WO2023058100A1

WO2023058100A1 - 構造多型の検出方法、プライマーセット及びプライマーセットの設計方法

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Publication number: WO2023058100A1
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Inventors: 和明横山
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Abstract

【課題】各人の有するＳＶの構造上の特徴を利用することで、各人に適したＳＶの検出を可能とする方法を提供する。【解決手段】被検体に由来するゲノムＤＮＡ、遊離ＤＮＡ又は相補的ＤＮＡから成るサンプルＤＮＡにおける特定の構造多型の有無を検出する方法であって、サンプルＤＮＡを鋳型とし、第１プライマー対と第２プライマー対との組み合わせを用いたＰＣＲを行い、その結果に基づいて特定の構造多型の有無を検出する検出工程を含む方法、当該方法に用いられるプライマーセット及び当該プライマーセットの設計方法を提供する。

Description

構造多型の検出方法、プライマーセット及びプライマーセットの設計方法

　本発明は、構造多型の検出方法、構造多型の検出に用いられるプライマーセット及び当該プライマーセットの設計方法に関する。

　構造多型（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　Ｖａｒｉａｔｉｏｎ、以下ＳＶともいう）は、ゲノムの生体間の違いのうち、５０塩基対（ｂｐ、ｂａｓｅ　ｐａｉｒ）以上の大きさの変異であり、欠失、挿入、タンデム重複、逆位などの多型の総称である。このＳＶは、体細胞変異によって引き起こされるがんなどの疾患や、発達障害や知的障害といった疾患など、様々な疾患の遺伝的要因となることが多くの研究から示されている。

　従来、ＳＶのような異常を検出する方法として、遺伝子パネル検査が用いられている（例えば、特表２０１７－５０３５２７号公報（米国特許出願公報第２０１６／３３３４２０号公報に相当））。遺伝子パネル検査では、予め数個から数百個の変異遺伝子をターゲットとして登録し、これらの登録された変異遺伝子を増幅可能なプライマーセットを準備する。そして、ＰＣＲ反応で任意の配列を増幅し、増幅された配列をシーケンサーで解析することにより、ＳＶのような異常を検出する。

　例えば、がん患者は、この遺伝子パネル検査で予め登録されている多数の変異遺伝子を同時に調べ、患者自身のどの遺伝子に変異が生じているかを明らかにすることで、体質や病状に合わせた治療を受けることができる。

　しかしながら、近年は、次世代シーケンサー（ＮＧＳ）の登場により、個人レベルにおける全ゲノムの解析が可能となった。これにより、多種多様なＳＶが次々と発見されており、その数は指数関数的に増加している。各人によってＳＶの構造は様々であり、例えば、同じ遺伝子の変異に起因した、同一の疾患を有する患者であっても、その遺伝子におけるＳＶは異なることが明らかとなっている。

　前述の遺伝子パネル検査では、予めターゲットとする変異遺伝子を登録し、更にこれらを増幅可能なプライマーセットを用意する必要があるため、上述のような多種多様なＳＶの全てに対応することは不可能である。そこで、多くの患者を網羅的に検査する方法ではなく、各患者の遺伝情報に基づき、一人ひとりに最適化されたＳＶの検査方法が求められている。

　本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、各ＳＶの構造上の特徴を利用し、個人に最適化したＳＶの検出を可能とする方法を提供することを目的とする。

　本発明者は、上記課題を解決すべく研究を行った結果、各人の有するＳＶの構造上の特徴を利用して、特定のＳＶを含まない野生型塩基配列を増幅する第１プライマー対と特定のＳＶを含む変異型塩基配列を増幅する第２プライマー対との組み合わせを用いたＰＣＲを行う工程を含む方法により、各人に最適化したＳＶの検出が可能となることを見出し、本発明を完成させるに至った。

　具体的には、本発明は以下の通りである。

　〔１〕　被検体に由来するゲノムＤＮＡ、遊離ＤＮＡ又は相補的ＤＮＡから成るサンプルＤＮＡにおける特定の構造多型の有無を検出する方法であって、
　前記サンプルＤＮＡを鋳型とし、第１プライマー対と第２プライマー対との組み合わせを用いたＰＣＲを行い、その結果に基づいて前記特定の構造多型の有無を検出する検出工程を含み、
　前記第１プライマー対は、前記特定の構造多型を含まない野生型塩基配列を検出するためのものであり、前記特定の構造多型を含まないサンプルＤＮＡにおける前記特定の構造多型に対応する箇所又は領域の一部若しくは全部を含む塩基配列を挟むように設計され、
　前記第２プライマー対は、前記特定の構造多型を含む変異型塩基配列を検出するためのものであり、前記特定の構造多型を含むサンプルＤＮＡにおける前記特定の構造多型が発生した箇所又は領域の一部若しくは全部を含む塩基配列を挟むように設計された、方法。

　〔２〕　前記第１プライマー対と前記第２プライマー対との前記組み合わせは、
　前記特定の構造多型を含まない場合と比して前記特定の構造多型を含む場合に挟む塩基配列の長さが１０倍以上になるように設計された前記第１プライマー対と、前記特定の構造多型を含む場合にのみ挟む塩基配列が存在するように設計された前記第２プライマー対の組み合わせ、
　前記特定の構造多型を含まない場合にのみ挟む塩基配列が存在するように設計された前記第１プライマー対と、前記特定の構造多型を含む場合にのみ挟む領域が存在するように設計された前記第２プライマー対と組み合わせ、
　前記特定の構造多型を含まない場合にのみ挟む塩基配列が存在するように設計された前記第１プライマー対と、前記特定の構造多型を含まない場合と比して前記特定の構造多型を含む場合に挟む塩基配列の長さが１／１０以下になるように設計された前記第２プライマー対との組み合わせ、及び
　前記特定の構造多型を含まない場合と比して前記特定の構造多型を含む場合に挟む塩基配列の長さが２倍以上になるように設計された前記第１プライマー対と、前記特定の構造多型を含む場合にのみ挟む領域が存在ように設計された前記第２プライマー対との組み合わせ、を含む、〔１〕に記載の方法。

　〔３〕　前記第１プライマー対の一方のプライマーと、前記第２プライマー対の一方のプライマーと、は同一の塩基配列を有する共通プライマーである、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。

　〔４〕　前記共通プライマーは、前記サンプルＤＮＡ中の前記特定の構造多型が存在する領域を含まない塩基配列に結合するように設計される、〔３〕に記載の方法。

　〔５〕　前記ＰＣＲによって得られた増幅産物のシーケンシングを行う、アンプリコンシーケンス工程を有する、〔１〕～〔４〕に記載の方法。

　〔６〕　前記ＰＣＲは定量ＰＣＲである、〔１〕～〔５〕に記載の方法。

　〔７〕　前記定量ＰＣＲはデジタルＰＣＲである、〔６〕に記載の方法。

　〔８〕　前記定量ＰＣＲは、標識機能を有し、ＰＣＲの増幅産物に結合する核酸プローブを用いて定量を行う、〔６〕又は〔７〕に記載の方法。

　〔９〕　前記核酸プローブは、前記第１プライマー対に挟まれる塩基配列に特的に結合する第１プローブと、前記第２プライマー対に挟まれる塩基配列に特異的に結合する第２プローブと、を含む、〔８〕に記載の方法。

　〔１０〕　前記サンプルＤＮＡが前記ゲノムＤＮＡ又は前記遊離ＤＮＡから成る場合に、前記サンプルＤＮＡについて全ゲノム配列解析を行う全ゲノム配列解析工程を含む、〔１〕～〔９〕に記載の方法。

　〔１１〕　前記全ゲノム配列解析工程の結果に基づき、前記特定の構造多型を決定する決定工程を含む、〔１０〕に記載の方法。

　〔１２〕　前記サンプルＤＮＡが前記ゲノムＤＮＡ又は前記遊離ＤＮＡから成る場合に、前記被検体からゲノムＤＮＡを抽出する工程、又は前記被検体から遊離ＤＮＡを単離する工程を有する、〔１〕～〔１１〕に記載の方法。

　〔１３〕　前記被検体は、ヒト又は動物の血液、骨髄、体腔液、生体組織、及びリンパ組織を含む、〔１〕～〔１２〕に記載の方法。

　〔１４〕　前記特定の構造多型は、挿入、転座、欠失、逆位、及びタンデム重複からなる群より選ばれる、〔１〕～〔１３〕に記載の方法。

　〔１５〕　前記特定の構造多型は、疾患のドライバー変異である、〔１〕～〔１４〕に記載の方法。

　〔１６〕　〔１〕～〔１５〕に記載の方法を用いて残存微小病変（ＭＲＤ）の分析を行うＭＲＤ分析方法。

　〔１７〕　被検体に由来するゲノムＤＮＡ、遊離ＤＮＡ又は相補的ＤＮＡから成るサンプルＤＮＡにおける特定の構造多型の有無を検出するために用いられるプライマーセットであって、
　前記プライマーセットは、前記サンプルＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによる増幅反応に用いられる、第１プライマー対と第２プライマー対との組み合わせから成り、
　前記第１プライマー対は、前記特定の構造多型を含まない野生型塩基配列を検出するためのものであり、前記特定の構造多型を含まないサンプルＤＮＡにおける前記特定の構造多型に対応する箇所又は領域の一部若しくは全部を含む塩基配列を挟むように設計され、
　前記第２プライマー対は、前記特定の構造多型を含む変異型塩基配列を検出するためのものであり、前記特定の構造多型を含むサンプルＤＮＡにおける前記特定の構造多型が発生した箇所又は領域の一部若しくは全部を含む塩基配列を挟むように設計された、プライマーセット。

　〔１８〕　被検体に由来するゲノムＤＮＡ、遊離ＤＮＡ又は相補的ＤＮＡから成るサンプルＤＮＡにおける特定の構造多型の有無を検出するために用いられるプライマーセットの設計方法であって、
　前記プライマーセットは、前記サンプルＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによる増幅反応に用いられる、第１プライマー対と第２プライマー対との組み合わせから成り、
　前記第１プライマー対は、前記特定の構造多型を含まない野生型塩基配列を検出するためのものであり、前記特定の構造多型を含まないサンプルＤＮＡにおける前記特定の構造多型に対応する箇所又は領域の一部若しくは全部を含む塩基配列を挟むように設計され、
　前記第２プライマー対は、前記特定の構造多型を含む変異型塩基配列を検出するためのものであり、前記特定の構造多型を含むサンプルＤＮＡにおける前記特定の構造多型が発生した箇所又は領域の一部若しくは全部を含む塩基配列を挟むように設計される、プライマーセットの設計方法。

　本発明によれば、各人の有するＳＶの構造上の特徴を利用することで、各人に適したＳＶの検出を可能とする方法を提供することができる。

構造多型が挿入である場合に、本実施形態にかかる方法が適応される例を示した図である。構造多型が転座である場合に、本実施形態にかかる方法が適応される例１を示した図である。構造多型が転座である場合に、本実施形態にかかる方法が適応される例２を示した図である。構造多型が逆位である場合に、本実施形態にかかる方法が適応される例１を示した図である。構造多型が逆位である場合に、本実施形態にかかる方法が適応される例２を示した図である。構造多型が欠失である場合に、本実施形態にかかる方法が適応される例１を示した図である。構造多型が欠失である場合に、本実施形態にかかる方法が適応される例２を示した図である。構造多型がタンデム重複である場合に、本実施形態にかかる方法が適応される例を示した図である。実施例を説明するための図である。実施例の結果を示す図である。

　本発明にかかる方法は、被検体に由来するゲノムＤＮＡ、遊離ＤＮＡ又は相補的ＤＮＡから成るサンプルＤＮＡにおける特定の構造多型の有無を検出する方法である。

　〔構造多型〕
　構造多型は、ゲノムの生体間の違いのうち、５０塩基対（ｂｐ、ｂａｓｅ　ｐａｉｒ）以上の大きさの変異である。構造多型の種類には、変異のパターンに応じて、特定の位置に別の塩基配列が挿入される挿入、塩基配列の一部が正常の位置から別の位置や他の染色体へ移動する転座、塩基配列の一部が失われる欠失、一部の領域が逆方向に変換されている逆位、一部の領域が重複して挿入されるタンデム重複等がある。本実施形態における特定の構造多型は、挿入、転座、欠失、逆位、及びタンデム重複からなる群より選ばれてもよい。また、構造多型は、がんの発生や悪化の直接的な原因となる遺伝子の変異であるドライバー変異となり得ることから、本実施形態においても、特定の構造多型は、患者の疾患のドライバー変異であってもよい。

　〔サンプルＤＮＡ〕
　本実施形態におけるサンプルＤＮＡは、被検体に由来するゲノムＤＮＡ、遊離ＤＮＡ又は相補的ＤＮＡを意味する。本明細書における被検体は、ヒト又は動物から得られたものであり、ゲノムＤＮＡ、遊離ＤＮＡ、又は相補的ＤＮＡの鋳型となるＲＮＡを採取可能な対象物であれば、特に制限されない。しかしながら、採取が容易であることから、被検体は、ヒト又は動物の血液、骨髄、体腔液、生体組織、又はリンパ組織であることが好ましい。また、動物とは、例えば、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、マウスなどが挙げられる。被検体に由来するゲノムＤＮＡ、遊離ＤＮＡ又は相補的ＤＮＡを得る方法は後述する抽出工程にて述べる。

　本明細書において、「ゲノムＤＮＡ」は、被検体の細胞の核内部に見られる遺伝物質を意味する。ゲノムＤＮＡは、全ての遺伝子、特にコード配列及びその調節エレメントを含む。また、本明細書において、「遊離ＤＮＡ」とは、血液中や体腔液中などに存在し得る、ゲノム情報の一部または全部を持った遺伝物質を指し、その例としてセルフリーＤＮＡ（ｃｅｌｌ　ｆｒｅｅ　ＤＮＡ、ｃｆＤＮＡ）及び循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　ｔｕｍｏｒ　ＤＮＡ、ｃｔＤＮＡ）が挙げられる。本明細書において、「血液」は、全血、血清、及び血漿のいずれも含むものとする。また、本明細書において、「相補的ＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ＤＮＡ；ｃＤＮＡ）」は、ＲＮＡを鋳型として逆転写酵素によって合成されたＤＮＡを意味する。

　以下、本発明の特定の構造多型の有無を検出する方法及び当該方法に用いられるプライマーセットの設計方法について説明する。

　本実施形態にかかる特定の構造多型の有無を検出する方法は、サンプルＤＮＡを鋳型とし、第１プライマー対と第２プライマー対との組み合わせを用いたＰＣＲを行い、その結果に基づいて特定の構造多型の有無を検出する検出工程を含む。

　〔サンプルＤＮＡのＰＣＲによる増幅〕
　本実施形態におけるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）では、サンプルＤＮＡを鋳型とする第１プライマー対及び第２プライマー対の組み合わせを用いて、増幅反応を行う。なお、第１プライマー対と第２プライマー対との組み合わせをプライマーセットとも呼ぶ。

　（第１プライマー対及び第２プライマー対）
　本実施形態においてプライマー対とは、鋳型ＤＮＡのアンチセンス鎖を５’末端から３’末端の方向に伸長するためのフォワードプライマーと、センス鎖を５’末端から３’末端の方向に伸長するためのリバースプライマーとの対をいう。

　第１プライマー対は、特定の構造多型を含まない野生型塩基配列を検出するためのものであり、特定の構造多型を含まないサンプルＤＮＡおける特定の構造多型に対応する箇所又は特定の構造多型に対応する領域の一部若しくは全部を含む塩基配列を挟むように設計される。ここで、特定の構造多型に対応する箇所又は領域とは、特定の構造多型を含むサンプルＤＮＡにおいて構造多型が発生した箇所又は領域に相当する、特定の構造多型を含まないサンプルＤＮＡ上の場所を意味する。より具体的には、例えば、後述する図１～図３に示したＷｉｌｄ　ｔｙｐｅ上のＢＰ（塩基配列の切断点、ｂｒｅａｋ　ｐｏｉｎｔ）や、図４～図８に示したＷｉｌｄ　ｔｙｐｅ上のＢＰ又はＴＰに挟まれた領域を指す。

　また、第２プライマー対は、特定の構造多型を含む変異型塩基配列を検出するためのものであり、特定の構造多型を含むサンプルＤＮＡにおける特定の構造多型が発生した箇所又は特定の構造多型が発生した領域の一部若しくは全部を含む塩基配列を挟むように設計される。

　（共通プライマー）
　第１プライマー対の一方のプライマーと、第２プライマー対の一方のプライマーと、は同一の塩基配列を有する共通プライマーであってもよい。共通プライマーを用いることで、作成するプライマーの数を減らすことができ、実験方法の簡素化や費用の削減につなげることができる。また、当該共通プライマーは、サンプルＤＮＡ中の特定の構造多型が存在する領域を含まない塩基配列に結合するように設計されてもよい。

　（第１プライマー対及び第２プライマー対の組み合わせ）
　以下、第１プライマー対及び第２プライマー対の組み合わせについて、図１～図８を用いて具体的に説明するが、組み合わせはこれらの具体例に限られるものではない。

　Ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅは特定の構造多型を含まない場合のサンプルＤＮＡを、Ｍｕｔａｎｔは特定の構造多型を含む場合のサンプルＤＮＡを意味する。また、第１プライマー対のフォワードプライマーをＷＴ－Ｆ、リバースプライマーをＷＴ－Ｒと表し、第２プライマー対のフォワードプライマーをＭｕｔ－Ｆ、リバースプライマーをＭｕｔ－Ｒと表す。また、図中に示したＢＰは、塩基配列の切断点（Ｂｒｅａｋ　Ｐｏｉｎｔ）であり、Ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ上の切断点にて塩基配列が切断されることにより、構造多型が生じうる。

　（組み合わせ１）
　第一の組み合わせは、特定の構造多型を含まない場合と比して特定の構造多型を含む場合に挟む塩基配列の長さが１０倍以上になるように設計された第１プライマー対と、特定の構造多型を含む場合にのみ挟む塩基配列が存在するように設計された第２プライマー対の組み合わせ、である。

　第一の組み合わせについて、図１に示した挿入の場合を例に説明する。図１では、Ｍｕｔａｎｔ上の挿入が発生した領域を、斜めのハッチングで示す。

　第１のプライマー対は、Ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅにおける特定の構造多型に対応する箇所、すなわち挿入が発生する際にＷｉｌｄ　ｔｙｐｅの塩基配列が切断される切断点（Ｂｒｅａｋ　Ｐｏｉｎｔ、図中のＢＰ）を挟むように設計し、更にＷｉｌｄ　ｔｙｐｅにハイブリダイズする場合と比して、Ｍｕｔａｎｔにハイブリダイズする場合に、第１プライマー対が挟む塩基配列の長さが１０倍以上になるようにし得る。このように設計することで、鋳型がＭｕｔａｎｔである場合は、ＰＣＲによる第１プライマー対による塩基配列の増幅が起こらないか、鋳型がＷｉｌｄ　ｔｙｐｅである場合と比して増幅効率が落ちることとなる。

　第２プライマー対は、フォワードプライマー（Ｍｕｔ－Ｆ）とリバースプライマー（Ｍｕｔ－Ｒ）との少なくとも一方のプライマーを、挿入された領域を含む塩基配列にハイブリダイズするように設計し得る。この場合、プライマーは挿入された領域にハイブリダイズするように設計してもよいし、挿入された領域とそれ以外の塩基配列とにまたがるように設計されてもよい。このように設計することのより、第２プライマーは、特定の構造多型を含む場合にのみ挟む塩基配列が存在することとなるため、鋳型がＭｕｔａｎｔの場合のみ塩基配列の増幅が可能となる。

　なお、図１の例の場合、第１プライマー対のリバースプライマーと、挿入された領域を含まない塩基配列にハイブリダイズするように設計された第２プライマー対のリバースプライマーとは、共通の塩基配列を有する共通プライマーであってもよい。

　（組み合わせ２）
　第二の組み合わせは、特定の構造多型を含まない場合にのみ挟む塩基配列が存在するように設計された第１プライマー対と、特定の構造多型を含む場合にのみ挟む領域が存在するように設計された第２プライマー対と組み合わせ、である。第二の組み合わせについては、図２及び図３に示した転座の場合、並びに図４及び図５に示した逆位の場合を例に説明する。

　まず、第二の組み合わせについて、図２及び図３に示した転座の場合を例に説明する。図２及び図３では、説明の便宜のため、転座にかかわる２つの配列（図中のＳｅｑ．１及びＳｅｑ．２）のうち、一方を斜めのハッチングで示す。

　図２及び図３に示すように第１のプライマー対は、Ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅにおける特定の構造多型に対応する箇所、すなわち転座が発生する際にＷｉｌｄ　ｔｙｐｅの塩基配列が切断される切断点（ＢＰ、図中の破線部分）を挟むように設計し得る。このように設計することで、鋳型がＷｉｌｄ　ｔｙｐｅである場合にのみ挟む塩基配列が存在することとなり、第１プライマーは、Ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅの場合にのみ塩基配列の増幅が可能となる。

　一方、第２プライマー対は、図２の例の場合は、フォワードプライマー（Ｍｕｔ－Ｆ）がＭｕｔａｎｔのＳｅｑ１に相当する配列にハイブリダイズし、リバースプライマー（Ｍｕｔ－Ｆ）がもう一方のＳｅｑ２に相当する配列にハイブリダイズするように設計し得る。また、図３の例の場合は、フォワードプライマーがＭｕｔａｎｔのＳｅｑ２に相当する配列にハイブリダイズし、リバースプライマーがＳｅｑ１に相当する配列にハイブリダイズするように設計し得る。このように設計することで、第２プライマーは特定の構造多型を含む場合にのみ挟む領域が存在こととなり、鋳型がＭｕｔａｎｔの場合にのみ塩基配列の増幅が可能となる。

　ここで、図２の例の場合は、第１プライマー対のフォワードプライマーと、第２プライマー対のフォワードプライマーが共通の塩基配列を有する共通プライマーであってもよく、図３の例の場合は、第１プライマー対のリバースプライマーと、第２プライマー対のリバースプライマーが共通の塩基配列を有する共通プライマーであってもよい。

　次に、第二の組み合わせについて、図４及び図５に示した逆位による構造多型の場合を例に説明する。図４及び図５においては、説明の便宜のため、逆位が発生する領域を斜めのハッチングで塗り、更に配列の方向を矢印で示した。

　図４及び図５に示すように第１のプライマー対は、いずれか一方のプライマーをＭｕｔａｎｔにおいて逆位が発生した領域に対応するＷｉｌｄ　ｔｙｐｅの領域（図中のＢＰに囲まれた領域）にハイブリダイズするように設計し、もう一方のプライマーが逆位の発生しない領域にハイブリダイズするように設計する。このように設計することで、特定の構造多型を含まない場合にのみ挟む塩基配列が存在することとなり、鋳型がＷｉｌｄ　ｔｙｐｅの場合にのみ塩基配列の増幅が可能となる。図４では、フォワードプライマー（ＷＴ－Ｆ）が逆位の発生しない領域にハイブリダイズし、リバースプライマー（ＷＴ－Ｒ）が逆位の発生に対応する領域にハイブリダイズするように設計し、図５では、フォワードプライマーが逆位の発生に対応する領域にハイブリダイズし、リバースプライマーが逆位の発生しない領域にハイブリダイズするように設計した例を示す。

　一方、第２プライマー対は、いずれか一方のプライマーを逆位の発生した塩基配列にハイブリダイズするように設計し、もう一方のプライマーを逆位の発生していない領域にハイブリダイズするように設計する。このように設計することで、特定の構造多型を含み場合にのみ挟む塩基配列が存在することになるため、鋳型がＭｕｔａｎｔの場合にのみ塩基配列の増幅が可能となる。図４では、フォワードプライマー（Ｍｕｔ－Ｆ）が逆位の発生していない領域にハイブリダイズし、リバースプライマー（Ｍｕｔ－Ｒ）が逆位の発生した領域にハイブリダイズするように設計し、図５では、フォワードプライマーが逆位の発生した領域にハイブリダイズし、リバースプライマーが逆位の発生していない領域にハイブリダイズするように設計した例を示す。

　ここで、図４の例の場合は、第１プライマー対のフォワードプライマーと、第２プライマー対のフォワードプライマーが共通の塩基配列を有する共通プライマーであってもよく、図５の例の場合は、第１プライマー対のリバースプライマーと、第２プライマー対のリバースプライマーが共通の塩基配列を有する共通プライマーであってもよい。

　（組み合わせ３）
　第三の組み合わせは、特定の構造多型を含まない場合にのみ挟む塩基配列が存在するように設計された第１プライマー対と、特定の構造多型を含まない場合と比して特定の構造多型を含む場合に挟む塩基配列の長さが１／１０以下になるように設計された第２プライマー対との組み合わせ、である。

　第三の組み合わせについて、図６及び図７に示した欠失の場合を例に説明する。図６及び図７は、Ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅの図において斜めのハッチングで示した領域が、Ｍｕｔａｎｔでは欠失している。

　図６及び図７に示すように第１のプライマー対は、いずれか一方のプライマーがＭｕｔａｎｔにおいて抜け落ちた領域に対応するＷｉｌｄ　ｔｙｐｅの領域（図中のＢＰに囲まれた部分）にハイブリダイズするように設計し、もう一方のプライマーが欠失の発生しない領域にハイブリダイズするように設計する。このように設計されることで、特定の構造多型を含まない場合にのみ挟む塩基配列が存在することとなり、鋳型がＷｉｌｄ　ｔｙｐｅの場合にのみ塩基配列の増幅が可能となる。図６では、フォワードプライマー（ＷＴ－Ｆ）が欠失が発生しない領域にハイブリダイズし、リバースプライマー（ＷＴ－Ｒ）が欠失の発生に対応する領域にハイブリダイズするように設計し、図７では、フォワードプライマー（ＷＴ－Ｆ）が欠失の発生に対応する領域にハイブリダイズし、リバースプライマー（ＷＴ－Ｒ）が欠失の発生しない領域にハイブリダイズするように設計した例を示す。

　一方、第２プライマー対では、欠失が生じた箇所を挟むように、フォワードプライマー（Ｍｕｔ－Ｆ）及びリバースプライマー（Ｍｕｔ－Ｆ）を設計する。第２プライマーは、欠失が生じていない場合、すなわち特定の構造多型を含まない場合の塩基配列にもハイブリダイズすることが可能であるが、欠失が生じていない場合と比して、欠失が生じている場合に挟む塩基配列の長さが１／１０以下になるように設計する。これにより、欠失が生じていない場合は、第２プライマー対で挟まれる領域が長くなるため、ＰＣＲによる増幅が起きないか、欠失が生じている場合と比して増幅効率が悪くなる。

　ここで、図６の例の場合は、第１プライマー対のフォワードプライマーと、第２プライマー対のフォワードプライマーが共通の塩基配列を有する共通プライマーであってもよく、図７の例の場合は、第１プライマー対のリバースプライマーと、第２プライマー対のリバースプライマーが共通の塩基配列を有する共通プライマーであってもよい。

　（組み合わせ４）
　第四の組み合わせは、特定の構造多型を含まない場合と比して特定の構造多型を含む場合に挟む塩基配列の長さが２倍以上になるように設計された第１プライマー対と、特定の構造多型を含む場合にのみ挟む領域が存在ように設計された第２プライマー対との組み合わせ、である。

　第四の組み合わせについて、図８に示したタンデム重複による構造多型の場合を例に説明する。図８においては、説明の便宜のため、タンデム重複が発生する領域を斜めのハッチングで示し、更にタンデム重複により繰り返される領域の一単位を矢印で示した。

　図８に示すように第１のプライマー対は、Ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅにおけるタンデム重複に対応する領域（図中のＴＰに囲まれた領域）を挟み込むように設計し得る。第１プライマー対は、Ｍｕｔａｎｔにおいてもハイブリダイズすることが可能であり、挟む領域が存在することになるが、タンデム重複を含まない場合と比してタンデム重複を含む場合に挟む塩基配列の長さが２倍以上になるように設計することで、Ｍｕｔａｎｔの場合は塩基配列の増幅がされないか、Ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅの場合と比して増幅の効率が下がる。

　一方、第２プライマー対は、フォワードプライマー（Ｍｕｔ－Ｆ）及びリバースプライマー（Ｍｕｔ－Ｆ）のいずれかが、タンデム重複した配列同士が接合する箇所（図中のＪＰ）を含むように設計することで、タンデム重複を含む場合にのみ挟む領域が存在ように設計することができる。図８では、フォワードプライマー（Ｍｕｔ－Ｆ）がタンデム重複した配列同士が接合する箇所を含むように設計され、一方のリバースプライマー（Ｍｕｔ－Ｆ）はタンデム重複が生じない領域にハイブリダイズするように設計することで、タンデム重複を含む場合にのみ挟む領域が存在ように設計し得る。このように設計することで、第２プライマー対は、鋳型がＭｕｔａｎｔの場合のみ塩基配列の増幅が可能となる。

　ここで、図８の例の場合は、第１プライマー対のリバースプライマーと、第２プライマー対のリバースプライマーが共通の塩基配列を有する共通プライマーであってもよい。

　本実施形態におけるＰＣＲは、核酸増幅用酵素（ポリメラーゼ、特にＤＮＡポリメラーゼ）やｄＮＴＰミックス等、ＰＣＲのために必要な試薬については公知のものを適宜選択して用いることができる。また例えば、増幅サイクル数についても、用いる核酸増幅用酵素や増幅核酸長等に応じて、適宜設定することができる。例えば、増幅サイクル数としては、１０～１００サイクルが挙げられ、当該範囲の上限は９０、８０、７０、６０、５０若しくは４０であってもよく、当該範囲の下限は１５、２０、２５、３０、若しくは３５であってもよい。

　当該ＰＣＲによって増幅対象とされる領域の長さ、すなわちプライマー対のフォワードプライマーとリバースプライマーとで挟まれる領域の長さは、増幅対象となる領域を増幅させることができれば、特に制限されず、適宜設定することができる。例えば、５０～１０００ｂｐ（ｂａｓｅ　ｐａｉｒ：塩基対）であってもよく、１００～８００ｂｐであってもよく、１５０～５００ｂｐ程度であってもよく、１００～５００ｂｐ程度であってもよい。

　また、各プライマーも、増幅対象となる領域を増幅させることができる範囲であればその塩基長は特に制限はされず、例えば１５～５０塩基長、又は２０～４０塩基長程度であってよい。

　〔ＰＣＲの結果に基づく、特定の構造多型の有無の検出〕
　本実施形態おける検出工程は、前述のＰＣＲの結果に基づいて特定の構造多型の有無を検出する。検出に用いる方法としては、第１プライマー対によって増幅された増幅産物と、第２プライマー対によって増幅された増幅産物と、を区別して検出可能な方法であればよく、種々の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲによる増幅産物をＤＮＡマイクロアレイ法により検出する方法や、当該増幅産物の塩基配列を次世代シーケンサーにより解析する方法が挙げられる。

　また、検出工程におけるＰＣＲが、定量ＰＣＲ法である場合は、増幅されたＤＮＡ量を検出・定量することができるため、定量ＰＣＲの結果を解析することにより特定の構造多型の有無を検出することができる。以下、検出工程におけるＰＣＲが定量ＰＣＲである場合における、特定の構造多型の有無を検出する方法を説明する。定量ＰＣＲは、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、又はデジタルＰＣＲであってもよい。

　（定量ＰＣＲによる検出）
　定量ＰＣＲでは、ＤＮＡ量は、蛍光等の標識機能を有した核酸プローブ（以下、単にプローブという）又はインターカレーティング色素を用いて、光シグナルとして検出することができるが、増幅されたＤＮＡを特異的に検出するという観点から、蛍光等の標識機能を有し、ＰＣＲの増幅産物に結合する核酸プローブを用いて検出や定量をする方法が好ましい。本発明において、プローブとは、相補的な配列の標的核酸に結合（ハイブリダイゼーション）することができる核酸をいう。従って、プローブは、相補的な配列の標的核酸に結合することができれば、標的の核酸に対して完全な相補性を欠いてもよい。蛍光標識したプローブは、増幅サイクルの間のＤＮＡポリメラーゼによるプローブが加水分解され、消光部分を蛍光部分から外すことで、蛍光が発せられる。

　本実施形態における定量ＰＣＲに用いられるプローブは、第１プライマー対によって増幅される塩基配列に特異的に結合する第１プローブと、第２プライマー対よって増幅される塩基配列に特異的に結合する第２プローブと、を含む。第１プローブと第２プローブを有することにより、第１プライマー対によって増幅された産物と、第２プライマーにより増幅された産物とを明確に区別することができる。この際、第１プローブと、第２プローブとで標識する蛍光の種類（例えば、発する色など）を変えることにより、増幅産物が第１プライマー対を用いて増殖された塩基配列か、第２プライマー対を用いて増幅された塩基配列かをより明確に区別することができる。

　以下、本実施形態においてプローブがハイブリダイズする塩基配列の位置を、図１～図８を用いて例示する。下記に例示した位置にハイブリダイズするように設計した各プローブを用いることで、第１プローブによる蛍光は第１プライマー対による増幅がされた場合にのみ発せられ、第２プローブによる蛍光は第２プライマー対による増幅がされた場合にのみ発せられることとなる。なお、図１～図８では、各プライマーが鋳型ＤＮＡのセンス鎖にハイブリダイズするように示したが、各プライマーは鋳型ＤＮＡのアンチセンス鎖にハイブリダイズしてもよい。

　まず、図１を用いて、挿入の場合を例に説明する。第１プローブは、第１プライマー対に挟まれる領域であって、図１のＷｉｌｄ　ｔｙｐｅにおける構造多型に対応する箇所である塩基配列の切断点（図中のＢＰ）よりも上流の領域にハイブリダイズする。もしくは、第１プローブは当該塩基配列の切断点を含むようにハイブリダイズしてもよい。

　一方で、第２プローブは、第２プライマー対に挟まれる領域であって、挿入された領域とそれ以外の領域の接合点（図中のＪＰ）を含むようにハイブリダイズする。もしくは、第２プローブは、第２プライマー対に挟まれる領域であって、第２プライマー対の挿入された領域にハイブリダイズしてもよい。

　次に、図２及び図３における転座の場合を例に説明する。まず、図２に示す転座の場合は、第１プローブは、第１プライマー対に挟まれる領域であって塩基配列の切断点（図中のＢＰ）よりも下流側にハイブリダイズするか、又は第１プライマー対に挟まれる領域であって塩基配列の切断点を含む領域にハイブリダイズする。一方で、第２プローブは、第２プライマー対に挟まれる領域であって、転座によって入れ替わった領域であるＳｅｑ．２に相当する領域にハイブリダイズするか、Ｓｅｑ．１とＳｅｑ．２に相当する配列の接合点（図中のＪＰ）を含む領域にハイブリダイズする。

　また、図３に示す転座の場合は、第１プローブが、第１プライマー対に挟まれる領域であって塩基配列の切断点（図中のＢＰ）よりも上流側の領域か、又は第１プライマー対に挟まれる領域であって塩基配列の切断点（ＢＰ）を含む領域にハイブリダイズする。一方で、第２プローブは、第２プライマー対に挟まれる領域であって転座によって入れ替わった領域であるＳｅｑ．２に相当する領域にハイブリダイズするか、Ｓｅｑ．２とＳｅｑ．１に相当する配列の接合点（図中のＪＰ）を含む領域にハイブリダイズする。

　次に、図４及び図５を用いて、逆位の場合を例に説明する。図４及び図５に示すように、逆位の場合は、第１プローブが、第１プライマー対に挟まれる領域にハイブリダイズする。一方で、第２プローブは、第２プライマー対に挟まれる領域にハイブリダイズする。

　次に、図６及び図７を用いて、欠失の場合を例に説明する。まず、図６に示す欠失の場合は、第１プローブは、第１プライマー対に挟まれる領域であってＭｕｔａｎｔにおいて抜け落ちた領域に対応するＷｉｌｄ　ｔｙｐｅの領域（図中のＢＰに囲まれた部分）にハイブリダイズするか、又は第１プライマー対に挟まれる領域にある塩基配列の切断点（ＢＰ）含むようにハイブリダイズする。一方で、第２プローブは、第２プライマー対に挟まれる領域であって、欠失が発生した箇所（図中のＤＰ）の下流側の領域にハイブリダイズするか、欠失が発生した箇所（図中のＤＰ）を含むようにハイブリダイズする。

　また、図７に示す欠失の場合は、図６と同様に、第１プローブが、第１プライマー対に挟まれる領域であってＭｕｔａｎｔにおいて抜け落ちた領域に対応するＷｉｌｄ　ｔｙｐｅの領域（図中のＢＰに囲まれた部分）にハイブリダイズするか、又は第１プライマー対に挟まれる領域にある塩基配列の切断点（ＢＰ）を含むようにハイブリダイズする。一方で、第２プローブは、第２プライマー対に挟まれる領域であって、欠失が発生した箇所（図中のＤＰ）の上流側の領域にハイブリダイズするか、欠失が発生した箇所（ＤＰ）を含むようにハイブリダイズする。

　次に、図８を用いて、タンデム重複の場合を例に説明する。タンデム重複の場合は、第１プローブが、第１プライマー対に増幅される領域であって、Ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅにおけるタンデム重複に対応する領域（図中のＴＰに囲まれた領域）よりも上流の領域にハイブリダイズするか、又は第１プライマー対に増幅される領域であって、Ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅにおけるタンデム重複に対応する領域とその他の領域の境目のうち上流側の境目（図中の上流側のＴＰ）を含むようにハイブリダイズする。一方で、第２プローブは、第２プライマー対に増幅される領域であって、タンデム重複が生じた配列同士が接合する箇所（図中のＪＰ）を含むようにハイブリダイズする。

　なお、上述したＤＮＡマイクロアレイ法は、基板上にＤＮＡ断片を高密度に配置し、板上のＤＮＡ配列に対して、ハイブリダイゼーションすることによって、遺伝子情報を分析する方法である。また、デジタルＰＣＲ法とは、対象のサンプルを複数のウェルに分配し、個別にＰＣＲを並行して実行し、増幅の終了時に陽性反応の数をカウントする方法である。

　〔ゲノムＤＮＡの抽出工程・遊離ＤＮＡの単離工程〕
　本実施形態における方法は被検体からゲノムＤＮＡを抽出する工程、又は被検体から遊離ＤＮＡを単離する工程を有していてもよい。これらの工程は、当業者に周知の方法を用いて行うことができる。被検体からゲノムＤＮＡを抽出する方法、及び遊離ＤＮＡを単離するためのキットは、例えば、タカラバイオ社、Ｑｉａｇｅｎ社、サーモフィッシャーサイエンティフィック社、オメガ　バイオテック社、モーバイオ　ラボラトリーズ社、プロメガ社、ジェンスクリプト社等から購入して用いることができる。当該抽出・単離工程により抽出・単離をしたゲノムＤＮＡ又は遊離ＤＮＡをＰＣＲに用いることにより、被検体をそのままＰＣＲ等に用いるよりも、効率よく目的の塩基配列を増幅することができ、検出の精度が向上する。

　〔ゲノムＤＮＡ・遊離ＤＮＡの全ゲノム配列解析工程〕
　本実施形態は、被検体に由来するゲノムＤＮＡ又は遊離ＤＮＡについて全ゲノム配列解析を行う全ゲノム配列解析工程を有していてもよい。ここで、全ゲノム配列解析とは、全ゲノムの塩基配列を網羅的に解析する手法であり、例えば、次世代シーケンサー（ＮＧＳ）とスーパーコンピュータを使って、個人やがんの全ゲノム情報を解析し、それぞれの違いや変化を同定することができる技術である。また、本実施形態は、全ゲノム配列解析工程の結果に基づき、特定の構造多型を決定する決定工程を含んでもよい。これらの工程を有することにより、各患者の疾患の原因となる構造多型をより正確に把握することができ、一人ひとりにおける治療精度を格段に向上させることができる。

　本実施形態において次世代シーケンサーとは、サンガー法を利用したキャピラリーシーケンサー（第一世代シーケンサーと呼ばれる）に対比して分類されるシーケンサーを意味する。次世代シーケンサーは、第二世代、第三世代、第四世代、及び今後開発されるシーケンサーを含む。現時点において最も普及している次世代シーケンサーは、ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成又はＤＮＡリガーゼによる相補鎖結合に連動した蛍光又は発光をとらえ塩基配列を決定する原理のシーケンサーである。具体的には、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）、ＨｉＳｅｑ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、ＨｉＳｅｑは登録商標）、Ｒｏｃｈｅ４５４（Ｒｏｃｈｅ社），ＮｏｖａＳｅｑ６０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）、ＤＮＢＳＥＱ－Ｇ４００（ＭＧＩ社）、ＤＮＢＳＥＱ－Ｔ７（ＭＧＩ社）などが挙げられる。

　次世代シーケンサーにより得られた配列データをアライメントする手段としては、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ　Ａｌｉｇｎｅｒ（ＢＷＡ）が挙げられ、ＢＷＡによって既知のヒトゲノム配列へ配列データをマッピングすることができる。ＳＡＭｔｏｏｌｓ等により、ＰＣＲ重複、不良なシーケンスリード、アダプター配列を除去した後に、遺伝子を解析する手段としては、Ｍｕｔｅｃｔ２（ｈｔｔｐｓ：／／ｇａｔｋ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｈｃ／ｅｎ－ｕｓ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／３６００３７５９３８５１－Ｍｕｔｅｃｔ２）、Ｇｅｎｏｍｏｎ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｏｎ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ＧｅｎｏｍｏｎＰａｇｅｓＲ／）等の解析パイプラインが挙げられる。

　〔相補的ＤＮＡの合成工程〕
　本実施形態における方法は被検体からＲＮＡを抽出し、当該ＲＮＡを鋳型として相補的ＤＮＡを合成する工程を有していてもよい。当該工程は、当業者に周知の方法を用いて行うことができる。例えば、ＲＮＡの抽出には、フェノール／クロロホルム法、ＡＧＰＣ（ａｃｉｄ　ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ　ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ－ｐｈｅｎｏｌ－ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法、シリカをコーティングした特殊な磁性体粒子を用いる方法、あるいは市販のＲＮＡ精製用試薬（例えばＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）、ＱＩＡｚｏｌ（登録商標）、ＩＳＯＧＥＮ等）などを用いることができる。また、ＲＮＡを鋳型とした相補的ＤＮＡの合成では、ＲＮＡ、プライマー、逆転写酵素、及び基質を含有する反応液をインキュベートして、該ＲＮＡに逆転写酵素を作用させてｃＤＮＡを合成すればよい。該プライマーとしては、解析したい特定のＲＮＡを標的としたプライマーを用いてもよい。ｃＤＮＡをＰＣＲに用いることにより、被検体をそのままＰＣＲ等に用いるよりも、効率よく目的の塩基配列を増幅することができ、検出の精度が向上する。また、本実施形態は、合成した相補的ＤＮＡをシーケンシングし、当該シーケンシングの結果に基づき、特定の構造多型を決定する工程を含んでもよい。

　〔アンプリコンシーケンス工程〕
　本実施形態における検出工程は、ＰＣＲによって得られた増幅産物（アンプリコン）のシーケンシングを行う、アンプリコンシーケンス工程を有していてもよい。ＰＣＲによる増幅産物のシーケンシングを行ない、塩基配列を解読することにより、構造多型の存在の有無をより正確に把握することができる。

　アンプリコンシーケンス工程においてシーケンシングを行う方法は、特に制限されないが、上述の次世代シーケンサーを用いた方法が好ましい。次世代シーケンサーを用いたシーケンスでは、例えば、解析に必要なアダプター配列をライゲーションしたプライマー対を用いてＰＣＲで得た増幅産物を更に増幅し、その後、インデックスＰＣＲによって任意の識別配列及びシーケンス配列を付加することで、各種シーケンサーでのシーケンスが可能となる。また、ＰＣＲで用いる各プライマー対にアダプター配列を付加することで、増幅産物をシーケンスに用いることもできる。

　〔微小残存病変（ＭＲＤ）分析〕
　本実施形態における特定の構造多型の有無を検出する方法は、残存微小病変（ＭＲＤ）の分析に用いることができる。微小残存病変（ＭＲＤ）とは、治療中および治療後も体内に残り、最終的には疾患の再発を引き起こす可能性がある少数の癌細胞を指す。本実施形態における方法は、ＭＲＤが有する特定の構造多型を検出することにより、間接的にＭＲＤを検出することができる。

　例えば、治療中及び治療後の患者から定期的に被検体を回収し、当該被検体に対して本実施形態の方法を適用することによって、患者の被検体におけるＭＲＤの存在の有無やその増減を定期的に観察し、患者の疾患の治療状況や、疾患の再発の状況を把握することができる。

　〔プライマーセット〕
　本実施形態において、プライマーセットは被検体に由来するゲノムＤＮＡ、遊離ＤＮＡ又は相補的ＤＮＡから成るサンプルＤＮＡにおける特定の構造多型の有無を検出するために用いられるものであり、サンプルＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによる増幅反応を行うための、第１プライマー対と第２プライマー対との組み合わせから成る。第１プライマー対と第２プライマー対との組み合わせとしては、上述した各組み合わせが挙げられる。

　以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。なお、実験に用いた被検体については、すべての患者よりインフォームドコンセントを得ている。

　（１）被検体の取得及びゲノムＤＮＡの抽出
　（被検体の取得）
　被検体として急性リンパ性白血病（ａｃｕｔｅ　ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ　ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＡＬＬ）の患者（以下、患者Ａとする）から骨髄を得た。また、同じ患者Ａから正常組織比較検体（コントロール）として口腔粘膜細胞をスワブで採取した。

　（ゲノムＤＮＡの抽出）
　上述の骨髄からＧｅｎｔｒａ　Ｐｕｒｅｇｅｎｅ　Ｂｌｏｏｄ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてのゲノムＤＮＡ抽出を行った。また、口腔粘膜細胞からのゲノムＤＮＡ抽出はＱＩＡａｍｐ　ＤＮＡ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて行った。

　（２）全ゲノム配列解析及び、検出すべき特定の構造多型の決定
　（次世代シーケンスによる網羅的遺伝子解析）
　抽出されたゲノムＤＮＡを用いて全ゲノム配列解析を行った。ＮＧＳ用のライブラリ調整は、Ｔｒｕｓｅｑ　ＤＮＡ　Ｎａｎｏ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｐｒｅｐ　ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いて行った。Ｃｏｖａｒｉｓ　Ｍ２２０（Ｃｏｖａｒｉｓ社）を用いて物理的断片化を行った１００ｎｇのＤＮＡについて、末端修復、サイズセレクション、アダプター付加、ＰＣＲ増幅、濃縮を行うという手順でライブラリ作成を行なった。作成したライブラリは、Ｑｕｂｉｔ　ｄｓＤＮＡ　ＨＳ　Ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて定量し、Ａｇｉｌｅｎｔ　４２００　Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を使用して電気泳動で単一バンドが増幅されていることを確認した。作成したライブラリは、Ｍａｃｒｏｇｅｎ　Ｊａｐａｎ社にてＮｏｖａｓｅｑ　６０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いたシーケンスを行い、リード情報を含むＦＡＳＴＱファイルを得た。

　（スーパーコンピュータを用いたデータ解析）
　上述のシーケンスによって得られたＦＡＳＴＱファイルを、東京大学医科学研究所ヒトゲノム解析センターのスーパーコンピュータＳＨＩＲＯＫＡＮＥ４に投入し、解析した。データ解析は、次世代シーケンスデータ専用のパイプラインソフトウェアＧｅｎｏｍｏｎ２（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｏｎ．ｒｅａｄｔｈｅｄｏｃｓ．ｉｏ／ｊａ／ｌａｔｅｓｔ／）を用いて行われた。シーケンスデータからアダプター配列、サンプル固有のインデックス配列、ＰＣＲによる重複リード、シーケンスクオリティの低いリードの除去といった前処理を行った後に、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ　Ｈｕｍａｎ　Ｂｕｉｌｄ　３７（ＧＲＣｈ３７，ｈｇ１９）をリファレンス配列としてマッピングを行った。マッピングした参照配列と比較して変異がある位置情報のシーケンスリードについて、統計的検定を用いた計算処理を行い、骨髄検体由来のＤＮＡとコントロール（口腔粘膜細胞由来のＤＮＡ）を比較し、有意に変異が観察される位置情報の検出を行った。統計的検定は、Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定を用いて行い、帰無仮説の棄却域はｐ値＜０．１０で設定した。一塩基置換（Ｓｉｎｇｌｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｖａｒｉａｎｔｓ　：ＳＮＶｓ）、塩基の挿入／欠失（Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ／Ｄｅｌｅｔｉｏｎ　：Ｉｎｄｅｌｓ）、融合遺伝子異常（Ｆｕｓｉｏｎ）を検出し、ＡＮＮＯＶＡＲ（ｈｔｔｐｓ：／／ａｎｎｏｖａｒ．ｏｐｅｎｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｒｇ／ｅｎ／ｌａｔｅｓｔ／）のデータベースを元にアノテーションが行われた。

　（検出すべき特定の構造多型の決定）
　全ゲノムシーケンシングのデータからＧｅｎｏｍｏｎ２を用いて検出した遺伝子変異から、ＡＬＬ発症に関与すると考えられるがん関連遺伝子変異、すなわち疾患のドライバー変異となる構造多型の特定を行った。まず、遺伝子変異を有するアレルの割合（Ｖａｒｉａｎｔ　Ａｌｌｅｌｅ　Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ：　ＶＡＦ）が３％未満の変異、ＮＣＢＩのｄｂＳＮＰ　（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｎｐ／）を含む複数の一塩基多型データベースに登録されている既知の病的ではない変異、コントロールの検体（口腔粘膜細胞由来）にも存在しシーケンスエラーと考えられる変異、シーケンスリードのクオリティが低い変異、アミノ酸置換を伴わない変異を除外した。次に、ＣＯＳＭＩＣ　ｖｅｒｓｉｏｎ　９０，　９１（ｈｔｔｐｓ：／／ｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｏｓｍｉｃ）、日本血液学会の造血器腫瘍ゲノム検査ガイドライン２０１８，２０２０年度版（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｓｈｅｍ．ｏｒ．ｊｐ／ｇｅｎｏｍｇｌ／ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ）などの腫瘍データベースを参照し、登録のある変異や、造血器腫瘍関連遺伝子にある塩基の挿入や欠失などの有害な変異を抽出しドライバー変異であるかどうかを判断した。マッピングされたリードについてはＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｖｉｅｗｅｒ　ｖｅｒｓｉｏｎ　２．８．２（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｉｇｖ／）を用いて視覚的に確認し、Ｆｕｓｉｏｎの切断点の同定も行った。

　なお、ドライバー遺伝子変異の同定においては腫瘍検体の遺伝子変異と正常コントロールである口腔粘膜検体の遺伝子変異の比較を行うことを前提としているが、ＣＨＩＰ　（Ｃｌｏｎａｌ　Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ　ｗｉｔｈ　Ｉｎｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅ　Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）変異の影響も考慮して行う必要があり、検出した変異アレル割合と臨床検査における腫瘍割合に齟齬がないことも確認した。

　上記の解析の結果、患者ＡのＡＬＬ発症に関与すると考えられるドライバー変異として、２２番染色体のＢＣＲ遺伝子の２３６３１９２８番目の塩基と９番染色体のＡＢＬ遺伝子の１３３６８８６７６番目の塩基との間で転座が生じているＢＣＲ－ＡＢＬ融合遺伝子を発見した（図９参照）。そこで、当該ＢＣＲ－ＡＢＬ融合遺伝子を、検出すべき特定の構造多型として決定した。

　（３）定量ＰＣＲによる構造多型の検出
　（プライマーとプローブの作成）
　上記で患者Ａの特定の構造多型として決定したＢＣＲ－ＡＢＬ融合遺伝子を検出するための、第１プライマー対と第２プライマー対、第１プローブ、第２プローブを作製した。作成したプライマー及びプローブを表１に示す。なお、配列表の配列番号１が第１プライマー対のフォワードプライマー、配列番号２が第１プライマー対のリバースプライマー、配列番号３が第２プライマー対のフォワードプライマー、配列番号４が第２プライマー対のリバースプライマー、配列番号５が第１プローブ、配列番号６が第２プローブである。

　図９に示すように第１プライマー対は、ＢＣＲにおける特定の構造多型に対応する箇所、すなわち転座が発生する際にＢＣＲの塩基配列が切断される切断点（図中の２３６３１９２８）を挟むように設計した。一方、第２プライマー対は、フォワードプライマー（Ｍｕｔ－Ｆ）がＭｕｔａｎｔのＢＣＲに相当する配列にハイブリダイズし、リバースプライマー（Ｍｕｔ－Ｆ）がＡＢＬ１に相当する配列にハイブリダイズするように設計した。また第１プローブは、第１プライマー対に挟まれる領域であって塩基配列の切断点（図中の２３６３１９２８）を含む領域にハイブリダイズするように設計した。一方で、第２プローブは、第２プライマー対に挟まれる領域であって、ＢＣＲとＡＢＬ１に相当する配列の接合点を含む領域にハイブリダイズするように設計した。また、第１プライマー対と第２プライマー対のフォワードプライマーについては共通の配列を有する共通プライマーとして作成した。

　プライマーとプローブの各配列は、Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　ｖｅｒｓｉｏｎ　５．０（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて設計した。また、プローブは３’末端にクエンチャーとしてＢｌａｃｋ　Ｈｏｌｅ　Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＨＱ、登録商標）１を修飾し、５’末端に蛍光色素として変異型には６－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　（ＦＡＭ）を、野生型には６－ｃａｒｂｏｘｙ－２，４，４，５，７，７－ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｅｓｔｅｒ（ＨＥＸ）を修飾した。プライマー及びプローブの合成はＦＡＳＭＡＣ社にて行われた。

　（デジタルＰＣＲ及びその結果の解析）
　続いて、上述したＤＮＡの抽出で得た骨髄検体由来のＤＮＡと、コントロールである口腔粘膜細胞由来のＤＮＡとを用いて、それぞれデジタルＰＣＲを実施した。

　まず、各ＤＮＡにｄｄＰＣＲ　Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－ｒａｄ社）を加え、さらに上述で作成した第１プライマー対、第２プライマー対、第１プローブ及び第２プローブを加え、調整済みサンプルとした。

　続いて、ＱＸ２００　Ｄｒｏｐｌｅｔ　Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ－ｒａｄ社）の専用カートリッジにＤｒｏｐｌｅｔ　Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ　Ｏｉｌ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｂｅｓ（Ｂｉｏ－ｒａｄ社）と上述の調整済みサンプルを分注し、カートリッジをジェネレーターにセットし、ドロップレットを作製した。

　続いて、作製したドロップレット内のＤＮＡをＶｅｒｉｔｉ　Ｄｘ　サーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）でＰＣＲ反応を実施し、増幅した。９５℃１０分の初期変性後、９４℃１０秒間と５８－６１℃、１分のアニーリングを４０サイクル行い、９８℃、１０分の伸長反応を行った。

　（デジタルＰＣＲの結果の解析）
　ＱＸ２００　Ｄｒｏｐｌｅｔ　Ｒｅａｄｅｒ及びＱｕａｎｔａＳｏｆｔ（ともにＢｉｏ－ｒａｄ社）を用いて、ドロップレットの蛍光を測定し、その結果を解析することにより、患者Ａの特定の構造多型である転座が検出可能であるかを確認した。結果を図１０に示す。

　図１０（ａ）が骨髄検体由来のＤＮＡの結果、図１０（ｂ）がコントロールである口腔粘膜細胞由来のＤＮＡの結果を示す。図中、ＷＴが野生型（すなわち、転座が生じていないもの）、ＭＴが変異型（すなわち、転座が生じているもの）を意味し、＋（プラス）は塩基配列が増幅され検出された結果を示し、－（マイナス）は塩基配列が増幅されず検出されなかった結果を示す。例えば、ＷＴ－／ＭＴ＋は、野生型が増幅されず、変異型のみが増幅されたドロップレットを示し、ＷＴ＋／ＭＴ＋は、野生型も変異型も増幅されたドロップレットを示す。

　図１０（ａ）に示した通り、骨髄検体由来のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った結果、ＷＴ－／ＭＴ＋が確認された。すなわち、患者Ａの特定の構造多型である転座が検出可能であることが確認された。加えて、ＷＴ＋／ＭＴ＋、ＷＴ＋／ＭＴ－及びＷＴ－／ＭＴ－も確認され、変異型及び野生型の有無をそれぞれ検出可能であることが確認された。一方で、口腔粘膜細胞由来のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った結果である図１０（ｂ）では、ＷＴ＋／ＭＴ－及びＷＴ－／ＭＴ－のみが確認された。すなわち、患者Ａの特定の構造多型である転座が存在しないことも示すことができることが確認された。

　上記の方法は、患者Ａの特定の構造多型であるＢＣＲ－ＡＢＬ融合遺伝子の有無を検出するための、患者Ａに最適化した方法である。例えば、当該方法を患者Ａに対して定期的に実施することにより、患者ＡにおけるＢＣＲ－ＡＢＬ融合遺伝子の有無や増減を把握することができるため、患者Ａの病気の進行状況や治療の効果などを把握することができる。

　なお、本発明は、上述した実施形態や実施例のみに限定されるものではなく、特許請求の範囲内において、種々改変することができる。例えば、上記の実施例では、患者ＡのＢＣＲ－ＡＢＬ融合遺伝子に最適化した検出方法やプライマーセット、プライマーセットの設計方法を示したが、本発明の実施形態はこれに制限されるものではない。本発明は、個々の患者やそれぞれの構造多型に対応したプライマー対やプローブを作製することにより、各人に最適化した構造多型の検出を可能とすることができる。

Claims

　被検体に由来するゲノムＤＮＡ、遊離ＤＮＡ又は相補的ＤＮＡから成るサンプルＤＮＡにおける特定の構造多型の有無を検出する方法であって、
　前記サンプルＤＮＡを鋳型とし、第１プライマー対と第２プライマー対との組み合わせを用いたＰＣＲを行い、その結果に基づいて前記特定の構造多型の有無を検出する検出工程を含み、
　前記第１プライマー対は、前記特定の構造多型を含まない野生型塩基配列を検出するためのものであり、前記特定の構造多型を含まないサンプルＤＮＡにおける前記特定の構造多型に対応する箇所又は領域の一部若しくは全部を含む塩基配列を挟むように設計され、
　前記第２プライマー対は、前記特定の構造多型を含む変異型塩基配列を検出するためのものであり、前記特定の構造多型を含むサンプルＤＮＡにおける前記特定の構造多型が発生した箇所又は領域の一部若しくは全部を含む塩基配列を挟むように設計された、方法。
　前記第１プライマー対と前記第２プライマー対との前記組み合わせは、
　前記特定の構造多型を含まない場合と比して前記特定の構造多型を含む場合に挟む塩基配列の長さが１０倍以上になるように設計された前記第１プライマー対と、前記特定の構造多型を含む場合にのみ挟む塩基配列が存在するように設計された前記第２プライマー対の組み合わせ、
　前記特定の構造多型を含まない場合にのみ挟む塩基配列が存在するように設計された前記第１プライマー対と、前記特定の構造多型を含む場合にのみ挟む領域が存在するように設計された前記第２プライマー対と組み合わせ、
　前記特定の構造多型を含まない場合にのみ挟む塩基配列が存在するように設計された前記第１プライマー対と、前記特定の構造多型を含まない場合と比して前記特定の構造多型を含む場合に挟む塩基配列の長さが１／１０以下になるように設計された前記第２プライマー対との組み合わせ、及び
　前記特定の構造多型を含まない場合と比して前記特定の構造多型を含む場合に挟む塩基配列の長さが２倍以上になるように設計された前記第１プライマー対と、前記特定の構造多型を含む場合にのみ挟む領域が存在ように設計された前記第２プライマー対との組み合わせ、を含む、請求項１に記載の方法。
　前記第１プライマー対の一方のプライマーと、前記第２プライマー対の一方のプライマーと、は同一の塩基配列を有する共通プライマーである、請求項１又は２に記載の方法。
　前記共通プライマーは、前記サンプルＤＮＡ中の前記特定の構造多型が存在する領域を含まない塩基配列に結合するように設計される、請求項３に記載の方法。
　前記ＰＣＲによって得られた増幅産物のシーケンシングを行う、アンプリコンシーケンス工程を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
　前記ＰＣＲは定量ＰＣＲである、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
　前記定量ＰＣＲはデジタルＰＣＲである、請求項６に記載の方法。
　前記定量ＰＣＲは、標識機能を有し、ＰＣＲの増幅産物に結合する核酸プローブを用いて定量を行う、請求項６又は７に記載の方法。
　前記核酸プローブは、前記第１プライマー対に挟まれる塩基配列に特的に結合する第１プローブと、前記第２プライマー対に挟まれる塩基配列に特異的に結合する第２プローブと、を含む、請求項８に記載の方法。
　前記サンプルＤＮＡが前記ゲノムＤＮＡ又は前記遊離ＤＮＡから成る場合に、前記サンプルＤＮＡについて全ゲノム配列解析を行う全ゲノム配列解析工程を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
　前記全ゲノム配列解析工程の結果に基づき、前記特定の構造多型を決定する決定工程を含む、請求項１０に記載の方法。
　前記サンプルＤＮＡが前記ゲノムＤＮＡ又は前記遊離ＤＮＡから成る場合に、前記被検体からゲノムＤＮＡを抽出する工程、又は前記被検体から遊離ＤＮＡを単離する工程を有する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
　前記被検体は、ヒト又は動物の血液、骨髄、体腔液、生体組織、及びリンパ組織を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
　前記特定の構造多型は、挿入、転座、欠失、逆位、及びタンデム重複からなる群より選ばれる、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
　前記特定の構造多型は、疾患のドライバー変異である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
　請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法を用いて残存微小病変（ＭＲＤ）の分析を行うＭＲＤ分析方法。
　被検体に由来するゲノムＤＮＡ、遊離ＤＮＡ又は相補的ＤＮＡから成るサンプルＤＮＡにおける特定の構造多型の有無を検出するために用いられるプライマーセットであって、
　前記プライマーセットは、前記サンプルＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによる増幅反応に用いられる、第１プライマー対と第２プライマー対との組み合わせから成り、
　前記第１プライマー対は、前記特定の構造多型を含まない野生型塩基配列を検出するためのものであり、前記特定の構造多型を含まないサンプルＤＮＡにおける前記特定の構造多型に対応する箇所又は領域の一部若しくは全部を含む塩基配列を挟むように設計され、
　前記第２プライマー対は、前記特定の構造多型を含む変異型塩基配列を検出するためのものであり、前記特定の構造多型を含むサンプルＤＮＡにおける前記特定の構造多型が発生した箇所又は領域の一部若しくは全部を含む塩基配列を挟むように設計された、プライマーセット。
　被検体に由来するゲノムＤＮＡ、遊離ＤＮＡ又は相補的ＤＮＡから成るサンプルＤＮＡにおける特定の構造多型の有無を検出するために用いられるプライマーセットの設計方法であって、
　前記プライマーセットは、前記サンプルＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによる増幅反応に用いられる、第１プライマー対と第２プライマー対との組み合わせから成り、
　前記第１プライマー対は、前記特定の構造多型を含まない野生型塩基配列を検出するためのものであり、前記特定の構造多型を含まないサンプルＤＮＡにおける前記特定の構造多型に対応する箇所又は領域の一部若しくは全部を含む塩基配列を挟むように設計され、
　前記第２プライマー対は、前記特定の構造多型を含む変異型塩基配列を検出するためのものであり、前記特定の構造多型を含むサンプルＤＮＡにおける前記特定の構造多型が発生した箇所又は領域の一部若しくは全部を含む塩基配列を挟むように設計される、プライマーセットの設計方法。