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WO2022163770A1 - ゲノム編集ツールの評価方法 - Google Patents

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WO2022163770A1
WO2022163770A1 PCT/JP2022/003152 JP2022003152W WO2022163770A1 WO 2022163770 A1 WO2022163770 A1 WO 2022163770A1 JP 2022003152 W JP2022003152 W JP 2022003152W WO 2022163770 A1 WO2022163770 A1 WO 2022163770A1
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WO
WIPO (PCT)
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genome editing
binding
editing tool
genome
dcas9
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PCT/JP2022/003152
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English (en)
French (fr)
Inventor
康志 岡田
一穂 池田
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RIKEN
Original Assignee
RIKEN
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material

Definitions

  • the present invention relates to methods for evaluating genome editing tools.
  • Genome editing tools represented by CRISPR/Cas9 are tools that specifically recognize specific target sequences in the genome and perform editing such as cutting. However, it is known to have off-target activity that binds to and edits other than the designed target sequence. Especially in clinical application to humans, it is necessary to quantitatively evaluate off-target activity as safety evaluation. Especially for CRISPR/Cas9, this high off-target activity is an obstacle for clinical application, and the development of improved genome editing tools with low off-target activity is underway.
  • a general method for evaluating the safety (specificity) of genome editing is to analyze the entire genome sequence after genome editing and confirm the presence or absence of mutations in sequences other than the target sequence.
  • this method cannot evaluate off-target activity below a mutation rate of about 0.5% or less due to sequence reading errors, sample-derived SNPs, mutations, etc.
  • ChIP-seq that perform genome-wide search for binding sites of genome editing tools on genomic DNA and perform sequence analysis. It is not possible to distinguish between the sites that are physically linked and the sites that are linked to cause a genome editing reaction. It is also not possible to obtain kinetic parameters of the genome editing reaction that can be used as indicators for tool improvement.
  • An object of the present invention is to provide a method for evaluating the safety (specificity) of genome editing, particularly a method for quantitative evaluation, specifically a method for quantitatively evaluating off-target activity in a genome editing tool.
  • the present inventors have conducted intensive research and found that it is possible to evaluate a genome editing tool by performing single-molecule imaging of a fluorescence-labeled genome editing tool in the nucleus of a living cell. rice field.
  • the imaging technology we succeeded in quantitatively evaluating where, with what frequency, and with what kind of kinetics the genome editing tool binds to the genome sequence, leading to the completion of the present invention.
  • rice field That is, the present invention is as follows.
  • a method for evaluating genome editing tools using fluorescence single-molecule imaging (2) The method according to (1) above, wherein the fluorescence single-molecule imaging method utilizes a binding reaction rate analysis technique. (3) The method according to (1) above, which comprises the step of analyzing the binding site of the genome editing tool to the genomic DNA by mapping the binding site in a microscope image. (4) The method according to any one of (1) to (3) above, including the step of analyzing off-target effects. (5) The method according to any one of (1) to (4) above, wherein the genome editing tool is TALE or CRISPR/dCas9. (6) The method according to any one of (1) to (5) above, wherein a Halo-tag is used to label the genome editing tool.
  • Genome-editing tools with high specificity bind specifically and repeatedly only to the target sequence, whereas genome-editing tools with low specificity repeatedly bind to multiple sites in the nucleus.
  • the presence of binding sites can be visualized.
  • mapping the binding sites in the microscope image it is possible to analyze where the binding occurs spatially. This enables comprehensive and direct safety evaluation of individual genome editing tools or individual designed target sequences to determine whether they function as highly specific genome editing tools in target cells. became possible.
  • FIG. 2 shows the results of intranuclear fluorescence single-molecule imaging of living cells (Indian barking deer cells incorporating LacO sequences) using a genome editing tool (TALE) targeting the LacO sequences.
  • TALE genome editing tool
  • FIG. 4 shows comparison of binding specificities after double staining with TALE and dCas9 targeting sequences flanking the second exon of the Muc4 gene.
  • FIG. 3 shows the results of designing three gRNAs for the second exon of the Muc4 gene and examining the difference in binding specificity among them.
  • FIG. 2 shows target sequences on genomic DNA used in Examples 2 and 3.
  • Genome editing tool generally refers to a technology in which a DNA cleavage domain is fused to a system that recognizes the base sequence of target DNA, but in the present invention, a system that recognizes and binds to the base sequence of target DNA is intended, regardless of the presence or absence of DNA cleavage.
  • ZFN zinc-finger nuclease
  • TALEN transcription activator-like effector nuclease
  • CRISPR clustered regularly interspaced short palindromic repeats
  • Cas CRISPR-associated proteins
  • ZFNs are artificial nucleases with zinc fingers as DNA-binding domains, and since one zinc finger recognizes 3 nucleotides, ZFNs with 3-6 zinc fingers are specific for 9-18 base pairs (bp). It binds and introduces a DNA double-strand break with a pairwise specificity of 18-36 bp.
  • TALENs are artificial nucleases that have TALEs of the phytopathogenic bacterium Xanthomonas as a DNA-binding domain.
  • the DNA-binding domain of TALE consists of 34 amino acids that recognize one base, and TALENs with 15 to 20 units of 34 amino acids are created for each of the sense strand and antisense strand, and the DNA double strand is attached to the target site. Introduce cutting.
  • the CRISPR/Cas system introduces a DNA double-strand break at the target base sequence using a complex of a Cas nuclease that has DNA double-strand breaking activity and a target-sequence-specific single-stranded guide RNA.
  • the CRISPR/Cas system has become a standard technology for genome editing used around the world due to its convenience, high efficiency, and versatility.
  • CasX and the like preferably Cas9.
  • Cas9 includes Streptococcus pyogenes-derived Cas9 (SpCas9), Staphylococcus aureus-derived Cas9 (SaCas9), Francisella novicida-derived Cas9 (FnCas9), Campylobacter jejuni-derived Cas9 (CjCas9), and Streptococcus thermophilus-derived Cas9 (St1Cas9, St3Cas9).
  • Cpf1 includes Acidaminococcus sp.-derived Cpf1 (AsCpf1) and Lachnospiraceae bacterium-derived Cpf1 (LbCpf1).
  • the CRISPR/Cas system can also use mutants (subspecies) in which the amino acid sequence of Cas nuclease is mutated.
  • dCas9 (dead Cas9) is a nuclease-deficient form of Cas9 that binds to DNA sequences but does not cleave them.
  • nCas9 (nickase Cas9) introduces a single-stranded nick, and xCas9 (Hu, JH et al., Nature, 556, 57-63. (2018)) has broad PAM compatibility and high DNA specificity.
  • any genome editing tool may be used, but since the binding of the genome editing tool to the genome sequence is evaluated, the one that does not cut the DNA sequence, such as dCas9, is preferred.
  • Single-molecule imaging is an imaging technique that tracks the behavior of molecules at the single-molecule level.
  • Fluorescent single-molecule imaging is an imaging technique that visualizes the dynamics of fluorescently-labeled molecules of interest in solutions or cells using a microscope.
  • molecules in solutions and in cells usually exhibit diffusional motion (Brownian motion).
  • diffusional motion is constrained and halted.
  • Kinetic analysis of molecular binding and dissociation is performed using this dynamic change as an index.
  • mapping the binding sites in the microscope image it is possible to analyze where the binding occurs spatially.
  • the genome editing tool is fluorescently labeled, the binding of the fluorescently labeled genome editing tool and the target sequence on the genomic DNA is visualized, and quantitatively evaluated by reaction rate analysis.
  • the fluorescent label can be added to any position of the genome editing tool, but when using dCas9 as the genome editing tool, for example, it is preferably added to the C-terminus of dCas9. Furthermore, it is preferred for localization to the nucleus that a nuclear localization signal sequence is added to the C-terminus.
  • fluorescent labels examples include green fluorescent protein (e.g., green fluorescent protein; GFP, enhanced green fluorescent protein; EGFP, monomeric enhanced green fluorescent protein; mEGFP), rhodamine dyes (e.g., tetramethylrhodamine; TMR, tetramethylrhodamine methylester; TMRM), silicon A rhodamine dye (eg, SaraFluor), JF646, etc. can be used, or a tag sequence (eg, HaloTag, SNAP-tag, CLIP-tag) can be added to covalently bind a fluorescent label.
  • green fluorescent protein e.g., green fluorescent protein; GFP, enhanced green fluorescent protein
  • EGFP monomeric enhanced green fluorescent protein
  • mEGFP rhodamine dyes
  • TMR tetramethylrhodamine methylester
  • TMRM silicon A rhodamine dye
  • JF646, etc. can be used, or a tag sequence (e
  • dCas9-gRNA fluorescently labeled A complex of dCas9 and guide RNA (hereinafter also referred to as dCas9-gRNA) is produced. Since dCas9-gRNA needs to bind to genomic DNA, a nuclear localization signal is added. The obtained dCas9-gRNA is brought into contact with the cells to be measured.
  • the diffusion dynamics (diffusion movement) of dCas9-gRNA in the cell nucleus is determined.
  • the diffusion kinetics is determined using the fluorescent label added to dCas9 as an index.
  • HaloTag is used as a fluorescent label, it is stained with HaloTag TMR ligand (Promega), STELLA Fluo 650 HaloTag ligand (Goryo Chemical), or the like. Any known method can be used to determine the diffusion dynamics of dCas9-gRNA, but for the purposes of the present invention, it is necessary to track the diffusion dynamics of dCas9 at the level of a single molecule. method is used.
  • single-molecule imaging may be performed by highly inclined and laminated optical sheet microscopy, HILO microscopy; HILO method) that illuminates with light thinner than the thickness of cells under a microscope. Physics 49(6), 318-321 (2009)).
  • HILO method samples such as cells are illuminated in a thin layer of light, brightly illuminating only the desired areas and not illuminating unnecessary areas, so higher image quality can be expected compared to conventional methods.
  • the annular HILO method which is an improved version of the HILO method.
  • the laser beam is divided into 72 parts on the circumference by a transmissive diffractive optical element, magnified by an axicon lens, and then focused on the rear exit exit pupil plane of a high numerical aperture (NA) objective lens.
  • NA numerical aperture
  • TIRF Ordinary total internal reflection illumination
  • microscopes provide illumination from only one direction, but annular illumination is preferable because illumination from all directions makes it possible to uniformly illuminate a wider field of view.
  • the diffusion kinetics of the genome editing tool is determined from the captured fluorescence images.
  • the position and brightness information of the bright spots of the genome editing tool are obtained using a bright spot detection algorithm for the captured fluorescence image. Furthermore, information on the trajectory of each bright spot is acquired by connecting the bright spots located closest to each other under a certain threshold value in the time-series images.
  • the bright spot detection algorithm an existing algorithm can be used as long as it can estimate the position of a single fluorescent molecule, preferably at high speed and with high accuracy. Specific examples include a two-dimensional Gaussian fitting method. .
  • an algorithm based on radial symmetry Optics Letters Vol. 37, Issue 13, pp. 2481-2483 (2012)
  • various other estimation methods have been proposed.
  • the slow diffusion kinetics of genome-editing tools in the cell nucleus implies a long duration of binding of genome-editing tools to genomic DNA, in which case the binding of genome-editing tools to their target sites is specific.
  • slow diffusion kinetics means that dCas9-gRNA has a long binding duration to genomic DNA.
  • the binding of dCas9-gRNA to the target site can be specific.
  • the fast diffusion dynamics of the genome editing tool in the cell nucleus means that the binding duration of the genome editing tool to the genomic DNA is short, and in this case, the binding of the genome editing tool to the target site is not selective. means no.
  • fast diffusion kinetics means that the duration of binding of dCas9-gRNA to genomic DNA is short.
  • the binding of dCas9-gRNA to the target site may be non-specific.
  • the method for measuring the duration of binding is not particularly limited, but it can be measured quantitatively by, for example, reaction rate analysis.
  • a short binding duration means, for example, in the case of TALE, a time constant of 0.1 to 1 second, preferably about 0.2 to 0.5 seconds, and in the case of CRISPR/Cas9, A time constant of 0.1 to 1 second, preferably about 0.1 to 0.5 seconds is intended. In the case of /Cas9, the time constant is intended to be 1 to 5 seconds, preferably about 1 to 3 seconds.
  • the binding site of the genome editing tool to the genomic DNA can be analyzed by mapping the binding site of the genome editing tool to the genomic DNA in the microscope image. Furthermore, by extracting such binding events and plotting the binding frequency at each location (pixel) in the nucleus, it is possible to investigate whether the binding of the genome editing tool to genomic DNA is selective. For example, if the binding of dCas9-gRNA in the nucleus occurs only at a specific site, it means that the binding of dCas9-gRNA to genomic DNA is selective, thus the gRNA used has off-target activity. It can be judged that the safety is low and the safety is high.
  • the binding in the nucleus of dCas9-gRNA repeatedly binds to multiple sites in the nucleus, it means that the binding of dCas9-gRNA to genomic DNA is non-selective, therefore, The gRNA used can be judged to have high off-target activity and low safety. Since the genome editing tool is designed based on the target sequence to be bound, it is possible to predict the site (number) on the genomic DNA to which the genome editing tool binds. Therefore, if the number of binding sites significantly exceeds the predicted number, it can be determined to have non-specific binding, that is, to have high off-target activity and low safety.
  • Example 1 Locus-targeted evaluation Each genome editing tool was evaluated with loci as targets.
  • TALE genome editing tools
  • LacO lac operator
  • DM cells Indian barking deer fibroblasts
  • TMR tetramethylrhodamine
  • EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein
  • LacI-EGFP specifically binds to the LacO sequence incorporated into cells, and fluorescently stains a specific site on the chromosome. After that, LacI was dissociated from LacO by the addition of isopropyl ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG), and the binding of TALE to the site was observed and analyzed. Similarly, we evaluated a genome editing tool (CRISPR/dCas9) targeting major satellite sequences in mice. Mouse 3T3 cells (CL5611) (living cells) were used for the measurement. Target sequence: CAAGAAAACTGAAAATCA (NGG) (SEQ ID NO: 1) (NGG) is the PAM sequence, dCas9 is dSpCas9.
  • Halo-tag was fused to dCas9 for fluorescent dye labeling.
  • Halo-tag fused dCas9 was expressed in guide RNA and animal cells, and fluorescent labeling was performed by binding TMR to Halo-tag.
  • Single-molecule imaging in the nucleus was carried out by observing the prepared sample (encapsulated with a cover glass) using a microscope using annular illumination and oblique thin-layer illumination. Equivalent observation is possible with a general total internal reflection illumination microscope on the market, but it is possible to obtain high-contrast images by devising the shape of the light source and making it ring-shaped (annular illumination method). Become. The fluorescence signal from the sample was photographed with an scMOS camera and analyzed for the position and duration of bright spots.
  • the illumination light enters the cell at an angle to the sample, and the incident angle is adjusted so that the inside of the nucleus on the side closer to the coverslip can be observed with high contrast. It was adjusted.
  • the expression level of dCas9 and fluorescent labeling with Halo-tag were adjusted to a level suitable for single-molecule observation (specifically, one molecule or less labeled molecule per 1 cubic ⁇ m).
  • Figure 1 shows the kinetics of binding and dissociation of TALE to its target site. As shown in FIG. 1, we were able to visualize the kinetics of binding and dissociation of TALE to genomic DNA at the single-molecule level.
  • Fluorescently-labeled TALE selectively bound to the LacO sequence that was artificially integrated into the genome at one site (Fig. 2, left panel).
  • fluorescently labeled dCas9 was found to bind to many sites in the nucleus (Fig. 2, right panel). Binding kinetics analysis was performed from the results of fluorescent single-molecule imaging in the nucleus using TALE and dCas9. The results are shown in FIG. 3 (left: TALE, right: dCas9).
  • TALE binding time analysis showed that 65% of binding events were as short as 0.3 seconds in duration and 35% of binding events were as short as 12 seconds in duration. The former is considered to be weak binding during searching for the target site, and the latter is specific binding to the target site.
  • 75% of binding events had a duration of 0.2 seconds and 25% had a duration of 2 seconds.
  • Example 2 Off-target evaluation Double staining with TALE and dCas9 was performed to compare binding specificity.
  • the target sequence used (SEQ ID NO: 2) is shown in FIG.
  • gRNAs targeting sequences flanking the second exon of the MUC4 gene of human cultured cells (HeLa cells) were designed and used (1 to 3 in FIG. 6).
  • analysis was performed using gRNA No. 2.
  • TALE was also analyzed in the same manner (the target sequence of TALE is indicated by the arrow).
  • EGFP was fused to TALE and Halo-tag was fused to dCas9 for fluorescence labeling.
  • a dCas9-Halo plasmid, a gRNA plasmid, and a TALE-EGFP plasmid were transfected using X-treme GENE TM .
  • TMR Halo-ligand was added and cultured for about 20 hours. After that, they were re-sewn on a glass-bottom dish, and after several hours, they were observed by thin-layer oblique illumination using a microscope using ring-shaped illumination. The results are shown in FIG. The upper row shows the results of dCas9, and the lower row shows the results of TALE. Co-stained sites were detected and confirmed to specifically bind to target sites.
  • Example 3 Differences due to gRNA (target sequence) Using dCas9, comparison of binding specificities due to differences in gRNA type was performed. The target sequences used are shown in FIG. Using CRISPR/dCas9, gRNAs targeting sequences flanking the second exon of the MUC4 gene of human cultured cells (HeLa cells) were designed and used (1 to 3 in FIG. 6). In this example, gRNAs Nos. 1 to 3 were used for analysis. Halo-tag was fused to dCas9 for fluorescence labeling. The dCas9-Halo plasmid and the gRNA plasmid were transfected with X-treme GENE TM .
  • TMR Halo-ligand was added and cultured for about 20 hours. After that, they were re-sewn on a glass-bottom dish, and after several hours, they were observed by thin-layer oblique illumination using a microscope using ring-shaped illumination. The results are shown in FIG. The left two columns are the results using the first gRNA, the middle two columns are the results using the second gRNA, and the right two columns are the results using the third gRNA. Selective binding was observed with the second and third gRNAs, especially the third gRNA, indicating low off-target activity of genome editing tools using these gRNAs.
  • results can be given as numerical values such as binding time or the number of binding sites, enabling quantitative evaluation of genome editing tools.
  • Genome-editing tools with high specificity bind specifically and repeatedly only to the target sequence, whereas genome-editing tools with low specificity repeatedly bind to multiple sites in the nucleus. The presence of binding sites can be visualized. Further, by mapping the binding sites in the microscope image, it is possible to analyze where the binding occurs spatially. This enables comprehensive and direct safety evaluation of individual genome editing tools or individual designed target sequences to determine whether they function as highly specific genome editing tools in target cells. became possible.
  • This application is based on Japanese Patent Application No. 2021-012474 filed on January 28, 2021, the entire contents of which are incorporated herein by reference.

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Abstract

本発明は、細胞と蛍光標識されたゲノム編集ツールとを接触させる工程と、前記細胞の核内におけるゲノム編集ツールの動態を蛍光一分子イメージング法を用いて決定する工程と、を含む、ゲノム編集ツールの評価方法に関する。当該評価方法により、ゲノム編集の安全性（特異性）を定量的に評価すること、ゲノム編集ツールにおけるオフターゲット活性を定量的に評価することが可能になる。

Description

ゲノム編集ツールの評価方法
　本発明は、ゲノム編集ツールの評価方法に関する。
　CRISPR/Cas9に代表されるゲノム編集ツールは、ゲノムの中の特定の標的配列を特異的に認識し、切断などの編集を行うツールである。しかし、設計した標的配列以外にも結合し、編集を行ってしまうオフターゲット活性の存在が知られている。特にヒトへの臨床応用などにおいては、安全性評価としてオフターゲット活性を定量的に評価することが必要である。特にCRISPR/Cas9では、このオフターゲット活性の高さが臨床応用における障害となっており、オフターゲット活性の低い改良型ゲノム編集ツールの開発が進められている。
　一方、低頻度のオフターゲット活性の評価は必ずしも容易ではない。ゲノム編集の安全性(特異性)の評価としては、ゲノム編集後に全ゲノム配列を解析して、標的配列以外への変異導入の有無を確認する方法が一般的である。しかし、この方法では、配列読み取りエラー、試料由来のSNPs、突然変異などにより、0.5%程度以下の変異率より低いオフターゲット活性を評価することが出来ない。
　より高感度なオフターゲット活性評価法としては、標的配列類似配列を全ゲノム配列からコンピュータで検索し、このオフターゲット候補だけを集中的に解析するという手法が提案されている。しかし、この方法では、ゲノム全体を網羅的に検索することはできない。
　これまで、ゲノム編集ツールのターゲットおよびオフターゲットに対する細胞・個体レベルでの活性評価では、DNA２本鎖切断と修復反応（ゲノム編集反応）の結果の解析が行われてきた。たとえば、ルシフェラーゼ遺伝子などのレポーター遺伝子のゲノム編集反応による破壊あるいは修復は広く利用されている。また、ゲノム上のターゲット配列およびそれに類似したオフターゲット候補配列について、その周辺のゲノムDNA配列をシークエンスすることも、特にゲノム編集の事後評価として実施されている。さらに、ゲノム編集反応が起きた場所をゲノムワイドに探索しシークエンス解析する手法も多数考案されている(非特許文献１～７)。また、ChIP-seqなどの手法により、ゲノムDNA上のゲノム編集ツールの結合箇所をゲノムワイドに探索しシークエンス解析する手法も存在するが、これらの方法では、ゲノム編集ツールがターゲット探索のために一時的に結合した箇所か、ゲノム編集反応を起こすべく結合した箇所かを区別することが出来ない。また、ツールの改良の指標となるゲノム編集反応の反応速度論的パラメータを取得することも出来ない。
Nat Methods. 2013 Apr;10(4):361-365. doi: 10.1038/nmeth.2408. Epub 2013 Mar 17. Nat Methods. 2015 Mar;12(3):237-243, 1 p following 243. doi: 10.1038/nmeth.3284. Epub 2015 Feb 9. Nat Biotechnol. 2015 Feb;33(2):187-197. doi: 10.1038/nbt.3117. Epub 2014 Dec 16. Nat Biotechnol. 2015 Feb;33(2):179-186. doi: 10.1038/nbt.3101. Epub 2014 Dec 15. Nat Methods. 2017 Jun;14(6):607-614. doi: 10.1038/nmeth.4278. Epub 2017 May 1. Nature. 2018 Sep;561(7723):416-419. doi: 10.1038/s41586-018-0500-9. Epub 2018 Sep 12. Science. 2019 Apr 19;364(6437):286-289. doi: 10.1126/science.aav9023. Epub 2019 Apr 18.
　本発明は、ゲノム編集の安全性（特異性）を評価する、特に定量的に評価する方法、具体的には、ゲノム編集ツールにおけるオフターゲット活性を定量的に評価する方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意研究した結果、生きた細胞の核内で、蛍光標識したゲノム編集ツールの一分子イメージングを行うことでゲノム編集ツールの評価が可能であることを見出した。該イメージング技術を用いることにより、ゲノム編集ツールが、ゲノム配列のどこに、どのような頻度で、どのようなキネティクスで結合するのかを定量的に評価することに成功して本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は以下の通りである。
（１）蛍光一分子イメージング法を利用したゲノム編集ツールの評価方法。
（２）蛍光一分子イメージング法が結合反応速度解析技術を利用したものである上記（１）に記載の方法。
（３）顕微鏡画像において結合箇所をマッピングすることによりゲノム編集ツールのゲノムＤＮＡへの結合部位を解析する工程を含む、上記（１）に記載の方法。
（４）オフターゲット作用を解析する工程を含む、上記（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）ゲノム編集ツールが、TALE又はCRISPR/dCas9である、上記（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）ゲノム編集ツールの標識にHalo-tagを用いることを特徴とする上記（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（７）イメージングに輪帯照明顕微鏡を用いることを特徴とする上記（１）～（６）のいずれかに記載の方法。
（８）結合する箇所が限定的であり、結合時間が長時間である場合に、そのゲノム編集ツールがオフターゲット活性の低い安全性の高いものであると判断する工程を含む、上記（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）細胞と蛍光標識されたゲノム編集ツールとを接触させる工程と、
前記細胞の核内におけるゲノム編集ツールの動態を蛍光一分子イメージング法を用いて決定する工程と、
を含む、ゲノム編集ツールの評価方法。
（１０）ゲノム編集ツールの動態が、ゲノム編集ツールの標的配列への結合に基づく、上記（９）記載の方法。
　イメージング技術を用いることにより、結果が結合時間あるいは結合箇所の数などの数値で与えられるため、定量的なゲノム編集ツールの評価が可能となる。特異性の高いゲノム編集ツールでは、標的配列のみに特異的にかつ繰り返し結合するのに対して、特異性の低いゲノム編集ツールは核内の複数の箇所に繰り返し結合する様子が見られ、オフターゲット結合サイトが存在することを可視化できる。また、顕微鏡画像において結合箇所をマッピングすることで、空間的にどこに結合したかが解析できる。これにより、個々のゲノム編集ツールについて、あるいは個々の設計標的配列に対して、それが目的の細胞内で特異性の高いゲノム編集ツールとして機能するかという安全性評価を網羅的かつ直接的に実施することが可能となった。
LacO配列を標的としたゲノム編集ツール（TALE）を用いて生細胞（LacO配列を組み込んだインドホエジカ細胞）の核内での蛍光一分子イメージングを実施した結果を示す図である。TALEの標的箇所への結合解離の動態を可視化出来た。 （左図）特異性が高いことが知られているTALEを用いて、ゲノム内に１ヶ所人為的に挿入したLacO配列を標的として、生細胞(インドホエジカ細胞)の核内で蛍光一分子イメージングを実施した結果を示す図である。（右図）マウスのメジャーサテライト配列を標的としたゲノム編集ツール(CRISPR/dCas9)を用いた生細胞(3T3細胞)の核内での蛍光一分子イメージングを実施した結果を示す図である。 TALE（左）及びdCas9（右）の結合時間解析の結果を示すグラフ、及び累積頻度分布を2成分指数関数でフィッティングした結果を示す図である。横軸は、結合持続時間（Sec:秒）を示し、縦軸は、結合イベントの累積頻度を示す。 Muc4 遺伝子の第2エクソンに隣接する配列を標的とするTALEとdCas9で二重染色を行い、結合特異性を比較した図である。 Muc4遺伝子の第2エクソンに対し3つのgRNAを設計し、それらの間の結合特異性の違いを調べた結果を示す図である。 実施例２及び３で用いたゲノムDNA上の標的配列を示す図である。
　以下、本発明を説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味を有する。
ゲノム編集ツール
　ゲノム編集ツールは、一般的には、標的DNAの塩基配列を認識するシステムにDNA切断ドメインを融合した技術を指すが、本発明においては特に標的DNAの塩基配列を認識し結合するシステムを意図し、DNA切断の有無は問わない。具体的には、zinc-finger nuclease (ZFN)、transcription activator-like effector nuclease (TALEN)、clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated proteins (Cas) (CRISPR/Cas、以下CRISPR/Casと略する）等が挙げられる。
　ZFNは、DNA結合ドメインとしてzinc fingerを持つ人工ヌクレアーゼで、1つのzinc fingerは3塩基を認識するので、3～6個のzinc fingerを持つZFNは9～18 base pair (bp)に特異的に結合し、一対で18～36 bpの特異性でDNA二本鎖切断を導入する。
　TALENは、DNA結合ドメインとして植物病原細菌のXanthomonas属が有するTALEを持つ人工ヌクレアーゼである。TALEのDNA結合ドメインは、1塩基を認識する34個のアミノ酸が一単位となり、それを15～20単位持つTALENをセンス鎖、アンチセンス鎖それぞれに作製し、狙った標的部位にDNA二本鎖切断を導入する。
　CRISPR/Casシステムは、単独でDNA二本鎖切断活性を持つCasヌクレアーゼと標的配列特異的一本鎖ガイドRNAとの複合体を用い、狙った塩基配列にDNA二本鎖切断を導入する。CRISPR/Casシステムは、その利便性、高効率、汎用性から、世界中で使われるゲノム編集の標準技術となり、Casヌクレアーゼとしては、Cas9，Cas12a (Cpf1)，Cas13a (C2c2)，Cas14，Cas3及びCasX等が挙げられ、好ましくはCas9である。Cas9としては、Streptococcus pyogenes由来Cas9（SpCas9）、Staphylococcus aureus由来Cas9（SaCas9）、Francisella novicida由来Cas9（FnCas9）、Campylobacter jejuni由来Cas9（CjCas9）、Streptococcus thermophilus由来Cas9（St1Cas9、St3Cas9）が挙げられる。Cpf1としてはAcidaminococcus sp.由来Cpf1（AsCpf1）やLachnospiraceae bacterium由来Cpf1（LbCpf1）が挙げられる。CRISPR/Casシステムでは、Casヌクレアーゼのアミノ酸配列中に変異を施した変異体（亜種）を用いることもできる。dCas9（dead Cas9）はヌクレアーゼ活性欠損型のCas9でDNA配列に結合するが、切断しない。nCas9（nickase Cas9）は一本鎖ニックを導入し、xCas9 (Hu, J.H. et al., Nature, 556, 57-63. (2018))は広いPAM適合と高いDNA特異性を有する。
　本発明の方法において、ゲノム編集ツールはいずれを用いてもよいが、ゲノム編集ツールのゲノム配列への結合を評価することから、DNA配列を切断しない、例えばdCas9が好ましい。
評価方法（一分子イメージング）
　一分子イメージングとは、分子の挙動を1分子レベルで追跡するイメージング技術をいう。蛍光一分子イメージングは、顕微鏡を用いて溶液あるいは細胞内で、蛍光標識された目的分子の動態を可視化するイメージング技術である。一般に、溶液中・細胞内の分子は、通常は拡散運動(ブラウン運動)を示す。しかし、ゲノムDNAのような(分子に比べると)巨大な構造物に結合すると、拡散運動は抑えられて停止する。この動態変化を指標として、分子の結合・解離の速度論的解析を行う。また、顕微鏡画像において結合箇所をマッピングすることで、空間的にどこに結合したかも解析できる。
　本発明の方法では、ゲノム編集ツールを蛍光標識し、蛍光標識したゲノム編集ツールとゲノムDNA上の標的配列との結合を可視化し、さらに反応速度解析により定量的に評価する。
　蛍光標識はゲノム編集ツールの任意の位置に付加することができるが、例えばゲノム編集ツールとしてdCas9を用いる場合には、好ましくはdCas9のC末端に付加される。さらにそのC末側に核局在化シグナル配列が付加されていることが、核への局在の為には好ましい。蛍光標識としては、例えば緑色蛍光タンパク質（例、green fluorescent protein; GFP、enhanced green fluorescent protein; EGFP、monomeric enhanced green fluorescent protein; mEGFP）、ローダミン色素（例、tetramethylrhodamine; TMR、tetramethylrhodamine methylester; TMRM）、シリコンローダミン色素（例、SaraFluor）、JF646等を用いることができ、あるいは、タグ配列（例えば、HaloTag、SNAP-tag、CLIP-tag）を付加して蛍光標識を共有結合させることもできる。
　例えば、ゲノム編集ツールとしてCRISPR/dCas9を用いた場合、dCas9と蛍光標識（又はタグ配列を介した蛍光標識）を含む融合タンパク質とガイドRNAとを常法により動物培養細胞に発現させて、蛍光標識されたdCas9とガイドRNAとの複合体（以下、dCas9-gRNAとも称する）を作製する。dCas9-gRNAにはゲノムDNAに結合する必要があるため、核移行シグナルが付加されている。得られたdCas9-gRNAと測定対象とする細胞とを接触させる。接触後、細胞の核内におけるdCas9-gRNAの拡散動態（拡散運動）を決定する。好ましくは、dCas9に付加した蛍光標識を指標に拡散動態を決定する。蛍光標識としてHaloTagを使用した場合には、HaloTag TMR ligand(Promega)やSTELLA Fluo 650 HaloTag ligand (Goryo Chemical)等により染色する。dCas9-gRNAの拡散動態の決定には任意の公知の方法を用いることができるが、本発明の目的のためにはdCas9の拡散動態を1分子のレベルで追跡する必要があるため、一分子イメージングが可能な方法が用いられる。例えば、蛍光顕微鏡下、全反射照明を用いてゲノム編集ツール接触後の細胞の核内でゲノム編集ツールに付加した蛍光標識を励起し、一分子イメージングを行う。あるいは、顕微鏡下において細胞の厚みよりも薄い光で照明する薄層斜光照明法（highly inclined and laminated optical sheet microscopy, HILO microscopy; HILO法）により一分子イメージングを行ってもよく、また、好ましい（生物物理 49（6），318-321（2009））。HILO法は、細胞等の試料を、薄い層状に近づけた光で照明し、見たい場所のみを明るく照明し、余分な場所は照らさないので、従来法に比べ、高画質が期待できる。本発明ではHILO法の改良型である輪帯HILO法を用いることが好ましい。輪帯HILO法では、レーザー光を透過型回折光学素子によって円周上に７２分割し、これをアキシコンレンズで拡大した後、高開口数（NA）対物レンズの後放出射瞳面に集光する。
　通常の全反射照明（ＴＩＲＦ）顕微鏡では、一方向からのみの照明となるが、輪帯照明では全方向から照明することにより、より広視野を一様に照明することが可能になるので好ましい。
　次いで、撮影した蛍光画像から、ゲノム編集ツールの拡散動態を求める。具体的には、撮影した蛍光画像に対して、輝点検出アルゴリズムを用いて、ゲノム編集ツールの輝点の位置・輝度情報を取得する。さらに、時系列画像について一定の閾値下で最近接に位置する輝点をつなぐなどして、各輝点の軌跡の情報を取得する。輝点検出アルゴリズムとしては、単一蛍光分子の位置を推定できる、好ましくは高速かつ高精度に推定できるアルゴリズムであれば既存のものが利用でき、具体的には２次元ガウシアンフィッティング法等が挙げられる。また、近年では、放射相称（radial symmetry）に基づいたアルゴリズム（Optics Letters Vol. 37, Issue 13, pp. 2481-2483 (2012)）やその他種々の推定方法が提案されている。
　細胞核内でのゲノム編集ツールの拡散動態が遅いことは、ゲノム編集ツールのゲノムDNAへの結合持続時間が長いことを意味し、その場合、ゲノム編集ツールの標的部位への結合が特異的であることを意味する。例えば、dCas9-gRNAと細胞とを接触させ、dCas9-gRNAの細胞核内での拡散動態を求めた場合、拡散動態が遅いことは、dCas9-gRNAのゲノムDNAへの結合持続時間が長いことを意味し、その場合、dCas9-gRNAの標的部位への結合は特異的であり得る。一方、細胞核内でのゲノム編集ツールの拡散動態が早いことはゲノム編集ツールのゲノムDNAへの結合持続時間が短いことを意味し、その場合、ゲノム編集ツールの標的部位への結合が選択的ではないことを意味する。例えば、dCas9-gRNAと細胞とを接触させ、dCas9-gRNAの細胞核内での拡散動態を求めた場合、拡散動態が早いことは、dCas9-gRNAのゲノムDNAへの結合持続時間が短いことを意味し、その場合、dCas9-gRNAの標的部位への結合は非特異的であり得る。ここで、結合持続時間の測定方法は特に限定されないが、例えば反応速度解析により定量的に測定することができる。用いるゲノム編集ツールの種類によっても異なるが、結合持続時間が短いとは、例えばTALEの場合には、時定数0.1～1秒、好ましくは0.2～0.5秒程度を、CRISPR/Cas9の場合には、時定数0.1～1秒、好ましくは0.1～0.5秒程度を意図し、結合持続時間が長いとは、例えばTALEの場合には、時定数5～20秒、好ましくは10～15秒程度を、CRISPR/Cas9の場合には、時定数1～5秒、好ましくは１～3秒程度を意図する。
　また、ゲノム編集ツールのゲノムDNAへの結合箇所を顕微鏡画像においてマッピングすることによりゲノム編集ツールのゲノムDNAへの結合部位を解析することができる。さらにかかる結合イベントを抽出し、核内のそれぞれの場所（ピクセル）での結合頻度をプロットすることにより、ゲノム編集ツールのゲノムDNAへの結合が選択的であるか否かを調べることができる。例えば、dCas9-gRNAの核内での結合が特定の部位でのみ起こる場合には、dCas9-gRNAのゲノムDNAへの結合が選択的であることを意味し、従って、使用したgRNAはオフターゲット活性の低い安全性の高いものであると判断することができる。一方、dCas9-gRNAの核内での結合が核内の複数の箇所に繰り返し結合するような場合には、dCas9-gRNAのゲノムDNAへの結合は非選択的であることを意味し、従って、使用したgRNAはオフターゲット活性の高い安全性の低いものであると判断することができる。
　ゲノム編集ツールは、結合すべき標的配列をもとに設計されるので、ゲノム編集ツールが結合するゲノムDNA上の部位（数）を予測することが可能である。従って、結合箇所が当該予測される数を有意に超える場合には、非特異的な結合を有する、即ち、オフターゲット活性の高い安全性の低いものであると判断することができる。
　以下に実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明は何ら限定されるものではない。使用する試薬及び材料は特に限定されない限り商業的に入手可能であるか、既知文献等によって調製可能である。また、同様の効果、作用を有するものであれば代替可能であることを当業者は理解している。また、公知の手法であれば特に限定されず、既知文献等に基づき、あるいはそれを適宜改変して実施することができる。
実施例１：遺伝子座を標的とした評価
　遺伝子座を標的とし、各ゲノム編集ツールを評価した。
　lac operator (LacO) 配列を標的として、ゲノム編集ツール(TALE)を評価した。測定にはゲノム内に１ヶ所人為的にLacO配列を組み込んだインドホエジカ線維芽細胞（DM細胞）（生細胞)を用いた。LacO配列を標的として設計したTALEに蛍光色素標識のためにHalo-tagを融合し、テトラメチルローダミン(TMR)を結合させた。また、標的配列の位置を確認するために、LacO配列に結合するLacIタンパク質と融合したEnhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) (lacI-EGFP)を発現させた。LacI-EGFPが、細胞に組み込まれたLacO配列に特異的に結合することで染色体上の特定の部位が蛍光染色される。その後、isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)添加によりLacIをLacOから解離させ、その場所にTALEが結合する様子を観察・解析した。
　同様に、マウスのメジャーサテライト配列を標的として、ゲノム編集ツール(CRISPR/dCas9)を評価した。測定にはマウス3T3細胞（CL5611）（生細胞）を用いた。
　標的配列：CAAGAAAACTGAAAATCA(NGG)（配列番号１）
(NGG)はPAM配列、dCas9はdSpCas9。
　dCas9に蛍光色素標識のためにHalo-tagを融合した。Halo-tag融合dCas9はガイドRNAと動物細胞に発現させ、TMRをHalo-tagに結合させることで蛍光標識を行った。
　調製した試料（カバーガラスで封入）を、輪帯照明を利用した顕微鏡を用い、薄層斜光照明法により観察することにより核内での一分子イメージングを実施した。市販されている一般的な全反射照明顕微鏡でも同等の観察は可能であるが、光源の形状を工夫し、輪帯状(輪帯照明法)とすることにより高コントラストな像を得ることが可能となる。試料からの蛍光信号は、scMOSカメラで撮影し、輝点の位置及び持続時間を解析した。
　首尾よく核内の一分子イメージングを実施する為、試料に対し、角度を持たせて細胞内に照明光を進入させ、カバーガラスに近い側の核内を高コントラストで観察できるように入射角を調整した。また、dCas9の発現量やHalo-tagによる蛍光標識は、一分子観察に適したレベルになるように（具体的には、１立方μｍに標識分子が1分子以下になるように）調整した。
　TALEの標的箇所への結合解離の動態を図１に示す。図１に示されるように、TALEの一分子レベルでのゲノムDNAへの結合解離の動態を可視化することが出来た。蛍光標識されたTALEは、ゲノム内に１ヶ所人為的に組み込んだLacO配列に選択的に結合した（図２、左図）。
　一方、蛍光標識されたdCas9は、核内の多数の箇所に結合することが判った（図２、右図）。
　TALE及びdCas9を用いた核内での蛍光一分子イメージングの結果から結合反応速度解析を行った。結果を図３に示す（左：TALE、右：dCas9）。
　TALEの結合時間解析によれば、65％の結合イベントは持続時間が0.3秒と短く35％の結合イベントは持続時間が12秒であった。前者はターゲット箇所を探索中の弱い結合、後者がターゲット箇所との特異的な結合であると考えられる。
　同様の解析をdCas9について行うと、結合イベントの75％の結合イベントは持続時間が0.2秒、25％の結合イベントは持続時間が2秒であった。
実施例２：オフターゲット評価
　TALEとdCas9で二重染色を行い、結合特異性を比較した。
　用いた標的配列（配列番号２）を図６に示す。
　CRISPR/dCas9でヒト培養細胞(HeLa細胞)のMUC4遺伝子の第２エクソンに隣接する配列を標的としたgRNAを設計し用いた（図６中、１～３）。本実施例では2番のgRNAを用いて解析した。また、TALEについても同様に解析した（TALEの標的配列は矢印の部分）。蛍光標識の為にTALEにはEGFPを、dCas9にはHalo-tagを融合した。
　dCas9-HaloのプラスミドとgRNAのプラスミド、TALE-EGFPのプラスミドをX-treme GENETMでトランスフェクションした。トランスフェクション後にTMR Halo-ligandを添加して約20時間培養し。その後、グラスボトムディッシュにまきなおして、数時間後に輪帯照明を利用した顕微鏡を用い、薄層斜光照明法により観察した。結果を図４に示す。
　上段がdCas9の結果を、下段がTALEの結果を示す。共染色される箇所が検出され、標的サイトに特異的に結合していることが確認された。
実施例３：gRNA（標的配列）による違い
　dCas9を用い、gRNAの種類の違いによる結合特異性の比較を行った。
　用いた標的配列を図６に示す。
　CRISPR/dCas9でヒト培養細胞(HeLa細胞)のMUC4遺伝子の第２エクソンに隣接する配列を標的としたgRNAを設計し用いた（図６中、１～３）。本実施例では１～3番のgRNAを用いて解析した。蛍光標識の為にdCas9にはHalo-tagを融合した。
　dCas9-HaloのプラスミドとgRNAのプラスミドをX-treme GENETMでトランスフェクションした。トランスフェクション後にTMR Halo-ligandを添加して約20時間培養し。その後、グラスボトムディッシュにまきなおして、数時間後に輪帯照明を利用した顕微鏡を用い、薄層斜光照明法により観察した。結果を図５に示す。
　左２列が１番目のgRNAを、中２列が２番目のgRNAを、右２列が３番目のgRNAを用いた結果である。２番目及び３番目、特に３番目のgRNAを用いた場合に選択的な結合が観察され、これらのgRNAを用いたゲノム編集ツールのオフターゲット活性が低いことが示された。
　イメージング技術を用いることにより、結果が結合時間あるいは結合箇所の数などの数値で与えられるため、定量的なゲノム編集ツールの評価が可能となる。特異性の高いゲノム編集ツールでは、標的配列のみに特異的にかつ繰り返し結合するのに対して、特異性の低いゲノム編集ツールは核内の複数の箇所に繰り返し結合する様子が見られ、オフターゲット結合サイトが存在することを可視化できる。また、顕微鏡画像において結合箇所をマッピングすることで、空間的にどこに結合したかが解析できる。これにより、個々のゲノム編集ツールについて、あるいは個々の設計標的配列に対して、それが目的の細胞内で特異性の高いゲノム編集ツールとして機能するかという安全性評価を網羅的かつ直接的に実施することが可能となった。
　本出願は、2021年1月28日付で出願された特願2021-012474を基礎としており、ここで言及することによりその内容はすべて本明細書に包含される。

Claims (10)

  1. 　蛍光一分子イメージング法を利用したゲノム編集ツールの評価方法。
  2. 　蛍光一分子イメージング法が結合反応速度解析技術を利用したものである請求項１に記載の方法。
  3. 　顕微鏡画像において結合箇所をマッピングすることによりゲノム編集ツールのゲノムＤＮＡへの結合部位を解析する工程を含む、請求項１に記載の方法。
  4. 　オフターゲット作用を解析する工程を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　ゲノム編集ツールが、TALE又はCRISPR/dCas9である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　ゲノム編集ツールの標識にHalo-tagを用いることを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　イメージングに輪帯照明顕微鏡を用いることを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　結合する箇所が限定的であり、且つ結合時間が長時間である場合に、そのゲノム編集ツールがオフターゲット活性の低い安全性の高いものであると判断する工程を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　細胞と蛍光標識されたゲノム編集ツールとを接触させる工程と、
    前記細胞の核内におけるゲノム編集ツールの動態を蛍光一分子イメージング法を用いて決定する工程と、
    を含む、ゲノム編集ツールの評価方法。
  10. 　ゲノム編集ツールの動態が、ゲノム編集ツールの標的配列への結合に基づく、請求項９記載の方法。
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