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WO2022031093A1 - 재조합 히알루로니다제의 생산 방법 - Google Patents

재조합 히알루로니다제의 생산 방법 Download PDF

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Publication number
WO2022031093A1
WO2022031093A1 PCT/KR2021/010368 KR2021010368W WO2022031093A1 WO 2022031093 A1 WO2022031093 A1 WO 2022031093A1 KR 2021010368 W KR2021010368 W KR 2021010368W WO 2022031093 A1 WO2022031093 A1 WO 2022031093A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
culture
variant
content
hyaluronidase
medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2021/010368
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
박순재
김규완
윤상훈
조정수
박기범
변민수
송형남
김지선
남기석
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Alteogen Inc
Original Assignee
Alteogen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=80118320&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=WO2022031093(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority to BR112022019726A priority Critical patent/BR112022019726A2/pt
Priority to EP21853474.1A priority patent/EP4194551A4/en
Priority to AU2021320569A priority patent/AU2021320569B2/en
Priority to US17/907,538 priority patent/US12221638B2/en
Priority to CA3173310A priority patent/CA3173310A1/en
Priority to CN202510513013.7A priority patent/CN120738156A/zh
Application filed by Alteogen Inc filed Critical Alteogen Inc
Priority to MX2022012342A priority patent/MX2022012342A/es
Priority to JP2022559471A priority patent/JP7622088B2/ja
Priority to CN202180030097.9A priority patent/CN115427562B/zh
Publication of WO2022031093A1 publication Critical patent/WO2022031093A1/ko
Priority to ZA2022/10840A priority patent/ZA202210840B/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to JP2024161573A priority patent/JP2025004022A/ja
Priority to AU2024220188A priority patent/AU2024220188A1/en
Priority to US18/940,064 priority patent/US20250136964A1/en
Priority to US18/940,159 priority patent/US20250129352A1/en
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2474—Hyaluronoglucosaminidase (3.2.1.35), i.e. hyaluronidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01035—Hyaluronoglucosaminidase (3.2.1.35), i.e. hyaluronidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2523/00—Culture process characterised by temperature

Definitions

  • the present invention relates to the amino acid sequence of a hyaluronidase, in particular native PH20 or mature native PH20, or native PH20 or mature native PH20, comprising substitution of one or more amino acid residues, optionally N-terminal and/or to a method for producing a hyaluronidase PH20 variant in which some of the C-terminal amino acid residues are deleted.
  • Hyaluronidase is an enzyme that degrades hyaluronic acid located in the extracellular matrix. This hyaluronidase hydrolyzes hyaluronic acid to reduce the viscosity (viscosity) of hyaluronic acid in the extracellular matrix, thereby increasing the permeability to tissues (skin) (Bookbinder et al., 2006). Hyaluronidase has been used to enhance absorption of body fluids provided by subcutaneous injection [Muchmore et al., 2012] or intramuscular injection [Krantz et al., 2016] and to improve diffusion of local anesthetics [Clement et al. al., 2003].
  • Drugs promoted subcutaneous administration in this way include morphine [Thomas et al., 2009], ceftriaxone [Harb et al., 2010], insulin [Muchmore et al., 2012] and immunoglobulin [Wasserman et al., 2014]. It is also used to improve the dispersion of fluids or drugs leaked into tissues by intravenous injection or hematoma spread.
  • hyaluronidases a recombinant human PH20 protein having activity at neutral pH was developed by Halozyme Therapeutic and sold under the trade name Hylenex (Bookbinder et al., 2006).
  • PH20 protein is expressed in yeast (P. pastoris), DS-2 insect cells, and animal cells.
  • Recombinant PH20 protein produced in insect cells and yeast is different from human PH20 in N-glycosylation in the post-translational modification process, so it affects the activity and there is a possibility of side effects in the body.
  • Glycosylation is a post-translational process of proteins in cells (eukaryotes), a reaction occurring in the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus. It is divided into N-glycosylation and O-glycosylation, which differ depending on the attached functional group.
  • the process of attaching sugars such as lactose or fucose to proteins produced in cells is called 'glycation'.
  • sugar chain When a sugar chain is linked to a protein through glycosylation, the protein undergoes a 'folding' process to form a three-dimensional structure. This gives the protein stability that can be maintained for a long time without loosening.
  • These sugar chains are important processes as they also play a role in communication and information exchange between cells.
  • ALG Asparagine-Linked Glycosylation
  • PP-Dol Dolichol Pyrophosphate
  • LLO lipid-linked oligosaccharide
  • the N-sugar chains attached to the protein are removed one by one from the glucose at the end of the sugar chain by glucosidase ( ⁇ -Glucosidase I, Gls1p; ⁇ glucosidase II, Glsp II) present in the endoplasmic reticulum.
  • glucosidase ⁇ -Glucosidase I, Gls1p; ⁇ glucosidase II, Glsp II
  • the initial biosynthesis process of N-saccharides in the endoplasmic reticulum described above is conserved in almost the same manner from yeast, a eukaryotic microorganism, to an animal, a higher organism.
  • the sugar chains transferred to the Golgi body undergo various sugar chain modification processes specifically for each species, and as a result, completely different types of sugar chains are made in yeast, insects, plants and animals.
  • these various sugar chains also have a core site in common.
  • the structure in which three mannose and two GlcNAc are linked to the nitrogen of asparagine is called Trimannosyl Core.
  • the type in which mannose is mainly connected to the Trimannosyl Core is called the high-mannose type, and is often observed in yeast and mold.
  • Mannose addition continues in the Golgi apparatus, and dozens of mannose addition forms are also observed.
  • glycoproteins with sugar chains of the deficient mannose type are observed in insect cells. These are first trimmed into Man5GlcNAc2 form by mannosidase (Mannosidase IA, IB & IC) in the Golgi apparatus, and then N-Acetylglucosaminyltransferase (GNT) I acts to add one GlcNAc, and then mannosidase II acts to trigger Trimannosyl Core A hybrid structure in which one GlcNAc is added is formed.
  • GNT II acts on a structure in which one GlcNAc is added to the Trimannosyl Core, and another GlcNAc is added to form a sugar chain having two antenna structures.
  • GNT IV and V act to form a four-antenna structure, and in some cases, GNT VI, IX, or VB acts to make up to a six-antenna structure.
  • ⁇ -Galactosyltransferase and ⁇ -Sialyltransferase present in the Golgi body act to form a complex sugar chain structure in which galactose and sialic acid are added to GlcNAc.
  • N-glycosylation can have a significant effect on the folding or activity of a protein, and when producing for industrial use a protein or its variants existing in nature using a genetic engineering method, the type of host cell and the manipulation method of the recombinant , there is a very high possibility that glycosylation and the structure or shape of sugar chains may vary depending on the culture conditions (Schilling, et al., 2002). That is, depending on the difference in production conditions during the protein production process, the structure of the sugar chain or the quantitative difference in the sugar components constituting the sugar chain occur.
  • Culture conditions affecting N-glycosylation include glucose or Glutamine concentration in the culture medium (Tachibana et al. 1994), Dissolved oxygen (DO) concentration (Restelli et al. 2006), culture medium pH (Borys et al. 1993), and culture medium. concentration of ammonia (Borys et al. 1994;) and incubation temperature (Clark et al. 2004).
  • an enzyme specifically binds to a substrate to form an enzyme-substrate complex, thereby accelerating the enzyme reaction by acting as a catalyst to lower the activation energy of the reaction.
  • Enzymes can discriminate between substrates and molecules that compete with the substrate, which enables specific binding to the substrate due to the complementary charge distribution, complementary structure, and hydrophilicity/hydrophobicity distribution at the substrate binding site of the enzyme.
  • a lock-key model has been proposed in which the enzyme and the substrate are complementary to each other and have a geometrical shape, so that they are easy to bind, but it is difficult to explain the transition state of the enzyme-substrate complex.
  • the proposed derivation fit model changes the structure as the enzyme and substrate continue to interact in the enzyme-substrate complex through the flexible structure of the enzyme protein.
  • amino acid residues or N-saccharide chains constituting the active site The reaction can be further promoted by the distribution of the surrounding electric charge and the hydrophilicity/hydrophobicity distribution.
  • charge interaction is an essential element in the reaction of the hyaluronidase enzyme that hydrolyzes the substrate hyaluronic acid.
  • Arming et al. revealed that in hyaluronidase PH20, an arginine residue having a positive charge is an essential element for enzyme activity in order to bind to hyaluronic acid, a substrate in which a large amount of negative charge is distributed (Arming et al. 1997). Therefore, it can be inferred that the charge distribution of the N-saccharide chain also affects the enzyme activity.
  • the content ie the sialylation content, constitutes an enzyme-substrate conjugate or influences the progress of the enzymatic reaction. In order to limit the sialylation content, the transfer of sialic acid to the galactose residue must be restricted, desialylation, or the galactosylation content must be limited.
  • hyaluronic acid that can be used industrially with excellent activity and high productivity by controlling and maintaining it Research on a method for producing nidase PH20 or a variant thereof is required in the art for efficient large-scale production.
  • the activity by controlling the sialylation content, the galactosylation content and/or the mannosylation content, in particular the sialylation content, in the N-saccharide content.
  • the glucose concentration and/or pH in the medium is adjusted, or culture It was confirmed that the enzymatic activity and productivity of the hyaluronidase PH20 or a variant thereof desired in the present invention can be remarkably increased by culturing for a certain period of time after changing the temperature.
  • the method for producing hyaluronidase PH20 or a variant thereof according to the present invention comprises:
  • Host cells expressing recombinant hyaluronidase PH20 or a variant thereof are cultured at a culture temperature of 35 ° C to 38 ° C to 20x106 to 120x106 cells x day/mL based on the integral viable cell density to do;
  • PH20 or a variant thereof produced by the production method according to the present invention has a sialylation content of 1 to 38% of the N-saccharide chain content, and is characterized in that the enzyme activity is remarkably increased, but is not limited thereto, and the value is 10 It is an experimental value with a margin of error of %. In the case of setting culture conditions, deviations occur depending on conditions such as the equipment used for culture and the degree of work proficiency of the tester. because it does
  • the culture of the host cells is a batch culture method, repeated batch culture method, fed-batch culture method, repeated fed-batch culture method (repeated fed-batch culture), continuous culture method (continuous culture) and perfusion method It can be cultured by one or more methods selected from the group consisting of perfusion culture.
  • 1A is an enzymatic activity for native human hyaluronidase PH20 and its variants
  • 1B is an isoelectric point electrophoresis result of each sample
  • 1C shows the content of N-sugar chains.
  • 2A is the iso-point electrophoresis result of each sample
  • 3 is a result of analyzing changes in cell growth, cell viability, pH, and lactate concentration in the culture conditions in which N-acetyl-D-Mannosamine or Galactose was added to cells producing a hyaluronidase PH20 variant;
  • 3A is cell growth
  • 3B is the cell viability
  • 3C is a change in pH
  • Figure 4 is a graph analyzing the activity of the culture recovery solution in the culture condition of the addition of N-acetyl-D-Mannosamine or Galactose to the cells producing the hyaluronidase PH20 variant.
  • FIG. 5 shows the results of analysis by performing isoelectric focusing on the culture recovered in N-acetyl-D-Mannosamine or Galactose-added culture of cells producing hyaluronidase PH20 variants.
  • FIG. 6 shows the results of analysis by performing N-saccharide structure analysis on the culture recovered in the culture in which N-acetyl-D-Mannosamine or Galactose was added to the cells producing the hyaluronidase PH20 variant.
  • FIG. 8 is a graph analyzing the activity of the recovery solution for each culture day for cells producing a hyaluronidase PH20 variant.
  • 9 is an analysis result by performing isoelectric focusing on the recovered solution for each culture day of cells producing a hyaluronidase PH20 variant.
  • 11 is a result of analyzing cell growth, cell viability, pH change, osmotic pressure change, glucose concentration, and lactate concentration under glucose concentration conditions for cells producing a hyaluronidase PH20 variant;
  • 11D is an osmotic pressure change.
  • 11E is a change in glucose concentration.
  • FIG. 12 is a graph analyzing the activity of cells producing hyaluronidase PH20 variants under glucose concentration conditions.
  • 13 is a result of analysis by performing isoelectric focusing on cells producing a hyaluronidase PH20 variant under a glucose concentration condition.
  • 15D shows the cumulative cell concentration change.
  • 16 is a graph analyzing the activity of cells producing hyaluronidase PH20 variants under pH conditions.
  • 17 is an analysis result of isoelectric focusing under pH conditions on cells producing a hyaluronidase PH20 variant.
  • 19 is a purification chromatogram by secondary anion exchange resin chromatography obtained in the purification process of the hyaluronidase PH20 variant.
  • the Sialylation, Galactosylation and/or Mannosylation content among the N-saccharide chain content, particularly the Sialylation content is hyaluronidase PH20 Or it was completed by confirming the fact that it is very important for the enzymatic activity and productivity of a variant thereof.
  • the Sialylation content of PH20 or the N-saccharide chain content of the variant is 1 to 38%, preferably 1 to 30%, more preferably 1.5 to 28%, and most preferably 2 to 25%, hyaluronan It was confirmed that the enzyme activity and productivity of nidase PH20 or a variant thereof were improved to an unexpectedly high degree.
  • the galactosylation content is 1-68%, the sialylation content is 1-38%, the mannosylation content is 40-63%, preferably the galactosylation content is 5-60%, the sialylation The content is 1-30%, the Mannosylation content is 42-62%, more preferably the Galactosylation content is 10-56%, the Sialylation content is 1.5-28%, the Mannosylation content is 44-61%, most preferably the Galactosylation content is Enzyme activity and productivity of hyaluronidase PH20 or a variant thereof may be improved to an unexpectedly high degree when the content of 15-50%, Sialylation content is 2-25%, and Mannosylation content is 47-60%.
  • the above numerical value is a numerical value derived from the experimental results of Example Table 1 and a numerical value of a 95% confidence interval is applied, and this numerical value may also include an error of 10%. This is because when measuring the sugar content of a protein, there is a deviation depending on the conditions such as the equipment used for the experiment, the enzyme reaction time, the test temperature, the tester's work proficiency, etc., so the sugar content measured in the present invention is not in a limited sense. This is because it should be interpreted in a broader sense in consideration of the differences between them.
  • the galactosylation % content of the N-saccharide chain content is the sum of the % content of those containing galactose at the ends, such as G1, G1F, G1F', G2, G2F, A1, A1F, A2, A2F, among the N-saccharide chains
  • the sialylation % content is the sum of the % content of those containing sialic acid at the terminals such as A1, A1F, A2, and A2F among the N-saccharide chains
  • the mannosylation % content is the M4G0F, M5, M5G0, M6, M7, M8, It is the sum of the % content of those containing mannose at the terminal, such as M9.
  • Host cells expressing recombinant hyaluronidase PH20 or a variant thereof were cultured at a culture temperature of 35 ° C to 38 ° C to 20x10 6 to 120x10 6 cells x day/mL based on the integral viable cell density. culturing so as to be; and
  • the reduction of the culture temperature from step (1) to step (2) is 20x10 6 ⁇ 120x10 6 cells x day/mL, preferably 40x10 6 ⁇ 100x10 6 cells x based on the integral viable cell density day/mL, more preferably 60x10 6 to 80x10 6 cells x day/mL, but is not limited thereto.
  • the culture period in step (2) may be 2 to 18 days, preferably 3 to 16 days, more preferably 4 to 14 days, but is not limited thereto.
  • the cell inoculation concentration of the main culture may be 1x10 5 cells/mL or more, preferably 5x10 5 cells/mL or more, and more preferably 1x10 6 cells/mL or more, but is not limited thereto.
  • the residual glucose concentration in the medium can be cultured while maintaining 0.001 g / L ⁇ 4.5 g / L, preferably 0.01 ⁇ 4.0 g / L, more preferably 0.1 ⁇ 3.5 g / L,
  • the present invention is not limited thereto.
  • the meaning of “culturing while maintaining the residual glucose concentration in the medium at 0.001 g/L to 4.5 g/L, preferably 0.01 to 4.0 g/L, more preferably 0.1 to 3.5 g/L” Measures the concentration of residual glucose in the medium during the culture period at intervals of 1 to 36 hours, preferably every 3 to 30 hours, more preferably every 6 to 24 hours, or in real time, so that the concentration of residual glucose in the medium is 0.001 If it is below the reference concentration set within g/L to 4.5 g/L, preferably 0.01 to 4.0 g/L, more preferably 0.1 to 3.5 g/L, add a glucose stock solution to the medium to obtain the corresponding reference concentration. It means adding and culturing.
  • the reference concentration of the residual glucose concentration in the medium is 0.001 g/L to 4.5 g/L, preferably 0.01 to 4.0 g/L, more preferably 0.1 to 3.5 g/L. It will be apparent to those skilled in the art that the reference concentration may be appropriately changed during the culture period. For example, in the initial 1st and 2nd days, the standard concentration of residual glucose in the medium is 2 g/L, and on the 3rd to 5th days, the standard concentration is lowered to 1.5 g/L, and then the reference concentration is increased again. It may be cultured at 2 g/L, or it may be cultured by setting the reference concentration to a concentration lower than 1.5 g/L, that is, 1.0 g/L.
  • Hyaluronidase PH20 or a variant thereof produced by the method according to the present invention and having a specific Sialylation content and/or Galactosylation content and Mannosylation content in the N-sugar chain content has an activity of 10,000 units in a culture medium of the hyaluronidase enzyme. /mL, preferably 11,000 unit/mL or more, more preferably 12,000 unit/mL or more, but is not limited thereto,
  • hyaluronidase PH20 or a variant thereof produced by the method according to the present invention and having a specific Sialylation content and/or Galactosylation content and Mannosylation content in the N-sugar chain content is a natural human PH20 produced by a conventional method. It may be characterized in that the enzyme activity is increased by 10% or more, preferably by 12% or more, more preferably by 15% or more than the activity, but is not limited thereto.
  • the culturing of the host cells in step (1) and/or step (2) comprises:
  • the culturing of the host cells in step (1) and/or step (2) is performed by adding ammonia to the medium or It may be characterized in that the ammonia concentration is increased to 5mM or more, Glutamine is added, Galactose and ManNAc are not added, Uridine or Glucosamine is added, and Sodium Butyrate is added, but it is not limited thereto. .
  • hyaluronidase PH20 or a variant thereof refers to an enzyme that degrades hyaluronic acid located in the extracellular matrix.
  • “hyaluronidase PH20” or “PH20” is interpreted to include both native PH20 and mature forms thereof, and “variant” of “hyaluronidase PH20” or “PH20” means “ In the amino acid sequence of hyaluronidase PH20 or "PH20", PH20 comprising substitutions, deletions and insertions of one or more amino acid residues, and optionally some of N-terminal and/or C-terminal amino acid residues deleted variant, but is not limited thereto.
  • the hyaluronidase according to the present invention is derived from animals and microorganisms such as Stereptomyces, and refers to anything having hyaluronidase activity, among which “hyaluronidase PH20” or “PH20” refers to animals and Those derived from microorganisms such as Stereptomyces, preferably those derived from humans, cattle, or sheep.
  • Human-derived “hyaluronidase PH20” or “PH20 variant” according to the present invention may be exemplified by those described in International Patent Publication No. 2020/022791 and US Patent No. 9,447,401, but is not limited thereto, and “ In the amino acid sequence of hyaluronidase PH20 or "PH20", one or more amino acid residues are substituted, deleted and inserted, and optionally, some of the N-terminal and/or C-terminal amino acid residues are deleted. It should be construed as including all those having enzymatic activity of nidase.
  • hyaluronidase protein As the host cell used for expression of the hyaluronidase protein in the present invention, animal cells, yeast, Actinomycetes and insect cells, etc. may be used, but are not limited thereto no.
  • the animal cells are preferably mammalian cells. More preferably, generally used animal culture cells such as CHO cells, HEK cells, COS cells, 3T3 cells, myeloma cells, BHK cells, HeLa cells, and Vero cells are used, and in the case of mass expression, especially CHO cells Cells are preferred.
  • animal culture cells such as CHO cells, HEK cells, COS cells, 3T3 cells, myeloma cells, BHK cells, HeLa cells, and Vero cells are used, and in the case of mass expression, especially CHO cells Cells are preferred.
  • dhfr-CHO cells Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220
  • CHO K-1 cells Proc which are CHO cells deficient in the DHFR gene. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275
  • Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275 is preferably a cell suitable for introducing a desired gene.
  • the CHO cell is particularly preferably a DG44 strain, a DXB-11 strain, a K-1 strain or a CHO-S strain, and introduction of the vector into a host cell is carried out by the calcium phosphate method, the DEAE dextran method, the electroporation method, or the lipoprotein method. It is possible to carry out by a method such as a screening.
  • Yeast may include Sacchromyces sp., Hansenula sp., Kluyveromyces and Pichia sp. (Streptomyces) may be exemplified, but is not limited thereto.
  • the culture of the host cells in step (1) and/or step (2) is a batch culture method, a repeated batch culture method (repeated batch) culture), fed-batch culture, repeated fed-batch culture, continuous culture, and perfusion culture It can be done by one or more methods selected from the group consisting of, The present invention is not limited thereto.
  • the batch culture method is a culture method in which cells are proliferated without newly adding a medium or discharging a culture solution during culture.
  • the continuous culture method is a culture method in which a medium is continuously added and discharged continuously during culture.
  • the continuous culture method includes perfusion culture. Since the fed-batch culture method falls between the batch culture method and the continuous culture method, it is also called semi-batch culture, and medium is added continuously or sequentially during culture. This is a culture method in which cell outflow is not carried out.
  • any culture method may be used, but preferably, a fed-batch culture method or a continuous culture method is used, and particularly preferably, a fed-batch culture method is used.
  • the specific activity of the enzyme can be increased by 10% or more compared to that produced by the general method, in particular, natural human PH20 It is characterized in that the activity is improved by more than 10%.
  • This increase in enzymatic activity is due to change in N-glycosylation properties and/or charge modification of hyaluronidase PH20 or a variant thereof produced by the production method according to the present invention.
  • the enzyme activity increases according to the change of the Sialylation content and/or Galactosylation content and Mannosylation content during N-glycosylation.
  • these N-glycosylation properties particularly Sialylation content and/or Galactosylation content and Mannosylation content This can be adjusted.
  • the covalent bond between sugar and protein is an N-glycosidic bond in which N-acetyl-D-glucosamine is covalently linked to an asparagine residue constituting a protein (N-glycosidic linked sugar chain), and N-acetyl to a serine or threonine residue
  • N-glycosidic linked sugar chain N-glycosidic linked sugar chain
  • O-glycosidic bonds O-glycosidic linked sugar chains
  • a glycoprotein having either or both of -glycosidic-linked sugar chains and O-glycosidic-linked sugar chains is also included in the glycoproteins of the present invention.
  • the present invention provides a hyaluronidase PH20 having a sialylation content of 1 to 38%, preferably 1 to 30%, more preferably 1.5 to 28%, and most preferably 2 to 25% of the N-saccharide chain content. or a variant thereof.
  • the galactosylation content is 1-68%, the sialylation content is 1-38%, the mannosylation content is 40-63%, preferably the galactosylation content is 5-60%, the sialylation content is 1-30% %, Mannosylation content is 42 ⁇ 62%, more preferably Galactosylation content is 10 ⁇ 56%, Sialylation content is 1.5 ⁇ 28%, Mannosylation content is 44 ⁇ 61%, most preferably Galactosylation content is 15 ⁇ 50%, It relates to hyaluronidase PH20 or a variant thereof, characterized in that the sialylation content is 2-25% and the mannosylation content is 47-60%.
  • the above numerical value is a numerical value derived from the experimental results of Example Table 1 and a numerical value of a 95% confidence interval is applied, and this numerical value may also include an error of 10%. Because, when measuring the sugar content of a protein, there is a deviation depending on the conditions such as the equipment used for the experiment, the enzyme reaction time, the test temperature, the degree of work mastery of the tester, etc., so the sugar content measured in the present invention is rather than in a limited sense This is because it should be interpreted in a broader sense in consideration of the differences between laboratories.
  • the charge modification of PH20 or a variant thereof may be identified through isoelectric focusing.
  • Hyaluronidase PH20 or a variant thereof having a specific Sialylation content and/or Galactosylation content and Mannosylation content among the N-sugar chain content according to the present invention is preferably produced by the production method according to the present invention, but is not limited thereto. , it is natural that it can be produced by other methods that can be modified in light of the common sense of those skilled in the art.
  • the medium used for culturing cells to express the glycoprotein is preferably, but not limited to, a serum-free medium, and DMEM/F12 medium (mixed medium of DMEM and F12) may be used as a basic medium.
  • DMEM/F12 medium mixed medium of DMEM and F12
  • commercially available serum-free medium for example, HycellCHO medium, ActiPro medium (Hyclone, USA), CD OptiCHO TM medium, CHO-S-SFM II medium, or CD CHO medium (Above Gibco, USA) , IS CHO-V TM medium (Irvine Scientific, USA), EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch Medium (Sigma-Aldrich, USA), etc.
  • a basal medium but is not limited thereto.
  • the feed medium used to culture the cells to express the glycoprotein is a serum-free medium, for example, Cell Boost TM 1, Cell Boost TM 2, Cell Boost TM 3, Cell Boost TM 4, Cell Boost. TM 5, Cell Boost TM 6, Cell Boost TM 7a/7b (Hyclone, USA), CD CHO EfficientFeed TM A AGT TM , CD CHO EfficientFeed TM B AGT TM , CD CHO EfficientFeed TM C AGT TM , CD CHO EfficientFeed TM A plus AGT TM , CD CHO EfficientFeed TM B plus AGT TM , CD CHO EfficientFeed TM C plus AGT TM (Gibco, USA), BalanCD ® CHO Feed 4 (Irvine Scientific, USA), EX-CELL ® Advanced CHO Feed (Sigma-Aldrich, USA), CHO-U Feed Mix U1B7/ CHO-U Feed Mix
  • feed medium and "enriched nutrient medium” are a medium composed of specific nutrients or a plurality of nutrients such as amino acids, vitamins, salts, trace elements, lipids and glucose, and may be concentrated products of the basal medium. , It is possible to manufacture and use various components and concentrations of the feed medium according to the cells to be cultured.
  • feed medium for example, Cell Boost Series supplement medium (Hyclone, USA), EfficientFeed Supplement medium, GlycanTune feed medium (Gibco, USA), BalanCD CHO feed medium (Irvine Scientific, USA) USA), Cellvento®CHO Cell Culture feed medium (Merck, USA), EX-CELL®Advanced CHO feed medium (Sigma-Aldrich, USA), etc.
  • Cell Boost Series supplement medium Hyclone, USA
  • EfficientFeed Supplement medium GlycanTune feed medium
  • GlycanTune feed medium GlycanTune feed medium
  • BalanCD CHO feed medium Irvine Scientific, USA
  • Cellvento®CHO Cell Culture feed medium Merck, USA
  • EX-CELL®Advanced CHO feed medium Sigma-Aldrich, USA
  • the plant-derived hydrolyzate used in the present invention refers to a product extracted from garden pea, cotton seed, or wheat gluten, soybean, etc. without containing animal-derived components, and includes amino acids, peptides, vitamins, carbohydrates, nucleotides, minerals, etc. As a supplement containing abundant components, it can also be used by manufacturing various components and component concentrations of plant-derived hydrolysates depending on the cells to be cultured.
  • the additive used to increase or decrease the N-saccharide content of the glycoprotein used in the present invention generally refers to a component known to be involved in protein glycation.
  • the delivery of sialic acid to the galactose residue must be limited, desialylation, or galactosylation content must be limited.
  • Min, Glucose, Mannose, Glutamine, Galactose, ammonia, butyric acid, etc. are components that are precursors to saccharification.
  • a medium containing serum is a complex composition whose chemical composition is not clear.
  • a serum-free medium or a low-serum medium is mainly used because it can have a negative effect on separation and purification as well as problems of cost or reproducibility.
  • glucose, the main carbon source is additionally added to the medium for culture, and additionally, glutamine can be added to culture.
  • glucose and glutamine in the medium in order to increase the sialylation content in order to increase the half-life in the body, glucose and glutamine in the medium must be maintained at a certain concentration or higher without depleting, and the pH of the culture medium must also be maintained at a specific value.
  • concentrations of glucose and glutamine measured in the culture medium refer to the respective residual concentrations remaining after use by the cells.
  • a promoter for the activity of enzymes involved or an inhibitor that inhibits desialylation is sometimes used.
  • the sialylation content is also increased by adding a precursor of the N-saccharide chain or adjusting the activity promoter or culture condition of the related enzyme to increase the galactosylation content.
  • the N-saccharide chain content cannot be controlled by the above method, but in the case of production according to the production method according to the present invention, the N- It is possible to produce hyaluronidase PH20 or a variant thereof having a sugar chain content characteristic and thus a high enzymatic activity.
  • the production method according to the present invention may include a separation and purification step of additionally produced hyaluronidase PH20 or a variant thereof.
  • Separation and purification of hyaluronidase PH20 or a variant thereof according to the present invention does not use affinity binding properties, but separation and purification using ionic binding properties and/or hydrophobic interaction properties of hyaluronidase PH20 or a variant thereof Preferably, but not limited thereto.
  • the separation and purification of hyaluronidase PH20 or a variant thereof according to the present invention does not use affinity chromatography, but cation exchange chromatography and/or anion exchange chromatography chromatography) may be performed using ion exchange chromatography and hydrophobic interaction chromatography, but is not limited thereto.
  • the separation and purification step of hyaluronidase PH20 or a variant thereof according to the present invention is characterized in that the acidic hyaluronidase PH20 or a variant thereof having low enzymatic activity is removed, preferably the acidic is characterized in that the removal of hyaluronidase PH20 or a variant thereof is performed using ion exchange chromatography.
  • the enzymatic reaction can be divided into an enzymatic reaction having an active site of fixed reactivity and an enzymatic reaction having several active sites having various reactivity. It is known that the rate of the catalytic reaction of an enzyme with a single active site of fixed reactivity, such as hyaluronidase, follows the Michaelis-Menten rate formula.
  • Michaelis-Menten's enzymatic reaction kinetics is as follows: a reversible reaction step in the formation of a complex [ES] of an enzyme (E) - a substrate (S) and an irreversible reaction step in which a product (P) is generated due to dissociation of the ES complex It is premised on the assumption of an enzymatic reaction as a two-step reaction system of In this case, kf, kr, and kcat are the rate constants of the reaction in each direction (Alan Fersht (1977) Enzyme structure and mechanism).
  • reaction rate of the final product can be expressed by the following Michaelis-Menten rate formula.
  • K M ( k r + k cat ) / k f
  • V max k cat [E] 0 .
  • the Lineweaver-Burk equation is used to experimentally analyze the enzyme reaction rate using the Michaelis-Menten rate formula.
  • This equation is an equation showing the relationship with the value of the reciprocal 1/V of the reaction rate experimentally measured for the reciprocal 1/[S] of the given substrate concentration in the experiment. If it is statistically confirmed that this equation is a first-order equation, it can be confirmed that the enzymatic reaction is a reaction according to Michaelis-Menten's rate formula, and K M and V max can be obtained using this equation.
  • an enzyme In catalyzing a chemical reaction, an enzyme has a transition state after bonding to a substrate at the active site, and the activation energy to reach a transition state with high energy is lowered through various bonds with the substrate.
  • the equilibrium constant for reaching this transition state is proportional to k cat / K M .
  • 1 / K M is an index that combines the degree to which the enzyme and substrate combine to form an enzyme-substrate complex and the degree to which the enzyme-substrate complex is maintained without decomposition
  • k cat is the equilibrium constant at which the enzyme-substrate complex forms a product. Therefore, k cat / K M is an indicator of how much product can be obtained from the substrate and the enzyme, that is, it can be said to represent the catalytic efficiency of the enzyme.
  • hyaluronidase The industrial availability of hyaluronidase is proportional to the enzyme catalytic efficiency.
  • the enzyme catalytic efficiency of hyaluronidase plays an important role.
  • the mutant according to the present invention has a higher k cat / K M than the native PH20, when the hyaluronidase contained in the pharmacologically active polymer is administered subcutaneously, it decomposes the hyaluronic acid present in the subcutaneous tissue more rapidly. This gives the superior effect of being able to disperse quickly.
  • the mutant according to the present invention has a larger k cat than wild-type PH20, at the same enzyme concentration, the maximum reaction rate, V max , increases, so that a greater amount of hyaluronic acid is decomposed at the same time, thereby providing pharmacologically active substances in a wider range It gives the superior effect of being able to disperse.
  • the enzyme reaction rate of each variant was analyzed and its K M (substrate concentration under 50% Vmax condition), k cat (substrate conversion rate), k cat / K M (Enzyme catalyst efficiency) The results were compared in Example 4. From these results, it can be demonstrated that the superiority of the PH20 variant according to the present invention compared to the wild-type PH20.
  • the two fractions had a difference in the range of the isoelectric point, and the enzyme activity decreased in the acidic fraction.
  • PNGase F both fractions were inactive, and the range of isoelectric points was similar.
  • the content of N-saccharide chains was closely related to the enzyme activity.
  • the basic fraction with a low terminal sialic acid content showed an increase in the enzymatic activity of hyaluronidase than the acidic fraction with a high sialic acid content.
  • cell line clone culture refers to a culture using a highly productive cell line clone selected using a selective marker from a clone of an animal cell transfected with a recombinant gene, which is a polyclonal cell line and is produced to produce a monoclonal cell line.
  • the cell line consists of a research cell line (RCB), a production master cell line (MCB), and a production cell line (WCB).
  • RBC research cell line
  • MMB production master cell line
  • WCB production cell line
  • various combinations of test culture were tried to optimize production, and it was found that even in this case, there was a difference in activity and N-saccharide content.
  • Cell line clone test culture #1 is a condition of batch culture at 37° C. without changing the culture temperature in a 2 L scale using HycellCHO medium (Hyclone, USA).
  • Cell line clone test culture #2 Purified fraction #1 and cell line clone test culture #2 Purified fraction #2 were placed in EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch medium (Sigma-Aldrich, USA) on an 8 L scale with Cotton 100UF (Gibco).
  • . 1 is the Low Salt Elution fraction
  • purified fraction #2 is the High Salt Elution fraction
  • cell line test culture #1 is Cotton 100UF in EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch medium (Sigma-Aldrich, USA) at 2 L scale.
  • Cell line test culture #3 is CD CHO EfficientFeed TM B plus AGT TM (after adding Cotton 200UF (Gibco, USA) to EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch medium (Sigma-Aldrich, USA) at 50 L scale.
  • Gibco, USA is a fed-batch culture method that is cultured at a culture temperature of 37°C and changed to 2°C when a certain cumulative cell concentration is reached, and cell line test culture #4 is EX-CELL® Advanced in a 10 L scale
  • a fed-batch culture method in which Cotton 200UF (Gibco, USA) is added to CHO Fed-Batch medium (Sigma-Aldrich, USA) and then CD CHO EfficientFeed TM B plus AGT TM (Gibco, USA) is added.
  • Culture temperature 37 When incubated at °C to reach a certain cumulative cell concentration, the temperature was changed to 32°C and cultured for 13 days.
  • Cell line culture #1, cell line culture #2, cell line culture #3, and cell line culture #4 are EX- at 200 L scale for research cell line (RCB), production master cell line (MCB), and production cell line (WCB), respectively.
  • CELL® Advanced CHO Fed-Batch medium (Sigma-Aldrich, USA) was added with Cotton 200UF (Gibco, USA) and then CD CHO EfficientFeed TM B plus AGT TM (Gibco, USA) was added as a fed-batch culture method. It is a condition of culturing at a culture temperature of 37°C, changing to 32°C when reaching a certain cumulative cell concentration, and culturing for 12 days. Based on these contents, experiments on the culture conditions of Examples 2-5 were conducted to establish a culture method for maintaining the N-saccharide content.
  • Natural human hyaluronidase PH20 and variants of Table 1, and the N-saccharide content of mammalian hyaluronidase PH20 is Galactosylation: 15-50%, Sialylation: 2.5-28%, Mannosylation: 47-60% If the 95% confidence interval of test results is applied, Galactosylation: 1-68%, Sialylation content: 1-38%, Mannosylation: 40-63% of industrially useful hyaluronidase. It was found that it can have activity.
  • the industrially useful activity of hyaluronidase means 50% or more of the activity of natural human PH20. The above values may include an error of 10%.
  • hyaluronidase with industrial efficiency higher than the activity of natural human PH20 can be produced when sialylation is limited to about 30% or less.
  • the above numerical value is a numerical value derived from the experimental result and may include an error of 10%.
  • High-quality hyaluronidase maintaining the N-sugar chain content was confirmed through temporary expression culture, and a cell line was prepared by selecting a monoclonal strain with high productivity for stable commercial production.
  • Cell line test culture #2, #3, #4, cell line culture #2, #3, #4, cell line culture #1, #2, #3, #4 In the case of all of the enzyme expression levels of 10,000 unit/mL or more, the efficiency of producing high-quality hyaluronidase at low cost was demonstrated.
  • the activity of the sample cultured under the above conditions was confirmed by HPLC and turbidity analysis, and protein patterns and N-saccharide chain levels were confirmed by performing isoelectric focusing and glycosylation analysis.
  • the medium to which 50mM galactose was added showed a 24% increase in galactosylation and a 2% decrease in activity compared to the medium without addition of 50mM galactose. It was confirmed that it was reduced by 20% ( FIGS. 3 , 4 , 5 and 6 ).
  • the temperature was changed to 32°C and fed-batch culture.
  • the feed medium CD CHO EfficientFeed TM B plus AGT TM medium (Gibco, USA) was supplied daily at 1.88% of the starting volume of the culture in the bioreactor.
  • the culture day was carried out until the cell viability was 40% or less, and the culture was terminated on the 19th day, and the various states of cells were taken daily from the culture and the number of viable cells, cell viability, cumulative viable cell concentration, and level of ammonium ions were measured.
  • the culture medium was recovered using a depth filter.
  • Hyaluronidase PH20 variant were inoculated at 2x10 6 cells/mL in EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch medium (Sigma-Aldrich, USA) in a Sartorius 2 L bioreactor. did On the second day of culture, Cotton 200UF (Gibco, USA) and CD CHO EfficientFeed TM B plus AGT TM medium (Gibco, USA), which is a concentrated nutrient medium (Gibco, USA), were used as feed-batch culture, pH 7.2. It was stirred at a speed of 120 rpm by setting ⁇ 0.4 and DO 40%.
  • the temperature was changed to 32°C and fed-batch culture.
  • the feed medium CD CHO EfficientFeed TM B plus AGT TM medium (Gibco, USA) was supplied daily at 1.88% of the starting volume of the culture in the bioreactor.
  • Various states of cells were taken from the culture every day, and the number of viable cells, cell viability, pH, osmotic pressure, glucose, and lactate levels were measured.
  • Glucose concentration was controlled by measuring the concentration of glucose in the culture medium every day, and the concentration was adjusted from the point in time when the concentration of glucose contained in the medium was consumed according to cell growth and was measured to be below the reference concentration of 2, 4, or 6 g/L.
  • the measured glucose concentration is 2, 4, or 6 g/L or less, which is the respective standard concentration
  • Each concentration condition was maintained in such a way that the In general, within 3 hours in animal cell culture, the effect of changes in glucose content on cell growth is negligible.
  • the condition to maintain 2 g/L as the reference concentration is referred to as 1 g/L ( ⁇ 1 g/L) concentration condition
  • the condition to maintain 4 g/L as the reference concentration is referred to as 3 g/L ( ⁇ 1) g/L) concentration condition
  • the condition of maintaining 6 g/L as the reference concentration was referred to as 5 g/L ( ⁇ 1 g/L) concentration condition.
  • the condition for maintaining the glucose concentration of 1 g/L ( ⁇ 1 g/L) means that the lower limit of the control range of glucose concentration is set to 0 g/L, and the upper limit of the control range of glucose concentration is set at 2 g/L.
  • the concentration condition of 2 g/L is 1 g/L ( ⁇ 1 g/L) L)
  • the concentration refers to the upper limit condition
  • the 3 g/L ( ⁇ 1 g/L) concentration refers to the lower limit condition.
  • the culture supernatant was obtained by centrifugation at 4°C and 10,000 rpm for 60 minutes.
  • the activity of the sample cultured under the above conditions was confirmed by HPLC and turbidity analysis, and protein patterns and N-saccharide chain levels were confirmed by performing isoelectric focusing and glycosylation analysis.
  • As the concentration of glucose in the culture medium increased it was confirmed that the contents of galactosylation and sialylation increased and the activity decreased ( FIGS. 11 , 12 , 13 and 14 ).
  • Hyaluronidase PH20 variant were inoculated at 2x10 6 cells/mL in EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch medium (Sigma-Aldrich, USA) in a Sartorius 2 L bioreactor. did On the second day of culture, a fed-batch culture using Cotton 200UF (Gibco, USA) and a concentrated nutrient medium, CD CHO EfficientFeed TM B plus AGT TM medium (Gibco, USA), was carried out and with 40% DO set and stirred at a speed of 120 rpm. After initial culture at 37°C, when the cumulative viable cell concentration reached the change range, the temperature was changed to 32°C and fed-batch culture.
  • the feed medium CD CHO EfficientFeed TM B plus AGT TM medium (Gibco, USA) was supplied daily at 1.88% of the starting volume of the culture in the bioreactor.
  • the culture pH was divided into four conditions: pH 6.8 ⁇ 0.1, pH 7.0 ⁇ 0.1, pH 7.2 ⁇ 0.1, and pH 7.4 ⁇ 0.1 in order to find an improved condition compared to the existing pH 7.2 ⁇ 0.4.
  • These four conditions set the pH control range of the culture using a conventional incubator with a pH control function.
  • pH 7.0 ⁇ 0.1 means that the lower limit of the pH control range is set to pH 6.9
  • the upper limit of the pH control range is set to pH 7.1.
  • the condition of pH 6.9 refers to the condition that is the upper limit at pH 6.8 ⁇ 0.1, and the condition that is the lower limit at pH 7.0 ⁇ 0.1. Therefore, it cannot be said to be a duplicate condition.
  • the culture was carried out until the cell viability was less than 40%, and various states of cells were taken from the culture every day and the number of viable cells, cell viability, pH, and the level of cumulative viable cell concentration were measured.
  • the culture supernatant was obtained by centrifugation at 10,000 rpm for 60 minutes.
  • the samples cultured under the above conditions were checked for activity by HPLC and turbidity analysis, and protein patterns were confirmed by performing isoelectric focusing. A change in activity was observed depending on the pH of the culture medium, and the highest activity and the lowest sialylation content were observed at pH 7.0 ⁇ 0.1, an improvement condition compared to the existing condition. (Table 2, Fig. 15, Fig. 16, Fig. 17)
  • Step 1 Buffer exchange/surfactant treatment of culture supernatant
  • the culture was readjusted with adjustment of pH and conductivity by UF/DF using a 30 kDa MWCO membrane filter to adjust to the first anion exchange column equilibration conditions.
  • the reconditioned solution was treated with an appropriate concentration of solvent/surfactant for virus inactivation, and reacted for about 60 minutes under room temperature conditions.
  • Step 2 First Q Sepharose Fast Flow Column Chromatography
  • the filtered protein solution was passed through a first anion exchange column to capture hyaluronidase with an anion exchange resin, followed by eluting from the column at a high salt concentration.
  • the column Prior to loading, the column was equilibrated using tromethamine buffer, pH 8.0, at a salt concentration of 30 mM. After loading, the column was washed with the same buffer (first wash). Following the first wash step, the column was washed with the same buffer, pH 8.0, but at a salt concentration of 60 mM, which conductivity was higher than the salt concentration of the first wash step.
  • elution of the desired protein, hyaluronidase was performed using an appropriate buffer of pH 8.0 at 200 mM salt concentration as shown in FIG. 18 .
  • Step 3 Secondary anion exchange (Capto Q) column chromatography
  • the filtered protein solution was passed through a secondary anion exchange column to remove the acidic variant of hyaluronidase with an anion exchange resin, followed by eluting from the column at a high salt concentration.
  • the column Prior to loading, the column was equilibrated using Bistris buffer, pH 6.0 without salt. After loading, the column was washed with the same pH 6.0 Bistris buffer (first wash). Following the first wash step, the column was washed with Bistris buffer, but at a salt concentration of 20 mM, which conductivity was higher than the salt concentration of the first wash step. After the second washing step, elution of the desired protein, hyaluronidase, was performed using a Bistris buffer at a salt concentration as shown in FIG. 19 .
  • Step 4 Cation exchange (Capto MMC) column chromatography
  • the reconditioned protein solution was passed through a column to remove the acidic variant of hyaluronidase with a cation exchange resin, followed by eluting from the column at high pH and salt concentration.
  • the column Prior to loading, the column was equilibrated with a citrate buffer pH 5.5 at a salt concentration of 80 mM. After loading, the column was washed with the same buffer (first wash). Following the first wash step, the column was washed with an appropriate Bistris buffer, pH 7.5. After the second washing step, elution of the desired protein, hyaluronidase, was performed using a Bistris buffer of pH 8.0 at a salt concentration of 400 mM as shown in FIG. 20 .
  • the protein solution containing the desired hyaluronidase was filtered through a 1um filter and subjected to a nano-filtration step.
  • the protein solution passed through the nanofiltration was concentrated to a high concentration of 10 mg/mL and readjusted by UF/DF using an 8 kDa MWCO membrane filter for exchange with a histidine buffer at pH 7.0 containing 145 mM salt.
  • the enzymatic activity of hyaluronidase PH20 and other hyaluronidases was measured using the following Turbidimetric assay.
  • Turbidimetric assay is a method to measure the precipitate generated when hyaluronic acid and albumin (BSA) are mixed using absorbance.
  • BSA albumin
  • the absorbance decreases when mixed with albumin.
  • Hyaluronidase PH20 Sigma was diluted to 1, 2, 5, 7.5, 10, 15, 20, 30, 50, 60 units/mL and prepared in each tube.
  • the purified protein sample is dissolved in enzyme diluent buffer (20 mM Tris HCl, pH 7.0, 77 mM NaCl, 0.01% (w/v) bovine serum albumin) and diluted to 100X, 300X, 600X, 1200X, 2400X in each tube.
  • enzyme diluent buffer (20 mM Tris HCl, pH 7.0, 77 mM NaCl, 0.01% (w/v) bovine serum albumin
  • 100X, 300X, 600X, 1200X, 2400X prepared in A new tube was diluted 10-fold so that the concentration of 3 mg/mL hyaluronic acid solution was 0.3 mg/mL, so that the volume of each tube was 180 ⁇ l.
  • 60 ⁇ l of the enzyme was added to the diluted hyaluronic acid solution, mixed, and reacted at 37° C. for 45 minutes.
  • Isoelectric point electrophoresis of hyaluronidase was analyzed using Invitrogen's Precast Gel (pH 3-7) and a buffer solution for isoelectric point electrophoresis. After loading the purified hyaluronidase sample on Precast Gel, using an electrophoresis apparatus of Novex, 100 V for 1 hour, 200 V for 1 hour, and 500 V for 30 minutes were carried out for development. After the development was completed, the gel was washed with purified water, the protein was fixed with a 12% TCA solution, and then stained with Coomassie Blue R-250 staining solution.
  • the N-sugar chain content of hyaluronidase was determined by labeling the N-saccharide sample separated by treating the hyaluronidase with PNGase F (N-glycosidase F) with 2-AB (2-aminobanzamide), followed by ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide column (Ultra High Performance Liquid Chromatography) was performed using (Waters) and analyzed.
  • the purified hyaluronidase sample was desalted and reacted with PNGase F at 37°C for 16-18 hours to separate N-saccharide chains, which were dried and then 2-AB Labeling was reacted at 65°C for 3 hours, and excess 2-AB was removed.
  • the labeled N-saccharide sample was separated by HPLC with a 72%-20% acetonitrile gradient. The separated sample was detected with a Flourescence detector (FLD) and the N-saccharide content was analyzed.
  • Galactosylation % content by classifying each separated N-saccharide chain and adding up each content of each N-saccharide chain (G1, G1F, G1F', G2, G2F, A1, A1F, A2, A2F, etc.) including galactose at the end of the N-saccharide chain is obtained, and the sialylation % content is obtained by summing all the contents of each N-saccharide chain (A1, A1F, A2, A2F, etc.) including sialic acid at the end of the N-saccharide chain, and the N-sugar chain including mannose (M4G0F , M5, M5G0, M6, M7, M8, M9, etc.) were summe
  • hyaluronidase PH20 of animal origin, that is, bonobo, apes, and sheep
  • ox, hyaluronidase PH20 was prepared as follows, respectively.
  • cDNA was synthesized from each native gene, and inserted into the Xho I and Not I restriction enzyme sites of pcDNA3.4-TOPO vector.
  • pcDNA3.4-TOPO vector For expression in ExpiCHO cells, one of the signal peptides of human growth hormone, human serum albumin, or human Hyal1 was used as a signal peptide instead of the native signal peptide of PH20.
  • a His-tag DNA sequence was placed at the 3'-end of the PH20 cDNA. Each sequence was confirmed using DNA sequencing. Table 3 presents the sequences of animal-derived hyaluronidases.
  • ExpiCHO expression was performed using the ExpiCHO expression system.
  • the plasmid in which hyaluronidase PH20 cDNA was inserted into pcDNA3.4-TOPO vector was used to transfect ExpiCHO cells using ExpiFectamine CHO Reagent.
  • ExpiCHO Expression Medium 100 ⁇ 500 mL was used.
  • ExpiCHO cells were cultured with shaking at 130 rpm for a total of 6 days. During this period, they were cultured at 37°C for 1 day, and the temperature was lowered to 32°C and cultured for 5 more days. Upon completion of the culture, the cell supernatant was recovered by centrifugation at 10,000 rpm for 30 minutes.
  • the recombinant protein of C-terminal His-tagged animal hyaluronidase PH20 produced in ExpiCHO cells was purified by two-step column chromatography using AKTA prime equipment (GE Healthcare). Since the pI is 6, Q Sepharose, which is anion exchange chromatography, was used. In the case of sheep PH20, since the pI is 8 or higher, one-step purification was performed using a Capto S column, which is a cation exchange chromatography, and each protein was analyzed by His-Tag affinity chromatography. Two-step purification was performed using a HisTrap HP column.
  • buffer A (20 mM sodium phosphate, pH 7.5) and buffer B (20 mM sodium phosphate, pH 7.5, 0.5 M NaCl) were prepared. After binding the protein to the Q Sepharose column, 5 CV of buffer A was flowed to remove non-specifically bound proteins, and 5 CV of buffer B was flowed at a concentration gradient of 0-100% to elute the protein.
  • buffer A (20 mM sodium phosphate, 15 mM NaCl, pH 6.0) and buffer B (20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, pH 6.0) were prepared, respectively.
  • the pH and conductivity of the culture were adjusted to be the same as those of Buffer A, and the culture was filtered through a membrane with a pore size of 0.22 ⁇ m.
  • 3 column volume (CV) of buffer A was flowed to remove the non-specifically bound protein.
  • the target protein was eluted by sequentially flowing 4 CV of Buffer B.
  • Buffer A (20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, pH 7.5) and Buffer B (20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, 500 mM Imidazole, pH 7.5) were prepared, respectively.
  • Buffer B 20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, 500 mM Imidazole, pH 7.5
  • After binding the protein sample to the HisTrap HP column 7 CV of 7% Buffer B was flowed to remove non-specifically bound proteins, and 3 CV of 40% Buffer B was flowed for elution of the target protein.
  • the column eluate was dialyzed using Dialysis buffer (20 mM sodium phosphate, 100 mM NaCl, pH 7.0).
  • the enzyme activity was measured by the Morgan-Elson method (Takahashi, T. et al (2003) Anal Biochem 322:257-263).
  • the Morgan-Elson method when hyaluronic acid is hydrolyzed by hyaluronidase, the reducing end of N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) produced by the reaction of para-dimetylaminobenzaldehyde (DMAB), Ehrlich's reagent, is produced. It is a colorimetric analysis method that quantifies red substances (545 nm).
  • N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc, Sigma) was diluted with dilution buffer (0.1 M NaPi, 0.1 M NaCl, 1.5 mM Saccharic Acid 1,4-lactone, pH 5.35) to 0.25, 0.50, 0.75, 1.00, 1.25 mM. After reduction by treatment with tetraborate in each test tube prepared by dilution, DMAB was added to react with color development. After the reaction, absorbance was measured at 545 nm to prepare a standard response curve for GlcNAc.
  • dilution buffer 0.1 M NaPi, 0.1 M NaCl, 1.5 mM Saccharic Acid 1,4-lactone, pH 5.35
  • DMAB was added to react with color development. After the reaction, absorbance was measured at 545 nm to prepare a standard response curve for GlcNAc.
  • the substrate hyaluronic acid was diluted to 0.54, 0.65, 0.87, 1.23, 2.17 ⁇ M with a dilution buffer solution, and hyaluronidase was added to each prepared test tube, reacted at 37°C for 5 minutes, and then heated at 100°C for 5 minutes for enzymatic reaction. After completion of the reduction by treatment with tetraborate, DMAB was added to cause a color reaction. After the reaction, absorbance was measured at 545 nm, and enzyme activity was measured using the standard reaction curve of GlcNAc above.
  • Table 4 analyzes the enzyme reaction rates of fractions #1 and #2 obtained by preparing cell line clone test culture #2 among the samples in Table 1 of Example 1. As a result, it can be seen that when the galactosylation content and the mannosylation content are in a similar range and the sialylation content is low, the enzyme activity of the recombinant hyaluronidase is increased because the catalytic efficiency (kcat/Km) of the enzyme is large.
  • H Tachibana K Taniguchi, Y Ushio, K Teruya, K Osada, H Murakami. (1994). Changes of monosaccharide availability of human hybridoma lead to alteration of biological properties of human monoclonal antibody. Cytotechnology. 16(3):151-7.

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Abstract

본 발명은 히알루로니다제 또는 이의 변이체의 생산방법에 관한 것으로, 구체적으로 배양액 Glucose 농도를 조절하여 배양하는 조건, 감소된 배양 온도에서 특정 배양일로 배양하는 조건 등을 적용함으로써, 상기 단백질의 N-glycan의 함량을 변화시킴으로써 비활성을 10% 이상 증가시켜 품질 및 생산 수율을 향상시키는 것을 특징으로 한다.

Description

재조합 히알루로니다제의 생산 방법
본 발명은 히알루로니다제, 특히 천연형 PH20 또는 성숙된 천연형 PH20, 또는 천연형 PH20 또는 성숙된 천연형 PH20의 아미노산 서열에 있어, 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 포함하고, 선택적으로 N-말단 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기의 일부가 결실된 히알루로니다제 PH20 변이체의 생산 방법에 관한 것이다.
히알루로니다제는 세포외기질(extracellular matrix)에 위치한 히알루론산을 분해하는 효소이다. 이러한 히알루로니다제는 히알루론산을 가수분해하여 세포외기질의 히알루론산의 점성(viscosity)을 감소시켜 조직(피부)으로의 투과성(permeability)를 증가시킨다 (Bookbinder et al., 2006). 히알루로니다제는 피하 주사 [Muchmore et al., 2012] 또는 근육 내 주사 [Krantz et al., 2016]에 의해 제공되는 체액의 흡수를 향상시키고 국소 마취제의 확산을 개선하기 위해 사용되고 있다 [Clement et al., 2003]. 이러한 방식으로 피하 투여가 촉진된 약물에는 모르핀 [Thomas et al., 2009], 세프트리악손 [Harb et al., 2010], 인슐린 [Muchmore et al., 2012] 및 면역 글로불린 [Wasserman et al., 2014]이 있다. 또한, 정맥 주사 또는 혈종 확산에 조직으로 유출된 체액 또는 약물의 분산을 향상시키는 데 사용되고 있다. 히알루로니다제 중 중성 pH에서 활성을 갖고 있는 인간 PH20의 재조합 단백질은 Halozyme Therapeutic사에 의해 개발되어 Hylenex 상품명으로 판매되고 있다 (Bookbinder et al., 2006).
인간 PH20의 재조합 단백질은 효모(P. pastoris), DS-2 곤충세포, 동물세포 등에서 발현된 것이 보고되었다. 곤충세포와 효모에서 생산된 재조합 PH20 단백질은 단백질 번역 후 변형 과정에서 N-당화의 양상이 인간 PH20과 다르기 때문에 활성에도 영향을 미치며 체내에서의 부작용의 발생 우려가 존재한다.
바이오 의약품 개발의 경우 제품 일관성과 긴 유효기간은 제조 및 유연성을 제공하는 중요한 요소이다. 제조하는 동안 효소 또는 자발적 분해 및 변형으로 인해 크기 및 전하 등의 차이로 다양한 형태의 Microheterogeneity가 발생한다. 탈 아미드화 및 시알릴화와 같은 화학적 및 효소적 변형은 각각 항체에서 순 음전하를 증가시키고 pI 값을 감소시켜 산성 변이체를 형성한다 [Harris RJ et al., 2004]. 또한, C- 말단 라이신 절단은 순 양전하의 손실을 초래하고 산성 변이체 형성을 초래한다. 염기성 변이체의 형성은 C- 말단 라이신 또는 glycine amidation, succinimide 형성, 아미노산 산화 또는 시알산 제거로 인해 발생할 수 있으며, 이는 추가적인 양전하 또는 음전하를 제거하고; 두 가지 유형의 변형은 pI 값을 증가시킨다 [Harris RJ et al., 2004].
당화 (glycosylation)는 세포(진핵생물)의 단백질 번역 후 과정으로써 소포체 및 골지체에서 일어나는 반응이다. N-당화와 O-당화로 나뉘는데 이는 붙는 작용기에 따라 다르다. 세포에서 생성된 단백질에 락토스나 푸코스 등의 당이 붙는 과정을 통틀어 '당화'라고 한다. 당화 과정으로 당사슬이 단백질에 연결되면 단백질이 '폴딩'과정을 거쳐 입체적인 구조물을 형성한다. 이는 단백질이 풀어지지 않고 오랫동안 유지될 수 있는 안정성을 부여한다. 이러한 당사슬은 세포간의 의사소통과 정보교환의 역할도 하여 중요한 과정이다.
단백질에 당사슬이 부가되는 반응에는 N-결합 혹은 O결합 당질화 (N-linked or O-linked Glycosylation)의 두 가지 형태가 있다. 이 두 당질화 과정은 당 사슬 합성 및 부가 메커니즘에서 차이가 있으며, 이 중 N-당질화의 기작과 역할이 보다 잘 알려져 있다. N-당질화를 통해서 부가되는 당 사슬을 N-당사슬 (N-Glycan)이라 부르며 소포체에서 시작된다. 소포체 막에 존재하는 돌리콜 피로인산 (Dolichol Pyrophosphate, PP-Dol)에 ALG (Asparagine-Linked Glycosylation)로 명명된 일련의 ALG 효소들이 N-아세틸 글루코사민 (N-Acetylglucosamine, GlcNAc), 만노즈 (Mannose, Man), 포도당 (Glucose, Glc) 등을 부가하여, 최종적으로 지질과 연결된 올리고당 (Lipid-linked Oligosaccharide, LLO) 형태의 복합 당사슬인 Glc3Man9GlcNAc2 -PP-Dol을 합성하게 된다. 이렇게 합성된 LLO는 8개 이상의 subunit으로 구성된 올리고당 전이효소 (Oligosaccharyltransferase)에 의해서 Co-translational Translocation 기작으로 리보좀에서 소포체로 직접 번역되어 나오는 N-x-S/T를 포함하는 펩타이드의 N-당질화 서열에 전달된다. 이렇게 단백질에 부착되어진 N-당사슬은 소포체 안에 존재하는 글루코시다아제 (α-Glucosidase I, Gls1p; αglucosidase II, Glsp II)에 의해서 당사슬 맨 끝의 포도당부터 하나씩 제거된다. 두 번째와 세 번째 포도당이 좀 더 천천히 제거되면서 Lectin Chaperone인 Calnexin/Calreticulin의 도움으로 폴딩이 완성된다. 모든 포도당이 다 잘려 나가면 단백질 폴딩이 완료된 것으로 인지하고 Man8GlcNAc2 당사슬이 부착된 형태로 골지체로 옮겨지게 된다. 그런데, 소포체에서 골지체로 옮겨 가기 전에 한번 더 당단백질의 폴딩을 검증하는 품질 관리 과정이 있다. 적절한 폴딩이 이루어져 있지 않으면, 포도당 한 분자를 다시 Calnexin /Calreticulin Cycle에 들어가도록 해서 폴딩을 완성할 수 있는 기회를 주는 과정을 반복한다.
상기 기술된 소포체에서 이루어지는 N-당사슬의 초기 생합성 과정은 진핵 미생물인 효모에서 고등생물인 동물에 이르기까지 거의 동일한 과정으로 보존되어 있다. 그러나, 골지체로 넘어간 당사슬은 각 종에 특이적으로 다양한 당사슬 수식 과정을 거치게 되며, 그 결과로 효모, 곤충, 식물 및 동물 등에서 완전히 다른 형태의 당사슬들이 만들어 지게 된다. 그러나, 이렇게 다양한 당사슬들도 핵심 부위는 공통적으로 가지고 있는데, 세 개의 만노즈와 두 개의 GlcNAc이 아스파라긴의 질소에 연결된 구조로 Trimannosyl Core로 불린다. 이 Trimannosyl Core에 주로 만노즈가 연결된 형태를 고만노즈형 (high-mannose type)이라 부르며 효모와 곰팡이 등에서 많이 관찰된다. 전통 효모인 Saccharomyces cerevisiae의 경우에는 골지체에서 만노즈 부가가 계속되어 수십여 개의 만노즈가 부가된 형태가 관찰되기도 한다. 반면에 곤충세포에서는 결핍 만노즈형 (Pauci-mannose type)의 당사슬을 갖는 당단백질들이 관찰된다. 이들은 골지체에서 만노시다제 (Mannosidase IA, IB & IC)들에 의해서 먼저 Man5GlcNAc2 형태로 다듬어지고 여기에 N-Acetylglucosaminyltransferase (GNT) I이 작용해서 GlcNAc이 하나 부가된 후에 만노시다제 II가 작용해서 Trimannosyl Core에 GlcNAc이 하나 부가되어 있는 혼합형 구조가 만들어 진다. 그리고 나서야 부가되었던 GlcNAc이 다시 잘려 나가면서 결핍 만노즈형 당사슬 구조가 만들어지는 것이다. 동물세포는 아스파라진 잔기에 결합되어 있는 첫번째 GlcNAc에 α(1,6)-퓨코스 (Fucose)가 종종 부가된다. 동물에서는 Trimannosyl Core에 GlcNAc이 하나 부가되어 있는 구조에 GNT II가 작용해서 GlcNAc이 하나 더 부가되어서 두 개의 안테나 구조를 갖는 당사슬이 생성된다. 이 후에 GNT IV와 V가 작용해서 네 개의 안테나 구조가 만들어지기도 하며, 일부에서는 GNT VI, IX 또는 VB 등이 작용해서 6개의 안테나 구조까지 만들어지는 경우도 있다. GlcNAc이 부가되어 안테나의 골격이 만들어진 후에 골지체 내에 존재하는 β-Galactosyltransferase와 α-Sialyltransferase등이 작용해서 GlcNAc 위에 갈락토즈와 시알산이 부가된 형태의 복합형 당사슬 구조가 만들어 진다.
N-당화는 단백질의 접힘이나 활성 등에 상당한 영향을 미칠 수 있고, 유전공학 방법을 이용하여 자연계에 존재하는 단백질 혹은 그 변이체들을 산업적으로 이용하기 위하여 생산하는 경우 숙주세포의 종류, 재조합체의 조작 방법, 배양 조건에 따라 당질화 여부와 당사슬의 구조나 형태가 달라질 수 있는 가능성이 매우 크다 (Schilling, et al.,2002). 즉, 단백질의 생산과정 중 생산조건의 차이에 따라 당사슬 구조나 당사슬을 구성하는 당 성분들의 양적 차이 등이 발생한다. N-당화에 영향을 미치는 배양 조건에는 배양 배지의 Glucose 또는 Glutamine 농도 (Tachibana et al. 1994), Dissolved oxygen (DO) 농도 (Restelli et al. 2006), 배양액 pH (Borys et al. 1993), 배양액의 ammonia 농도 (Borys et al. 1994;), 배양 온도 (Clark et al. 2004) 등이 있다.
일반적으로 효소는 기질과 특이적으로 결합하여 효소-기질 복합체(enzyme-substrate complex)를 형성함으로써 반응의 활성화 에너지 (activation energy)를 낮추는 촉매 역할을 하여 효소의 반응을 촉진시킨다. 효소는 기질 및 기질과 경쟁하는 분자들을 식별할 수 있는데, 이는 효소의 기질 결합 위치에 상보적인 전하의 분포, 상보적인 구조, 친수성/소수성의 분포로 인하여 기질과 특이적으로 결합이 가능하게 한다. 효소의 결합 위치를 설명하기 위하여 효소와 기질이 서로 상보적이고 기하학적인 형태를 갖고 있어서 결합하기 쉽다고 하는 자물쇠-열쇠 모델이 제시되었지만, 이는 효소-기질 복합체의 전이 상태에 대한 설명이 어렵다. 이를 극복하기 위하여 제시된 유도 적합 모델은 효소 단백질의 유연한 구조를 통해 효소-기질 복합체에서 효소와 기질이 상호 작용을 계속 수행하면서 구조가 변화되는데, 이 과정에서는 활성 부위를 구성하는 아미노산 잔기나 N-당사슬에 의한 주변 전하의 분포, 친수성/소수성 분포에 의해 반응이 더욱 촉진될 수 있다.
더욱이 기질인 히알루론산을 가수분해하는 히알루로니다제 효소의 반응에 있어서 전하 상호 작용은 필수적인 요소이다. Arming 등은 히알루로니다제 PH20에서 음전하가 다량으로 분포되어 있는 기질인 히알루론산과 결합하기 위해서는 양전하를 갖고 있는 Arginine 잔기가 효소 활성에 필수적인 요소임을 밝혔다 (Arming et al. 1997). 따라서, N-당사슬의 전하 분포도 이러한 효소 활성에 영향을 끼친다고 유추할 수 있으며, 음전하가 많은 기질인 히알루론산과 히알루로니다제가 결합하는 경우, N-당사슬 중 음전하를 띠는 Sialic Acid Capping Sugars의 함량, 즉, Sialylation 함량이 효소-기질 결합체를 구성하거나 효소 반응의 진행에 영향을 미치는지를 입증하는 것이 중요하다. Sialylation 함량을 제한하기 위해서는 Galactose 잔기에 Sialic acid의 전달이 제한되거나, Desialylation되거나, Galactosylation 함량이 제한되어야 한다.
따라서, 재조합 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 생산성 및 활성은 N-당사슬의 함량 변화에 따라 영향을 받으므로, 이를 조절하고 유지하여 활성이 우수하고 생산성이 높은 산업적으로 유용하게 사용될 수 있는 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 생산 방법에 대한 연구는 효율적인 대규모 생산을 위하여 당업계에서는 요구되고 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 재조합 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체를 생산하는 숙주 세포의 배양 방법 및 이러한 방법으로 제조된 PH20 또는 이의 변이체를 제공하는 것으로, 특히 효소 활성 및 생산성이 향상된 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 생산방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 본 발명 명세서의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명에서는 재조합 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체를 생산하는 숙주세포를 특정한 배양 조건 하에서 배양할 경우, 생산된 재조합 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 N-당화 특성, 나아가 생산된 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 효소 활성이 현저하게 향상되는 것을 확인하였다.
구체적으로 N-당사슬 함량에서 Sialylation 함량, Galactosylation 함량 및/또는Mannosylation 함량, 특히 Sialylation 함량을 조절하여 활성을 높이는 것이 효과적이며, 이 함량을 조절하기 위해서는 배지 내의 Glucose 농도 및/또는 pH를 조절하거나, 배양 온도 변경 후 일정 기간 동안 배양함으로써 본 발명에서 목적하는 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 효소 활성 및 생산성을 현저하게 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
구체적으로 본 발명에 따른 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 생산 방법은,
(1) 재조합 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체를 발현하는 숙주 세포를 배양 온도 35℃ ~ 38℃에서 누적생존세포농도 (integral viable cell density)를 기준으로 20x106 ~ 120x106 cells x day/mL까지 되도록 배양하는 단계; 및
(2) 배양 온도를 28℃ ~ 34℃로 감소시킨 후 배양 온도를 유지하며 2 ~ 18일 동안
(a) 배지 내의 잔류 Glucose 농도를 배양 기간 동안 0.001 g/L ~ 4.5 g/L로 유지하는 배양; 및
(b) 배양액의 pH를 pH를 6.8 ~ 7.2로 유지하는 배양;
하는 방법으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 방법으로 배양하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 본 발명에 따른 생산방법으로 생산된 PH20 또는 이의 변이체는 N-당사슬 함량 중 Sialylation 함량이 1~38%이며, 효소 활성이 현저하게 증가된 것을 특징으로 하지만 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 수치는 10%의 오차 범위를 갖고 있는 실험치이다. 이는 배양 조건을 설정하는 경우에는 배양에 사용하는 기기 및 시험자의 업무 숙달 정도 등등의 조건에 따라 편차가 발생하므로, 본 발명에서 설정한 수치는 제한된 의미에서 보다는 편차를 고려하여 더 광범위한 의미에서 해석되어야 하기 때문이다.
상기 숙주 세포의 배양은 회분 배양법 (batch culture), 반복 회분 배양법 (repeated batch culture), 유가 배양법 (fed-batch culture), 반복 유가 배양법 (repeated fed-batch culture), 연속 배양법 (continuous culture) 및 관류 배양법 (perfusion culture)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의해 배양할 수 있다.
도 1은 천연형 인간 히알루로니다제 PH20 와 그 변이체에 대한 효소 활성, 등전점, N-당사슬 함량 분석 결과로,
도 1의 A는 천연형 인간 히알루로니다제 PH20과 그 변이체에 대한 효소 활성,
도 1의 B는 각 시료의 등전점 전기 영동 결과,
도 1의 C는 N-당사슬 함량을 나타낸다.
도 2는 히알루로니다제 PH20 변이체의 정제 분획에서의 효소 활성과 등전점 분석을 PNGase F 처리, Sialidase A 처리, Sialidase A + Galactosidase 처리를 하여 비교한 결과로,
도 2의 A는 각 시료의 등점점 전기 영동 결과,
도 2의 B는 효소 활성 결과,
도 2의 C는 N-당사슬 함량을 나타낸다.
도 3은 히알루로니다제 PH20 변이체를 생산하는 세포에 대한 N-acetyl-D-Mannosamine 또는 Galactose의 첨가 배양 조건에서의 세포 성장, 세포 생존율, pH, Lactate 농도의 변화를 분석한 결과로,
도 3의 A는 세포 성장,
도 3의 B는 세포 생존율,
도 3의 C는 pH의 변화,
도 3의 D는 Lactate 농도의 변화를 나타낸다.
도 4는 히알루로니다제 PH20 변이체를 생산하는 세포에 대한 N-acetyl-D-Mannosamine 또는 Galactose의 첨가 배양 조건에서 배양 회수액에 대한 활성을 분석한 그래프이다.
도 5는 히알루로니다제 PH20 변이체를 생산하는 세포에 대한 N-acetyl-D-Mannosamine 또는 Galactose의 첨가 배양에서 배양 회수액에 대한 등전점 전기영동 (isoelectric focusing)을 수행하여 분석한 결과이다.
도 6은 히알루로니다제 PH20 변이체를 생산하는 세포에 대한 N-acetyl-D-Mannosamine 또는 Galactose의 첨가 배양에서 배양 회수액에 N-당사슬 구조 분석을 수행하여 분석한 결과이다.
도 7은 히알루로니다제 PH20 변이체를 생산하는 세포에 대한 배양일에 따른 세포 성장 및 세포 생존율, 암모니아 농도 변화를 분석한 결과로,
도 7의 A는 세포 성장,
도 7의 B는 세포 생존율,
도 7의 C는 누적세포 농도,
도 7의 D는 암모니아 농도의 변화를 나타낸다.
도 8은 히알루로니다제 PH20 변이체를 생산하는 세포에 대한 배양일별 회수액에 대한 활성을 분석한 그래프이다.
도 9는 히알루로니다제 PH20 변이체를 생산하는 세포에 대한 배양일별 회수액에 대한 등전점 전기영동 (isoelectric focusing)을 수행하여 분석한 결과이다.
도 10은 히알루로니다제 PH20 변이체를 생산하는 세포에 대한 배양일별 회수액에 N-당사슬 구조 분석 및 활성 결과를 분석한 결과이다.
도 11은 히알루로니다제 PH20 변이체를 생산하는 세포에 대한 Glucose 농도 조건에서의 세포 성장, 세포 생존율, pH 변화, 삼투압 변화, Glucose 농도, Lactate 농도를 분석한 결과로,
도 11의 A는 세포 성장,
도 11의 B는 세포 생존율,
도 11의 C는 pH 변화,
도 11의 D는 삼투압 변화.
도 11의 E는 Glucose 농도의 변화.
도 11의 F는 Lactate 농도의 변화를 나타낸다.
도 12는 히알루로니다제 PH20 변이체를 생산하는 세포에 대한 Glucose 농도 조건에서의 활성을 분석한 그래프이다.
도 13은 히알루로니다제 PH20 변이체를 생산하는 세포에 대한 Glucose 농도 조건에서의 등전점 전기영동 (isoelectric focusing)을 수행하여 분석한 결과이다.
도 14는 히알루로니다제 PH20 변이체를 생산하는 세포에 대한 Glucose 농도 조건에서의 N-당사슬 구조 분석을 수행하여 분석한 결과이다.
도 15는 히알루로니다제 PH20 변이체를 생산하는 세포에 대한 pH 조건에서의 세포 성장, 세포 생존율, pH 변화, 누적세포농도 변화를 분석한 결과로,
도 15의 A는 세포 성장,
도 15의 B는 세포 생존율,
도 15의 C는 pH 변화,
도 15의 D는 누적세포농도 변화를 나타낸다.
도 16은 히알루로니다제 PH20 변이체를 생산하는 세포에 대한 pH 조건에서의 활성을 분석한 그래프이다.
도 17은 히알루로니다제 PH20 변이체를 생산하는 세포에 대한 pH 조건에서의 등전점 전기영동 (isoelectric focusing)을 수행하여 분석한 결과이다.
도 18은 히알루로니다제 PH20 변이체의 정제 과정에서 얻은 제 1차 음이온교환 수지 크로마토그래피에 의한 정제 크로마토그램이다
도 19는 히알루로니다제 PH20 변이체의 정제 과정에서 얻은 제 2차 음이온교환 수지 크로마토그래피에 의한 정제 크로마토그램이다
도 20은 히알루로니다제 PH20 변이체의 정제 과정에서 얻은 양이온교환 수지 크로마토그래피에 의한 정제 크로마토그램이다.
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 발명은 유전자 재조합 방법으로 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체를 산업적으로 유용하게 사용하기 위하여 생산함에 있어, N-당사슬 함량 중 Sialylation, Galactosylation 및/또는 Mannosylation 함량, 특히 Sialylation 함량이 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 효소 활성 및 생산성에 매우 중요하다는 사실을 확인하여 완성된 것이다.
구체적으로 PH20 또는 이의 변이체의 N-당사슬 함량 중 Sialylation 함량이 1~38%, 바람직하게는 1~30%, 더욱 바람직하게는 1.5~28%, 가장 바람직하게는 2~25%일 경우, 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 효소 활성 및 생산성이 예측하지 못할 높은 정도로 향상됨을 확인하였다.
보다 구체적으로, PH20 또는 이의 변이체의 N-당사슬 함량 중 Galactosylation 함량이 1~68%, Sialylation 함량이 1~38%, Mannosylation 함량이 40~63%, 바람직하게는 Galactosylation 함량이 5~60%, Sialylation 함량이 1~30%, Mannosylation 함량이 42~62%, 더욱 바람직하게는 Galactosylation 함량이 10~56%, Sialylation 함량이 1.5~28%, Mannosylation 함량이 44~61%, 가장 바람직하게는 Galactosylation 함량이 15~50%, Sialylation 함량이 2~25%, Mannosylation 함량이 47~60%일 경우 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 효소 활성 및 생산성이 예측하지 못할 높은 정도로 향상될 수 있다.
상기의 수치는 실시예 표 1의 실험 결과에서부터 도출된 수치로써 95% 신뢰 구간의 수치를 적용한 것이며, 이 수치도 10%의 오차를 포함할 수 있다. 이는 단백질의 당 함량을 측정하는 경우 실험에 사용하는 기기 및 효소 반응 시간, 시험 온도, 시험자의 업무 숙달 정도 등등의 조건에 따라 편차가 발생하므로, 본 발명에서 측정한 당 함량은 제한된 의미에서 보다는 실험실 간의 편차를 고려하여 더 광범위한 의미에서 해석되어야 하기 때문이다.
본 발명에 있어, N-당사슬 함량 중 Galactosylation % 함량은 N-당사슬 중 G1, G1F, G1F', G2, G2F, A1, A1F, A2, A2F 등 말단에 갈락토스를 포함한 것의 % 함량을 합산한 것이고, Sialylation % 함량은 N-당사슬 중 A1, A1F, A2, A2F 등 말단에 시알산을 포함한 것의 % 함량을 합산한 것이며, Mannosylation % 함량은 N-당사슬 중 M4G0F, M5, M5G0, M6, M7, M8, M9 등 말단에 만노스를 포함한 것의 % 함량을 합산한 것이다.
구체적으로, 본 발명에 따른 N-당사슬 함량 중 Sialylation 함량이 1~38%인 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 생산방법은,
(1) 재조합 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체를 발현하는 숙주 세포를 배양 온도 35℃ ~ 38℃에서 누적생존세포농도 (integral viable cell density)를 기준으로 20x106 ~ 120x106 cells x day/mL까지 되도록 배양하는 단계; 및
(2) 배양 온도를 28℃ ~ 34℃로 감소시킨 후 배양 온도를 유지하며 2 ~ 18일 동안
(a) 배지 내의 잔류 Glucose 농도를 배양 기간 동안 0.001 g/L ~ 4.5 g/L로 유지하는 배양; 및
(b) 배양액의 pH를 pH를 6.8 ~ 7.2로 유지하는 배양;
하는 방법으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 방법으로 배양하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 수치는 10%의 오차 범위를 갖고 있는 실험치이다. 이는 배양 조건을 설정하는 경우에는 배양에 사용하는 기기 및 시험자의 업무 숙달 정도 등등의 조건에 따라 편차가 발생하므로, 본 발명에서 설정한 수치는 제한된 의미에서 보다는 편차를 고려하여 더 광범위한 의미에서 해석되어야 하기 때문이다.
상기 (1) 단계에서 (2) 단계로의 배양 온도 감소는 누적생존세포농도 (integral viable cell density)를 기준으로 20x106 ~ 120x106 cells x day/mL, 바람직하게는 40x106 ~ 100x106 cells x day/mL, 더욱 바람직하게는 60x106 ~ 80x106 cells x day/mL 일 경우에 이루어질 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 (2) 단계에서의 배양 기간은 2 ~ 18일, 바람직하게는 3 ~ 16일, 더욱 바람직하게는 4 ~ 14일 배양할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
예시적으로 본 발명에 따른 PH20 또는 이의 변이체의 생산에서 유가 배양법을 사용하는 경우에 있어, 본배양 직전 종배양에서 관류 배양법 또는 유가 배양법으로 일정 농도의 세포에 도달할 때까지 35℃ ~ 38℃에서 배양한 이후 본배양으로 접종하여 35℃ 미만으로 감소시킨 후 2 ~ 18일, 바람직하게는 3 ~ 16일, 더욱 바람직하게는 4 ~ 14일 배양함으로써 PH20 또는 이의 변이체의 생산성을 극대화시킬 수 있을 뿐 아니라 생산된 PH20 또는 이의 변이체의 효소 활성도 현저하게 증가시킬 수 있다.
상기 본배양 세포접종 농도는 1x105 cells/mL 이상, 바람직하게는 5x105 cells/mL 이상, 더욱 바람직하게는 1x106 cells/mL 이상일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 PH20 또는 이의 변이체의 생산에서 유가 배양법과 관류 배양법을 혼용하여 사용하는 경우에 있어 배양함으로써 PH20 또는 이의 변이체의 생산성을 극대화시킬 수 있을 뿐 아니라 생산된 PH20 또는 이의 변이체의 효소 활성도 현저하게 증가시킬 수 있다.
본 발명에 있어, 상기 배지 내의 잔류 Glucose 농도는 0.001 g/L ~ 4.5 g/L, 바람직하게는 0.01 ~ 4.0 g/L, 더욱 바람직하게는 0.1 ~ 3.5 g/L로 유지하면서 배양할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어, 상기 “배지 내의 잔류 Glucose 농도를 0.001 g/L ~ 4.5 g/L, 바람직하게는 0.01 ~ 4.0 g/L, 더욱 바람직하게는 0.1 ~ 3.5 g/L로 유지하면서 배양”한다는 의미는 배양 기간 동안 배지 내의 잔류 Glucose의 농도를 매 1 ~ 36 시간, 바람직하게는 매 3 ~ 30 시간, 더욱 바람직하게는 매 6 ~ 24 시간으로 간격, 또는 실시간으로 측정하여 배지 내의 잔류 Glucose 농도가 0.001 g/L ~ 4.5 g/L, 바람직하게는 0.01 ~ 4.0 g/L, 더욱 바람직하게는 0.1 ~ 3.5 g/L 내에서 설정된 기준 농도 이하일 경우 해당 기준 농도가 되도록 배지에 Glucose 용액(glucose stock solution)을 첨가하여 배양하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어, 상기 배지 내의 잔류 Glucose 농도의 기준 농도는 0.001 g/L ~ 4.5 g/L, 바람직하게는 0.01 ~ 4.0 g/L, 더욱 바람직하게는 0.1 ~ 3.5 g/L 범위 내에서 설정될 수 있으며, 배양 기간 동안 적절히 그 기준 농도가 변화될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다. 예를 들어 초기 1~2일째에는 배지 내의 잔류 Glucose 농도의 기준 농도를 2 g/L로 하여 배양하다가, 3~5일째에는 기준 농도를 1.5 g/L로 낮추어 배양하고, 이후에는 다시 기준 농도를 2 g/L로 하여 배양할 수도 있고, 1.5 g/L 보다 낮은 농도, 즉 1.0 g/L로 기준 농도를 설정하여 배양할 수도 있다.
본 발명에 따른 방법에 의해 생산되고 N-당사슬 함량에서의 특정한 Sialylation 함량 및/또는 Galactosylation 함량과 Mannosylation 함량을 갖는 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체는 히알루로니다제 효소의 배양액에서의 활성이 10,000 unit/mL, 바람직하게는 11,000 unit/mL 이상, 더욱 바람직하게는 12,000 unit/mL 이상인 것을 특징으로 하지만, 이에 제한되는 것은 아니며,
또한 본 발명에 따른 방법에 의해 생산되고 N-당사슬 함량에서의 특정한 Sialylation 함량 및/또는 Galactosylation 함량과 Mannosylation 함량을 갖는 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체는 통상적인 방법에 의해 생산된 천연형 인간 PH20의 활성보다 10% 이상, 바람직하게는 12% 이상, 더욱 바람직하게는 15% 이상 효소 활성이 증가된 것을 특징으로 할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는 본 발명에 따른 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 생산방법에 있어, 상기 (1) 단계 및/또는 (2) 단계에서의 숙주세포의 배양은
(i) 배지 내에 암모니아를 첨가하거나 배지 내의 암모니아 농도를 5mM 이상으로 증가시키는 조건;
(ii) Glutamine, Glucosamine, Uridine, Glucosamine 및 Sodium Butyrate로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질을 배지에 첨가하는 조건; 및
(iii) Galactose 및 ManNAc을 첨가하지 않는 조건;
으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 조건 하에서 수행될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
보다 구체적으로는 본 발명에 따른 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 생산방법에 있어, 상기 (1) 단계 및/또는 (2) 단계에서의 숙주세포의 배양은 상기 배지 내에 암모니아를 첨가하거나 배지 내의 암모니아 농도를 5mM 이상으로 증가시키는 배양, Glutamine 첨가하는 배양, Galactose 및 ManNAc을 첨가하지 않는 배양, Uridine 또는 Glucosamine을 첨가하는 배양, Sodium Butyrate을 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체는 세포외 기질 (extracellular matrix)에 위치한 히알루론산을 분해하는 효소를 의미한다.
본 발명에 따른 “히알루로니다제 PH20” 또는 “PH20”은 천연형 PH20과 이의 성숙된 형태를 모두 포함하는 의미로 해석되며, “히알루로니다제 PH20” 또는 “PH20”의 “변이체”는 “히알루로니다제 PH20” 또는 “PH20”의 아미노산 서열에 있어, 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 결실 및 삽입을 포함하고, 선택적으로 N-말단 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기의 일부가 결실된 PH20 변이체를 의미하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 히알루로니다제는 동물 및 스테렙토마이세스 등의 미생물 유래의 것으로서, 히알루로니다제 활성을 가지는 모든 것을 의미하며, 이 중 “히알루로니다제 PH20” 또는 “PH20”은 동물 및 스테렙토마이세스 등의 미생물 유래의 것으로서, 바람직하게는 인간, 소 또는 양 유래의 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 인간 유래의 “히알루로니다제 PH20” 또는 “PH20 변이체”는 국제공개특허 제2020/022791호 및 미국 등록특허 제9,447,401호 등에 기재된 것들이 예시될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며, “히알루로니다제 PH20” 또는 “PH20”의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 결실 및 삽입을 포함하고, 선택적으로 N-말단 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기의 일부가 결실된 것으로서 히알루로니다제의 효소 활성을 가진 것이라면 모두 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명에서 히알루로니다제 단백질의 발현에 사용하는 숙주 세포로는 동물 세포(animal cell), 효모(yeast), 방선균(Actinomycetes) 및 곤충 세포(insect cell), 등이 사용될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
동물 세포는 포유 동물 세포가 바람직하다. 더욱 바람직하게는 CHO 세포, HEK 세포, COS 세포, 3T3 세포, 미엘로마 세포, BHK 세포, HeLa 세포, Vero 세포 등 일반적으로 사용되고 있는 동물 배양 세포를 사용하고, 대량 발현을 목적으로 하는 경우에는 특히 CHO 세포가 바람직하다. 또한, 원하는 단백질을 제조하기 위해서는, 특히, DHFR 유전자를 결손한 CHO 세포인 dhfr- CHO 세포 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220)나 CHO K-1 세포 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275) 등 원하는 유전자를 도입하는 데에 적합한 세포인 것이 바람직하다. 상기 CHO 세포로는 특히, DG44 주, DXB-11 주, K-1 주 또는 CHO-S 주가 바람직하고, 숙주 세포로의 벡터의 도입은 인산칼슘법, DEAE 덱스트란법, 일렉트로 포레이션법, 리포펙션 등의 방법으로 실시하는 것이 가능하다.
효모로는 사카로마이세스(Sacchromyces sp.), 한세눌라(Hansenula sp.), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 및 피키아(Pichia sp.) 등이 예시될 수 있으며, 방선균으로는 스테렙토마이세스(Streptomyces) 등이 예시될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 생산방법에 있어, 상기 (1) 단계 및/또는 (2) 단계에서의 숙주세포의 배양은 회분 배양법 (batch culture), 반복 회분 배양법 (repeated batch culture), 유가 배양법 (fed-batch culture), 반복 유가 배양법 (repeated fed-batch culture), 연속 배양법 (continuous culture) 및 관류 배양법 (perfusion culture)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의해 이루어질 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
회분 배양법은 배양 중에 새롭게 배지를 추가하거나 또는 배양액을 배출하거나 하지 않고, 세포를 증식시키는 배양 방법이다. 연속 배양법은 배양 중에 연속적으로 배지를 추가하고, 또한 연속적으로 배출시키는 배양 방법이다. 또, 연속 배양법에는 관류 배양 (perfusion culture)도 포함된다. 유가 배양법은 회분 배양법과 연속 배양법의 중간에 해당되므로, 반(半) 회분 배양법 (semi-batch culture) 이라고도 불리고, 배양 중에 연속적으로 또는 축차적으로 배지가 추가되는데, 연속 배양법과 같은 연속적인 배양액의 배출이 실시되나 세포의 유출이 되지 않는 배양 방법이다. 본 발명에서 어느 배양 방법을 사용해도 되는데, 바람직하게는, 유가 배양법 또는 연속 배양법이 사용되고, 특히 바람직하게는, 유가 배양법이 사용된다.
앞에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 생산방법에 의해 생산된 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체는 효소의 비활성이 일반적인 방법에 의해 생산된 것에 비해 10% 이상 증가될 수 있으며, 특히 천연형 인간 PH20의 활성보다 10% 이상 향상된 것을 특징으로 한다. 이러한 효소 활성의 증가는 본 발명에 따른 생산방법에 의해 생산된 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 N-당화 특성 변화 및/또는 전하 변형에 따른 것이다.
특히 N-당화 중 Sialylation 함량 및/또는 Galactosylation 함량과 Mannosylation 함량의 변화에 따라 효소 활성이 증가하는데, 본 발명에 따른 생산방법에 의해 이러한 N-당화 특성, 특히 Sialylation 함량 및/또는 Galactosylation 함량과 Mannosylation 함량이 조절될 수 있다.
본 발명에서 당과 단백질의 공유결합은 단백질을 구성하는 아스파라긴 잔기에 N-아세틸-D-글루코사민이 공유결합된 N-글리코시드 결합(N-글리코시드 결합 당쇄), 세린 또는 트레오닌 잔기에 N-아세틸-D-갈락토사민이 공유결합된 O-글리코시드 결합(O-글리코시드 결합 당쇄) 등이 있지만, 본 발명의 당단백질에 있어서의 당과 단백질과 공유결합의 양식에 특별한 한정은 없고, N-글리코시드 결합 당쇄와 O-글리코시드 결합 당쇄 중 어느 한쪽 및 양쪽을 갖는 당단백질도 본 발명의 당단백질에 포함된다.
이러한 관점에서 본 발명은 N-당사슬 함량 중 Sialylation 함량이 1~38%, 바람직하게는 1~30%, 더욱 바람직하게는 1.5~28%, 가장 바람직하게는 2~25%인 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체에 대한 것이다.
보다 구체적으로는 N-당사슬 함량 중 Galactosylation 함량이 1~68%, Sialylation 함량이 1~38%, Mannosylation 함량이 40~63%, 바람직하게는 Galactosylation 함량이 5~60%, Sialylation 함량이 1~30%, Mannosylation 함량이 42~62%, 더욱 바람직하게는 Galactosylation 함량이 10~56%, Sialylation 함량이 1.5~28%, Mannosylation 함량이 44~61%, 가장 바람직하게는 Galactosylation 함량이 15~50%, Sialylation 함량이 2~25%, Mannosylation 함량이 47~60%인 것을 특징으로 하는 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체에 대한 것이다.
상기의 수치는 실시예 표 1의 실험 결과에서부터 도출된 수치로써 95% 신뢰 구간의 수치를 적용한 것이며, 이 수치도 10%의 오차를 포함할 수 있다. 왜냐하면, 단백질의 당 함량을 측정하는 경우 실험에 사용하는 기기 및 효소 반응 시간, 시험 온도, 시험자의 업무 숙달 정도 등등의 조건에 따라 편차가 발생하므로, 본 발명에서 측정한 당 함량은 제한된 의미에서 보다는 실험실 간의 편차를 고려하여 더 광범위한 의미에서 해석되어야 하기 때문이다. 또한 상기 PH20 또는 이의 변이체의 전하 변형체는 등전점 전기영동 (isoelectric focusing)을 통해 확인될 수 있다.
본 발명에 따른 N-당사슬 함량 중 특정한 Sialylation 함량 및/또는 Galactosylation 함량과 Mannosylation 함량을 갖는 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체는 본 발명에 따른 생산방법에 의해 생산된 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 통상의 기술자의 상식에 비추어 변형 가능한 다른 방법에 의해 생산될 수 있음은 당연한 것이다.
본 발명에 있어서, 세포를 배양하여 당단백질을 발현시키기 위해 이용한 배지는 무혈청 배지가 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니며, DMEM/F12 배지 (DMEM과 F12의 혼합 배지)를 기본 배지로서 사용할 수 있다. 또한, 상업적으로 이용가능한무혈청 배지, 예를 들면, HycellCHO 배지, ActiPro 배지 (이상 Hyclone사, 미국), CD OptiCHOTM 배지, CHO-S-SFM II 배지 또는 CD CHO 배지 (이상 Gibco사, 미국), IS CHO-VTM 배지(Irvine Scientific사, 미국), EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch Medium (Sigma-Aldrich사, 미국) 등을 기본 배지로서 사용할 수도 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 세포를 배양하여 당단백질을 발현시키기 위해 이용한 피드 배지는 무혈청 배지로서, 예를 들면, Cell BoostTM 1, Cell BoostTM 2, Cell BoostTM 3, Cell BoostTM 4, Cell BoostTM 5, Cell BoostTM 6, Cell BoostTM 7a/7b (이상 Hyclone사, 미국), CD CHO EfficientFeedTM A AGTTM, CD CHO EfficientFeedTM B AGTTM, CD CHO EfficientFeedTM C AGTTM, CD CHO EfficientFeedTM A plus AGTTM, CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM, CD CHO EfficientFeedTM C plus AGTTM(이상 Gibco사, 미국), BalanCD® CHO Feed 4(Irvine Scientific사, 미국), EX-CELL® Advanced CHO Feed(Sigma-Aldrich사, 미국), CHO-U Feed Mix U1B7/ CHO-U Feed Mix U2B13 (Kerry사, 미국) 등을 피드 배지로서 사용할 수도 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 "피드 배지" 및 "농축 영양물 배지" 란 용어는 아미노산, 비타민, 염, 미량 원소, 지질 및 포도당 등의 특정 영양소 또는 복수의 영양소로 구성된 배지로서 기본 배지의 농축 산물일 수 있으며, 배양하는 세포에 따라 피드 배지의 구성 성분과 농도를 다양하게 제작하여 사용할 수 있다. 또한, 상업적으로 이용할 수 있는 피드 배지, 예를 들면, Cell Boost Series supplement 배지 (Hyclone사, 미국), EfficientFeed Supplement 배지, GlycanTune 피드 배지 (이상 Gibco사, 미국), BalanCD CHO 피드 배지 (Irvine Scientific사, 미국), Cellvento®CHO Cell Culture 피드 배지 (Merck사, 미국), EX-CELL®Advanced CHO 피드 배지 (Sigma-Aldrich사, 미국)등을 피드 배지로서 사용할 수도 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 식물 유래의 가수분해물은 동물 유래성분은 함유하지 않으면서, 가든피, 목화씨, 또는 밀글루텐, 대두 등에서 추출된 산물을 말하며, 아미노산, 펩타이드, 비타민, 탄수화물, 뉴클레오티드, 미네랄, 기타 성분이 풍부하게 함유되어 있는 보충제로서 이 또한, 배양하는 세포에 따라 식물 유래 가수분해물의 구성 성분과 성분 농도를 다양하게 제작하여 사용 가능하다. 또한, 상업적으로 이용가능한 식물 유래 가수분해물, 예를 들면, Hy-Pea™ 7404, UltraPep™ Cotton, HyPep™ 7504, HyPep™ 4601N (이상 Kerry사, 미국), Cotton 100, Cotton 200, Phytone™, Soy 100 (이상 Gibco사, 미국) 등을 보충제로서 사용할 수도 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 당 단백질의 N-당사슬 함량을 증가 또는 감소시키기 위해 사용한 첨가물은 일반적으로 단백질 당화를 관여한다고 알려져 있는 성분을 말한다. 특히, Sialylation 함량을 제한하기 위해서는 Galactose 잔기에 Sialic acid의 전달이 제한되거나, Desialylation되거나, Galactosylation 함량이 제한되어야 하는데 이러한 첨가물로는 세포를 배양할 때에 배지에 소정 농도의 N-아세틸-D-만노사민, Glucose, Mannose, Glutamine 및 Galactose, 암모니아, 부티르산 등의 당화 전구체가 되는 구성 성분 등이 있다.
대부분의 동물세포 배양에서는 주로 혈청이 포함된 배지를 사용하고 있지만 혈청이 포함된 배지는 화학적으로 성분이 명확하지 않은 복합 구성물이므로 단백질의 생산에 적합한 배지를 설계하는데 어려움이 따른다. 혈청을 사용할 때는 비용이나 재현성 확보의 문제뿐만 아니라 분리 및 정제에도 부정적인 영향을 줄 수 있기 때문에 무혈청 배지나 저혈청 배지를 주로 사용한다. 무혈청 배지에서는 탄소원인 Glucose 농도가 현저히 낮기 때문에 세포의 성장을 유지하고 높은 농도의 목적 단백질을 생산하기 위해서는 배지에 추가적으로 주 탄소원인 Glucose를 첨가하여 배양하며, 추가적으로 Glutamine을 첨가하여 배양할 수도 있다. 특히, 단백질 의약품 생산에서는 체내 반감기를 증가시키기 위해서 Sialylation 함량을 증가하기 위하여 배지 내 Glucose 및 Glutamine을 고갈시키지 않고 일정 농도 이상으로 유지하여야 하며, 배양액의 pH도 특정한 값을 유지하여야 한다. 배양액에서 측정된 Glucose 및 Glutamine 농도는 세포가 사용하고 남아 있는 각각의 잔류 농도를 의미한다. 또한 Sialylation 함량을 증가시키는데 관련된 효소들의 활성 촉진제나 Desialylation을 억제하는 억제제를 사용하기도 한다. 또한, N-당사슬의 전구체를 첨가하거나 관련된 효소의 활성 촉진제나 배양 조건을 조절하여 Galactosylation 함량을 증가시켜 Sialylation 함량을 증가시키기도 한다.
하지만 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 생산에서는 위와 같은 방법으로는 N-당사슬 함량을 조절할 수가 없지만, 본 발명에 따른 생산방법에 따라 생산할 경우에는 목적하는 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 N-당사슬 함량 특성 및 이에 따른 높은 효소 활성을 갖는 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 생산이 가능하다.
본 발명에 따른 생산방법은 추가적으로 생산된 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 분리 정제 단계가 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 분리 정제는 친화력 결합 특성을 이용하지 않고, 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 이온결합 특성 및/또는 소수성 상호작용 특성을 이용하여 분리 정제되는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 본 발명에 따른 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 분리 정제는 친화크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용하지 않고, 양이온교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography) 및/또는 음이온교환크로마토그래피(anion exchange chromatography) 등의 이온교환크로마토그래피(ion exchange chromatography)와 소수성작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography)를 이용하여 수행될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 분리 정제 단계는 효소 활성이 낮은 산성을 띠는 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체가 제거되는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 상기 산성을 띠는 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체의 제거는 이온교환크로마토그래피를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 한다.
효소의 산업적 이용 가능성을 확인하기 위하여서는 효소의 촉매 반응 속도에 대한 분석이 필요하다. 효소 반응은 고정된 반응성의 활성 부위를 갖는 효소 반응과 다양한 반응성을 가진 여러 활성 부위를 갖는 효소 반응으로 나뉠 수 있다. 히알루로니다제와 같이 고정된 반응성의 단일 활성 부위를 갖는 효소의 촉매 반응의 속도는 Michaelis-Menten의 속도 공식에 따르는 것으로 알려져 있다.
Michaelis-Menten의 효소 반응 속도론은 다음의 식과 같이 효소(E) - 기질(S)의 복합체[ES] 형성단계에서의 가역 반응 단계와 ES 복합체의 해리로 인한 생성물(P)가 생성되는 비가역 반응 단계의 2단계 반응체계로 효소 반응을 가정하는 것을 전제로 한다. 이 경우, kf, kr, kcat은 각 방향으로의 반응의 속도 상수이다 (Alan Fersht (1977) Enzyme structure and mechanism).
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효소 반응은 효소와 기질이 반응하여 ES 복합체를 형성하는 과정이 빠르게 평형 상태로 도달한다고 가정하거나, 충분히 높은 기질 농도를 유지하는 반응을 수행하여 효소의 농도를 충분히 낮게 하여 d[ES]/dt≒0이라 가정할 수 있는 유사 정상상태라고 할 수 있다. 빠른 평형을 가정하거나 유사 정상상태를 가정하는 속도식은 모두 동일하게 유도되기 때문에, 대부분의 실험은 초기에 효소농도에 비해 높은 기질농도를 유지하는 유사 정상상태로 가정한다.
이와 같은 가정하에서 “효소의 양은 반응 전후에 일정하다.”와 “”화학 반응에서 화학 평형점에 도달할 경우, 생성물이 만들어지는 반응속도와 이 물질이 다시 분해되는 속도는 같다.”라는 조건을 이용하면, 최종 생성물의 반응 속도는 다음과 같은 Michaelis-Menten 속도 공식으로 표현할 수 있다. 이 때, K M = (k r + k cat) / k f 이며, Vmax = k cat [E]0이다.
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이와 같은 Michaelis-Menten 속도 공식을 이용하여 효소 반응속도의 분석을 실험적으로 수행하기 위하여서 Lineweaver-Burk 방정식을 이용한다. 이 방정식은 실험에서 주어진 기질 농도의 역수 1/[S]에 대해 실험적으로 측정한 반응속도의 역수 1/V의 값과의 관계를 보여주는 방정식이다. 이 방정식이 1차 방정식임을 통계적으로 확인하게 되면, 효소 반응이 Michaelis-Menten의 속도 공식에 따르는 반응임을 확인할 수 있으며, 이 방정식을 이용하여 K M 과 Vmax 를 구할 수 있다.
효소는 화학 반응을 촉매하는데 있어, 활성 부위에서 기질과 결합한 후 전이 상태를 갖게 되는데, 높은 에너지를 갖는 전이 상태로 도달하기 위한 활성화 에너지는 기질과의 여러 결합을 통하여 낮아지게 된다. 이러한 전이 상태로 도달하기 위한 평형 상수는 k cat / K M 에 비례하게 된다. 여기서 1 / K M 은 효소와 기질이 결합하여 효소-기질 복합체를 만드는 정도와 효소-기질 복합체가 분해되지 않고 유지되는 정도를 합친 지표이고, k cat 은 효소-기질 복합체가 생성물을 만들어지는 평형 상수이므로 k cat / K M 은 기질과 효소로부터 얼마만큼의 생산물을 얻어낼 수 있는지에 대한 지표, 즉 효소의 촉매 효율을 나타내는 것이라 할 수 있다.
히알루로니다제의 산업적 이용 가능성은 효소 촉매 효율과 비례한다. 특히, 단클론 항체와 같은 고분자 약리 활성 물질과 함께 피하로 주사하는 경우에는 히알루로니다제의 효소 촉매 효율이 중요한 역할을 한다. 본 발명에 따른 변이체가 천연형 PH20보다 k cat / K M 이 높은 경우에는 고분자 약리 활성 물질에 포함된 히알루로니다제가 피하로 투여될 때, 피하 내에 존재하는 히알루론산을 더 빠르게 분해함으로 약리 활성 물질이 빨리 분산될 수 있게 하는 우월한 효과를 준다. 또한 본 발명에 따른 변이체가 야생형 PH20보다 k cat 이 큰 경우에는 동일한 효소 농도에서는 최대 반응 속도인 Vmax가 증가하여 동일한 시간에 더 많은 양의 히알루론산을 분해하게 되어 보다 넓은 범위에 약리 활성 물질을 분산시킬 수 있게 하는 우월한 효과를 준다.
따라서, 본 발명에 따른 PH20변이체의 효소학적 특성을 확인하기 위하여 각 변이체의 효소 반응 속도를 분석하고 이의 K M (50% Vmax 조건에서 기질 농도), k cat (기질 전환율), k cat / K M (효소 촉매 효율) 결과를 실시예 4에서 비교하였다. 이 결과를 보면, 야생형 PH20 대비하여 본 발명에 따른 PH20 변이체의 우월성을 입증할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하고자 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 히알루로니다제의 활성과 N-당사슬, 등전점과의 관계
천연형 인간 히알루로니다제 PH20과 그의 변이체 HM46에 대해서 활성과 등전점, N-당사슬 함량 분석을 한 결과를 도 1에 제시하였다. 두 히알루로니다제의 활성 단위의 차이가 2배 이상이지만, 등전점 범위와 N-당사슬 함량은 크게 다르지 않았다.
히알루로니다제 PH20에서의 N-당사슬 함량과 등전점, 활성과의 관계에 대해서 확인하는 실험을 진행하였다. 히알루로니다제 PH20 변이체를 정제하는 과정에서 염기성 분획(Fraction 1)과 산성 분획(Fraction 2)를 분리할 수 있었고, 이 각 분획을 시료로 하여 PNGase F로 처리하여 N-당사슬을 모두 제거한 시료와 Sialidae A로 처리하여 말단의 시알산을 제거한 시료, Sialidae A와 Galactosidase를 처리하여 말단의 시알산과 갈락토오즈를 제거한 시료에 대해서 등전점과 효소 활성을 분석한 결과를 도 2에 제시하였다. 두 분획은 등전점의 범위에 차이가 있었으며, 산성 분획에서 효소 활성이 감소하는 결과를 나타내었다. PNGase F 처리시에는 두 분획 모두 활성이 없어졌으며, 등전점의 범위는 유사한 범위를 가지게 되었다. 이러한 결과를 통해 N-당사슬의 함량이 효소 활성과 밀접한 관계가 있음을 알 수 있었다. 더욱이, 말단의 시알산을 제거하는 경우에는 산성 분획의 등전점 범위나 효소 활성이 염기성 분획의 것과 유사해지는 현상을 통해 말단의 시알산 함량과 효소 활성의 관련은 있음을 알 수 있었다. 하지만, 말단의 시알산 함량이 낮은 염기성 분획이 시알산 함량이 높은 산성 분획보다 히알루로니다제의 효소 활성이 증가한 결과를 나타내었다.
이러한 효소 활성과 N-당사슬 함량과의 관계는 배양을 위한 Cell source를 다르게 한 천연형이나 다양한 변이체에서의 조사 결과 (표 1)에 의해 관련성을 더 알 수 있었다.
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표 1에서와 같이 다양한 히알루로니다제 PH20 및 변이체 단백질을 제조하고 N-당사슬 함량을 조사하였다. 이를 위하여 재조합 유전자를 ExpiFectamine CHO Reagent (Gibco사, 미국)를 이용하여 ExpiCHO cell에 배양시마다 형질 주입하여 생산하는 임시발현 배양, 재조합 유전자를 이용하여 제조한 세포주 클론을 이용한 세포주 클론 배양과 생산성이 높은 단일 클론을 선별하여 이를 이용한 세포주 배양 등의 다양한 Cell Source를 사용한 배양을 진행하였다. 여기서, 세포주 클론 배양이란 재조합 유전자를 Transfection한 동물 세포의 클론에서 Selective Marker를 사용하여 선별한 생산성이 높은 세포주 클론을 이용한 배양을 말하며, 이는 다클론 세포주이며 단일 클론 세포주를 생산하기 위하여 제작하는 것이다. 세포주는 연구용 세포주 (RCB), 생산용 마스터 세포주 (MCB), 생산용 세포주 (WCB)로 구성되어 있다. 또한, 배양 방법에도 생산의 최적화를 위하여 다양한 조합의 시험 배양을 시도하였고, 이 경우에도 활성과 N-당사슬함량에 대하여 차이가 발생하였다는 것을 발견하였다.
세포주클론시험배양#1은 HycellCHO 배지(Hyclone사, 미국)를 사용하여 2 L 규모에서 배양 온도 변경 없이 37℃로 회분 배양한 조건이다. 세포주클론시험배양#2 정제분획#1과 세포주클론시험배양#2 정제분획#2는 8 L 규모에서 EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch 배지(Sigma-Aldrich사, 미국)에 Cotton 100UF(Gibco사, 미국)를 첨가한 후 BalanCD®CHO Feed 4(Irvine Scientific사, 미국)를 첨가하는 유가 배양 방법으로 온도 변경 없이 37℃로 배양한 배양액을 대상으로 Anion Exchange Chromatography 정제 분획을 구분한 것으로 정제 분획#1은 Low Salt Elution 분획이며, 정제 분획#2는 High Salt Elution 분획이고, 세포주 시험배양#1은 2 L 규모에서 EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch 배지(Sigma-Aldrich사, 미국)에 Cotton 100UF(Gibco사, 미국)를 첨가한 후 BalanCD®CHO Feed 4(Irvine Scientific사, 미국)를 첨가하는 유가 배양 방법으로 배양 온도 37℃에서 배양하여 일정 누적세포농도에 도달할 때 32℃로 변경한 조건이다. 세포주시험배양#2은 10 L 규모에서 EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch 배지(Sigma-Aldrich사, 미국)에 Cotton 200UF(Gibco사, 미국)를 첨가한 후 CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM(Gibco사, 미국)을 첨가하는 유가 배양 방법으로 배양 온도 37℃에서 배양하여 일정 누적세포농도에 도달할 때 32℃로 변경하고 12일 배양한 조건이다. 세포주시험배양#3은 50 L 규모에서 EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch 배지(Sigma-Aldrich사, 미국)에 Cotton 200UF(Gibco사, 미국)를 첨가한 후 CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM(Gibco사, 미국)을 첨가하는 유가 배양 방법으로 배양 온도 37℃에서 배양하여 일정 누적세포농도에 도달할 때 2℃로 변경한 조건이고, 세포주시험배양#4는 10 L 규모에서 EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch 배지(Sigma-Aldrich사, 미국)에 Cotton 200UF(Gibco사, 미국)를 첨가한 후 CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM(Gibco사, 미국)을 첨가하는 유가 배양 방법으로 배양 온도 37℃에서 배양하여 일정 누적세포농도에 도달할 때 32℃로 변경하고 13일 배양한 조건이다. 세포주배양#1, 세포주배양#2, 세포주배양#3, 세포주배양#4는 각각 연구용 세포주 (RCB), 생산용 마스터 세포주 (MCB), 생산용 세포주 (WCB)를 대상으로 200 L 규모에서 EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch 배지(Sigma-Aldrich사, 미국)에 Cotton 200UF(Gibco사, 미국)를 첨가한 후 CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM(Gibco사, 미국)을 첨가하는 유가 배양 방법으로 배양 온도 37℃에서 배양하여 일정 누적세포농도에 도달할 때 32℃로 변경하고 12일 배양한 조건이다. 이러한 내용을 바탕으로 실시예 2~5의 배양 조건에 대한 실험을 진행하여 N-당사슬 함량을 유지하는 배양 방법을 확립하였다.
표1의 천연형 인간 히알루로니다제 PH20 및 변이체, 그리고, 포유동물의 히알루로니다제 PH20의 N-당사슬 함량은 Galactosylation: 15~50%, Sialylation: 2.5~28%, Mannosylation: 47~60%의 범위를 갖고 있으며, 시험 결과들의 95% 신뢰 구간을 적용하면, Galactosylation: 1~68%, Sialylation 함량: 1~38%, Mannosylation: 40~63%의 범위를 가져야 산업적으로 유용한 히알루로니다제의 활성을 가질 수 있음을 알 수 있었다. 산업적으로 유용한 히알루로니다제의 활성은 천연형 인간 PH20의 활성의 50% 이상을 의미한다. 상기의 수치는 10%의 오차를 포함할 수 있다. 왜냐하면, 단백질의 당 함량을 측정하는 경우 실험에 사용하는 기기 및 효소 반응 시간, 시험 온도, 시험자의 업무 숙달 정도 등등의 조건에 따라 실험실 마다 편차가 발생하므로, 본 발명에서 측정한 당 함량은 제한된 의미에서 보다는 실험실 간의 편차를 고려하여 더 광범위한 의미에서 해석되어야 하기 때문이다.
그리고, 특히, 활성과 Sialylation의 관계를 살펴보면, Sialylation은 약 30% 이하로 제한되어야 천연형 인간 PH20의 활성 이상으로 산업적인 효율이 높은 히알루로니다제를 생산할 수 있음을 알 수 있다. 상기의 수치는 실험 결과에서부터 도출된 수치로써 10%의 오차를 포함할 수 있다.
이러한 N-당사슬 함량을 유지하는 고품질의 히알루로니다제는 임시발현 배양을 통하여 확인을 하였고, 이를 안정적인 상업 생산을 하기 위하여 생산성이 높은 단일 클론 균주를 선정하여 세포주를 제조하였다. 이러한 세포주를 사용하여 실시예 2, 3, 4, 5의 결과를 적용한 방법으로 배양인 표 1의 세포주 시험배양#2, #3, #4, 세포주 배양#1, #2, #3, #4의 경우에는 모두 10,000 unit/mL 이상의 효소 발현량을 보였기 때문에 고품질의 히알루로니다제를 저비용으로 생산할 수 있는 효율을 증명하였다.
실시예 2. 첨가물 조정 배양
히알루로니다제(Hyaluronidase) PH20 변이체를 EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch 배지(Sigma-Aldrich사, 미국)에 Cotton 200UF(Gibco사, 미국)를 첨가한 후 20mM N-acetyl-D-mannosamine(NZP사, 네덜란드) 또는 50mM Galactose(Pfanstiehl사, 미국)을 추가로 첨가 또는 미첨가된 배지가 들어있는 3개의 125mL 삼각 플라스크 (Erlenmeyer flask)에 동일하게 2x106cells/mL로 접종하고, 37°C, 8% CO2 인큐베이터(incubator)에서 회분 배양으로 성장시킨 다음, 누적 생존 세포 농도 (integral viable cell density, IVCD)가 변경 범위에 도달하였을 때, 32℃로 온도를 낮추어 유가 배양하였다. 피드 배지인 CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM 배지(Gibco사, 미국)는 플라스크 내의 배양 시작 부피의 1.88%로 매일 공급하였다. 세포 샘플은 배양으로부터 매일 취하여 생존 세포수, 세포 생존율, pH, Lactate의 수준을 측정하였고, 배양 종료 후 2,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 배양액 상등액을 확보하였다. 상기 조건으로 배양된 시료는 HPLC 및 탁도 분석으로 활성을 확인하였고, 등전점 전기영동 (isoelectric focusing) 및 당화 분석을 수행하여 단백질 패턴과 N-당사슬 수준을 확인하였다. 50mM Galactose를 첨가한 배지는 미첨가된 배지보다 Galactosylation이 24% 증가한 반면 활성은 2% 감소하였고, 20mM N-acetyl-D-mannosamine 첨가한 배지는 미첨가된 배지보다 Sialylation은 35% 증가한 반면 활성은 20% 감소한 것으로 확인되었다 (도 3, 도 4, 도 5, 도 6).
실시예 3. 배양일 조건 배양
히알루로니다제(Hyaluronidase) PH20 변이체를 과발현하는 세포를 Sartorius 200 L 생물반응기(bioreactor) 내에서 EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch 배지(Sigma-Aldrich사, 미국)에 2x106 cells/mL로 접종하였다. 배양 2일차에 Cotton 200UF(Gibco사, 미국)및 농축 영양물 배지인 CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM 배지(Gibco사, 미국)를 공급물 배지로서 사용하는 유가 배양법(fed-batch culture)으로 진행하였고 pH 7.2±0.4와 DO 40%로 설정하여 47rpm의 속도로 교반 하였다. 37℃조건으로 초기 배양을 진행한 후 누적 생존세포농도가 변경 범위에 도달하면 32℃로 온도 변화시켜 유가 배양하였다. 피드 배지인 CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM 배지(Gibco사, 미국)는 생물반응기(bioreactor)내의 배양 시작 부피의 1.88%로 매일 공급하였다. 배양일은 세포 생존율이 40% 이하가 되는 조건까지 배양을 진행하여 배양 19일에 종료하였고, 세포의 다양한 상태는 배양으로부터 매일 취하여 생존 세포수, 세포 생존율, 누적생존세포농도, 암모늄 이온의 수준을 측정하였으며 배양 종료 후 Depth filter를 사용하여 배양액을 회수하였다. 상기 조건으로 배양된 시료는 HPLC 및 탁도 분석으로 활성을 확인하였고, 등전점 전기영동 (isoelectric focusing) 및 당화 분석을 수행하여 단백질 패턴과 N-당사슬 수준을 확인하였다. 배양일이 증가할수록 Galactosylation 및 Sialylation 함량이 감소하고 활성은 증가하는 경향을 확인하였다 (도 7, 도 8, 도 9, 도 10).
실시예 4. 배양액 Glucose 농도 조절 배양
히알루로니다제(Hyaluronidase) PH20 변이체를 과발현하는 세포를 Sartorius 2 L 생물반응기(bioreactor) 내에서 EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch 배지(Sigma-Aldrich사, 미국)에 2x106cells/mL로 접종하였다. 배양 2일차에 Cotton 200UF(Gibco사, 미국)및 농축 영양물 배지인 CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM 배지(Gibco사, 미국)를 공급물 배지로서 유가 배양법(fed-batch culture)으로 진행하였고 pH 7.2±0.4와 DO 40%로 설정하여 120rpm의 속도로 교반 하였다. 37℃조건으로 초기 배양을 진행한 후 누적 생존세포농도가 변경 범위에 도달하면 32℃로 온도 변화시켜 유가 배양하였다. 피드 배지인 CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM 배지(Gibco사, 미국)는 생물반응기(bioreactor)내의 배양 시작 부피의 1.88%로 매일 공급하였다. 세포의 다양한 상태는 배양으로부터 매일 취하여 생존 세포수, 세포 생존율, pH, 삼투압, Glucose, Lactate의 수준을 측정하였다.
Glucose 농도 조절은 배양액내 Glucose 농도를 매일 측정하여 배지에 포함된 Glucose 농도가 세포 성장에 따라 소모되어 기준 농도인 2, 4 또는 6 g/L 이하로 측정된 시점부터 농도를 조절하였다. 측정된 Glucose 농도가 각각의 기준 농도인 2, 4 또는 6 g/L 이하일 때 200 g/L Glucose stock 용액을 기준 농도에 달하는 양으로 3시간 이내 첨가하고, 기준 농도 이상으로 측정이 되면 첨가를 하지 않는 방식으로 각각의 농도 조건을 유지하였다. 일반적으로 동물 세포 배양에서 3시간 이내에는 Glucose의 함량의 변화가 세포 성장에 미치는 영향이 미미하다.
이 경우, 2 g/L을 기준 농도로 유지하는 조건을 1 g/L (±1 g/L) 농도 조건이라 하고, 4 g/L을 기준 농도로 유지하는 조건을 3 g/L (±1 g/L) 농도 조건이라 하고, 6 g/L을 기준 농도로 유지하는 조건을 5 g/L (±1 g/L) 농도 조건이라 하였다. 예를 들면, Glucose 농도 유지 조건 1 g/L (±1 g/L)농도 이란 의미는 Glucose 농도의 조절 범위의 하한선을 0 g/L로 설정하고, Glucose의 농도 조절 범위의 상한선을 2 g/L로 설정한다는 의미이며 실제 배양에서는 배양액의 측정된 Glucose 농도가 하한선은 0 g/L에 도달할 때, 최대 2 g/L의 Glucose 농도가 되도록 추가로 200 g/L의 Glucose stock 용액을 첨가하며, 배양액 내의 Glucose 농도가 상한선인 2 g/L에 도달할 때, 200 g/L의 Glucose stock 용액을 첨가하지 않는 것을 의미한다. 따라서, 1 g/L (±1 g/L) 농도, 3 g/L (±1 g/L) 농도의 2가지 농도조건에서 2 g/L의 농도 조건은 1 g/L (±1 g/L) 농도에서는 상한선 조건을 말하며, 3 g/L (±1 g/L) 농도에서는 하한선인 조건을 말하므로 전혀 다른 작용이 진행되는 조건이므로 중복된 조건이라고 할 수 없다.
배양 종료 후 4℃10,000 rpm으로 60분간 원심분리하여 배양액 상등액을 확보하였다. 상기 조건으로 배양된 시료는 HPLC 및 탁도 분석으로 활성을 확인하였고, 등전점 전기영동 (isoelectric focusing) 및 당화 분석을 수행하여 단백질 패턴과 N-당사슬 수준을 확인하였다. 배양액내 Glucose 농도가 증가할수록 Galactosylation 및 Sialylation 함량이 증가하고 활성은 감소하는 결과를 확인하였다 (도 11, 도 12, 도 13, 도 14).
실시예 5. 배양 pH 조절 배양
히알루로니다제(Hyaluronidase) PH20 변이체를 과발현하는 세포를 Sartorius 2 L 생물반응기(bioreactor) 내에서 EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch 배지(Sigma-Aldrich사, 미국)에 2x106cells/mL로 접종하였다. 배양 2일차에 Cotton 200UF(Gibco사, 미국)및 농축 영양물 배지인 CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM 배지(Gibco사, 미국)를 사용하는 유가 배양법(fed-batch culture)으로 진행하였고 DO 40%로 설정하여 120rpm의 속도로 교반 하였다. 37℃조건으로 초기 배양을 진행한 후 누적 생존세포농도가 변경 범위에 도달하면 32℃로 온도 변화시켜 유가 배양하였다. 피드 배지인 CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM 배지(Gibco사, 미국)는 생물반응기(bioreactor)내의 배양 시작 부피의 1.88%로 매일 공급하였다. 배양 온도 변경 후 배양 pH를 기존 조건인 pH 7.2±0.4보다 개선된 조건을 찾기 위하여 pH 6.8±0.1, pH 7.0±0.1, pH 7.2±0.1, pH 7.4±0.1의 4가지 조건으로 나누어서 진행하였다. 이러한 4가지 조건은 pH의 조절 기능이 포함된 통상의 배양기를 사용한 배양의 pH의 조절 범위를 설정한 것으로 예를 들면, pH 7.0±0.1이란 의미는 pH의 조절 범위의 하한선을 pH 6.9로 설정하고, pH의 조절 범위의 상한선을 pH 7.1로 설정한다는 의미이며 실제 배양에서는 배양액의 pH가 하한선인 pH 6.9에 도달할 때, pH를 상승시켜주는 염기가 추가되며, 배양액의 pH가 상한선인 pH 7.1에 도달할 때, pH를 감소시켜주는 이산화탄소가 추가됨을 의미한다. 따라서, pH 6.8±0.1과 pH 7.0±0.1의 2가지 조건에서 pH 6.9의 조건은 pH 6.8±0.1에서는 상한선인 조건을 말하며, pH 7.0±0.1에서는 하한선인 조건을 말하므로 전혀 다른 작용이 진행되는 조건이므로 중복된 조건이라고 할 수 없다. 배양일은 세포 생존율이 40% 이하가 되는 조건까지 배양을 진행하였고, 세포의 다양한 상태는 배양으로부터 매일 취하여 생존 세포수, 세포 생존율, pH, 누적생존세포농도의 수준을 측정하였으며, 배양 종료 후 4℃10,000 rpm으로 60분간 원심분리하여 배양액 상등액을 확보하였다. 상기 조건으로 배양된 시료는 HPLC 및 탁도 분석으로 활성을 확인하였고, 등전점 전기영동 (isoelectric focusing) 분석을 수행하여 단백질 패턴을 확인하였다. 배양액 pH에 따라 활성이 변화되는 양상이 관찰되었으며, 기존 조건보다 개선 조건인 pH 7.0±0.1에서 가장 높은 활성과 가장 낮은 Sialylation 함량이 관찰되었다. (표 2, 도 15, 도 16, 도 17)
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실시예 6. 동물 세포 배양 상층액을 이용한 히알루로니다제 정제
단계 1: 배양 상층액의 완충액 교환/계면활성제 처리
배양액은 제 1 차 음이온 교환 컬럼 평형화 조건까지 조정되도록 30 kDa MWCO 막 필터를 사용한 UF/DF에 의해 pH 및 전도도의 조정으로 재조정되었다. 재조정된 용액에 바이러스 불활성화를 위해 용매/계면활성제를 적절한 농도로 처리하여 실온 조건하에서 약 60분 동안 반응하였다.
단계 2: 제 1차 음이온교환(Q Sepharose Fast Flow) 컬럼 크로마토그래피
여과한 단백질 용액을 음이온 교환수지 의해 히알루로니다아제를 포획하도록 제 1차 음이온 교환 컬럼에 통과시켰고, 뒤이어 높은 염농도에서 그 컬럼으로부터 용출시켰다. 로딩 전에, 그 컬럼은 30mM의 염농도에서 pH 8.0의 트로메타민 완충액을 이용하여 평형화되었다. 로딩 후에, 그 컬럼을 동일한 완충액 (제 1 세척)를 이용하여 세척하였다. 제 1 세척 단계 다음에, 그 컬럼을 pH 8.0의 동일한 완충액으로, 그러나 전도도는 제 1 세척 단계의 염농도 보다 높은 60mM 염농도에서 세척하였다. 제 2 세척 단계 후에, 원하는 단백질인, 히알루로니다아제 용출을 도 18에 나타낸 바와 같이 200mM 염농도에서 pH 8.0의 적절한 완충제를 이용하여 수행하였다.
단계 3: 제 2차 음이온교환(Capto Q) 컬럼 크로마토그래피
여과한 단백질 용액을 음이온 교환수지 의해 히알루로니다아제의 acidic variant를 제거하기 위해 제 2차 음이온 교환 컬럼에 통과시켰고, 뒤이어 높은 염농도에서 그 컬럼으로부터 용출시켰다. 로딩 전에, 컬럼은 염이 없는 pH6.0의 비스트리스 완충액를 이용하여 평형화되었다. 로딩 후에, 그 컬럼을 동일한 pH6.0의 비스트리스 완충액(제 1 세척)를 이용하여 세척하였다. 제 1 세척 단계 다음에, 그 컬럼을 비스트리스 완충액으로, 그러나 전도도는 제 1 세척 단계의 염농도 보다 높은 20mM 염농도에서 세척하였다. 제 2 세척 단계 후에, 원하는 단백질인, 히알루로니다아제 용출을 도 19에 나타낸 바와 같이 염농도에서 비스트리스 완충액를 이용하여 수행하였다.
단계 4: 양이온교환(Capto MMC) 컬럼 크로마토그래피
재조정한 단백질 용액을 양이온 교환수지 의해 히알루로니다아제의 acidic variant를 제거하기 위해 컬럼에 통과시켰고, 뒤이어 높은 pH와 염농도에서 그 컬럼으로부터 용출시켰다. 로딩 전에, 컬럼은 80mM의 염농도에서 pH 5.5의 시트레이트 완충액를 이용하여 평형화되었다. 로딩 후에, 그 컬럼을 동일한 완충액 (제 1 세척)를 이용하여 세척하였다. 제 1 세척 단계 다음에, 그 컬럼을 pH 7.5의 적절한 비스트리스 완충액으로 세척하였다. 제 2 세척 단계 후에, 원하는 단백질인, 히알루로니다아제 용출을 도 20에 나타낸 바와 같이 400mM의 염농도에서 pH 8.0의 비스트리스 완충액를 이용하여 수행하였다.
단계 5: 나노-여과 / Formulation
양이온 교환 컬럼 단계 이후에, 원하는 히알루로니다아제를 포함하는 단백질 용액은 1um 필터로 여과하고 나노-여과 단계를 수행하였다. 나노 여과를 통과한 단백질 용액을 10mg/mL의 고농도로 농축하고 145mM 염이 함유된 pH7.0의 히스티딘 완충제로 교환하기 위해 8 kDa MWCO 막 필터를 사용한 UF/DF에 의해 재조정하였다.
실시예 7. 히알루로니다제의 효소 활성 분석
히알루로니다제 PH20 및 기타 히알루로니다제의 효소 활성을 다음과 같은 Turbidimetric assay를 이용하여 측정하였다.
Turbidimetric assay은 히알루론산과 알부민(BSA) 혼합 시 생성되는 침전을 흡광도를 이용하여 측정하는 방법으로, PH20에 의해 히알루론산이 가수분해되면 알부민과 혼합 시 흡광도가 감소한다. 일반적으로는 다음과 같이 진행하였다. 히알루로니다제 PH20 (Sigma)를 1, 2, 5, 7.5, 10, 15, 20, 30, 50, 60 units/mL되게 희석하여 각 튜브에 준비하였다. 정제된 단백질 샘플을 enzyme diluent buffer (20 mM Tris·HCl, pH 7.0, 77 mM NaCl, 0.01% (w/v) bovine serum albumin)에 용해하여 100X, 300X, 600X, 1200X, 2400X 되게 희석하여 각 튜브에 준비하였다. 새로운 튜브에 3 mg/mL인 히알루론산 용액의 농도가 0.3 mg/mL 되게 10배 희석하여 각 튜브의 부피가 180 ㎕가 되게 하였다. 희석한 히알루론산 용액에 효소를 60 ㎕ 넣고 혼합하여 37℃에서 45분간 반응시켰다. 반응이 끝나면 96-well plate에 반응시킨 효소 50 ㎕와 acidic albumin solution 250 ㎕를 각 well에 넣고 10분간 진탕한 후 600 nm에서 분광 광도계로 흡광도를 측정하였다. 이 활성 단위를 알고 있는 표준품의 시험 결과와 시료의 시험 결과를 이용하여 시료의 활성 단위를 구하였다.
실시예 8. 히알루로니다제의 등전점 전기 영동 분석
히알루로니다제의 등전점 전기 영동은 Invitrogen사의 Precast Gel (pH 3-7)과 등전점 전기 영동용 완충용액을 사용하여 분석하였다. Precast Gel에 정제한 히알루로니다제 시료를 Loading한 후, Novex사의 전기 영동 장치를 이용하여 100 V 로 1시간, 200 V 로 1시간, 500 V로 30분 간 수행하여 전개하였다. 전개가 완료된 Gel은 정제수로 세척을 하고, 12% TCA 용액으로 단백질을 고정한 후 Coomassie Blue R-250 염색용액으로 염색을 한 후, 초산-메탄올 용액으로 탈색을 하여 Gel에 나타난 단백질 띠를 분석하였다.
실시예 9. 히알루로니다제의 N-당사슬 함량 분석
히알루로니다제의 N-당사슬 함량은 히알루로니다제를 PNGase F (N-glycosidase F)로 처리하여 분리한 N-당사슬 시료를 2-AB (2-aminobanzamide)로 Labelling하여 ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide column (Waters사)을 이용하여 UPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography)를 실시하여 분석하였다. 정제한 히알루로니다제 시료는 탈염하여 PNGase F로 37℃에서 16-18시간 동안 반응하여 N-당사슬을 분리하였고, 이는 건조한 후 2-AB Labelling을 65℃에서 3시간 반응하였고 과량의 2-AB를 제거하였다. 라벨이 된 N-당사슬 시료는 72%-20% Acetonitrile gradient로 HPLC를 진행하여 분리하였다. 분리된 시료는 FLD (Flourescence detector)로 검출하여 N-당사슬 함량을 분석하였다. 분리된 각 N-당사슬을 분류하여 N-당사슬 말단에 갈락토스를 포함한 N-당사슬 (G1, G1F, G1F', G2, G2F, A1, A1F, A2, A2F 등)의 각 함량을 모두 합하여 Galactosylation % 함량을 구하고, N-당사슬 말단에 시알산을 포함한 N-당사슬 (A1, A1F, A2, A2F 등)의 각 함량을 모두 합하여 Sialylation % 함량을 구하며, N-당사슬 말단에 만노스를 포함한 N-당사슬 (M4G0F, M5, M5G0, M6, M7, M8, M9 등)의 각 함량을 모두 합하여 Mannosylation % 함량을 구하였다.
실시예 10. 동물 유래 히알루로니다제의 제조 및 N-당사슬 함량 분석
(1) Bonobo와 양의 히알루로니다제 PH20의 유전자 제조
동물 유래 즉, 유인원인 Bonobo와 우제류인 양의 히알루로니다제 PH20의 활성과 N-당사슬 함량을 조사하기 위하여 다음과 같이 각각 히알루로니다제 PH20를 제조하였다. 각각의 천연형 유전자로부터 cDNA를 합성하고, pcDNA3.4-TOPO vector의 Xho I과 Not I 제한효소 자리에 삽입하였다. ExpiCHO 세포에서의 발현을 위해 PH20의 고유한 신호 펩티드 대신 인간 성장호르몬, 인간 혈청 알부민, 또는 인간 Hyal1의 신호 펩티드 중 하나를 신호 펩티드로 사용하였다. HisTrap 컬럼을 이용한 단백질 정제를 위해 PH20 cDNA의 3'-말단에 His-tag의 DNA 서열이 위치하게 하였다. 각 서열의 확인은 DNA sequencing을 이용하였다. 표 3은 동물 유래 히알루로니다제의 서열을 제시하였다.
Figure PCTKR2021010368-appb-img-000005
(2) Bonobo와 양의 히알루로니다제 PH20의 발현
발현은 ExpiCHO 발현 시스템을 사용하였다. ExpiCHO 세포의 세포수가 6x106/mL이 되었을 때 히알루로니다제 PH20의 cDNA가 pcDNA3.4-TOPO 벡터에 삽입된 플라스미드로 ExpiFectamine CHO Reagent를 이용하여 ExpiCHO 세포를 형질주입 시켰다. 세포배양액은 ExpiCHO Expression Medium (100~500 mL)을 이용하였다. 형질주입 후 ExpiCHO 세포를 총 6일간 130 rpm에서 진탕 배양하였으며, 이 기간 동안 37 ℃에서 1일 배양하고, 온도를 32 ℃로 낮추어서 5일간 더 배양하였다. 배양 완료 시 10,000 rpm에서 30분간 원심 분리하여 세포 상등액을 회수하였다.
(3) Bonobo와 양의 히알루로니다제 PH20의 정제
ExpiCHO 세포에서 생산한 C-말단 His-tag이 붙은 동물 유래 히알루로니다제PH20의 재조합단백질은 AKTA prime 장비(GE Healthcare사)를 이용하여 2단계의 컬럼 크로마토그래피로 정제하였는데, 이 Bonobo PH20의 경우에는 pI가 6이므로 Anion Exchange Chromatography인 Q Sepharose를 사용하였고, 양 PH20의 경우에는 pI가 8 이상이므로 Cation Exchange Chromatography인 Capto S 컬럼을 사용하여 1단계 정제를 실시하였고, 각 단백질은 His-Tag 친화 Chromatography인 HisTrap HP 컬럼으로 2 단계 정제를 실시하였다.
Q Sepharose 컬럼을 이용한 단백질 정제를 위해서 버퍼 A (20 mM sodium phosphate, pH 7.5)와 버퍼 B (20 mM sodium phosphate, pH 7.5, 0.5 M NaCl)를 제조하였다. 단백질을 Q Sepharose 컬럼에 결합시키고, 버퍼 A를 5 CV 흘려주어 비 특이적으로 결합한 단백질을 제거한 후, 0~100%의 농도 기울기로 버퍼 B를 5 CV 흘려주어 단백질을 용출하였다.
Capto S 컬럼을 이용한 단백질 정제를 위해서 버퍼 A (20 mM sodium phosphate, 15 mM NaCl, pH 6.0)와 버퍼 B (20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, pH 6.0)를 각각 제조하였다. 배양액의 pH와 conductivity를 Buffer A와 동일하게 맞추고 0.22 μm pore 크기의 membrane에 배양액을 여과하였다. 다음 Capto S 컬럼에 단백질을 결합시킨 후 버퍼 A를 3 column volume (CV) 흘려주어 비특이적(non-specific)으로 결합한 단백질을 제거하였다. Buffer B를 4 CV 순차적으로 흘려주어 타겟 단백질을 용출하였다.
HisTrap HP 컬럼을 이용한 단백질 정제를 위해서 Buffer A (20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, pH 7.5)와 Buffer B (20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, 500 mM Imidazole, pH 7.5)를 각각 제조하였다. 단백질 시료를 HisTrap HP 컬럼에 결합시킨 후 비특이적으로 결합된 단백질을 제거하고자 7% Buffer B를 7 CV 흘려주었으며, 타겟 단백질의 용출을 위해 40% Buffer B를 3 CV 흘려주었다. 컬럼 용출액은 Dialysis buffer (20 mM sodium phosphate, 100 mM NaCl, pH 7.0)를 이용하여 투석하였다.
(4) Bonobo와 양의 PH-20 히알루로니다제의 분석
활성 분석은 실시예7과 동일한 방법으로 측정하였고, N-당사슬 함량 분석은 실시예 9와 동일한 방법으로 측정하였다. 결과는 표 1에 제시하였다.
실시예 11. N-당사슬함량에 따른 변이체의 효소 반응 속도 (Enzyme kinetics) 분석
본 발명에 따른 변이체의 효소 반응 속도 (Enzyme kinetics)를 분석하기 위해 Morgan-Elson 방법 (Takahashi, T. et al (2003) Anal Biochem 322:257-263)으로 효소 활성을 측정하였다. Morgan-Elson 방법은 히알루론산이 히알루로니다제에 의해 가수분해되었을 때, 생성된 N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc)의 환원 말단과 Ehrlich’s Reagent인 para-dimetylaminobenzaldehyde (DMAB)의 반응에 의해 생성되는 붉은색 물질을 정량(545 nm)하는 비색분석법이다. N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc, Sigma)를 희석 완충 용액 (0.1 M NaPi, 0.1 M NaCl, 1.5 mM Saccharic Acid 1,4-lactone, pH 5.35)로 0.25, 0.50, 0.75, 1.00, 1.25 mM 되게 희석하여 준비한 각 시험관에 Tetraborate를 처리하여 환원 후, DMAB를 첨가하여 발색 반응시켰다. 반응 후 545 nm에서 흡광도를 측정하여 GlcNAc의 표준 반응 곡선을 작성하였다. 기질인 히알루론산을 희석 완충 용액으로 0.54, 0.65, 0.87, 1.23, 2.17 μM 되게 희석하여 준비한 각 시험관에 히알루로니다제를 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시키고 100℃에서 5분간 가열하여 효소 반응을 종료시키고, Tetraborate를 처리하여 환원 후, DMAB를 첨가하여 발색 반응시켰다. 반응 후 545 nm에서 흡광도를 측정하여서 위의 GlcNAc의 표준 반응 곡선을 이용하여 효소 활성을 측정하였다. 이 방법을 사용하여 서열번호 1의 야생형 PH20 및 본 발명에 따른 PH20 변이체의 효소 반응 속도 (Enzyme kinetics)를 분석하면 Lineweaver-Burk 곡선의 직선성이 확인되어 본 발명에 따른 PH20 변이체는 Michaelis-Menten 효소 반응 속도 공식에 따르는 것을 확인하였다.
표 4는 실시예 1의 표1의 시료 중 세포주 클론 시험배양#2로 제조하여 얻어진 분획#1, #2의 효소 반응 속도를 분석하였다. 그 결과, Galactosylation 함량과 Mannosylation 함량이 유사한 범위에 있으면서 Sialylation 함량이 낮은 경우에는 효소의 촉매 효율(kcat/Km)이 크기 때문에 재조합 히알루로니다제의 효소 활성이 증가 함을 알수 있다.
이 실험 결과는 동일한 아미노산의 구조를 가진 효소의 경우에도 당화의 변화 더 나아가서는 Sialylation 함량의 변화에 의해서도 효소의 활성이 영향을 받음을 확인할 수 있음을 증명한다. 따라서, 재조합 방법으로 천연형 PH20 혹은 천연형 PH20의 변이체 히알루로니다제를 대량 생산하여 산업적으로 유용한 히알루로니다제를 생산하고자 하는 경우 Sialyation 함량을 조정함으로써 산업적 이용 가능성이 더 큰 효소를 개발할 수 있는 것을 확인하였다.
Figure PCTKR2021010368-appb-img-000006
본 발명에 따른 재조합 히알루로니다제 PH20 단백질 또는 이의 변이체의 생산방법에 의해 높은 생산성과 함께 높은 효소 활성을 갖는 재조합 히알루로니다제 PH20 단백질 또는 이의 변이체의 생산이 가능하여, 재조합 히알루로니다제 PH20 단백질 또는 이의 변이체의 대량 제조 및 공급이 가능하다.
이상 기술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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Claims (16)

  1. (1) 재조합 히알루로니다제 PH20 또는 이의 변이체를 발현하는 숙주 세포를 배양 온도 35℃~ 38℃에서 누적생존세포농도 (integral viable cell density)를 기준으로 20x106 ~ 120x106 cells x day/mL까지 되도록 배양하는 단계; 및
    (2) 배양 온도를 28℃~ 34℃로 감소시킨 후 배양 온도를 유지하며 2 ~ 18일 동안
    (a) 배지 내의 잔류 Glucose 농도를 배양 기간 동안 0.001 g/L ~ 4.5 g/L로 유지하는 배양; 및
    (b) 배양액의 pH를 pH를 6.8 ~ 7.2로 유지하는 배양;
    하는 방법으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 방법으로 배양하는 단계;
    를 포함하는 PH20 또는 이의 변이체의 생산방법으로,
    상기 생산된 PH20 또는 이의 변이체의 N-당사슬 함량 중 Sialylation 함량이 1~38%이며, 히알루로니다제 효소의 배양액에서의 활성이 10,000 unit/mL 이상인 것을 특징으로 하는 PH20 또는 이의 변이체의 생산방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생산된 PH20 또는 이의 변이체의 N-당사슬 함량중 Galactosylation 함량이 1~68%, Sialylation 함량이 1~38%, Mannosylation 함량이 40~63%인 것을 특징으로 하는 PH20 또는 이의 변이체의 생산방법.
  3. 제1항에 있어서, N-당사슬 함량 중 Sialylation 함량이 1~30%인 것을 특징으로 하는 PH20 또는 이의 변이체의 생산방법.
  4. 제1항에 있어서, 생산된 PH20 또는 이의 변이체의 효소 비활성이 천연형 인간 PH20의 활성보다 10% 이상 향상된 것을 특징으로 하는 PH20 또는 이의 변이체의 생산방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (1) 단계 및/또는 (2) 단계에서의 숙주세포의 배양은 회분 배양법 (batch culture), 반복 회분 배양법 (repeated batch culture), 유가 배양법 (fed-batch culture), 반복 유가 배양법 (repeated fed-batch culture), 연속 배양법 (continuous culture) 및 관류 배양법 (perfusion culture)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 PH20 또는 이의 변이체의 생산방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (1) 단계 및/또는 (2) 단계에서의 숙주세포의 배양은
    (i) 배지 내에 암모니아를 첨가하거나 배지 내의 암모니아 농도를 5mM 이상으로 증가시키는 조건;
    (ii) Glutamine, Glucosamine, Uridine, Glucosamine 및 Sodium Butyrate로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질을 배지에 첨가하는 조건; 및
    (iii) Galactose 및 ManNAc을 첨가하지 않는 조건;
    으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 조건 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 PH20 또는 이의 변이체의 생산방법.
  7. 제1항에 있어서, PH20의 변이체는 천연형 PH20의 아미노산 서열에 있어, 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 포함하고, 선택적으로 N-말단 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기의 일부가 결실된 것을 특징으로 하는 PH20 또는 이의 변이체의 생산방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 숙주 세포는 동물 세포(animal cell), 효모(yeast), 방선균(Actinomycetes) 또는 곤충 세포(insect cell)인 것을 특징으로 하는 PH20 또는 이의 변이체의 생산방법.
  9. 제1항에 있어서, 추가적으로 생산된 PH20 또는 이의 변이체를 분리 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 PH20 또는 이의 변이체의 생산방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 PH20 또는 이의 변이체의 분리 정제는 친화력 결합 특성을 이용하지 않고, PH20 또는 이의 변이체의 이온결합 특성 및/또는 소수성 상호작용 특성을 이용하여 정제되는 것을 특징으로 하는 PH20 또는 이의 변이체의 생산방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 PH20 또는 이의 변이체의 분리 정제는 친화크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용하지 않고, 이온교환크로마토그래피(ion exchange chromatography)와 소수성작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography)를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 PH20 또는 이의 변이체의 생산방법.
  12. 제9항에 있어서, 산성을 띠는 PH20 또는 이의 변이체가 제거되는 것을 특징으로 하는 PH20 또는 이의 변이체의 생산방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 산성을 띠는 PH20 또는 이의 변이체의 제거는 이온교환크로마토그래피를 이용하는 것을 특징으로 하는 PH20 또는 이의 변이체의 생산방법.
  14. N-당사슬 함량 중 Galactosylation 함량이 1~68%, Sialylation 함량이 1~38%, Mannosylation 함량이 40~63%인 것을 특징으로 하는 PH20 또는 이의 변이체
  15. 제14항에 있어서, N-당사슬 함량 중 Sialylation 함량을 1~30%로 제한하는 것을 특징으로 하는 PH20 또는 이의 변이체.
  16. 제14항에 있어서, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 방법에 의해 상산된 것을 특징으로 하는 PH20 또는 이의 변이체.
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