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WO2022019649A1 - 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 항암용 조성물 - Google Patents

효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 항암용 조성물 Download PDF

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Publication number
WO2022019649A1
WO2022019649A1 PCT/KR2021/009416 KR2021009416W WO2022019649A1 WO 2022019649 A1 WO2022019649 A1 WO 2022019649A1 KR 2021009416 W KR2021009416 W KR 2021009416W WO 2022019649 A1 WO2022019649 A1 WO 2022019649A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cancer
stem cells
enhanced
preventing
anticancer efficacy
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2021/009416
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
이명우
김대성
송주용
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cellnlife Inc
Original Assignee
Cellnlife Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cellnlife Inc filed Critical Cellnlife Inc
Publication of WO2022019649A1 publication Critical patent/WO2022019649A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to an anticancer composition comprising stem cells with enhanced efficacy.
  • Stem cells are cells that have the ability to differentiate into all kinds of cells that make up the body, such as nerves, blood, and cartilage, if necessary, while remaining undifferentiated into specific cells. There are two main ways to obtain these stem cells. First, they are obtained from a fetus generated from a fertilized egg (embryonic stem cells), and secondly, stem cells (adult stem cells) stored in each part of our body as adults. is to recover Although there are differences in function, both embryonic and adult stem cells have the characteristic of being able to differentiate into various types of cells.
  • human mesenchymal stem cells can be derived from a variety of tissues and are strong candidates for cell-based transplantation or regenerative drug therapy. Characteristics of MSCs such as migration to damaged tissues, immunosuppressive function, self-renewal, and pluripotency open up the possibility of their therapeutic application.
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • the present inventors have completed the present invention by developing a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing stem cells with enhanced anticancer efficacy.
  • an object of the present invention is to provide a method for preparing a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, including stem cells with enhanced anticancer efficacy, and a composition prepared by the method.
  • Another object of the present invention PD-L1, CXCR7, PGES and two or more proteins selected from the group consisting of PGDS; Or a gene encoding it; to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising stem cells having enhanced anticancer efficacy with increased expression.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating cancer, comprising the step of treating the pharmaceutical composition for preventing or treating cancer.
  • the present invention provides (a) PD-L1 or CXCR7 protein; or a gene encoding it; selecting stem cells with enhanced expression; (b) culturing the stem cells selected in step (a) to enable cell-to-cell interaction; And (c) treating the stem cells cultured in step (b) with a stimulant to prepare stem cells with enhanced anticancer efficacy; Provided is a method for preparing a red composition.
  • the present invention also provides a composition for preventing or treating cancer comprising stem cells with enhanced anticancer efficacy prepared by the above method.
  • the present invention provides two or more proteins selected from the group consisting of PD-L1, CXCR7, PGES and PGDS; Or a gene encoding it; provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising stem cells with enhanced anticancer efficacy with increased expression.
  • the present invention comprises the step of administering a composition for preventing or treating cancer comprising stem cells with enhanced anticancer efficacy to an individual in need thereof, wherein the stem cells with enhanced anticancer efficacy are (a) PD-L1 or CXCR7 protein; or a gene encoding it; selecting stem cells with enhanced expression; (b) culturing the stem cells selected in step (a) to enable cell-to-cell interaction; And (c) treating the stem cells cultured in step (b) with a stimulant; it provides a method for preventing or treating cancer, which is produced through.
  • a composition for preventing or treating cancer comprising stem cells with enhanced anticancer efficacy to an individual in need thereof, wherein the stem cells with enhanced anticancer efficacy are (a) PD-L1 or CXCR7 protein; or a gene encoding it; selecting stem cells with enhanced expression; (b) culturing the stem cells selected in step (a) to enable cell-to-cell interaction; And (c) treating the stem cells culture
  • the present invention includes; administering a composition for preventing or treating cancer comprising stem cells with enhanced anticancer efficacy to an individual in need thereof, wherein the stem cells with enhanced anticancer efficacy are PD-L1, CXCR7, two or more proteins selected from the group consisting of PGES and PGDS; Or a gene encoding it; the expression of which is enhanced, it provides a method for preventing or treating cancer.
  • composition for preventing or treating cancer containing stem cells with enhanced anticancer efficacy according to the present invention has an effect of inhibiting cell proliferation in various carcinomas, and thus can be variously used in the field of cancer prevention or treatment.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of confirming the factors whose expression is increased compared to the control group, naive MSC, in mesenchymal stem cells with enhanced anticancer efficacy prepared by the culturing method of the present invention through a microarray.
  • Figure 2 confirms the anticancer effect of mesenchymal stem cells with enhanced anticancer efficacy prepared by the culturing method of the present invention, and various cancer cell lines of naive MSC and MSC prepared by the culturing method according to the present invention (human acute T lymphocytes).
  • Anticancer effect by measuring the cell viability in a leukemia cell line (Jurkat), a human liver cancer cell line (HepG2, Hep3b), a human lung cancer cell line (A549), a human breast cancer cell line (MBA-MB-231), and a human colorectal cancer cell line (HCT116) shows the results of checking .
  • the present invention provides a method for preparing a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising stem cells with enhanced anticancer efficacy; And the composition prepared by the above method; provides.
  • the method for preparing a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising stem cells with enhanced anticancer efficacy includes (a) PD-L1 or CXCR7 protein; or a gene encoding it; selecting stem cells with enhanced expression; (b) culturing the stem cells selected in step (a) to enable cell-to-cell interaction; and (c) treating the stem cells cultured in step (b) with a stimulant to prepare stem cells with enhanced anticancer efficacy.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating cancer, comprising administering the pharmaceutical composition for preventing or treating cancer to an individual in need thereof.
  • a stem cell refers to a cell having the ability to differentiate into two or more cells while having the ability to self-renew, and the stem cell is an adult stem cell, a pluripotent stem cell, an induced pluripotent stem cell or an embryonic stem cell. contains stem cells.
  • the stem cells preferably include embryonic stem cells or adult stem cells, stem cells with enhanced anticancer efficacy.
  • the adult stem cells are preferably derived from bone marrow, blood, skin, fat, brain, umbilical cord, umbilical cord blood, periodontal, amniotic membrane, chorion, decidua, placenta or Wharton's jelly.
  • the stem cells may be mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord.
  • mesenchymal stem cells are undifferentiated stem cells isolated from human or mammalian tissues.
  • Mesenchymal stem cells can be derived from various tissues, and in particular, from one or more selected from the group consisting of bone marrow, blood, skin, fat, brain, umbilical cord, umbilical cord blood, periodontal, amniotic membrane, chorion, decidua, placenta, or Wharton's jelly. can come from Techniques for isolating stem cells from each tissue are already known in the art.
  • the mesenchymal stem cells are autologous, allogeneic or allogeneic bone marrow, blood, skin, fat, brain, umbilical cord, umbilical cord blood, periodontal, amniotic membrane, chorion, decidua, placenta or Wharton's jelly.
  • the mesenchymal stem cells may be derived from humans, fetuses, or mammals other than humans.
  • the mammals other than humans may be more preferably canines, felines, monkeys, cattle, sheep, pigs, horses, rats, mice or guinea pigs, and the origin is not limited thereto.
  • selection means selecting cells according to whether a certain protein or a gene encoding it is expressed or not and the amount of expression.
  • PD-L1 Programmed death-ligand 1 refers to a transmembrane protein encoded by the CD274 gene in humans, and suppresses the immune system in the treatment of pregnancy, tissue allograft, autoimmune disease and hepatitis. It plays an important role.
  • the PD-L1 transmits a signal that reduces the proliferation of antigen-specific T cells in the lymph node, and at the same time increases apoptosis.
  • CXCR7 C-X-C chemokine receptor type 7 refers to a chemokine receptor also known as ACKR3 (G-protein coupled receptor 159) and GPR159 (Atypical chemokine receptor 3).
  • PGES prostaglandin E2 synthase
  • PGE prostaglandin E2 synthase
  • PGDS Prostaglandin-D synthase refers to an enzyme belonging to the sigma class glutathione-S-transferase family.
  • the PGDS catalyzes the conversion of PGH2 to PGD2 (Prostaglandin-D), and is involved in prostanoid production in the immune system and mast cells.
  • the presence of PGDS is also used to identify the differentiation stage of human megakaryocytes.
  • IDO indoleamine 2,3-dioxygenase
  • IDO refers to a heme-containing enzyme encoded by the IDO 1 gene in humans. IDO limits T cell function and is involved in immune regulation through its ability to control mechanisms of immune tolerance.
  • CXCL9 (Chemokine (C-X-C motif) ligand 9), also known as gamma-interferon-induced monochitin, is a small cytokine belonging to the CXC chemokine.
  • the CXCL9 is a T-cell chemoattractant induced by gamma-interferon.
  • CXCL10 (Chemokine (CXC motif) ligand 10) is known as IP-10 (Interferon gamma-induced protein 10) or small-inducible cytokine B10, a protein of 8.7 kDa encoded by the CXCL10 gene in humans. it means.
  • CXCL10 is a small cytokine belonging to the C-X-C chemokine family.
  • the selected stem cells of step (a) are BD2 (Beta-defensin 2) or LL-37 (Cathelicidin antimicrobial peptides (CAMP) LL-37) protein; Or it is preferred that the expression of the gene encoding it is further enhanced.
  • BD2 Beta-defensin 2
  • LL-37 Cathelicidin antimicrobial peptides (CAMP) LL-37
  • culturing to enable the cell-to-cell interaction in step (b) maintains a state of 90% or more confluent when expressed in terms of culture density, but maintains the shape of the cells, It is preferable to be cultured at a level that does not overlap, and more preferably, after seeding at a density of 3,000 to 20,000 cells/cm 2 , it may be cultured for 3 to 5 days.
  • the stimulatory agent is preferably at least one selected from the group consisting of IFN- ⁇ , TNF- ⁇ and poly IC.
  • the stem cells of step (b) include one or more proteins selected from the group consisting of CXCR7 (C-X-C chemokine receptor type 7), PGES (prostaglandin E2 synthase), and PGDS (Prostaglandin-D synthase); Or the gene encoding it; it is preferred that the expression of the enhanced.
  • CXCR7 C-X-C chemokine receptor type 7
  • PGES prostaglandin E2 synthase
  • PGDS Prostaglandin-D synthase
  • the anticancer efficacy is enhanced stem cells (i) two or more proteins selected from the group consisting of PD-L1, CXCR7, PGES and PGDS; or a gene encoding it; (ii) IDO (indoleamine 2,3-dioxygenase), CXCL9 (Chemokine (CXC motif) ligand 9), CXCL10 (Chemokine (CXC motif) ligand 10), HLA-G (human leukocyte antigen G), ICAM1 (Intercellular Adhesion Molecule 1), VCAM1 (vascular cell adhesion molecule 1), IL18BP (Interleukin-18-binding protein), RARRES3 (Retinoic acid receptor responder protein 3), CCL8 (CC motif ligand 8) ), CCL13 (CC motif ligand 13), TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand), APRIL (A proliferation-inducing ligand),
  • IDO indo
  • TRAIL TRAIL, APRIL and BAFF proteins among the aforementioned factors; and a gene encoding it; is known in the art to be deeply related to anticancer function.
  • the steps (a) to (c) refer to selection, interaction, and stimulation steps, respectively, and each step is preferably performed sequentially.
  • the cancer is gastric cancer, breast cancer, lung cancer, liver cancer, blood cancer, acute leukemia, bone cancer ( bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head or neck cancer, cutaneous or intraocular melanoma, uterine sarcoma, ovarian cancer ), rectal cancer, anal cancer, colon cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical cancer, small intestine cancer, endocrine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue tumor, urethral cancer, prostate cancer ), one or more selected from the group consisting of bronchogenic cancer and bone marrow tumor, but is not limited thereto.
  • bone cancer bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head or neck cancer, cutaneous or intraocular melanoma, uterine sarcoma, ovarian cancer
  • rectal cancer anal cancer, colon cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical cancer, small intestine cancer, endocrine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising stem cells with enhanced anticancer efficacy prepared by the above method may be formulated in various forms according to a conventional method and used. For example, it can be formulated and used in the form of external preparations, suppositories and sterile injection solutions.
  • composition of the present invention may contain one or more known active ingredients having a preventive or therapeutic effect on cancer together with stem cells with enhanced anticancer efficacy.
  • composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable additive, wherein the pharmaceutically acceptable additive includes starch, gelatinized starch, microcrystalline cellulose, lactose, povidone, colloidal silicon dioxide, calcium hydrogen phosphate, and lactose.
  • the pharmaceutically acceptable additive includes starch, gelatinized starch, microcrystalline cellulose, lactose, povidone, colloidal silicon dioxide, calcium hydrogen phosphate, and lactose.
  • mannitol, syrup, gum arabic, pregelatinized starch, corn starch, powdered cellulose, hydroxypropyl cellulose, Opadry, sodium starch glycolate, carnauba wax, synthetic aluminum silicate, stearic acid, magnesium stearate, aluminum stearate, calcium stearate, Sucrose and the like may be used.
  • the pharmaceutically acceptable additive according to the present invention is preferably included in an amount of 0.1 to 90 parts by weight based on the composition, but is not limited thereto.
  • composition of the present invention can be administered in various parenteral formulations during actual clinical administration, and when formulated, it is prepared using a diluent or excipient such as a filler, extender, binder, wetting agent, disintegrant, surfactant, etc. It can be done, and suitable formulations known in the art are preferably those disclosed in the literature (Remington's Pharmaceutical Science, recently Mack Publishing Company, Easton PA).
  • the formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized formulations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • injectable esters such as ethyl oleate.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin, and the like can be used.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the formulation method, administration method, administration time and/or route of administration of the pharmaceutical composition, and the type and extent of a response to be achieved by administration of the pharmaceutical composition , various factors including the type of subject to be administered, age, weight, general health status, symptoms or severity of disease, sex, diet, excretion, components of drugs or other compositions used simultaneously or at the same time in the subject; It may vary depending on similar factors well known in the pharmaceutical field, and a person skilled in the art can easily determine and prescribe an effective dosage for a desired treatment.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is, for example, preferably administered at a concentration of 0.05 to 5 mg/kg, more preferably 0.1 to 0.4 mg/kg, more preferably 0.2 to 0.35 mg/kg , more preferably 0.25 mg/kg, but the dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the administration route and administration method of the pharmaceutical composition of the present invention may be each independent, and the method is not particularly limited, and any administration route and administration method as long as the pharmaceutical composition can reach the desired site. can follow
  • the pharmaceutical composition may be administered by parenteral administration.
  • the parenteral administration method includes, for example, intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, transdermal administration, or subcutaneous administration.
  • composition of the present invention can be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy, and biological response modifiers for the prevention or treatment of cancer.
  • the subject is a subject expected to develop cancer; affected individuals; or an individual who has been determined to be cured; may be, but is not limited thereto.
  • two or more proteins selected from the group consisting of PD-L1, CXCR7, PGES and PGDS; Or a gene encoding it; provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising stem cells with enhanced anticancer efficacy with increased expression.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating cancer, comprising administering the composition for preventing or treating cancer to an individual in need thereof.
  • the anticancer efficacy is enhanced stem cells are additional selection factors BD-2 or LL-37 protein; Or the gene encoding it; expression may be further enhanced.
  • the stem cells with enhanced efficacy are IDO, CXCL9, CXCL10, HLA-G, ICAM1, VCAM1, IL18BP, RARRES3, CCL8, CCL13, TRAIL, APRIL, BAFF, HLA-DRA, CD74, GBP1 , at least one protein selected from the group consisting of GBP2, GBP4, GBP5, PGE2 and IFN-beta; Or it is preferred that the expression of the gene encoding it is further enhanced.
  • the subject is a subject expected to develop cancer; affected individuals; or an individual who has been determined to be cured; may be, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating cancer according to this aspect has significantly improved anticancer efficacy compared to naive stem cells, and can be used in various ways in the field of prevention and treatment of cancer.
  • the umbilical cord tissue collected immediately after childbirth was washed before being transferred to the laboratory, and containing F-12 medium supplemented with transfer medium (50 IU/ml penicillin, 50 ⁇ g/ml streptomycin (purchased from Invitrogen))
  • transfer medium 50 IU/ml penicillin, 50 ⁇ g/ml streptomycin (purchased from Invitrogen)
  • the stem cells were extracted in a sterile flow hood.
  • the sample is transferred to a sterile stainless steel container, washed several times with PBS, cut into 2 cm lengths, transferred to a cell culture dish with a diameter of 10 cm, and additionally washed with 70% (v/v) ethanol. Infection treatment was carried out, and the solution was washed several times with PBS to which an antibiotic mixture (50 IU/ml penicillin, 50 ⁇ g/ml streptomycin (purchased from Invitrogen)) was added until the solution became clear.
  • an antibiotic mixture 50 IU/ml penicillin,
  • the umbilical cord tissue was incised to separate Wharton's jelly (the matrix of the umbilical cord) from the blood vessels and other internal elements of the umbilical cord, the blood vessels were removed to separate the Wharton's jelly.
  • the isolated Wharton's jelly was cut into small pieces (0.5 cm ⁇ 0.5 cm). The culture of the isolated tissue was performed according to cell culture conditions suitable for the extraction of mesenchymal stem cells.
  • the explanted tissue was impregnated with 5 ml of MEM- ⁇ (Minimum essential medium-alpha, Gibco) with 10% FBS, 10% FBS and 1% antibiotics-antimycotic. It was cultured at a temperature of 37° C. in a carbon dioxide cell incubator. At this time, the medium was replaced every 3 or 4 days, and the outgrowth of cells was monitored with an optical microscope. Elongating cells were trypsinized (0.125% trypsin/0.05% EDTA) for further expansion and cryopreservation (MEM- ⁇ , 10% FBS), and the medium was changed every 3 or 4 days. The outgrowth of cells from the explanted tissue was monitored by light microscopy.
  • MEM- ⁇ Minimum essential medium-alpha, Gibco
  • the cell pellet was resuspended in medium (MEM- ⁇ (Gibco), 10% FBS, 1% Antibiotics-antimycotic) and counted, and inoculated into T75 tissue culture flasks. The medium was changed every 3 or 4 days. Cell growth and clonogenesis were monitored by light microscopy. At about 90% confluence, cells were sub-cultured as described above.
  • Human acute T lymphocytic leukemia cell line Jurkat
  • human liver cancer cell line HepG2, Hep3b
  • human lung cancer cell line A549
  • human breast cancer cell line MAA-MB-231
  • human colorectal cancer cell line HCT116
  • Example 2 S-I-S (Selection-Interaction-Stimulation) culture method for producing mesenchymal stem cells with enhanced efficacy
  • mesenchymal stem cells isolated from the human umbilical cord tissue of Example 1 cells with enhanced expression of PD-L1 and CXCR7 proteins were selected. Specifically, the mesenchymal stem cells of Example 1 were cultured confluently to enable cell-to-cell interaction. An experiment was performed to confirm the expression of PD-L1 and CXCR7 proteins in cultured mesenchymal stem cells. In addition, the expression of BD-2 and LL-37 proteins was confirmed as additional selection factors.
  • Example 1-2 Among the mesenchymal stem cells isolated and cultured in Example 1-2, cells with enhanced expression of PD-L1, CXCR7, BD-2 and LL-37 proteins were identified and selected, and these were used in the next experiment.
  • the selected PD-L1, CXCR7, BD-2 and LL-37 protein expression-enhanced mesenchymal stem cells were subcultured. Specifically, the mesenchymal stem cells were put into the mesenchymal stem cell culture medium and tissue culture flask of Example 1-2, and cultured at 37° C., 5% CO 2 in an incubator. At this time, bFGF was added to the culture medium. During subculture, mesenchymal stem cells of each generation were frozen. In addition, experiments were performed to confirm the morphology and cell proliferation rate of mesenchymal stem cells during subculture and freezing.
  • mesenchymal stem cells with enhanced expression of PD-L1, CXCR7, BD-2 and LL-37 proteins maintained the characteristics of mesenchymal stem cells even during subculture, and maintained or increased the cell proliferation rate.
  • mesenchymal stem cells with enhanced expression of PD-L1, CXCR7, BD-2 and LL-37 proteins maintained the characteristics of mesenchymal stem cells even when frozen and thawed, and maintained or increased the cell proliferation rate.
  • mesenchymal stem cells selected in the selection step of Example 2-1 cells with enhanced expression of CXCR7, PGES and PGDS proteins were selected in the additional selection step.
  • 'culture to enable interaction between cells' refers to maintaining a state of 90% or more confluent when expressed in terms of culture density, but maintaining the shape of the cells and culturing at a level where cells do not overlap. do.
  • the mesenchymal stem cells selected in the selection step of Example 2-1 were seeded at a density of 3,000 to 20,000 cells/cm 2 to enable cell-to-cell interaction, and then harvested after culturing for 3 to 5 days. An experiment was performed to confirm the expression of CXCR7, PGES and PGDS proteins in the harvested mesenchymal stem cells.
  • IFN- ⁇ , TNF- ⁇ , or polyIC Polyinosinic:polycytidylic acid, Poly I:C
  • the gene expression of mesenchymal stem cells ie, mesenchymal stem cells cultured by S-I-S culture method
  • the results of analysis of genes with increased expression in mesenchymal stem cells treated with immune stimulants are shown in FIG. 1 .
  • the genes encoding the PD-L1, TRAIL, APRIL and BAFF proteins are denoted as CD274, TNFSF10, TNFSF13 and TNFSF13B, respectively.
  • the mesenchymal stem cells stimulated with the immune stimulator increased the expression of the gene encoding TRAIL (TNFSF10), the gene encoding APRIL (TNFSF13) and the gene encoding BAFF (TNFSF13B), which are anticancer function-related factors.
  • TNFSF10 the gene encoding TRAIL
  • APRIL the gene encoding APRIL
  • BAFF the gene encoding BAFF
  • Example 3 Evaluation of anticancer function of stem cells with enhanced efficacy prepared by the culture method of Example 2
  • Alamar Blue analysis was performed.
  • the Alamar Blue assay is a modified form of the MTT assay. After treating living cells with a compound that is degraded by a specific enzyme, the relative number of living cells after drug treatment is confirmed by measuring the fluorescence intensity of the product that is released as the compound is decomposed.
  • the cell growth inhibitory effect on the cancer cell line of the mesenchymal stem cells with enhanced efficacy prepared by the culture method of Example 2 was confirmed.
  • the mesenchymal stem cells with enhanced efficacy are mesenchymal stem cells (MSC SIS CP (I) ) cultured by the culture method of Example 2 and pretreated with IFN- ⁇ in the stimulant treatment step.
  • the cancer cell lines used in this experiment were human acute T lymphocytic leukemia cell line (Jurkat), human liver cancer cell line (HepG2, Hep3b), human lung cancer cell line (A549), human breast cancer cell line (MBA-MB-231), and human colorectal cancer cell line (HCT116). )to be.
  • 4.0 ⁇ 10 4 cancer cells per well were dispensed in a 24-well plate, and mesenchymal stem cells with enhanced efficacy prepared by the culturing method of Example 2, which inhibited growth with MMC 0.4 mm pores (Corning Inc.) were plated at a density of 1 ⁇ 10 4 cells in the inserted transwell, and cultured at 37° C. in a humid atmosphere containing 5% CO 2 for 72 hours.
  • a 24-well plate After adding Alamar Blue reagent corresponding to 1/10 of the amount of the culture solution to the cell culture solution filled in each well, the plate was incubated in an incubator for 2 hours. To evenly react the cells in each well, shake the plate slowly and measure the fluorescence intensity at 600 nm while irradiating light at a wavelength of 570 nm with a Fluorescence Microplate Reader (Molecular Devices Corp.) to determine the cell viability. Confirmed. As a control, naive MSCs that were not subjected to the S-I-S culture method were used. The results of confirming the cell viability are shown in FIG. 2 .
  • MSC SIS mesenchymal stem cell
  • mesenchymal stem cells with enhanced anticancer efficacy through the culturing method of the present invention, and confirmed their anticancer efficacy against various carcinomas such as acute T lymphocytic leukemia, liver cancer, lung cancer, breast cancer and colorectal cancer did Therefore, mesenchymal stem cells with enhanced anticancer efficacy can be used in various ways in the field of cancer treatment and prevention.

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Abstract

본 발명은 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항암 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물은 다양한 암종에서 세포 증식을 억제하는 효과를 가지고 있는바, 암 예방 또는 치료 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

Description

효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 항암용 조성물
본 발명은 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.
줄기세포란 특정한 세포로 분화가 진행되지 않은 채 유지되다가, 필요한 경우 신경, 혈액, 연골 등 신체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화할 능력을 가진 세포를 말한다. 이러한 줄기세포를 얻을 수 있는 방법은 크게 두가지가 있는데, 첫째는 수정란으로부터 발생한 태아로부터 얻는 것(배아줄기세포)이고 둘째는 성인이 된 우리 몸의 각 부분에 간직되어 있는 줄기세포(성체줄기세포)를 회수하는 것이다. 기능적인 면에서 차이는 있지만 배아줄기세포나 성체줄기세포는 모두 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 특징을 가지고 있다.
특히, 인간 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)는 다양한 조직에서 유래될 수 있으며, 세포 기반 이식 또는 재생 의약 치료에 있어서 강력한 후보자이다. 손상된 조직으로의 이동, 면역 억제기능, 자가-재생, 및 다분화능과 같은 MSCs의 특징은 이의 치료적 적용의 가능성을 연다. 현재, MSCs의 주입, 또는 이식을 포함하는 500 여개의 임상이 clinicaltrials.gov에 등록되어 있다. 그러나 대부분의 임상 1 상은 생물학적 안정성 문제를 나타내지 않음에도 불구하고, 그 이상의 임상단계에서는 미비한 결과가 도출되고 있다.
이에 본 발명자들은 항암 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은, 항암 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, PD-L1, CXCR7, PGES 및 PGDS로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증가된 항암 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 처리하는 단계;를 포함하는 암 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) PD-L1 또는 CXCR7 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 줄기세포를 선별하는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 선별된 줄기세포를 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 배양된 줄기세포에 자극제를 처리하여 항암 효능이 증진된 줄기세포를 제조하는 단계;를 포함하는 항암 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 방법으로 제조된 항암 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 PD-L1, CXCR7, PGES 및 PGDS로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증가된 항암 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 항암 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하고, 상기 항암 효능이 증진된 줄기세포는 (a) PD-L1 또는 CXCR7 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 줄기세포를 선별하는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 선별된 줄기세포를 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 배양된 줄기세포에 자극제를 처리하는 단계;를 통해 제조되는 것인, 암 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한 본 발명은 항암 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하고, 상기 항암 효능이 증진된 줄기세포는 PD-L1, CXCR7, PGES 및 PGDS로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 것인, 암 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에 따른 항암 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물은 다양한 암종에서 세포 증식을 억제하는 효과를 가지고 있는바, 암 예방 또는 치료 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 마이크로 어레이를 통해 본 발명의 배양방법으로 제조된 항암 효능이 증진된 중간엽 줄기세포에서 대조군인 naive MSC에 비해 발현이 증가된 인자를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 배양방법으로 제조된 항암 효능이 증진된 중간엽 줄기세포의 항암 효과를 확인한 것으로, naive MSC와 본 발명에 따른 배양방법에 의해 제조된 MSC의 다양한 암 세포주(인간 급성 T 림프성 백혈병 세포주(Jurkat), 인간 간암 세포주(HepG2, Hep3b), 인간 폐암 세포주(A549), 인간 유방암 세포주(MBA-MB-231) 및 인간 대장암 세포주(HCT116)에서 세포의 생존율을 측정하여 항암 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 항암 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법; 및 상기 방법으로 제조된 조성물;을 제공한다.
상기 항암 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법은 (a) PD-L1 또는 CXCR7 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 줄기세포를 선별하는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 선별된 줄기세포를 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 배양된 줄기세포에 자극제를 처리하여 항암 효능이 증진된 줄기세포를 제조하는 단계;를 포함한다.
또한 본 발명은 상기 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 줄기세포(stem cell)는 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 상기 줄기세포는 성체줄기세포, 만능줄기세포, 유도만능줄기세포 또는 배아줄기세포를 포함한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포인, 항암 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 성체줄기세포는 골수, 혈액, 피부, 지방, 뇌, 제대, 제대혈, 치주, 양막, 융모막, 탈락막, 태반 또는 와튼 젤리로부터 유래된 것이 바람직하다.
본 발명의 보다 바람직한 구체예에서, 상기 줄기세포는 인간 제대 유래의 중간엽 줄기세포일 수 있다.
본 발명에서 있어서, 중간엽 줄기세포는 인간 또는 포유류의 조직으로부터 분리해 낸 미분화된 줄기세포이다. 중간엽 줄기세포는 다양한 조직에서 유래할 수 있으며, 특히 골수, 혈액, 피부, 지방, 뇌, 제대, 제대혈, 치주, 양막, 융모막, 탈락막, 태반 또는 와튼 젤리로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상으로부터 유래할 수 있다. 각 조직에서 줄기세포를 분리하는 기술은 당해 업계에 이미 공지되어 있다.
상기 중간엽 줄기세포는 자가, 타가 또는 동종이형의 골수, 혈액, 피부, 지방, 뇌, 제대, 제대혈, 치주, 양막, 융모막, 탈락막, 태반 또는 와튼 젤리로 구성된 군에서 선택되는 것으로부터 유래될 수 있다. 또한, 상기 중간엽 줄기세포는 인간, 태아, 또는 인간을 제외한 포유동물로부터 유래될 수 있다. 상기 인간을 제외한 포유동물은 보다 바람직하게는 개과 동물, 고양이과 동물, 원숭이과 동물, 소, 양, 돼지, 말, 랫트, 마우스 또는 기니피그 등일 수 있으며, 그 유래를 제한하지 않는다.
본 발명에 있어서, 선별은 어떤 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 여부 및 발현량에 따라 세포를 골라내는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, PD-L1(Programmed death-ligand 1)은 인간에서 CD274 유전자에 의해 암호화되는 막 관통 단백질을 의미하며, 임신, 조직 동종 이식, 자가 면역 질환 및 간염의 치료에 있어서 면역계를 억제하는데 중요한 역할을 한다. 상기 PD-L1은 림프절에서 항원 특이적 T 세포의 증식을 감소시키는 신호를 전달하는 동시에, 세포자살(apoptosis)를 증가시킨다.
본 발명에 있어서, CXCR7(C-X-C chemokine receptor type 7)은 ACKR3(G-protein coupled receptor 159) 및 GPR159(Atypical chemokine receptor 3)로도 알려진 케모카인 수용체를 의미한다.
본 발명에 있어서, PGES(prostaglandin E2 synthase)는 MAPEG(Membrane-Associated Proteins in Eicosanoid and Glutathione metabolism) 계통인 에이코사노이드(eicosanoid) 및 글루타치온(glutathione)의 대사에 관여하는 효소를 의미한다. 보다 상세하게는 상기 PGES는 PGH2(Prostaglandin H2)로부터 PGE(prostaglandin E)를 생성한다.
본 발명에 있어서, PGDS(Prostaglandin-D synthase)는 시그마 클래스 글루타치온-S-트랜스퍼레이즈 패밀리에 속하는 효소를 의미한다. 상기 PGDS는 PGH2가 PGD2(Prostaglandin-D)로 전환되는 것을 촉매하고, 면역계와 비만 세포에서 프로스타노이드 생성에 관여한다. 또한 PGDS의 존재는 인간 거핵세포(megakaryocyte)의 분화 단계를 확인하는 데에 이용된다.
본 발명에 있어서, IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase)는 인간에서 IDO 1 유전자에 의해 암호화되는 헴-함유 효소(heme-containing enzyme)를 의미한다. IDO는 T 세포의 기능을 제한하고, 면역 내성의 메커니즘은 제어하는 능력을 통해 면역 조절에 관여한다.
본 발명에 있어서, CXCL9(Chemokine(C-X-C motif) ligand 9)는 감마-인터페론에 의해 유도된 모노키틴으로도 알려져 잇으며, CXC 케모카인에 속하는 작은 사이토카인이다. 상기 CXCL9는 감마-인터페론에 의해 유도되는 T 세포 화학유인물질(T-cell chemoattractant)이다.
본 발명에 있어서, CXCL10(Chemokine(C-X-C motif) ligand 10)은 IP-10(Interferon gamma-induced protein 10) 또는 small-inducible cytokine B10으로 알려져 있는, 인간에서 CXCL10 유전자에 의해 코딩되는 8.7 kDa의 단백질을 의미한다. CXCL10은 C-X-C 케모카인 계통에 속하는 작은 사이토카인이다
본 발명의 구체예에서, 상기 단계 (a)의 선별된 줄기세포는 BD2(Beta-defensin 2) 또는 LL-37(Cathelicidin antimicrobial peptides (CAMP) LL-37) 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 추가 증진된 것이 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 단계 (b)의 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 것은 배양 밀도로 표현 시 90% 이상의 컨플루언트(confluent) 상태를 유지하되, 세포의 형태가 유지되며, 세포가 겹치지 않는 수준으로 배양되는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 3,000 내지 20,000 cells/cm2의 밀도로 시딩한 후 3 내지 5일 동안 배양하는 것일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 자극제는 IFN-γ, TNF-α 및 폴리IC(Poly IC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것이 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 단계 (b)의 줄기세포는 CXCR7(C-X-C chemokine receptor type 7), PGES(prostaglandin E2 synthase) 및 PGDS(Prostaglandin-D synthase)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 것이 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 항암 효능이 증진된 줄기세포는 (i) PD-L1, CXCR7, PGES 및 PGDS로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진되고, (ii) IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase), CXCL9(Chemokine(C-X-C motif) ligand 9), CXCL10(Chemokine(C-X-C motif) ligand 10), HLA-G(human leukocyte antigen G), ICAM1(Intercellular Adhesion Molecule 1), VCAM1(vascular cell adhesion molecule 1), IL18BP(Interleukin-18-binding protein), RARRES3(Retinoic acid receptor responder protein 3), CCL8(C-C motif ligand 8), CCL13(C-C motif ligand 13), TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand), APRIL(A proliferation-inducing ligand), BAFF(B-cell activating factor), HLA-DRA(HLA class II histocompatibility antigen-DR alpha chain), CD74(Cluster of Differentiation 74), GBP1(Guanylate-binding protein 1), GBP2(Guanylate-binding protein 2), GBP4(Guanylate-binding protein 4), GBP5(Guanylate-binding protein 5), PGE2(Prostaglandin E2) 및 IFN-beta(Interferon-beta)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 것이 바람직하다.
특히, 전술한 인자 중 TRAIL, APRIL 및 BAFF 단백질; 및 이를 코딩하는 유전자;는 당업계에서 항암 기능과 깊은 관련성이 있다고 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (a) 내지 (c)는 각각 선별(selection), 상호작용(interaction) 및 자극(stimulation) 단계를 의미하며, 각 단계는 순차적으로 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 암은 위암(gastric cancer), 유방암(breast cancer), 폐암(lung cancer), 간암(liver cancer), 혈액암(blood cancer), 급성 백혈병(acute leukemia), 뼈암(bone cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 피부암(skin cancer), 머리 또는 목암(head or neck cancer), 피부 또는 안구 흑색종(cutaneous or intraocular melanoma), 자궁육종(uterine sarcoma), 난소암(ovarian cancer), 직장암(rectal cancer), 항문암(anal cancer), 대장암(colon cancer), 난관암(fallopian tube carcinoma), 자궁내막암(endometrial carcinoma), 자궁경부암(cervical cancer), 소장암(small intestine cancer), 내분비암(endocrine cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 부갑상선암(parathyroid cancer), 신장암(adrenal cancer), 연조직종양(soft tissue tumor), 요도암(urethral cancer), 전립선암(prostate cancer), 기관지암(bronchogenic cancer) 및 골수암(bone marrow tumor)으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
전술한 방법으로 제조된 항암 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 항암 효능이 증진된 줄기세포와 함께 암에 대하여 예방 또는 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 실제 임상투여 시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있으며, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 이용하는 것이 바람직하다.
상기 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 상기 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 상기 약학적 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어, 0.05 내지 5 mg/kg의 농도로 투여되는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 0.1 내지 0.4 mg/kg, 더욱 바람직하게는 0.2 내지 0.35 mg/kg, 더더욱 바람직하게는 0.25 mg/kg일 수 있으나, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 각각 독립적일 수 있으며, 그 방식에 있어 특별히 제한되지 아니하며, 목적하는 해당 부위에 상기 약학적 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다.
상기 약학적 조성물은 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다. 상기 비경구 투여 방식으로는 예를 들어 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여 또는 피하 투여 등이 포함된다.
본 발명의 약학적 조성물은 암의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 개체는 암이 발병할 것으로 예상되는 개체; 발병한 개체; 또는 완치판정을 받은 개체;일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, PD-L1, CXCR7, PGES 및 PGDS로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증가된 항암 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 암 예방 또는 치료용 조성물을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 암 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 항암 효능이 증진된 줄기세포는 추가 선별 인자인 BD-2 또는 LL-37 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 추가 증진된 것일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 효능이 증진된 줄기세포는 IDO, CXCL9, CXCL10, HLA-G, ICAM1, VCAM1, IL18BP, RARRES3, CCL8, CCL13, TRAIL, APRIL, BAFF, HLA-DRA, CD74, GBP1, GBP2, GBP4, GBP5, PGE2 및 IFN-beta로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 추가 증진된 것이 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 개체는 암이 발병할 것으로 예상되는 개체; 발병한 개체; 또는 완치판정을 받은 개체;일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 양태에 따른 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 항암 효능이 naive 줄기세포에 비해 현저히 증진된 것으로, 암의 예방 및 치료 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 실험 재료 준비
1-1. 인간 제대 채취
출산 직후에 바로 수집된 제대 조직을 실험실로 옮기기 전 세척하고, 이송용 배지(50 IU/㎖의 페니실린, 50 ㎍/㎖의 스트렙토마이신(Invitrogen으로부터 구매))가 첨가된 F-12 배지를 포함하는 500㎖의 멸균 유리병으로 옮긴 후, 멸균상태의 플로우 후드에서 줄기세포의 추출을 진행하였다. 먼저, 시료는 멸균 스테인리스 스틸의 용기로 옮겨진 후, PBS로 수차례 세정한 후 2 cm 길이로 잘라 10 cm 지름의 세포배양 접시로 옮겨지며, 추가적인 세정 및 70%(v/v) 에탄올에 의해 항감염 처리를 진행하고, 항생제 혼합물(50 IU/㎖의 페니실린, 50 ㎍/㎖의 스트렙토마이신 (Invitrogen으로부터 구매))이 첨가된 PBS로 상기 용액이 깨끗해질 때까지 수차례 세정하여 사용하였다.
1-2. 인간 제대 조직으로부터 줄기세포 분리 및 배양
제대의 혈관 및 기타 내부요소들로부터 와튼젤리(제대의 기질)를 분리하기 위해 제대조직을 절개한 후, 혈관을 제거하여 와튼젤리를 분리하였다. 세포 추출을 위해 상기 분리된 와튼젤리를 작은 조각(0.5 cm×0.5 cm)으로 잘랐다. 분리된 조직의 배양은 중간엽 줄기세포의 추출에 적합한 세포 배양 조건에 맞추어 수행하였다.
중간엽 줄기세포의 분리 및 배양을 위해 상기 외식된 조직을 10% FBS가 첨가된 5 ml의 MEM-α(Minimum essential medium-alpha, Gibco), 10% FBS 및 1% antibiotics-antimycotic에 함침시킨 후 이산화탄소 세포배양기에서 37℃ 온도로 배양하였다. 이때, 배지는 매 3일 또는 4일 마다 교체하였으며 세포의 성장(outgrowth)은 광학현미경으로 모니터링하였다. 신장하는 세포들은 추가적인 확장 및 냉동보관(MEM-α, 10% FBS)을 위해 트립신처리(0.125% 트립신/0.05% EDTA)하였으며, 상기 배지는 매 3일 또는 4일마다 교체되었다. 외식된 조직으로부터의 세포의 신장(outgrowth)은 광학현미경으로 모니터링하였다.
중간엽 줄기세포의 추출을 위해, 세포의 펠렛은 배지(MEM-α(Gibco), 10% FBS, 1% Antibiotics-antimycotic)에 재현탁 및 카운트되었으며, T75 조직배양 플라스크에 접종되었다. 상기 배지는 매 3일 또는 4일마다 교환되었다. 세포의 성장(growth) 및 클론형성은 광학현미경으로 모니터링되었다. 약 90%의 세포수(confluence)에서, 세포들은 상기에 설명된 바와 같이 서브-배양(sub-culture)되었다.
이러한 세포들은 in vitro에서 지방세포, 연골세포, 골세포 등으로의 분화능 및 중간엽 줄기세포를 특정하는 표면 항원(CD44/CD105, >95% positive; CD31/CD45, >95% negative) 존재 유무를 확인하였다.
1-3. 암세포주의 확보 및 배양
인간 급성 T 림프성 백혈병 세포주(Jurkat), 인간 간암 세포주(HepG2, Hep3b), 인간 폐암 세포주(A549), 인간 유방암 세포주(MBA-MB-231) 및 인간 대장암 세포주(HCT116)를 American Type Culture Collection으로부터 얻어 배양하였다. 모든 세포들은 항생제 및 10% FBS로 보충하고, 5% CO2를 함유하는 습한 대기에서 37℃ 온도조건 하에 배양하였다.
실시예 2. 효능이 증진된 중간엽 줄기세포 제조를 위한 S-I-S(Selection-Interaction-Stimulation) 배양방법
2-1. PD-L1 및 CXCR7 단백질 발현이 증진된 중간엽 줄기세포 선별 단계(Selection stage)
2-1-1. 중간엽 줄기세포에서 PD-L1 및 CXCR7 단백질 발현 분석
실시예 1의 인간 제대 조직으로부터 분리된 중간엽 줄기세포 중 PD-L1 및 CXCR7 단백질의 발현이 증진된 세포를 선별하였다. 구체적으로, 실시예 1의 중간엽 줄기세포를 세포 간 상호작용이 가능하도록 컨플루언트하게 배양하였다. 배양된 중간엽 줄기세포에서 PD-L1 및 CXCR7 단백질의 발현을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 또한 추가 선별 인자로서 BD-2 및 LL-37 단백질의 발현을 확인하였다.
실시예 1-2에 의해 분리 및 배양된 중간엽 줄기세포 중 PD-L1, CXCR7, BD-2 및 LL-37 단백질의 발현이 증진된 세포를 확인 및 선별하였으며, 이를 다음 실험에 사용하였다.
2-1-2. PD-L1 및 CXCR7 단백질 발현이 증진된 중간엽 줄기세포의 계대 배양 및 동결
선별된 PD-L1, CXCR7, BD-2 및 LL-37 단백질 발현이 증진된 중간엽 줄기세포를 계대 배양하였다. 구체적으로 상기 중간엽 줄기세포를 실시예 1-2의 중간엽 줄기세포 배양배지와 조직배양 플라스크에 넣어 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 이 때, 배양배지에 bFGF를 첨가하였다. 계대 배양 중 각 세대의 중간엽 줄기세포를 동결시켰다. 또한 계대 배양 및 동결 시 중간엽 줄기세포의 형태 및 세포증식율을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
PD-L1, CXCR7, BD-2 및 LL-37 단백질 발현이 증진된 중간엽 줄기세포는 계대 배양 중에도 중간엽 줄기세포의 특성이 유지되며, 세포 증식율이 유지 또는 증가하는 것을 확인하였다.
PD-L1, CXCR7, BD-2 및 LL-37 단백질 발현이 증진된 중간엽 줄기세포는 동결 및 해동 시에도 중간엽 줄기세포의 특성이 유지되며, 세포 증식율이 유지 또는 증가하는 것을 확인하였다.
2-2. 선별 단계에서 선별된 중간엽 줄기세포에서 CXCR7, PGES 및 PGDS 단백질 발현이 증진된 중간엽 줄기세포의 상호작용 단계(Interaction stage)
실시예 2-1의 선별 단계에서 선별된 중간엽 줄기세포 중 CXCR7, PGES 및 PGDS 단백질의 발현이 증진된 세포를 추가 선별 단계에서 선별하였다. 구체적으로, ‘세포 간 상호작용이 가능하도록 배양’은 배양 밀도로 표현 시 90% 이상의 컨플루언트(confluent) 상태를 유지하되, 세포의 형태가 유지되며, 세포가 겹치지 않는 수준으로 배양되는 것을 의미한다. 상기 실시예 2-1의 선별 단계에서 선별된 중간엽 줄기세포를 세포 간 상호작용이 가능하도록 3,000 내지 20,000 cells/cm2의 밀도로 시딩한 후 3 내지 5일 동안 배양한 후 수확하였다. 수확된 중간엽 줄기세포에서 CXCR7, PGES 및 PGDS 단백질의 발현을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
실시예 2-1의 선별 단계에서 선별된 중간엽 줄기세포를 상호작용이 가능하도록 배양한 후 이들 중 CXCR7, PGES 및 PGDS 단백질의 발현이 증진된 세포를 확인 및 선별하였으며, 선별된 세포를 다음 실험에 사용하였다.
2-3. 선별된 중간엽 줄기세포에 면역 자극제를 처리하는 프라이밍 단계 (Stimulation stage)
실시예 2-2의 추가 선별 단계에서 선별된 중간엽 줄기세포에 면역 자극제인 IFN-γ, TNF-α 또는 폴리IC(Polyinosinic:polycytidylic acid, Poly I:C)를 처리하거나 상기 자극제를 혼합하여 자극하였다. 마이크로 어레이를 통해 면역 자극제를 처리한 중간엽 줄기세포(즉, S-I-S 배양방법으로 배양된 중간엽 줄기세포)의 유전자 발현을 분석하였다. 면역 자극제를 처리한 중간엽 줄기세포에서 발현이 증가된 유전자의 분석 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 면역 자극제를 처리한 중간엽 줄기세포는 IDO, PD-L1, CXCL9, CXCL10, CXCR7, PGES, PGDS, HLA-G, ICAM1, VCAM1, IL18BP, RARRES3, CCL8, CCL13, TRAIL, APRIL, BAFF, HLA-DRA, CD74, GBP1, GBP2, GBP4, GBP5 및 IFN-beta 단백질을 코딩하는 유전자; 및 PGE2 단백질;의 발현이 증가된 것을 확인하였다. 상기 PD-L1, TRAIL, APRIL 및 BAFF 단백질을 코딩하는 유전자는 각각 CD274, TNFSF10, TNFSF13 및 TNFSF13B로 표시된다. 특히, 상기 면역 자극제로 자극된 중간엽 줄기세포는 항암 기능 관련 인자인 TRAIL을 코딩하는 유전자(TNFSF10), APRIL을 코딩하는 유전자(TNFSF13) 및 BAFF를 코딩하는 유전자(TNFSF13B)의 발현이 증가한 것을 알 수 있다.
이하, 실험에서는 면역 자극제 처리로 부스팅된 줄기세포를 이용하였다.
실시예 3. 실시예 2의 배양방법으로 제조된 효능이 증진된 줄기세포의 항암 기능 평가
상기 실시예 2에 의한 배양방법으로 제조된 효능이 증진된 중간엽 줄기세포의 항암 능력을 확인하기 위해 다양한 암세포와 공동배양 후, Alamar Blue 분석을 시행하였다. Alamar Blue 분석은 MTT 분석의 변형된 형태로서, 특정 효소에 의해서 분해되는 화합물을 살아있는 세포에 처리한 후 화합물이 분해되면서 나오는 생성물의 형광 세기를 측정함으로써 약물을 처리한 후 살아있는 세포의 상대적인 숫자를 확인할 수 있다.
상기 실시예 2의 배양 방법으로 제조된 효능이 증진된 중간엽 줄기세포의 암세포주에 대한 세포 성장 억제효과를 확인하였다. 상기 효능이 증진된 중간엽 줄기세포는 실시예 2의 배양방법으로 배양하고 자극제 처리 단계에서 IFN-γ를 전처리한 중간엽 줄기세포(MSCS-I-S CP (I))이다. 본 실험에서 사용한 암세포주는 인간 급성 T 림프성 백혈병 세포주(Jurkat), 인간 간암 세포주(HepG2, Hep3b), 인간 폐암 세포주(A549), 인간 유방암 세포주(MBA-MB-231) 및 인간 대장암 세포주(HCT116)이다. 구체적으로, 공동배양을 위해 24 웰 플레이트에 각 웰 당 4.0×104 개의 암 세포를 분주하고, MMC로 성장을 억제시킨 실시예 2의 배양 방법으로 제조된 효능이 증진된 중간엽 줄기세포를 0.4mm 포어(Corning Inc.)가 삽입된 트랜스웰에 1×104 세포 밀도로 플레이팅하고, 72시간 동안 5% CO2를 함유하는 습한 대기에서 37℃ 온도조건 하에 배양하였다.
24-웰 플레이트에서 각 웰에 채워진 세포 배양액에 배양액양의 1/10에 해당하는 Alamar Blue 시약을 첨가한 후 플레이트를 인큐베이터에서 2시간 동안 배양하였다. 각 웰의 세포를 고르게 반응시키기 위하여 플레이트를 천천히 흔들고, 570 ㎚의 파장에서 조사광을 조사하면서 600 ㎚에서 형광 세기를 형광광도계(Fluorescence Microplate Reader; Molecular Devices Corp.)로 측정하여, 세포의 생존율을 확인하였다. 대조군으로는 S-I-S 배양방법을 수행하지 않은 naive MSC를 이용하였다. 세포의 생존율을 확인한 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, naive MSC 처리군보다 실시예 2에 의한 배양방법으로 제조된 효능이 증진된 중간엽 줄기세포(MSCS-I-S) 처리군에서 암세포의 세포 생존율 억제 효과가 높은 것을 확인하였다. 상기 결과는 MSCS-I-S가 급성 T 림프성 백혈병, 간암, 폐암, 유방암 및 대장암 등과 같은 다양한 암종에 대하여 현저한 항암 효과가 있음을 의미한다.
종합적으로 본 발명자들은 본 발명의 배양방법을 통해 항암 효능이 증진된 중간엽 줄기세포를 제조하고, 이의 급성 T 림프성 백혈병, 간암, 폐암, 유방암 및 대장암 등과 같은 다양한 암종에 대한 항암 효능을 확인하였다. 따라서 항암 효능이 증진된 중간엽 줄기세포는 암의 치료 및 예방 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (16)

  1. (a) PD-L1(Programmed death-ligand 1) 또는 CXCR7(C-X-C chemokine receptor type 7) 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 줄기세포를 선별하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 선별된 줄기세포를 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)에서 배양된 줄기세포에 자극제를 처리하여 항암 효능이 증진된 줄기세포를 제조하는 단계;
    를 포함하는 항암 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포인, 항암 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 성체줄기세포는 골수, 혈액, 피부, 지방, 뇌, 제대, 제대혈, 치주, 양막, 융모막, 탈락막, 태반 또는 와튼 젤리로부터 유래된 것인, 항암 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)의 선별된 줄기세포는 BD2(Beta-defensin 2) 또는 LL-37(Cathelicidin antimicrobial peptides (CAMP) LL-37) 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 추가 증진된 것인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)의 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 것은 배양 밀도로 표현 시 90% 이상의 컨플루언트(confluent) 상태를 유지하되, 세포의 형태가 유지되며, 세포가 겹치지 않는 수준으로 배양하는 것인, 항암 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 단계 (b)는 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 것은 3,000 내지 20,000 cells/cm2의 밀도로 시딩한 후 3 내지 5일 동안 배양하는 것인, 항암 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 자극제는 IFN-γ, TNF-α 및 폴리IC(Poly IC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 항암 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)의 줄기세포는 CXCR7, PGES(prostaglandin E2 synthase) 및 PGDS(Prostaglandin-D synthase)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 것인, 항암 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 항암 효능이 증진된 줄기세포는,
    (i) PD-L1, CXCR7, PGES 및 PGDS로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진되고,
    (ii) IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase), CXCL9(Chemokine(C-X-C motif) ligand 9), CXCL10(Chemokine(C-X-C motif) ligand 10), HLA-G(human leukocyte antigen G), ICAM1(Intercellular Adhesion Molecule 1), VCAM1(vascular cell adhesion molecule 1), IL18BP(Interleukin-18-binding protein), RARRES3(Retinoic acid receptor responder protein 3), CCL8(C-C motif ligand 8), CCL13(C-C motif ligand 13), TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand), APRIL(A proliferation-inducing ligand), BAFF(B-cell activating factor), HLA-DRA(HLA class II histocompatibility antigen-DR alpha chain), CD74(Cluster of Differentiation 74), GBP1(Guanylate-binding protein 1), GBP2(Guanylate-binding protein 2), GBP4(Guanylate-binding protein 4), GBP5(Guanylate-binding protein 5), PGE2(Prostaglandin E2) 및 IFN-beta(Interferon-beta)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 것인, 항암 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 암은 위암(gastric cancer), 유방암(breast cancer), 폐암(lung cancer), 간암(liver cancer), 혈액암(blood cancer), 급성 백혈병(acute leukemia), 뼈암(bone cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 피부암(skin cancer), 머리 또는 목암(head or neck cancer), 피부 또는 안구 흑색종(cutaneous or intraocular melanoma), 자궁육종(uterine sarcoma), 난소암(ovarian cancer), 직장암(rectal cancer), 항문암(anal cancer), 대장암(colon cancer), 난관암(fallopian tube carcinoma), 자궁내막암(endometrial carcinoma), 자궁경부암(cervical cancer), 소장암(small intestine cancer), 내분비암(endocrine cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 부갑상선암(parathyroid cancer), 신장암(adrenal cancer), 연조직종양(soft tissue tumor), 요도암(urethral cancer), 전립선암(prostate cancer), 기관지암(bronchogenic cancer) 및 골수암(bone marrow tumor)으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상인, 항암 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된, 항암 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물.
  12. PD-L1, CXCR7, PGES 및 PGDS로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증가된 항암 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 항암 효능이 증진된 줄기세포는 BD-2 또는 LL-37 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 추가 증진된 것인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 항암 효능이 증진된 줄기세포는 IDO, CXCL9, CXCL10, HLA-G, ICAM1, VCAM1, IL18BP, RARRES3, CCL8, CCL13, TRAIL, APRIL, BAFF, HLA-DRA, CD74, GBP1, GBP2, GBP4, GBP5, PGE2 및 IFN-beta로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 추가 증진된 것인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 항암 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하고,
    상기 항암 효능이 증진된 줄기세포는
    (a) PD-L1 또는 CXCR7 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 줄기세포를 선별하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 선별된 줄기세포를 세포 간 상호작용이 가능하도록 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)에서 배양된 줄기세포에 자극제를 처리하는 단계;를 통해 제조되는 것인,
    암 예방 또는 치료방법.
  16. 항암 효능이 증진된 줄기세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하고,
    상기 항암 효능이 증진된 줄기세포는 PD-L1, CXCR7, PGES 및 PGDS로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증진된 것인,
    암 예방 또는 치료방법.
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