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WO2022003063A1 - Construction d'adn pour le traitement de pathologies oculaires - Google Patents

Construction d'adn pour le traitement de pathologies oculaires Download PDF

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WO2022003063A1
WO2022003063A1 PCT/EP2021/068085 EP2021068085W WO2022003063A1 WO 2022003063 A1 WO2022003063 A1 WO 2022003063A1 EP 2021068085 W EP2021068085 W EP 2021068085W WO 2022003063 A1 WO2022003063 A1 WO 2022003063A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sequence
protein
seq
nucleotide sequence
sequence seq
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/EP2021/068085
Other languages
English (en)
Inventor
Thierry Bordet
Elise ORHAN
Karine Bigot
Ronald BUGGAGE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
EYEVENSYS
Original Assignee
EYEVENSYS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to IL299487A priority Critical patent/IL299487A/en
Priority to EP21737667.2A priority patent/EP4171636A1/fr
Priority to CN202180047366.2A priority patent/CN115768486A/zh
Priority to US18/003,585 priority patent/US20240189448A1/en
Priority to JP2022580806A priority patent/JP7766054B2/ja
Priority to CA3182197A priority patent/CA3182197A1/fr
Priority to KR1020237002892A priority patent/KR20230028509A/ko
Priority to AU2021298865A priority patent/AU2021298865A1/en
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Definitions

  • the present invention relates to a novel DNA construct as well as its use in the treatment of ocular pathologies by non-viral gene therapy.
  • a method according to the invention relates more particularly to said DNA construct allowing the targeted intraocular production of two therapeutic proteins for a period which can range up to several months.
  • the DNA construct and its use according to the invention are more particularly suitable for the treatment of pathologies of the retina by means of an injection of the DNA construct into the ciliary muscle followed by an electrotransfer for intraocular production and long-lasting therapeutic proteins of interest.
  • AMD age-related macular degeneration
  • RD diabetic retinopathies
  • Tuvéitis glaucoma
  • retinitis pigmentosa hemorrhages resulting from ocular trauma and retinal detachment.
  • AMD age-related macular degeneration
  • DR diabetic retinopathies
  • Tuvéitis represents a group of inflammatory eye diseases whose prevalence is estimated at 1/1000 and the incidence at 0.5 / 1000.
  • Uveitis is responsible for 10% of blindness cases and therefore, although rarer than previous illnesses, has a major social and economic impact in young patients of working age.
  • Glaucoma is the second leading cause of irreversible blindness worldwide. The number of people with glaucoma worldwide is expected to increase from 76 million in 2020 to 111 million in 2040.
  • Glaucoma is characterized by abnormal intraocular pressure inducing progressive optic neuropathy characterized by degeneration retinal ganglion cells and loss of visual field. Intraocular pressure is currently the only risk factor for which there are treatments. However, glaucomatous damage persists in almost 50% of patients, despite a drop in intraocular pressure.
  • Retinitis pigmentosa represents a clinically and genetically heterogeneous group of inherited disorders of the retina characterized by a progressive loss of photoreceptors at the periphery of the retina which then progresses to the macula. Visual impairment usually manifests as night blindness and progressive loss of visual field. Its prevalence is 1/3000 to 1/5000. More than 50 genes responsible for retinitis pigmentosa have been identified to date.
  • the first anti-VEGF-type therapeutic proteins for Vascular Endothelial Growth Factor
  • the first anti-VEGF-type therapeutic proteins were administered intraocularly for the treatment of choroidal neovascularization in AMD.
  • Lucentis® ranibizumab
  • Intraocular injections of therapeutic proteins, and in particular of recombinant proteins have since become common for the treatment of macular edema, AMD, diabetic retinopathy and venous obstructions.
  • the anti-VEGFs described above are administered once a month or at best once every two months depending on the patient. There is therefore a need to monitor each patient to determine the frequency of administration of anti-VEGF for the treatment to be fully effective.
  • This monitoring creates a significant constraint for the patients, the caregivers as well as for the caregivers which most often results in a suboptimal and ineffective treatment in the long term (Ciulla 2020, Ophthalmology Retina 2020; 4: 19-30).
  • this method of treatment induces variations in the level of therapeutic protein in the eye sphere of the patient, namely a high concentration during the injection (a peak) and a concentration which gradually diminishes to tend towards zero. until the next injection.
  • the concentration of therapeutic protein is therefore not regular and is not optimal for the entire duration of treatment.
  • the risk of side effects associated with intravitreal administration increases with repeated administration (Schargus 2020, Clinical Ophthalmology 2020: 14 897-904).
  • uveitis is defined as an inflammatory process that affects the iris, ciliary body or choroid of the patient's eye, these three elements forming uvea. It is a generic term that covers several different pathologies whose causes remain unknown but are generally of two types: infectious uveitis and non-infectious uveitis.
  • infectious uveitis which affects the iris or the ciliary body and is the most common uveitis in western countries, intermediate uveitis which affects the anterior vitreous, and posterior uveitis which affects the choroid and the retina.
  • Non-infectious uveitis often has an autoimmune component.
  • Acute anterior uveitis associated with the HLA-B27 antigen is the primary cause of uveitis (Rothova et a 1., Br J Ophthalmol. 1992; 76: 137-41).
  • uveitis associated with many rheumatic diseases such as sarcoidosis.
  • Posterior uveitis of non-infectious cause is most often associated with Behçet's disease, Vogt Koyanagi Harada disease, Birdshot chorio-retinopathy, etc.
  • Treatment with oral and / or topical corticosteroids is widely used in the treatment of non-infectious posterior uveitis.
  • immunosuppressants can be added to the treatment to increase the anti-inflammatory effects of corticosteroids.
  • This concerns in particular but not exclusively cyclosporine, methotrexate, G azathioprine, mycophenolate mofetil, tacrolimus and chlorambucil.
  • treatments using anti-TNF alpha antibodies have also been used, including Humira® (Adalimumab) recently approved for the treatment of non-infectious uveitis with inflammation of the back of the eye.
  • the treatment methods described above therefore have several drawbacks.
  • the therapeutic compounds administered systemically and topically cause a large number of side effects.
  • Recombinant proteins administered by intravitreal injections should be administered frequently with large fluctuations in concentrations between each administration. The repetition of these injections remains extremely heavy and stressful for the patients and can also cause side effects. (increased intraocular pressure, intraocular inflammation, endophthalmitis, cataracts, etc.). Thus, in the end, many patients forgo their treatment.
  • the inventors have previously proposed, as illustrated in particular in application FR3031112, to reduce the number and / or the frequency of the surgeon's interventions, and therefore to reduce the invasive aspect of intraocular injections, while ensuring stable and constant production of a therapeutic protein over a period of several months via the implementation of a DNA construct intended for the non-viral transfer of nucleic acids into the muscle cells of the ocular sphere of a patient.
  • This construct comprises an origin of replication, a promoter allowing the expression of G DNA in the ocular sphere of the patient, one or more sequences promoting the expression of DNA in the ocular sphere of the patient, and a polynucleotide encoding a protein therapy selected for its activity in the treatment of ocular pathologies, said construct being brought into the ocular sphere by direct injection into the ciliary muscle followed by an electrotransfer.
  • the treatment of the ocular pathologies mentioned above may however require the use of two therapeutic active ingredients, of a second compound which potentiates the effectiveness of a therapeutic active ingredient, or of a compound consisting of 2 peptide subunits.
  • a composition comprising two types of DNA constructs, distinguished in that a first type allows the expression of the first molecule d. 'interest while a second type allows the expression of the second molecule of interest.
  • the inventors consequently propose, in the context of the present invention, the implementation of a DNA construct comprising the sequences encoding the two proteins of interest. Summary of the invention
  • a first object of the present invention therefore relates to a DNA construct for its use in the treatment of an ocular pathology, said DNA construct being intended for the non-viral transfer of nucleic acids into the muscle cells of the ocular sphere. a patient suffering from said ocular pathology; said DNA construct being characterized in that it comprises:
  • the first therapeutic protein of a DNA construct according to the invention is an anti-VEGF type protein, in particular chosen from the group consisting of S-Fltl, Aflibercept, conbercept, brolucizumab, and in particular of a protein having at least 85% sequence identity with the peptide sequence SEQ ID NO: 3, this protein being more particularly Aflibercept.
  • the first therapeutic protein is encoded by a nucleotide sequence having at least 75% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1, and is more particularly encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 2.
  • the second therapeutic protein of a DNA construct according to the invention is a protein having at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 8, this protein being more particularly decorin .
  • the second therapeutic protein is encoded by a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 6, and in particular by a sequence chosen from the group consisting of the nucleotide sequences SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, more particularly constituted by the sequence SEQ ID NO: 7 and the sequence SEQ ID NO: 1, and in particular the sequence SEQ ID NO: 11.
  • a DNA construct for its use according to the invention is such that:
  • the first nucleotide sequence encodes: - for a protein having at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 3, this protein being more particularly Aflibercept;
  • the origin of replication of a DNA construct as mentioned above is bacterial, and is in particular an origin of replication derived from the natural plasmid R6K of Escherichia coli, in particular the origin of R6K gamma replication of the natural R6k plasmid of Escherichia coli, in particular of sequence SEQ ID NO: 31.
  • the DNA construct according to the invention can be linear or circular in shape, in particular circular in shape.
  • the DNA construct according to the invention is a circular plasmid.
  • the DNA construct is a naked DNA construct.
  • a DNA construct for its use as mentioned above is characterized in that the ocular pathology is retinal degeneration, in particular retinal degeneration selected from the group consisting of macular degeneration related to l 'age (AMD), wet or dry; diabetic retinopathies (DR); retinal venous occlusion, in particular central retinal vein occlusion (CRVO) or branch retinal vein occlusion (OBVR); myopic choroidal neovascularization (CNV); uveitis, especially non-infectious uveitis; retinitis pigmentosa and glaucoma, and more particularly in that the retinal degeneration is selected from the group consisting of age-related macular degeneration (AMD), in particular the neovascular (wet) form of the AMD; reduced visual acuity due to diabetic macular edema (DME); retinal venous occlusion, in particular central retinal vein occlusion (CRVO) or branch retina
  • AMD age
  • Another object of the present invention relates to a DNA construct intended for the non-viral transfer of nucleic acids into the muscle cells of the ocular sphere of a patient for the treatment of ocular pathologies, characterized in that it comprises: (a) an origin of bacterial or prokaryotic, in particular bacterial, replication,
  • said first therapeutic protein being a protein having at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 3, this protein being more particularly G Aflibercept, and
  • a signal peptide allowing the secretion of this first therapeutic protein, in particular a signal peptide of peptide sequence SEQ ID NO: 4, this signal peptide being contiguous with the sequence of the first therapeutic protein, at the N-terminal of said first protein therapeutic;
  • said second therapeutic protein being a protein having at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 8, this protein being more particularly decorin, and
  • a signal peptide allowing the secretion of this first therapeutic protein, in particular a signal peptide of peptide sequence SEQ ID NO: 13, this signal peptide being contiguous with the sequence of the second therapeutic protein, at the N-terminal of said second protein therapeutic;
  • the DNA construction according to the invention is such that: c) the first nucleotide sequence comprises:
  • nucleotide sequence encoding G Aflibercept and in particular a sequence having at least 75% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1, and is in particular the sequence SEQ ID NO: 2;
  • the second nucleotide sequence comprises: a nucleotide sequence encoding decorin, more particularly a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 6, more particularly a sequence chosen from the group consisting of sequences SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, and is in particular the sequence SEQ ID NO: 7 or the sequence SEQ ID NO: 11; and
  • Figure 1 shows a DNA construct according to the invention (Plasmid A).
  • FIG. 2 represents a DNA construct not in accordance with the invention since it encodes only a single therapeutic protein (transferrin - same sequence as that used in Plasmid A), the latter being, just as in Plasmid A , under the control of a CMV type promoter (Plasmid a ').
  • FIG. 3 represents the variation in the concentration of Transferrin of sequence SEQ ID NO: 17 (ordinate: pg / mL) in the eye fluids of rats from 3 to 30 days (abscissa: days post-electrotransfer (D0)) after the administration of a construction, in accordance with the invention (Plasmid A) or of a construction not in accordance with the invention (Plasmid a ') because it only encodes transferrin, the latter being under the control of the same promoter as in plasmid A, in the ciliary muscle of both eyes of said rats.
  • Each group of rats was thus administered a specific construct of the two mentioned.
  • Figure 4 represents the variation of the concentration of anti-TNF-alpha fusion protein of sequence SEQ ID NO: 22 (ordinate: pg / mL) in the eye fluids of rats from 3 to 30 days old (abscissa: days post-electrotransfer (J0)) after the administration of a construct, in accordance with the invention (Plasmid A) in the ciliary muscle of the two eyes of said rats.
  • FIG. 5 shows a DNA construct according to the invention (Plasmid B).
  • FIG. 6 represents a DNA construct not in accordance with the invention since it encodes only a single therapeutic protein (aflibercept - same sequence as that used in Plasmid B, ie sequence SEQ ID NO: 2), that- ci being, just as in Plasmid B, under the control of a promoter of the CAG type (Plasmid b ').
  • Figure 7 represents the variation of the Aflibercept concentration of sequence SEQ ID NO: 3 (ordinate: pg / mL) in the eye fluids of rats from 3 to 21 days (abscissa: days post electrotransfer (D0)) after administration of a construction in accordance with the invention (Plasmid B) or of a construction not in accordance with the invention (Plasmid b ') because it only encodes for aflibercept, the latter being under the control of the same promoter as in plasmid B, in the ciliary muscle of the two eyes of said rats.
  • Each group of rats was thus administered a specific construct among the two mentioned.
  • Figure 8 represents the variation of the concentration of Decorin of sequence SEQ ID NO: 8 (ordinate: pg / mL) in the eye fluids of rats from 3 to 21 days (abscissa: days post electrotransfer (D0)) after administration of a construction according to the invention (Plasmid B) in the ciliary muscle of the two eyes of said rats.
  • Figure 9 shows a DNA construct according to the invention (Plasmid C).
  • Figure 10 represents the percentage of impact presenting a severe leak (grade 3) (ordinate:% Grade 3 CNV Lesions) according to the treatments (abscissa). On the left: vehicle (control). Right: Plasmid C.
  • treating and “treatment” associated with an ocular pathology denote a reduction or even an interruption of said pathology.
  • patient as used in the present text preferably denotes a mammal, including a non-human mammal, and more particularly a human being.
  • first nucleotide sequence and “second nucleotide sequence” are used in the present text in order to allow, when reading it, to clearly distinguish between these two sequences and the proteins which they encode.
  • nucleotide sequences correspond to expression cassettes, each of these cassettes being as defined below.
  • first nucleotide sequence and “second nucleotide sequence” are not, however, intended to indicate the order in which these expression sequences / cassettes are present in a construct according to the invention.
  • first nucleotide sequence in the reading direction of a construct according to the invention, the first nucleotide sequence may be present before the second nucleotide sequence.
  • second nucleotide sequence in the sense of reading a construct according to the invention, the second nucleotide sequence may be present before the first nucleotide sequence.
  • the "first nucleotide sequence” comprises a sequence encoding a first therapeutic protein and a sequence encoding a signal peptide, these sequences being, within the “first nucleotide sequence”, in the order as specifically indicated with respect to each other, namely that the sequence encoding the signal peptide is such that the peptide signal is at the N-terminus of the first therapeutic protein, ie the sequence encoding the signal peptide is 5 'of the sequence encoding the first therapeutic protein.
  • the “second nucleotide sequence” comprises a sequence encoding a second therapeutic protein and a sequence encoding a signal peptide, these sequences being, within the “second nucleotide sequence” , in the order as specifically indicated with respect to each other, namely that the sequence encoding the signal peptide is such that the signal peptide is at the N-terminus of the second therapeutic protein, ie the sequence encoding the peptide signal is 5 'of the sequence encoding the second therapeutic protein.
  • the "percentage identity" between two sequences of amino acids or nucleic acids, within the meaning of the present invention, is determined by comparing the two optimally aligned sequences, through a comparison window.
  • the part of the nucleotide sequence in the comparison window can thus comprise additions or deletions (for example "gaps") with respect to the reference sequence (which does not include these additions or these deletions) so as to obtain a optimal alignment between the two sequences.
  • Percent identity is calculated by determining the number of positions at which an identical amino acid (or identical nucleic base) is observed for the two sequences compared, then dividing the number of positions at which there is identity between the two amino acids. (or between the two nucleic bases) by the total number of positions in the comparison window, then by multiplying the result by one hundred in order to obtain the percentage identity in amino acids (or in nucleotides) of the two sequences between them.
  • Optimal alignment of sequences for comparison can be achieved by computer using known algorithms.
  • an amino acid sequence having for example at least 80% identity in amino acids with a reference amino acid sequence encompasses the amino acid sequences having at least 81%, 82% , 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or at minus 99% amino acid identity with said reference sequence.
  • nucleotide sequence having for example at least 80% nucleotide identity with a reference nucleotide sequence encompasses nucleotide sequences having at least 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or at least 99% identity in nucleotides with said reference sequence.
  • the present invention primarily relates to a DNA construct for its use in the treatment of ocular pathology.
  • This construct is intended for the non-viral transfer of nucleic acids into the muscle cells of the ocular sphere of a patient suffering from said ocular pathology.
  • a DNA construct according to the present invention is characterized in that it comprises (a) a bacterial or prokaryotic origin of replication.
  • such an origin of replication is in particular bacterial and may for example be an origin of replication of the Escherichia coli type, more particularly chosen from the group consisting of an origin of replication obtained from the natural plasmid R6K of Escherichia coli, in particular the R6K gamma origin of replication of the natural R6k plasmid of Escherichia coli; and the pUC OriC origin of replication.
  • origins of replication derived from the natural plasmid R6K of Escherichia coli are in particular defined in patent EP1366176B2.
  • a DNA construct according to the invention is moreover characterized in that it comprises (b) one or more sequence (s) promoting the expression of DNA in the ocular sphere of the patient.
  • sequences promoting the expression of DNA are well known to those skilled in the art, such as, for example, sequences of enhancer type, also called sequences. enhancer or activator sequences. Mention may be made, for example, of the enhancer sequences derived from cytomegalovirus (CMV) and / or from the simian DNA tumor virus SV40.
  • CMV cytomegalovirus
  • a DNA construct according to the invention is moreover also characterized in that it comprises (c) a first nucleotide sequence coding in particular for a first therapeutic protein as well as (f) a second nucleotide sequence coding in particular for a second therapeutic protein , different from the first therapeutic protein.
  • a DNA construct according to the invention comprises only two sequences encoding therapeutic proteins, ie comprises only two expression cassettes, each of these expression cassettes comprising one of the two. sequences encoding a therapeutic protein.
  • first and second therapeutic proteins can in particular be chosen from proteins known for their effect on ocular pathologies.
  • first and second therapeutic proteins which are different from each other, can for example be chosen from the group consisting of:
  • a protein with anti-fibrotic properties such as the BMP7 protein (Bone
  • Morphogenic Protein 7 an anti TGF-beta type protein, an anti FGF2 type protein, an anti CTGF type protein (connective tissue growth factor), and in particular a protein having at least 85% identity of sequence with the sequence SEQ ID NO: 8, this protein being more particularly decorin;
  • a protein having anti-inflammatory properties in particular an anti-TNF-type protein, such as for example hTNFR-Is, hTNFR-Is / mlgGl, Lenercept or the fusion protein comprising the domain extracellular human TNF alpha receptor p55 coupled via a hinge to the constant fragment of human immunoglobulin IgG1, more particularly an anti TNF-alpha type protein, in particular a fusion protein comprising the extracellular domain of the human p55 TNF alpha receptor coupled via a hinge to the constant fragment of human immunoglobulin IgG1 (Peppel et al., J Exp Med, 174: 1483-1489 - Murphy et al., Arch Ophtalmol, 22: 845-851), and more particularly a protein having at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 22; (iv) an anti-VEGF-type protein, in particular selected from the group consisting of S-Fltl, Aflibercept, conbercept
  • a protein having anti-angiogenic properties such as angiostatin, endostatin, thrombospondin, an anti angiopoietin-2 type protein, an anti FGF2 type protein, an anti PLGF type protein, an anti PDGF-like protein; and
  • a protein regulating complement activation such as complement factor I (CFI)
  • CFI complement factor I
  • a protein having at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 26, this protein being more particularly the H factor of the complement is particularly particularly the CFI of the complement.
  • a protein having at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 17 comprises a protein having at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% at less 99% and 100% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 17.
  • this protein is more particularly transferrin (ie a protein having 100% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 17 ).
  • a protein having at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 8 comprises a protein having at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% at less 99% and 100% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 8.
  • this protein is more particularly decorin (ie a protein having 100% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 8 ).
  • a protein having at least 85% sequence identity with the fusion protein of sequence SEQ ID NO: 22 comprises a protein having at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least at least 98% at least 99% and 100% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 22.
  • this protein is more particularly the fusion protein comprising the extracellular domain of the human receptor p55 to TNF alpha coupled via a hinge to the constant fragment of human immunoglobulin IgG1 of sequence SEQ ID NO: 22.
  • a protein having at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 3 comprises a protein having at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% at less 99% and 100% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 3.
  • this protein is more particularly aflibercept (ie a protein having 100% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 3).
  • a protein having at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 26 comprises a protein having at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% at less 99% and 100% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 26.
  • this protein is more particularly the factor H of the complement (ie a protein having 100% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 26).
  • sequences encoding the first and second therapeutic proteins which are different from each other, can for example be chosen from the group consisting of:
  • nucleotide sequence encoding transferrin in particular a nucleotide sequence having at least 75% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 15, and is in particular the sequence SEQ ID NO: 16;
  • a nucleotide sequence encoding a protein having anti-fibrotic properties such as the BMP7 protein (Bone Morphogenic Protein 7), an anti TGF-beta type protein, an anti FGF2 type protein, a protein of anti CTGF type (connective tissue growth factor), and in particular of a protein encoding decorin, more particularly of a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 6, more particularly of a sequence chosen from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, and is in particular the sequence SEQ ID NO : 7 or the sequence SEQ ID NO: 11, and more particularly the sequence SEQ ID NO: 11;
  • a nucleotide sequence encoding a protein having anti-inflammatory properties in particular an anti-TNF-type protein, such as for example hTNFR-Is, hTNFR-Is / mlgGl, Lenercept or the protein fusion comprising the extracellular domain of the human TNF alpha receptor p55 coupled via a hinge to the constant fragment of human immunoglobulin IgG1, more particularly a sequence encoding an anti-TNF-alpha-type protein, in particular a fusion protein comprising the extracellular domain of the human p55 receptor for TNF alpha coupled via a hinge to the constant fragment of the human immunoglobulin IgG1, and more particularly a sequence having at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 21;
  • nucleotide sequence encoding an anti-VEGF type protein such as S-Fltl, Aflibercept, conbercept, brolucizumab, and in particular a sequence encoding F Aflibercept, more particularly of a sequence having at least 75% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1, in particular the sequence SEQ ID NO: 2;
  • a sequence encoding a protein having anti-angiogenic properties such as angiostatin, endostatin, thrombospondin, an anti-angiopoietin-2-like protein, an anti-FGF2-like protein, a protein of anti PLGF-like, an anti-PDGF-like protein;
  • sequences encoding the first and second therapeutic proteins it should not be understood “first nucleotide sequence” and “second nucleotide sequence” as indicated above, but the sequences which are present within the first nucleotide sequence and within the second nucleotide sequence according to the invention, and which specifically encode the first and the second therapeutic proteins.
  • the first or the second therapeutic protein of a DNA construct according to the invention is a protein having at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 17, this protein being more particularly transferrin.
  • a DNA construct according to the invention can be characterized in that the first nucleotide sequence or the second nucleotide sequence encodes:
  • one of the sequences encoding the first and second therapeutic proteins of a DNA construct according to the invention can in particular be a nucleotide sequence encoding transferrin, and in particular a sequence having at least 75% of sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 15, and is in particular the sequence SEQ ID NO: 16.
  • a DNA construct according to the invention can be characterized in that the first nucleotide sequence or the second nucleotide sequence understand :
  • nucleotide sequence encoding transferrin and in particular a sequence having at least 75% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 15, and is in particular the sequence SEQ ID NO: 16;
  • nucleotide sequence SEQ ID NO: 20 encoding a signal peptide.
  • the first and second therapeutic proteins encoded by a DNA construct according to the invention are respectively:
  • a protein of anti-TNF-alpha type in particular a protein having at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 22, and more particularly the fusion protein comprising the extracellular domain of the human p55 receptor at TNF alpha coupled via a hinge to the constant fragment of human immunoglobulin IgG1 of sequence SEQ ID NO: 22.
  • sequences encoding the first and second therapeutic proteins of a DNA construct according to the invention are respectively:
  • nucleotide sequence encoding transferrin and in particular a sequence having at least 75% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 15, and is in particular the sequence SEQ ID NO: 16;
  • sequence encoding an anti-TNF-alpha type protein in particular a sequence encoding the fusion protein comprising the extracellular domain of the human p55 receptor for TNF alpha coupled via a hinge to the constant fragment of human immunoglobulin IgG1, of peptide sequence SEQ ID NO: 22, and in particular a nucleotide sequence having at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 21.
  • Inflammation and oxidative stress are important components of retinal degenerations such as AMD or glaucomatous neuropathy resulting from the increase in intraocular pressure caused by glaucoma.
  • an increase in Intraocular TNF alpha concentrations are observed in glaucomatous eyes (Tezel et al., 2001, Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001 Jul; 42 (8): 1787-94) and Injection of TNF-alpha into rodent eye induces degeneration axonal optic nerve and programmed death of retinal ganglion cells (Kitaoka 2006, Invest Ophthalmol Vis Sci. 2006; 47: 1448-1457).
  • a DNA construct according to the invention can be characterized in that:
  • the first nucleotide sequence comprises:
  • nucleotide sequence encoding transferrin and in particular a sequence having at least 75% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 15, and is in particular the sequence SEQ ID NO: 16;
  • nucleotide sequence SEQ ID NO: 20 encoding a signal peptide; and (f) the second nucleotide sequence comprises:
  • nucleotide sequence encoding an anti-TNF-alpha type protein in particular a sequence encoding the fusion protein comprising the extracellular domain of the human p55 receptor for TNF alpha coupled via a hinge to the constant fragment of human immunoglobulin IgG1 , of peptide sequence SEQ ID NO: 22, and in particular a nucleotide sequence having at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 21, and in particular the sequence SEQ ID NO: 21; and
  • nucleotide sequence SEQ ID NO: 23 encoding a signal peptide.
  • a DNA construct according to the invention can be characterized in that:
  • this protein being more particularly the fusion protein comprising the domain extracellular human TNF alpha receptor p55 coupled via a hinge to the constant fragment of human immunoglobulin IgG1 G of sequence SEQ ID NO: 22;
  • the first and second therapeutic proteins encoded by a DNA construct according to the invention are respectively:
  • a protein having anti-fibrotic properties in particular a protein having at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 8, this protein being more particularly decorin.
  • sequences encoding the first and second therapeutic proteins of a DNA construct according to the invention are respectively:
  • nucleotide sequence encoding transferrin and in particular a sequence having at least 75% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 15, and is in particular the sequence SEQ ID NO: 16;
  • nucleotide sequence encoding a protein having anti-fibrotic properties such as the BMP7 protein (Bone Morphogenic Protein 7), an anti TGF-beta type protein, an anti FGF2 type protein, an anti CTGF type protein ( connective tissue growth factor), and in particular of a protein encoding decorin, more particularly of a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 6, more particularly of a sequence chosen from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, and is in particular the sequence SEQ ID NO: 7 or the sequence SEQ ID NO: 11, and more particularly the sequence SEQ ID NO: 11.
  • Glaucoma particularly primary open-angle glaucoma, is characterized by increased intraocular pressure following fibrosis of the trabecular meshwork, and loss of retinal ganglion cells and optic nerve degeneration.
  • Current treatments for glaucoma reduce intraocular pressure but do not slow down the progression of neurodegeneration.
  • the administration of an agent acting as a neuroprotector, such as an anti-TNF or transferrin advantageously makes it possible to potentiate the effects of an anti-fibrotic such as decorin, and both reduce intraocular pressure and protect the retina and optic nerve from degeneration.
  • a DNA construct according to the invention can be characterized in that:
  • the first nucleotide sequence comprises:
  • nucleotide sequence encoding transferrin and in particular a sequence having at least 75% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 15, and is in particular the sequence SEQ ID NO: 16;
  • nucleotide sequence SEQ ID NO: 20 encoding a signal peptide; and (f) the second nucleotide sequence comprises:
  • nucleotide sequence encoding decorin more particularly a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 6, more particularly a sequence chosen from the group consisting of sequences SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, and is in particular the sequence SEQ ID NO: 7 or the sequence SEQ ID NO: 11, and more particularly the sequence SEQ ID NO: 11; and
  • a DNA construct according to the invention can be characterized in that:
  • the first or the second therapeutic protein of a DNA construct according to the invention is an anti-VEGF type protein, in particular of a protein having at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 3, this protein being more particularly G Aflibercept.
  • a DNA construct according to the invention can be characterized in that the first nucleotide sequence or the second nucleotide sequence encodes:
  • one of the sequences encoding the first and second therapeutic proteins of a DNA construct according to the invention can in particular be a nucleotide sequence encoding a protein of anti-VEGF type, such as S-Fltl, F Aflibercept, conbercept, brolucizumab, and in particular a sequence encoding F Aflibercept, more particularly a sequence having at least 75% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1, and is in particular the sequence SEQ ID NO: 2.
  • a DNA construct according to the invention can be characterized in that the first nucleotide sequence or the second nucleotide sequence comprises:
  • nucleotide sequence encoding F Aflibercept and in particular a sequence having at least 75% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1, and is in particular the sequence SEQ ID NO: 2;
  • the first and second therapeutic proteins of a DNA construct according to the invention are respectively:
  • a protein having anti-fibrotic properties in particular a protein having at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 8, this protein being more particularly decorin;
  • an anti-VEGF-type protein in particular a protein having at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 3, this protein being more particularly F Aflibercept.
  • sequences encoding the first and second therapeutic proteins of a DNA construct according to the invention are respectively:
  • nucleotide sequence encoding a protein having anti-fibrotic properties such as the BMP7 protein (Bone Morphogenic Protein 7), an anti TGF-beta type protein, an anti FGF2 type protein, an anti CTGF type protein ( connective tissue growth factor), and in particular of a protein encoding decorin, more particularly a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 6, more particularly a sequence chosen from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, and is in particular the sequence SEQ ID NO: 7 or the sequence SEQ ID NO: 11; and
  • nucleotide sequence encoding an anti-VEGF-type protein such as S-Fltl, FAflibercept, conbercept, brolucizumab, and in particular a sequence encoding Aflibercept, more particularly a sequence having at least 75% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1, in particular the sequence SEQ ID NO: 2.
  • the presence of the anti-fibrotic active agent advantageously makes it possible to potentiate the effects of anti-VEGF, thus improving the effectiveness of this compound in the treatment of the targeted ocular pathologies.
  • anti-VEGF over time (Daniel et al. 2014, Ophthalmology 121, 656-666).
  • subretinal fibrosis has been identified as a cause of poor therapeutic response to anti-VEGF in AMD patients who do not respond to anti-VEGF (Cohen et al. 2012, Retina 32, 1480-1485).
  • a DNA construct according to the invention can be characterized in that:
  • the first nucleotide sequence comprises:
  • nucleotide sequence encoding Aflibercept and in particular a sequence having at least 75% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1, and is in particular the sequence SEQ ID NO: 2;
  • nucleotide sequence SEQ ID NO: 5 encoding a signal peptide; and (f) the second nucleotide sequence comprises:
  • nucleotide sequence encoding decorin more particularly a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 6, more particularly a sequence chosen from the group consisting of sequences SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, and is in particular the sequence SEQ ID NO: 7 or the sequence SEQ ID NO: 11; and
  • a DNA construct according to the invention can be characterized in that:
  • the first nucleotide sequence comprises: a nucleotide sequence encoding G Aflibercept, and in particular a sequence having at least 75% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1, and is in particular the sequence SEQ ID NO: 2; and
  • nucleotide sequence SEQ ID NO: 5 encoding a signal peptide; and (f) the second nucleotide sequence comprises:
  • nucleotide sequence encoding decorin more particularly the sequence SEQ ID NO: 7;
  • a DNA construct according to the invention can be characterized in that:
  • the first nucleotide sequence comprises:
  • nucleotide sequence encoding G Aflibercept and in particular a sequence having at least 75% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1, and is in particular the sequence SEQ ID NO: 2;
  • nucleotide sequence SEQ ID NO: 5 encoding a signal peptide; and (f) the second nucleotide sequence comprises:
  • nucleotide sequence encoding decorin more particularly the sequence SEQ ID NO: 11;
  • a DNA construct according to the invention can be characterized in that:
  • the first and second therapeutic proteins of a DNA construct according to the invention are respectively: - a protein of anti-TNF-alpha type, in particular a protein having at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 22, and more particularly the fusion protein comprising the extracellular domain of the human p55 receptor at TNF alpha coupled via a hinge to the constant fragment of human immunoglobulin IgG1 of sequence SEQ ID NO: 22;
  • an anti-VEGF type protein in particular of a protein having at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 3, this protein being more particularly Aflibercept.
  • sequences encoding the first and second therapeutic proteins of a DNA construct according to the invention are respectively:
  • sequence encoding an anti-TNF-alpha type protein in particular a sequence encoding the fusion protein comprising the extracellular domain of the human p55 receptor for TNF alpha coupled via a hinge to the constant fragment of human immunoglobulin IgG1 from peptide sequence SEQ ID NO: 22, and in particular a nucleotide sequence having at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 21; and
  • nucleotide sequence encoding an anti-VEGF-type protein such as S-Fltl, Aflibercept, conbercept, brolucizumab, and in particular a sequence encoding Aflibercept, more particularly a sequence having at least 75% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1, and is in particular the sequence SEQ ID NO: 2.
  • VEGF vascular permeability
  • inflammatory agents such as TNF-alpha
  • TNF-alpha can also lead to vascular permeability, especially in patients who do not respond to anti-VEGF treatment such as this.
  • VEGF and TNF-alpha induce permeability by separate mechanisms.
  • a DNA construct according to the invention can be characterized in that:
  • the first nucleotide sequence comprises:
  • nucleotide sequence encoding an anti-TNF-alpha type protein in particular a sequence encoding the fusion protein comprising the extracellular domain of the human TNF alpha receptor p55 coupled via a hinge to the constant fragment of human immunoglobulin IgG1, of peptide sequence SEQ ID NO: 22, and in particular a nucleotide sequence having at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO : 21, and in particular the sequence SEQ ID NO: 21; and
  • nucleotide sequence SEQ ID NO: 23 encoding a signal peptide; and (f) the second nucleotide sequence comprises:
  • nucleotide sequence encoding Aflibercept and in particular a sequence having at least 75% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1, and is in particular the sequence SEQ ID NO: 2;
  • a DNA construct according to the invention can be characterized in that:
  • this protein being more particularly the fusion protein comprising the extracellular domain of the human receptor p55 for TNF alpha coupled via a hinge to the constant fragment human IgG1 immunoglobulin of sequence SEQ ID NO: 22;
  • the first and second therapeutic proteins of a DNA construct according to the invention are respectively:
  • a protein regulating the activation of complement in particular of a protein having at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 26, this protein being more particularly factor H of complement;
  • sequences encoding the first and second therapeutic proteins of a DNA construct according to the invention are respectively:
  • CFI complement factor I
  • H complement factor H
  • SEQ ID NO: 25 a nucleotide sequence encoding a protein regulating complement activation, such as complement factor I (CFI), and complement factor H, and in particular a sequence encoding complement factor H, more particularly a sequence having at least 75% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 25; and
  • nucleotide sequence encoding an anti-VEGF-type protein such as S-Fltl, Aflibercept, conbercept, brolucizumab, and in particular a sequence encoding F Aflibercept, more particularly a sequence having at least less 75% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1, and is in particular the sequence SEQ ID NO: 2.
  • Activation of the alternate complement pathway is an important component of AMD. This activation leads to the formation of the membrane attack complex, the recruitment of macrophages, and the induction of inflammation with the production of cytokines involved in the inflammasome.
  • Complement factor H acts to regulate the self-activation of complement.
  • inhibition of the alternate pathway by intraocular injection of CFH reduces neovascularization in animal models of choroidal neovascularization.
  • an active regulating the activation of complement and of an anti-VEGF, such as F aflibercept advantageously makes it possible to reduce both the neovascularization and the inflammation associated with AMD.
  • a DNA construct according to the invention can be characterized in that:
  • the first nucleotide sequence comprises:
  • CFI complement factor I
  • H complement factor H
  • SEQ ID NO: 25 a nucleotide sequence encoding a protein regulating complement activation, such as complement factor I (CFI), and complement factor H, and in particular a sequence encoding complement factor H, more particularly a sequence having at least 75% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 25; and
  • nucleotide sequence SEQ ID NO: 28 encoding a signal peptide; and (f) the second nucleotide sequence comprises:
  • nucleotide sequence encoding F Aflibercept and in particular a sequence having at least 75% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1, and is in particular the sequence SEQ ID NO: 2; and - the nucleotide sequence SEQ ID NO: 5 encoding a signal peptide.
  • a DNA construct according to the invention can be characterized in that:
  • a protein regulating the activation of complement in particular of a protein having at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 26, this protein being more particularly factor H of complement;
  • a DNA construct according to the invention is further characterized in that the first nucleotide sequence also encodes a signal peptide allowing the secretion of the first therapeutic protein.
  • This signal peptide is well known to those skilled in the art.
  • This signal peptide may for example be the human tissue plasminogen activator (tPA) of peptide sequence SEQ ID NO: 4 (and may for example be encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 5) or the signal peptide of HTLV-1 Env with peptide sequence SEQ ID NO: 29 (and may for example be encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 30).
  • tPA human tissue plasminogen activator
  • the signal peptide of an anti-TNF-alpha type protein in particular the native fusion protein signal peptide comprising the extracellular domain of the human p55 receptor for TNF alpha coupled via a hinge to the constant fragment of human immunoglobulin IgG1, this signal peptide having a peptide sequence SEQ ID NO: 23 (and may for example be encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 24); Where - the native signal peptide of factor H, of peptide sequence SEQ ID NO: 27 (and which may for example be encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 28).
  • this signal peptide is contiguous with the first therapeutic protein, that is to say that it is directly attached to the N-terminal of the first therapeutic protein, and thus, the sequence encoding the signal peptide is 5 'to the sequence encoding the first therapeutic protein.
  • a DNA construct according to the invention is further characterized in that the second nucleotide sequence also encodes a signal peptide allowing the secretion of the second therapeutic protein.
  • This signal peptide may for example be the human tissue plasminogen activator (tPA) of peptide sequence SEQ ID NO: 4 (and may for example be encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 5) or the signal peptide of HTLV-1 Env with peptide sequence SEQ ID NO: 29 (and may for example be encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 30). It can also be the native signal peptide of the therapeutic protein in question, such as for example:
  • the signal peptide of an anti-TNF-alpha type protein in particular the native fusion protein signal peptide comprising the extracellular domain of the human p55 receptor for TNF alpha coupled via a hinge to the constant fragment of human immunoglobulin IgG1, this signal peptide having a peptide sequence SEQ ID NO: 23 (and may for example be encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 24);
  • This signal peptide can be identical or different from the signal peptide encoded by the first nucleotide sequence, and is preferably different from the signal peptide encoded by the first nucleotide sequence. As previously indicated, this signal peptide is contiguous with the second therapeutic protein, that is to say that it is directly attached to the N-terminal of the second therapeutic protein, and thus, the sequence encoding the signal peptide is 5 'to the sequence encoding the second therapeutic protein.
  • the signal peptide encoded by the first nucleotide sequence and the signal peptide encoded by the second nucleotide sequence are, independently of one another, chosen from the group consisting of peptide sequences SEQ ID NO: 4 ; SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 29.
  • sequence encoding the signal peptide encoded by the first nucleotide sequence and the sequence encoding the signal peptide encoded by the second nucleotide sequence are, independently of one another, chosen from the group consisting of nucleotide sequences SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 30.
  • a DNA construct according to the invention is moreover also characterized in that it comprises (d) a promoter allowing the expression of the first therapeutic protein of a construct according to the invention as well as (g) a promoter allowing the expression of the second therapeutic protein of a construct according to the invention.
  • These promoters can be the same or different. According to a particular embodiment, these two promoters are different from each other.
  • Such promoters can for example be promoters of the CAG or CMV type.
  • a DNA construct according to the invention is further characterized in that it comprises (e) a 3 'polyadenylation sequence of the first nucleotide sequence and (h) a 3' polyadenylation sequence of the second nucleotide sequence .
  • a polyadenylation sequence contains in particular a conserved motif of AATAAA sequence well known to those skilled in the art.
  • These two polyadenylation sequences can be the same or different from each other. According to one embodiment, they are different from each other.
  • polyadenylation sequences can for example be polyadenylation sequences of the RBG (Rabbit Beta Globin) or BGH (Bovine Growth Hormone) type.
  • the DNA construct according to the invention is circular in shape.
  • the DNA construct is a naked DNA construct.
  • the DNA construct according to the invention is a naked DNA construct of circular shape.
  • the DNA construct according to the invention is a naked DNA construct of circular shape in which the sequences encoding the first and second therapeutic proteins of a DNA construct according to invention are respectively:
  • nucleotide sequence encoding transferrin and in particular a sequence having at least 75% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 15, and is in particular the sequence SEQ ID NO: 16;
  • the DNA construct according to The invention is a naked DNA construct of circular shape in which the sequences encoding the first and second therapeutic proteins of a DNA construct according to the invention are respectively:
  • nucleotide sequence encoding a protein having anti-fibrotic properties such as the BMP7 protein (Bone Morphogenic Protein 7), an anti TGF-beta type protein, an anti FGF2 type protein, an anti CTGF type protein ( connective tissue growth factor), and in particular of a protein encoding decorin, more particularly of a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 6, more particularly of a sequence chosen from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, and is in particular the sequence SEQ ID NO: 7 or the sequence SEQ ID NO: 11, and more particularly the sequence SEQ ID NO: 11; and
  • nucleotide sequence encoding an anti-VEGF-type protein such as S-Fltl, FAflibercept, conbercept, brolucizumab, and in particular a sequence encoding Aflibercept, more particularly a sequence having at least 75% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1, and is in particular the sequence SEQ ID NO: 2.
  • the DNA construct according to the invention is a naked DNA construct of circular shape in which the sequences encoding the first and second therapeutic proteins of a DNA construct according to the invention are respectively :
  • nucleotide sequence encoding transferrin and in particular a sequence having at least 75% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 15, and is in particular the sequence SEQ ID NO: 16;
  • nucleotide sequence encoding a protein having anti-fibrotic properties such as the BMP7 protein (Bone Morphogenic Protein 7), an anti TGF-beta type protein, an anti FGF2 type protein, an anti CTGF type protein ( connective tissue growth factor), and in particular of a protein encoding decorin, more particularly of a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 6, more particularly of a sequence chosen from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, and is in particular the sequence SEQ ID NO: 7 or the sequence SEQ ID NO: 11, and more particularly the sequence SEQ ID NO: 11.
  • the DNA construct according to the invention is a naked DNA construct of circular shape in which the sequences encoding the first and second therapeutic proteins of a DNA construct according to l invention are respectively:
  • - a sequence encoding an anti-TNF-alpha type protein in particular a sequence encoding the fusion protein comprising the extracellular domain of the human p55 receptor for TNF alpha coupled via a hinge to the constant fragment of human immunoglobulin IgG1 from protein sequence SEQ ID NO: 22, and in particular a nucleotide sequence having at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 21; and - a nucleotide sequence encoding an anti-VEGF-type protein, such as S-Fltl, FAflibercept, conbercept, brolucizumab, and in particular a sequence encoding Aflibercept, more particularly a sequence having at least 75% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1, and is in particular the sequence SEQ ID NO: 2.
  • the DNA construct according to the invention is a naked DNA construct of circular shape in which the sequences encoding the first and second therapeutic proteins of a DNA construct according to l invention are respectively:
  • CFI complement factor I
  • H complement factor H
  • SEQ ID NO: 25 a nucleotide sequence encoding a protein regulating complement activation, such as complement factor I (CFI), and complement factor H, and in particular a sequence encoding complement factor H, more particularly a sequence having at least 75% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 25; and
  • nucleotide sequence encoding an anti-VEGF-type protein such as S-Fltl, Aflibercept, conbercept, brolucizumab, and in particular a sequence encoding Aflibercept, more particularly a sequence having at least 75% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1, and is in particular the sequence SEQ ID NO: 2.
  • this signal peptide being contiguous with the sequence of the first therapeutic protein, at the N-terminal of said first therapeutic protein,
  • a DNA construct as defined above is especially dedicated to the treatment of ocular pathologies.
  • An ocular pathology according to the present invention is retinal degeneration.
  • This retial degeneration can in particular be chosen from the group consisting of age-related macular degeneration (AMD), wet or dry; diabetic retinopathies (DR); retinal venous occlusion, in particular central retinal vein occlusion (CRVO) or branch retinal vein occlusion (OBVR); myopic choroidal neovascularization (CNV); uveitis, especially non-infectious uveitis; retinitis pigmentosa and glaucoma.
  • AMD age-related macular degeneration
  • DR diabetic retinopathies
  • CRVO central retinal vein occlusion
  • OBVR branch retinal vein occlusion
  • CNV myopic choroidal neovascularization
  • uveitis especially non-infectious uveitis
  • retinitis pigmentosa and glaucoma glaucoma.
  • diabetic retinopathy it is intended in particular to denote a reduction in visual acuity due to diabetic macular edema (DME), intravitreal hemorrhage, retinal detachment, or neovascular glaucoma.
  • DME diabetic macular edema
  • said pathology ocular is a retinal degeneration which can more particularly be chosen from the group consisting of age-related macular degeneration (AMD), in particular the wet form; diabetic retinopathies (DR); retinal venous occlusion, especially occlusion of the central retinal vein (OVCR) or branch retinal vein occlusion (OBVR); and myopic choroidal neovascularization (CNV); and more particularly be chosen from the group consisting of age-related macular degeneration (AMD), in particular the neovascular (wet) form of AMD; reduced visual acuity due to diabetic macular edema (DME); retinal venous occlusion, especially central retinal vein occlusion (CRVO) or branch retinal vein occlusion (OBVR); and myopic
  • AMD age-related macular degeneration
  • DME diabetic macular edema
  • DME diabetic macular edema
  • CRVO central retinal vein occlusion
  • diabetic retinopathy By way of diabetic retinopathy, it is intended in particular to denote a decrease in visual acuity due to diabetic macular edema (DME) and the formation of new vessels observed in the proliferating form of diabetic retinopathy.
  • DME diabetic macular edema
  • a DNA construct according to the invention is injected into an eye muscle, the ciliary muscle, where it is subjected to an electrotransfer.
  • the known technique of non-viral gene therapy used in the present invention is the injection of the DNA construct into an ocular muscle and then G electrotransfer to induce transient permeabilization of ciliary muscle cells and DNA migration to optimize the transfection of the DNA construct.
  • This DNA electrotransfer technique also called electroporation or electroporation
  • G DNA electrotransfer does not induce an immune response and allows long-term expression of the genes thus introduced.
  • the injection of a DNA construct is made into the ciliary muscle because the latter is capable of producing proteins in a homogeneous and constant manner and, due to its position, promotes the diffusion of these proteins in the entire ocular sphere (Bloquel et al. “Plasmid electrotransfer of eye ciliary muscle: principles and therapeutic efficacy using hTNF-alpha soluble receptor in uveitis”, FASEB J. 2006 Feb; 20 (2): 389-91). Smooth muscle cells have a low turnover rate and are well distributed on both sides of the lens.
  • the quantity of protein to be produced is proportional to the surface of the transfected muscle (Touchard “The ciliary smooth muscle electrotransfer: basic principles and potetial for sustained intraocular production of therapeutic proteins ”, J Gene Med. 2010 Nov; 12 (ll): 904-19).
  • the production of the proteins of interest according to the present invention, and in particular of therapeutic proteins as described above will be homogeneous and constant throughout the ocular sphere and will be limited to this ocular sphere.
  • the electrotransfer method described in patent application EP2266656 which deals with a method of injecting a composition which may contain DNA at the level of the tissues of the ciliary body and / or of the tissues. extraocular muscles.
  • the ciliary muscle is part of the ciliary body, near the limbus and just behind the sclera.
  • the injection of a DNA construct according to the invention into it is therefore very minimally invasive unlike subretinal injections and therefore advantageously constitutes the site of injection of the DNA construct according to the invention.
  • the present invention also relates to the use of a DNA construct for treating an ocular pathology, said DNA construct being intended for the non-viral transfer of nucleic acids into the muscle cells of the ocular sphere of the eye. a patient suffering from said ocular pathology; said DNA construct being characterized in that it comprises:
  • this signal peptide being contiguous with the sequence of the first therapeutic protein, at the N-terminal of said first therapeutic protein,
  • the present invention also relates to a method of treating an ocular pathology, comprising the administration of a DNA construct to a patient by injection into a ciliary muscle and then electrotransfer into the cells of the ciliary muscle, said DNA construct being intended for the non-viral transfer of nucleic acids into the muscle cells of the ocular sphere of a patient suffering from said ocular pathology; said DNA construct being characterized in that it comprises:
  • this signal peptide being contiguous with the sequence of the first therapeutic protein, at the N-terminal of said first therapeutic protein,
  • the inventors have demonstrated the expression of two therapeutic proteins encoded in a DNA construct according to the invention (plasmid) in the vitreous of the eye of rats after electrotransfer of this DNA construct into the ciliary muscle.
  • Plasmid A comprising:
  • sequence SEQ ID NO: 16 encoding human transferrin of sequence SEQ ID NO: 17 (the sequence encoding its signal peptide being the sequence SEQ ID NO: 20);
  • sequence SEQ ID NO: 21 encoding a fusion protein comprising the extracellular domain of the human receptor p55 for TNF alpha coupled via a hinge to the constant fragment of human immunoglobulin IgG1 (hTNFR-Is / hlgGl) of sequence SEQ ID NO: 22 (the sequence encoding its signal peptide being the sequence SEQ ID NO: 24);
  • FIG. 1 A so-called simple comparative construction, in that it codes only for one of the proteins of interest mentioned above, ie the sequence SEQ ID NO: 16 encoding human transferrin of sequence SEQ ID NO: 17, was also prepared according to a similar method, with a plasmid backbone similar to the plasmid construction A, the only sequence encoding a protein of interest also being under the control a promoter of the CMV type.
  • This comparative plasmid (called Plasmid a ') is shown in Figure 2.
  • 7-week-old Long Evans rats are used according to the provisions of the ARVO protocol (for Association for Research in Vision and Ophthalmology).
  • the rats are anesthetized by intramuscular injection of a dose of ketamine (40 mg / kg) and xylazine (4 mg / kg) before bilateral injection of the plasmid (30 pg / eye) and electrotransfer on day 0 (D0).
  • 6 rats are used for each of the analysis times (D3, D7, D14, D21, and D30).
  • the rats are euthanized by administration of a lethal dose of pentobarbital (400 mg / kg) then the animals are enucleated and the eye fluids (vitreous humor and aqueous humor) are taken and stored at -80 ° C until analysis.
  • pentobarbital 400 mg / kg
  • eye fluids vitreous humor and aqueous humor
  • Rat ciliary muscle electrotransfer The electrotransfer is carried out as described in Bloquel et al. “Plasmid electrotransfer of eye ciliary muscle: principles and therapeutic efficacy using hTNF-alpha soluble receptor in uveitis” (FASEB J 2006; 20: 389-391) by modifying the injection route by a transscleral approach (Touchard “The ciliary smooth muscle electrotransfer: basic principles and potetial for sustained intraocular production of therapeutic proteins ”, J Gene Med. 2010 Nov; 12 (ll): 904-19).
  • the plasmids are injected at a rate of 30 ⁇ g in 10 ⁇ l of Tris-EDTANaCl solution, into the ciliary muscle of the animals using a suitable syringe.
  • the electrical pulses are administered using a specific iridium / platinum electrode 250 ⁇ m in diameter.
  • This internal electrode is introduced into the existing transscleral tunnel.
  • the outer electrode is a sheet of stainless steel curved to conform to the shape of the eye and placed at the limbus facing the inner electrode.
  • the electrotransfer is carried out at the rate of 8 unipolar square electrical pulses (200V / cm, 10 ms, 5 Hz) generated by an electroporator similar to that described in Touchard et al (J Gene Med. 2010 Nov; l 2 (11): 904-19).
  • Eye fluid samples are taken 3 days (D + 3), 7 days (D + 7), 14 days (D + 14), 21 days (D + 21) and 30 days (D + 30) after the injection of plasmid followed by electrotransfer (D0).
  • an ELISA measurement is carried out in order to measure the quantity of human transferrin and / or of the anti-TNF-alpha fusion protein of sequence SEQ ID NO: 22 present in the samples.
  • Figure 4 which represents the concentration of anti-TNF-alpha fusion protein (in pg / mL) of sequence SEQ ID NO: 22 produced in the ocular fluids taken from D + 3 to D + 30.
  • Example 1 The inventors confirmed the observations made in Example 1 in a second experimental protocol using a plasmid according to the invention different from that used in Example 1.
  • Plasmid B A DNA construct according to the invention, called plasmid B, comprising:
  • sequence SEQ ID NO: 7 encoding the Decorin of sequence SEQ ID NO: 8;
  • sequence SEQ ID NO: 2 encoding G Aflibercept of sequence SEQ ID NO: 3;
  • the animals used in this protocol are as described in Example 1. 6 rats are used for each of the analysis times (D3, D7, D14 and D21).
  • the rats are euthanized by administration of a lethal dose of pentobarbital (400 mg / kg) then the animals are enucleated and the eye fluids (vitreous humor and aqueous humor) are taken and stored at -80 ° C until analysis.
  • the electrotransfer is carried out as described in Example 1.
  • Eye fluid samples are taken 3 days (D + 3), 7 days (D + 7), 14 days (D + 14) and 21 days (D + 21) after the injection of plasmid followed by G electrotransfer (D0 ). For each of these samples, an ELISA measurement is performed to measure the amount of decorin and / or Aflibercept present in the samples.
  • Example 1 Furthermore, as had previously been shown in Example 1, they also illustrate, and quite unexpectedly, the ability of a construct according to the invention to produce proteins in a more stable manner over time than it encodes compared to constructs encoding only one of these proteins (Fig. 7).
  • Plasmid C comprising:
  • Brown Norway rats aged 7 to 8 weeks are used according to the provisions of the ARVO protocol (for Association for Research in Vision and Ophthalmology). Rats are anesthetized by intramuscular injection of a dose of ketamine (40 mg / kg) and xylazine (4 mg / kg) before bilateral injection of the plasmid (30 pg / eye) or vehicle (10 pL) and daily electrotransfer. 0 (J0). 6 rats are used for each of the treatments. The electrotransfer is performed as described in Example 1.
  • choroidal neovascularization is induced in all animals by laser photocoagulation in several places of the retina (4 to 5 laser impacts per eye).
  • the vascular leakage of the neo-vessels is evaluated by fluorescent angiography and attribution of a score according to the severity of the vascular leak according to the following table.
  • SEQ ID NO: 1 Nucleotide sequence encoding Aflibercept agtgatacaggtagacctttcgtagagatgtacagtgaaatccccgaaattatacacatgactgaaggaagggagctcgtcattccctgc cgggttacgtcacctaacatcactgttactttaaaaaagtttccacttgacactttgatccctgatggaaaacgcataatctgggacagtag aaagggcttcatcatatcaaatgcaacgtacaaagaaatagggcttctgacctgtgaagcaacagtcaatgggcatttgtataagacaaa ctatctcacacatcgacaaaccaatacaatcatagatgtcgttctgagtctcattcatcg
  • SEQ ID NO: 2 Nucleotide sequence encoding Aflibercept cagcgacaccggcagacccttcgtggaaatgtacagcgagatccccgagatcatccacatgaccgagggccgcgagctggtgatcc cttgcagagtgaccagccccaacatcaccgtgacactgaagaagttcccctctggacacactgatccccgacggcaagaggatcatctg ggacagcagaaagggcttcatcatcagcaacgccacatacaaagagatcggactgctgacatgcgaggccaccgtgaacggccatc tgtacaagaccaactatctgacccaccgccagaccaacaccatcatcgacgtggtgctgagccccagccacggcatcgagctgag
  • SEQ ID NO: 3 peptide sequence of TAflibercept
  • SEQ ID NO: 4 peptide sequence of the TPA signal peptide MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPS
  • SEQ ID NO: 5 nucleotide sequence encoding the TPA signal peptide atggatgcaatgaagagagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtggagcagtcttcgtttcgcccag
  • SEQ ID NO: 6 Nucleotide sequence coding for Decorin ggaccgtttcaacagagaggcttatttgactttatgctagaagatgaggcttctgggataggcccagaagttcctgatgaccgcgacttc gagccctcctaggcccagtgtgccccttccgctgtcaatgccatcttcgagtggtccagtgttctgatttgggtctggacaaagtgccaa aggatcttcccctgacacaactctgctagacctgcaaaacaacaaataaccgaaatcaaagatggagactttaagaacctgaagaa ccttcacgcattgattcttgtcaacaataaaattagcaaagttagtctggagcatttcttgtca
  • SEQ ID NO: 8 Peptide sequence of Decorin
  • SEQ ID NO: 9 Nucleotide sequence coding for Decorin ggaccgtttcaacagagaggcttatttgactttatgctagaagatgaggcctctggaatcggacctgaggtgcccgacgacagagactt cgaaccttctctgggccctgtgtgccccttcagatgccagtgtcatctgagagtggtgcagtgcgacctgggccttgataaggtgc ccaaggacctgcctctgacaccacactgctggacctgcagaacaacaagatcaccgagatcaaggacggcgacttcaagaacctg aagaatctgcacgcctgatctggtcaacaacaaatcaccgagatcaaggacggcgacttcaagaacctg aagaatctgcac
  • SEQ ID NO: 10 Nucleotide sequence coding for Decorin ggaccgtttcaacagagaggcttatttgactttatgctagaagacgaggctagcggaattggacctgaagtgcccgacgaccgcgatttt gaaccatcactgggacctgtctgcccctttagatgtcagtgccacctgagggtggtgcagtgttctgacctgggcctggataaggtgcc aaaggacctgcccctgataccacactgctggacctgcagaacaataagatcaccgagatcaaggacggcgatttcaagaatctgaa gaacctgcacgcctgatcctggtgaacaataagatctctaaggtgaggtgcccaggcgctttaccccctga
  • SEQ ID NO: 11 Nucleotide sequence coding for Decorin ggaccgtttcaacagagaggcttatttgactttatgctagaagacgaggccagcggcatcggccccgaggtgcccgacgaccgcgac ttcgagcccagcctgggcccccgtgtgccccttccgctgccagtgccacctgcgcgtggtgcagtgcgacctgggcctggacaag gtgcccaaggacctgccccccgacaccaccctgctggacctgcagaacaacaagatcaccgagatcaaggacggcgacttcaaga acctgaagaacctgcacgccctgatcctggtgaacaacaagatcagaggtgagccccggcggg
  • SEQ ID NO: 13 Peptide sequence of the native signal peptide of Decorin MK ATIILLLL AQ V SW A
  • SEQ ID NO: 14 Nucleotide sequence encoding the native signal peptide of Decorin atgaaggccactatcatcctccttctgcttgcacaagtttcctgggct
  • SEQ ID NO: 15 Nucleotide sequence encoding transferrin gtccctgataaaactgtgagatggtgtgcagtgtcggagcatgaggccactaagtgccagagtttccgcgaccatatgaaaagcgtcat tccatccgatggtcccagtgttgcttgtgtgaagaaagcctcctaccttgattgcatcagggccattgcggcaaacgaagcggatgctgt gacactggatgcaggtttggtgtgtgtgtgt gacactggatgcaggtttggtgtgtatgatgcttacctggctcccaataacctgaagcctgtggtggcagagttctatgggtcaaaagagga tccacagactttctattatgc
  • SEQ ID NO: 16 Nucleotide sequence encoding transferrin gtgccagataagacagttcgttggtgcgccgtgtctgagcacgaggccacaaagtgccagagcttccgggaccacatgaagtctgtg atccctagcgacggcccttccgtggcttgtgtgaagaaggccagctatctggactgcatcagagccattgccgccaacgacgacgagccgatg ccgttacactggatgccggactggtgtacgatgcctatctggccccaaacaatctgaagcccgtggtcgcgagttctacggctctaaa gaggaccctcagacattctactacgccgtggtcaagaaggacaca
  • SEQ ID NO: 17 Peptide sequence of human transferrin
  • SEQ ID NO: 18 Peptide sequence of the native signal peptide of human transferrin MRL AV GALL V C AVLGLCL A
  • SEQ ID NO: 19 Nucleotide sequence encoding the native signal peptide of Transferrin atgaggctcgccgtgggagccctgctggtctgcgccgtcctggggctgtgtctggcttggctgtgtctggct
  • SEQ ID NO: 20 Nucleotide sequence encoding the signal peptide of Transferrin atgagactggctgtgggagcactgcttgtgtgtgctgttctgggactgtgtctggcc
  • SEQ ID NO: 21 nucleotide sequence encoding a fusion protein comprising the extracellular domain of the human p55 receptor for TNF alpha coupled via a hinge to the constant fragment of G human immunoglobulin IgG1 (Peppel et al., J Exp Med, 174: 1483 - 1489 - Murphy et al, Arch Ophthalmol, 22: 845-851) actggtccctcacctaggggacagggagaagagagatagtgtgtgtccccaaggaaatatatccaccctcaaaataattcgatttgct gtaccaagtgccacaaaggaacctacttgtacaatgactgtccaggcccggggcaggatacggactgcagggagtgtgagagcggcttcaccgcttcagaaaaccacctcagacactgcctcagctccaaaaccacctcactgca
  • SEQ ID NO: 22 peptide sequence of the fusion protein comprising the extracellular domain of the human p55 receptor for TNF alpha coupled via a hinge to the constant fragment of G human immunoglobulin IgG1 (Peppel et al., J Exp Med, 174: 1483- 1489 - Murphy et al., Arch Ophthalmol, 22: 845-851)
  • SEQ ID NO: 23 Peptide sequence of the native signal peptide of the protein of sequence SEQ ID NO: 22
  • SEQ ID NO: 24 Nucleotide sequence encoding the signal peptide of sequence SEQ ID NO: 23 atgggcctctccaccgtgcctgacctgctgctgccgctggtgctcctggagctgttggtgggaatatacccctcaggggttattgg
  • SEQ ID NO: 25 nucleotide sequence coding for the complement factor H gaagattgcaatgaacttcctccaagaagaaatacagaaattctgacaggttcctggtctgaccaaacatatccagaaggcacccaggc tatctataaatgccgcctggatatagatctcttggaaatataataatggtatgcaggaagggagaatgggttgctcttaatccattaagga aatgtcagaaaaggccctgtggacat
  • SEQ ID NO: 26 peptide sequence of complement factor H
  • VKCLP VT APEN GKI V S S AMEPDREYHF GQ A VRF VCN S GYKIEGDEE
  • SEQ ID NO: 27 Peptide sequence of the native signal peptide of factor H MRLL AKIICLML W AIC VA
  • SEQ ID NO: 28 Nucleotide sequence encoding the native signal peptide of factor H atgagacttctagcaaagattatttgccttatgttatgggctatttgtgtagca
  • SEQ ID NO: 29 peptide sequence of the signal peptide of HTLV-1 Env MGKFL ATLILFF QF CPLIF G
  • SEQ ID NO: 30 nucleotide sequence encoding the signal peptide of HTLV-1 Env atgggtaagtttctcgccactttgattttattcttccagttctgcccctcatcttcggt
  • SEQ ID NO: 31 replication origin sequence gamma R6K plasmid E. coli gatcagcagttcaacctgttgatagtatgtactaagctctcatgtttaatgtactaagctctcatgtttaatgaactaaaccctcatggctaatg tactaagctctcatggctaatgtactaagctctcatgttttcacgtactaagctctcatgttttgaacaataaattaatataaatcagcaacttaa atagcctctaaggttttaagttttataagaaaaaaaagaatatataaggctttttaaaggttttaatggttgtggacaacaagcccctaaggttttataagaaaaaaaaagaatatataaggctttt

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Abstract

La présente invention concerne à titre principal une construction d'ADN pour son utilisation dans le traitement d'une pathologie oculaire, destinée au transfert non viral d'acides nucléiques dans les cellules musculaires de la sphère oculaire d'un patient souffrant de ladite pathologie oculaire; et étant caractérisée en ce qu'elle comprend notamment une première séquence codant pour une première protéine thérapeutique et une seconde séquence codant pour une seconde protéine thérapeutique, différente de la première protéine thérapeutique, ladite construction d'ADN étant administrée au patient par injection dans un muscle ciliaire puis électrotransfert dans les cellules du muscle ciliaire.

Description

Description
Titre : CONSTRUCTION D’ADN POUR LE TRAITEMENT DE PATHOLOGIES OCULAIRES
Domaine technique
La présente invention concerne une nouvelle construction d’ADN ainsi que sa mise en œuvre dans le traitement des pathologies oculaires par thérapie génique non virale. Une méthode selon l’invention concerne plus particulièrement ladite construction d’ADN permettant la production ciblée intraoculaire de deux protéines thérapeutiques durant une période pouvant aller jusqu’à plusieurs mois. La construction d’ADN et son utilisation selon l’invention sont plus particulièrement adaptées au traitement des pathologies de la rétine par le biais d’une injection de la construction d’ADN dans le muscle ciliaire suivie d’un électrotransfert pour la production intraoculaire et durable des protéines thérapeutiques d’intérêt.
Technique antérieure
La cécité liée aux maladies métaboliques, inflammatoires ou à l’âge est en forte croissance et pose un problème de société de plus en plus significatif en Europe et dans le monde en terme de santé publique. Les causes principales de cécité sont liées à des pathologies de la rétine, parmi lesquelles la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), les rétinopathies diabétiques (RD), Tuvéite, le glaucome, les rétinites pigmentaires, les hémorragies consécutives au trauma oculaires et le décollement de rétine. La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) entraînant une cécité a une prévalence de l’ordre de 8,7%, affecte près de 26% de la population de 50 ans et plus. La DMLA devient un problème majeur de santé publique et social en raison de l’accroissement de l’âge de la population. L’augmentation constante et majeure de l’incidence du diabète est la cause majeure des rétinopathies diabétiques (RD) qui deviennent à leur tour une priorité de santé publique et de recherche scientifique. Les statistiques montrent que le diabète de type II touchera d’ici 2030 plus de 4,5% de la population dont près de 30% souffrira de rétinopathie diabétique. Enfin, Tuvéite représente un groupe de maladies inflammatoires oculaires dont la prévalence est estimée à 1/1000 et l’incidence à 0,5/1000. L’uvéite est responsable de 10% des cas de cécité et a donc, bien que plus rare que les maladies précédentes, un impact social et économique majeur chez de jeunes patients en âge de travailler. Le glaucome est la deuxième cause de cécité irréversible dans le monde. Le nombre de personnes atteintes de glaucome dans le monde devrait passer de 76 millions en 2020 à 111 millions en 2040. Le glaucome se caractérise par une pression intraoculaire anormale induisant une neuropathie optique progressive caractérisée par une dégénérescence des cellules ganglionnaires rétiniennes et une perte du champ visuel. La pression intraoculaire est actuellement le seul facteur de risque pour lequel il existe des traitements. Cependant, les dommages glaucomateux persistent chez près de 50% des patients, malgré une baisse de la pression intraoculaire. Les rétinites pigmentaires représentent un groupe cliniquement et génétiquement hétérogène de troubles héréditaires de la rétine caractérisés par une perte progressive des photorécepteurs en périphérie de la rétine qui progresse ensuite vers la macula. La déficience visuelle se manifeste généralement par une cécité nocturne et une perte progressive du champ visuel. Sa prévalence est de 1/3000 à 1/5000. Plus de 50 gènes responsables de rétinites pigmentaires ont été identifiés à ce jour.
Pour traiter certaines de ces pathologies, des injections intraoculaires, voire intravitréennes, d’agents thérapeutiques ont été développées. En 2006, les premières protéines thérapeutiques de type anti-VEGF (pour Vascular Endothélial Growth Factor ou facteur de croissance de l’endothélium vasculaire) ont été administrées par voie intraoculaire pour le traitement des néovascularisations choroïdiennes de la DMLA. On citera notamment en tant qu’ exemple de protéine de type anti-VEGF le Lucentis® (ranibizumab) qui a obtenu une autorisation de mise sur le marché pour le traitement des néovascularisations choroïdiennes de la DMLA et de l’œdème diabétique maculaire. Les injections intraoculaires de protéines thérapeutiques, et notamment de protéines recombinantes, sont devenues depuis communes pour le traitement des œdèmes maculaires de la DMLA, de la rétinopathie diabétique et des occlusions veineuses. Afin d’assurer un effet continu sur les pathologies oculaires, les anti-VEGF décrits ci-dessus sont administrés une fois par mois ou au mieux une fois tous les deux mois selon les patients. Il y a donc une nécessité de suivi de chaque patient afin de déterminer la fréquence d’administration des anti-VEGF pour que le traitement soit pleinement efficace. Ce suivi engendre une contrainte importante pour les patients, les aidants ainsi que pour les soignants qui le plus souvent résulte en un traitement sous-optimal et peu efficace sur le long terme (Ciulla 2020, Ophthalmology Retina 2020;4:19-30). Par ailleurs, cette méthode de traitement induit des variations du taux de protéine thérapeutique dans la sphère oculaire du patient, à savoir une concentration importante lors de l’injection (un pic) et une concentration qui s’amenuise petit à petit pour tendre vers zéro jusqu’à l’injection suivante. La concentration en protéine thérapeutique n’est donc pas régulière et n’est pas optimale pour toute la durée du traitement. De plus le risque d’effets secondaires associés à l'administration intravitréenne augmente avec la répétition des administrations (Schargus 2020, Clinical Ophthalmology 2020:14 897-904).
Parmi les pathologies oculaires, l’uvéite est définie comme un processus inflammatoire qui affecte l’iris, le corps ciliaire ou la choroïde de l’œil du patient, ces trois éléments formant l’uvée. C’est un terme générique qui couvre plusieurs pathologies différentes dont les causes demeurent inconnues mais sont généralement de deux types : les uvéites infectieuses et les uvéites non infectieuses. On distingue l’uvéite antérieure qui touche l’iris ou le corps ciliaire et est la plus commune des uvéites dans les pays de l’ouest, de l’uvéite intermédiaire qui touche le vitré antérieur, et l’uvéite postérieure qui touche la choroïde et la rétine. L’uvéite non infectieuse a souvent une composante autoimmune. L’uvéite antérieure aigue associée à l’antigène HLA-B27 représente la première cause d’uvéite (Rothova et a 1., Br J Ophthalmol. 1992; 76:137-41). Par ailleurs on retrouve des uvéites antérieures associées à de nombreuses maladies rhumatologiques telles la sarcoïdose. L’uvéite postérieure de cause non infectieuse est le plus souvent associée à la maladie de Behçet, à la maladie de Vogt Koyanagi Harada, à la chorio-rétinopathie de Birdshot, etc.
Le traitement avec des corticoïdes par voie orale et/ou topique est largement utilisé dans le traitement des uvéites postérieures non infectieuses. De plus, pour les pathologies les plus réfractaires, des immunosuppresseurs peuvent être ajoutés au traitement pour augmenter les effets anti-inflammatoires des corticostéroïdes. Ceci concerne notamment mais pas exclusivement la cyclosporine, le methotrexate, G azathioprine, le mycophénolate mofétil, le tacrolimus et le chlorambucil. Depuis une dizaine d’années, des traitements utilisant des anticorps anti-TNF alpha peuvent également été utilisés dont Humira® (Adalimumab) récemment approuvé pour le traitement de l’uvéite non infectieuse avec inflammation de l’arrière de l’œil.
Des essais cliniques portant sur l’utilisation des composés thérapeutiques suivants : cyclosporine A, rapamycine, tacrolimus, et anti-TNF alpha, ont été menés pour évaluer l’efficacité et la sûreté de ces composés et ainsi pouvoir traiter des pathologies oculaires autoimmunes comme la maladie de Behçet. Il a cependant été montré que l’administration systémique de ces composés thérapeutiques conduit à long terme à de nombreux effets secondaires et que pour certains d’entre eux, leur administration locale présente peu d’efficacité ou une mauvaise tolérance par le patient.
Les méthodes de traitement décrites ci-dessus présentent donc plusieurs inconvénients. Les composés thérapeutiques administrés par voie systémique et topique entraînent de très nombreux effets secondaires. Les protéines recombinantes administrées par injections intra vitréennes doivent être administrées fréquemment avec des fluctuations importantes des concentrations entre chaque administration. La répétition de ces injections reste extrêmement lourdes et stressantes pour les patients et peuvent engendrer également des effets secondaires (élévation de la pression intraoculaire, inflammation intraoculaire, endophtalmie, cataracte, etc). Ainsi, au final, de nombreux patients renoncent à leur traitement.
Afin de surmonter ce problème, les inventeurs ont précédemment proposé, comme notamment illustré dans la demande FR3031112, de diminuer le nombre et/ou la fréquence des interventions du chirurgien, et donc de réduire l’aspect invasif des injections intra oculaires, tout en assurant une production stable et constante d’une protéine thérapeutique pendant une durée de plusieurs mois via la mise en œuvre d’une construction d’ADN destinée au transfert non viral d’acides nucléiques dans les cellules musculaires de la sphère oculaire d’un patient. Cette construction comprend une origine de réplication, un promoteur permettant l’expression de G ADN dans la sphère oculaire du patient, une ou plusieurs séquences favorisant l’expression de l’ADN dans la sphère oculaire du patient, et un polynucléotide codant pour une protéine thérapeutique sélectionnée pour son activité dans le traitement des pathologies oculaires, ladite construction étant amenée dans la sphère oculaire par injection directe dans le muscle ciliaire suivie d’un électrotransfert.
Le traitement des pathologies oculaires précédemment mentionnées peut toutefois nécessiter la mise en œuvre de deux actifs thérapeutiques, d’un second composé venant potentialiser l’efficacité d’un actif thérapeutique, ou d’un composé constitué de 2 sous-unités peptidiques. Dans le cadre de la méthode mentionnée ci-dessus, il pourrait ainsi être envisagé d’administrer au patient une composition comprenant deux types de constructions d’ADN, se distinguant en ce qu’un premier type permet l’expression de la première molécule d’intérêt tandis qu’un second type permet l’expression de la seconde molécule d’intérêt. Une telle méthode ne serait toutefois pas idéale, (i) en ce qu’elle nécessiterait le développement de deux produits, ce qui conduirait à une augmentation des coûts de développement et de production, et à la nécessité d’évaluer l’activité et la sécurité de chacun des produits pris séparément et en combinaison, (ii) en ce qu’elle imposerait une contrainte importante en terme de dosage, réduisant de moitié la dose maximale de chacun des deux actifs thérapeutiques pouvant être administrés, et enfin (iii) en ce qu’elle ne permettrait pas la maîtrise complète de la quantité de chacune de ces constructions pénétrant les cellules ciblées, ce qui conduirait par conséquent à une incertitude quant au ratio entre ces molécules d’intérêt exprimées au niveau de l’œil. De telles contraintes et incertitudes ne sont pas souhaitables dans le cadre du traitement d’une pathologie.
Les inventeurs proposent par conséquent, dans le cadre de la présente invention, la mise en œuvre d’une construction d’ADN comprenant les séquences codant pour les deux protéines d’intérêt. Résumé de l’invention
Un premier objet de la présente invention concerne donc une construction d’ADN pour son utilisation dans le traitement d’une pathologie oculaire, ladite construction d’ADN étant destinée au transfert non viral d’acides nucléiques dans les cellules musculaires de la sphère oculaire d’un patient souffrant de ladite pathologie oculaire ; ladite construction d’ADN étant caractérisée en ce qu’elle comprend :
(a) une origine de réplication bactérienne ou procaryotique, en particulier bactérienne,
(b) une ou plusieurs séquences favorisant l’expression de l’ADN dans la sphère oculaire du patient,
(c) une première séquence nucléotidique codant :
- pour une première protéine thérapeutique, et
- pour un peptide signal permettant la sécrétion de cette première protéine thérapeutique, ce peptide signal étant contiguë de la séquence de la première protéine thérapeutique, en N- terminal de ladite première protéine thérapeutique ;
(d) un promoteur permettant l’expression de cette première protéine thérapeutique dans la sphère oculaire du patient ;
(e) une séquence de polyadénylation en 3’ de la première séquence nucléotidique ;
(f) une seconde séquence nucléotidique codant :
- pour une seconde protéine thérapeutique, différente de la première protéine thérapeutique, et
- pour un peptide signal permettant la sécrétion de cette seconde protéine thérapeutique, le peptide signal étant contiguë de la séquence de la seconde protéine thérapeutique, en N- terminal de ladite seconde protéine thérapeutique ;
(g) un promoteur permettant l’expression de cette seconde protéine thérapeutique dans la sphère oculaire du patient ; et
(h) une séquence de polyadénylation en 3’ de la seconde séquence nucléotidique ; ladite construction d’ADN étant administrée au patient par injection dans un muscle ciliaire puis électrotransfert dans les cellules du muscle ciliaire.
En effet, et contre toute attente, l’augmentation significative de la taille de la construction d’ADN, conséquence de l’introduction non pas d’une mais de deux séquences codant pour les molécules d’intérêt, n’affecte pas négativement sa capacité à pénétrer les cellules ciblées dans le cadre d’une méthode telle qu’indiquée ci-dessus, comprenant non seulement l’injection directe dans le muscle ciliaire de ladite construction, mais également une étape d’électrotransfert.
Par conséquent, une méthode et une construction selon l’invention permettent avantageusement, et contre toute attente :
- non seulement de démultiplier les possibilités de traitements de pathologies oculaires, en permettant la production in situ de deux actifs ou d’un actif et d’un composé apte à potentialiser l’activité/1’ efficacité de l’actif ;
- mais également de conserver, sans les diminuer, les avantages de la méthode indiquée ci- dessus en termes de nombre / de fréquence réduit(e) des interventions du chirurgien, et par conséquent de réduction de l’aspect invasif des injections intra oculaires, tout en assurant une production stable et constante des protéines thérapeutiques pendant une durée de plusieurs mois.
Selon un mode de réalisation, la première protéine thérapeutique d’une construction d’ADN selon l’invention est une protéine de type anti-VEGF, en particulier choisie dans le groupe constitué de S-Fltl, l’Aflibercept, le conbercept, le brolucizumab, et en particulier d’une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence peptidique SEQ ID NO : 3, cette protéine étant plus particulièrement l’Aflibercept.
Selon un mode de réalisation, la première protéine thérapeutique est encodée par une séquence nucléotidique ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est plus particulièrement encodée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 2.
Selon un mode de réalisation, la seconde protéine thérapeutique d’une construction d’ADN selon l’invention est une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 8, cette protéine étant plus particulièrement la décorine.
Selon un mode de réalisation, la seconde protéine thérapeutique est encodée par une séquence nucléotidique ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6, et en particulier par une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 12, plus particulièrement constitué par la séquence SEQ ID NO : 7 et la séquence SEQ ID NO : 1, et en particulier la séquence SEQ ID NO : 11.
Selon un mode de réalisation, une construction d’ADN pour son utilisation selon l’invention est telle que :
(c) la première séquence nucléotidique code : - pour une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, cette protéine étant plus particulièrement Aflibercept ; et
- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 4 ; et (f) la seconde séquence nucléotidique code :
- pour une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 8, cette protéine étant plus particulièrement la décorine ; et
- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 13.
Selon un mode de réalisation, l’origine de réplication d’une construction d’ADN telle que mentionnée ci-dessus est bactérienne, et est en particulier une origine de réplication issue du plasmide naturel R6K d ’Escherichia coli , en particulier l’origine de réplication R6K gamma du plasmide naturel R6k d ’ Escherichia coli, notamment de séquence SEQ ID NO : 31.
La construction d’ADN selon l’invention peut être de forme linéaire ou circulaire, en particulier de forme circulaire. Dans un mode de réalisation particulier, la construction d’ADN selon l’invention est un plasmide circulaire.
Dans un mode de réalisation particulier, la construction d’ADN est une construction d’ADN nu.
Selon un mode de réalisation, une construction d’ADN pour son utilisation telle que mentionnée ci-dessus est caractérisée en ce que la pathologie oculaire est une dégénérescence rétinienne, en particulier une dégénérescence rétinienne choisie dans le groupe constitué de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), humide ou sèche ; des rétinopathies diabétiques (RD) ; d’une occlusion veineuse rétinienne, en particulier d’une occlusion de la veine centrale de la rétine (OVCR) ou d’une occlusion de la branche veineuse rétinienne (OBVR) ; d’une néovascularisation choroïdienne (NVC) myopique ; d’une uvéite, en particulier d’une uvéite non infectieuse ; d’une rétinite pigmentaire et d’un glaucome, et plus particulièrement en ce que la dégénérescence rétinienne est choisie dans le groupe constitué de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), en particulier de la forme néovasculaire (humide) de la DMLA ; d’une baisse d’acuité visuelle due à un œdème maculaire diabétique (OMD) ; d’une occlusion veineuse rétinienne, en particulier d’une occlusion de la veine centrale de la rétine (OVCR) ou d’une occlusion de la branche veineuse rétinienne (OBVR) ; et d’une néovascularisation choroïdienne (NVC) myopique.
Un autre objet de la présente invention concerne une construction d’ADN destinée au transfert non viral d’acides nucléiques dans les cellules musculaires de la sphère oculaire d’un patient pour le traitement de pathologies oculaires caractérisée en ce qu’elle comprend : (a) une origine de réplication bactérienne ou procaryotique, en particulier bactérienne,
(b) une ou plusieurs séquences favorisant l’expression de l’ADN dans la sphère oculaire du patient,
(c) une première séquence nucléotidique codant :
- pour une première protéine thérapeutique, ladite première protéine thérapeutique étant une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, cette protéine étant plus particulièrement G Aflibercept, et
- pour un peptide signal permettant la sécrétion de cette première protéine thérapeutique, en particulier un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 4, ce peptide signal étant contiguë de la séquence de la première protéine thérapeutique, en N- terminal de ladite première protéine thérapeutique ;
(d) un promoteur permettant l’expression de cette première protéine thérapeutique dans la sphère oculaire du patient ;
(e) une séquence de polyadénylation en 3’ de la première séquence nucléotidique ;
(f) une seconde séquence nucléotidique codant :
- pour une seconde protéine thérapeutique, ladite seconde protéine thérapeutique étant une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 8, cette protéine étant plus particulièrement la décorine, et
- pour un peptide signal permettant la sécrétion de cette première protéine thérapeutique, en particulier un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 13, ce peptide signal étant contiguë de la séquence de la seconde protéine thérapeutique, en N- terminal de ladite seconde protéine thérapeutique ;
(g) un promoteur permettant l’expression de cette seconde protéine thérapeutique dans la sphère oculaire du patient ; et
(h) une séquence de polyadénylation en 3’ de la seconde séquence nucléotidique.
En particulier, la construction d’ADN selon l’invention est telle que : c) la première séquence nucléotidique comprend :
- une séquence nucléotidique codant pour G Aflibercept, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 2 ; et
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 codant pour un peptide signal ; et (f) la seconde séquence nucléotidique comprend : - une séquence nucléotidique codant pour la décorine, plus particulièrement une séquence nucléotidique ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6, plus particulièrement d’une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 12, et est en particulier la séquence SEQ ID NO : 7 ou la séquence SEQ ID NO : 11 ; et
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 14 codant pour un peptide signal.
Brève description des dessins
La Figure 1 représente une construction d’ADN conforme à l’invention (Plasmide A).
La Figure 2 représente une construction d’ADN non conforme à l’invention car ne codant que pour une seule protéine thérapeutique (la transferrine - même séquence que celle utilisée dans le Plasmide A), celle-ci étant, tout comme dans le Plasmide A, sous le contrôle d’un promoteur de type CMV (Plasmide a’).
La Figure 3 représente la variation de la concentration en Transferrine de séquence SEQ ID NO : 17 (ordinate : pg/mL) dans les fluides oculaires de rats de 3 à 30 jours (abscisse : jours post-électrotransfert (J0)) après l’administration d’une construction, conforme à l’invention (Plasmide A) ou d’une construction non conforme à l’invention (Plasmide a’) car ne codant que pour la transferrine, celle-ci étant sous le contrôle du même promoteur que dans le plasmide A, dans le muscle ciliaire des deux yeux desdits rats. Chaque groupe de rats s’est ainsi vu administrer une construction spécifique parmi les deux mentionnées.
La Figure 4 représente la variation de la concentration en protéine de fusion anti-TNF-alpha de séquence SEQ ID NO : 22 (ordinate : pg/mL) dans les fluides oculaires de rats de 3 à 30 jours (abscisse : jours post-électrotransfert (J0)) après l’administration d’une construction, conforme à l’invention (Plasmide A) dans le muscle ciliaire des deux yeux desdits rats.
La Figure 5 représente une construction d’ADN conforme à l’invention (Plasmide B).
La Figure 6 représente une construction d’ADN non conforme à l’invention car ne codant que pour une seule protéine thérapeutique (l’aflibercept - même séquence que celle utilisée dans le Plasmide B, i.e. séquence SEQ ID NO : 2), celle-ci étant, tout comme dans le Plasmide B, sous le contrôle d’un promoteur de type CAG (Plasmide b’).
La Figure 7 représente la variation de la concentration en Aflibercept de séquence SEQ ID NO : 3 (ordinate : pg/mL) dans les fluides oculaires de rats de 3 à 21 jours (abscisse : jours post électrotransfert (J0)) après l’administration d’une construction conforme à l’invention (Plasmide B) ou d’une construction non conforme à l’invention (Plasmide b’) car ne codant que pour l’aflibercept, celle-ci étant sous le contrôle du même promoteur que dans le plasmide B, dans le muscle ciliaire des deux yeux desdits rats. Chaque groupe de rats s’est ainsi vu administrer une construction spécifique parmi les deux mentionnées.
La Figure 8 représente la variation de la concentration en Décorine de séquence SEQ ID NO : 8 (ordinate : pg/mL) dans les fluides oculaires de rats de 3 à 21 jours (abscisse : jours post électrotransfert (J0)) après l’administration d’une construction conforme à l’invention (Plasmide B) dans le muscle ciliaire des deux yeux desdits rats.
La Figure 9 représente une construction d’ADN conforme à l’invention (Plasmide C).
La Figure 10 représente le pourcentage d’impact présentant une fuite sévère (grade 3) (ordonnée : % Grade 3 CNV Lésions) en fonction des traitements (abscisse). A gauche : véhicule (contrôle). A droite : Plasmide C.
Description détaillée
Définitions
Dans le contexte du présent texte, les termes « traiter » et « traitement » associés à une pathologie oculaire, désignent une diminution, voire une interruption de ladite pathologie.
Le terme « patient » tel qu’utilisé dans le présent texte désigne de préférence un mammifère, y compris un mammifère non-humain, et plus particulièrement un être humain.
Les termes « première séquence nucléotidique » et « seconde séquence nucléotidique » sont utilisés dans le présent texte afin de permettre, lors de la lecture de celui-ci, de clairement faire la distinction entre ces deux séquences et les protéines qu’elles encodent.
De telles séquences nucléotidiques correspondent à des cassettes d’expression, chacune de ces cassettes étant telle que définie ci-après.
Ces termes de « première séquence nucléotidique » et « seconde séquence nucléotidique » ne visent toutefois pas à indiquer l’ordre dans lequel ces séquences/cassettes d’expression sont présentent dans une construction selon l’invention. Ainsi, selon un mode de réalisation, dans le sens de lecture d’une construction selon l’invention, la première séquence nucléotidique peut être présente avant la seconde séquence nucléotidique. Dans un autre mode de réalisation, dans le sens de lecture d’une construction selon l’invention, la seconde séquence nucléotidique peut être présente avant la première séquence nucléotidique.
Conformément à ce qui est précédemment indiqué, la « première séquence nucléotidique » comprend une séquence codant pour une première protéine thérapeutique et une séquence codant pour un peptide signal, ces séquences étant, au sein de la « première séquence nucléotidique », dans l’ordre tel que spécifiquement indiqué les unes par rapport aux autres, à savoir que la séquence codant pour le peptide signal est telle que le peptide signal est en N- terminal de la première protéine thérapeutique, i.e. la séquence codant pour le peptide signal est en 5’ de la séquence codant pour la première protéine thérapeutique.
De même, et en conformité avec ce qui est précédemment indiqué, la « seconde séquence nucléotidique » comprend une séquence codant pour une seconde protéine thérapeutique et une séquence codant pour un peptide signal, ces séquences étant, au sein de la « seconde séquence nucléotidique », dans l’ordre tel que spécifiquement indiqué les unes par rapport aux autres, à savoir que la séquence codant pour le peptide signal est telle que le peptide signal est en N- terminal de la seconde protéine thérapeutique, i.e. la séquence codant pour le peptide signal est en 5’ de la séquence codant pour la seconde protéine thérapeutique.
Le "pourcentage d'identité" entre deux séquences d’acides aminés ou d'acides nucléiques, au sens de la présente invention, est déterminé en comparant les deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.
La partie de la séquence nucléotidique dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des " gaps ") par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal entre les deux séquences.
Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles un acide aminé identique (ou une base nucléique identique) est observé pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux acides aminés (ou entre les deux bases nucléiques) par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité en acides aminés (ou en nucléotides) des deux séquences entre elles.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus.
De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité de séquence est déterminé à l'aide du logiciel CLUSTAL W (version 1 .82) les paramètres étant fixés comme suit : (1 ) CPU MODE = ClustalW mp ; (2) ALIGNMENT = " full " ; (3) OUTPUT FORMAT = " aln w/numbers " ; (4) OUTPUT ORDER = " aligned " ; (5) COLOR ALIGNMENT = " no " ; (6) KTUP (word size) = " default " ; (7) WINDOW LENGTH = " default " ; (8) SCORE TYPE = " percent " ; (9) TOPDIAG = " default " ; (10) PAIRGAP = " default " ; (1 1 ) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = " none " ; (12) MATRIX = " default " ; (13) GAP OPEN = " default " ; (14) END GAPS = " default " ; (15) GAP EXTENSION = " default " ; (16) GAP DISTANCES = " default " ; (17) TREE TYPE = " cladogram " et (18) TREE GRAP DISTANCES = " hide
Au sens de l’invention, une séquence d’acides aminés ayant par exemple au moins 80 % d’identité en acides aminés avec une séquence d’acides aminés de référence englobe les séquences d’acides aminés ayant au moins 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou au moins 99 % d’identité en acides aminés avec ladite séquence de référence.
Au sens de l’invention, une séquence nucléotidique ayant par exemple au moins 80 % d’identité en nucléotides avec une séquence nucléotidique de référence englobe les séquences nucléotidiques ayant au moins 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou au moins 99 % d’identité en nucléotides avec ladite séquence de référence.
Construction d’ADN
Comme précédemment indiqué, la présente invention concerne en premier lieu une construction d’ADN pour son utilisation dans le traitement d’une pathologie oculaire.
Cette construction est destinée au transfert non viral d’acides nucléiques dans les cellules musculaires de la sphère oculaire d’un patient souffrant de ladite pathologie oculaire.
Par ailleurs, une construction d’ADN selon la présente invention est caractérisée en ce qu’elle comprend (a) une origine de réplication bactérienne ou procary otique.
Selon un mode de réalisation particulier, une telle origine de réplication est en particulier bactérienne et peut par exemple être une origine de réplication de type Escherichia coli , plus particulièrement choisie dans le groupe constitué d’une origine de réplication issue du plasmide naturel R6K d’ Escherichia coli, en particulier l’origine de réplication R6K gamma du plasmide naturel R6k d’ Escherichia coli ; et de l’origine de réplication pUC OriC.
Les origines de réplication issue du plasmide naturel R6K d’ Escherichia coli sont en particulier définies dans le brevet EP1366176B2.
Une construction d’ADN selon l’invention est par ailleurs caractérisée en ce qu’elle comprend (b) une ou plusieurs séquence(s) favorisant l’expression de l’ADN dans la sphère oculaire du patient. De telles séquences favorisant l’expression de l’ADN sont bien connues de l’homme du métier, telles que par exemples les séquences de type enhancer, également appelées des séquences amplificatrices ou activatrices. Peuvent par exemple être mentionnées les séquences enhancer issues de cytomégalovirus (CMV) et/ou du virus tumoral à ADN simien SV40.
Une construction d’ADN selon l’invention est par ailleurs également caractérisée en ce qu’elle comprend (c) une première séquence nucléotidique codant notamment pour une première protéine thérapeutique ainsi que (f) une seconde séquence nucléotidique codant notamment pour une seconde protéine thérapeutique, différente de la première protéine thérapeutique. Selon un mode de réalisation particulier, une construction d’ADN selon l’invention ne comprend que deux séquences codant pour des protéines thérapeutiques, i.e. ne comprend que deux cassettes d’expression, chacune de ces cassettes d’expression comprenant l’une des deux séquences codant pour une protéine thérapeutique.
Ces premières et secondes protéines thérapeutiques peuvent notamment être choisies parmi les protéines connues pour leur effet sur les pathologies oculaires.
Les effets de ces deux protéines peuvent être additionnels ou complémentaires. Par ailleurs, l’une de ces deux protéines peut avoir un effet potentialisateur de l’activité thérapeutique de l’autre protéine produite à partir de la construction d’ADN selon l’invention.
En particulier, les premières et secondes protéines thérapeutiques, différentes l’une de l’autre, peuvent par exemple être choisies dans le groupe constitué :
(i) d’une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 17, cette protéine étant plus particulièrement la transferrine ;
(ii) d’une protéine ayant des propriétés anti-fibrotiques, telle que la protéine BMP7 (Bone
Morphogenic Protein 7), une protéine de type anti TGF-beta, une protéine de type anti FGF2, une protéine de type anti CTGF (connective tissue growth factor), et en particulier d’une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 8, cette protéine étant plus particulièrement la décorine;
(iii) d’une protéine ayant des propriétés anti-inflammatoires, en particulier d’une protéine de type anti-TNF, tel que par exemple hTNFR-Is, hTNFR-Is/mlgGl, le Lenercept ou la protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl, plus particulièrement une protéine de type anti TNF-alpha, en particulier une protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl (Peppel et al., J Exp Med, 174 : 1483-1489 - Murphy et al., Arch Ophtalmol, 22 :845-851), et plus particulièrement une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 22 ; (iv) d’une protéine de type anti-VEGF, en particulier choisie dans le groupe constitué de S-Fltl, l’Aflibercept, le conbercept, le brolucizumab, et en particulier d’une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence peptidique SEQ ID NO : 3, cette protéine étant plus particulièrement l’Aflibercept ;
(v) d’une protéine ayant des propriétés anti-angiogéniques, telle que l’angiostatine, l’endostatine, la thrombospondine, une protéine de type anti angiopoiétine-2, une protéine de type anti FGF2, une protéine de type anti PLGF, une protéine de type anti PDGF ; et
(vi) d’une protéine régulant l’activation du complément, telle que le facteur I du complément (CFI), et une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 26, cette protéine étant plus particulièrement le facteur H du complément.
En particulier, (i) une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 17 comprend une protéine ayant au moins 86%, au moins 87%, au moins 88%, au moins 89%, au moins 90%, au moins 91%, au moins 92%, au moins 93%, au moins 93%, au moins 94%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% et 100% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 17. En particulier, cette protéine est plus particulièrement la transferrine (i.e. une protéine ayant 100% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 17).
En particulier, (ii) une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 8 comprend une protéine ayant au moins 86%, au moins 87%, au moins 88%, au moins 89%, au moins 90%, au moins 91%, au moins 92%, au moins 93%, au moins 93%, au moins 94%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% et 100% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 8. En particulier, cette protéine est plus particulièrement la décorine (i.e. une protéine ayant 100% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 8).
En particulier, (iii) une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la protéine de fusion de séquence SEQ ID NO : 22 comprend une protéine ayant au moins 86%, au moins 87%, au moins 88%, au moins 89%, au moins 90%, au moins 91%, au moins 92%, au moins 93%, au moins 93%, au moins 94%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% et 100% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 22. En particulier, cette protéine est plus particulièrement la protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl de séquence SEQ ID NO : 22. En particulier, (iv) une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3 comprend une protéine ayant au moins 86%, au moins 87%, au moins 88%, au moins 89%, au moins 90%, au moins 91%, au moins 92%, au moins 93%, au moins 93%, au moins 94%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% et 100% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3. En particulier, cette protéine est plus particulièrement l’aflibercept (i.e. une protéine ayant 100% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3).
En particulier, (vi) une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 26 comprend une protéine ayant au moins 86%, au moins 87%, au moins 88%, au moins 89%, au moins 90%, au moins 91%, au moins 92%, au moins 93%, au moins 93%, au moins 94%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% et 100% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 26. En particulier, cette protéine est plus particulièrement le facteur H du complément (i.e. une protéine ayant 100% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 26).
En particulier, les séquences codant pour les premières et secondes protéines thérapeutiques, différentes l’une de l’autre, peuvent par exemple être choisies dans le groupe constitué :
(i) d’une séquence nucléotidique codant pour la transferrine, en particulier d’une séquence nucléotidique ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 15, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 16;
(ii) d’une séquence nucléotidique codant pour une protéine ayant des propriétés anti- fibrotiques, telle que la protéine BMP7 (Bone Morphogenic Protein 7), une protéine de type anti TGF-beta, une protéine de type anti FGF2, une protéine de type anti CTGF (connective tissue growth factor), et en particulier d’une protéine codant pour la décorine, plus particulièrement d’une séquence nucléotidique ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6, plus particulièrement d’une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 12, et est en particulier la séquence SEQ ID NO : 7 ou la séquence SEQ ID NO : 11, et plus particulièrement la séquence SEQ ID NO : 11;
(iii) d’une séquence nucléotidique codant pour une protéine ayant des propriétés anti- inflammatoires, en particulier d’une protéine de type anti-TNF, tel que par exemple hTNFR-Is, hTNFR-Is/mlgGl, le Lenercept ou la protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl, plus particulièrement une séquence codant pour une protéine de type anti TNF-alpha, en particulier une protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl, et plus particulièrement une séquence ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 21 ;
(iv) d’une séquence nucléotidique codant pour une protéine de type anti-VEGF, tel que S-Fltl, l’Aflibercept, le conbercept, le brolucizumab, et en particulier d’une séquence codant pour F Aflibercept, plus particulièrement d’une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, notamment la séquence SEQ ID NO : 2 ;
(v) d’une séquence codant pour une protéine ayant des propriétés anti-angiogéniques, telle que l’angiostatine, l’endostatine, la thrombospondine, une protéine de type anti angiopoiétine-2, une protéine de type anti FGF2, une protéine de type anti PLGF, une protéine de type anti PDGF ; et
(vi) d’une séquence codant pour une protéine régulant l’activation du complément, telle que le facteur I du complément (CFI), et le facteur H du complément, et en particulier une séquence codant pour le facteur H du complément, plus particulièrement une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 25.
Par « séquences codant pour les premières et secondes protéines thérapeutiques », il ne faut pas entendre « première séquence nucléotidique » et « seconde séquence nucléotidique » telles qu’indiquées précédemment, mais bien les séquences qui sont présentent au sein de la première séquence nucléotidique et au sein de la seconde séquence nucléotidique selon l’invention, et qui codent spécifiquement pour la première et la seconde protéines thérapeutiques.
Selon un mode de réalisation, la première ou la seconde protéine thérapeutique d’une construction d’ADN selon l’invention est une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 17, cette protéine étant plus particulièrement la transferrine.
En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que la première séquence nucléotidique ou la seconde séquence nucléotidique code :
- pour une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 17, cette protéine étant plus particulièrement la transferrine ; et
- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 18. Ainsi, l’une des séquences codant pour les premières et secondes protéines thérapeutiques d’une construction d’ADN selon l’invention peut en particulier être une séquence nucléotidique codant pour la transferrine, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 15, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 16. En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que la première séquence nucléotidique ou la seconde séquence nucléotidique comprend :
- une séquence nucléotidique codant pour la transferrine, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 15, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 16 ; et
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 20 codant pour un peptide signal.
Selon un mode de réalisation, les premières et secondes protéines thérapeutiques codées par une construction d’ADN selon l’invention sont respectivement :
- une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 17, cette protéine étant plus particulièrement la transferrine ; et
- une protéine de type anti-TNF-alpha, en particulier une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 22, et plus particulièrement la protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl de séquence SEQ ID NO : 22.
Ainsi, selon un mode de réalisation, les séquences codant pour les premières et secondes protéines thérapeutiques d’une construction d’ADN selon l’invention sont respectivement :
- une séquence nucléotidique codant pour la transferrine, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 15, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 16; et
- une séquence codant pour une protéine de type anti-TNF-alpha, en particulier une séquence codant pour la protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl, de séquence peptidique SEQ ID NO : 22, et notamment une séquence nucléotidique ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 21.
L’inflammation et le stress oxydatif sont des composantes importantes des dégénérescences rétiniennes telles que la DMLA ou la neuropathie glaucomateuse consécutive à l’augmentation de la pression intraoculaire engendrée par le glaucome. En particulier, une augmentation des concentrations intraoculaires en TNF alpha est observée dans les yeux glaucomateux (Tezel et al., 2001, Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001 Jul; 42(8): 1787-94) etTinjection de TNF-alpha dans l’œil de rongeur induit une dégénérescence axonale du nerf optique et une mort programmée des cellules ganglionnaires de la rétine (Kitaoka 2006, Invest Ophthalmol Vis Sci. 2006;47:1448-1457). Une augmentation de l’expression des gènes régulant le taux de fer a aussi été observée dans les yeux glaucomateux suggérant que le stress oxydatif induit par le fer puisse jouer un rôle dans la pathogenèse du glaucome (Farkas et al., 2004). L’administration d’un anti-TNF et d’un chélateur du fer, tel que la transferrine, permet avantageusement de réduire à la fois l’inflammation et le stress oxydatif médié par le fer.
En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que :
(c) la première séquence nucléotidique comprend :
- une séquence nucléotidique codant pour la transferrine, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 15, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 16 ; et
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 20 codant pour un peptide signal ; et (f) la seconde séquence nucléotidique comprend :
- une séquence nucléotidique codant pour une protéine de type anti-TNF-alpha, en particulier une séquence codant pour la protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl, de séquence peptidique SEQ ID NO : 22, et notamment une séquence nucléotidique ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 21, et en particulier la séquence SEQ ID NO : 21 ; et
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 23 codant pour un peptide signal.
En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que :
(c) la première séquence nucléotidique code :
- pour une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 17, cette protéine étant plus particulièrement la transferrine ; et
- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 18 ; et (f) la seconde séquence nucléotidique code :
- pour une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 22, cette protéine étant plus particulièrement la protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de G immunoglobuline humaine IgGl de séquence SEQ ID NO : 22 ; et
- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 23.
Selon un autre mode de réalisation, les premières et secondes protéines thérapeutiques codées par une construction d’ADN selon l’invention sont respectivement :
- une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 17, cette protéine étant plus particulièrement la transferrine ; et
- une protéine ayant des propriétés anti-fibrotiques, en particulier une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 8, cette protéine étant plus particulièrement la décorine.
Ainsi, selon un mode de réalisation, les séquences codant pour les premières et secondes protéines thérapeutiques d’une construction d’ADN selon l’invention sont respectivement :
- une séquence nucléotidique codant pour la transferrine, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 15, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 16 ; et
- une séquence nucléotidique codant pour une protéine ayant des propriétés anti-fibrotiques, telle que la protéine BMP7 (Bone Morphogenic Protein 7), une protéine de type anti TGF-beta, une protéine de type anti FGF2, une protéine de type anti CTGF (connective tissue growth factor), et en particulier d’une protéine codant pour la décorine, plus particulièrement d’une séquence nucléotidique ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6, plus particulièrement d’une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 12, et est en particulier la séquence SEQ ID NO : 7 ou la séquence SEQ ID NO : 11, et plus particulièrement la séquence SEQ ID NO : 11.
Le glaucome, en particulier le glaucome à angle ouvert primaire, se caractérise par une augmentation de la pression intraoculaire consécutive à la fibrose du réseau trabéculaire, et par la perte des cellules ganglionnaires de la rétine et la dégénérescence du nerf optique. Les traitements actuels du glaucome réduisent la pression intraoculaire mais ne permettent pas de freiner l’évolution de la neurodégénérescence. L’administration d’un agent agissant comme neuroprotecteur, tel qu’un anti-TNF ou la transferrine, permet avantageusement de potentialiser les effets d’un anti-fibrotique tel que la décorine, et de réduire à la fois la pression intraoculaire et de protéger la rétine et le nerf optique de la dégénérescence.
En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que :
(c) la première séquence nucléotidique comprend :
- une séquence nucléotidique codant pour la transferrine, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 15, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 16 ; et
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 20 codant pour un peptide signal ; et (f) la seconde séquence nucléotidique comprend :
- une séquence nucléotidique codant pour la décorine, plus particulièrement une séquence nucléotidique ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6, plus particulièrement d’une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 12, et est en particulier la séquence SEQ ID NO : 7 ou la séquence SEQ ID NO : 11, et plus particulièrement la séquence SEQ ID NO : 11 ; et
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 14 codant pour un peptide signal.
En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que :
(c) la première séquence nucléotidique code :
- pour une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 17, cette protéine étant plus particulièrement la transferrine ; et
- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 18 ; et (f) la seconde séquence nucléotidique code :
- pour une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 8, cette protéine étant plus particulièrement la décorine ; et
- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 13.
Selon un mode de réalisation, la première ou la seconde protéine thérapeutique d’une construction d’ADN selon l’invention est une protéine de type anti-VEGF, en particulier d’une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, cette protéine étant plus particulièrement G Aflibercept. En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que la première séquence nucléotidique ou la seconde séquence nucléotidique code :
- pour une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, cette protéine étant plus particulièrement G Aflibercept ; et
- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 4.
Ainsi, l’une des séquences codant pour les premières et secondes protéines thérapeutiques d’une construction d’ADN selon l’invention peut en particulier être une séquence nucléotidique codant pour une protéine de type anti-VEGF, tel que S-Fltl, F Aflibercept, le conbercept, le brolucizumab, et en particulier d’une séquence codant pour F Aflibercept, plus particulièrement d’une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 2.
En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que la première séquence nucléotidique ou la seconde séquence nucléotidique comprend :
- une séquence nucléotidique codant pour F Aflibercept, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 2 ; et
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 codant pour un peptide signal.
Selon un autre mode de réalisation, les premières et secondes protéines thérapeutiques d’une construction d’ADN selon l’invention sont respectivement :
- une protéine ayant des propriétés anti-fibrotiques, en particulier d’une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 8, cette protéine étant plus particulièrement la décorine ; et
- une protéine de type anti-VEGF, en particulier d’une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, cette protéine étant plus particulièrement F Aflibercept.
Ainsi, selon un mode de réalisation, les séquences codant pour les premières et secondes protéines thérapeutiques d’une construction d’ADN selon l’invention sont respectivement :
- une séquence nucléotidique codant pour une protéine ayant des propriétés anti-fibrotiques, telle que la protéine BMP7 (Bone Morphogenic Protein 7), une protéine de type anti TGF-beta, une protéine de type anti FGF2, une protéine de type anti CTGF (connective tissue growth factor), et en particulier d’une protéine codant pour la décorine, plus particulièrement une séquence nucléotidique ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6, plus particulièrement une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 12, et est en particulier la séquence SEQ ID NO : 7 ou la séquence SEQ ID NO : 11 ; et
- une séquence nucléotidique codant pour une protéine de type anti-VEGF, tel que S-Fltl, FAflibercept, le conbercept, le brolucizumab, et en particulier d’une séquence codant pour l’Aflibercept, plus particulièrement d’une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, notamment la séquence SEQ ID NO : 2.
La présence de l’actif anti-fibrotique permet avantageusement de potentialiser les effets de l’anti-VEGF, améliorant ainsi l’efficacité de ce composé dans le traitement des pathologies oculaires visées. Notamment, il a été observé que même chez les patients recevant des injections d'anti-VEGF à des intervalles optimaux, le développement d'une fibrose sous-rétinienne apparaît avec le temps dans plus de la moitié des patients, réduisant l’efficacité des anti-VEGF au fil du temps (Daniel et al. 2014, Ophthalmology 121, 656-666). Par ailleurs, le développement de fibrose sous-rétinienne a été identifié comme une cause de mauvaise réponse thérapeutique aux anti-VEGF chez les patients DMLA non-répondeurs aux anti-VEGF (Cohen ét al. 2012, Retina 32, 1480-1485).
En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que :
(c) la première séquence nucléotidique comprend :
- une séquence nucléotidique codant pour l’Aflibercept, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 2 ; et
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 codant pour un peptide signal ; et (f) la seconde séquence nucléotidique comprend :
- une séquence nucléotidique codant pour la décorine, plus particulièrement une séquence nucléotidique ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6, plus particulièrement d’une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 12, et est en particulier la séquence SEQ ID NO : 7 ou la séquence SEQ ID NO : 11 ; et
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 14 codant pour un peptide signal.
En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que :
(c) la première séquence nucléotidique comprend : - une séquence nucléotidique codant pour G Aflibercept, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 2 ; et
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 codant pour un peptide signal ; et (f) la seconde séquence nucléotidique comprend :
- une séquence nucléotidique codant pour la décorine, plus particulièrement la séquence SEQ ID NO : 7 ; et
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 14 codant pour un peptide signal.
En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que :
(c) la première séquence nucléotidique comprend :
- une séquence nucléotidique codant pour G Aflibercept, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 2 ; et
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 codant pour un peptide signal ; et (f) la seconde séquence nucléotidique comprend :
- une séquence nucléotidique codant pour la décorine, plus particulièrement la séquence SEQ ID NO : 11 ; et
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 14 codant pour un peptide signal.
En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que :
(c) la première séquence nucléotidique code :
- pour une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, cette protéine étant plus particulièrement G Aflibercept ; et
- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 4 ; et (f) la seconde séquence nucléotidique code :
- pour une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 8, cette protéine étant plus particulièrement la décorine ; et
- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 13.
Selon un autre mode de réalisation, les premières et secondes protéines thérapeutiques d’une construction d’ADN selon l’invention sont respectivement : - une protéine de type anti-TNF-alpha, en particulier une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 22, et plus particulièrement la protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl de séquence SEQ ID NO : 22 ;
- une protéine de type anti-VEGF, en particulier d’une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, cette protéine étant plus particulièrement l’Aflibercept.
Ainsi, selon un mode de réalisation, les séquences codant pour les premières et secondes protéines thérapeutiques d’une construction d’ADN selon l’invention sont respectivement :
- une séquence codant pour une protéine de type anti-TNF-alpha, en particulier une séquence codant pour la protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl de séquence peptidique SEQ ID NO : 22, et notamment une séquence nucléotidique ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 21 ; et
- une séquence nucléotidique codant pour une protéine de type anti-VEGF, tel que S-Fltl, l’Aflibercept, le conbercept, le brolucizumab, et en particulier d’une séquence codant pour l’Aflibercept, plus particulièrement d’une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 2.
La présence de l’actif anti-TNF-alpha permet avantageusement de potentialiser les effets de l’anti-VEGF, améliorant ainsi l’efficacité de ce composé dans le traitement des pathologies oculaires visées. Notamment, il est bien connu que le VEGF induit la perméabilité rétinienne mais des agents inflammatoires, tels que le TNF-alpha, peuvent également conduire à la perméabilité vasculaire, en particulier chez les patients qui ne répondent pas au traitement anti- VEGF tel que cela peut être observé chez les patients souffrant de rétinopathie diabétique (Arias L. et al. ; Retina 2010, 30:1601el608 et Sfikakis et al. ; Diabètes Care 2010, 33: 1523el528). Des preuves récentes suggèrent que le VEGF et le TNF-alpha induisent la perméabilité par des mécanismes distincts.
En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que :
(c) la première séquence nucléotidique comprend :
- une séquence nucléotidique codant pour une protéine de type anti-TNF-alpha, en particulier une séquence codant pour la protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl, de séquence peptidique SEQ ID NO : 22, et notamment une séquence nucléotidique ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 21, et en particulier la séquence SEQ ID NO : 21 ; et
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 23 codant pour un peptide signal ; et (f) la seconde séquence nucléotidique comprend :
- une séquence nucléotidique codant pour l’Aflibercept, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 2 ; et
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 codant pour un peptide signal.
En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que :
(c) la première séquence nucléotidique code :
- pour une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 22, cette protéine étant plus particulièrement la protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl de séquence SEQ ID NO : 22 ; et
- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 23 ; et (f) la seconde séquence nucléotidique code :
- pour une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, cette protéine étant plus particulièrement l’Aflibercept ; et
- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 4.
Selon un autre mode de réalisation, les premières et secondes protéines thérapeutiques d’une construction d’ADN selon l’invention sont respectivement :
- d’une protéine régulant l’activation du complément, en particulier d’une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 26, cette protéine étant plus particulièrement le facteur H du complément ;
- une protéine de type anti-VEGF, en particulier d’une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, cette protéine étant plus particulièrement l’Aflibercept. Ainsi, selon un mode de réalisation, les séquences codant pour les premières et secondes protéines thérapeutiques d’une construction d’ADN selon l’invention sont respectivement :
- une séquence nucléotidique codant pour une protéine régulant l’activation du complément, telle que le facteur I du complément (CFI), et le facteur H du complément, et en particulier une séquence codant pour le facteur H du complément, plus particulièrement une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 25 ; et
- une séquence nucléotidique codant pour une protéine de type anti-VEGF, tel que S-Fltl, l’Aflibercept, le conbercept, le brolucizumab, et en particulier d’une séquence codant pour F Aflibercept, plus particulièrement d’une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 2.
L’activation de la voie alterne du complément est une composante importante de la DMLA. Cette activation conduit à la formation du complexe d’attaque membranaire, au recrutement de macrophages, et à l’induction d’une inflammation avec production de cytokines impliquées dans l’inflammasome. Le facteur H du complément intervient pour réguler l’auto-activation du complément. Plusieurs variants polymorphiques dans le gène codant CFH, affectant la fonction de la protéine, confèrent une forte susceptibilité pour développer les deux formes de DMLA, sèche et humide. A l’inverse, l’inhibition de la voie alterne par l’injection intraoculaire de CFH réduit la néovascularisation dans des modèles animaux de néovascularisation choroidienne. Aussi, l’administration d’un actif régulant l’activation du complément_et d’un anti-VEGF, tel que F aflibercept, permet avantageusement de réduire à la fois la néovascularisation et l’inflammation associées à la DMLA.
En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que :
(c) la première séquence nucléotidique comprend :
- une séquence nucléotidique codant pour une protéine régulant l’activation du complément, telle que le facteur I du complément (CFI), et le facteur H du complément, et en particulier une séquence codant pour le facteur H du complément, plus particulièrement une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 25 ; et
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 28 codant pour un peptide signal ; et (f) la seconde séquence nucléotidique comprend :
- une séquence nucléotidique codant pour F Aflibercept, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 2 ; et - la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 codant pour un peptide signal.
En particulier, une construction d’ADN selon l’invention peut être caractérisée en ce que :
(c) la première séquence nucléotidique code :
- pour une protéine régulant l’activation du complément, en particulier d’une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 26, cette protéine étant plus particulièrement le facteur H du complément ; et
- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 27 ; et (f) la seconde séquence nucléotidique code :
- pour une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, cette protéine étant plus particulièrement G Aflibercept ; et
- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 4.
Une construction d’ADN selon l’invention est par ailleurs caractérisée en ce que la première séquence nucléotidique code également pour un peptide signal permettant la sécrétion de la première protéine thérapeutique.
Un tel peptide signal est bien connu de l’homme du métier. Ce peptide signal peut par exemple être l’activateur tissulaire du plasminogène humain (tPA) de séquence peptidique SEQ ID NO : 4 (et pouvant par exemple être codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5) ou le peptide signal du HTLV-1 Env de séquence peptidique SEQ ID NO : 29 (et pouvant par exemple être codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 30). Il peut également s’agir du peptide signal natif de la protéine thérapeutique considérée, tel que par exemple :
- le peptide signal natif de la Décorine, de séquence peptidique SEQ ID NO : 13 (et pouvant par exemple être codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 14) ;
- le peptide signal natif de la Transferrine, de séquence peptidique SEQ ID NO : 18 (et pouvant être par exemple codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 19 ou par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 20) ;
- le peptide signal d’une protéine de type anti-TNF-alpha, en particulier le peptide signal natif protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl, ce peptide signal ayant une séquence peptidique SEQ ID NO : 23 (et pouvant par exemple être codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 24) ; ou - le peptide signal natif du facteur H, de séquence peptidique SEQ ID NO : 27 (et pouvant par exemple être codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 28).
Comme précédemment indiqué, ce peptide signal est contiguë de la première protéine thérapeutique, c’est-à-dire qu’il se trouve directement accolé en N-terminal de la première protéine thérapeutique, et ainsi donc, la séquence codant pour le peptide signal est en 5’ de la séquence codant pour la première protéine thérapeutique.
Une construction d’ADN selon l’invention est par ailleurs caractérisée en ce que la seconde séquence nucléotidique code également pour un peptide signal permettant la sécrétion de la seconde protéine thérapeutique.
Ce peptide signal peut par exemple être l’activateur tissulaire du plasminogène humain (tPA) de séquence peptidique SEQ ID NO : 4 (et pouvant par exemple être codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5) ou le peptide signal du HTLV-1 Env de séquence peptidique SEQ ID NO : 29 (et pouvant par exemple être codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 30). Il peut également s’agir du peptide signal natif de la protéine thérapeutique considérée, tel que par exemple :
- le peptide signal natif de la Décorine, de séquence peptidique SEQ ID NO : 13 (et pouvant par exemple être codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 14) ;
- le peptide signal natif de la Transferrine, de séquence peptidique SEQ ID NO : 18 (et pouvant être par exemple codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 19 ou par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 20) ;
- le peptide signal d’une protéine de type anti-TNF-alpha, en particulier le peptide signal natif protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl, ce peptide signal ayant une séquence peptide SEQ ID NO : 23 (et pouvant par exemple être codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 24) ; ou
- le peptide signal natif du facteur H, de séquence peptidique SEQ ID NO : 27 (et pouvant par exemple être codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 28).
Ce peptide signal peut être identique ou différent du peptide signal codé par la première séquence nucléotidique, et est préférentiellement différent du peptide signal codé par la première séquence nucléotidique. Comme précédemment indiqué, ce peptide signal est contiguë de la seconde protéine thérapeutique, c’est-à-dire qu’il se trouve directement accolé en N-terminal de la seconde protéine thérapeutique, et ainsi donc, la séquence codant pour le peptide signal est en 5’ de la séquence codant pour la seconde protéine thérapeutique.
Selon un mode de réalisation particulier, le peptide signal codé par la première séquence nucléotidique et le peptide signal codé par la seconde séquence nucléotidique sont, indépendamment l’un de l’autre, choisis dans le groupe constitué des séquences peptidiques SEQ ID NO : 4 ; SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 27 et SEQ ID NO : 29.
Selon un mode de réalisation, la séquence codant pour le peptide signal codé par la première séquence nucléotidique et la séquence codant pour le peptide signal codé par la seconde séquence nucléotidique sont, indépendamment l’une de l’autre, choisies dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 5; SEQ ID NO : 14; SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20; SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 28 et SEQ ID NO : 30.
Une construction d’ADN selon l’invention est par ailleurs également caractérisée en ce qu’elle comprend (d) un promoteur permettant l’expression de la première protéine thérapeutique d’une construction selon l’invention ainsi que (g) un promoteur permettant l’expression de la seconde protéine thérapeutique d’une construction selon l’invention.
Ces promoteurs peuvent être identiques ou différents. Selon un mode de réalisation particulier, ces deux promoteurs sont différents l’un de l’autre.
De tels promoteurs peuvent par exemple être des promoteurs de type CAG, ou CMV.
Une construction d’ADN selon l’invention est par ailleurs caractérisée en ce qu’elle comprend (e) une séquence de polyadénylation en 3’ de la première séquence nucléotidique et (h) une séquence de polyadénylation en 3’ de la seconde séquence nucléotidique.
Une séquence de polyadénylation contient en particulier un motif conservé de séquence AATAAA bien connue de l’homme du métier.
Ces deux séquences de polyadénylation peuvent être identiques ou différentes l’une de l’autre. Selon un mode de réalisation, elles sont différentes l’une de l’autre.
Ces séquences de polyadénylation peuvent par exemple être des séquences de polyadénylation de type RBG (Rabbit Beta Globin), ou BGH (Bovine Growth Hormone). Enfin, comme précédemment indiqué, une construction d’ADN selon l’invention est administrée au patient par injection dans un muscle ciliaire puis électrotransfert dans les cellules du muscle ciliaire.
Dans un mode de réalisation particulier, la construction d’ADN selon l’invention est de forme circulaire.
Dans un mode de réalisation de l’invention la construction d’ADN est une construction d’ADN nu.
Selon un mode de réalisation de l’invention, la construction d’ADN selon l’invention est une construction d’ADN nu de forme circulaire.
Dans un mode de réalisation de l’invention, la construction d’ADN selon l’invention est une construction d’ADN nu de forme circulaire dans laquelle les séquences codant pour les premières et secondes protéines thérapeutiques d’une construction d’ADN selon l’invention sont respectivement :
- une séquence nucléotidique codant pour la transferrine, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 15, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 16 ; et
- une séquence codant pour une protéine de type anti-TNF-alpha, en particulier une séquence codant pour la protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl de séquence peptidique SEQ ID NO : 22, et notamment une séquence nucléotidique ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 21. Dans un mode de réalisation de l’invention, la construction d’ADN selon l’invention est une construction d’ADN nu de forme circulaire dans laquelle les séquences codant pour les premières et secondes protéines thérapeutiques d’une construction d’ADN selon l’invention sont respectivement :
- une séquence nucléotidique codant pour une protéine ayant des propriétés anti-fibrotiques, telle que la protéine BMP7 (Bone Morphogenic Protein 7), une protéine de type anti TGF-beta, une protéine de type anti FGF2, une protéine de type anti CTGF (connective tissue growth factor), et en particulier d’une protéine codant pour la décorine, plus particulièrement d’une séquence nucléotidique ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6, plus particulièrement d’une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 12, et est en particulier la séquence SEQ ID NO : 7 ou la séquence SEQ ID NO : 11, et plus particulièrement la séquence SEQ ID NO : 11 ; et
- une séquence nucléotidique codant pour une protéine de type anti-VEGF, tel que S-Fltl, FAflibercept, le conbercept, le brolucizumab, et en particulier d’une séquence codant pour l’Aflibercept, plus particulièrement d’une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 2.
Dans une mode de réalisation, la construction d’ADN selon l’invention est une construction d’ADN nu de forme circulaire dans laquelle les séquences codant pour les premières et secondes protéines thérapeutiques d’une construction d’ADN selon l’invention sont respectivement :
- une séquence nucléotidique codant pour la transferrine, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 15, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 16 ; et
- une séquence nucléotidique codant pour une protéine ayant des propriétés anti-fibrotiques, telle que la protéine BMP7 (Bone Morphogenic Protein 7), une protéine de type anti TGF-beta, une protéine de type anti FGF2, une protéine de type anti CTGF (connective tissue growth factor), et en particulier d’une protéine codant pour la décorine, plus particulièrement d’une séquence nucléotidique ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6, plus particulièrement d’une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 12, et est en particulier la séquence SEQ ID NO : 7 ou la séquence SEQ ID NO : 11, et plus particulièrement la séquence SEQ ID NO : 11.
Dans une mode de réalisation selon l’invention, la construction d’ADN selon l’invention est une construction d’ADN nu de forme circulaire dans laquelle les séquences codant pour les premières et secondes protéines thérapeutiques d’une construction d’ADN selon l’invention sont respectivement :
- une séquence codant pour une protéine de type anti-TNF-alpha, en particulier une séquence codant pour la protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl de séquence protéique SEQ ID NO : 22, et notamment une séquence nucléotidique ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 21 ; et - une séquence nucléotidique codant pour une protéine de type anti-VEGF, tel que S-Fltl, FAflibercept, le conbercept, le brolucizumab, et en particulier d’une séquence codant pour l’Aflibercept, plus particulièrement d’une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 2.
Dans une mode de réalisation selon l’invention, la construction d’ADN selon l’invention est une construction d’ADN nu de forme circulaire dans laquelle les séquences codant pour les premières et secondes protéines thérapeutiques d’une construction d’ADN selon l’invention sont respectivement :
- une séquence nucléotidique codant pour une protéine régulant l’activation du complément, telle que le facteur I du complément (CFI), et le facteur H du complément, et en particulier une séquence codant pour le facteur H du complément, plus particulièrement une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 25 ; et
- une séquence nucléotidique codant pour une protéine de type anti-VEGF, tel que S-Fltl, l’Aflibercept, le conbercept, le brolucizumab, et en particulier d’une séquence codant pour l’Aflibercept, plus particulièrement d’une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 2.
La présente invention concerne également une construction d’ADN destinée au transfert non viral d’acides nucléiques dans les cellules musculaires de la sphère oculaire d’un patient pour le traitement de pathologies oculaires caractérisée en ce qu’elle comprend :
(a) une origine de réplication bactérienne ou procaryotique, en particulier bactérienne,
(b) une ou plusieurs séquences favorisant l’expression de F ADN dans la sphère oculaire du patient,
(c) une première séquence nucléotidique codant :
- pour une première protéine thérapeutique, ladite première protéine thérapeutique étant l’aflibercept ; et
- pour un peptide signal permettant la sécrétion de cette première protéine thérapeutique, ce peptide signal étant contiguë de la séquence de la première protéine thérapeutique, en N- terminal de ladite première protéine thérapeutique,
(d) un promoteur permettant l’expression de cette première protéine thérapeutique dans la sphère oculaire du patient ;
(e) une séquence de polyadénylation en 3’ de la première séquence nucléotidique ; (f) une seconde séquence nucléotidique codant :
- pour une seconde protéine thérapeutique, ladite seconde protéine thérapeutique étant la décorine, et
- pour un peptide signal permettant la sécrétion de cette seconde protéine thérapeutique, le peptide signal étant contiguë de la séquence de la seconde protéine thérapeutique, en N-terminal de ladite seconde protéine thérapeutique ; et
(g) un promoteur permettant l’expression de cette seconde protéine thérapeutique dans la sphère oculaire du patient ; et
(h) une séquence de polyadénylation en 3’ de la seconde séquence nucléotidique.
Mise en œuyre d’une construction d’ADN décrite ci-dessus
Une construction d’ADN telle que définie ci-dessus est notamment dédiée au traitement de pathologies oculaires.
Une pathologie oculaire selon la présente invention est une dégénérescence rétinienne.
Cette dégénérescence rétienne peut en particulier être choisie dans le groupe constitué de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), humide ou sèche ; des rétinopathies diabétiques (RD) ; d’une occlusion veineuse rétinienne, en particulier d’une occlusion de la veine centrale de la rétine (OVCR) ou d’une occlusion de la branche veineuse rétinienne (OBVR) ; d’une néovascularisation choroïdienne (NVC) myopique ; d’une uvéite, en particulier d’une uvéite non infectieuse ; d’une rétinite pigmentaire et d’un glaucome.
A titre de rétinopathie diabétique, on entend en particulier désigner une baisse d’acuité visuelle due à un œdème maculaire diabétique (OMD), à une hémorragie intravitréenne, un décollement de rétine, ou un glaucome néovasculaire.
Selon un mode de réalisation particulier, et notamment lorsque une construction selon l’invention mise en œuvre pour le traitement d’une pathologie oculaire comprend à titre de première et seconde protéines thérapeutiques G Aflibercept et la Décorine telle que définie ci- dessus, ladite pathologie oculaire est une dégénérescence rétinienne pouvant plus particulièrement être choisie dans le groupe constitué de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), en particulier la forme humide ; des rétinopathies diabétiques (RD) ; d’une occlusion veineuse rétinienne, en particulier d’une occlusion de la veine centrale de la rétine (OVCR) ou d’une occlusion de la branche veineuse rétinienne (OBVR) ; et d’une néovascularisation choroïdienne (NVC) myopique ; et plus particulièrement être choisie dans le groupe constitué de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), en particulier de la forme néovasculaire (humide) de la DMLA ; d’une baisse d’acuité visuelle due à un œdème maculaire diabétique (OMD) ; d’une occlusion veineuse rétinienne, en particulier d’une occlusion de la veine centrale de la rétine (OVCR) ou d’une occlusion de la branche veineuse rétinienne (OBVR) ; et d’une néovascularisation choroïdienne (NVC) myopique.
A titre de rétinopathie diabétique, on entend en particulier désigner une baisse d’acuité visuelle due à un œdème maculaire diabétique (OMD) et la formation de néovaisseaux observée dans la forme proliférante de rétinopathie diabétique.
Comme indiqué précédemment, une construction d’ADN selon l’invention est injectée dans un muscle oculaire, le muscle ciliaire, où elle est soumise à un électrotransfert. La technique connue de thérapie génique non virale utilisée dans la présente invention est l’injection de la construction d’ADN dans un muscle oculaire puis G électrotransfert pour induire une perméabilisation transitoire des cellules du muscle ciliaire et une migration de l'ADN pour optimiser la transfection de la construction d’ADN. Cette technique d’électrotransfert d’ADN (appelée aussi électroporation ou électroperméabilisation) est simple à mettre en œuvre, fiable et sûre pour le patient. A l’inverse des vecteurs viraux, G électrotransfert d’ADN n’induit pas de réponse immunitaire et permet une expression à long terme des gènes ainsi introduits. De plus, les études menées sur les lentivirus et les rétrovirus montrent que ces derniers sont susceptibles d’induire des mutations d’insertion durant leur intégration dans le génome hôte. Les constructions d’ADN présentement décrites ne présentent pas ce type d’inconvénients, sont faciles à produire et à manipuler et n’induisent pas de réponse immunitaire, les rendant ainsi parfaitement adaptées à la thérapie génique de patients, notamment humains.
Selon la présente invention, l’injection d’une construction d’ADN se fait dans le muscle ciliaire car ce dernier est capable de produire les protéines de façon homogène et constante et, du fait de sa position, favorise la diffusion de ces protéines dans l’ensemble de la sphère oculaire (Bloquel et al. “Plasmid electrotransfer of eye ciliary muscle: principles and therapeutic efficacy using hTNF-alpha soluble receptor in uveitis”, FASEB J. 2006 Feb;20(2):389-91). Les cellules musculaires lisses ont un taux de renouvellement faible et sont bien réparties de part et d’autre du cristallin. La quantité de protéine à produire est proportionnelle à la surface du muscle transfecté (Touchard “The ciliary smooth muscle electrotransfer: basic principles and potetial for sustained intraocular production of therapeutic proteins”, J Gene Med. 2010 Nov;12(ll):904-19). Ainsi, la production des protéines d’intérêt selon la présente invention, et notamment de protéines thérapeutiques telles que précédemment décrites, sera homogène et constante dans l’ensemble de la sphère oculaire et sera limitée à cette sphère oculaire. On citera à titre d’exemple la méthode d’électrotransfert décrite dans la demande de brevet EP2266656 qui traite d’une méthode d’injection d’une composition pouvant contenir de l’ADN au niveau des tissus du corps ciliaire et/ou des tissus musculaires extraoculaires.
Le muscle ciliaire fait partie du corps ciliaire, proche du limbe et juste derrière la sclère. L’injection d’une construction d’ADN selon l’invention dans celui-ci est donc très faiblement invasive contrairement aux injections sous-rétiniennes et constitue donc avantageusement le lieu d’injection de la construction d’ADN selon l’invention.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne également l’utilisation d’une construction d’ADN pour traiter une pathologie oculaire, ladite construction d’ADN étant destinée au transfert non viral d’acides nucléiques dans les cellules musculaires de la sphère oculaire d’un patient souffrant de ladite pathologie oculaire ; ladite construction d’ADN étant caractérisée en ce qu’elle comprend :
(a) une origine de réplication bactérienne ou procaryotique, en particulier bactérienne,
(b) une ou plusieurs séquences favorisant l’expression de l’ADN dans la sphère oculaire du patient,
(c) une première séquence nucléotidique codant :
- pour une première protéine thérapeutique, et
- pour un peptide signal permettant la sécrétion de cette première protéine thérapeutique, ce peptide signal étant contiguë de la séquence de la première protéine thérapeutique, en N- terminal de ladite première protéine thérapeutique,
(d) un promoteur permettant l’expression de cette première protéine thérapeutique dans la sphère oculaire du patient ;
(e) une séquence de polyadénylation en 3’ de la première séquence nucléotidique ;
(f) une seconde séquence nucléotidique codant :
- pour une seconde protéine thérapeutique, différente de la première protéine thérapeutique, et
- pour un peptide signal permettant la sécrétion de cette seconde protéine thérapeutique, le peptide signal étant contiguë de la séquence de la seconde protéine thérapeutique, en N- terminal de ladite seconde protéine thérapeutique ; (g) un promoteur permettant l’expression de cette seconde protéine thérapeutique dans la sphère oculaire du patient, et
(h) une séquence de polyadénylation en 3’ de la seconde séquence nucléotidique ; ladite construction d’ADN étant administrée au patient par injection dans un muscle ciliaire puis électrotransfert dans les cellules du muscle ciliaire.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne également une méthode de traitement d’une pathologie oculaire, comprenant l’administration d’une construction d’ADN à un patient par injection dans un muscle ciliaire puis électrotransfert dans les cellules du muscle ciliaire, ladite construction d’ADN étant destinée au transfert non viral d’acides nucléiques dans les cellules musculaires de la sphère oculaire d’un patient souffrant de ladite pathologie oculaire ; ladite construction d’ADN étant caractérisée en ce qu’elle comprend :
(a) une origine de réplication bactérienne ou procaryotique, en particulier bactérienne,
(b) une ou plusieurs séquences favorisant l’expression de l’ADN dans la sphère oculaire du patient,
(c) une première séquence nucléotidique codant :
- pour une première protéine thérapeutique, et
- pour un peptide signal permettant la sécrétion de cette première protéine thérapeutique, ce peptide signal étant contiguë de la séquence de la première protéine thérapeutique, en N- terminal de ladite première protéine thérapeutique,
(d) un promoteur permettant l’expression de cette première protéine thérapeutique dans la sphère oculaire du patient ;
(e) une séquence de polyadénylation en 3’ de la première séquence nucléotidique ;
(f) une seconde séquence nucléotidique codant :
- pour une seconde protéine thérapeutique, différente de la première protéine thérapeutique, et
- pour un peptide signal permettant la sécrétion de cette seconde protéine thérapeutique, le peptide signal étant contiguë de la séquence de la seconde protéine thérapeutique, en N- terminal de ladite seconde protéine thérapeutique ;
(g) un promoteur permettant l’expression de cette seconde protéine thérapeutique dans la sphère oculaire du patient ; et
(h) une séquence de polyadénylation en 3’ de la seconde séquence nucléotidique.
L’invention est décrite ci-dessous de façon plus détaillée au moyen des exemples suivants qui sont présentés à titre d’illustration uniquement. Exemple 1
Les inventeurs ont mis en évidence l’expression de deux protéines thérapeutiques encodées dans une construction d’ADN selon l’invention (plasmide) dans le vitré de l’œil de rats après électrotransfert de cette construction d’ADN dans le muscle ciliaire.
Plasmides
Une construction d’ADN selon l’invention, dénommée plasmide A, comprenant :
- la séquence SEQ ID NO : 16 encodant la transferrine humaine de séquence SEQ ID NO : 17 (la séquence codant pour son peptide signal étant la séquence SEQ ID NO : 20);
- ainsi que la séquence SEQ ID NO : 21 encodant une protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de l’immunoglobuline humaine IgGl (hTNFR-Is/hlgGl) de séquence SEQ ID NO : 22 (la séquence codant pour son peptide signal étant la séquence SEQ ID NO : 24);
- ces deux séquences étant sous le contrôle de promoteurs de type CMV ; a tout d’abord été préparée selon les méthodes conventionnelles et est représentée en Figure 1. Une construction comparative dite simple, en ce qu’elle ne code que pour une seule des protéines d’intérêt mentionnées ci-dessus, i.e. la séquence SEQ ID NO : 16 encodant la transferrine humaine de séquence SEQ ID NO : 17, a également été préparée selon une méthode similaire, avec un squelette plasmidique similaire à la construction plasmide A, la seule séquence codant pour une protéine d’intérêt étant également sous le contrôle d’un promoteur de type CMV. Ce plasmide comparatif (dénommée Plasmide a’) est représenté en Figure 2.
Animaux
Des rats Long Evans âgées de 7 semaines sont utilisés conformément aux dispositions du protocole ARVO (pour Association for Research in Vision and Ophthalmology). Les rats sont anesthésiés par injection intramusculaire d’une dose de kétamine (40 mg/kg) et de xylazine (4 mg/kg) avant injection bilatérale du plasmide (30 pg/œil) et électrotransfert au jour 0 (J0). 6 rats sont utilisés pour chacun des temps d’analyse (J3, J7, J14, J21, et J30).
A chaque temps d’analyse, les rats sont euthanasiés par administration d’une dose létale de pentobarbital (400 mg/kg) puis les animaux sont énucléés et les liquides oculaires (humeur vitrée et humeur aqueuse) sont prélevés et conservés à -80°C jusqu’à analyse.
Électrotransfert au niveau du muscle ciliaire du rat L’électrotransfert est réalisé comme décrit dans Bloquel et al. « Plasmid electrotransfer of eye ciliary muscle: principles and therapeutic efficacy using hTNF-alpha soluble receptor in uveitis » ( FASEB J 2006; 20: 389-391 ) en modifiant la voie d’injection par une approche transsclérale (Touchard “The ciliary smooth muscle electrotransfer: basic principles and potetial for sustained intraocular production of therapeutic proteins”, J Gene Med. 2010 Nov;12(ll):904-19). Les plasmides sont injectés à raison de 30 pg dans 10 pL de solution Tris- EDTANaCl, dans le muscle ciliaire des animaux à l’aide d’une seringue adaptée.
Les impulsions électriques sont administrées à l’aide d’une électrode spécifique iridium/platine de 250 pm de diamètre. Cette électrode interne est introduite dans le tunnel transscléral existant. L’électrode externe est une feuille d’acier inoxydable courbée pour épouser la forme de l’œil et placée au niveau du limbe face à l’électrode interne. L’électrotransfert est réalisé à raison de 8 impulsions électriques carrées unipolaires (200V/cm, 10 ms, 5 Hz) générées par un électroporateur similaire à celui décrit dans Touchard et al (J Gene Med. 2010 Nov;l 2(11 ):904- 19).
Résultats des tests
Des échantillons de liquides oculaires sont prélevés 3 jours (J+3), 7 jours (J+7), 14 jours (J+14), 21 jours (J+21) et 30 jours (J+30) après l’injection de plasmide suivie de l’électrotransfert (J0). Pour chacun de ces échantillons, une mesure ELISA est réalisée afin de mesurer la quantité de transferrine humaine et/ou de la protéine fusion anti-TNF-alpha de séquence SEQ ID NO : 22 présente dans les échantillons.
Une concentration moyenne est ainsi calculée pour chacun des groupes au fil du temps.
Les résultats obtenus sont représentés :
- en Figure 3 et représente en particulier la concentration en transferrine humaine (en pg/mL) produite dans les fluides oculaires prélevés de J+3 à J+30 par une construction conforme à l’invention en comparaison avec une construction non-conforme à l’invention ; et
- en Figure 4 qui représente la concentration en protéine fusion anti-TNF-alpha (en pg/mL) de séquence SEQ ID NO : 22 produite dans les fluides oculaires prélevés de J+3 à J+30.
Il apparaît à la lecture de ces Figures que la concentration en protéine fusion anti-TNF-alpha et en transferrine humaine est constante au fil du temps chez les rats ayant reçu la construction selon l’invention.
Ainsi, ces expériences matérialisent le fait que la mise en œuvre d’une construction selon l’invention, ayant une taille très importante du fait de la présence de non pas une mais de deux séquences codant pour des protéines d’intérêt, pénètre efficacement les cellules ciblées et permet l’expression des deux protéines encodées par ladite construction au niveau du site d’intérêt.
Par ailleurs, elles illustrent également, et de manière tout à fait inattendue, la capacité d’une construction selon l’invention à produire de manière plus stable dans le temps les protéines qu’elle encode comparativement à des constructions ne codant que pour une seule de ces protéines (Fig. 3).
Exemple 2
Les inventeurs ont confirmé les observations faites dans l’Exemple 1 dans un second protocole expérimental mettant en œuvre un plasmide conforme à l’invention différent de celui utilisé dans l’exemple 1.
Plasmides
Une construction d’ADN selon l’invention, dénommée plasmide B, comprenant :
- la séquence SEQ ID NO : 7 encodant la Décorine de séquence SEQ ID NO : 8;
- ainsi que la séquence SEQ ID NO : 2 encodant G Aflibercept de séquence SEQ ID NO : 3 ;
- ces deux séquences étant sous le contrôle, respectivement, de promoteurs de type CMV et de type CAG ; a tout d’abord été préparée selon les méthodes conventionnelles et est représentée en Figure 5. Une construction comparative dite simple, en ce qu’elle ne code que pour une seule des protéines d’intérêt mentionnées ci-dessus, i.e. la séquence SEQ ID NO : 2 encodant l’Aflibercept de séquence SEQ ID NO : 3, a également été préparée selon une méthode similaire, avec un squelette plasmidique similaire à la construction plasmide B, la seule séquence codant pour une protéine d’intérêt étant également sous le contrôle d’un promoteur de type CAG. La cassette d’expression de cette protéine d’intérêt est ainsi identique dans les deux constructions. Ce plasmide comparatif (dénommée Plasmide b’) est représenté en Figure 6
Les animaux mis en œuvre dans ce protocole sont tels que décrits dans l’exemple 1. 6 rats sont utilisés pour chacun des temps d’analyse (J3, J7, J14 et J21).
A chaque temps d’analyse, les rats sont euthanasiés par administration d’une dose létale de pentobarbital (400 mg/kg) puis les animaux sont énucléés et les liquides oculaires (humeur vitrée et humeur aqueuse) sont prélevés et conservés à -80°C jusqu’à analyse. L’électrotransfert est réalisé comme décrit dans l’exemple 1.
Résultats des tests
Des échantillons de liquides oculaires sont prélevés 3 jours (J+3), 7 jours (J+7), 14 jours (J+14) et 21 jours (J+21) après l’injection de plasmide suivie de G électrotransfert (J0). Pour chacun de ces échantillons, une mesure ELISA est réalisée afin de mesurer la quantité de décorine et/ou d’ Aflibercept présente dans les échantillons.
Une concentration moyenne est ainsi calculée pour chacun des groupes au fil du temps.
Les résultats obtenus sont représentés :
- en Figure 7 et représente en particulier la concentration en Aflibercept (en pg/mL) produite dans les fluides oculaires prélevés de J+3 à J+21 par une construction conforme à l’invention en comparaison avec une construction non-conforme à l’invention ; et
- en Figure 8 qui représente la concentration en décorine (en pg/mL) produite dans les fluides oculaires prélevés de J+3 à J+21.
Il apparaît à la lecture de ces Figures que le plasmide selon l’invention permet l’expression des deux protéines thérapeutiques d’intérêt.
Ainsi, ces expériences matérialisent le fait que la mise en œuvre d’une construction selon l’invention, ayant une taille très importante du fait de la présence de non pas une mais de deux séquences codant pour des protéines d’intérêt, pénètre efficacement les cellules ciblées et permet l’expression des deux protéines encodées par ladite construction au niveau du site d’intérêt.
Par ailleurs, comme cela avait précédemment été montré dans l’exemple 1, elles illustrent également, et de manière tout à fait inattendue, la capacité d’une construction selon l’invention à produire de manière plus stable dans le temps les protéines qu’elle encode comparativement à des constructions ne codant que pour une seule de ces protéines (Fig. 7).
Exemple 3
Les inventeurs ont par ailleurs également confirmé les observations faites ci-dessus dans un protocole expérimental mettant en œuvre un plasmide conforme à l’invention différent de celui utilisé dans les exemples 1 et 2. Plasmides
Une construction d’ADN selon l’invention, dénommée plasmide C, comprenant :
- la séquence SEQ ID NO : 11 encodant la Décorine de séquence SEQ ID NO : 8 sous le contrôle d’un promoteur de type CMV;
- ainsi que la séquence SEQ ID NO : 2 encodant G Aflibercept de séquence SEQ ID NO : 3 sous le contrôle d’un promoteur de type CAG ; a tout d’abord été préparée selon les méthodes conventionnelles et est représentée en Figure 9.
Animaux
Des rats Brown Norway âgés de 7 à 8 semaines sont utilisés conformément aux dispositions du protocole ARVO (pour Association for Research in Vision and Ophthalmology). Les rats sont anesthésiés par injection intramusculaire d’une dose de kétamine (40 mg/kg) et de xylazine (4 mg/kg) avant injection bilatérale du plasmide (30 pg/œil) ou du véhicule (10 pL) et électrotransfert au jour 0 (J0). 6 rats sont utilisés pour chacun des traitements. L’électrotransfert est réalisé comme décrit dans l’exemple 1.
A J3, une néovascularisation choroïdienne est induite chez tous les animaux par photocoagulation laser en plusieurs endroits de la rétine (4 à 5 impacts laser par œil).
Résultats des tests
Quatorze jours après la lésion (J 17), la fuite vasculaire des néo-vaisseaux est évaluée par angiographie fluorescente et attribution d’un score en fonction de la sévérité de la fuite vasculaire selon le tableau suivant.
Observation Grade
Pas d’hyper fluorescence 0
Légère hyper fluorescence sans augmentation d'intensité ni de taille 1
Hyper fluorescence augmentant d'intensité en phase tardive sans augmentation de taille (fuite modérée) 2
Hyper fluorescence avec fuite en phase précoce avec augmentation de la taille et de l'intensité en phase tardive (fuite sévère) 3
Les résultats obtenus sont représentés en Figure 10 et représentent en particulier le pourcentage d’impact présentant une fuite sévère (grade 3) en fonction des traitements. Il apparaît à la lecture de cette Figure que le plasmide selon Finvention permet de réduire de 38% le nombre d’impact présentant une fuite néo vasculaire sévère comparativement aux animaux ayant reçu le véhicule.
Listage de séquences
SEQ ID NO : 1 : séquence nucléotidique codant pour Aflibercept agtgatacaggtagacctttcgtagagatgtacagtgaaatccccgaaattatacacatgactgaaggaagggagctcgtcattccctgc cgggttacgtcacctaacatcactgttactttaaaaaagtttccacttgacactttgatccctgatggaaaacgcataatctgggacagtag aaagggcttcatcatatcaaatgcaacgtacaaagaaatagggcttctgacctgtgaagcaacagtcaatgggcatttgtataagacaaa ctatctcacacatcgacaaaccaatacaatcatagatgtcgttctgagtccgtctcatggaattgaactatctgttggagaaaagcttgtctt aaattgtacagcaagaactgaactaaatgtggggattgacttcaactgggaatacccttcttcgaagcatcagcataagaaacttgtaaac cgagacctaaaaacccagtctgggagtgagatgaagaaatttttgagcaccttaactatagatggtgtaacccggagtgaccaaggatt gtacacctgtgcagcatccagtgggctgatgaccaagaagaacagcacatttgtcagggtccatgaaaaagacaaaactcacacatgc ccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccgga cccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtg cataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactg gctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggc agccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaa ggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctgga ctccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgc atgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggtaaa
SEQ ID NO : 2: séquence nucléotidique codant pour Aflibercept cagcgacaccggcagacccttcgtggaaatgtacagcgagatccccgagatcatccacatgaccgagggccgcgagctggtgatcc cttgcagagtgaccagccccaacatcaccgtgacactgaagaagttccctctggacacactgatccccgacggcaagaggatcatctg ggacagcagaaagggcttcatcatcagcaacgccacatacaaagagatcggactgctgacatgcgaggccaccgtgaacggccatc tgtacaagaccaactatctgacccaccgccagaccaacaccatcatcgacgtggtgctgagccccagccacggcatcgagctgagcg tgggcgagaagctggtgctgaactgcaccgccagaaccgagctgaatgtgggcatcgacttcaactgggagtaccccagctccaag caccagcacaagaaactggtgaaccgggatctgaaaacccagagcggcagcgagatgaagaagtttctgagcacactgaccatcga cggcgtgaccagaagcgaccaaggactgtacacatgcgccgccagcagcggactgatgaccaagaagaacagcacattcgtccgg gtgcacgagaaggacaagacccacacatgcccaccatgcccagccccagagctgctgggaggcccctccgtgtttctgttccctcca aagcccaaggacactctgatgatcagcagaacccccgaagtgacatgcgtggtggtggacgtgtcccacgaggacccagaagtgaa gttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaacagcacatacagagtg gtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaagactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaagtctccaacaaggctctgccagccccc atcgaaaagaccatcagcaaggccaagggccagcctcgcgagccccaagtgtacacactgcctccaagccgggacgagctgacca agaatcaagtgtctctgacatgtctggtgaaaggcttctaccccagcgatatcgccgtggaatgggagagcaacggccagcccgaga acaactacaagaccacccctcccgtgctggacagcgacggcagcttctttctgtactccaaactgaccgtggacaagagcagatggca gcaaggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggctctgcacaaccactacacccagaagtctctgtctctgagccccggcaa gtga
SEQ ID NO : 3 : séquence peptidique de TAflibercept
SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSR KGFII SN AT YKEIGLLTCE AT VN GHL YKTN YLTHRQTNTIID VVL SP SHGIEL SV GEKL VLNCT ARTELN V GIDFNWE YP S SKHQHKKL VNRDLKT Q S GSEMKKFL S TLTIDG VTR SDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTC VVVD V SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV S VL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVF S C S VMHE ALHNH YT QK SL SL SPGK
SEQ ID NO : 4 : séquence peptidique du peptide signal TPA MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPS
SEQ ID NO : 5 : séquence nucléotidique codant pour le peptide signal TPA atggatgcaatgaagagagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtggagcagtcttcgtttcgcccag
SEQ ID NO : 6: Séquence nucléotidique codant pour la Décorine ggaccgtttcaacagagaggcttatttgactttatgctagaagatgaggcttctgggataggcccagaagttcctgatgaccgcgacttc gagccctccctaggcccagtgtgccccttccgctgtcaatgccatcttcgagtggtccagtgttctgatttgggtctggacaaagtgccaa aggatcttccccctgacacaactctgctagacctgcaaaacaacaaaataaccgaaatcaaagatggagactttaagaacctgaagaa ccttcacgcattgattcttgtcaacaataaaattagcaaagttagtcctggagcatttacacctttggtgaagttggaacgactttatctgtcc aagaatcagctgaaggaattgccagaaaaaatgcccaaaactcttcaggagctgcgtgcccatgagaatgagatcaccaaagtgcga aaagttactttcaatggactgaaccagatgattgtcatagaactgggcaccaatccgctgaagagctcaggaattgaaaatggggctttc cagggaatgaagaagctctcctacatccgcattgctgataccaatatcaccagcattcctcaaggtcttcctccttcccttacggaattaca tcttgatggcaacaaaatcagcagagttgatgcagctagcctgaaaggactgaataatttggctaagttgggattgagtttcaacagcatc tctgctgttgacaatggctctctggccaacacgcctcatctgagggagcttcacttggacaacaacaagcttaccagagtacctggtggg ctggcagagcataagtacatccaggttgtctaccttcataacaacaatatctctgtagttggatcaagtgacttctgcccacctggacaca acaccaaaaaggcttcttattcgggtgtgagtcttttcagcaacccggtccagtactgggagatacagccatccaccttcagatgtgtcta cgtgcgctctgccattcaactcggaaactataagtaa SEQ ID NO : 7: Séquence nucléotidique codant pour la Décorine ggaccgtttcaacagagaggcttatttgactttatgctagaagatgaggccagcggcatcggccccgaagtgcccgatgatagagattt cgagccctctctgggccccgtgtgtcctttcagatgccagtgtcatctgagagtggtgcagtgcagcgatctgggcctcgacaaagtgc ctaaggatctgcctccagacaccacactgctggatctgcagaacaacaagatcaccgagatcaaggacggcgactttaagaatctgaa gaatctccacgctctgatcctcgtgaacaacaaaatctccaaagtgtctcccggcgctttcacccctctggtcaagctggaacggctgtat ctgagcaagaaccagctgaaagaactgcccgagaagatgcccaagacactgcaagagctgagagcccacgagaacgagatcacc aaagtgcggaaagtgacattcaacgggctgaaccagatgatcgtgatcgagctgggcaccaatcctctgaagtcctccggaatcgag aacggcgccttccaaggcatgaagaagctgagctacatccggatcgccgacaccaacatcaccagcattcctcaagggctgcctcca tctctgaccgagctgcatctggacggcaacaagatttccagagtggacgccgcctctctgaagggactgaacaatctggccaaactgg gactgagcttcaacagcatcagcgccgtggacaacggctctctggccaacacaccacatctgcgggaactccatctggataacaaca agctgaccagagttcccggcggactggccgagcacaagtacatccaagtggtgtatctccacaacaacaatatcagcgtcgtgggca gcagcgatttctgccctccgggacacaataccaagaaggccagctacagcggagtgtctctgttcagcaatcccgtgcagtactggga gatccagcctagcacattcagatgcgtgtacgtgcggagcgccatccagctgggcaactacaagtgatga
SEQ ID NO : 8: Séquence peptidique de la Décorine
GPFQQRGLFDFMLEDEASGIGPEVPDDRDFEPSLGPVCPFRCQCHLRVVQCSDLGLD KVPKDLPPDTTLLDLQNNKITEIKDGDFKNLKNLHALILVNNKISKVSPGAFTPLVKL ERL YL SKN QLKELPEKMPKTLQELRAHENEITK VRK VTFN GLN QMI VIELGTNPLK S S GIENGAFQGMKKLSYIRIADTNITSIPQGLPPSLTELHLDGNKISRVDAASLKGLNNLA KLGLSFNSISAVDNGSLANTPHLRELHLDNNKLTRVPGGLAEHKYIQVVYLHNNNIS VVGSSDF CPPGHNTKKAS YSGV SLF SNP VQYWEIQPSTFRC VYVRS AIQLGNYK
SEQ ID NO : 9: Séquence nucléotidique codant pour la Décorine ggaccgtttcaacagagaggcttatttgactttatgctagaagatgaggcctctggaatcggacctgaggtgcccgacgacagagactt cgaaccttctctgggccctgtgtgccccttcagatgccagtgtcatctgagagtggtgcagtgcagcgacctgggccttgataaggtgc ccaaggacctgcctcctgacaccacactgctggacctgcagaacaacaagatcaccgagatcaaggacggcgacttcaagaacctg aagaatctgcacgccctgatcctggtcaacaacaaaatcagcaaggtgtcccctggcgccttcacacctctggtcaagctggaaagact gtacctgagcaagaaccagctgaaagaactgcccgagaagatgcccaagacactgcaagagctgcgggcccacgagaacgagatc accaaagtgcggaaagtgaccttcaacggcctgaaccagatgatcgtgatcgagctgggcaccaatcctctgaagtccagcggcattg agaacggcgccttccagggcatgaagaagctgagctacatccggatcgccgacaccaacatcaccagcattcctcagggcctgcctc caagcctgacagagctgcatctggacggcaacaagattagcagagtggacgccgcctctctgaagggcctgaacaatctggccaaa ctgggcctgagcttcaacagcatcagcgccgtggataacggcagcctggccaacacacctcacctgagggaactgcacctggataac aacaagctgaccagagtgcctggcggactggccgagcacaagtacatccaggtggtgtatctccacaacaacaacatctccgtcgtg ggcagcagcgacttctgtcctcctggccacaataccaagaaggccagctactctggcgtgtccctgttcagcaaccccgtgcagtactg ggagatccagcctagcacctttagatgcgtgtacgtgcggagcgccatccagctgggcaactacaaatga
SEQ ID NO : 10: Séquence nucléotidique codant pour la Décorine ggaccgtttcaacagagaggcttatttgactttatgctagaagacgaggctagcggaattggacctgaagtgcccgacgaccgcgatttt gaaccatcactgggacctgtctgcccctttagatgtcagtgccacctgagggtggtgcagtgttctgacctgggcctggataaggtgcc aaaggacctgccccctgataccacactgctggacctgcagaacaataagatcaccgagatcaaggacggcgatttcaagaatctgaa gaacctgcacgccctgatcctggtgaacaataagatctctaaggtgagcccaggcgcctttacccccctggtgaagctggagagactg tacctgagcaagaatcagctgaaggagctgcccgagaagatgcctaagacactgcaggagctgcgggcccacgagaacgagatca ccaaggtgagaaaggtgacattcaatggcctgaaccagatgatcgtgatcgagctgggcaccaatcccctgaagagctccggcatcg agaacggcgcctttcagggcatgaagaagctgtcctatatccggatcgccgacaccaatatcacatctatccctcagggcctgccaccc agcctgacagagctgcacctggacggcaacaagatcagcagagtggatgccgcctccctgaagggcctgaacaatctggccaagct gggcctgtccttcaactccatctctgccgtggacaatggctctctggccaacacccctcacctgagggagctgcacctggataacaata agctgacacgcgtgccaggcggcctggcagagcacaagtacatccaggtggtgtatctgcacaacaataacatctccgtggtgggct ctagcgatttctgccctccaggccacaatacaaagaaggccagctactccggcgtgtccctgttttctaaccctgtgcagtattgggagat ccagccctctacttttcggtgcgtctatgtcaggtccgccattcagctggggaactacaaataa
SEQ ID NO : 11: Séquence nucléotidique codant pour la Décorine ggaccgtttcaacagagaggcttatttgactttatgctagaagacgaggccagcggcatcggccccgaggtgcccgacgaccgcgac ttcgagcccagcctgggccccgtgtgccccttccgctgccagtgccacctgcgcgtggtgcagtgcagcgacctgggcctggacaag gtgcccaaggacctgccccccgacaccaccctgctggacctgcagaacaacaagatcaccgagatcaaggacggcgacttcaaga acctgaagaacctgcacgccctgatcctggtgaacaacaagatcagcaaggtgagccccggcgccttcacccccctggtgaagctgg agcgcctgtacctgagcaagaaccagctgaaggagctgcccgagaagatgcccaagaccctgcaggagctgcgcgcccacgaga acgagatcaccaaggtgcgcaaggtgaccttcaacggcctgaaccagatgatcgtgatcgagctgggcaccaaccccctgaagagc agcggcatcgagaacggcgccttccagggcatgaagaagctgagctacatccgcatcgccgacaccaacatcaccagcatccccca gggcctgccccccagcctgaccgagctgcacctggacggcaacaagatcagccgcgtggacgccgccagcctgaagggcctgaa caacctggccaagctgggcctgagcttcaacagcatcagcgccgtggacaacggcagcctggccaacaccccccacctgcgcgag ctgcacctggacaacaacaagctgacccgcgtgcccggcggcctggccgagcacaagtacatccaggtggtgtacctgcacaacaa caacatcagcgtggtgggcagcagcgacttctgcccccccggccacaacaccaagaaggccagctacagcggcgtgagcctgttca gcaaccccgtgcagtactgggagatccagcccagcaccttccgctgcgtgtacgtgcgcagcgccatccagctgggcaactacaagt aa SEQ ID NO : 12: Séquence nucléotidique codant pour la Décorine ggaccgtttcaacagagaggcttatttgactttatgctagaagatgaggcgagtggcattggacctgaagtacccgatgatagagacttt gaaccatcattgggcccagtttgcccttttaggtgtcagtgccacctccgggtagttcaatgcagcgatttgggactcgataaagtaccga aagacttgccaccggacacaacattgctcgatcttcaaaacaacaagatcactgaaataaaggatggagactttaaaaatctgaagaatt tgcacgccctcatcctggtcaacaacaagatcagcaaggtgtcccctggagcattcacgcccctcgtaaagttggaacgcctctacctg tctaagaaccagttgaaagaactgcccgagaagatgcctaaaactctgcaagagcttagagctcatgaaaatgaaattaccaaggttcg gaaggtaacctttaacggtcttaaccagatgatagtcattgagttgggcacgaacccattgaaatcttctggcatagaaaacggggctttc caggggatgaaaaaactctcatatatccgcatcgcggataccaacatcacatctatacctcaaggtttgcccccgagtttgaccgagctt cacctggatggcaacaagataagccgggtcgacgctgcctcactcaaagggctcaataatctggcgaaactggggttgagtttcaattc aatatctgctgtcgacaacggctcacttgcgaacacaccccatcttagggaacttcatctggacaacaacaagttgacacgggttcctgg gggactcgctgaacataaatatatacaggtcgtttatctccataataataatatcagcgttgtaggctcatctgacttctgccctccaggcca taatacaaagaaagcgtcatacagtggcgtcagtttgttctctaacccggttcagtattgggagattcaaccgtccacttttcggtgcgttta cgtgaggagtgcgattcagctgggtaactataagtaa
SEQ ID NO : 13: Séquence peptidique du peptide signal natif de la Décorine MK ATIILLLL AQ V SW A
SEQ ID NO : 14: Séquence nucléotidique codant pour le peptide signal natif de la Décorine atgaaggccactatcatcctccttctgcttgcacaagtttcctgggct
SEQ ID NO : 15: Séquence nucléotidique codant pour la transferrine gtccctgataaaactgtgagatggtgtgcagtgtcggagcatgaggccactaagtgccagagtttccgcgaccatatgaaaagcgtcat tccatccgatggtcccagtgttgcttgtgtgaagaaagcctcctaccttgattgcatcagggccattgcggcaaacgaagcggatgctgt gacactggatgcaggtttggtgtatgatgcttacctggctcccaataacctgaagcctgtggtggcagagttctatgggtcaaaagagga tccacagactttctattatgctgttgctgtggtgaagaaggatagtggcttccagatgaaccagcttcgaggcaagaagtcctgccacac gggtctaggcaggtccgctgggtggaacatccccataggcttactttactgtgacttacctgagccacgtaaacctcttgagaaagcagt ggccaatttcttctcgggcagctgtgccccttgtgcggatgggacggacttcccccagctgtgtcaactgtgtccagggtgtggctgctc cacccttaaccaatacttcggctactcgggagccttcaagtgtctgaaggatggtgctggggatgtggcctttgtcaagcactcgactata tttgagaacttggcaaacaaggctgacagggaccagtatgagctgctttgcctggacaacacccggaagccggtagatgaatacaag gactgccacttggcccaggtcccttctcataccgtcgtggcccgaagtatgggcggcaaggaggacttgatctgggagcttctcaacc aggcccaggaacattttggcaaagacaaatcaaaagaattccaactattcagctctcctcatgggaaggacctgctgtttaaggactctg cccacgggtttttaaaagtcccccccaggatggatgccaagatgtacctgggctatgagtatgtcactgccatccggaatctacgggaa ggcacatgcccagaagccccaacagatgaatgcaagcctgtgaagtggtgtgcgctgagccaccacgagaggctcaagtgtgatga gtggagtgttaacagtgtagggaaaatagagtgtgtatcagcagagaccaccgaagactgcatcgccaagatcatgaatggagaagct gatgccatgagcttggatggagggtttgtctacatagcgggcaagtgtggtctggtgcctgtcttggcagaaaactacaataagagcga taattgtgaggatacaccagaggcagggtattttgctatagcagtggtgaagaaatcagcttctgacctcacctgggacaatctgaaagg caagaagtcctgccatacggcagttggcagaaccgctggctggaacatccccatgggcctgctctacaataagatcaaccactgcaga tttgatgaatttttcagtgaaggttgtgcccctgggtctaagaaagactccagtctctgtaagctgtgtatgggctcaggcctaaacctgtgt gaacccaacaacaaagagggatactacggctacacaggcgctttcaggtgtctggttgagaagggagatgtggcctttgtgaaacacc agactgtcccacagaacactgggggaaaaaaccctgatccatgggctaagaatctgaatgaaaaagactatgagttgctgtgccttgat ggtaccaggaaacctgtggaggagtatgcgaactgccacctggccagagccccgaatcacgctgtggtcacacggaaagataagga agcttgcgtccacaagatattacgtcaacagcagcacctatttggaagcaacgtaactgactgctcgggcaacttttgtttgttccggtcg gaaaccaaggaccttctgttcagagatgacacagtatgtttggccaaacttcatgacagaaacacatatgaaaaatacttaggagaaga atatgtcaaggctgttggtaacctgagaaaatgctccacctcatcactcctggaagcctgcactttccgtagaccttaa
SEQ ID NO : 16: Séquence nucléotidique codant pour la transferrine gtgccagataagacagttcgttggtgcgccgtgtctgagcacgaggccacaaagtgccagagcttccgggaccacatgaagtctgtg atccctagcgacggcccttccgtggcttgtgtgaagaaggccagctatctggactgcatcagagccattgccgccaacgaagccgatg ccgttacactggatgccggactggtgtacgatgcctatctggccccaaacaatctgaagcccgtggtcgccgagttctacggctctaaa gaggaccctcagacattctactacgccgtggccgtggtcaagaaggacagcggctttcagatgaaccagctgcggggcaagaagtct tgtcacaccggacttggaagaagcgccggctggaatatccccatcggactgctgtactgcgatctgcccgagcctagaaagcctctgg aaaaggccgtggccaacttcttctctggctcttgtgccccttgcgccgatggcacagattttccacagctctgtcagctgtgtcccggctg tggctgtagcacactgaaccagtactttggctacagcggcgccttcaagtgtctgaaagatggtgctggcgacgtggccttcgtgaagc acagcacaatcttcgagaatctggccaacaaggccgaccgggatcagtacgaactgctgtgcctcgacaacaccagaaagccagtg gacgagtacaaggactgccatctggctcaagtgcctagccacacagtggttgccagatccatgggcggcaaagaggatctgatctgg gagctgctgaatcaagcccaagagcacttcggcaaggacaagagcaaagagttccagctgttcagcagccctcacggcaaggatct gctgttcaaggatagcgcccacggatttctgaaagtgcctcctcggatggacgccaagatgtatctgggctacgagtacgtgaccgcc atccggaatctgagagaaggcacatgcccagaggctcccaccgatgagtgtaaaccagtgaagtggtgcgctctgtctcaccacgag agactgaagtgtgacgagtggtccgtgaacagcgtgggcaagattgagtgtgtgtccgccgagacaaccgaggactgtatcgccaag atcatgaacggcgaggccgacgctatgtctctggatggcggatttgtgtacattgccggaaagtgtggactggtgccagtgctggccg agaactacaacaagagcgacaactgcgaggataccccagaggccggatattttgccgtggcagtcgtgaagaagtccgccagcgat ctgacatgggacaatctcaagggcaagaaaagctgccacaccgccgtgggaagaacagccggatggaacattcctatggggctgct gtacaacaaaatcaaccactgccgcttcgacgagttcttcagcgaaggatgtgctcccggcagcaagaaagacagctctctgtgcaag ctgtgcatgggcagcggactgaatctgtgcgagcccaacaacaaagagggctactacggctacaccggggcctttagatgtctggttg agaagggcgacgttgcatttgtgaaacaccagaccgtgcctcagaacaccggcggcaagaatcccgatccttgggccaagaatctga acgagaaggactatgagctgctctgtctggacggcacccggaaaccagtggaagaatacgccaactgtcatctggcaagagcccca aatcacgccgtcgtgaccagaaaggacaaagaggcttgcgtccacaagattctgcggcagcagcagcatctgttcggcagcaatgtg accgactgcagcggcaacttctgtctgttcagaagcgagacaaaggatctcctcttccgcgacgataccgtgtgtctcgccaagctgca cgaccggaacacatacgagaagtatctgggagaagagtatgtgaaggctgtgggcaatctgcggaagtgcagcacatcttctctgctc gaggcttgcacatttcggcggccttgatga
SEQ ID NO : 17 : Séquence peptidique de la transferrine humaine
VPDKTVRWCAVSEHEATKCQSFRDHMKSVIPSDGPSVACVKKASYLDCIRAIAANEA D AVTLD AGL VYD AYL APNNLKP VVAEF Y GSKEDPQTF YY AVAVVKKDSGF QMNQL RGKKSCHTGLGRSAGWNIPIGLLYCDLPEPRKPLEKAVANFFSGSCAPCADGTDFPQL CQLCPGCGCSTLNQYFGYSGAFKCLKDGAGDVAFVKHSTIFENLANKADRDQYELL CLDNTRKP VDE YKDCHL AQ VP SHT V V ARSMGGKEDLIWELLN Q AQEHF GKDK SKEF QLF S SPHGKDLLFKD S AHGFLK VPPRMD AKMYLGYE Y VT AIRNLREGT CPE APTDEC KPVKW CAL SHHERLKCDEW S VN SV GKIEC V S AETTEDCI AKTMNGE AD AMSLDGGF V YI AGKC GL VP VL AENYNK SDN CEDTPE AGYF AV A VVKK S ASDLT WDNLKGKK S C HT AV GRT AGWNIPMGLL YNKINHCRFDEFF SEGC APGSKKD S SLCKLCMGSGLNLCE PNNKEGYYGYTGAFRCLVEKGDVAFVKHQTVPQNTGGKNPDPWAKNLNEKDYELL CLDGTRKPVEEYANCHLARAPNHAVVTRKDKEACVHKILRQQQHLFGSNVTDCSGN F CLFRSETKDLLFRDDT V CL AKLHDRNT YEKYLGEE YVK AV GNLRKC STS SLLEACT FRRP
SEQ ID NO : 18 : Séquence peptidique du peptide signal natif de la Transferrine humaine MRL AV GALL V C AVLGLCL A
SEQ ID NO : 19 : Séquence nucléotidique codant pour le peptide signal natif de la Transferrine atgaggctcgccgtgggagccctgctggtctgcgccgtcctggggctgtgtctggct
SEQ ID NO : 20 : Séquence nucléotidique codant pour le peptide signal de la Transferrine atgagactggctgtgggagcactgcttgtgtgtgctgttctgggactgtgtctggcc
SEQ ID NO : 21 : séquence nucléotidique codant pour une protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de G immunoglobuline humaine IgGl (Peppel et al., J Exp Med, 174 : 1483- 1489 - Murphy et al., Arch Ophtalmol, 22 : 845-851) actggtccctcacctaggggacagggagaagagagatagtgtgtgtccccaaggaaaatatatccaccctcaaaataattcgatttgct gtaccaagtgccacaaaggaacctacttgtacaatgactgtccaggcccggggcaggatacggactgcagggagtgtgagagcggc tccttcaccgcttcagaaaaccacctcagacactgcctcagctgctccaaatgccgaaaggaaatgggtcaggtggagatctcttcttgc acagtggaccgggacaccgtgtgtggctgcaggaagaaccagtaccggcattattggagtgaaaaccttttccagtgcttcaattgcag cctctgcctcaatgggaccgtgcacctctcctgccaggagaaacagaacaccgtgtgcacctgccatgcaggtttctttctaagagaaa acgagtgtgtctcctgtagtaactgtaagaaaagcctggagtgcacgaagttgtgcctaccccagattgagaatgttaagggcactgag gactcaggcaccacactggttccgcgtggatccgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggacc gtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagcc acgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagta caacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaa caaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccat cccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggag agcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcacc gtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcacgaggctctgcacaaccactacacgcagaagag cctctccctgtctccgggtaaatga
SEQ ID NO : 22: séquence peptidique de la protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire du récepteur humain p55 au TNF alpha couplé via une charnière au fragment constant de G immunoglobuline humaine IgGl (Peppel et al., J Exp Med, 174 : 1483-1489 - Murphy et al., Arch Ophtalmol, 22 :845-851)
LVPHLGDREKRDSVCPQGKYIHPQNNSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGQDTDCRECES GSF T ASENHLRHCL S C SKCRKEMGQ VEI S S CT VDRDT VCGCRKN Q YRH YW SENLF Q CFNCSLCLNGTVHLSCQEKQNTVCTCHAGFFLRENECVSCSNCKKSLECTKLCLPQIE NVKGTED SGTTL VPRGSDKTHT CPPCP APELLGGP S VFLFPPKPKDTLMISRTPEVT C V VVD V SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVV S VLTVLHQDWLNG KEYKCK V SNK ALP APIEKTI SK AKGQPREPQ V YTLPP SREEMTKN Q VSLT CL VKGF YP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO : 23 : Séquence peptidique du peptide signal natif de la protéine de séquence SEQ ID NO : 22
MGL ST VPDLLLPL VLLELL V GI YP S GVIG
SEQ ID NO : 24 : Séquence nucléotidique codant pour le peptide signal de séquence SEQ ID NO : 23 atgggcctctccaccgtgcctgacctgctgctgccgctggtgctcctggagctgttggtgggaatatacccctcaggggttattgg SEQ ID NO : 25: séquence nucléotidique codant pour le facteur H du complément gaagattgcaatgaacttcctccaagaagaaatacagaaattctgacaggttcctggtctgaccaaacatatccagaaggcacccaggc tatctataaatgccgccctggatatagatctcttggaaatataataatggtatgcaggaagggagaatgggttgctcttaatccattaagga aatgtcagaaaaggccctgtggacatcctggagatactccttttggtacttttacccttacaggaggaaatgtgtttgaatatggtgtaaaa gctgtgtatacatgtaatgaggggtatcaattgctaggtgagattaattaccgtgaatgtgacacagatggatggaccaatgatattcctat atgtgaagttgtgaagtgtttaccagtgacagcaccagagaatggaaaaattgtcagtagtgcaatggaaccagatcgggaataccattt tggacaagcagtacggtttgtatgtaactcaggctacaagattgaaggagatgaagaaatgcattgttcagacgatggtttttggagtaaa gagaaaccaaagtgtgtggaaatttcatgcaaatccccagatgttataaatggatctcctatatctcagaagattatttataaggagaatga acgatttcaatataaatgtaacatgggttatgaatacagtgaaagaggagatgctgtatgcactgaatctggatggcgtccgttgccttcat gtgaagaaaaatcatgtgataatccttatattccaaatggtgactactcacctttaaggattaaacacagaactggagatgaaatcacgtac cagtgtagaaatggtttttatcctgcaacccggggaaatacagcaaaatgcacaagtactggctggatacctgctccgagatgtaccttg aaaccttgtgattatccagacattaaacatggaggtctatatcatgagaatatgcgtagaccatactttccagtagctgtaggaaaatattac tcctattactgtgatgaacattttgagactccgtcaggaagttactgggatcacattcattgcacacaagatggatggtcgccagcagtac catgcctcagaaaatgttattttccttatttggaaaatggatataatcaaaattatggaagaaagtttgtacagggtaaatctatagacgttgc ctgccatcctggctacgctcttccaaaagcgcagaccacagttacatgtatggagaatggctggtctcctactcccagatgcatccgtgt caaaacatgttccaaatcaagtatagatattgagaatgggtttatttctgaatctcagtatacatatgccttaaaagaaaaagcgaaatatca atgcaaactaggatatgtaacagcagatggtgaaacatcaggatcaattacatgtgggaaagatggatggtcagctcaacccacgtgc attaaatcttgtgatatcccagtatttatgaatgccagaactaaaaatgacttcacatggtttaagctgaatgacacattggactatgaatgc catgatggttatgaaagcaatactggaagcaccactggttccatagtgtgtggttacaatggttggtctgatttacccatatgttatgaaaga gaatgcgaacttcctaaaatagatgtacacttagttcctgatcgcaagaaagaccagtataaagttggagaggtgttgaaattctcctgca aaccaggatttacaatagttggacctaattccgttcagtgctaccactttggattgtctcctgacctcccaatatgtaaagagcaagtacaat catgtggtccacctcctgaactcctcaatgggaatgttaaggaaaaaacgaaagaagaatatggacacagtgaagtggtggaatattatt gcaatcctagatttctaatgaagggacctaataaaattcaatgtgttgatggagagtggacaactttaccagtgtgtattgtggaggagagt acctgtggagatatacctgaacttgaacatggctgggcccagctttcttcccctccttattactatggagattcagtggaattcaattgctca gaatcatttacaatgattggacacagatcaattacgtgtattcatggagtatggacccaacttccccagtgtgtggcaatagataaacttaa gaagtgcaaatcatcaaatttaattatacttgaggaacatttaaaaaacaagaaggaattcgatcataattctaacataaggtacagatgta gaggaaaagaaggatggatacacacagtctgcataaatggaagatgggatccagaagtgaactgctcaatggcacaaatacaattatg cccacctccacctcagattcccaattctcacaatatgacaaccacactgaattatcgggatggagaaaaagtatctgttctttgccaagaa aattatctaattcaggaaggagaagaaattacatgcaaagatggaagatggcagtcaataccactctgtgttgaaaaaattccatgttcac aaccacctcagatagaacacggaaccattaattcatccaggtcttcacaagaaagttatgcacatgggactaaattgagttatacttgtga gggtggtttcaggatatctgaagaaaatgaaacaacatgctacatgggaaaatggagttctccacctcagtgtgaaggccttccttgtaa atctccacctgagatttctcatggtgttgtagctcacatgtcagacagttatcagtatggagaagaagttacgtacaaatgttttgaaggtttt ggaattgatgggcctgcaattgcaaaatgcttaggagaaaaatggtctcaccctccatcatgcataaaaacagattgtctcagtttaccta gctttgaaaatgccatacccatgggagagaagaaggatgtgtataaggcgggtgagcaagtgacttacacttgtgcaacatattacaaa atggatggagccagtaatgtaacatgcattaatagcagatggacaggaaggccaacatgcagagacacctcctgtgtgaatccgccca cagtacaaaatgcttatatagtgtcgagacagatgagtaaatatccatctggtgagagagtacgttatcaatgtaggagcccttatgaaat gtttggggatgaagaagtgatgtgtttaaatggaaactggacggaaccacctcaatgcaaagattctacaggaaaatgtgggccccctc cacctattgacaatggggacattacttcattcccgttgtcagtatatgctccagcttcatcagttgagtaccaatgccagaacttgtatcaac ttgagggtaacaagcgaataacatgtagaaatggacaatggtcagaaccaccaaaatgcttacatccgtgtgtaatatcccgagaaatta tggaaaattataacatagcattaaggtggacagccaaacagaagctttattcgagaacaggtgaatcagttgaatttgtgtgtaaacggg gatatcgtctttcatcacgttctcacacattgcgaacaacatgttgggatgggaaactggagtatccaacttgtgcaaaaagatag
SEQ ID NO : 26: séquence peptidique du facteur H du complément
EDCNELPPRRNTEILT GS W SDQT YPEGT Q AI YKCRPGYRSLGNUMV CRKGEW VALNP
LRKCQKRPCGHPGDTPF GTFTLTGGNVFEY GVKAVYTCNEGY QLLGEINYRECDTD
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CVISREIMENYNIALRWTAKQKLYSRTGESVEFVCKRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKL
EYPTCAKR
SEQ ID NO : 27 : Séquence peptidique du peptide signal natif du facteur H MRLL AKIICLML W AIC V A SEQ ID NO : 28 : Séquence nucléotidique codant pour le peptide signal natif du facteur H atgagacttctagcaaagattatttgccttatgttatgggctatttgtgtagca SEQ ID NO : 29 : séquence peptidique du peptide signal du HTLV-1 Env MGKFL ATLILFF QF CPLIF G
SEQ ID NO : 30 : séquence nucléotidique codant pour le peptide signal du HTLV-1 Env atgggtaagtttctcgccactttgattttattcttccagttctgccccctcatcttcggt
SEQ ID NO : 31 : séquence de l’origine de réplication gamma du plasmide E. coli R6K gatcagcagttcaacctgttgatagtatgtactaagctctcatgtttaatgtactaagctctcatgtttaatgaactaaaccctcatggctaatg tactaagctctcatggctaatgtactaagctctcatgtttcacgtactaagctctcatgtttgaacaataaaattaatataaatcagcaacttaa atagcctctaaggttttaagttttataagaaaaaaaagaatatataaggcttttaaagcttttaaggtttaatggttgtggacaacaagcc

Claims

REVENDICATIONS
1. Construction d’ADN pour son utilisation dans le traitement d’une pathologie oculaire, ladite construction d’ADN étant destinée au transfert non viral d’acides nucléiques dans les cellules musculaires de la sphère oculaire d’un patient souffrant de ladite pathologie oculaire ; ladite construction d’ADN étant caractérisée en ce qu’elle comprend :
(a) une origine de réplication bactérienne ou procaryotique, en particulier bactérienne,
(b) une ou plusieurs séquences favorisant l’expression de l’ADN dans la sphère oculaire du patient,
(c) une première séquence nucléotidique codant :
- pour une première protéine thérapeutique, et
- pour un peptide signal permettant la sécrétion de cette première protéine thérapeutique, ce peptide signal étant contiguë de la séquence de la première protéine thérapeutique, en N- terminal de ladite première protéine thérapeutique,
(d) un promoteur permettant l’expression de cette première protéine thérapeutique dans la sphère oculaire du patient ;
(e) une séquence de polyadénylation en 3’ de la première séquence nucléotidique ;
(f) une seconde séquence nucléotidique codant :
- pour une seconde protéine thérapeutique, différente de la première protéine thérapeutique, et
- pour un peptide signal permettant la sécrétion de cette seconde protéine thérapeutique, le peptide signal étant contiguë de la séquence de la seconde protéine thérapeutique, en N- terminal de ladite seconde protéine thérapeutique ; et
(g) un promoteur permettant l’expression de cette seconde protéine thérapeutique dans la sphère oculaire du patient, et
(h) une séquence de polyadénylation en 3’ de la seconde séquence nucléotidique ; ladite construction d’ADN étant administrée au patient par injection dans un muscle ciliaire puis électrotransfert dans les cellules du muscle ciliaire.
2. Construction d’ADN pour son utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la première protéine thérapeutique est une protéine de type anti-VEGF, en particulier choisie dans le groupe constitué de S-Fltl, l’Aflibercept, le conbercept, le brolucizumab, et en particulier d’une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence peptidique SEQ ID NO : 3, cette protéine étant plus particulièrement l’Aflibercept.
3. Construction d’ADN pour son utilisation selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle la première protéine thérapeutique est encodée par une séquence nucléotidique ayant au moins 75% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est plus particulièrement encodée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 2.
4. Construction d’ADN pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle :
(c) la première séquence nucléotidique code :
- pour une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, cette protéine étant plus particulièrement G Aflibercept ; et
- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 4.
5. Construction d’ADN pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle la seconde protéine thérapeutique est une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 8, cette protéine étant plus particulièrement la décorine.
6. Construction d’ADN pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle la seconde protéine thérapeutique est encodée par une séquence nucléotidique ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6, et en particulier par une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO :
7. SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 12, et en particulier constitué par la séquence SEQ ID NO : 7 et la séquence SEQ ID NO : 11.
7. Construction d’ADN pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle :
(c) la première séquence nucléotidique code :
- pour une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, cette protéine étant plus particulièrement G Aflibercept ; et
- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 4 ; et (f) la seconde séquence nucléotidique code :
- pour une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO :
8, cette protéine étant plus particulièrement la décorine ; et
- pour un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 13.
8. Construction d’ADN pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle l’origine de réplication est bactérienne, et est en particulier une origine de réplication issue du plasmide naturel R6K d ’ Escherichia coli , en particulier l’origine de réplication R6K gamma du plasmide naturel R6k d ’ Escherichia coli, notamment de séquence SEQ ID NO : 31.
9. Construction d’ADN pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu’elle est de forme circulaire.
10. Construction d’ADN pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que ladite construction est de G ADN nu.
11. Construction d’ADN pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que la pathologie oculaire est une dégénérescence rétinienne, en particulier une dégénérescence rétinienne choisie dans le groupe constitué de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), humide ou sèche ; des rétinopathies diabétiques (RD) ; d’une occlusion veineuse rétinienne, en particulier d’une occlusion de la veine centrale de la rétine (OVCR) ou d’une occlusion de la branche veineuse rétinienne (OBVR) ; d’une néovascularisation choroïdienne (NVC) myopique ; d’une uvéite, en particulier d’une uvéite non infectieuse ; d’une rétinite pigmentaire et d’un glaucome ; et plus particulièrement en ce que la dégénérescence rétinienne est choisie dans le groupe constitué de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), en particulier de la forme néovasculaire (humide) de la DMLA ; d’une baisse d’acuité visuelle due à un œdème maculaire diabétique (OMD) ; d’une occlusion veineuse rétinienne, en particulier d’une occlusion de la veine centrale de la rétine (OVCR) ou d’une occlusion de la branche veineuse rétinienne (OBVR) ; et d’une néovascularisation choroïdienne (NVC) myopique.
12. Construction d’ADN destinée au transfert non viral d’acides nucléiques dans les cellules musculaires de la sphère oculaire d’un patient pour le traitement de pathologies oculaires caractérisée en ce qu’elle comprend :
(a) une origine de réplication bactérienne ou procaryotique, en particulier bactérienne,
(b) une ou plusieurs séquences favorisant l’expression de l’ADN dans la sphère oculaire du patient, (c) une première séquence nucléotidique codant :
- pour une première protéine thérapeutique, ladite première protéine thérapeutique étant une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, cette protéine étant plus particulièrement G Aflibercept, et
- pour un peptide signal permettant la sécrétion de cette première protéine thérapeutique, en particulier un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 4, ce peptide signal étant contiguë de la séquence de la première protéine thérapeutique, en N- terminal de ladite première protéine thérapeutique,
(d) un promoteur permettant l’expression de cette première protéine thérapeutique dans la sphère oculaire du patient ;
(e) une séquence de polyadénylation en 3’ de la première séquence nucléotidique ;
(f) une seconde séquence nucléotidique codant :
- pour une seconde protéine thérapeutique, ladite seconde protéine thérapeutique étant une protéine ayant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 8, cette protéine étant plus particulièrement la décorine, et
- pour un peptide signal permettant la sécrétion de cette première protéine thérapeutique, en particulier un peptide signal de séquence peptidique SEQ ID NO : 13, ce peptide signal étant contiguë de la séquence de la première protéine thérapeutique, en N- terminal de ladite première protéine thérapeutique,
(g) un promoteur permettant l’expression de cette seconde protéine thérapeutique dans la sphère oculaire du patient ; et
(h) une séquence de polyadénylation en 3’ de la seconde séquence nucléotidique.
13. Construction d’ADN selon la revendication 12, dans laquelle :
(c) la première séquence nucléotidique comprend :
- une séquence nucléotidique codant pour G Aflibercept, et en particulier une séquence ayant au moins 75% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est notamment la séquence SEQ ID NO : 2 ; et
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5 codant pour un peptide signal ; et (f) la seconde séquence nucléotidique comprend :
- une séquence nucléotidique codant pour la décorine, plus particulièrement une séquence nucléotidique ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6, plus particulièrement d’une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 12, et est en particulier la séquence SEQ ID NO : 7 ou la séquence SEQ ID NO : 11 ; et - la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 14 codant pour un peptide signal.
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