을 말한다. 아울러 프로바이오틱스는 건조세포나 발효산물 형태로 사람이나 동물에 공급되어, 장내 균총을 개선하는 단일 또는 복합 균주 형태의 생균으로 정의되고 있다. 프로바이오틱스가 갖추어야 할 특성은 인간의 장내를 서식지로 하고, 비병원성, 무독성의 특성을 가지며, 장으로 가는 동안 살아 남아야 한다. 더 나아가 전달 식품 안에서 소비되기 전에 생존율과 활성을 유지하고, 감염 예방으로 사용되는 항생제에 대해 민감해야 하며, 항생제 내성을 갖는 플라스미드를 보유하지 않아야 한다. 또한, 장내 환경에서 산, 효소, 담즙에 대한 내성을 갖추어야 한다. 최근 프로바이오틱스는 다양한 건강 기능 개선 효과가 보고되면서 기존 화합물에 기초한 치료제를 대체할 수 있는 주요한 치료 물질로 각광받고 있다.
최근 다양한 연구를 통해 건강한 장내 미생물 군집은 영양 및 대사, 면역 반응 조절에 중요한 역할을 하며, 장내 미생물의 불균형은 비만, 제2형 당뇨, 염증성 장질환, 심혈관계 합병증 등 다양한 질병에 관여하는 것으로 보고되었다.
이에 본 발명자들은, 종래 만족할 만한 치료법이 없는 염증성 장 질환을 비롯한 장 질환의 치료를 위해 프로바이오틱스 연구에 매진하였고, 그 결과, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus Acidophilus) 균주가 장 염증 감소 측면 및 장내 유익 미생물 총의 다양성 증대에서 탁월한 효과를 나타내어, 장 질환의 개선, 예방 또는 치료에 유용함을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 장 질환의 개선, 예방 또는 치료에 우수한 효과를 보이는 락토바실러스 애시도필러스 균주를 포함하는 조성물을 제공하는 것을 일 목적으로 한다.
본 발명의 일 목적은, 기탁번호 KCTC 14640BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 또는 기탁번호 KCTC 13518BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL409 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 장 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 목적은, 기탁번호 KCTC 14640BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 또는 기탁번호 KCTC 13518BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL409 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 장 질환 개선 또는 예방용 식품 조성물; 또는 장 건강 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 목적은, 기탁번호 KCTC 14640BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 또는 기탁번호 KCTC 13518BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL409 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 동물사료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 락토바실러스 애시도필러스 KBL402(기탁번호 KCTC 14640BP) 및 KBL409(기탁번호 KCTC 13518BP) 균주는 장 염증을 감소시키고, 장내 유익 미생물 층의 다양성을 향상시킬 수 있다. 따라서, 장 질환의 개선, 예방 또는 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 실험군 및 대조군의 Rarefaction 플롯을 도시한 그래프이다.
도 2는 실험군 및 대조군의 가중 UniFrac 거리를 사용한 주성분 분석(Principal component analysis; PCA) 플롯을 도시한 그래프이다.
도 3은 실험군 및 대조군에서 맹장 미생물이 분류학적 구성을 도시한 그래프이다.
도 4는 선형 판별 분석 (LDA) 효과 크기 (LEfSe) 분석을 사용하여 실험군 및 대조군 사이의 현저하게 상이한 미생물 군들을 명확히 보인 그래프이다. (임계값 > 3.0)
도 5는 실험군 및 대조군의 속 수준 분류군의 상대적 풍부도와 특정 대사 산물 간의 스피어만 상관 관계에 대한 히트(heat)맵을 도시한 도면이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 기탁번호 KCTC 14640BP인 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus Acidophilus) KBL402 균주 또는 기탁번호 KCTC 13518BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL409 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 장 질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 조성물은 장 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 장 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물 또는 동물 사료용 조성물을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 “및/또는”은 복수의 구성 요소로부터 도출되는 모든 구성의 조합을 지칭하는 용어로 사용된다.
본 발명의 조성물은 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 또는 락토바실러스 애시도필러스 KBL409 균주 외에 다른 균주를 더 포함할 수 있으며, 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 및 락토바실러스 애시도필러스 KBL409 균주를 모두 포함할 수 있음은 물론이다.
본 발명의 조성물에서 균주는 생균의 균체, 사균의 균체 및 건조 균주의 형태, 이들의 배양물, 이들의 파쇄물 또는 이들의 추출물의 형태로 포함될 수 있다.
본 명세서에서 용어, “배양물”은 균주를 공지의 배지에서 배양시켜 수득한 산물을 의미하여, 상기 산물은 균주 자체를 포함할 수 있다. 상기 배지는 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 선택될 수 있으며, 예를 들어 MRS 액체 배지, GAM 액체 배지, MRS 한천 배지, GAM 한천 배지, BL 한천 배지일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 용어, “파쇄물”은 균주를 효소 처리, 균질화 또는 초음파 처리 등으로 파괴하여 얻은 임의의 산물을 의미한다.
또한, 본 명세서에서 용어, “추출물”은 균주를 공지의 추출 용매로 추출하여 수득한 산물을 의미한다. 본 발명에서, "추출물"은 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 및/또는 KBL409 균주의 물 추출물 및/또는 유기용매 추출물을 포함한다.
본 발명에서, KBL402 균주 및/또는 KBL409 균주의 유기용매 추출물은 탄소수 1 이상 10 이하의 유기용매 추출물일 수 있다. 예를 들어, 탄소수 1 이상 10 이하, 탄소수 1 이상 5 이하, 또는 탄소수 1 이상 3 이하의 치환 또는 비치환된 알코올 추출물 등이 추출 용매로 사용될 수 있다. 예를 들어, 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, iso-프로판올 추출물, n-프로판올 추출물, n-부탄올 추출물, iso-부탄올 추출물, tert-부탄올 추출물 및/또는 페놀 추출물과 같은 알코올 추출물; 디메틸에테르, 디에틸에테르, 메틸에틸에테르와 같은 디알킬에테르 등의 에테르 추출물; n-헥산, 아세트산에틸, 디클로로메탄, 클로로포름 및/또는 아세톤 추출물을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 용어, “생균의 균체”는 본 발명의 균주 그 자체를 의미하고, “사균의 균체”는 가열, 가압 또는 약물 처리 등으로 살균 처리된 균주를 의미한다.
본 발명의 조성물은 담체 혹은 매체와 같은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제가 추가로 조합 가능한 조성물로 제공될 수 있다. 본 발명에서 이용되는 첨가제는 용매, 분산제, 코팅, 흡수 촉진제, 제어 방출제(즉, 서방제), 및 1종 이상의 불활성 부형제(전분, 폴리올, 과립제, 극미세 셀룰로스(microfine cellulose), 미세결정형 셀룰로스(예컨대, 셀피어, 셀피어 비즈(Celphere beads), 희석제, 윤활제, 결착제(binder), 붕해제 등을 포함함) 등을 포함할 수 있다. 필요한 경우, 개시된 조성물의 정제 제형은 표준 수성 혹은 비수성 수법에 의해 코팅될 수도 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체 및 약제학적으로 허용가능한 불활성 담체로서 이용하기 위한 부형제 그리고 상기 추가의 성분의 비제한적인 예로는, 결착제, 충전제, 붕해제, 윤활제, 항미생물제 및 코팅제를 들 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 약제학적 조성물에 포함되는 첨가제의 함량은 특별히 제한되는 것은 아니며 통상의 제제화에 사용되는 함량 범위 내에서 적절하게 조절될 수 있다.
본 명세서에서 용어 “개선”은 질환이 치료되지는 않지만 증상의 정도가 감소되는 것 및 특정 기능이 향상되는 것을 포함하는 의미로 사용된다.
본 명세서에서, 용어 “예방”은, 질병, 장애 또는 질환의 발병을 지연시키는 것을 포함하는 의미로 사용된다.
본 명세서에서, 용어 “치료”란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 포함하는 의미로 사용된다. 따라서, 치료가 필요한 대상체에 있어서 질환의 치료 또는 치료 요법은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:
(1) 질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,
(2) 질환의 확산을 예방함,
(3) 질환을 경감시킴,
(4) 질환의 재발을 예방함, 및
(5) 질환의 증상을 개선함
본 발명에서, 치료가 필요한 대상체는 동물일 수 있다. 예를 들어, 전형적으로 본 발명의 조성물 이용하여 유익한 효과를 나타낼 수 있는 포유 동물이다. 이러한 대상체의 바람직한 예에는 인간과 같은 영장류가 포함된다. 또한 이와 같은 대상체들에는 장 질환 증상을 갖거나 이와 유사한 증상을 가질 위험이 있는 대상체들이 모두 포함된다.
본 발명의 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 액제, 현탁제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 엑스제, 에멀젼, 시럽제, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 피내, 근육 내, 척추, 척추강 또는 직장 내 국소 투여 또는 주입 등을 포함한 다양한 경로를 통해 비경구 투여될 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 투여 기간 또는 간격, 배설율, 체질 특이성, 제제의 성질, 질환의 중증 등에 따라 그 범위가 다양할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 “액제”는, 의약품을 물 또는 유기 용매에 용해한 물약 상태로 먹는 약을 의미한다. 액제는 현탁제 또는 고형제에 비하여 장관에서의 전신 순환계로의 약물 흡수가 보다 효과적인 이점을 지니며, 상기 액제는 의약품 외에도 부가적인 용질도 포함할 수 있으며, 색깔, 냄새, 감미 혹은 안정성을 주는 첨가제도 포함할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 “현탁제'는, 알기네이트 함유 조성물의 요망되는 용해도 및/또는 분산도를 제공할 수 있는, 즉, 실질적으로 투명하며 침강 및 덩어리가 없는 수성 제제를 제공할 수 있는 어떠한 작용제를 의미한다.
본 명세서에서 용어 “산제(powder)”는, 잘게 분할된 약물, 화학물질 또는 양자의 건조상태의 혼합물을 의미한다. “산제”는 동결건조상태의 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 산제는 동결건조 균주 및 동결건조 보존제와 같은 동결건조 제형에서 사용되는 통상의 첨가제를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 “과립제”는, 의약용 또는 의약품의 혼합물을 입상으로 한 것으로, 보통 4.76 내지 20 ㎜의 체를 통과하는 범위의 것을 말한다. 과립은 일반적으로 분말, 또는 분말 혼합물을 적셔서 그 덩어리를 필요로 하는 과립의 크기에 따라 적당한 메쉬 사이즈의 체 또는 과립기를 통과시킴으로써 생성한다. 과립제 역시 산제와 마찬가지로, 입자 상태이기 때문에 약물이 혀에 닿는 정도가 커서, 쓴맛을 가지는 약물을 과립제 형태로 사용할 경우에는, 환자, 특히 어린이나 노약자에게는 불편함을 야기할 수 있다.
본 명세서에서 용어 “정제”는, 분말상의 의약품을 작은 원판 모양으로 압축하여 복용하기 쉽게 만든 것을 의미한다. 정제는 나정, 필름 코팅정, 당의정, 다층정, 유핵정, 내핵정, 구강붕해정, 츄어블정, 발포정, 분산정, 용해정 등이 포함될 수 있다.
본 명세서에서 용어 “캡슐제”는, 의약품을 액상, 현탁상, 물상, 분말상, 과립상, 미니정제 또는 펠렛 등의 형태로 캡슐에 충전하거나 캡슐기제로 피포 성형하여 만든 것을 의미한다.
예를 들어, 일 실시예에 따른 약제학적 조성물은 동결건조된 균주를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일 실시예의 약제학적 조성물은 동결건조된 균주를 캡슐제의 형태로 제형화 할 수 있다. 일 실시예의 조성물이 동결건조 형태의 균주를 포함할 경우, 열로 인해 발생할 수 있는 KBL693 균주의 손실을 최소화하여 균주의 저장 기간을 향상시킬 수 있다. 또한, 균주의 생물학적 활성이 비활성화되어 제제 안정성이 향상될 수 있고, 다른 제형화 방법보다 균주의 재수화를 쉽게 유도하여 건조 균주에 수분 공급 후 고유한 활성 및 성장 능력이 신속히 회복될 수 있다. 또한, 동결 건조 제제는 타정 및 캡슐화 등의 제형화가 용이하여 다양한 제형으로 제조가 가능하다. 또한 균주 제제와 같은 LBP(Live Biotherapeutic Products)에서 가장 중요한 특징인 재생(regeneration)이 매우 안정적으로 진행될 수 있다.
일 실시예에서, 균주를 동결전조하여 제형화 할 경우 균주의 동결건조 시 급격한 활성 저하를 방지하기 위해 스킴밀크, 당류(예를 들어, 트레할로스, 수크로오스, 말토오스 또는 글루코오스 등), 당알코올류(예를 들어 만니톨, 이노시톨 또는 소르비톨 등) 등 당 기술 분야에서 사용되는 통상적인 보존제와 혼합 후 동결 건조될 수 있다. 그러나, 당 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 동결건조 방법이라면 특별한 제한 없이 사용될 수 있음은 물론이다.
본 명세서에서 용어 “환제”는, 결합제 및 기타 부형제와 혼합된 복합입자를 포함하는 작고 둥근 고체 투여형을 포괄하는 의미이다.
본 명세서에서 용어 “시럽제”는, 설탕 또는 설탕대용제의 농조한 수제를 의미한다. 본 발명에서 상기 시럽제는, 불쾌한 맛, 예컨대 쓴맛이 있는 의약품을 액제로 하여 복용하기 쉽게 한 것으로, 특히 어린이들이 복용하기에 적합한 제형이다. 본 발명에서 상기 시럽제는 정제수 및 추출물 외에 사당 또는 감미와 점성을 주기 위하여 쓰이는 사당의 대용약품, 항균성 보존제, 착미제 향료(flavor), 또는 착색제 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 시럽제에 포함될 수 있는 감미제의 예로는 백당, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 아스파탐, 스테비오사이드, 과당, 유당, 수크랄로스, 사카린 또는 멘톨 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 “주사제”는, 피부 내 또는 피부 혹은 점막을 통하여 체내에 적용하는 무균의 제제를 의미하며, 특히 주사제 투여 경로로는 피하 주사, 근육 주사, 피내 주사 및 복강 주사 등 어느 투여 형태도 가능하고, 투여 형태는 각각의 약리활성 물질의 특성에 의해서 선택된다.
일 실시예에서, 본 발명의 조성물은 경구 투여용 조성물일 수 있다. 본 명세서에서 용어 “경구 투여”는, 활성물질이 흡수를 위해 경구를 통해 위장기관으로 투여되는 것을 의미한다. 상기 경구 투여용 제제의 비제한적인 예로는, 정제, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭실제 등을 들 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴 푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 윤활유 등을 사용할 수 있으며, 감미제, 방향제, 시럽제 등도 사용할 수 있다. 나아가 캡슐제의 경우에는 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 특히, 경구용 단위 제형으로서 장용 피복된 장용성 제제로서 제공될 수 있다. 본 명세서에서의 "장용 피복"은 위산에 의해서는 분해되지 아니하여 피복이 유지되나, 소장에서는 충분히 분해되어 활성 성분이 소장내에 방출될 수 있도록 하는, 약제학상 허용 가능한 모든 종류의 공지의 피복을 포함한다. 본 발명의 "장용 피복"은 pH 1의 HCl 용액과 같은 인공 위즙을 36℃ 내지 38℃에서 접촉시킬 때, 2시간 이상 동안 그대로 유지되며, 바람직하게는 이후에 pH 6.8의 KH2PO4 완충 용액과 같은 인공 장즙에서 30분 이내에 분해되는 피복을 지칭한다.
본 발명의 장용 피복은 1개의 코어(core)에 약 16 내지 30, 바람직하게는 16 내지 20 또는 25 mg 이하의 양으로 피복된다. 본 발명의 장용 피복의 두께가 5 내지 100 ㎛, 바람직하게는 20 내지 80 ㎛인 경우가 장용 피복으로서 만족스러운 결과를 나타낸다. 장용 피복의 재료는 공지의 고분자 물질들 중에서 적당히 선택된다. 적당한 고분자 물질은 다수의 공지 문헌(L. Lachman 외, The Theory and Practice of Industrial Pharmacy, 3판, 1986, pp. 365∼373 H.Sucker 외, Pharmazeutische Technologie, Thieme, 1991, pp. 355~359; Hagers Handbuchder pharmazeutischen Praxis, 4판, Vol. 7, pp. 739∼742, 및 766∼778, (SpringerVerlag, 1971); 및 Remington's Pharmaceutical Sciences, 13판, pp. 1689∼1691 (Mack Publ., Co., 1970))에 열거되어 있고, 셀룰로즈 에스테르 유도체, 셀룰로즈 에테르, 아크릴 수지의 메틸아크릴레이트 공중합체 및 말레산 및 프탈산 유도체의 공중합체가 이들에 포함될 수 있다.
본 발명의 장용 피복은 장용 피복 용액을 코어에 분무하는 통상적인 장용 피복법을 사용하여 제조될 수 있다. 장용 피복 공정에 사용되는 적당한 용매로는 에탄올과 같은 알콜, 아세톤과 같은 케톤, 다이클로로메탄(CH2Cl2)과 같은 할로겐화 탄화수소 용매이며 이들 용매들의 혼합 용매가 사용될 수도 있다. 디(di)-n-부틸프탈레이트 또는 트리아세틴과 같은 연화제를 1 대 약 0.05 내지 약 0.3 (코팅 재료 대 연화제)의 비율로 피복 용액에 첨가한다. 분무 과정을 연속적으로 수행하는 것이 적절하며 피복의 조건을 고려하여 분무량을 조절하는 것이 가능하다. 분무압은 다양하게 조절할 수 있고, 일반적으로 약 1 내지 약 1.5 바(bar)의 분무압으로 만족할만한 결과가 얻어진다.
본 발명의 조성물은 비경구 투여용 조성물일 수 있다. 본 명세서에서 용어 “비경구 투여”는, 정맥 내, 복강 내, 피하, 피내, 근육 내, 척추, 척추강 또는 직장 내 국소 투여 또는 주입하는 것을 의미한다. 비경구 투여는 좌약기제, 피하주사제, 정맥 주사제, 근육 내 주사제 또는 흉부 내 주사제를 주입하는 방법에 의한다. 이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이 체질 특이성, 제제의 성질, 질병의 정도, 조성물의 투여 시간, 투여 방법, 투여 기간 또는 간격, 배설율, 및 약물 형태에 따라 그 범위가 다양할 수 있으며, 이 분야 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예컨대, 약 0.1 내지 10,000 mg/kg의 범위일 수 있으나 이제 제한되지 않으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여될 수 있다.
본 발명에서, 식품 조성물이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 건강기능식품 및 기능성 음료를 모두 포함하는 것을 말한다. 예를 들어, 식품은 건강 기능 식품일 수 있다.
상기 식품 조성물 또는 식품 첨가용 조성물은 장 질환 개선 또는 예방에 효과가 있는 식품에 포함될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물은 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 건강기능식품 또는 기능성 음료 등으로 용이하게 활용될 수 있다.
본 발명에 따른 식품 또는 식품 첨가용 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스낵류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
본 명세서에서 용어 “건강 기능 식품”이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
나아가 상기 기술한 것 이외에 본 발명의 식품 조성물을 포함하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 또는 식품 첨가용 조성물을 포함하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001 중량% 내지 100 중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 1 중량% 내지 99 중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100 mL를 기준으로 0.001 g 내지 10 g, 바람직하게는 0.01 g 내지 1 g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 또는 식품 첨가용 조성물은 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 및/또는 KBL409 균주를 약제학적으로 허용 가능한 담체에 첨가하거나, 인간 또는 동물이 섭취하기에 적합한 조성물 형태로 제조될 수 있다. 즉, 다른 프로바이오틱 세균을 함유하지 않은 식품 및 이미 몇 가지의 프로바이오틱 세균을 함유한 식품에 첨가되어 사용될 수 있다.
본 발명의 동물 사료용 첨가제는 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 및/또는 KBL409 균주 이외에 비병원성의 다른 미생물을 더 포함할 수도 있다.
본 발명의 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 및/또는 KBL409 균주를 동물 사료용 첨가제로 사용함에 있어서, 사료용 원료로는 각종 곡물 및 대두 단백을 비롯한 땅콩, 완두콩, 사탕무우, 펄프, 곡물 부산물, 동물 내장 가루 및 어분 가루 등이 사용될 수 있으며, 이들은 가공되지 않거나 또는 가공된 것을 제한없이 사용할 수 있다.
위에서 설명한 약제학적 조성물, 식품 조성물 및 동물 사료용 조성물 중 어느 한 조성물에 대한 설명은, 모순되지 않는 한 다른 조성물에 대한 설명에도 동일하게 적용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 기탁번호 KCTC 14640BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 또는 기탁번호 KCTC 13518BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL409 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 장 질환의 예방 또는 치료 방법이 제공될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 장 질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조에 있어서 기탁번호 KCTC 14640BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 또는 기탁번호 KCTC 13518BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL409 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물의 용도가 제공될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 기탁번호 KCTC 14640BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 또는 기탁번호 KCTC 13518BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL409 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 약제학적 조성물의 장 질환 예방 또는 치료 용도가 제공될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 기탁번호 KCTC 14640BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 또는 기탁번호 KCTC 13518BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL409 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 식품 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 장 질환의 개선 또는 예방 방법이 제공될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 장 질환의 개선 또는 예방용 식품의 제조에 있어서 기탁번호 KCTC 14640BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 또는 기탁번호 KCTC 13518BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL409 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물의 용도가 제공될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 기탁번호 KCTC 14640BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 또는 기탁번호 KCTC 13518BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL409 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 식품 조성물의 장 질환 개선 또는 예방 용도가 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 프로바이오틱인 락토바실러스 애시도필러스 KBL402(기탁번호 KCTC 14640BP) 균주는 하기 서열번호 1로 표시되는 16s rDNA 서열을 포함한다.
<서열번호 1> 락토바실러스 애시도필러스 KBL402(기탁번호 KCTC 14640BP) 균주의 16s rDNA 서열
Figure PCTKR2021013946-appb-I000001
본 발명에 따른 프로바이오틱인 락토바실러스 애시도필러스 KBL409(기탁번호 KCTC 13518BP) 균주는 하기 서열번호 2로 표시되는 16s rDNA 서열을 포함한다.
<서열번호 2> 락토바실러스 애시도필러스 KBL409(기탁번호 KCTC 13518BP) 균주의 16s rDNA 서열
Figure PCTKR2021013946-appb-I000002
본 발명에서는 상기 균주에 대한 효능 실험을 진행하였고, 그 결과 상기 균주는 장 염증을 감소시키고, 장내 유익 미생물 총의 다양성을 향상시키는 것으로 확인되었다.
본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 장 염증을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 결장을 포함한 대장의 염증을 감소시킬 수 있다.
일 실시예에 따른 조성물은 전-염증성 사이토카인의 발현을 감소시키고, 항-염증성 사이토카인의 발현을 증가시키고, 골수세포형과산화효소(MPO, myeloperoxidase) 발현을 감소시키고, 조절 T 세포를 유도하고, miRNA-107 발현을 증가시키고 또는 miRNA-146a, miRNA-155 또는 miRNA-223 발현을 감소시키는 것일 수 있다.
일 실시예에 따른 조성물은 전-염증성 사이토카인 및 전-염증성 케모카인을 포함하는 전-염증성 면역조절물질을 하향 조절하며, 이들의 발현을 감소시킬 수 있다. 전-염증성 사이토카인의 비제한적인 예시는 IFN-γ, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-17A 및/또는 TNF 등을 들 수 있고, 전-염증성 케모카인의 비제한적인 예시는 CCL2(chemokine (C-C motif) ligand 2) 및 CXCL1(Chemokine C-X-C Motif Ligand 1) 등을 들 수 있다.
예를 들어, 일 실시예에 따른 조성물은 IFN-γ, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-17A TNF, CCL2 및 CXCL1과 같은 전-염증성 면역조절물질의 발현 감소를 통해 장 염증을 감소시킬 수 있다.
또한, 일 실시예에 따른 조성물은 항-염증성 사이토카인을 상향 조절하며, 이들의 발현을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 일 실시예에 따른 조성물은 IL-10과 같은 항-염증성 사이토카인의 발현을 증가시켜 장 염증을 감소시킬 수 있다.
또한, 일 실시예에 따른 조성물은 골수세포형과산화효소의 발현을 감소시키고, 장 염증을 감소시킬 수 있다.
또한, 일 실시예에 따른 조성물은 조절 T 세포(Treg, regulatory T cell)의 발현을 유도할 수 있다. 예를 들어, CD4+ CD25+ Foxp3+ 조절 T 세포(Treg, regulatory T cell)의 발현을 유도하여 장 염증을 감소시킬 수 있다.
또한, 일 실시예에 따른 조성물은 miRNA-107 발현을 증가시킬 수 있고, 이를 통해 전-염증성 사이토카인을 하향 조절하고, 발현을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, IL-6, IFN-γ, TNF-α 및/또는 TGF-β의 발현을 감소시키고 장 염증을 감소시킬 수 있다.
일 실시예에 따른 조성물은 유익균의 상대적 장내 분포를 향상시키는 것일 수 있다. 또한, 일 실시예의 조성물은 장내 유익 미생물 총의 다양성을 향상시킬 수 있다.
예를 들어, 상기 조성물은 아커만시아(Akkermansia) 속의 세균 및 프레보텔라(Prevotella) 속의 세균 중 1 이상의 세균의 상대적 장내 분포를 향상시킬 수 있다. 또한, 상기 조성물은 박테로이데스(Bacteroides) 속 세균 및 뮤시스피릴룸(Mucispirillum) 속의 세균 중 1 이상의 세균의 상대적 장내 분포를 감소시킬 수 있다.
아커만시아 속의 세균은 Foxp3+ 조절 T 세포를 유도할 수 있고, IL-10과 같은 항-염증성 사이토카인의 발현을 증가시킬 수 있다. 프레보텔라 속의 세균은 T 조절 세포를 유도하고 사이토카인의 분비를 조절할 수 있다.
아커만시아 속의 세균 및/또는 프레보텔라 속의 세균의 상대적 장내 분포가 향상됨에 따라, 박테로이데스 속 세균 및 뮤시스피릴룸 속의 세균 중 1 이상의 세균의 상대적 장내 분포는 감소하고, 유익균의 상대적 장내 분포가 향상될 수 있다.
즉, 일 실시예의 조성물은 아커만시아 속의 세균 및 프레보텔라 속의 세균 중 1 이상의 세균의 상대적 장내 분포를 향상시켜 장 염증을 개선할 수 있다.
일 실시예의 조성물을 투여할 경우 대상체의 장 내에서 아스파라긴산, 시스테인, 글루타민, 글리신, 세린 및/또는 트레오닌과 같은 다양한 아미노산의 농도가 감소될 수 있다. 또한, 아세테이트, 부티레이트 및/또는 프로피오네이트와 같은 단쇄 지방산 농도가 증가할 수 있다. 이는, 본원 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 또는 KBL409 균주를 투여할 경우 장내 미생물총의 균형 및 다양성이 향상되어 단쇄 지방산 농도의 증가에 영향을 미쳤기 때문인 것으로 보인다. 전술한 단쇄 지방산은 장 항상성과 관련된 상피 세포 분화, 조절 T 세포 자극 및 유도 또는 점막 염증의 개선 등에 기여하여 장 질환의 개선, 예방 및 치료에 우수한 효과를 보일 수 있다.
일 실시예에서, 장 질환은 대장 또는 소장에서 발생하는 염증성 질환일 수 있다. 장 질환의 비제한적인 예로는 염증성 장질환(Inflammatory bowel disease, IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 대장증후군, 장염(enteritis), 허혈성 대장염, 장관형 베체트병, 출혈성 직장 궤양 및/또는 회장낭염(pouchitis) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 일 실시예의 장질환은 염증성 장질환일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 또한, 장 기능을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 일 실시예의 조성물은 장 염증을 개선시켜 저하된 장 기능을 개선할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험 방법
1. 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 및 KBL409 균주, 이들의 파쇄물 및 이들의 추출물의 준비
(1) 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 및 KBL409 균주의 준비
건강한 한국인의 대변에서 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 및 KBL409 균주를 분리하여 이전 연구에서 설명한대로 배양하였으며, 두 균주를 16S ribosomal RNA (rRNA) 유전자 시퀀싱으로 동정하였다.
두 균주 모두 고농도의 담즙 염 (2%) 및 낮은 산도인 pH 4에서 강한 저항성을 나타내는 것을 확인하였다. 이후, 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 및 KBL409 균주를 혐기성 조건에서 24 시간 동안 37℃에서 0.05% L-cysteine hydrochloride가 보충된 Lactobacilli MRS Agar (BD Difco, Sparks, MD, USA)에서 배양하였다. 박테리아 세포를 3000 rpm에서 원심 분리하여 수집하고 사용하기 전에 1× 인산염 완충 식염수 (PBS, Phosphate-buffered saline)로 2 회 세척하였다. 배양법에 의해 세균 농도를 측정하였고, 20% 글리세롤이 포함된 1× PBS를 함유한 세균 군락을 사용 전까지 -80℃에서 보관하였다.
(2) 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 및 KBL409 균주 각각의 파쇄물의 준비
다음의 방법으로 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 및 KBL409 균주 각각의 파쇄물을 수득하였다. 균체 용액 1 mL을 0.2 mm 지르코니아 비드(zirconia bead)가 담긴 튜브에 넣고 1/30의 비트 프리퀀시(beat frequency)로 5분 동안 3회 반복하여 비드-비팅(bead-beating) 파쇄 하였다. 파쇄물이 담긴 튜브를 통째로 5,000 rpm에서 10분 동안 원심분리 하였다. 이후, 상층액만을 옮겨서 40 μm의 세포 여과기(cell strainer)로 여과한 후, 0.2 μm, 시린지 필터로 2회 여과하여 파쇄물을 준비하였다.
(3) 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 및 KBL409 균주 각각의 추출물의 준비
다음의 방법으로 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 및 KBL409 균주 각각의 추출물을 수득하였다. 미생물 균체 20 g(wet weight)을 준비하고, 준비된 균체를 0.1 M 시트르산 나트륨(sodium citrate) 버퍼(pH 4.5) 140 mL로 재현탁하였다. 버퍼에 현탁된 균체를 워터배스 타입의 소니케이터를 이용하여 60 분간 초음파 처리하였다. 초음파처리가 끝난 샘플에 n-부탄올 140 mL을 넣어 1 시간 동안 교반하였다. 혼합용액을 10,000 g, 4℃ 조건으로 20 분간 원심분리하여 상분리시켰다. 상분리되어 얻어지는 유기용매층과 수용액층을 따로 모았으며, 각각 순수한 물에 대한 투석을 (2 kDa 투석막, 4℃, 7 일) 수행하였다. 투석을 마친 용액은 동결건조하여 모든 용매를 증발시켰다. 동결건조 후 얻은 건조샘플을 초순수 30 mL을 사용하여 녹이고, 이를 0.2 μm 주사기 필터로 여과하여 균주 추출물을 수득하였다.
2. 생체 내( in vivo ) 대장염 모델의 개발
DSS를 사용한 마우스 대장염 모델은 급성 IBD의 개선을 위한 프로바이오틱스의 효능과 기전을 설명하는 유용한 도구이다.
DSS-유도 대장염 모델에 대한 모든 실험 절차는 대한민국 서울대학교의 동물시험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC: SNU-160602-9-3)의 승인을 받았다. 본 연구에서는 7-8 주령 암컷 C57BL/6J 마우스 (중앙 연구소 동물 사, 대한민국 서울)를 사용하였다.
각 실험 조건에서 8 마리의 마우스를 사용하였다. 마우스는 12 시간의 명암 주기로 에어컨이 설치된 케이지에서 식수와 먹이에 자유롭게 접근 가능하도록 보관되었다. 대장염을 유도하기 위해 물에 DSS(Dextran Sodium Sulfate, MW 36 000-50,000 Da; MP Biomedicals, LLC, Santa Ana, CA, USA)를 용해시켜 2 중량%의 DSS 용액을 제조 후, 7 일 동안 마우스에 공급하였다.
락토바실러스 애시도필러스 KBL402 또는 KBL409 균주의 대략 1 × 109 콜로니 형성 단위를 1× PBS 200 μL와 매일 경구 위관 영양법으로 동시에 투여하였다. 체중 변화(%), 대변 농도 및 혈변 여부에 대한 정보를 포함하는 마우스의 체중 및 질병 활동 지수(Disease Activity Indices, DAI)는 각 시점에서 3 회 측정되었으며, 이를 후술할 표 1에 기재하였다.
락토바실러스 애시도필러스 처리 8 일 후 모든 마우스를 희생시키고 마우스의 맹장 무게와 결장 길이를 측정하였다. 결장, 대변 및 맹장 샘플은 추후 사용을 위해 즉시 -80℃에 보관되었다.
3. 조직학적 분석
수집 된 결장을 근위 및 원위 결장의 두 부분으로 나누었다. 원위 분절을 10% 포름 알데히드로 고정하고 헤마톡실린 및 에오신으로 염색했다. 원위 분절의 조직학적 점수를 Panoramic Viewer (3DHISTECH, Ltd, Budapest, Hungary)를 사용하여 검사했다.
조직학적 점수는 다음 네 개의 카테고리에 대해서 0점부터 12점까지 기록하였다.
(1) 상피 손실, (2) 창자움(intestinal crypt) 손상, (3) 배상(goblet) 세포의 고갈(depletion), (4) 염증 세포 침윤.
4. 결장 샘플에서 사이토카인 및 골수세포형과산화효소 수준의 분석
계량된 결장 샘플은 1× RIPA 완충액 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) 및 Halt Protease Inhibitor Cocktail (Thermo Fisher Scientific)에서 MM 400 Mixer Mill homogenizer (Retsch, GmbH, Haan, Germany)를 이용하여 균질화되었다.
원심 분리(4℃에서 15,000 g에서 10 분 동안)하여 상청액을 수집하였다. IFN-γ, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A 및 종양 괴사 인자 (TNF)를 포함한 사이토카인을 BD 세포 측정 비드 어레이 마우스(BD cytometric bead array mouse) Th1/Th2/Th17 사이토카인 키트(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 측정하였다.
결장 샘플에서 Cytokine IL-1β는 Murine IL-1β Mini ABTS ELISA 개발 키트 (#900-M47; PeproTech, RockyHill, NJ, USA)를 사용하여 측정하였다. 결장 샘플에서 C-C 모티프 케모카인 리간드 2 (CCL2) 및 C-X-C 모티프 케모카인 리간드 1 (CXCL1)은 각각 JE/MCP-1 (CCL2) 및 CXCL1 Mini ABTS ELISA 개발 키트 (#900-M126 및 #900-M127; PeproTech)를 사용하여 측정하였다. 마우스 MPO ELISA (Hycult Biotech, Uden, the Netherlands)는 결장 샘플에서 MPO 검출에 사용되었다
5. 유세포 분석
T 조절 세포 (Treg)의 유세포 분석은 아래와 같이 수행되었다. 먼저, 마찰을 줄이기 위해 장간막 림프절 (MLN) 샘플을 습식 슬라이드에서 조심스럽게 분쇄하고 세포 여과기 (70 μm pore size, SPL Life Science Co., Ltd, 대한민국, 경기도, 포천시)를 사용하여 여과하였다. 세포 생존력을 확인하기 위해 fixable viability stain 510 (FVS510; BD Biosciences)을 사용하여 T 세포를 염색하였다. 세포 표면은 제조업체의 지침에 따라 anti-CD3 FITC(fluorescein isothiocyanate, 145-2C11; BD Biosciences), anti-CD4 PerCP-Cyanine5.5 (RM4-5; BD Biosciences) 및 anti-CD25 phycoerythrin (PC61; BD Biosciences)을 사용하여 염색하였다. 고정/투과화 키트 (eBioscience, San Diego, CA, USA)를 세포 투과화에 사용하였다. 그 후, Alexa Fluor 647 anti-Foxp3 항체 (MF23; BD Biosciences)를 사용하여 세포 내 염색을 수행하였다. CD4+ CD25+ Foxp3+ T 조절 세포는 BD FACSVerse™ 유세포 분석기 (BD Biosciences)를 사용하여 측정되었으며 면역글로불린 G(IgG) 이소타입 (BD Biosciences)을 대조군으로 사용하였다.
6. 콜론 샘플에서 miRNA 발현 분석
제조업체의 지침에 따라 miRNeasy 미니 키트 (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 말단 결장 샘플에서 small RNA (<200 뉴클레오티드) 분획을 추출하였다.
그런 다음 Nanodrop® ND 1000 (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 RNA 샘플을 정량화하고, miScript II RT 키트 (Qiagen)를 사용하여 500 ng RNA 샘플을 역전사하였다.
QuantiTects SYBR green PCR 마스터 믹스 (Qiagen), miScript 범용 프라이머 (Qiagen) 및 miScript 프라이머 분석 (Qiagen)을 사용하여 miRNA-107 (MS00023961), miRNA-146 (MS00001638), miRNA-155 (MS00001701) 및 miRNA-223 (MS00001960)의 상보적 DNA (2 ng)를 증폭하였다.
PCR 반응은 다음 조건에서 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems)을 사용하여 수행되었다: 95℃에서 15분 동안 최초 변성(denaturation) 후, 이어서 94℃에서 15초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 30초 동안 40 사이클을 수행하였다. miRNA 발현은 소형 핵 RNA(snRNA) 및 C/D box 95 (Qiagen)를 이용하여 정규화되었다.
7. 맹장 미생물 군 분석
제조업체의 지시에 따라 QIAamp fast DNA stool mini kit (Qiagen)를 사용하여 맹장 샘플의 전체 DNA를 추출하였다. 범용 프라이머 515F 및 926R를 16S rRNA 유전자의 V4-5 영역의 증폭에 사용하였다. PCR 앰플리콘은 QIAquick PCR 정제 키트 (Qiagen)를 사용하여 정제하였다. MiSeq 플랫폼 (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA)이 차세대 시퀀싱에 사용되었다. 데이터 처리는 Quantitative Insights into Microbial Ecology 1.8.0 (QIIME) 소프트웨어 (QIIME 개발팀, http://qiime.org) 및 Greengenes ver. 13_5 데이터베이스 (http://greengene.secondgenome.com)를 사용하여 수행되었다.
서열은 적어도 97% 뉴클레오티드 동일성을 갖는 OTU 선택 프로토콜을 사용하여 운영 분류학적 단위(OTUs, operational taxonomic units)로 클러스터링 하였고, 상대적으로 풍부한 미생물 분류군에 대해 비-희귀 OTU 표를 생성하였다. 알파-다양성은 PD(phylogenetic diversity) 전체 트리 척도(whole tree indices)로 입증하였다. 베타 다양성은 UniFrac 거리로 입증하였으며, 가중치가 적용된 원리 좌표 분석에 따라 3 차원 플롯으로 시각화하였다. 선형 판별 분석 (LDA) 효과 크기 (LEfSe) 분석은 Galaxy ver를 사용하여 수행하였다.
8. 맹장 샘플에서 아미노산의 정량
맹장 샘플에서 아미노산을 측정하였다. 액체 크로마토그래피-등급 메탄올 (20 mg/mL)에서 농축된 맹장 추출물 (1 mL)을 70 μL AccQ·Tag 울트라 붕산염 완충액 (Waters Corporation., Milford, MA, USA) 및 20 μL AccQ·Tag 울트라 시약 (Waters Corporation)으로 유도체화하였다.
55℃에서 10 분 동안 배양한 후, 유도체화된 샘플에서의 아미노산을 Acquity 초고성능 액체 크로마토그래피 (Waters Corporation) 및 ESI 프로브가 구비된 SYNAPT G2-Si 질량 분석기 (Waters Corporation)를 사용하여 다음 조건 하에서 측정하였다: 1.5 kV 모세관 전압, 600 L/h 탈용매 가스 유량, 50 L/h 콘(cone) 가스 유량 및 250℃ 탈용매 온도.
아미노산은 AA-S-19 분석 표준 혼합물 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)을 사용하여 확인하였다. MassLynx 소프트웨어 4.1 (Waters Corporation)을 사용하여 데이터 수집 및 정량화를 수행하였다.
9. 맹장 샘플에서 단쇄 지방산의 정량
맹장 샘플을 증류수에서 균질화하고, 5 분 동안 13,000 g에서 원심 분리하였다. 상청액을 수집하고 1%의 2-메틸펜탄산을 내부 표준 물질로 상청액에 첨가하였다. 추출 용매로는 에틸 에테르를 사용하였다.
샘플의 유기층은 Agilent 7890A 가스 크로마토그래프 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 다음 조건에서 측정하였다: 1.5 kV 모세관 전압, 600 L/h 탈용매 가스 유량, 50 L/h 콘(cone) 가스 유량, 170℃ 오븐 온도 및 225℃ (불꽃 이온화 검출기 및 주입 포트 온도). 질소를 캐리어 가스로 사용하였다. 샘플의 머무름 시간과 피크 면적은 표준 혼합물을 사용하여 확인하였다.
10. 통계 분석
데이터는 세 개의 독립적인 실험에서 실험 그룹의 평균 ± 표준 편차, 최대값, 중앙값 및 최소값으로 표시하였다. 적절한 경우 GraphPad Prism ver. 5.04 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)를 Dunnett의 사후 검정 및 시각화를 사용하여 Shapiro-Wilk 검정 및 분산 분석 (ANOVA)과 같은 통계 분석에 사용하였다. P-값 (P) <0.05은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
또한, 속(genus) 수준 분류군의 상대적 풍부도와 특정 대사 산물 사이의 스피어만의 비모수 상관 계수는 GraphPad Prism ver 5.04를 사용하여 계산하였고, R (ver. 3.5.0)의 pheatmap (ver. 1.0.12) 패키지를 사용하여 시각화하였다.
실험 결과
이하, 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들에 따른 결과를 상세히 설명한다.
실험군은 각각 DDS와 함께 KBL402 균주 및 KBL409 균주를 투여 하였으며, 음성 대조군은 물과 PBS를, 양성 대조군은 DSS 및 PBS를 투여하였다.
도 1은 실험군 및 대조군의 Rarefaction 플롯을 도시한 그래프이다. 도 2는 실험군 및 대조군의 가중 UniFrac 거리를 사용한 주성분 분석(Principal component analysis; PCA) 플롯을 도시한 그래프이다. 도 3은 실험군 및 대조군에서 맹장 미생물이 분류학적 구성을 도시한 그래프이다. 도 4는 선형 판별 분석 (LDA) 효과 크기 (LEfSe) 분석을 사용하여 실험군 및 대조군 사이의 현저하게 상이한 미생물 군들을 명확히 보인 그래프이다. (임계값 > 3.0) 도 5는 실험군 및 대조군의 속 수준 분류군의 상대적 풍부도와 특정 대사 산물 간의 스피어만 상관 관계에 대한 히트(heat)맵을 도시한 도면이다. 도 5에서 매트릭스의 색상은 분류군과 메타 데이터 변수 간의 상관 정도를 나타내고, * 표시는 통계적 유의성을 나타낸다 (*, P <0.05; **, P <0.01).
1. 락토바실러스 애시도필러스 처리한 DSS 유발 대장염 마우스의 증상 개선 효과 확인
표 1 및 도 1을 참조하면, 락토바실러스 애시도필러스 처리시 마우스의 대장염 증상이 개선되는 효과가 확인된다.
락토바실러스 애시도필러스 투여 8 일 후 대장염 증상 개선
Figure PCTKR2021013946-appb-T000001
표 1에서, 데이터는 평균 ± 표준 편차 (SD) (범위, 중앙값)로 기재하였다. * 표시는 양성 대조군에 대한 DSS + PBS 처리군의 통계적 유의성을 나타낸다 [*, P <0.05; **, P <0.01; ***, P <0.001; Dunnett의 사후 검정을 사용한 분산 분석 (ANOVA)]. DAI는 질병 활동 지수 (Disease activity index)를 의미한다. 이하, 표 2 내지 7에서도 동일한 내용이 적용된다.
DSS 처리 7 일 후, 마우스는 체중 감소, 설사 및 직장 출혈 등의 임상 증상을 보인 바, 결장에 심각한 손상을 입는 것으로 확인되었다. 그러나, 표 1 및 도 4를 참조하면, 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 또는 KBL409 처리를 받은 마우스의 대장염 증상이 현저히 감소함이 확인된다. DSS + KBL402 처리 및 DSS + KBL409 처리 마우스에서 처리 8 일 후 DAI 점수는 DSS + PBS 처리 마우스의 처리 8일 후 DAI 점수와 비교하여 감소하는 것이 확인된다.
DSS + KBL402 처리 및 DSS + KBL409 처리 마우스는 또한 현저하게 더 긴 결장 길이를 보였으며, DSS + PBS 처리 된 마우스의 조직학적 점수와 비교할 때 낮은 조직학적 점수를 보였다.
위 결과로부터 KBL402 균주 및 KBL409 균주의 장 질환에 대한 현저히 우수한 개선, 예방 및 치료 효과가 확인된다.
2. 락토바실러스 애시도필러스 처리한 DSS 유발 대장염 마우스의 염증 개선 효과 확인
이하, 실시예를 통해 DSS 유발 대장염 마우스에 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 및 KBL409 균주를 처리하는 경우 장 질환에서 항염증 효과가 달성되어 장 질환의 개선, 예방 및 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있음을 구체적으로 설명한다.
2-1. 락토바실러스 애시도필러스 처리된 DSS 유발 대장염 마우스에서의 사이토카인 수준 확인
표 2를 참조하면, DSS 유도 대장염 마우스에 락토바실러스 애시도필러스 처리 시 사이토카인 조절 효과가 확인된다.
락토바실러스 애시도필러스 투여한 결장의 사이토카인 수준의 차이
Figure PCTKR2021013946-appb-T000002
락토바실러스 애시도필러스 처리는 DSS 유도 대장염 마우스에서 Th1-, 2- 및 17-관련 사이토카인의 전반적인 하향 조절에 상당한 영향을 미치는 것으로 확인된다.
또한, DSS + KBL402 처리된 마우스의 결장은 DSS + PBS 처리된 마우스에서보다 훨씬 더 높은 수준의 항-염증성 사이토카인 IL-10 농도를 나타낸 것으로 확인된다.
IBD를 갖는 대상체에서는 전-염증성 사이토카인이 상향 조절 되지만, DSS 유도 대장염 마우스에 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 및 KBL409 균주를 처리할 경우 전-염증성 사이토카인이 하향 조절 되는 것이 확인된다. 이로부터, 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 및 KBL409 균주의 처리 시 염증성 사이토카인 및 염증 관련 분자의 분비를 조절하여 장 질환을 갖는 대상체에서의 우수한 항염증 효과를 보이는 것을 확인 할 수 있다.
또한, IL-10의 상향 조절은 조절 T 세포의 유도와 밀접한 관련이 있으므로, 하기에서 상세히 설명할 바와 같이 락토바실러스 애시도필러스 처리를 통해 장간막 림프절에서 조절 T 세포를 유도하여 급성 대장염이 성공적으로 억제 될 수 있다.
2-2. 락토바실러스 애시도필러스 치료를 사용한 DSS 유발 대장염 마우스에서 케모카인 및 MPO 수준의 차이
CCL2는 주로 대식세포에 의해 생성되는 중요한 전-염증성 케모카인이며, CXCL1은 호중구의 모집 및 활성화와 관련된 주요 케모카인이다. MPO는 호중구 침윤의 중요한 지표이다. 높은 수준의 CCL2, CXCL1 및 MPO 수치는 백혈구 침윤 증가와 높은 상관 관계가 있다.
표 3을 참조하면, DSS 유도 대장염 마우스에 락토바실러스 애시도필러스 처리 시 사이토카인 CCL2, CXCL1 및 MPO 수치 조절에 우수한 효과가 있음이 확인된다.
락토바실러스 애시도필러스 투여한 마우스 결장의 케모카인과 골수세포형과산화효소(MPO) 수준의 차이
Figure PCTKR2021013946-appb-T000003
DSS + KBL402 처리 또는 DSS + KBL409 처리 마우스의 결장 내 케모카인 수준 은 DSS + PBS 처리된 마우스에서 보다 현저히 낮았다. 또한, 락토바실러스 애시도필러스 KBL409 처리시 DSS 유도 대장염 마우스에서 MPO 수준에서 유의한 감소를 나타냈다. 따라서 락토바실러스 애시도필러스 처리시 IBD가 개선, 예방 및 치료 될 수 있음이 확인된다.
2-3. 락토바실러스 애시도필러스 치료를 사용한 DSS 유발 대장염 마우스의 조절 T 세포 차이
표 4를 참조하면, DSS 유도 대장염 마우스에 락토바실러스 애시도필러스 처리시 장간막 림프절에서 T 조절 세포의 유도 효과가 확인된다.
락토바실러스 애시도필러스 투여를 사용한 장간막 림프절에서 CD4+ CD25+ Foxp3+ T 조절 세포의 차이
Figure PCTKR2021013946-appb-T000004
CD4+ CD25+ Foxp3+ T 조절 세포는 DSS + PBS 처리된 마우스의 장간막 림프절에서보다 DSS + KBL409 처리된 마우스의 장간막 림프절에서 유의하게 높은 것으로 확인된다. 이를 통해, 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 및 KBL409 균주를 처리할 경우, 림프절에서 CD4+ CD25+ Foxp3+와 같은 T 조절 세포가 유도되고 장 질환의 개선, 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음이 확인된다.
2-4. 락토바실러스 애시도필러스 치료를 사용한 DSS 유발 대장염 마우스에서 miRNA의 변화
miRNA 발현이 세포 분화, 증식, 세포 사멸, 종양 형성, 세포 사멸 등과 같은 다양한 중요한 생물학적 과정과 밀접한 관련이 있다. 특히, miRNA-107은 IL-6, IFN-γ, TNF-α 및 TGF-β 촉진의 하향 조절과 밀접한 관련이 있고, miRNA-146a는 다양한 장 장벽 또는 면역 관련 신호 경로 내의 염증 유전자를 억제 할 수 있다. 특히, miRNA-146a 녹아웃 마우스는 궤양성 대장염에 대한 내성을 보인다.
miRNA-155 또는 miRNA-223은 대식세포, Th1 및 Th17을 포함한 다양한 면역 세포 또는 인플라마좀 복합체(inflammasome complex) 및 IL-1β 생산의 조절 인자로 알려져 있고, 두 miRNA 모두 IBD와 같은 염증 상태에서 증가 할 수 있다.
표 5를 참조하면, 락토바실러스 애시도필러스 처리로 인한 DSS 유발 대장염 마우스에서 miRNA 발현의 차이가 확인된다.
락토바실러스 애시도필러스를 투여한 장간막 림프절의 마이크로 RNA (miRNA) 차이
Figure PCTKR2021013946-appb-T000005
miRNA-107의 발현 수준은 DSS + PBS 처리 마우스에 비해 DSS + KBL409 처리 마우스에서 유의하게 높았다. 또한, DSS + PBS 처리 마우스의 보다 DSS + KBL409 처리 마우스의 miRNA-146a 발현이 낮은 수준인 것으로 확인되었다. 또한, miRNA-155 및 miRNA-223의 발현 수준은 DSS + PBS 처리 마우스에 비해 DSS + KBL402 처리 마우스에서 유의하게 낮았다.
이를 통해, KBL402 균주 및 KBL409 균주가 숙주의 염증과 밀접하게 관련된 miRNAs의 조절을 통해 대장염의 치료에 효과를 보임을 확인하였으며, 장 질환의 개선, 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
3. 락토바실러스 애시도필러스 처리한 DSS 유발 대장염 마우스의 장내 미생물 다양성 개선 효과 확인
미생물 다양성 및 조성은 IBD의 진행에 중요한 요소이다. 이하, 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 및 KBL409 균주를 처리한 DSS 유발 대장염 마우스의 장내 미생물 다양성 회복 효과에 대해 설명한다.
3-1. 락토바실러스 애시도필러스 처리한 DSS 유발 대장염 마우스의 맹장 미생물 군의 변화
락토바실러스 애시도필러스 처리된 DSS 유발 대장염 마우스의 맹장 미생물 총의 차이를 도 1 및 표 6에 요약하였다. 아커만시아 속은 Foxp3+ T 조절 세포 및 IL-10을 유도한다. 또한, 프레보텔라 속의 특정 종이 T 조절 세포를 유도하고 사이토카인을 조절할 수 있다.
락토바실러스 애시도필러스 투여한 맹장 미생물 군에서 유의한 상이성을 보이는 미생물 분류군의 상대적 풍부도 차이
Figure PCTKR2021013946-appb-T000006
도 1 및 도 2를 참조하면, DSS + PBS 처리된 마우스와 비교하여 DSS + KBL402 처리된 마우스와 DSS + KBL409 처리된 마우스의 미생물 군집은 풍부한 세균 다양성을 보였으며 뚜렷하게 군집화 되었다.
도 3 및 4를 참조하면, 물 + PBS 처리된 마우스에서 주목할만한 박테리아 군집은 S24-7의 미분류 과(unclassified family) (50.1%) 였다. 그러나, DSS + PBS 처리 마우스에서는 매우 낮은 수준의 S24-7의 미분류 과가 관찰되었고 (4.6%), 박테로이데스 속 (34.4%)이 가장 큰 비율을 차지했다.
DSS + KBL402 처리 및 DSS + KBL409 처리 마우스에서 S24-7의 미분류 과의 명확한 상향 경향 및 박테로이데스의 하향 경향이 관찰되었다(도 3 및 4). 또한, DSS + KBL402 처리된 마우스는 DSS-유도 대장염을 가진 마우스에 비해 아커만시아 속에 대해 유의하게 더 높은 풍부도 수준을 보였다.
박테로이데스와 뮤시스피릴룸 속의 상대적 풍부도는 DSS + KBL402 처리 및 DSS + KBL409 처리 마우스에서 명확히 감소하였다. 프레보텔라 속은 DSS + KBL402 처리 및 DSS + KBL409 처리 마우스에서 유의하게 복원되었다.
이를 통해 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 및 KBL409 균주가 장 질환 개선, 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음이 확인된다.
3-2. 락토바실러스 애시도필러스 처리된 DSS 유발 대장염 마우스의 대사 산물 변화
표 7을 참조하면, DSS 유도된 대장염 마우스의 맹장에서 아미노산과 단쇄 지방산(Short Chain Fatty Acid, SCFA)을 포함한 대사 산물이 확인된다.
락토바실러스 애시도필러스 투여 시의 다양한 아미노산 및 단쇄 지방산의 차이
Figure PCTKR2021013946-appb-T000007
DSS + PBS 처리 마우스와 비교하여 DSS + KBL402 처리 및 DSS + KBL409 처리 마우스에서 아스파라긴산, 시스테인, 글루타민, 글리신 및 세린을 포함한 다양한 아미노산이 상당히 낮은 농도로 관찰된다. 특히, KBL409 처리 (100.24 ± 67.65 ng/mg) 후 DSS 처리된 대장염 마우스에서 트레오닌 농도의 현저한 감소가 나타났다. 반대로, DSS + KBL402 처리된 마우스의 맹장에서 부티레이트 및 프로피오네이트를 포함하는 단쇄 지방산은 DSS + PBS 처리된 마우스보다 상당히 높은 것으로 확인된다.
도 5를 참조하면, DSS + KBL402 처리 마우스에서 Lactobacillus 속은 아세테이트와 유의한 상관 관계를 보이고, DSS + KBL409 처리 마우스에서 프레보텔라 속은 글리신 및 아스파르트 산과도 음의 상관 관계를 보인다.
아미노산은 주로 장내 미생물 총에 의해 생성되는 단쇄 지방산의 중요한 전구체이다. 아세테이트, 부티레이트 및 프로피오네이트와 같은 단쇄 지방산은 장 항상성과 관련된 상피 세포 분화, 조절 T 세포 자극 및 점막 염증의 개선과 같은 다양한 과정에 기여하면서 IBD 예방 및 치료에 효과를 보인다. 부티레이트는 또한 상피의 주요 에너지원이며 조절 T 세포를 광범위하게 유도할 수 있기 때문에 궤양성 대장염과 같은 장 질환에 유익한 효과를 발휘할 수 있다.
이를 통해, 락토바실러스 애시도필러스 KBL 402 및 409 균주 처리 시, 단쇄 지방산 생산이 촉진되며, 염증성 장 질환과 같은 장 질환에 대한 예방 및 치료 효과가 분명히 나타나는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (20)

  1. 기탁번호 KCTC 14640BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 또는 기탁번호 KCTC 13518BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL409 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 장 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 KBL402 균주는 서열번호 1로 표시되는 16s rDNA 서열을 갖는 것인, 조성물.
  3. 제1 항에 있어서,
    상기 KBL409 균주는 서열번호 2로 표시되는 16s rDNA 서열을 갖는 것인, 조성물.
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 조성물은 장 염증을 감소시키는 것인, 조성물.
  5. 제4 항에 있어서,
    상기 조성물은 전-염증성 사이토카인의 발현을 감소, 전-염증성 케모카인의 발현을 감소, 항-염증성 사이토카인의 발현을 증가, 골수세포형과산화효소 발현을 감소, 조절 T 세포를 유도, miRNA-107 발현을 증가 또는 miRNA-146a, miRNA-155 또는 miRNA-223 발현을 증가시키는 것인, 조성물.
  6. 제1 항에 있어서,
    상기 조성물은 유익균의 상대적 장내 분포를 향상시키는 것인, 조성물.
  7. 제6 항에 있어서,
    상기 조성물은 아커만시아 속의 세균 및 프레보텔라 속의 세균 중 1 이상의 세균의 상대적 장내 분포를 향상시키는 것인, 조성물.
  8. 제1 항에 있어서,
    상기 장 질환은 염증성 장질환, 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 대장증후군, 장염, 허혈성 대장염, 장관형 베체트병, 출혈성 직장 궤양 및 회장낭염으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 조성물.
  9. 제1 항에 있어서,
    상기 장 질환은 염증성 장질환인 것인, 조성물.
  10. 기탁번호 KCTC 14640BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 또는 기탁번호 KCTC 13518BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL409 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 장 질환 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  11. 제10 항에 있어서,
    상기 조성물은 장 기능을 개선 시키는 것인, 조성물.
  12. 제10 항에 있어서,
    상기 조성물은 건강 기능 식품인 것인, 조성물.
  13. 제10 항에 있어서,
    상기 장 질환은 염증성 장질환, 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 대장증후군, 장염, 허혈성 대장염, 장관형 베체트병, 출혈성 직장 궤양 및 회장낭염으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 조성물.
  14. 기탁번호 KCTC 14640BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 또는 기탁번호 KCTC 13518BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL409 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 동물사료용 조성물.
  15. 기탁번호 KCTC 14640BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 또는 기탁번호 KCTC 13518BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL409 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 장 질환의 예방 또는 치료 방법.
  16. 기탁번호 KCTC 14640BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 또는 기탁번호 KCTC 13518BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL409 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 식품 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 장 질환의 개선 또는 완화 방법.
  17. 장 질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조에 있어서 기탁번호 KCTC 14640BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 또는 기탁번호 KCTC 13518BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL409 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물의 용도.
  18. 장 질환의 개선 또는 예방용 식품의 제조에 있어서 기탁번호 KCTC 14640BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 또는 기탁번호 KCTC 13518BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL409 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물의 용도.
  19. 기탁번호 KCTC 14640BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 또는 기탁번호 KCTC 13518BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL409 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 약제학적 조성물의 장 질환 예방 또는 치료 용도.
  20. 기탁번호 KCTC 14640BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL402 균주 또는 기탁번호 KCTC 13518BP인 락토바실러스 애시도필러스 KBL409 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 식품 조성물의 장 질환 개선 또는 예방 용도.
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