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WO2022091793A1 - 糞便由来タンパク質を用いた膵臓がんバイオマーカーの開発 - Google Patents

糞便由来タンパク質を用いた膵臓がんバイオマーカーの開発 Download PDF

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Publication number
WO2022091793A1
WO2022091793A1 PCT/JP2021/037977 JP2021037977W WO2022091793A1 WO 2022091793 A1 WO2022091793 A1 WO 2022091793A1 JP 2021037977 W JP2021037977 W JP 2021037977W WO 2022091793 A1 WO2022091793 A1 WO 2022091793A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pancreatic cancer
protein
proteins
feces
testing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2021/037977
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
伊織 元尾
收 小原
祐介 川島
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kazusa DNA Research Institute Foundation
University of Toyama NUC
Original Assignee
Kazusa DNA Research Institute Foundation
University of Toyama NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kazusa DNA Research Institute Foundation, University of Toyama NUC filed Critical Kazusa DNA Research Institute Foundation
Priority to JP2022558994A priority Critical patent/JPWO2022091793A1/ja
Publication of WO2022091793A1 publication Critical patent/WO2022091793A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a biomarker for pancreatic cancer testing composed of a protein derived from feces and a method for testing pancreatic cancer using the biomarker.
  • Pancreatic cancer is considered to be a representative of intractable tumors with a poor prognosis, but the main reason is that a method for early diagnosis has not been established. In addition, it is also experienced that the diagnosis of pancreatic cancer does not reach a definitive diagnosis before surgical resection because it is difficult to make a histological diagnosis or an image diagnosis for a small lesion.
  • Non-Patent Document 1 In recent years, with the improvement of mass spectrometers due to the progress of science and technology, comprehensive protein analysis technology has been rapidly advancing (Non-Patent Document 1). So far, there have been reports suggesting a relationship between specific proteins present in human stool and the onset or exacerbation of gastrointestinal diseases such as inflammatory bowel disease, but suggesting a relationship between proteins in feces and diseases. There are very few reports of comprehensive protein analysis (Non-Patent Documents 2 and 3). For the first time in 2016, a proteome analysis study using mouse feces was reported (Non-Patent Document 4), and since then, studies on the search for colorectal cancer markers targeting host-derived proteins in feces have begun to be reported (Non-Patent Document 4). 5).
  • cancer mainly gastrointestinal cancers such as gastric cancer and colorectal cancer
  • CA19-9 the positive rate of "CA19-9” is high, and it is used together with “CEA” for cancer diagnosis and treatment monitoring.
  • these tumor markers may increase in value even in inflammation and benign diseases, and are not reliable and are currently used as an auxiliary diagnosis.
  • pancreatic cancer biomarkers There are no reports of fecal-derived pancreatic cancer biomarkers yet.
  • the only cancer screening using feces in the health examination is colorectal cancer screening by fecal occult blood test (detection of hemoglobin in blood). It would be very useful if there was a pancreatic cancer biomarker that could non-invasively monitor the early detection and treatment of pancreatic cancer by a stool test, which is less physically burdensome than a blood test.
  • An object to be solved by the present invention is to provide a novel pancreatic cancer testing method using a fecal-derived protein as a biomarker for pancreatic cancer.
  • the inventors performed a comprehensive proteomics analysis in the feces of pancreatic cancer patients and healthy subjects, and identified 12 kinds of proteins as proteins that are significantly detected in pancreatic cancer patients, and completed the present invention. ..
  • the present invention includes the embodiments described below.
  • Item 1 A method for testing pancreatic cancer, which comprises measuring the protein in the feces of a subject, wherein the protein is a collagen ⁇ -1 (I) chain, protein S100-A8, All-trans-retinol dehydrogenase, and the like.
  • Peroxyledoxin 4 cysteine-rich secreted protein 3, protein-glutamin ⁇ -glutaminase transferase E, ⁇ -enolase, lactotransferase, signal peptidase complex catalytic subunit 11A, plasminogen activator inhibitor 2, eukaryotic translation initiation factor 6
  • Item 2 If the level of one or more of the proteins in the feces of the subject is higher than the level of the corresponding protein in the feces of a healthy subject, the subject has pancreatic cancer or the pancreas. Item 2. The test method according to Item 1, which indicates that there is a high possibility of contracting cancer.
  • Item 3. Item 2. The method according to Item 1 or 2, wherein the measurement includes measurement by mass spectrometry.
  • Item 4. Item 2. The method according to Item 1 or 2, wherein the measurement comprises measuring using an antibody against each one or two or more of the above proteins or polypeptides which are a part thereof.
  • the pancreatic cancer testing method includes a method for testing for the presence of pancreatic cancer, a method for testing the risk of developing pancreatic cancer, a method for testing the preventive effect of pancreatic cancer, and a method for testing the therapeutic effect of pancreatic cancer.
  • Item 1 including methods, methods for examining the possibility of recurrence after treatment for pancreatic cancer, methods for screening drugs that are effective in preventing pancreatic cancer, or methods for screening drugs that are effective in treating pancreatic cancer. The method according to any one of 4 to 4.
  • Collagen ⁇ -1 (I) chain protein S100-A8, All-trans-retinol dehydrogenase, peroxyredoxin 4, cysteine-rich secretory protein 3, protein-glutaminase ⁇ -glutaminasetransferase E, ⁇ -enolase, lactotransferase, signal peptidase complex
  • a pancreatic cancer detection kit containing antibodies against each.
  • Item 7 Collagen ⁇ -1 (I) chain, protein S100-A8, All-trans-retinol dehydrogenase, peroxyredoxin 4, cysteine-rich secreted protein 3, protein-glutaminase ⁇ -glutaminasetransferase E, ⁇ -enolase, lactotransferase, signal peptidase complex
  • a pancreatic cancer diagnostic agent containing an antibody against each.
  • Collagen ⁇ -1 (I) chain protein S100-A8, All-trans-retinol dehydrogenase, peroxyredoxin 4, cysteine-rich secretory protein 3, protein-glutaminase ⁇ for examination of pancreatic cancer using fecal samples
  • non-invasive pancreatic cancer can be diagnosed at an early stage using feces. Early diagnosis of pancreatic cancer also leads to early treatment of pancreatic cancer.
  • proteins 1 to 12 The 12 types of intact proteins (hereinafter, may be simply referred to as "proteins 1 to 12") that can be used as biomarkers for the examination of pancreatic cancer of the present invention are as follows.
  • Protein 1 is a collagen ⁇ -1 (I) chain (gene names COL1A1, 139Da).
  • protein 1 is a human collagen ⁇ -1 (I) chain
  • protein 1 is a human collagen ⁇ -1 (I) chain
  • a protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is included.
  • the identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • the mouse collagen ⁇ -1 (I) chain is a protein or sequence consisting of Uniprot accession number P11087 (NCBI reference sequence NP_031768.2, SEQ ID NO: 2).
  • a protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of No. 2 is included. The identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher. Is included.
  • the rat collagen ⁇ -1 (I) chain is a protein or sequence consisting of Uniprot accession number P02454 (NCBI reference sequence NP_445756.1, SEQ ID NO: 3).
  • a protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of No. 3 is included. The identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • Protein 2 is protein S100-A8 (gene name S100A8, 11 kDa).
  • the human protein S100-A8 consists of Uniprot accession number P05109 (NCBI reference sequence NP_001306126.1, NP_001306127.1, NP_001306130.1, NP_002955.2, SEQ ID NO: 4).
  • a protein or a protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is included. The identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • mouse protein S100-A8 contains 90% of the protein consisting of Uniprot accession number P27005 (NCBI reference sequence NP_038678.1, SEQ ID NO: 5) or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • a protein consisting of an amino acid sequence having the above-mentioned identity is included. The identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • rat protein S100-A8 contains 90% of the protein consisting of Uniprot accession number P50115 (NCBI reference sequence NP_446274.2, SEQ ID NO: 6) or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • a protein consisting of an amino acid sequence having the above-mentioned identity is included. The identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • Protein 3 is All-trans-retinol dehydrogenase (gene name ADH7, 41 kDa).
  • the human All-trans-retinol dehydrogenase is a protein or sequence consisting of Uniprot accession number P40394 (NCBI reference sequence NP_000664.2, NP_001159976.1, SEQ ID NO: 7).
  • a protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of No. 7 is included. The identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • mouse All-trans-retinol dehydrogenase is a protein consisting of Uniprot accession number Q64437 (NCBI reference sequence P_033756.2, SEQ ID NO: 8), or the amino acid of SEQ ID NO: 8.
  • a protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the sequence is included. The identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • the rat All-trans-retinol dehydrogenase is a protein consisting of Uniprot accession number P41682 (NCBI reference sequence NP_599156.1, SEQ ID NO: 9), or the amino acid of SEQ ID NO: 9.
  • a protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the sequence is included. The identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • Protein 4 is peroxiredoxin 4 (gene name PRDX4, 31 kDa).
  • human protein 4 is human peroxyredoxin 4
  • the human protein 4 is the protein consisting of Uniprot accession number Q13162 (NCBI reference sequence NP_006397.1, SEQ ID NO: 10), or the protein of SEQ ID NO: 10.
  • a protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence is included. The identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • the mouse peroxyredoxin 4 is a protein consisting of Uniprot accession number O08807 (NCBI reference sequence, NP_001300640.1, NP_058044.1, SEQ ID NO: 11), or SEQ ID NO: 11.
  • a protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence is included. The identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • rat peroxyredoxin 4 contains 90% of the protein consisting of Uniprot accession number Q9Z0V5 (NCBI reference sequence NP_445964.1, SEQ ID NO: 12) or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.
  • a protein consisting of an amino acid sequence having the above-mentioned identity is included. The identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • Protein 5 is cysteine-rich secreted protein 3 (gene name Crisp3, 28 kDa).
  • the human cysteine-rich secreted protein 3 includes a protein consisting of Uniprot accession number P54108 (NCBI reference sequence NP_001177915.1, NP_006052.2, SEQ ID NO: 13), or SEQ ID NO: 13.
  • the mouse cysteine-rich secreted protein 3 includes a protein consisting of Uniprot accession number O55135 (NCBI reference sequence NP_033769.1, SEQ ID NO: 14) or an amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
  • a protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity is included. The identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • the rat cysteine-rich secreted protein 3 includes a protein consisting of Uniprot accession number P12020 (NCBI reference sequence NP_074050.1, SEQ ID NO: 15) or an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15.
  • a protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity is included. The identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • Protein 6 is protein-glutamin ⁇ -glutaminase transferase E (gene name TGM3, 77 kDa).
  • the human protein-glutamine ⁇ -glutamyltransferase E is a protein consisting of Uniprot accession number Q08188 (NCBI reference sequence N NP_003236.3, SEQ ID NO: 16), or a SEQ ID NO: It contains a protein consisting of 16 amino acid sequences and an amino acid sequence having 90% or more identity. The identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • mouse protein-glutamine ⁇ -glutamyltransferase E is a protein consisting of Uniprot accession number Q08189 (NCBI reference sequence NP_033400.2, SEQ ID NO: 17), or SEQ ID NO: 17 Contains a protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of. The identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • the rat protein-glutamine ⁇ -glutamyltransferase E is a protein consisting of Uniprot accession number D4A5U3 (NCBI reference sequence NP_001102429.1, SEQ ID NO: 18), or SEQ ID NO: 18 Contains a protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of. The identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • Protein 7 is ⁇ -enolase (gene name ENO1, 47kDa).
  • the human ⁇ -enolase includes the protein consisting of Uniprot accession number P04764 (NCBI reference sequence NP_001103378.1, NP_036686.2, SEQ ID NO: 19), or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19.
  • a protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity is included. The identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • the mouse ⁇ -enolase is a protein consisting of Uniprot accession number P17182 (NCBI reference sequence NP_001020559.1, NP_075608.2, SEQ ID NO: 20), or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 and 90.
  • a protein consisting of an amino acid sequence having an identity of% or more is included. The identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • the rat ⁇ -enolase is a protein consisting of Uniprot accession number P04764 (NCBI reference sequence NP_001103378.1, NP_036686.2, SEQ ID NO: 21), or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 and 90.
  • a protein consisting of an amino acid sequence having an identity of% or more is included. The identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • Protein 8 is lactotransferrin (gene name LTF, 78 kDa).
  • the human lactotransferase is a protein or sequence consisting of Uniprot accession number P02788 (NCBI reference sequence NP_001186078.1, NP_001308050.1, NP_001308051.1, NP_002334.2, SEQ ID NO: 22).
  • a protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of No. 22 is included. The identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • mouse lactotransferrin has 90% or more identity with the protein consisting of Uniprot accession number P08071 (NCBI reference sequence NP_032548.2, SEQ ID NO: 23) or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23. Includes a protein consisting of an amino acid sequence having. The identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • the rat lactotransferrin has 90% or more identity with the protein consisting of Uniprot accession number D3ZAB1 (NCBI reference sequence NP_001100334.1, SEQ ID NO: 24) or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24.
  • the identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • Protein 9 is a signal peptidase complex catalytic subunit 11A (gene names SEC11A, 21 kDa).
  • the human signal peptidase complex-catalyzed subunit 11A may contain Uniprot accession number P67812 (NCBI reference sequence NP_001258847.1, NP_001258848.1, NP_001258849.1, NP_001258850. 1, NP_001258851.1, NP_055115.1, SEQ ID NO: 25), or a protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25 is included.
  • the identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • the mouse signal peptidase complex-catalyzed subunit 11A is a protein or sequence consisting of Uniprot accession number Q9R0P6 (NCBI reference sequence NP_064335.1, SEQ ID NO: 26).
  • a protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of No. 26 is included.
  • the identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • the rat signal peptidase complex-catalyzed subunit 11A may be a protein or sequence consisting of Uniprot accession number P42667 (NCBI reference sequence NP_113911.2, SEQ ID NO: 27).
  • a protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of No. 27 is included. The identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • Protein 10 is plasminogen activator inhibitor 2 (gene name SERPINB2, 47kDa).
  • the human plasminogen activator inhibitor 2 is a protein consisting of Uniprot accession number P05120 (NCBI reference sequence NP_001137290.1, NP_002566.1 SEQ ID NO: 28), or A protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28 is included.
  • the identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • the mouse plasminogen activator inhibitor 2 includes a protein consisting of Uniprot accession number P12388 (NCBI reference sequence NP_001167641.1, NP_035241.1, SEQ ID NO: 29). Alternatively, a protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29 is included. The identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • the rat plasminogen activator inhibitor 2 includes a protein consisting of Uniprot accession number P04764 (NCBI reference sequence NP_001103378.1, NP_036686.2, SEQ ID NO: 30).
  • a protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 is included. The identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • Protein 11 is eukaryotic translation initiation factor 6 (gene names EIF6, 27 kDa).
  • EIF6, 27 kDa When protein 11 is human eukaryotic translation initiator 6, Uniprot accession number P56537 (NCBI reference sequence NP_001254739.1, NP_002203.1, NP_852131.1, NP_852133.1, A protein consisting of SEQ ID NO: 31) or a protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31 is included. The identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • the mouse eukaryotic translation initiation factor 6 is a protein consisting of Uniprot accession number O55135 (NCBI reference sequence NP_034709.1, SEQ ID NO: 32), or SEQ ID NO: 32. Contains a protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of. The identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • the rat eukaryotic translation initiation factor 6 is a protein consisting of Uniprot accession number Q3KRD8 (NCBI reference sequence NP_001032429.1, SEQ ID NO: 33), or SEQ ID NO: 33.
  • Protein 12 is malate dehydrogenase 1 (gene name MDH1, 36 kDa).
  • the human apple acid dehydrogenase 1 is a protein consisting of Uniprot accession number P40925 (NCBI reference sequence NP_001186040.1, NP_001186041.1, NP_001303303.1, NP_005908.1, SEQ ID NO: 34).
  • a protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 is included. The identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • the mouse apple acid dehydrogenase 1 is a protein consisting of Uniprot accession number P14152 (NCBI reference sequence NP_001303604.1, NP_032644.3, SEQ ID NO: 35), or an amino acid of SEQ ID NO: 35.
  • a protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the sequence is included. The identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • the rat apple acid dehydrogenase 1 is 90% with the protein consisting of Uniprot accession number O88989 (NCBI reference sequence NP_150238.1, SEQ ID NO: 36) or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36.
  • a protein consisting of an amino acid sequence having the above-mentioned identity is included. The identity is preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and even more preferably 99% or higher.
  • the "test" for pancreatic cancer includes detection of pancreatic cancer, determination of pancreatic cancer, determination of a pancreatic cancer patient (responder) for whom a therapeutic agent is effective (companion diagnostic method), and pancreatic cancer. Judgment of preventive effect, judgment of therapeutic effect of pancreatic cancer, auxiliary test for diagnosis of pancreatic cancer (especially early diagnosis), and auxiliary test for treatment of pancreatic cancer (especially early treatment) Inspection is included. Detection of pancreatic cancer includes detecting the "presence or absence" of pancreatic cancer.
  • Determination of pancreatic cancer includes not only determining the presence or absence of pancreatic cancer, but also prophylactically determining the possibility of developing pancreatic cancer and predicting the prognosis of pancreatic cancer after treatment. This includes determining the therapeutic effect of a therapeutic agent for pancreatic cancer.
  • Substance screening methods include methods for screening substances useful for "detection,””determination,” and “treatment” of pancreatic cancer.
  • treatment means cure or amelioration of a disease or symptom, or suppression of a symptom, and includes “prevention”.
  • Prevention means preventing the onset of a disease or symptom.
  • polypeptide refers to a molecule formed by binding two or more and less than 100 amino acids.
  • protein refers to a molecule formed by binding 100 or more amino acids.
  • measuring one or more of the proteins in a subject's feces refers to measuring the presence (presence) or level of the protein, and the "level” of the protein. “” refers to the concentration, amount, or signal intensity of protein.
  • proteins 1-12 are proteins consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34. Alternatively, it refers to a protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence (identity is preferably 95% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more), respectively, and a mouse. In the case of the protein of SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 15, 20, 23, 26, 31, 32, 35, a protein consisting of the amino acid sequence or an amino acid having 90% or more identity with the amino acid sequence.
  • a protein consisting of a sequence (identity is preferably 95% or more, more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more), and in the case of a rat protein, SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12 respectively. , 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 or a protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence (identity is preferably 95% or more, More preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more).
  • a method for testing pancreatic cancer which comprises measuring one or more selected from the group consisting of the above proteins 1 to 12 in the feces of a subject.
  • the measurement of proteins 1 to 12 can also be performed by measuring the concentration, amount, or signal intensity of the intact protein of proteins 1 to 12, or the full length of the partial sequence of proteins 1 to 12, the concentration, amount, or signal intensity. It can also be measured by measuring.
  • the level (concentration, amount, or signal intensity) of the polypeptide containing some of the amino acid residues of these 12 proteins also has a high level (concentration, amount, or signal intensity).
  • concentration, amount, or signal intensity As long as it reflects the level (concentration, amount, or signal intensity) of intact proteins 1-12, it can also be a marker for pancreatic cancer as long as it is a marker that can distinguish between healthy individuals and pancreatic cancer patients.
  • a part of the amino acid residues means 10 or more consecutive amino acids among the amino acid residues of each protein, preferably 15 or more consecutive amino acids, and more preferably 20 consecutive amino acids.
  • proteins 1 to 12 correlate with the presence or absence of pancreatic cancer. Specifically, the expression levels of proteins 1 to 12 in feces are all significantly higher in pancreatic cancer patients than in healthy subjects.
  • proteins 1 to 12 alone or in combination of two or more as biomarkers for pancreatic cancer testing, the disease can be tested with high accuracy in vitro.
  • the sensitivity (presence accuracy rate) and specificity (disease-free accuracy rate) of the test can be further increased.
  • the subject may be a healthy person or a person suffering from pancreatic cancer.
  • Subjects include those suspected of having pancreatic cancer. "Persons suspected of having pancreatic cancer” include those who are subjectively suspected by the subject (not limited to those who have some subjective symptoms, but who simply wish to undergo preventive screening. ), Or a person who has been determined or diagnosed as pancreatic cancer based on some objective basis (for example, as a result of conventionally known pancreatic cancer tests and / or examinations, pancreatic cancer is rational. It may be a person who is judged by the doctor to have a possibility of illness).
  • the subject is a mammal, preferably a human, a mouse, a rat, a rabbit, a goat, a sheep, a horse, a guinea pig, a hamster, etc., more preferably a human, a mouse, a rat, and further preferably a human. ..
  • the proteins 1 to 12 of the present invention are measured using a fecal sample derived from a subject as a test sample.
  • the stool sample may be centrifuged to remove substances other than the proteins 1 to 12 of the present invention, or the protein-containing fraction may be trypsinized, if necessary.
  • proteins 1 to 12 of the present invention for example, fecal samples are subjected to various molecular mass spectrometry methods (eg, gel electrophoresis, etc.) and various separation and purification methods (eg, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, reverse phase).
  • molecular mass spectrometry methods eg, gel electrophoresis, etc.
  • separation and purification methods eg, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, reverse phase.
  • ionization method eg, electron impact ionization method, field dispersion method, secondary ionization method, high-speed atomic collision method, matrix-assisted laser desorption ionization method, electrospray ionization method, etc.
  • mass spectrometers eg, double convergent mass spectrometer, quadrupole type analyzer, flight time type mass spectrometer, Fourier conversion mass spectrometer, ion cyclotron mass spectrometer, immunomass spectrometer, stable isotope inside Used in a method of combining a standardized mass spectrometer, an MS-MS mass spectrometer using stable isotope-labeled fragment ions as an internal standard, an immunomicroscope, a mass spectrometer, etc.), and matches the molecular weight of proteins 1 to 12. This can be done by detecting fragment ions, spots, or peaks of the band or partial polypeptide thereof, but is
  • the preferred method for measuring proteins 1 to 12 in the test method of the present invention is mass spectrometry. Therefore, according to one aspect of the present invention, one or more of the proteins consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 36 in the feces of the subject are measured by mass spectrometry. Methods for testing for pancreatic cancer are provided.
  • both undegraded proteins and similar polypeptides are biomarkers proteins 1-12 of the invention (particularly proteins consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1-36) or portions thereof. It is completely separated from the polypeptide, and the exact molecular weight of the polypeptide can be quantified quickly and with high accuracy (specificity, sensitivity).
  • proteins 1 to 12 of the present invention are obtained from information on molecular weight.
  • the presence or level of can be identified.
  • programs are well known and that one of ordinary skill in the art can easily construct or modify such programs using known information processing techniques.
  • the measurement of proteins 1 to 12 of the present invention can also be performed using an antibody against a partial polypeptide of each protein 1 to 12. Therefore, according to one aspect of the present invention, one or more selected from the group consisting of proteins 1 to 12 in the feces of a subject is subjected to an antibody against the proteins 1 to 12 or a partial polypeptide thereof. Methods for testing pancreatic cancer, including measuring with, are provided. Such an antibody against the protein of the present invention or a partial polypeptide thereof can be used as a test agent or a diagnostic agent for pancreatic cancer.
  • Antibodies to proteins 1 to 12 or partial polypeptides thereof of the present invention are prepared, and the presence or level of proteins 1 to 12 or partial polypeptides thereof is determined by various immunological methods such as ELISA, immunochromatography, immunoassay, and Western blotting. It can also be a measuring method.
  • Antibodies to proteins 1 to 12 of the present invention or partial polypeptides thereof can be prepared, for example, by immunizing an animal with a sequence of proteins 1 to 12 of the present invention or a partial polypeptide thereof as an epitope antigen.
  • the polypeptide can be isolated and purified from a biological sample derived from a patient expressing the polypeptide, or it can be prepared by a well-known genetic engineering method such as amplification of a cDNA fragment encoding the polypeptide. Furthermore, it can be prepared in large quantities by an organic synthesis method.
  • the antibody against the proteins 1 to 12 or a partial polypeptide thereof of the present invention can specifically bind to the proteins 1 to 12 or a partial polypeptide thereof via the antigen-binding site of the antibody, and the proteins 1 to 12 or the partial polypeptide thereof can be specifically bound to the antibody.
  • Epitope antigens which are 12 or a partial polypeptide thereof, can be made by conventional techniques using one or more immunogens.
  • the epitope antigen is a polypeptide consisting of at least 7, at least 8, at least 10, at least 15, and at least 20 consecutive amino acid residues in the amino acid sequence of each polypeptide represented by SEQ ID NOs: 1 to 36. It consists of a fragment or the full length of each polypeptide.
  • the antibody against the proteins 1 to 12 or a partial polypeptide thereof of the present invention may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and can be produced by a well-known immunological method.
  • the polyclonal antibody can be produced by immunizing an animal such as a bird (for example, a chicken) or a mammal (for example, a rabbit, a goat, a horse, a sheep, a rat, etc.) with the polypeptide according to the present invention.
  • Monoclonal antibodies can be obtained by techniques comprising producing hybridoma cell lines in mice by conventional techniques that produce monoclonal antibodies specific for each polypeptide.
  • the test method of the present invention using an antibody is not particularly limited, and the amount of antibody, antigen or antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen in the test sample is detected by chemical or physical means. Any measuring method may be used as long as it is a measuring method for calculating this from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephrometry, competitive method, immunometric method, sandwich method and the like are preferably used. Upon measurement, the antibody or antigen may be bound to a labeling agent such as a radioisotope, enzyme, fluorescent substance, or luminescent substance. Furthermore, a biotin-avidin system can also be used for binding an antibody or antigen to a labeling agent. These individual immunoassays can be applied to the quantification method of the present invention by the ordinary skill of those skilled in the art.
  • pancreatic cancer testing method using an antibody is useful in that the polypeptide can be detected easily and with high accuracy without the need for a mass spectrometer.
  • the expression level (expression concentration, expression level, signal intensity) of proteins 1 to 12 in feces collected from pancreatic cancer patients is based on the expression level of the corresponding polypeptide in feces collected from healthy subjects. Is also expensive.
  • test method of the present invention can be carried out by collecting fecal samples from a patient in chronological order and examining the expression of proteins 1 to 12 of the present invention in each sample only once, or a plurality of changes with time. It can also be done by examining.
  • the sample collection interval is not particularly limited when the test is performed over time, but the sample collection interval can be, for example, every 1 to several days, 1 to 4 weeks, or 1 to 6 months.
  • the method for testing pancreatic cancer of the present invention is a method for testing the presence of pancreatic cancer, which is one or more of proteins 1 to 12 in the feces of a subject. This includes comparing the level or measured value with the reference value and determining that the subject is likely to have pancreatic cancer if it is equal to or higher than the reference value.
  • the reference value is, for example, a cutoff value that distinguishes between a pancreatic cancer patient and a healthy person, or a mean value, a median value, or a value larger than those of the corresponding proteins 1 to 12 in a pancreatic cancer patient.
  • the method for testing pancreatic cancer of the present invention is a method for testing the presence of pancreatic cancer, which is one or more of proteins 1 to 12 in the feces of a subject. This includes comparing the level or measured value with the reference value and determining that the subject is unlikely to have pancreatic cancer if it is below the reference value.
  • the reference value is, for example, a cutoff value which is a threshold for distinguishing between a pancreatic cancer patient and a healthy person, or a mean value, a median value, or a value smaller than those of the corresponding proteins 1 to 12 in the healthy person.
  • the method for testing pancreatic cancer of the present invention is a method for testing the presence of pancreatic cancer, which is one or more of proteins 1 to 12 in the feces of a subject.
  • pancreatic cancer which is one or more of proteins 1 to 12 in the feces of a subject.
  • Level or measured value is compared with the standard value, and if it is equal to or higher than the standard value, it is determined that the subject is likely to have pancreatic cancer, and if it is lower than the standard value. Including determining that the subject is unlikely to have pancreatic cancer.
  • the reference value is, for example, a cutoff value that distinguishes between a pancreatic cancer patient and a healthy person, or a mean value, a median value, or a value larger than those of the corresponding proteins 1 to 12 in a pancreatic cancer patient.
  • the method for testing pancreatic cancer of the present invention is a method for testing the risk of developing pancreatic cancer, and one or more of proteins 1 to 12 in the feces of a subject. Includes comparing the level or measured value of the patient with the reference value and determining that the subject is more likely to develop pancreatic cancer if it is equal to or higher than the reference value.
  • the reference value is, for example, a cutoff value that distinguishes between a pancreatic cancer patient and a healthy person, or a mean value, a median value, or a value larger than those of the corresponding proteins 1 to 12 in a pancreatic cancer patient.
  • the method for testing pancreatic cancer of the present invention is a method for testing the risk of developing pancreatic cancer, and one or more of proteins 1 to 12 in the feces of a subject. This includes comparing the level or measured value of the patient with the reference value and determining that the subject is unlikely to develop pancreatic cancer if the value is lower than the reference value.
  • the reference value is, for example, a cutoff value which is a threshold for distinguishing between a pancreatic cancer patient and a healthy person, or a mean value, a median value, or a value smaller than those of the corresponding proteins 1 to 12 in the healthy person.
  • the pancreatic cancer testing method of the present invention is a method for testing the risk of developing pancreatic cancer, and one or two of the proteins 1 to 12 in the feces of a subject.
  • the subject is judged to be more likely to develop pancreatic cancer when it is equal to or higher than the reference value, and when it is lower than the reference value. Includes determining that the subject is unlikely to develop pancreatic cancer.
  • the reference value is, for example, a cutoff value that distinguishes between a pancreatic cancer patient and a healthy person, or a mean value, a median value, or a value larger than those of the corresponding proteins 1 to 12 in a pancreatic cancer patient.
  • the method for testing pancreatic cancer of the present invention is a method for testing the preventive effect of pancreatic cancer, and among the proteins 1 to 12 in the feces of the subject after receiving the treatment. This includes comparing the level or measured value of one or more types with the reference value, and determining that the preventive effect of the measure is high for pancreatic cancer when the value is lower than the reference value.
  • the reference value is, for example, the level or measured value of one or more of the proteins 1 to 12 in the feces of the same subject before receiving the treatment, and the threshold value for distinguishing between pancreatic cancer patients and healthy subjects.
  • Measures include surgery for pancreatic cancer, radiation therapy, administration of therapeutic agents, diet therapy, exercise therapy, lifestyle improvement guidance, etc.
  • the subject may be given one or more of the measures listed above.
  • the method for testing pancreatic cancer of the present invention is a method for testing the preventive effect of pancreatic cancer, a method for testing the presence of pancreatic cancer, and a test after receiving treatment.
  • the level or measured value of one or more of the proteins 1 to 12 in the feces of a person is compared with the reference value, and if it is the same as or higher than the reference value, pancreatic cancer due to the measure is taken. It includes determining that the preventive effect is low.
  • the reference value is, for example, the level or measured value of one or more of the proteins 1 to 12 in the feces of the same subject before receiving the treatment, and the cutoff value for distinguishing between pancreatic cancer patients and healthy subjects. , Or the average, median, or greater than those of the corresponding proteins 1-12 in patients with pancreatic cancer.
  • Measures include surgery for pancreatic cancer, radiation therapy, administration of therapeutic agents, diet therapy, exercise therapy, lifestyle improvement guidance, etc.
  • the subject may be given one or more of the measures listed above.
  • the pancreatic cancer testing method of the present invention is a method for testing the preventive effect of pancreatic cancer, and among the proteins 1 to 12 in the feces of the subject after receiving the treatment.
  • the level or measured value of one or more of the above is compared with the standard value, and if it is lower than the standard value, it is judged that the preventive effect of pancreatic cancer by the measure is high, and it is the same as or lower than the standard value. If it is high, it includes determining that the preventive effect of the measures for pancreatic cancer is low.
  • the reference value is, for example, the level or measured value of one or more of the proteins 1 to 12 in the feces of the same subject before receiving the treatment, and the threshold value for distinguishing between pancreatic cancer patients and healthy subjects.
  • Measures include surgery for pancreatic cancer, radiation therapy, administration of therapeutic agents, diet therapy, exercise therapy, lifestyle improvement guidance, etc.
  • the subject may be given one or more of the measures listed above.
  • the method for testing pancreatic cancer of the present invention is a method for testing the therapeutic effect of pancreatic cancer, and among the proteins 1 to 12 in the feces of the subject after receiving the treatment. It includes comparing the level or measured value of one or more types with the reference value, and determining that the therapeutic effect of pancreatic cancer by the measure is high when the level is lower than the reference value.
  • the therapeutic effect of pancreatic cancer means that the pancreatic cancer is improving.
  • the reference value is, for example, the level or measured value of one or more of the proteins 1 to 12 in the feces of the same subject before receiving the treatment, and the threshold value for distinguishing between pancreatic cancer patients and healthy subjects.
  • Measures include surgery for pancreatic cancer, radiation therapy, administration of therapeutic agents, diet therapy, exercise therapy, lifestyle improvement guidance, etc.
  • the subject may be given one or more of the measures listed above.
  • the method for testing pancreatic cancer of the present invention is a method for testing the therapeutic effect of pancreatic cancer, a method for testing the presence of pancreatic cancer, and a test after receiving treatment.
  • the level or measured value of one or more of the proteins 1 to 12 in the feces of a person is compared with the reference value, and if it is the same as or higher than the reference value, pancreatic cancer due to the measure is taken. Includes determining that the therapeutic effect is low.
  • the reference value is, for example, the level or measured value of one or more of the proteins 1 to 12 in the feces of the same subject before receiving the treatment, and the cutoff value for distinguishing between pancreatic cancer patients and healthy subjects. , Or the average, median, or greater than those of the corresponding proteins 1-12 in patients with pancreatic cancer.
  • Measures include surgery for pancreatic cancer, radiation therapy, administration of therapeutic agents, diet therapy, exercise therapy, lifestyle improvement guidance, etc.
  • the subject may be given one or more of the measures listed above.
  • the method for testing pancreatic cancer of the present invention is a method for testing the therapeutic effect of pancreatic cancer, and among the proteins 1 to 12 in the feces of the subject after receiving the treatment.
  • the level or measured value of one or more of the above is compared with the standard value, and if it is lower than the standard value, it is judged that the therapeutic effect of pancreatic cancer by the measure is high, and it is the same as or lower than the standard value. If it is high, it includes determining that the therapeutic effect of pancreatic cancer by the measure is low.
  • the reference value is, for example, the level or measured value of one or more of the proteins 1 to 12 in the feces of the same subject before receiving the treatment, and the threshold value for distinguishing between pancreatic cancer patients and healthy subjects.
  • Measures include surgery for pancreatic cancer, radiation therapy, administration of therapeutic agents, diet therapy, exercise therapy, lifestyle improvement guidance, etc.
  • the subject may be given one or more of the measures listed above.
  • the method for testing pancreatic cancer of the present invention is a method for testing the possibility of recurrence after treatment for pancreatic cancer, and the protein 1 in the feces of the subject after receiving the treatment. Comparing the level or measured value of one or more of 12 to the reference value, if it is the same as or higher than the reference value, it is highly possible that pancreatic cancer has recurred after the treatment. It includes determining and / or determining that pancreatic cancer is unlikely to recur after treatment if it is below the reference value.
  • the reference value is, for example, the level or measured value of one or more of the proteins 1 to 12 in the feces of the same subject before receiving the treatment, and the cutoff value for distinguishing between pancreatic cancer patients and healthy subjects. , Or the average, median, or greater than those of the corresponding proteins 1-12 in patients with pancreatic cancer.
  • Measures include surgery for pancreatic cancer, radiation therapy, administration of therapeutic agents, diet therapy, exercise therapy, lifestyle improvement guidance, etc.
  • the subject may be given one or more of the measures listed above.
  • the method for testing pancreatic cancer of the present invention is a method for screening a drug effective for the prevention of pancreatic cancer, and among the proteins 1 to 12 in the feces of a subject after administration of the drug. It includes comparing the level or measured value of one or more of the above with the reference value, and determining that the drug is likely to be effective in the prevention of pancreatic cancer when it is lower than the reference value.
  • the reference value is, for example, the level or measured value of one or more of proteins 1 to 12 in the feces of the same subject before drug administration, and the threshold value for distinguishing between pancreatic cancer patients and healthy subjects.
  • the method for testing pancreatic cancer of the present invention is a method for screening a drug effective for the prevention of pancreatic cancer, and among the proteins 1 to 12 in the feces of a subject after administration of the drug.
  • the level or measured value of one or more of the above is compared with the standard value, and if it is the same as or higher than the standard value, it is judged that the drug is unlikely to be effective in preventing pancreatic cancer. Including doing.
  • the reference value is, for example, the level or measured value of one or more proteins 1 to 12 in the feces of the same subject before administration of the drug, the cutoff value for distinguishing between pancreatic cancer patients and healthy subjects, and the reference value. Or the mean, median, or greater than the corresponding proteins 1-12 in patients with pancreatic cancer.
  • the method for testing pancreatic cancer of the present invention is a method for screening a drug effective for the prevention of pancreatic cancer, and the protein 1 to 12 in the feces of a subject after administration of the drug.
  • the level or measured value of one or more of them is compared with the standard value, and if it is lower than the standard value, it is judged that the drug is highly likely to be effective in preventing pancreatic cancer, and the standard value is determined. Includes determining that the drug is unlikely to be effective in preventing pancreatic cancer if it is equal to or higher than.
  • the reference value is, for example, the level or measured value of one or more of the same subject's fecal proteins 1 to 12 before administration of the drug, and the cutoff which is a threshold for distinguishing between pancreatic cancer patients and healthy subjects.
  • the method for testing pancreatic cancer of the present invention is a method for screening a drug effective for treating pancreatic cancer, and among the proteins 1 to 12 in the feces of a subject after administration of the drug. It includes comparing the level or measured value of one or more of the above with the reference value, and determining that the drug is likely to be effective for the treatment of pancreatic cancer when it is lower than the reference value.
  • the reference value is, for example, the level or measured value of one or more of proteins 1 to 12 in the feces of the same subject before drug administration, and the threshold value for distinguishing between pancreatic cancer patients and healthy subjects.
  • the method for testing pancreatic cancer of the present invention is a method for screening a drug effective for treating pancreatic cancer, and among the proteins 1 to 12 in the feces of a subject after administration of the drug.
  • the level or measured value of one or more of the above is compared with the reference value, and if it is the same as or higher than the reference value, it is judged that the drug is unlikely to be effective in treating pancreatic cancer. Including doing.
  • the reference value is, for example, the level or measured value of one or more proteins 1 to 12 in the feces of the same subject before administration of the drug, the cutoff value for distinguishing between pancreatic cancer patients and healthy subjects, and the reference value. Or the mean, median, or greater than the corresponding proteins 1-12 in patients with pancreatic cancer.
  • the method for testing pancreatic cancer of the present invention is a method for screening a drug effective for treating pancreatic cancer, and the protein 1 to 12 in the feces of a subject after administration of the drug.
  • the level or measured value of one or more of them is compared with the standard value, and if it is lower than the standard value, it is judged that the drug is likely to be effective for the treatment of pancreatic cancer, and the standard value is determined. Includes determining that the drug is unlikely to be effective in treating pancreatic cancer if it is equal to or higher than.
  • the reference value is, for example, the level or measured value of one or more of the same subject's fecal proteins 1 to 12 before administration of the drug, and the cutoff which is a threshold for distinguishing between pancreatic cancer patients and healthy subjects.
  • the proteins 1 to 12 of the present invention are not only markers for diagnosing or detecting pancreatic cancer, but also markers for examining the risk of developing pancreatic cancer and determining the preventive effect of pancreatic cancer. Markers, markers for determining the therapeutic effect of pancreatic cancer, markers for testing the possibility of recurrence after pancreatic cancer treatment, markers for screening drugs that are effective in preventing pancreatic cancer, pancreatic cancer It can also be a marker for screening therapeutically effective drugs.
  • the proteins 1-12 of the present invention can be used for screening drug discovery target molecules for the treatment of pancreatic cancer and / or can be used as a companion diagnostic for selecting patients or adjusting the dosage of therapeutic agents. can.
  • the method for inspecting pancreatic cancer using proteins 1 to 12 of the present invention determines or diagnoses pancreatic cancer instead of the conventional method for diagnosing pancreatic cancer or in combination with the conventional method for diagnosing pancreatic cancer. Applicable to assistance.
  • test method using the proteins 1 to 12 of the present invention uses the feces of the patient as a sample, it can be carried out as a screening test for a health diagnosis in daily medical care. If a patient with strong suspicion of pancreatic cancer can be accurately detected by a medical examination, it can be linked to endoscopic ultrasonography as a secondary examination for pancreatic cancer scrutiny, and early diagnosis of pancreatic cancer can be made. , Useful for treatment.
  • a pancreatic cancer test or diagnostic kit containing an antibody against each of one or more of proteins 1 to 12 is provided.
  • the test or diagnostic kit may further include a container for containing antibodies against one or more of the proteins 1 to 12 individually or as a mixture, respectively.
  • Antibodies to proteins 1-12 or partial polypeptides thereof may be attached or bound to a solid phase carrier or may be in free form.
  • Antibodies to proteins 1-12 or partial polypeptides thereof may optionally be labeled with labels such as fluoresceins, enzymes, radioisotopes, etc., or secondary antibodies may be labeled as such. May be combined.
  • test or diagnostic kits may further include labeled secondary antibodies, carriers, washings, sample diluents, enzyme substrates, reaction arrests, purified standard marker polypeptides, instructions for use and the like. ..
  • the sample tested by the above test or diagnostic kit is, for example, feces collected from the subject.
  • a pancreatic cancer test kit using an antibody is useful in that it can easily and accurately detect each protein 1 to 12 or a partial polypeptide thereof without the need for a mass spectrometer.
  • the pancreatic cancer test or diagnostic kit of the present invention has the above-mentioned pancreatic cancer test method of the present invention, for example, a test for the presence of pancreatic cancer, a test for the risk of developing pancreatic cancer, and a preventive effect on pancreatic cancer. It can be used for testing, testing the therapeutic effect of pancreatic cancer, screening for drugs effective in preventing pancreatic cancer, and the like.
  • Example 1 1 mL of phosphate buffered saline (PBS-PI) containing a protease inhibitor was added to 50 mg of mouse feces, and the feces were gently crushed with a tip and gently stirred by pipetting until the feces were dissolved. Then, centrifugation was performed at 4 ° C. at 15000 G for 10 minutes, only the supernatant was recovered, and low molecular weight components were removed by trichloroacetic acid precipitation. 100 mM Tris-HCl pH 8.5-0.5% sodium dodecanoate was added to the precipitate containing the protein component, and the protein was redissolved by an ultrasonic crusher.
  • PBS-PI phosphate buffered saline
  • the total protein content was measured by BCA assay to adjust the protein concentration to 1 mg / mL.
  • 2 ⁇ L of 110 mM dithiothreitol was added, and the mixture was allowed to stand at 50 ° C. for 30 minutes to reduce the disulfide bond of the protein.
  • 2 uL of 360 mM iodoacetamide was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes to alkylate the cysteine side chain.
  • 2 ⁇ L of 780 mM cysteine was added and allowed to stand at room temperature for 10 minutes to stop the reaction of iodoacetamide.
  • the recovered sample was desalted by a C18 spin column, the eluate was completely dried on a centrifugal evaporator and then redissolved in 20 ⁇ L of 3% acetonitrile-0.1% formic acid.
  • the total amount of peptide was measured by BCA assay, the peptide concentration was adjusted to 0.25 mg / mL, and 2 ⁇ L was analyzed by liquid chromatography-mass spectrometer (LC / MS).
  • the LC / MS LC uses the UltiMate 3000 RSLC nano System manufactured by Thermo Fisher Scientific, the flow velocity is 100 nL / min, and the column is 75 umID x 400 mm packed with C18 2.6um core shell particles (manufactured by Osaka Soda Co., Ltd.). used.
  • MS an Orbitrap Exploris 480 Mass Spectrometer manufactured by Thermo Fisher Scientific was used.
  • the MS data obtained by LC / MS analysis was collated with the spectral library of human proteins using Scaffold DIA manufactured by Proteome Software to identify the proteins. The identification threshold was set so that the false positive rate of peptide-level and protein-level identification was 1% or less, respectively. Quantitative values were calculated from the MS / MS chromatograph area values for the identified proteins, and protein variability in each sample was analyzed.
  • the expression levels of the 12 proteins were shown to be significantly higher in pancreatic cancer patients (T01 to T10) than in healthy subjects (H01 to H10).
  • Table 1 shows the average expression level of each protein in pancreatic cancer patients (T01 to T10), the average expression level in healthy subjects (H01 to H10), and the p-value. The two groups were tested with the Mann-Whitney U Test.

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Abstract

被検者の糞便中のタンパク質を測定することを含む、膵臓がんの検査方法であって、前記タンパク質は、コラーゲンα－１（Ｉ）鎖、プロテインＳ１００－Ａ８、Ａｌｌ－ｔｒａｎｓ－レチノールデヒドロゲナーゼ、ペルオキシレドキシン４、システインリッチ分泌タンパク質３、タンパク質-グルタミン γグルタミルトランスフェラーゼＥ、α－エノラーゼ、ラクトトランスフェリン、シグナルペプチダーゼ複合体触媒サブユニット１１Ａ、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター２、真核生物翻訳開始因子６及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼ１から成る群から選択された１種又は２種以上である、検査方法。

Description

糞便由来タンパク質を用いた膵臓がんバイオマーカーの開発
　本発明は、糞便由来のタンパク質からなる膵臓がん検査用バイオマーカー及びそれを用いた膵臓がんの検査方法に関する。
　膵臓がんは予後不良な難治性腫瘍の代表とされているが、その主な理由は早期診断の手法が確立されていない事に起因する。また、膵臓がんの診断は、微小病変では組織診断や画像診断が困難なことから、外科的切除前には確定診断に至らないことも経験される。
　近年、科学技術の進歩による質量分析装置の改良に伴って、網羅的タンパク解析技術が急速に進歩してきている（非特許文献１）。これまでに、ヒト便中に存在する特定のタンパク質と炎症性腸疾患などの消化器疾患の発症や病態増悪の関連を示唆する報告が存在するが、糞便中のタンパク質と疾患との関連を示唆する網羅的タンパク解析の報告は極めて少ない（非特許文献２，３）。２０１６年に初めてマウス糞便を使ったプロテオーム解析研究が報告され（非特許文献４）、以降、便中の宿主由来タンパク質をターゲットにした大腸癌マーカーの探索に関する研究が報告され始めている（非特許文献５）。
　膵臓がんの早期診断の場合、超音波内視鏡下針生検により組織を得る必要がある。しかし、手技上の合併症の発症リスクを考慮すると、同手法をリスク評価として用いることは不可能である。そのため、超音波内視鏡検査を受ける対象を絞る目的で、健康診断で行うことのできる簡便な検査方法が求められている。これまで膵臓がんの診断用バイオマーカーの探索の目的で生体試料中のタンパク質の網羅的解析が行われてきたが（特許文献１，２）、これらは血液や尿から得られたタンパク質であり、実際に日常診療で使用できるほどの感度、特異度のあるバイオマーカーは特定されていない。その理由は、血液や尿ではタンパク質の多くをアルブミンが占めており、微量なタンパク質の解析が困難であったためと考えられる。
　他方、代表的な腫瘍マーカーとして、胃がん・大腸がんなどの消化器系がんを中心に広範囲のがん種で値が上昇する「ＣＥＡ」が汎用されている。一方、膵臓がんの場合は「ＣＡ１９－９」の陽性率が高く、「ＣＥＡ」と併せてがんの診断や治療のモニタリングに用いられている。しかしながら、これらの腫瘍マーカーは、炎症や良性疾患でも値が上昇する場合があり、確実なものではなく補助診断として使用されているのが現状である。
　最近、熊本大・東北大・国立がんセンターが共同で、早期膵がん患者の血液中でＩＧＦＢＰ２とＩＧＦＢＰ３が変化していることを見出し、この２つのタンパク質が従来の「ＣＡ１９－９」を補完することで、「ＣＡ１９－９」単独では難しかった早期膵がんの診断が可能になることを報告した（非特許文献６）。
特開2020-073920 特開2020-091295
Meier F, et al., Nat Methods. 15: 440-448, 2018 Midtvedt T. et al., PLoS One. 8(6): e66074, 2013 Vergnolle N, Gut. 65(7): 1215-1224, 2016 Lichtman, J. S. et al., ISME J. 10(5): 1170-1181, 2016 Ang, C. S.et al. Methods Enzymol. 586:247-274, 2017 Yoneyama T, PLoS One.2016 Aug 31;11(8):e0161009
　糞便由来の膵がんのバイオマーカーの報告はまだ存在しない。現在、健康診断で糞便を用いたがん検診としては便潜血検査（血液中のヘモグロビンを検出）による大腸がん検診が行われているのみである。もし、血液検査よりも身体的負担の少ない糞便検査によって非侵襲的に膵臓がんの早期発見や治療のモニタリングができる膵臓がんのバイオマーカーがあれば非常に有用である。
　本発明が解決しようとする課題は、糞便由来のタンパク質を膵臓がんのバイオマーカーとして用いた新規な膵臓がんの検査方法を提供することにある。
　発明者らは、膵がん患者と健常者の糞便中の網羅的なプロテオーム解析を行い、膵がん患者に有意に多く検出されるタンパク質として１２種のタンパク質を同定し、本発明を完成した。
　本発明は、以下に記載の実施形態を包含する。
　項１．被検者の糞便中のタンパク質を測定することを含む、膵臓がんの検査方法であって、前記タンパク質は、コラーゲンα－１（Ｉ）鎖、プロテインＳ１００－Ａ８、Ａｌｌ－ｔｒａｎｓ－レチノールデヒドロゲナーゼ、ペルオキシレドキシン４、システインリッチ分泌タンパク質３、タンパク質-グルタミン γグルタミルトランスフェラーゼＥ、α－エノラーゼ、ラクトトランスフェリン、シグナルペプチダーゼ複合体触媒サブユニット１１Ａ、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター２、真核生物翻訳開始因子６及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼ１から成る群から選択された１種又は２種以上である、検査方法。
　項２．前記被検者の糞便中のタンパク質のうちの１種又は２種以上のレベルが健常者の糞便中の対応するタンパク質のレベルよりも高いことは、被検者が膵臓がんであるか、又は膵臓がんに罹患する可能性が高いことを示す、項１に記載の検査方法。
　項３．前記測定することは、質量分析により測定することを含む項１又は２に記載の方法。
　項４．前記測定することは、上記タンパク質又はその一部であるポリペプチドのうちの１種又は２種以上の各々に対する抗体を用いて測定することを含む項１又は２に記載の方法。
　項５．前記膵臓がんの検査方法は、膵臓がんの存在を検査する方法、膵臓がんの発症リスクを検査する方法、膵臓がんの予防効果を検査する方法、膵臓がんの治療効果を検査する方法、膵臓がんの措置後の再発の可能性を検査する方法、膵臓がんの予防に有効な薬剤をスクリーニングする方法、又は膵臓がんの治療に有効な薬剤をスクリーニングする方法を含む項１～４のいずれかに記載の方法。
　項６．コラーゲンα－１（Ｉ）鎖、プロテインＳ１００－Ａ８、Ａｌｌ－ｔｒａｎｓ－レチノールデヒドロゲナーゼ、ペルオキシレドキシン４、システインリッチ分泌タンパク質３、タンパク質-グルタミン γグルタミルトランスフェラーゼＥ、α－エノラーゼ、ラクトトランスフェリン、シグナルペプチダーゼ複合体触媒サブユニット１１Ａ、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター２、真核生物翻訳開始因子６及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼ１から成る群から選択される１種又は２種以上のタンパク質又はその一部であるポリペプチドの各々に対する抗体を含む、膵臓がんの検出キット。
　項７．コラーゲンα－１（Ｉ）鎖、プロテインＳ１００－Ａ８、Ａｌｌ－ｔｒａｎｓ－レチノールデヒドロゲナーゼ、ペルオキシレドキシン４、システインリッチ分泌タンパク質３、タンパク質-グルタミン γグルタミルトランスフェラーゼＥ、α－エノラーゼ、ラクトトランスフェリン、シグナルペプチダーゼ複合体触媒サブユニット１１Ａ、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター２、真核生物翻訳開始因子６及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼ１から成る群から選択される１種又は２種以上のタンパク質又はその一部であるポリペプチドの各々に対する抗体を含む膵臓がん診断薬。
　項８．糞便試料を用いた膵臓がんの検査のための、コラーゲンα－１（Ｉ）鎖、プロテインＳ１００－Ａ８、Ａｌｌ－ｔｒａｎｓ－レチノールデヒドロゲナーゼ、ペルオキシレドキシン４、システインリッチ分泌タンパク質３、タンパク質-グルタミン γグルタミルトランスフェラーゼＥ、α－エノラーゼ、ラクトトランスフェリン、シグナルペプチダーゼ複合体触媒サブユニット１１Ａ、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター２、真核生物翻訳開始因子６及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼ１から成る群から選択される１種又は２種以上のタンパク質又はその一部であるポリペプチドの使用。
　本発明の検査方法によれば、糞便を用いた非侵襲的な膵臓がんの早期診断が可能となる。膵臓がんの早期診断は、膵臓がんの早期治療にも繋がる。
プロテオーム解析により抽出した糞便中の２０９３種類のタンパク質をプロットした散布図。縦軸：ｐ値、横軸：Fold Change。 （Ａ）～（Ｆ）ヒト膵癌患者(ｎ＝１０)と健常者(ｎ＝１０)の糞便中の12種類のタンパク質の発現量をそれぞれ示すグラフ。縦軸：強度。 （Ｇ）～（Ｌ）ヒト膵癌患者(ｎ＝１０)と健常者(ｎ＝１０)の糞便中の12種類のタンパク質の発現量をそれぞれ示すグラフ。縦軸：強度。
　本発明の膵臓がんの検査のためのバイオマーカーとして用い得る１２種類のインタクトなタンパク質（以下、単に「タンパク質１～１２」と称する場合がある）は、以下の通りである。
　タンパク質１はコラーゲンα－１（Ｉ）鎖（遺伝子名COL1A1、139Da）である。タンパク質１がヒトコラーゲンα－１（Ｉ）鎖の場合、ヒトコラーゲンα－１（Ｉ）鎖の場合には、Uniprotアクセッション番号P02402(NCBIリファレンス配列NP_000079.2、配列番号１）からなるタンパク質、又は配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。タンパク質１がマウスコラーゲンα－１（Ｉ）鎖の場合、マウスコラーゲンα－１（Ｉ）鎖には、Uniprotアクセッション番号P11087 (NCBIリファレンス配列NP_031768.2、配列番号２）からなるタンパク質、又は配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。が含まれる。タンパク質１がラットコラーゲンα－１（Ｉ）鎖の場合、ラットコラーゲンα－１（Ｉ）鎖には、Uniprotアクセッション番号P02454 (NCBIリファレンス配列NP_445756.1、配列番号３）からなるタンパク質、又は配列番号３のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。
　タンパク質２はプロテインＳ１００－Ａ８（遺伝子名S100A8、11kDa）である。タンパク質２がヒトプロテインＳ１００－Ａ８の場合、ヒトプロテインＳ１００－Ａ８には、Uniprotアクセッション番号P05109 (NCBIリファレンス配列NP_001306126.1, NP_001306127.1, NP_001306130.1, NP_002955.2、配列番号４）からなるタンパク質、又は配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。タンパク質２がマウスプロテインＳ１００－Ａ８の場合、マウスプロテインＳ１００－Ａ８には、Uniprotアクセッション番号P27005 (NCBIリファレンス配列NP_038678.1、配列番号５）からなるタンパク質、又は配列番号５のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。タンパク質２がラットプロテインＳ１００－Ａ８の場合、ラットプロテインＳ１００－Ａ８には、Uniprotアクセッション番号P50115 (NCBIリファレンス配列NP_446274.2、配列番号６）からなるタンパク質、又は配列番号６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。
　タンパク質３はＡｌｌ－ｔｒａｎｓ－レチノールデヒドロゲナーゼ（遺伝子名ADH7、41kDa）である。タンパク質３がヒトＡｌｌ－ｔｒａｎｓ－レチノールデヒドロゲナーゼの場合、ヒトＡｌｌ－ｔｒａｎｓ－レチノールデヒドロゲナーゼには、Uniprotアクセッション番号P40394 (NCBIリファレンス配列NP_000664.2, NP_001159976.1、配列番号７）からなるタンパク質、又は配列番号７のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。タンパク質３がマウスＡｌｌ－ｔｒａｎｓ－レチノールデヒドロゲナーゼの場合、マウスＡｌｌ－ｔｒａｎｓ－レチノールデヒドロゲナーゼには、Uniprotアクセッション番号Q64437 (NCBIリファレンス配列P_033756.2、配列番号８）からなるタンパク質、又は配列番号８のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。タンパク質３がラットＡｌｌ－ｔｒａｎｓ－レチノールデヒドロゲナーゼの場合、ラットＡｌｌ－ｔｒａｎｓ－レチノールデヒドロゲナーゼには、Uniprotアクセッション番号P41682 (NCBIリファレンス配列NP_599156.1、配列番号９）からなるタンパク質、又は配列番号９のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。
　タンパク質４はペルオキシレドキシン４（遺伝子名PRDX4、31kDa）である。ヒトタンパク質４がヒトペルオキシレドキシン４の場合、ヒトタンパク質４がヒトペルオキシレドキシン４には、Uniprotアクセッション番号Q13162 (NCBIリファレンス配列NP_006397.1、配列番号１０）からなるタンパク質、又は配列番号１０のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。タンパク質３がマウスペルオキシレドキシン４の場合、マウスペルオキシレドキシン４には、Uniprotアクセッション番号O08807 (NCBIリファレンス配列、NP_001300640.1, NP_058044.1、配列番号１１）からなるタンパク質、又は配列番号１１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。タンパク質４がラットペルオキシレドキシン４の場合、ラットペルオキシレドキシン４には、Uniprotアクセッション番号Q9Z0V5 (NCBIリファレンス配列NP_445964.1、配列番号１２）からなるタンパク質、又は配列番号１２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。
　タンパク質５はシステインリッチ分泌タンパク質３（遺伝子名Crisp3、28kDa）である。タンパク質５がヒトシステインリッチ分泌タンパク質３の場合、ヒトシステインリッチ分泌タンパク質３には、Uniprotアクセッション番号P54108 (NCBIリファレンス配列NP_001177915.1, NP_006052.2、配列番号１３）からなるタンパク質、又は配列番号１３のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。タンパク質５がマウスシステインリッチ分泌タンパク質３の場合、マウスシステインリッチ分泌タンパク質３には、Uniprotアクセッション番号O55135 (NCBIリファレンス配列NP_033769.1、配列番号１４）からなるタンパク質、又は配列番号１４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。タンパク質３がラットシステインリッチ分泌タンパク質３の場合、ラットシステインリッチ分泌タンパク質３には、Uniprotアクセッション番号P12020 (NCBIリファレンス配列NP_074050.1、配列番号１５）からなるタンパク質、又は配列番号１５のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。
　タンパク質６はタンパク質-グルタミン γグルタミルトランスフェラーゼＥ（遺伝子名TGM3、77kDa）である。タンパク質６がヒトタンパク質-グルタミン γグルタミルトランスフェラーゼＥの場合、ヒトタンパク質-グルタミン γグルタミルトランスフェラーゼＥ には、Uniprotアクセッション番号Q08188 (NCBIリファレンス配列N NP_003236.3、配列番号１６）からなるタンパク質、又は配列番号１６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。タンパク質６がマウスタンパク質-グルタミン γグルタミルトランスフェラーゼＥの場合、マウスタンパク質-グルタミン γグルタミルトランスフェラーゼＥ には、Uniprotアクセッション番号Q08189 (NCBIリファレンス配列NP_033400.2、配列番号１７）からなるタンパク質、又は配列番号１７のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。タンパク質６がラットタンパク質-グルタミン γグルタミルトランスフェラーゼＥの場合、ラットタンパク質-グルタミン γグルタミルトランスフェラーゼＥ には、Uniprotアクセッション番号D4A5U3(NCBIリファレンス配列NP_001102429.1、配列番号１８）からなるタンパク質、又は配列番号１８のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。
　タンパク質７はα－エノラーゼ（遺伝子名ENO1、47kDa）である。タンパク質７がヒトα－エノラーゼの場合、ヒトα－エノラーゼには、Uniprotアクセッション番号P04764 (NCBIリファレンス配列NP_001103378.1, NP_036686.2、配列番号１９）からなるタンパク質、又は配列番号１９のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。タンパク質７がマウスα－エノラーゼの場合、マウスα－エノラーゼにはUniprotアクセッション番号P17182 (NCBIリファレンス配列NP_001020559.1, NP_075608.2、配列番号２０）からなるタンパク質、又は配列番号２０のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。タンパク質７がラットα－エノラーゼの場合、ラットα－エノラーゼにはUniprotアクセッション番号P04764 (NCBIリファレンス配列NP_001103378.1, NP_036686.2、配列番号２１）からなるタンパク質、又は配列番号２１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。
　タンパク質８はラクトトランスフェリン（遺伝子名LTF、78kDa）である。タンパク質８がヒトラクトトランスフェリンの場合、ヒトラクトトランスフェリンには、Uniprotアクセッション番号P02788 (NCBIリファレンス配列NP_001186078.1, NP_001308050.1, NP_001308051.1, NP_002334.2、配列番号２２）からなるタンパク質、又は配列番号２２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。タンパク質８がマウスラクトトランスフェリンの場合、マウスラクトトランスフェリンには、Uniprotアクセッション番号P08071 (NCBIリファレンス配列NP_032548.2、配列番号２３）からなるタンパク質、又は配列番号２３のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。タンパク質８がラットラクトトランスフェリンの場合、ラットラクトトランスフェリンには、Uniprotアクセッション番号D3ZAB1 (NCBIリファレンス配列NP_001100334.1、配列番号２４）からなるタンパク質、又は配列番号２４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。
　タンパク質９はシグナルペプチダーゼ複合体触媒サブユニット１１Ａ（遺伝子名SEC11A、21kDa）である。タンパク質９がヒトシグナルペプチダーゼ複合体触媒サブユニット１１Ａの場合、ヒトシグナルペプチダーゼ複合体触媒サブユニット１１Ａ には、Uniprotアクセッション番号P67812(NCBIリファレンス配列NP_001258847.1, NP_001258848.1, NP_001258849.1, NP_001258850.1, NP_001258851.1, NP_055115.1、配列番号２５）からなるタンパク質、又は配列番号２５のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。タンパク質９がマウスシグナルペプチダーゼ複合体触媒サブユニット１１Ａの場合、マウスシグナルペプチダーゼ複合体触媒サブユニット１１Ａ には、Uniprotアクセッション番号Q9R0P6 (NCBIリファレンス配列NP_064335.1、配列番号２６）からなるタンパク質、又は配列番号２６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。タンパク質９がラットシグナルペプチダーゼ複合体触媒サブユニット１１Ａの場合、ラットシグナルペプチダーゼ複合体触媒サブユニット１１Ａには、Uniprotアクセッション番号P42667 (NCBIリファレンス配列NP_113911.2、配列番号２７）からなるタンパク質、又は配列番号２７のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。
　タンパク質１０はプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター２（遺伝子名SERPINB2、47kDa）である。タンパク質１０がヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター２の場合、ヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター２には、Uniprotアクセッション番号P05120 (NCBIリファレンス配列NP_001137290.1, NP_002566.1配列番号２８ ）からなるタンパク質、又は配列番号２８のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。タンパク質１０がマウスプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター２の場合、マウスプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター２には、Uniprotアクセッション番号P12388 (NCBIリファレンス配列NP_001167641.1, NP_035241.1、配列番号２９）からなるタンパク質、又は配列番号２９のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。タンパク質１０がラットプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター２の場合、ラットプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター２には、Uniprotアクセッション番号P04764 (NCBIリファレンス配列NP_001103378.1, NP_036686.2、配列番号３０）からなるタンパク質、又は配列番号３０のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。
　タンパク質１１は真核生物翻訳開始因子６（遺伝子名EIF6、27kDa）である。タンパク質１１がヒト真核生物翻訳開始因子６の場合、ヒト真核生物翻訳開始因子６には、Uniprotアクセッション番号P56537 (NCBIリファレンス配列NP_001254739.1, NP_002203.1, NP_852131.1, NP_852133.1、配列番号３１）からなるタンパク質、又は配列番号３１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。タンパク質１１がマウス真核生物翻訳開始因子６の場合、マウス真核生物翻訳開始因子６には、Uniprotアクセッション番号O55135 (NCBIリファレンス配列NP_034709.1、配列番号３２）からなるタンパク質、又は配列番号３２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。タンパク質１１がラット真核生物翻訳開始因子６の場合、ラット真核生物翻訳開始因子６には、Uniprotアクセッション番号Q3KRD8 (NCBIリファレンス配列NP_001032429.1、配列番号３３）からなるタンパク質、又は配列番号３３のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。
　タンパク質１２はリンゴ酸デヒドロゲナーゼ１（遺伝子名MDH1、36kDa）である。タンパク質１２がヒトリンゴ酸デヒドロゲナーゼ１の場合、ヒトリンゴ酸デヒドロゲナーゼ１には、Uniprotアクセッション番号P40925 (NCBIリファレンス配列NP_001186040.1, NP_001186041.1, NP_001303303.1, NP_005908.1、配列番号３４）からなるタンパク質、又は配列番号３４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。タンパク質１２がマウスリンゴ酸デヒドロゲナーゼ１の場合、マウスリンゴ酸デヒドロゲナーゼ１には、Uniprotアクセッション番号P14152 (NCBIリファレンス配列NP_001303604.1, NP_032644.3、配列番号３５）からなるタンパク質、又は配列番号３５のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。タンパク質１２がラットリンゴ酸デヒドロゲナーゼ１の場合、ラットリンゴ酸デヒドロゲナーゼ１には、Uniprotアクセッション番号O88989 (NCBIリファレンス配列NP_150238.1、配列番号３６）からなるタンパク質、又は配列番号３６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である。
  本明細書において、膵臓がんの「検査」には、膵臓がんの検出、膵臓がんの判定、治療薬が奏効する膵臓がん患者（レスポンダー）の判定（コンパニオン診断法）、膵臓がんの予防効果の判定、膵臓がんの治療効果の判定、膵臓がんの診断（特には早期診断）のための補助的検査、及び膵臓がんの治療（特には早期治療）のための補助的検査が含まれる。膵臓がんの検出には、膵臓がんの「有無」を検出することが含まれる。膵臓がんの「判定」には、膵臓がんの有無を判定することのみならず、予防的に膵臓がんの罹患可能性を判定することや、治療後の膵臓がんの予後を予測すること、及び膵臓がんの治療薬の治療効果を判定することが含まれる。物質のスクリーニング方法には、膵臓がんの「検出」、「判定」及び「治療」に有用な物質のスクリーニング方法が含まれる。
　本明細書において、「治療」とは、疾患もしくは症状の治癒又は改善、或いは症状の抑制を意味し「予防」を含む。「予防」とは、疾患又は症状の発現を未然に防ぐことを意味する。
　本明細書において、「ポリペプチド」とは、２個以上１００個未満のアミノ酸が結合して形成された分子を指す。
　本明細書において、「タンパク質」とは、１００以上のアミノ酸が結合して形成された分子を指す。
　本明細書において、被検者の糞便中のタンパク質のうちの１種又は２種以上を「測定する」とは、該タンパク質の存在（有無）又はレベルを測定することを指し、タンパク質の「レベル」とは、タンパク質の濃度、量、又はシグナル強度を指す。
　本明細書において、「タンパク質１～１２」は、ヒトのタンパク質の場合、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４のアミノ酸配列からなるタンパク質又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク（同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である）をそれぞれ指し、マウスのタンパク質の場合、配列番号２、５、８、１１、１４、１５、２０、２３、２６、３１、３２、３５のアミノ酸配列からなるタンパク質又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク（同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である）をそれぞれ指し、ラットのタンパク質の場合、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６のアミノ酸配列からなるタンパク質又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク（同一性は好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上である）をそれぞれ指す。
　本発明の一態様によれば、被検者の糞便中の上記タンパク質１～１２からなる群から選択される１種又は２種以上を測定することを含む、膵臓がんの検査方法が提供される。
　タンパク質１～１２の測定は、タンパク質１～１２のインタクトなタンパク質の濃度、量、又はシグナル強度を測定することによってもできるし、タンパク質１～１２の部分配列の全長を濃度、量、又はシグナル強度を測定することによってもできる。
　上記タンパク質１～１２が膵臓がんのマーカーとして有用であるので、この１２種のタンパク質のアミノ酸残基の一部を含むポリペプチドも、該ポリペプチドのレベル（濃度、量、又はシグナル強度）がインタクトなタンパク質１～１２のレベル（濃度、量、又はシグナル強度）を反映している限り、健常者と膵臓がん患者を区別できるマーカーである限り、同様に膵臓がんのマーカーとなることが考えられる。ここでアミノ酸残基の一部とは、各タンパク質のアミノ酸残基のうち、連続する１０個以上のアミノ酸を意味し、好ましくは連続する１５個以上のアミノ酸を意味し、より好ましくは連続する２０個以上のアミノ酸を意味し、より好ましくは連続する２３個以上、さらにより好ましくは連続する２５個以上のアミノ酸を意味する。タンパク質１～１２の発現レベル（発現濃度、発現量、シグナル強度）は、膵臓がんの有無と相関がある。具体的には、タンパク質１～１２の糞便中の発現レベルはいずれも、健常者よりも膵臓がん患者で有意に高い。
　よって、タンパク質１～１２を膵臓がん検査のバイオマーカーとして単独で又は２つ以上組み合わせて用いることで、当該疾患をインビトロで高い精度で検査することができる。タンパク質１～１２を２種以上組み合わせることにより、検査の感度（有病正診率）及び特異度（無病正診率）をより高めることができる。
　被検者は、健常者であっても、膵臓がんに罹患している者であってもよい。被検者には膵臓がんに罹患していると疑われる者も含まれる。「膵臓がんに罹患していると疑われる者」は、被検者本人が主観的に疑いを抱く者（何らかの自覚症状がある者に限らず、単に予防検診の受診を希望する者を含む）であってもよいし、何らかの客観的な根拠に基づいて膵臓がんと判定又は診断された者（例えば、従来公知の膵臓がんの検査及び／又は診察の結果、膵臓がんの合理的な罹患可能性があると医師が判断した者）であってもよい。
　被検者は哺乳動物であり、好ましくはヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、モルモット、ハムスター等が挙げられ、より好ましくはヒト、マウス、ラットであり、さらに好ましくはヒトである。
　被検試料となる被検者由来の糞便試料を用いて、本発明のタンパク質１～１２を測定する。糞便試料は、必要に応じて、本発明のタンパク質１～１２以外の物質を除去するために遠心分離したり、タンパク質を含有する画分をトリプシン処理したりしてもよい。
　本発明のタンパク質１～１２の測定は、例えば、糞便試料を各種の分子量測定法（例：ゲル電気泳動など）各種の分離精製法（例：イオン交換クロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィ、アフィニティークロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィなど）、表面プラズモン共鳴法、イオン化法（例：電子衝撃イオン化法、フィールドディソープション法、二次イオン化法、高速原子衝突法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法、エレクトロスプレーイオン化法など）、及び質量分析計（例：二重収束質量分析計、四重極型分析計、飛行時間型質量分析計、フーリエ変換質量分析計、イオンサイクロトロン質量分析計、免疫質量分析計、安定同位体を内部標準にした質量分析計、安定同位体標識フラグメントイオンを内部標準品にしたMS-MS質量分析計、免疫顕微鏡計、質量顕微計など）を組み合わせる方法等に供し、タンパク質１～１２の分子量と一致するバンドもしくは該部分ポリペプチドのフラグメントイオン、スポット、あるいはピークを検出することにより行うことができるが、これらに限定されない。
　本発明の検査方法におけるタンパク質１～１２の好ましい測定法は、質量分析法である。　よって、本発明の一態様によれば、被検者の糞便中の配列番号１～３６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のうちの１種又は２種以上を質量分析で測定することを含む膵臓がんの検査方法が提供される。
　免疫質量分析法によれば、未分解のタンパク質も類似ポリペプチドも、バイオマーカーである本発明のタンパク質１～１２（特には配列番号１～３６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質）又はその部分ポリペプチドと完全に分離され、ポリペプチドの正確な分子量を迅速かつ高い精度（特異度、感度）で定量することが可能となる。
　糞便試料中の分子を質量分析することにより、分子量に関する情報から標的分子である本発明のタンパク質１～１２（特には配列番号１～３６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質）又はその部分ポリペプチドの存在又はレベルを同定することができる。質量分析装置からの情報を、任意のプログラムを用いて、処置後の患者（フォローアップ）又は健常者由来の糞便試料における質量分析データと比較して、示差的な情報として出力させることも可能である。そのようなプログラムは周知であり、また、当業者は、公知の情報処理技術を用いて、容易にそのようなプログラムを構築もしくは改変することができることが理解されよう。
　本発明のタンパク質１～１２の測定は、各タンパク質１～１２の部分ポリペプチドに対する抗体を用いて行うこともできる。よって、本発明の一態様によれば、被検者の糞便中のタンパク質１～１２から成る群から選択された１種又は２種以上を、該タンパク質１～１２又はその部分ポリペプチドに対する抗体を用いて測定することを含む膵臓がんの検査方法が提供される。本発明のタンパク質又はその部分ポリペプチドに対するかかる抗体は膵臓がんの検査薬又は診断薬として使用することができる。
　本発明のタンパク質１～１２又はその部分ポリペプチドに対する抗体を作製し、ELISA、イムノクロマト法、イムノアッセイ法、ウェスタンブロッティングなどの各種免疫学的方法によりタンパク質１～１２又はその部分ポリペプチドの存在又はレベルを測定する方法とすることもできる。
　本発明のタンパク質１～１２又はその部分ポリペプチドに対する抗体は、例えば、本発明のタンパク質１～１２又はその部分ポリペプチドの配列を、エピトープ抗原として動物を免疫することにより調製することができる。ポリペプチドは、これを発現する患者由来の生体試料から単離・精製することもできるし、あるいはポリペプチドをコードするcDNA断片の増幅等の周知の遺伝子工学的手法によって調製することもできるし、さらには有機合成法により大量に調製することも可能である。
　本発明のタンパク質１～１２又はその部分ポリペプチドに対する抗体は、抗体の抗原結合部位を介して、該タンパク質１～１２又はその部分ポリペプチドに特異的に結合し得るものであり、該タンパク質１～１２又はその部分ポリペプチドであるエピトープ抗原を１または複数の免疫原として使用して慣用の技術によって作製することができる。
　エピトープ抗原は、配列番号１～３６で表される各ポリペプチドのアミノ酸配列において、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個の連続するアミノ酸残基からなるポリペプチド断片、または各ポリペプチド全長からなる。
　本発明の該タンパク質１～１２又はその部分ポリペプチドに対する抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製することができる。ポリクローナル抗体は、鳥類(例えば、ニワトリなど)、哺乳動物(例えば、ウサギ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ネズミなど)などの動物に本発明に係るポリペプチドを免疫することによって作製することができる。モノクローナル抗体は、各ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を、慣用技術によってマウスにおいて産生することを含む手法によって得ることができる。
　抗体を用いる本発明の検査方法は、特に制限されるべきものではなく、被験試料中の抗原量に対応した抗体、抗原もしくは抗体－抗原複合体の量を化学的又は物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法及びサンドイッチ法等が好適に用いられる。測定に際し、抗体又は抗原は、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、又は発光物質等の標識剤と結合され得る。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン-アビジン系を用いることもできる。これら個々の免疫学的測定法は、当業者の通常の技能により、本発明の定量方法に適用可能である。
　抗体を用いた膵臓がんの検査方法は、質量分析装置の必要なく簡便に高精度に該ポリペプチドを検出することができる点で有用である。
　上述したように、膵臓がん患者から採取した糞便中のタンパク質１～１２の発現レベル（発現濃度、発現量、シグナル強度）は、健常者から採取した糞便中の対応するポリペプチドの発現レベルよりも高い。
　本発明の上記検査方法は、患者から時系列で糞便試料を採取し、各試料における本発明のタンパク質１～１２の発現を１回のみ調べることにより行うこともできるし、複数回の経時変化を調べることにより行うこともできる。経時的に検査を行う場合の試料の採取間隔は特に限定されないが、例えば１～数日ごと、１～４週間ごと、１～６ヶ月ごとに行うことができる。
　膵臓がんの糞便中のタンパク質１～１２の発現レベル（発現濃度、発現量、シグナル強度）は、健常者の糞便中の同じタンパク質１～１２の発現レベルよりも有意に高い。従って、治療後の膵臓がん患者のタンパク質１～１２の発現レベルが低下している場合には、該患者における膵臓がんが改善している可能性が高いと判定することができる。
　一つの実施形態では、本発明の膵臓がんの検査方法は、膵臓がんの存在を検査する方法であり、被検者の糞便中のタンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル又は測定値を基準値と比較し、基準値と同じかそれよりも高い場合に、被検者は膵臓がんに罹患している可能性が高いと判定することを含む。
　基準値は、例えば膵臓がん患者と健常者を区別するカットオフ値、又は膵臓がん患者における対応するタンパク質１～１２の平均値、中央値、若しくはそれらよりも大きい値である。
　別の実施形態では、本発明の膵臓がんの検査方法は、膵臓がんの存在を検査する方法であり、被検者の糞便中のタンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル又は測定値を基準値と比較し、基準値よりも低い場合に、被検者は膵臓がんに罹患している可能性が低いと判定することを含む。
　基準値は、例えば膵臓がん患者と健常者を区別する閾値であるカットオフ値、又は健常者における対応するタンパク質１～１２の平均値、中央値、若しくはそれらよりも小さい値である。
　また別の実施形態では、本発明の膵臓がんの検査方法は、膵臓がんの存在を検査する方法であり、被検者の糞便中のタンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル又は測定値を基準値と比較し、基準値と同じかそれよりも高い場合に、被検者は膵臓がんに罹患している可能性が高いと判定し、基準値よりも低い場合に、被検者は膵臓がんに罹患している可能性が低いと判定することを含む。
　基準値は、例えば膵臓がん患者と健常者を区別するカットオフ値、又は膵臓がん患者における対応するタンパク質１～１２の平均値、中央値、若しくはそれらよりも大きい値である。
　一つの実施形態では、本発明の膵臓がんの検査方法は、膵臓がんの発症リスクを検査する方法であり、被検者の糞便中のタンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル又は測定値を基準値と比較し、基準値と同じかそれよりも高い場合に、被検者は膵臓がんを発症する可能性が高いと判定することを含む。
　基準値は、例えば膵臓がん患者と健常者を区別するカットオフ値、又は膵臓がん患者における対応するタンパク質１～１２の平均値、中央値、若しくはそれらよりも大きい値である。
　別の実施形態では、本発明の膵臓がんの検査方法は、膵臓がんの発症リスクを検査する方法であり、被検者の糞便中のタンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル又は測定値を基準値と比較し、基準値よりも低い場合に、被検者は膵臓がんを発症する可能性が低いと判定することを含む。
　基準値は、例えば膵臓がん患者と健常者を区別する閾値であるカットオフ値、又は健常者における対応するタンパク質１～１２の平均値、中央値、若しくはそれらよりも小さい値である。
　また別の実施形態では、本発明の膵臓がんの検査方法は、膵臓がんの発症リスクを検査する方法であり、被検者の糞便中のタンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル又は測定値を基準値と比較し、基準値と同じかそれよりも高い場合に、被検者は膵臓がんを発症する可能性が高いと判定し、基準値よりも低い場合に、被検者は膵臓がんを発症する可能性が低いと判定することを含む。
　基準値は、例えば膵臓がん患者と健常者を区別するカットオフ値、又は膵臓がん患者における対応するタンパク質１～１２の平均値、中央値、若しくはそれらよりも大きい値である。
　一つの実施形態では、本発明の膵臓がんの検査方法は、膵臓がんの予防効果を検査する方法であり、措置を受けた後の被検者の糞便中のタンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル又は測定値を基準値と比較し、基準値よりも低い場合に、当該措置による膵臓がんの予防効果が高いと判定することを含む。
　基準値は、例えば、措置を受ける前の同じ被検者糞便中のタンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル若しくは測定値、膵臓がん患者と健常者を区別する閾値であるカットオフ値、又は健常者における対応するタンパク質１～１２の平均値、中央値、若しくはそれらよりも小さい値である。
　措置としては、膵臓がんに対する手術、放射線療法、治療薬の投与、食事療法、運動療法、生活習慣改善指導等が挙げられる。上記に挙げた一つ又は複数の措置を被験者に施すことができる。
　別の実施形態では、本発明の膵臓がんの検査方法は、膵臓がんの予防効果を検査する方法であり、膵臓がんの存在を検査する方法であり、措置を受けた後の被検者の糞便中のタンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル又は測定値を基準値と比較し、基準値よりと同じかそれよりも高い場合に、当該措置による膵臓がんの予防効果が低いと判定することを含む。
　基準値は、例えば、措置を受ける前の同じ被検者糞便中のタンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル若しくは測定値、膵臓がん患者と健常者を区別するカットオフ値、又は膵臓がん患者における対応するタンパク質１～１２の平均値、中央値、若しくはそれらよりも大きい値である。
　措置としては、膵臓がんに対する手術、放射線療法、治療薬の投与、食事療法、運動療法、生活習慣改善指導等が挙げられる。上記に挙げた一つ又は複数の措置を被験者に施すことができる。
　また別の実施形態では、本発明の膵臓がんの検査方法は、膵臓がんの予防効果を検査する方法であり、措置を受けた後の被検者の糞便中のタンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル又は測定値を基準値と比較し、基準値よりも低い場合に、当該措置による膵臓がんの予防効果が高いと判定し、基準値よりと同じかそれよりも高い場合に、当該措置による膵臓がんの予防効果が低いと判定することを含む。
　基準値は、例えば、措置を受ける前の同じ被検者糞便中のタンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル若しくは測定値、膵臓がん患者と健常者を区別する閾値であるカットオフ値、又は健常者における対応するタンパク質１～１２の平均値、中央値、若しくはそれらよりも小さい値である。
　措置としては、膵臓がんに対する手術、放射線療法、治療薬の投与、食事療法、運動療法、生活習慣改善指導等が挙げられる。上記に挙げた一つ又は複数の措置を被験者に施すことができる。
　一つの実施形態では、本発明の膵臓がんの検査方法は、膵臓がんの治療効果を検査する方法であり、措置を受けた後の被検者の糞便中のタンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル又は測定値を基準値と比較し、基準値よりも低い場合に、当該措置による膵臓がんの治療効果が高いと判定することを含む。膵臓がんの治療効果とは、膵臓がんが改善していることを指す。
　基準値は、例えば、措置を受ける前の同じ被検者糞便中のタンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル若しくは測定値、膵臓がん患者と健常者を区別する閾値であるカットオフ値、又は健常者における対応するタンパク質１～１２の平均値、中央値、若しくはそれらよりも小さい値である。
　措置としては、膵臓がんに対する手術、放射線療法、治療薬の投与、食事療法、運動療法、生活習慣改善指導等が挙げられる。上記に挙げた一つ又は複数の措置を被験者に施すことができる。
　別の実施形態では、本発明の膵臓がんの検査方法は、膵臓がんの治療効果を検査する方法であり、膵臓がんの存在を検査する方法であり、措置を受けた後の被検者の糞便中のタンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル又は測定値を基準値と比較し、基準値よりと同じかそれよりも高い場合に、当該措置による膵臓がんの治療効果が低いと判定することを含む。
　基準値は、例えば、措置を受ける前の同じ被検者糞便中のタンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル若しくは測定値、膵臓がん患者と健常者を区別するカットオフ値、又は膵臓がん患者における対応するタンパク質１～１２の平均値、中央値、若しくはそれらよりも大きい値である。
　措置としては、膵臓がんに対する手術、放射線療法、治療薬の投与、食事療法、運動療法、生活習慣改善指導等が挙げられる。上記に挙げた一つ又は複数の措置を被験者に施すことができる。
　また別の実施形態では、本発明の膵臓がんの検査方法は、膵臓がんの治療効果を検査する方法であり、措置を受けた後の被検者の糞便中のタンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル又は測定値を基準値と比較し、基準値よりも低い場合に、当該措置による膵臓がんの治療効果が高いと判定し、基準値よりと同じかそれよりも高い場合に、当該措置による膵臓がんの治療効果が低いと判定することを含む。
　基準値は、例えば、措置を受ける前の同じ被検者糞便中のタンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル若しくは測定値、膵臓がん患者と健常者を区別する閾値であるカットオフ値、又は健常者における対応するタンパク質１～１２の平均値、中央値、若しくはそれらよりも小さい値である。
　措置としては、膵臓がんに対する手術、放射線療法、治療薬の投与、食事療法、運動療法、生活習慣改善指導等が挙げられる。上記に挙げた一つ又は複数の措置を被験者に施すことができる。
　別の実施形態では、本発明の膵臓がんの検査方法は、膵臓がんの措置後の再発の可能性を検査する方法であり、措置を受けた後の被検者の糞便中のタンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル又は測定値を基準値と比較し、基準値と同じかそれよりも高い場合に、措置後に膵臓がんが再発している可能性が高いと判定し、及び／又は基準値よりも低い場合に、措置後に膵臓がんが再発している可能性が低いと判定することを含む。
　基準値は、例えば、措置を受ける前の同じ被検者糞便中のタンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル若しくは測定値、膵臓がん患者と健常者を区別するカットオフ値、又は膵臓がん患者における対応するタンパク質１～１２の平均値、中央値、若しくはそれらよりも大きい値である。
　措置としては、膵臓がんに対する手術、放射線療法、治療薬の投与、食事療法、運動療法、生活習慣改善指導等が挙げられる。上記に挙げた一つ又は複数の措置を被験者に施すことができる。
　一つの実施形態では、本発明の膵臓がんの検査方法は、膵臓がんの予防に有効な薬剤をスクリーニングする方法であり、薬剤投与後の被検者の糞便中のタンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル又は測定値を基準値と比較し、基準値よりも低い場合に、当該薬剤が膵臓がんの予防に有効である可能性が高いと判定することを含む。
　基準値は、例えば、薬剤投与前の同じ被検者糞便中のタンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル若しくは測定値、膵臓がん患者と健常者を区別する閾値であるカットオフ値、又は健常者における対応するタンパク質１～１２の平均値、中央値、若しくはそれらよりも小さい値である。
　別の実施形態では、本発明の膵臓がんの検査方法は、膵臓がんの予防に有効な薬剤をスクリーニングする方法であり、薬剤投与後の被検者の糞便中のタンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル又は測定値を基準値と比較し、基準値よりと同じかそれよりも高い場合に、当該薬剤が膵臓がんの予防に有効である可能性が低いと判定することを含む。
　基準値は、例えば、薬剤投与前の同じ被検者糞便中のタンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル若しくは測定値、膵臓がん患者と健常者を区別するカットオフ値、又は膵臓がん患者における対応するタンパク質１～１２の平均値、中央値、若しくはそれらよりも大きい値である。
　また別の実施形態では、本発明の膵臓がんの検査方法は、膵臓がんの予防に有効な薬剤をスクリーニングする方法であり、薬剤投与後の被検者の糞便中のタンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル又は測定値を基準値と比較し、基準値よりも低い場合に、当該薬剤が膵臓がんの予防に有効である可能性が高いと判定し、基準値よりと同じかそれよりも高い場合に、当該薬剤が膵臓がんの予防に有効である可能性が低いと判定することを含む。
　基準値は、例えば、薬剤投与前の同じ被検者糞便中タンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル若しくは測定値、膵臓がん患者と健常者を区別する閾値であるカットオフ値、又は健常者における対応するタンパク質１～１２の平均値、中央値、若しくはそれらよりも小さい値である。
　一つの実施形態では、本発明の膵臓がんの検査方法は、膵臓がんの治療に有効な薬剤をスクリーニングする方法であり、薬剤投与後の被検者の糞便中のタンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル又は測定値を基準値と比較し、基準値よりも低い場合に、当該薬剤が膵臓がんの治療に有効である可能性が高いと判定することを含む。
　基準値は、例えば、薬剤投与前の同じ被検者糞便中のタンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル若しくは測定値、膵臓がん患者と健常者を区別する閾値であるカットオフ値、又は健常者における対応するタンパク質１～１２の平均値、中央値、若しくはそれらよりも小さい値である。
　別の実施形態では、本発明の膵臓がんの検査方法は、膵臓がんの治療に有効な薬剤をスクリーニングする方法であり、薬剤投与後の被検者の糞便中のタンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル又は測定値を基準値と比較し、基準値よりと同じかそれよりも高い場合に、当該薬剤が膵臓がんの治療に有効である可能性が低いと判定することを含む。
　基準値は、例えば、薬剤投与前の同じ被検者糞便中のタンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル若しくは測定値、膵臓がん患者と健常者を区別するカットオフ値、又は膵臓がん患者における対応するタンパク質１～１２の平均値、中央値、若しくはそれらよりも大きい値である。
　また別の実施形態では、本発明の膵臓がんの検査方法は、膵臓がんの治療に有効な薬剤をスクリーニングする方法であり、薬剤投与後の被検者の糞便中のタンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル又は測定値を基準値と比較し、基準値よりも低い場合に、当該薬剤が膵臓がんの治療に有効である可能性が高いと判定し、基準値よりと同じかそれよりも高い場合に、当該薬剤が膵臓がんの治療に有効である可能性が低いと判定することを含む。
　基準値は、例えば、薬剤投与前の同じ被検者糞便中タンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上のレベル若しくは測定値、膵臓がん患者と健常者を区別する閾値であるカットオフ値、又は健常者における対応するタンパク質１～１２の平均値、中央値、若しくはそれらよりも小さい値である。
　以上説明してきたように、本発明のタンパク質１～１２は、膵臓がんの診断又は検出用マーカーのみならず、すい臓がんの発症リスクを検査するためのマーカー、膵臓がんの予防効果判定のマーカー、膵臓がんの治療効果判定のマーカー、膵臓がんの措置後の再発の可能性を検査するためのマーカー、膵臓がんの予防に有効な薬剤をスクリーニングするためのマーカー、膵臓がんの治療に有効な薬剤をスクリーニングするためのマーカーともなり得る。本発明のタンパク質１～１２は、膵臓がんの治療の創薬標的分子のスクリーニングに使用でき、及び／又は患者の選別もしくは治療薬の投与量の調節のためのコンパニオン診断薬として使用することができる。本発明のタンパク質１～１２を使用した膵臓がんの検査方法は、従来の膵臓がんの診断方法に代わりに、又は従来の膵臓がんの診断方法と組み合わせて膵臓がんの判定若しくは診断の補助に、適用可能である。
　また、本発明のタンパク質１～１２を用いた検査方法は、患者の糞便を検体として用いるため、日常診療において、健康診断のスクリーニング検査として実施することができる。健康診断で、膵臓がんが強く疑われる患者を的確に発見することができれば、膵臓がん精査のための２次検査として超音波内視鏡検査に繋げることができ、膵臓がんの早期診断、治療に役立つ。
　本発明の一つの態様によれば、タンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上の各々に対する抗体を含む膵臓がんの検査又は診断キットが提供される。
　かかる検査又は診断キットは、上記タンパク質１～１２のうちの１種又は２種以上に対する抗体を、それぞれ個別に、あるいは混合物として収容するための容器をさらに備えてもよい。タンパク質１～１２又はその部分ポリペプチドに対する抗体は、固相担体に付着又は結合されていてもよいし、または遊離の形態でもよい。タンパク質１～１２又はその部分ポリペプチドに対する抗体には、必要に応じてラベル、例えば蛍光団、酵素、放射性同位元素などの標識を結合させてもよいし、あるいは二次抗体にこのようなラベルを結合してもよい。
　かかる検査又は診断キットは、ラベルされた二次抗体、担体、洗浄液、試料希釈液、酵素基質、反応停止液、精製された標準物質としてのマーカーポリペプチド、使用説明書等をさらに備えてもよい。
　上記検査又は診断キットにより検査されるサンプルは、例えば被検者から採取した糞便である。
　抗体を用いた膵臓がんの検査キットは、質量分析装置の必要なく簡便に高精度に各タンパク質１～１２又はその部分ポリペプチドを検出することができる点で有用である。
　本発明の膵臓がんの検査又は診断キットは、上述の本発明の膵臓がんの検査方法、例えば膵臓がんの存在の検査、膵臓がんの発症リスクの検査、膵臓がんの予防効果の検査、膵臓がんの治療効果の検査、膵臓がんの予防に有効な薬剤のスクリーニングなどに用いることができる。
　以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
実施例１
　マウス糞便50mgに対してプロテアーゼインヒビターを含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS-PI)１ｍLを加え、チップで軽く糞便を潰しながら糞便が解れるまでピペッティングで優しく攪拌した。その後、4℃で15000G、10分間の遠心分離を行い、上澄み液のみを回収し、トリクロロ酢酸沈殿によって低分子量成分を除去した。タンパク質成分が含まれる沈殿物に対して100mM Tris-HCl pH8.5-0.5%ドデカン酸ナトリウムを加え超音波破砕機によってタンパク質を再溶解させた。BCAアッセイにより、総タンパク量を測定して、タンパク質濃度を1mg/mLに調製した。濃度調製したサンプル20μLに対して110mMジチオトレイトールを2μL加え、50℃で30分間静置させてタンパク質のジスルフィド結合を還元させた。さらに、360mM ヨードアセトアミドを2uL加え、室温で30分間静置させてシステイン側鎖をアルキル化させた。その後、780mM システインを2μL加えて、室温で10分間静置させてヨードアセトアミドの反応を止めた。次に50mM重炭酸アンモニウムを150μL加え、さらに0.25mg/mL Lys-Cと0.25mg/mLトリプシンをそれぞれ2uLずつ加えて37℃で15時間静置させ、タンパク質を消化させた。消化物に対して5% TFAを30uL添加してLC-MS分析を阻害するドデカン酸ナトリウムを沈殿させ、15000G、10分間の遠心分離を行い、上澄み液のみを回収した。回収したサンプルはC18スピンカラムによって脱塩を行い、溶出物を遠心エバポレーターで完全に乾燥させた後に3%アセトニトリル-0.1%ギ酸 20μLで再溶解させた。BCAアッセイにより、総ペプチド量を測定して、ペプチド濃度を0.25mg/mLに調製し、液体クロマトグラフィー質量分析計(LC/MS)で2μLを分析した。LC/MSのLCは、Thermo Fisher Scientific社製のUltiMate 3000 RSLCnano Systemを用い、流速は100nL/分で、カラムは75umID x 400mmにC18の2.6umコアシェル粒子(大阪ソーダ社製)をパッキングしたものを使用した。MSに関しては、Thermo Fisher Scientific社製のOrbitrap Exploris 480 Mass Spectrometerを用いた。LC/MS分析で得られたMSデータはProteome Software社製のScaffold　DIAを用いてヒトタンパク質のスペクトラルライブラリと照合し、タンパク質の同定を行った。同定の閾値はペプチドレベルとタンパク質レベルの同定の擬陽性率がそれぞれ1％以下とした。同定されたタンパク質に対してMS/MSクロマトのエリア値から定量値を算出して、各サンプルのタンパク質の変動を解析した。
実施例２
　富山大学附属病院のヒト膵癌患者(n=10)と健常者(n=10)の糞便中の網羅的タンパク質解析を行い、宿主由来のタンパク質を2093種類抽出した。抽出されたタンパク質のうち膵臓がん患者で有意に多いタンパク質を50種類同定し、さらにその中から健常者でほとんど認めず、膵臓がん患者に有意に多く認められる12種類のタンパク質(p<0.025かつFC>2)を抽出した（図1）。この12種類のタンパク質は上述のタンパク質１－１２に対応する。
　図２Ａ，Ｂに示すように、12種類のタンパク質の発現量は、膵癌患者(T01～T10)において健常者(H01～H10)よりも有意に高いことが示された。各タンパク質の膵癌患者(T01～T10)における発現量の平均値、健常者(H01～H10)における発現量の平均値、ｐ値を表１に示す。２群の検定はMann-Whitney U Testで行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001

Claims (8)

  1. 　被検者の糞便中のタンパク質を測定することを含む、膵臓がんの検査方法であって、前記タンパク質は、コラーゲンα－１（Ｉ）鎖、プロテインＳ１００－Ａ８、Ａｌｌ－ｔｒａｎｓ－レチノールデヒドロゲナーゼ、ペルオキシレドキシン４、システインリッチ分泌タンパク質３、タンパク質-グルタミン γグルタミルトランスフェラーゼＥ、α－エノラーゼ、ラクトトランスフェリン、シグナルペプチダーゼ複合体触媒サブユニット１１Ａ、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター２、真核生物翻訳開始因子６及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼ１から成る群から選択された１種又は２種以上である、検査方法。
  2. 　前記被検者の糞便中のタンパク質のうちの１種又は２種以上のレベルが健常者の糞便中の対応するタンパク質のレベルよりも高いことは、被検者が膵臓がんであるか、又は膵臓がんに罹患する可能性が高いことを示す、請求項１に記載の検査方法。
  3. 　前記測定することは、質量分析により測定することを含む請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記測定することは、上記タンパク質又はその一部であるポリペプチドのうちの１種又は２種以上の各々に対する抗体を用いて測定することを含む請求項１又は２に記載の方法。
  5. 　前記膵臓がんの検査方法は、膵臓がんの存在を検査する方法、膵臓がんの発症リスクを検査する方法、膵臓がんの予防効果を検査する方法、膵臓がんの治療効果を検査する方法、膵臓がんの措置後の再発の可能性を検査する方法、膵臓がんの予防に有効な薬剤をスクリーニングする方法、又は膵臓がんの治療に有効な薬剤をスクリーニングする方法を含む請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 　コラーゲンα－１（Ｉ）鎖、プロテインＳ１００－Ａ８、Ａｌｌ－ｔｒａｎｓ－レチノールデヒドロゲナーゼ、ペルオキシレドキシン４、システインリッチ分泌タンパク質３、タンパク質-グルタミン γグルタミルトランスフェラーゼＥ、α－エノラーゼ、ラクトトランスフェリン、シグナルペプチダーゼ複合体触媒サブユニット１１Ａ、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター２、真核生物翻訳開始因子６及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼ１から成る群から選択される１種又は２種以上のタンパク質又はその一部であるポリペプチドの各々に対する抗体を含む、膵臓がんの検出キット。
  7. 　コラーゲンα－１（Ｉ）鎖、プロテインＳ１００－Ａ８、Ａｌｌ－ｔｒａｎｓ－レチノールデヒドロゲナーゼ、ペルオキシレドキシン４、システインリッチ分泌タンパク質３、タンパク質-グルタミン γグルタミルトランスフェラーゼＥ、α－エノラーゼ、ラクトトランスフェリン、シグナルペプチダーゼ複合体触媒サブユニット１１Ａ、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター２、真核生物翻訳開始因子６及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼ１から成る群から選択される１種又は２種以上のタンパク質又はその一部であるポリペプチドの各々に対する抗体を含む膵臓がん診断薬。
  8. 　糞便試料を用いた膵臓がんの検査のための、コラーゲンα－１（Ｉ）鎖、プロテインＳ１００－Ａ８、Ａｌｌ－ｔｒａｎｓ－レチノールデヒドロゲナーゼ、ペルオキシレドキシン４、システインリッチ分泌タンパク質３、タンパク質-グルタミン γグルタミルトランスフェラーゼＥ、α－エノラーゼ、ラクトトランスフェリン、シグナルペプチダーゼ複合体触媒サブユニット１１Ａ、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター２、真核生物翻訳開始因子６及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼ１から成る群から選択される１種又は２種以上のタンパク質又はその一部であるポリペプチドの使用。
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