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WO2021230369A1 - 金ナノ粒子含有医薬 - Google Patents

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WO2021230369A1
WO2021230369A1 PCT/JP2021/018485 JP2021018485W WO2021230369A1 WO 2021230369 A1 WO2021230369 A1 WO 2021230369A1 JP 2021018485 W JP2021018485 W JP 2021018485W WO 2021230369 A1 WO2021230369 A1 WO 2021230369A1
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WO
WIPO (PCT)
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aunp
peg
tumor
gold nanoparticles
cancer
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2021/018485
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
弘樹 加藤
浩一 深瀬
一哉 樺山
敦史 下山
悠一郎 角永
厚史 豊嶋
厚 篠原
安史 金田
智之 西川
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Osaka NUC
Original Assignee
Osaka University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to CA3178425A priority Critical patent/CA3178425A1/en
Priority to EP21804042.6A priority patent/EP4151198A4/en
Priority to US17/925,099 priority patent/US20230233705A1/en
Priority to BR112022023044A priority patent/BR112022023044A2/pt
Priority to CN202180044341.7A priority patent/CN115916264A/zh
Priority to AU2021270106A priority patent/AU2021270106A1/en
Priority to KR1020227040771A priority patent/KR20230010656A/ko
Priority to JP2022522223A priority patent/JPWO2021230369A1/ja
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    • A61K51/1244—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by a special physical form, e.g. emulsion, microcapsules, liposomes, characterized by a special physical form, e.g. emulsions, dispersions, microcapsules particles, powders, lyophilizates, adsorbates, e.g. polymers or resins for adsorption or ion-exchange resins microparticles or nanoparticles, e.g. polymeric nanoparticles
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    • A61K9/141—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers
    • A61K9/146—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers with organic macromolecular compounds
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures

Definitions

  • the present invention relates to a drug containing gold nanoparticles and a treatment for a proliferative disease using the same.
  • the present invention also relates to a gold nanoparticle-containing drug bound to an alpha ray emitting nuclide and the treatment of a proliferative disease using the same.
  • Non-Patent Document 1 It is known that radiation has different cytotoxicity depending on its quality.
  • Alpha rays have a very high linear energy transfer (LET) as compared with gamma rays and beta rays used in conventional treatments (Non-Patent Document 1), and have a particularly high antitumor effect.
  • alpha rays have a very short range and affect only a narrow range. Therefore, it is required that alpha-emitting nuclides are diffused in the lesion, while not being distributed in normal tissues.
  • a targeting molecule that specifically binds to or has an affinity for a target tumor cell or the like.
  • such methods require the selection of optimal targeting molecules for each tumor, requiring more versatile techniques for applying alpha-emitting nuclides to the treatment of proliferative disorders. ing.
  • AuNP gold nanoparticles
  • Au-21 gold nanoparticles
  • AuNP alpha-ray emitting nuclide astatine 211
  • PEG polyethylene glycol
  • An object of the present invention is to provide a drug having an excellent therapeutic effect by adjusting the diffusion characteristics in tumor cells and the like by optimizing the size of gold nanoparticles.
  • the gold nanoparticles are used to directly administer an alpha ray emitting nuclide to a proliferative disease to obtain a therapeutic effect.
  • the present invention treats a proliferative disease comprising gold nanoparticles having a particle size of 0.5 to 110 nanometers bound to At-211 and being locally administered.
  • the surface of the gold nanoparticles is from polyethylene glycol, polyether, polyol, polyethyleneimine, silica gel, peptides, antibodies, proteins, lipids, complex lipids, sugar chains, complex sugars, terpenes, terpenoids and virus-like particles. It may be modified by the selected molecule.
  • the surface modification comprises a molecule that does not bind a targeting molecule to a particular cell, and in yet another embodiment, the surface modification comprises no targeting molecule to a particular cell.
  • the molecule not bound to the target molecule for a particular cell may be polyethylene glycol having an average molecular weight of 2,000 to 20,000.
  • the particle size of the gold nanoparticles may be 0.5 to 13 nm.
  • the pharmaceuticals of the invention can be administered by injection into the lesion, hyperselective administration into the arteries that nourish the lesion, and topical administration selected from the group consisting of intracavitary spraying.
  • the proliferative disorder is a malignant tumor and may be a solid tumor.
  • the solid cancer may be selected from brain cancer, endocrine tumor, prostate cancer, head and neck cancer, oral cancer, breast cancer, gynecological cancer, skin cancer, pancreatic cancer and gastrointestinal cancer.
  • the invention comprises surface modification with polyethylene glycol having a particle size of 0.5-110 nanometers, binding to At-211 and not binding to a targeting molecule for a particular cell.
  • the gold nanoparticles of the invention may further comprise surface modification with a targeting molecule for a particular cell.
  • the invention provides the use of gold nanoparticles having a particle size of 0.5-110 nanometers for producing locally administered pharmaceuticals for treating proliferative disorders.
  • the gold nanoparticles are attached to At-211.
  • the surface of the gold nanoparticles is from polyethylene glycol, polyether, polyol, polyethyleneimine, silica gel, peptides, antibodies, proteins, lipids, complex lipids, sugar chains, complex sugars, terpenes, terpenoids and virus-like particles. It may be modified by the selected molecule. In one embodiment, the surface of the gold nanoparticles may be modified with polyethylene glycol having a molecular weight of 2,000 or more.
  • the present invention provides a method for treating a proliferative disease by locally administering gold nanoparticles having a particle size of 0.5 to 110 nanometers bound to At-211.
  • the surface of the gold nanoparticles is from polyethylene glycol, polyether, polyol, polyethyleneimine, silica gel, peptides, antibodies, proteins, lipids, complex lipids, sugar chains, complex sugars, terpenes, terpenoids and virus-like particles. It may be modified by the selected molecule. In one embodiment, the surface of the gold nanoparticles may be modified with polyethylene glycol having a molecular weight of 2,000 or more.
  • the topical administration can be selected from the group consisting of intra-lesion injection, intra-arterial hyperselective administration to nourish the lesion, and intracavitary spraying.
  • the proliferative disorder is a malignant tumor and may be a solid tumor.
  • the solid cancer is selected from brain cancer, endocrine tumor, prostate cancer, head and neck cancer, oral cancer, breast cancer, gynecological cancer, skin cancer, pancreatic cancer and gastrointestinal cancer.
  • the present invention is in another aspect.
  • Provided is a method of selecting the particle size of particles.
  • a step of evaluating the body weight change of the administered animal and / or the growth inhibitory effect of the proliferative disease tissue can be included.
  • administration into the proliferative disease tissue comprises a group consisting of injection into the central part of the tissue, hyperselective administration into the artery that nourishes the tissue, and spraying of the drug into the cavity in which the tissue is present. You can choose from.
  • the in vivo proliferative disease tissue may be a heterologous proliferative disease tissue transplanted into a subject.
  • the surface of the gold nanoparticles is a hydrocarbon polymer such as polyethylene glycol, polyether, polyol, polyethyleneimine, silica gel, peptide, antibody, protein, lipid, complex lipid, sugar chain, complex sugar, terpene, It may be modified with a molecule selected from terpenoids and virus-like particles.
  • the surface of the gold nanoparticles may be modified with polyethylene glycol having a molecular weight of 2,000 or more.
  • the proliferative disorder is a malignant tumor and may be a solid tumor.
  • the solid cancer is selected from brain cancer, endocrine tumor, prostate cancer, head and neck cancer, oral cancer, breast cancer, gynecological cancer, skin cancer, pancreatic cancer and gastrointestinal cancer.
  • the present invention is in another aspect.
  • Provided is a method for producing bonded gold nanoparticles.
  • a step of evaluating the body weight change of the administered animal and / or the growth inhibitory effect of the proliferative disease tissue can be included.
  • administration into the proliferative disease tissue comprises a group consisting of injection into the central part of the tissue, hyperselective administration into the artery that nourishes the tissue, and spraying of the drug into the cavity in which the tissue is present. You can choose from.
  • the in vivo proliferative disease tissue may be a heterologous proliferative disease tissue transplanted into a subject.
  • the surface of the gold nanoparticles is a hydrocarbon polymer such as polyethylene glycol, polyether, polyol, polyethyleneimine, silica gel, peptide, antibody, protein, lipid, complex lipid, sugar chain, complex sugar, terpene, It may be modified with a molecule selected from terpenoids and virus-like particles.
  • the surface of the gold nanoparticles may be modified with polyethylene glycol having a molecular weight of 2,000 or more.
  • the proliferative disorder is a malignant tumor and may be a solid tumor.
  • the solid cancer is selected from brain cancer, endocrine tumor, prostate cancer, head and neck cancer, oral cancer, breast cancer, gynecological cancer, skin cancer, pancreatic cancer and gastrointestinal cancer.
  • the alpha-ray nuclide-containing nanoparticles of the present invention have excellent intratumor tissue diffusivity and low systemic diffusivity, and have low other organ damage while effectively suppressing the growth of proliferative diseases. doing. In addition, since it is less necessary to consider exposure, it is possible to repeatedly administer an extremely high dose to a proliferative disease tissue, and to provide a drug having a high proliferative disease tissue growth inhibitory effect.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of scintigraphic analysis when 120 nm AuNP (At) PEG was administered to a subcutaneously transplanted glioma model rat.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of scintigraphic analysis when 30 nm AuNP (At) PEG was administered to a subcutaneously transplanted glioma model rat.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of scintigraphic analysis when AuNP (I-123) PEG was administered to a subcutaneously transplanted glioma model rat.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of scintigraphic analysis when 120 nm AuNP (At) PEG was administered to a subcutaneously transplanted glioma model rat.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of scintigraphic analysis when 30 nm AuNP (At) PEG was administered to a subcutaneously transplanted glioma model rat.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of autoradiography when 120 nm AuNP (At) PEG or 30 nm AuNP (At) PEG was administered to a subcutaneously transplanted glioma model rat.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of autoradiography when 30 nm AuNP (At) unmodified with PEG was administered to a subcutaneously transplanted glioma model rat.
  • FIG. 6 is a diagram showing changes in tumor size when AuNP (At) PEG at 5 nm, 13 nm, 30 nm or 120 nm was administered to a subcutaneously transplanted glioma model rat.
  • FIG. 7 is a diagram showing changes in body weight when AuNP (At) PEG at 5 nm, 13 nm, 30 nm or 120 nm was administered to a subcutaneously transplanted glioma model rat.
  • FIG. 8 is a diagram showing the mass of tumor tissue taken out on the 42nd day after administration of AuNP (At) PEG at 5 nm, 13 nm, 30 nm or 120 nm to a subcutaneously transplanted glioma model rat. be.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of scintigraphic analysis performed on subcutaneously transplanted glioma model rats 4 hours, 19 hours, and 42 hours after injection of 5 nmAuNP (At) PEG particles.
  • FIG. 10 is a diagram showing changes in tumor size when AuNP (At) PEG or AuNPPEG (unlabeled) is administered to subcutaneously transplanted renal cancer model mice.
  • FIG. 11 is a diagram showing changes in body weight when AuNP (At) PEG or AuNP-PEG (unlabeled) is administered to subcutaneously transplanted renal cancer model mice.
  • FIG. 12 is a diagram showing the mass of tumor tissue taken out 40 days after administration of AuNP (At) PEG or AuNP-PEG (unlabeled) to subcutaneously transplanted renal cancer model mice. .. FIG.
  • FIG. 13 is a schematic diagram showing the structure of 5 nm PEG-AuNP (At) -c [RGDfK (C)] (5 nm PEG-S-AuNP [ 211 At] -c [RGDfK (C)]).
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of scintigraphy in a subcutaneously transplanted glioma model rat. After selective intraarterial administration of 5 nm PEG-AuNP (At) -c [RGDfK (C) to the artery controlling the tumor transplantation area, 9 hours and 14 hours after administration when the left femoral artery was ligated. The results of scintigraphy after hours are shown.
  • FIG. 15 is a diagram showing body weight changes in a subcutaneously transplanted glioma model rat.
  • the changes in body weight of rats after selective intraarterial administration of 5 nm PEG-AuNP (At) -c [RGDfK (C)] are shown.
  • IA-1 and IA-2 show data of rats treated with 5 nm PEG-AuNP (At) -c [RGDfK (C)], and Ctl-1 and Ctl-2 show the left femoral artery without drug administration.
  • the data of the control rat which performed only the ligation of the above are shown.
  • FIG. 16 is a diagram showing changes in tumor volume in a subcutaneously transplanted glioma model rat.
  • the tumor volume change after selective intraarterial administration of 5 nm PEG-AuNP (At) -c [RGDfK (C)] is shown.
  • IA-1 and IA-2 show data of rats treated with 5 nm PEG-AuNP (At) -c [RGDfK (C), and Ctl-1 and Ctl-2 show data of control rats treated with no drug.
  • FIG. 17 is a diagram showing the results of scintigraphy in an intraperitoneal transplanted glioma model mouse.
  • FIG. 18 is a diagram showing a survival curve in an intraperitoneal transplanted glioma model mouse.
  • the survival curve after intraperitoneal administration (group A) of 5 nm PEG-AuNP (At) -c [RGDfK (C)] 2 weeks after tumor transplantation is shown.
  • FIG. 20 is an image showing the results of a fluorescence imager of a tumor in an intraperitoneal transplanted glioma model mouse.
  • the results of observing the aspect of the tumor by a fluorescent imager after intraperitoneal administration (group B) of 5 nm PEG-AuNP (At) -c [RGDfK (C)] one week after tumor transplantation are shown.
  • Data are shown 3 weeks after tumor transplantation and 11 days after drug administration.
  • “At administration” in the left column shows the results of mice administered with 5 nm PEG-AuNP (At) -c [RGDfK (C)]
  • Control in the right column shows the results of mice administered with saline as a control. ..
  • FIG. 21 is an image showing the results of a fluorescence imager of a tumor in an intraperitoneal transplanted glioma model mouse.
  • the results of observing the aspect of the tumor by a fluorescent imager after intraperitoneal administration (group B) of 5 nm PEG-AuNP (At) -c [RGDfK (C)] one week after tumor transplantation are shown.
  • Data are shown 4 weeks after tumor transplantation and 18 days after drug administration.
  • “At administration” in the left column shows the results of mice administered with 5 nm PEG-AuNP (At) -c [RGDfK (C)]
  • Control in the right column shows the results of mice administered with saline as a control. ..
  • FIG. 22 is an image showing a tumor in an intraperitoneal transplanted glioma model mouse.
  • Image of tumor removed 1 week after intraperitoneal tumor transplantation 5 nm PEG-AuNP (At) -c [RGDfK (C)] was intraperitoneally administered (Group B), 32 days after transplantation, and 23 days after drug administration. Is shown.
  • the "At-administered group” (At-1, At-2, At-3) is an image of a tumor removed from a mouse to which 5 nm PEG-AuNP (At) -c [RGDfK (C)] was administered, and the "Control group" (“Control group” ( Ctl-1, Ctl-2, Ctl-3) show images of tumors removed from mice treated with saline as a control.
  • FIG. 23 is an image showing the results of fluorescence imaging of a tumor in an intraperitoneal transplanted glioma model mouse.
  • FIG. 24 is a diagram showing tumor mass in an intraperitoneal transplanted glioma model mouse.
  • 1 week after intraperitoneal tumor transplantation 5 nm PEG-AuNP (At) -c [RGDfK (C)] was intraperitoneally administered (Group B), and then 32 days after transplantation and 23 days after drug administration, the mass of the tumor removed. Is shown.
  • At-211 When At-211 is used as an alpha ray emitting nuclide, At-211 has properties similar to iodine, and therefore, if administered as it is, it rapidly accumulates in the thyroid gland. Since the drug is retained in the tumor, AuNP can be used to control the distribution of the drug. Specifically, AuNP-PEG can be produced, purified, and then labeled with At-211 to produce At-211 AuNP (At) -PEG. AuNP can appropriately adjust its size according to the purpose.
  • At-211AuNP (At) -PEG when At-211AuNP (At) -PEG is administered to a malignant tumor, an appropriate amount of At-211AuNP (At) -PEG (hereinafter referred to as nanoparticles) is filled in a syringe, and the inside of the malignant tumor is filled with an injection needle. Can be injected slowly. Nanoparticles injected into the tumor diffuse into the tumor. It is known that the smaller the particles, the better the diffusion, but the capillaries of malignant tumors have higher substance permeability than those of normal tissues, and if the particle size is small to a certain extent, they diffuse throughout the body through the capillaries. Has been done.
  • the particle size is about 100 nm
  • the diffusion in the tumor deteriorates and a sufficient effect cannot be obtained. It was found that by setting the particle size to about 30 nm or less, diffusion in the tumor is good, and it does not flow into the capillaries that perfuse the tumor and does not diffuse into other organs outside the tumor. rice field.
  • the nanoparticles staying in the tumor continue to irradiate the tumor cells with alpha rays, decay with a half-life of about 7 hours, and the radioactivity disappears. Tumor cells are damaged by alpha rays with a single injection and their proliferative capacity disappears or is markedly reduced.
  • alpha ray emitting nuclide means a nuclide that emits alpha rays, and these can be mixed and used.
  • the nuclide that emits alpha rays At-211, Ac-225, Ra-223 and the like can be used, but the nuclide is not limited thereto. It is preferable to use At-211 as an alpha ray emitting nuclide.
  • At-211 is a radioactive isotope of astatine (At), which is an element belonging to halogen.
  • the At-211 emits high-energy alpha rays that are cell-killing and decays into stable lead (207Pb).
  • the half-life of At-211 is 7.2 hours. That is, since At-211 has a short life span and high cell killing property, it can efficiently destroy tumor tissue when used for tumor treatment.
  • At-211 is produced by a ( ⁇ , 2n) nuclear reaction using Bi-209 as a target substance using an accelerator such as a cyclotron, purified by a dry method (distillation), and then dissolved in water to At-211. It is supplied as an aqueous solution.
  • proliferative disease means a disease associated with unwanted cell proliferation of one or more subsets of cells for a multicellular organism. Proliferative disorders can occur in a variety of animals, including humans. As used herein, “proliferative disease” includes benign tumors, malignant tumors and other proliferative diseases. Examples of “proliferative disorders” include hematopoietic disorders (eg, myeloproliferative disorders), malignant tumors (eg, brain tumors, prostate cancer, head and neck cancer, oral cancer, breast cancer, pancreatic cancer and gastrointestinal cancer). However, it is not limited to these.
  • tumor means a tissue mass formed by autonomous overgrowth against control in the living body.
  • Tuor includes “benign tumor” which has no pathologically malignant findings and “malignant tumor” which invades surrounding tissues or causes metastasis.
  • the gold nanoparticles (AuNP) of the present invention can be prepared by a known method. For example, J. Phys. Chem. C 2011, vol. 115, pp. The method described in 45024506 can be used, but is not limited thereto.
  • the size of the gold nanoparticles can be arbitrarily set by a method well known to those skilled in the art, and the size of the produced particles can be measured. For example, a microscopy method using a transmission electron microscope (TEM) can be used, but is not limited thereto.
  • TEM transmission electron microscope
  • the size of the gold nanoparticles of the present invention can be appropriately selected based on the type and condition of the malignant tumor, the desired pharmacological effect, and the like.
  • the size of the gold nanoparticles is adjusted to the extent that they show sufficient diffusion within the tumor tissue, while influx into the capillaries that perfuse the tumor and do not spread extensively to other organs outside the tumor. NS.
  • the size of the gold nanoparticles is 0.5 nm or more, 0.6 nm or more, 0.7 nm or more, 0.8 nm or more, 0.9 nm or more, 1 nm or more, 2 nm or more, 3 nm or more, 4 nm or more, 5 nm or more, It is preferably 6 nm or more, 7 nm or more, 8 nm or more, 9 nm or more, 10 nm or more, 11 nm or more, 12 nm or more, 13 nm or more, 14 nm or more, 15 nm or more, 20 nm or more, 25 nm or more, or 30 nm or more.
  • the size of the gold nanoparticles is preferably 110 nm or less, 100 nm or less, 90 nm or less, 80 nm or less, 70 nm or less, 60 nm or less, 50 nm or less, 40 nm or less, or 30 nm or less. In one embodiment, the size of the gold nanoparticles is preferably 1.0 nm to 110 nm. In another embodiment, the size of the gold nanoparticles is preferably 5 nm to 30 nm.
  • Bonding of gold nanoparticles and alpha ray emitting nuclides can be performed by a known method.
  • gold is known to form a stable bond with a halogen element (Dziaver L et al. RSC advances, 2017, Vol. 7, pp. 41024-41032), and is like At-211 as an alpha ray emitting nuclide.
  • a halogen alpha ray emitting nuclide the gold nanoparticles and the alpha ray emitting nuclide can be bonded by mixing the gold nanoparticles and the halogen alpha ray emitting nuclide.
  • the behavior of the gold nanoparticles in a living body can be adjusted.
  • the gold nanoparticles in the tumor tissue can be aggregated, targeted, and promoted cell membrane permeation. Functions such as enhanced cell membrane adsorption can be imparted.
  • Modifications of such gold nanoparticles include hydrocarbon polymers such as polyethylene glycols, polyethers, polyols, polyethyleneimine, silica gels, peptides, antibodies, proteins, lipids, complex lipids, sugar chains, complex sugars, terpenes, etc. Terpenoids and virus-like particles can be used, but are not limited to these.
  • the gold nanoparticles of the invention are modified with polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • various polymers obtained by condensation polymerization of ethylene oxide and water which have various structures known to be used as biological materials, can be used and are chemically used.
  • Reactive PEG without end groups monofunctional PEG with one chemically reactive end group, bifunctional PEG with two chemically reactive end groups, linear PEG , Multi-arm type PEG, PEG having a reactive terminal group such as N-hydroxysuccinimide ester group, thiol group, carboxy group and the like can be used, but the present invention is not limited thereto (Drug Condensation System, 2015, Vol. 30). , No. 4, pp. 390-392). Multiple types of modifications can be combined as long as they do not interfere with each other's functions.
  • the size of the polymer used for modifying the gold nanoparticles of the present invention can be appropriately set by those skilled in the art according to the type and condition of the tumor to be treated, the desired effect, and the like.
  • PEG polymer of diethylene glycol or higher
  • the molecular weight thereof is not particularly limited, but for example, 100 or more, 200 or more, 300 or more, 400 or more, 500 or more, 600 or more, 700 or more, 800.
  • Carrier of gold nanoparticles of the present invention When the gold nanoparticles of the present invention are administered to cells, various substances that regulate the uptake into cells can be used in combination. For example, by enclosing the gold nanoparticles in the virus particles that pass through the cell membrane, the gold nanoparticles can be efficiently delivered into the cells. Further, by modifying the surface of the gold nanoparticles with a compound such as polyethyleneimine that has a cationic charge, the cell permeability of the gold nanoparticles is improved. In addition, by modifying the surface with an antibody or the like that causes cell-specific uptake, the uptake of gold nanoparticles into the cell is improved.
  • a targeting molecule that enhances uptake into a specific cell a molecule that binds to a substance specifically possessed by a proliferative disease cell, for example, an antibody using a protein specifically expressed in the proliferative disease cell as an antigen or an antibody thereof.
  • Antigen-binding fragments such as CD19, EpCAM, CD20, CD45, EGFR, HER2, CDH17-antigens or antigen-binding fragments thereof, ligands or fragments thereof that bind to receptors specifically expressed in proliferative disease cells, for example.
  • Substance P or a fragment thereof, which is a ligand of the NK1 receptor expressed in glioma for example, a peptide consisting of N-terminal 5 to 11 amino acids, other peptides having a tumor targeting function, for example, a cyclic peptide c having a tumor targeting function.
  • RGDfK (C) Vivitide (Kentucky, USA)
  • the targeted molecule can be attached directly to the alpha-emitting nuclide-bound gold nanoparticles, or can be attached via the surface-modified molecule or other carrier.
  • the gold nanoparticles bound to the alpha ray emitting nuclide of the present invention are provided as pharmaceuticals for treating proliferative diseases and the like.
  • the medicine containing gold nanoparticles bound to the alpha ray emitting nuclei of the present invention is effective for the treatment of various proliferative diseases, for example, brain cancer, prostate cancer, head and neck cancer, oral cancer, breast cancer, digestive organ cancer and the like. It can be applied to the treatment of malignant tumors.
  • the gold nanoparticles bound to the alpha ray emitting nuclide of the present invention have excellent diffusion characteristics in the tumor tissue, but have little migration to the outside of the tumor tissue.
  • the present invention also provides a method for treating proliferative diseases and the like using gold nanoparticles bound to alpha ray emitting nuclides.
  • Treatment of the above-mentioned malignant tumors includes suppression of progression, regression, elimination, suppression of metastasis, and prevention of recurrence of primary malignant tumors.
  • the bound gold nanoparticles of the alpha ray emitting nuclide of the present invention can be administered to humans or other mammals such as mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys and the like. ..
  • the administration route of the composition containing the gold nanoparticles of the present invention can be appropriately selected by those skilled in the art, and is provided by a dosage form suitable for the administration route.
  • the gold nanoparticles bound to the alpha ray emitting nuclide of the present invention are preferably locally administered to a lesion such as a tumor. In this case, it can be administered by injecting it into the lesion using an injection needle or the like (intratumor administration). For example, while observing with an echo image, an alpha ray-emitting nuclide-binding gold nanoparticle-containing liquid agent having the same volume as the tumor volume can be injected into the center of the tumor tissue over 1 minute.
  • gold nanoparticles can be superselectively administered into an artery that nourishes a lesion using a catheter or the like (superselective intraarterial administration).
  • hyperselective intra-arterial administration a procedure using a catheter, which has been remarkably developed in recent years, can be applied.
  • the drug can be administered to the lesion tissue in an exclusive manner without directly invading the lesion tissue.
  • Intraluminal administration can administer a high concentration of drug to the disseminated lesion. This administration method is useful as preventive administration for recurrence to the excised cavity after surgery.
  • these topically administered alpha ray emitting nuclei-bound gold nanoparticles do not require the utilization of specific targeting molecules for proliferative disease cells, once.
  • Proliferative disease When it reaches the tissue, it shows a uniform distribution in the tissue, while the outflow to the capillaries around the outside of the tissue is minimized. Therefore, it is possible to suppress radiation exposure to the whole body while obtaining an effective growth inhibitory effect on proliferative disease cells.
  • the alpha ray-emitting nuclide-bound gold nanoparticles used in the pharmaceutical composition or therapeutic method of the present invention may or may not be modified by the surface modification as long as it does not contradict the object of the present invention.
  • the alpha-emitting nuclide-bound gold nanoparticles are surface-modified with a hydrocarbon-based polymer such as polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • the alpha ray emitting nuclei-binding gold nanoparticles used in the pharmaceutical composition or therapeutic method of the present invention are targeting molecules having an affinity for specific proliferative disease cells, such as antibodies, other proteins, peptides, low molecular weight compounds.
  • the alpha-emitting nuclide-bound gold nanoparticles used in the pharmaceutical composition or therapeutic method of the invention of the invention are surface-modified with a hydrocarbon-based polymer to which no targeting molecule is attached.
  • the alpha-emitting nuclei-bound gold nanoparticles used in the pharmaceutical composition or therapeutic method of the invention of the invention are conjugated to a hydrocarbon-based polymer to which the targeting molecule is not bound and to the targeting molecule. It is surface-modified with the same or different hydrocarbon-based polymers.
  • the proportion of the hydrocarbon-based polymer to which the targeting molecule is not bound can be adjusted within a range not contrary to the object of the present invention.
  • the proportion of unbound hydrocarbon-based polymer of the targeted molecule is 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% of the total number of molecules of the surface-modified hydrocarbon-based polymer. It may be 80% or 90%.
  • the present invention provides, in one embodiment, a method of selecting the optimal particle size of alpha-emitting nuclide-bound gold nanoparticles for treating proliferative disorders by topical administration.
  • the method is (1) a step of preparing alpha ray-emitting nuclei-bonded gold nanoparticles having different particle diameters of 0.5 to 110 nanometers, and (2) alpha-ray emitting nuclei-bonded gold nanoparticles having each of the above particle sizes. , (3) The step of confirming the alpha ray distribution in the administered proliferative disease tissue and the systemic alpha ray distribution, (4) in the proliferative disease tissue. Including the step of selecting the particle size based on the alpha ray distribution of the above and the whole body alpha ray distribution.
  • the above method can be carried out using a model animal having a proliferative disease tissue, a cancer-bearing model animal, or a model animal in which a proliferative disease tissue is transplanted and propagated.
  • Evaluation of the alpha ray distribution and the whole body alpha ray distribution in the proliferative disease tissue can be carried out by using a method known to those skilled in the art.
  • the evaluation can be performed by image analysis using scintigraphy analysis, autoradiography analysis, or the like.
  • Specific uniformity of the alpha ray distribution in the tissue of the proliferative disease and the level of the alpha ray distribution outside the tissue of the proliferative disease can be specified by using statistical indexes known to those skilled in the art according to a desired effect.
  • the uniformity of the alpha ray distribution in the proliferative disease tissue for example, the radioactivity distribution obtained by scintigraphy or autoradiography can be visually evaluated. Alternatively, a texture analysis is performed, and a value such as entropy is used as an index, and when the value is low, the uniformity is evaluated as higher. In these evaluations, it is preferable that the uniformity is higher.
  • the alpha ray distribution level outside the proliferative disease tissue can be evaluated, for example, by measuring the radioactivity of each organ by scintigram or SPECT.
  • the radioactivity measurement value of each organ can be measured from the image. It is preferable that the measured value is close to zero.
  • the exposure dose is calculated by using dedicated software such as OLINDA / EXM, and the exposure dose is low.
  • the weight change of the administered animal and / or the growth inhibitory effect of the proliferative disease tissue was evaluated, and the particle size was selected based on these evaluations. You may.
  • the growth inhibitory effect of the proliferative disease tissue is obtained, for example, by comparing the volume change of the proliferative disease tissue after administration of alpha ray-bound gold nanoparticles and / or the mass of the proliferative disease tissue after a certain period of time after administration with the control. It can be carried out.
  • the administration into the tissue of the proliferative disease may be selected from the group consisting of injection into the center of the tissue, hyperselective administration into the artery that nourishes the tissue, and spraying of the drug into the cavity in which the tissue is present.
  • the in vivo proliferative disease tissue may be a heterologous proliferative disease tissue transplanted into a subject.
  • the surfaces of the gold nanoparticles are hydrocarbon-based polymers such as polyethylene glycol, polyether, polyol, polyethylene imine, silica gel, peptides, antibodies, proteins, lipids, complex lipids, sugar chains, complex sugars, terpenes, terpenoids and viruses. It may be modified with a molecule selected from the particles. In one embodiment, the surface modification may be modified with polyethylene glycol having a molecular weight of 2,000 to 20,000.
  • the proliferative disease is a malignant tumor and may be a solid cancer.
  • the solid cancer may be selected from brain cancer, endocrine tumor, prostate cancer, head and neck cancer, oral cancer, breast cancer, gynecological cancer, skin cancer, pancreatic cancer and gastrointestinal cancer.
  • Alpha-emitting nuclide-bound gold nanoparticles having a particle size selected by the method of the present invention show a uniform distribution in the tissue once they reach the proliferative disease tissue, while flowing out into the capillaries around the outside of the tissue. Is minimized. Therefore, according to the method of the present invention, the particle size of gold nanoparticles having excellent properties as an active ingredient of a drug that suppresses radiation exposure to the whole body while obtaining a sufficient growth inhibitory effect on proliferative disease cells can be obtained. You can choose.
  • the present invention provides a method for producing alpha ray emitting nuclide-bound gold nanoparticles having an optimum particle size for treating a proliferative disease by topical administration.
  • the method comprises selecting the particle size based on the method of selecting the particle size of the alpha ray emitting nuclei-bonded gold nanoparticles, and using the gold nanoparticles having the selected particle size, alpha ray emission.
  • Manufacture nucleated gold nanoparticles are used to produce the particle size based on the method of selecting the particle size of the alpha ray emitting nuclei-bonded gold nanoparticles, and using the gold nanoparticles having the selected particle size, alpha ray emission.
  • the alpha-ray emitting nuclide-bound gold nanoparticles produced by the method of the present invention show a uniform distribution in the tissue once they reach the proliferative disease tissue, while the outflow to the capillaries around the outside of the tissue is minimized. It is suppressed. Therefore, by the method of the present invention, it is possible to produce gold nanoparticles having excellent properties as an active ingredient of a drug that suppresses radiation exposure to the whole body while obtaining a sufficient growth inhibitory effect on proliferative disease cells. Can be done.
  • Aqueous solution A 8 mL of water was added to 2 mL of an aqueous solution of chloroauric acid (III) acid (0.17% w / v) to prepare the mixture.
  • Aqueous solution B 0.5 mL of an ascorbic acid (1% w / v) aqueous solution and 0.25 mL of a trisodium citrate (0.88% w / v) aqueous solution were mixed, and 9.25 mL of water was added to prepare the mixture.
  • Aqueous solution C 2 mL of water was added to 8 mL of an aqueous solution of chloroauric acid (III) acid (0.17% w / v) to prepare the mixture.
  • Aqueous solution D 2 mL of an ascorbic acid (1% w / v) aqueous solution and 1 mL of a trisodium citrate (0.88% w / v) aqueous solution were mixed, and 7 mL of water was added to prepare the mixture.
  • AuNP-PEG For a 13 nm AuNP-PEG aqueous solution, a 30 nm AuNP-PEG aqueous solution, and a 120 nm AuNP-PEG aqueous solution, AuNP-PEG was precipitated by centrifugation (10000 G, 1 hour). Then, the supernatant was removed by decantation, and the same amount of distilled water as the removed solution was added. This operation was performed twice in total to obtain a 13 nm AuNP-PEG aqueous solution, a 30 nm AuNP-PEG aqueous solution, and a 120 nm AuNP-PEG aqueous solution from which impurities were removed. TEM imaging confirmed that the AuNP surface was modified with PEG.
  • At-211 labeling of AuNP-PEG (At-211 labeling of 5 nm AuNP-PEG) At-211 aqueous solution was added to 5 nm AuNP-PEG aqueous solution, and the mixture was shaken at room temperature for 15 minutes. After shaking, an aqueous solution of 5 nm AuNP (At) PEG (5 nm mPEG-S-AuNP [ 211 At]) (about 42.3 MBq / mL) was obtained.
  • At-211 labeling of 13 nm AuNP-PEG At-211 aqueous solution was added to a 13 nm AuNP-PEG aqueous solution, and the mixture was shaken at room temperature for 15 minutes. After shaking, an aqueous solution of 13 nm AuNP (At) PEG (13 nm mPEG-S-AuNP [ 211 At]) (about 40.7 MBq / mL) was obtained.
  • At-211 labeling of 30 nm AuNP-PEG At-211 aqueous solution was added to a 30 nm AuNP-PEG aqueous solution, and the mixture was shaken at room temperature for 15 minutes. After shaking, an aqueous solution of 30 nm AuNP (At) PEG (30 nm mPEG-S-AuNP [ 211 At]) (about 39.0 MBq / mL) was obtained.
  • At-211 labeling of 120 nm AuNP-PEG At-211 aqueous solution was added to 120 nm AuNP-PEG aqueous solution, and the mixture was shaken at room temperature for 15 minutes. After shaking, an aqueous solution of 120 nm AuNP (At) PEG (120 nm mPEG-S-AuNP [ 211 At]) (about 39.9 MBq / mL) was obtained.
  • the mass concentration of AuNP (At) -PEG aqueous solution of each size was measured using ICP-OES (Optima 8300, Perkin Elmer Inc. (Waltherm, USA)), and the particle concentration was calculated. These values were used to adjust the particle concentration in AuNP (At) -PEG aqueous solutions to be administered to in vitro and in vivo experimental models to roughly align the doses to be administered.
  • the concentration was adjusted with distilled water, and in the in vivo experiment, the concentration was adjusted with physiological saline.
  • the dose was continuously diluted as described below, and in the in vivo experiment, the dose per animal was adjusted and administered so as to be the radiation dose shown in Table 1 below.
  • AuNP (At) -PEG As a result of culturing C6 glioma with AuNP-PEG for 24 hours, AuNP (At) -PEG at 5 nm, 13 nm, 30 nm and 120 nm was internalized in C6 glioma cells, but AuNP (At) -PEG at 5 nm, 13 nm and 30 nm. In comparison with AuNP (At) -PEG at 120 nm, intracellular internalization was not observed unless the concentration was high.
  • Animal model (3-1) Rat Male nude rats (F344 / NJcl-rnu / rnu (CLEA Japan, Inc. (Tokyo, Japan))) (7 weeks old) were used. (3-2) Mice Male nude mice (BALB / C Slc-nu / nu (Japan SLC, Inc. (Tokyo, Japan))) (5 weeks old) were used.
  • C6 glioma cells which are cell lines of rat glioma obtained by introduction of N-nitrosomethylurea, were used (obtained from RIKEN BRC). C6 glioma cells were cultured in a humidified incubator at 37 ° C. using 5% CO2 addition using MEM medium (Sigma-Aldrich Japan, (Tokyo, Japan)) containing 10% fetal bovine serum.
  • PANC-1 Human pancreatic cancer cell
  • PANC-1 contains The cells were cultured in medium RPMI1640 with L-glutamine and phenol red (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Tokyo, Japan)), 10% heat-inactivated fetal bovine serum and 1% penicillin-streptomycin. Cultivated in RPMI 1640 medium, including.
  • Human pancreatic cancer PANC-1 cells 1.0 ⁇ 10 ⁇ 7 cells / 50 ⁇ l RPMI1640 was added with 50 ⁇ l matrigel (Corning (New York, USA)) and transplanted subcutaneously to the left shoulder of a mouse.
  • Saline (3 animals, 6 tumors), 30 nmAuNP-PEG + physiological saline (3 animals, 6 tumors), 120 nmAuNP (At) -PEG + saline (4 animals, 8 tumors), 30 nmAuNP (At) ) -PEG + saline (4, 8 tumors), 13 nmAuNP (At) -PEG + saline (3, 6 tumors), 5 nmAuNP (At) -PEG + saline (3, 6 tumors), respectively. Prepared to be equal to volume.
  • physiological saline (3 animals, 6 tumors) and 30 nm AuNP-PEG + physiological saline (3 animals, 6 tumors) to which no radionuclide was added were prepared for the control animals.
  • Each of these test solutions was slowly administered over about 1 minute.
  • a linear probe of an ultrasonic device (ProSound ⁇ 6, Hitachi-Aloka Medical, Ltd. (Tokyo, Japan)) was used, and the needle tip of a syringe (Myjector 29G, Terumo Co. Ltd. (Tokyo, Japan)) was used. I left it in the center of the room.
  • the administered radioactivity per tumor was 1.4 ⁇ 0.4 MBq (Table 1).
  • an alpha ray survey meter (TCS-232B, Hitachi Co. Ltd. (Tokyo, Japan)) was used to confirm that there was no contamination of the skin due to the backflow of the radioactive drug.
  • FIG. 3 shows the results when AuNP (I-123) PEG in which the gamma ray nuclide I-123 was bound to the same AuNP-PEG was administered.
  • the binding between I-123 and AuNP is unstable, and 1.5 hours after injection into the subcutaneous tumor (arrow) on the left side, I-123 separates from AuNP relatively quickly, flows into the blood vessel, and is distributed throughout the body ( Figure 3).
  • the tumor mass was the lowest (Fig. 8).
  • the tumor mass was almost the same as that treated with saline. From this result, it was confirmed that AuNP (At) PEG particles have an excellent antitumor effect by having a small particle size of 5 nm.
  • scintigraphic analysis was performed 4 hours, 19 hours, and 42 hours after injecting 5 nmAuNP (At) PEG particles into bilateral subcutaneous tumors in the same manner as in (3-1). The results shown in 9 were obtained.
  • AuNP (At) PEG particles having a small particle size of 5 nm stay in the tumor tissue and diffuse out of the tumor tissue to a limited extent.
  • AuNP (At) PEG particles with a small particle size of 5 nm have excellent intra-tumor tissue diffusion properties, but their diffusion from the tumor tissue is limited. It is thought to bring about an excellent antitumor effect.
  • the particle size is adjusted so that the particles are uniformly distributed in the tumor tissue and spread out of the tumor tissue in a limited manner. It has been confirmed that alpha ray gold nanoparticles having extremely excellent properties as a radiation-emitting therapeutic agent can be produced.
  • adenosine 0.7 ml (adenosine: 2 mg) from the tail vein for the purpose of temporarily lowering the pulse and blood pressure and lowering the blood flow velocity.
  • adenosine 2 mg
  • 5 nm PEG-AuNP (At) -c [RGDfK (C)] 3.3 MBq was dissolved in 0.3 ml of physiological saline and slowly administered (over about 1.5 minutes). ..
  • mice Male nude mice (BALB / C Slc-nu / nu (JAPAN SLC, Inc,) of 6 8 W-aged animals (Group A) and 6 9 W-aged animals (Group B) (Tokyo, Japan)) was intraperitoneally transplanted with C6 cells 1 ⁇ 10 7 into which a fluorescent protein gene was introduced. 14 days after transplantation in group A and 7 days after transplantation in group B, 5 nm PEG-AuNP (At) -c [RGDfK (C)] was 0.98 ⁇ 0.19 MBq / 0 in 3 mice with a 26 G needle. .2 ml was administered intraperitoneally. Three control animals in each group were intraperitoneally administered 0.2 ml of saline with a 26 G needle.
  • the control animal perceived a tumor in the abdominal cavity, and fluorescence was observed in the same area as observed by a fluorescence imager.
  • the tumor was not eroded or the nodule was punctured, and slight fluorescence was observed in the same part.
  • the tumor was excised 32 days after transplantation (23 days after administration) and the masses of the excised tumors were compared, the tumor spread and the mass were larger in the control animals than in the At-administered animals (FIGS. 20 to 24). Fluorescence was observed in the resected tumor, although it was not uniform (Fig. 23).

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Abstract

本発明は、金ナノ粒子含有医薬およびこれを使用した増殖性疾患の治療に関する。本発明はまた、アルファ線放出核種と結合した金ナノ粒子含有医薬およびこれを使用した増殖性疾患の治療に関する。

Description

金ナノ粒子含有医薬
　本発明は、金ナノ粒子含有医薬およびこれを使用した増殖性疾患の治療に関する。本発明はまた、アルファ線放出核種と結合した金ナノ粒子含有医薬およびこれを使用した増殖性疾患の治療に関する。
　脳腫瘍をはじめとする悪性腫瘍の治療には、手術、抗腫瘍薬全身投与による化学療法、ガンマ線外照射による放射線治療が行われている。これらの治療は、多くの場合単独では有効性が低く、できるだけ多くの治療法を集学的に行うことが重要であるが、それぞれに問題点がある。手術治療は高侵襲であり、全身投与による化学療法は全身への副作用が非常に強い。ガンマ線照射による放射線治療は、飛程が比較的長いことなどから放射線被ばくが問題となる。近年、悪性腫瘍に従来の抗腫瘍薬を直接投与する治療法が開発されているが、それらの効果は未だ確立されていない。
　放射線はその線質によって、細胞傷害性が異なることが知られている。アルファ線は従来治療に用いられているガンマ線、ベータ線と比較して非常に高い線エネルギー付与（ＬＥＴ）を有し（非特許文献１）、抗腫瘍作用が特に高い。また、アルファ線はその飛程が非常に短く、狭い範囲にしか影響を及ぼさない。そのためアルファ線放出核種を病巣内で拡散させ、一方で正常組織には分布させないことが求められる。従来、腫瘍などの増殖性疾患の治療にアルファ線放出核種を使用する試みとして、目的とする腫瘍細胞などに特異的に結合し、または親和性を有する標的化分子を付加すること等が提案されている（非特許文献１、２）。しかしながら、このような方法では腫瘍ごとに最適な標的化分子を選択する必要性があるため、アルファ線放出核種を増殖性疾患の治療に適用するための、より汎用性の高い技術が必要とされている。
　本発明者らはこれまでに、神経膠腫への直接投与法に関して、金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）にアルファ線放出核種アスタチン２１１（Ａｔ－２１１）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を結合させたＡｕＮＰ（Ａｔ）－ＰＥＧが有用であることを初めて証明した。ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ＰＥＧのアルファ線はその飛程が非常に短いため、粒子の腫瘍組織内での拡散性が重要であり、そのためには粒子サイズの調整が最も重要であることを見出している。しかしながら、これまでに、当該粒子サイズの最適化については行われておらず、生体に投与した際の効果は証明されていなかった。
Ｒｏｙａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１７，Ｖｏｌ．４，ｐｐ．４１０２４－４１０３２ Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１９，Ｖｏｌ．９，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３９０／ｎａｎｏ９０４０６３２，ｐｐ．１－１５
　本発明は、金ナノ粒子のサイズを最適化することにより、腫瘍細胞等における拡散特性を調節し、優れた治療効果を有する医薬を提供することを課題とする。
　本発明者らは、毒性がない金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）に注目し、組織液中の拡散性を確保するためにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を付加し、組織内高拡散かつ全身不拡散を実現すべく粒子サイズについて鋭意研究を進めた結果、特定の細胞に選択的な標的化分子の使用を必須とせずに、アルファ線放出核種を腫瘍内にのみ局所的に長時間滞留させ、近傍の悪性細胞に強い抗腫瘍作用を及ぼす一方で、全身の臓器には薬剤を拡散させず、副作用のない神経膠腫の局所投与治療薬の作成を初めて実現した。
　本発明は、一態様において、上記金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）を利用して増殖性疾患にアルファ線放出核種を直接投与し、治療効果を得るものである。
　また、本発明は一態様において、Ａｔ－２１１と結合した、０．５～１１０ナノメートルの粒子径を有する金ナノ粒子を含有し、局所投与されることを特徴とする、増殖性疾患を治療するための医薬を提供する。
　一態様において、前記金ナノ粒子の表面はポリエチレングリコール、ポリエーテル、ポリオール、ポリエチレンイミン、シリカゲル、ペプチド、抗体、タンパク質、脂質、複合脂質、糖鎖、複合糖質、テルペン、テルペノイドおよびウイルス様粒子から選択される分子により修飾されていてもよい。
　一態様において、前記表面修飾は、特定の細胞に対する標的化分子を結合していない分子を含み、さらに別の態様において、前記表面修飾は、特定の細胞に対する標的化分子を含まない。
　一態様において、特定の細胞に対する標的化分子を結合していない分子は、２，０００～２０,０００の平均分子量を有するポリエチレングリコールであってもよい。
　一態様において金ナノ粒子の粒子径は、０．５～１３ｎｍであってもよい。
　一態様において、本発明の医薬は、病変内への注入、病変を栄養する動脈内への超選択的投与、および腔内散布からなる群から選択する局所投与により投与することができる。
　一態様において、前記増殖性疾患は悪性腫瘍であり、固形癌であってもよい。
　一態様において、前記固形癌は脳腫瘍、内分泌腫瘍、前立腺癌、頭頚部癌、口腔癌、乳癌、婦人科癌、皮膚癌、膵癌および消化器癌から選択されてもよい。
　また、本発明は別の態様において、０．５～１１０ナノメートルの粒子径を有し、Ａｔ－２１１と結合し、特定の細胞に対する標的化分子と結合していないポリエチレングリコールによる表面修飾を含む金ナノ粒子を提供する。
　一態様において、本発明の金ナノ粒子は、さらに特定の細胞に対する標的化分子による表面修飾を含んでもよい。
　また、本発明は別の態様において、増殖性疾患を治療するための局所投与される医薬を製造するための、０．５～１１０ナノメートルの粒子径を有する金ナノ粒子の使用を提供する。
　一態様において、前記金ナノ粒子は、Ａｔ－２１１と結合している。
　一態様において、前記金ナノ粒子の表面はポリエチレングリコール、ポリエーテル、ポリオール、ポリエチレンイミン、シリカゲル、ペプチド、抗体、タンパク質、脂質、複合脂質、糖鎖、複合糖質、テルペン、テルペノイドおよびウイルス様粒子から選択される分子により修飾されていてもよい。
　一態様において、前記金ナノ粒子の表面は、２，０００以上の分子量を有するポリエチレングリコールにより修飾されていてもよい。
　また、本発明は別の態様において、Ａｔ－２１１と結合した、０．５～１１０ナノメートルの粒子径を有する金ナノ粒子を局所投与することで、増殖性疾患を治療する方法を提供する。
　一態様において、前記金ナノ粒子の表面はポリエチレングリコール、ポリエーテル、ポリオール、ポリエチレンイミン、シリカゲル、ペプチド、抗体、タンパク質、脂質、複合脂質、糖鎖、複合糖質、テルペン、テルペノイドおよびウイルス様粒子から選択される分子により修飾されていてもよい。
　一態様において、前記金ナノ粒子の表面は、２，０００以上の分子量を有するポリエチレングリコールにより修飾されていてもよい。
　一態様において、前記局所投与は、病変内への注入、病変を栄養する動脈内への超選択的投与、および腔内散布からなる群から選択することができる。
　一態様において、前記増殖性疾患は悪性腫瘍であり、固形癌であってもよい。
　一態様において、前記固形癌は脳腫瘍、内分泌腫瘍、前立腺癌、頭頚部癌、口腔癌、乳癌、婦人科癌、皮膚癌、膵癌および消化器癌から選択される。
　また、本発明は別の態様において、
　（１）０．５～１１０ナノメートルの異なる粒子径を有するＡｔ－２１１結合金ナノ粒子を準備する工程、
　（２）前記各粒子径を有するＡｔ－２１１結合金ナノ粒子を、それぞれインビボの増殖性疾患組織内に投与する工程、
　（３）前記投与された増殖性疾患組織内のアルファ線分布、および全身アルファ線分布を確認する工程、
　（４）増殖性疾患組織内のアルファ線分布および、全身アルファ線分布に基づいて粒子径を選択する工程
　を含む、局所投与により増殖性疾患を治療するために最適な、Ａｔ－２１１結合金ナノ粒子の粒子径を選択する方法を提供する。
　一態様において、前記工程（４）に加えて、（５）投与動物の体重変化、および／または増殖性疾患組織の増殖抑制効果を評価する工程を含むことができる。
　一態様において、前記増殖性疾患組織内への投与は、組織内中心部への注入、組織を栄養する動脈内への超選択的投与、および組織の存在する腔内への薬剤散布からなる群から選択することができる。
　一態様において、インビボの増殖性疾患組織は、対象に移植された異種増殖性疾患組織であってもよい。
　一態様において、前記金ナノ粒子の表面はポリエチレングリコール、ポリエーテル、ポリオールなどの炭化水素系ポリマー、ポリエチレンイミン、シリカゲル、ペプチド、抗体、タンパク質、脂質、複合脂質、糖鎖、複合糖質、テルペン、テルペノイドおよびウイルス様粒子から選択される分子により修飾されていてもよい。一態様において、前記金ナノ粒子の表面は、２，０００以上の分子量を有するポリエチレングリコールにより修飾されていてもよい。
　一態様において、前記増殖性疾患は悪性腫瘍であり、固形癌であってもよい。一態様において、前記固形癌は脳腫瘍、内分泌腫瘍、前立腺癌、頭頚部癌、口腔癌、乳癌、婦人科癌、皮膚癌、膵癌および消化器癌から選択される。
　また、本発明は別の態様において、
　（１）０．５～１１０ナノメートルの異なる粒子径を有するＡｔ－２１１結合金ナノ粒子を準備する工程、
　（２）前記各粒子径を有するＡｔ－２１１結合金ナノ粒子を、それぞれインビボの増殖性疾患組織内に投与する工程、
　（３）前記投与された増殖性疾患組織内のアルファ線分布、および全身アルファ線分布を確認する工程、
　（４）増殖性疾患組織内のアルファ線分布および、全身アルファ線分布に基づいて粒子径を選択する工程
　を含む、局所投与により増殖性疾患を治療するために最適な粒子径を有するＡｔ－２１１結合金ナノ粒子を製造する方法を提供する。
　一態様において、前記工程（４）に加えて、（５）投与動物の体重変化、および／または増殖性疾患組織の増殖抑制効果を評価する工程を含むことができる。
　一態様において、前記増殖性疾患組織内への投与は、組織内中心部への注入、組織を栄養する動脈内への超選択的投与、および組織の存在する腔内への薬剤散布からなる群から選択することができる。
　一態様において、インビボの増殖性疾患組織は、対象に移植された異種増殖性疾患組織であってもよい。
　一態様において、前記金ナノ粒子の表面はポリエチレングリコール、ポリエーテル、ポリオールなどの炭化水素系ポリマー、ポリエチレンイミン、シリカゲル、ペプチド、抗体、タンパク質、脂質、複合脂質、糖鎖、複合糖質、テルペン、テルペノイドおよびウイルス様粒子から選択される分子により修飾されていてもよい。一態様において、前記金ナノ粒子の表面は、２，０００以上の分子量を有するポリエチレングリコールにより修飾されていてもよい。
　一態様において、前記増殖性疾患は悪性腫瘍であり、固形癌であってもよい。一態様において、前記固形癌は脳腫瘍、内分泌腫瘍、前立腺癌、頭頚部癌、口腔癌、乳癌、婦人科癌、皮膚癌、膵癌および消化器癌から選択される。
　本発明のアルファ線核種含有ナノ粒子は、優れた腫瘍組織内拡散性と、低い全身拡散性を有しており、増殖性疾患の増殖を効果的に抑制しながら、低い他臓器傷害性を有している。また被ばくを考慮する必要性が低いため、増殖性疾患組織に対して極めて高い用量を繰り返し投与することができ、高い増殖性疾患組織増殖抑制作用を奏する医薬を提供することができる。
図１は、皮下移植神経膠腫モデルラットに対して、１２０ｎｍ　ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧを投与した際のシンチグラフィー分析の結果を示す図である。 図２は、皮下移植神経膠腫モデルラットに対して、３０ｎｍ　ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧを投与した際のシンチグラフィー分析の結果を示す図である。 図３は、皮下移植神経膠腫モデルラットに対して、ＡｕＮＰ（Ｉ－１２３）ＰＥＧを投与した際のシンチグラフィー分析の結果を示す図である。 図４は、皮下移植神経膠腫モデルラットに対して、１２０ｎｍ　ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧまたは３０ｎｍ　ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧを投与した際のオートラジオグラフィーの結果を示す図である。 図５は、皮下移植神経膠腫モデルラットに対して、ＰＥＧにより修飾されていない３０ｎｍ　ＡｕＮＰ（Ａｔ）を投与した際のオートラジオグラフィーの結果を示す図である。 図６は、皮下移植神経膠腫モデルラットに対して、５ｎｍ、１３ｎｍ、３０ｎｍまたは１２０ｎｍのＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧを投与した際の腫瘍サイズの変化を示す図である。 図７は、皮下移植神経膠腫モデルラットに対して、５ｎｍ、１３ｎｍ、３０ｎｍまたは１２０ｎｍのＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧを投与した際の体重変化を示す図である。 図８は、皮下移植神経膠腫モデルラットに対して、５ｎｍ、１３ｎｍ、３０ｎｍまたは１２０ｎｍのＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧを投与した際の、投与後４２日目に取り出した腫瘍組織の質量を示す図である。 図９は、皮下移植神経膠腫モデルラットに対して、５ｎｍＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧ粒子を注入後、４時間、１９時間、４２時間後にシンチグラフィー分析を行った結果を示す図である。 図１０は、皮下移植腎癌モデルマウスに対して、ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧまたはＡｕＮＰＰＥＧ（非ラベル）を投与した際の腫瘍サイズの変化を示す図である。 図１１は、皮下移植腎癌モデルマウスに対して、ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧまたはＡｕＮＰ－ＰＥＧ（非ラベル）を投与した際の体重変化を示す図である。 図１２は、皮下移植腎癌モデルマウスに対して、ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧまたはＡｕＮＰ－ＰＥＧ（非ラベル）を投与した際の、投与後４０日目に取り出した腫瘍組織の質量を示す図である。 図１３は５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］（５ｎｍ　ｍＰＥＧ－Ｓ－ＡｕＮＰ［２１１Ａｔ］－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］）の構造を示す模式図である。 図１４は皮下移植神経膠腫モデルラットにおけるシンチグラフィーの結果を示す図である。腫瘍移植領域を支配する動脈に対して５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）の選択的動脈内投与を行った後、左大腿動脈を結紮した際の、投与後９時間および１４時間後のシンチグラフィーの結果を示す。矢印は大腿に皮下移植した腫瘍の位置を示す。 図１５は皮下移植神経膠腫モデルラットにおける体重変化を示す図である。５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］を選択的動脈内投与した後のラットの体重変化を示す。ＩＡ－１、ＩＡ－２は５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］を投与されたラットのデータを示し、Ｃｔｌ－１、Ｃｔｌ－２は薬剤を投与せずに左大腿動脈の結紮のみを行ったコントロールラットのデータを示す。 図１６は皮下移植神経膠腫モデルラットにおける腫瘍体積変化を示す図である。５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］を選択的動脈内投与した後の腫瘍体積変化を示す。ＩＡ－１、ＩＡ－２は５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）を投与されたラットのデータを示し、Ｃｔｌ－１、Ｃｔｌ－２は薬剤未投与のコントロールラットのデータを示す。 図１７は腹腔内移植神経膠腫モデルマウスにおけるシンチグラフィーの結果を示す図である。５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］を腹腔内投与した際の、投与後９時間および１４時間後のシンチグラフィーの結果を示す。 図１８は腹腔内移植神経膠腫モデルマウスにおける生存曲線を示す図である。腫瘍移植後２週間後に５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］を腹腔内投与（Ａ群）した後の生存曲線を示す。「Ａｔ」は５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］を投与したマウス（ｎ＝３）を示す。「Ｃｔｌ」はコントロールとして生理食塩水を投与したマウス（ｎ＝２）を示す。 図１９は腹腔内移植神経膠腫モデルマウスにおける体重変化を示す図である。腫瘍移植後１週間後に５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］を腹腔内投与（Ｂ群）した後の体重変化を示す。「Ａｔ」は５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］を投与したマウス（ｎ＝３）の平均を示す。「Ｃｔｌ」はコントロールとして生理食塩水を投与したマウス（ｎ＝３）の平均を示す。 図２０は腹腔内移植神経膠腫モデルマウスにおける腫瘍の蛍光イメージャ結果を示す画像である。腫瘍移植後１週間後に５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］を腹腔内投与（Ｂ群）した後の、腫瘍の態様を蛍光イメージャによって観察した結果を示す。腫瘍移植の３週間後、薬剤投与１１日後のデータを示す。左列の「Ａｔ投与」は５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］を投与したマウスの結果、右列の「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はコントロールとして生理食塩水を投与したマウスの結果を示す。 図２１は腹腔内移植神経膠腫モデルマウスにおける腫瘍の蛍光イメージャ結果を示す画像である。腫瘍移植後１週間後に５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］を腹腔内投与（Ｂ群）した後の、腫瘍の態様を蛍光イメージャによって観察した結果を示す。腫瘍移植の４週間後、薬剤投与１８日後のデータを示す。左列の「Ａｔ投与」は５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］を投与したマウスの結果、右列の「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はコントロールとして生理食塩水を投与したマウスの結果を示す。 図２２は腹腔内移植神経膠腫モデルマウスにおける腫瘍を示す画像である。腹腔内への腫瘍移植後１週間後に５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］を腹腔内投与（Ｂ群）した後、移植３２日後、薬剤投与２３日後に摘出した腫瘍の画像を示す。「Ａｔ投与群」（Ａｔ－１、Ａｔ－２、Ａｔ－３）は５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］を投与したマウスから摘出した腫瘍の画像、「Ｃｏｎｔｒｏｌ群」（Ｃｔｌ－１、Ｃｔｌ－２、Ｃｔｌ－３）はコントロールとして生理食塩水を投与したマウスから摘出した腫瘍の画像を示す。 図２３は腹腔内移植神経膠腫モデルマウスにおける腫瘍の蛍光イメージング結果を示す画像である。腹腔内への腫瘍移植後１週間後に５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］を腹腔内投与（Ｂ群）した後、移植３２日後、薬剤投与２３日後に摘出した腫瘍の蛍光イメージング結果を示す。「Ａｔ投与群」（Ａｔ－１、Ａｔ－２、Ａｔ－３）は５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］を投与したマウスから摘出した腫瘍の蛍光イメージング結果、「Ｃｏｎｔｒｏｌ群」（Ｃｔｌ－１、Ｃｔｌ－２、Ｃｔｌ－３）はコントロールとして生理食塩水を投与したマウスから摘出した腫瘍の蛍光イメージング結果を示す。 図２４は腹腔内移植神経膠腫モデルマウスにおける腫瘍質量を示す図である。腹腔内への腫瘍移植後１週間後に５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］を腹腔内投与（Ｂ群）した後、移植３２日後、薬剤投与２３日後に摘出した腫瘍の質量を示す。「Ａｔ」（は５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］を投与したマウスから摘出した腫瘍の平均質量（ｎ＝３）、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はコントロールとして生理食塩水を投与したマウスから摘出した腫瘍の平均質量（ｎ＝３）を示す。
　以下、本発明の実施形態について説明する。以下の説明は単なる例示であり、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
　アルファ線放出核種としてＡｔ－２１１を用いる場合、Ａｔ－２１１は、ヨウ素と似た性質を持つため、そのまま投与すれば速やかに甲状腺へ集積する。腫瘍内に薬剤を滞留させるため、ＡｕＮＰを用いて薬剤の分布を制御することができる。具体的には、ＡｕＮＰ－ＰＥＧを生成し、これを精製した後、Ａｔ－２１１標識してＡｔ－２１１ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ＰＥＧを生成することができる。ＡｕＮＰは目的に合わせてそのサイズを適切に調整することができる。
　一態様において、Ａｔ－２１１ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ＰＥＧを悪性腫瘍投与する場合、Ａｔ－２１１ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ＰＥＧ（以下ナノ粒子とする）の適切な量をシリンジに充填し、注射針より悪性腫瘍内に緩徐に注入することができる。腫瘍内に注入されたナノ粒子は腫瘍内に拡散する。この拡散程度は小さい粒子ほど良好であるが、悪性腫瘍の毛細血管は正常組織のそれに比して物質透過性が高く、粒子径が一定程度小さいと毛細血管を介して全身に拡散することが知られている。
　一方、粒子径が１００ｎｍ程度になると腫瘍内の拡散が悪化し、十分な効果が得られない。粒子径を３０ｎｍ程度あるいはそれ以下とすることによって、腫瘍内の拡散は良好であり、かつ腫瘍を灌流する毛細血管内には流入せずに、腫瘍外の他臓器には拡散しないことが見いだされた。腫瘍内に滞留したナノ粒子は、腫瘍細胞にアルファ線を照射し続け、半減期約７時間で減衰してゆき、放射能は消失する。腫瘍細胞は１回の注入でアルファ線による障害を受けその増殖能は消失あるいは著明に低下する。
　（定義）
　本明細書において、複数の数値の範囲が示された場合、それら複数の範囲の任意の下限値および上限値の組み合わせからなる範囲も同様に意味する。
　本明細書において、「アルファ線放出核種」とは、アルファ線を放出する核種を意味し、これらを混合して使用することもできる。アルファ線を放出する核種としては、Ａｔ－２１１、Ａｃ－２２５、Ｒａ－２２３等を用いることができるが、これらに限定されない。アルファ線放出核種として、Ａｔ－２１１を使用することが好ましい。
　Ａｔ－２１１は、ハロゲンに属する元素であるアスタチン（Ａｔ）の放射性同位体である。当該Ａｔ－２１１は、細胞殺傷性である高エネルギーのアルファ線を放出して、安定な鉛（２０７Ｐｂ）に壊変する。Ａｔ－２１１の半減期は７．２時間である。すなわち、Ａｔ－２１１は、短寿命かつ高い細胞殺傷性を有するため、腫瘍治療に用いた場合、効率的に腫瘍組織を破壊することができる。
　これらの放射線放出核種は、既知の方法を用いて製造することができる。例えば、Ａｔ－２１１は、サイクロトロン等の加速器を用いＢｉ－２０９をターゲット物質とする（α，２ｎ）核反応により製造され、乾式法（蒸留）で精製したのち、水に溶解してＡｔ－２１１水溶液として供給される。
　本明細書において、「増殖性疾患」とは、多細胞生物にとって１以上のサブセットの細胞の望まれない細胞増殖を伴う疾患を意味する。増殖性疾患は、ヒトを含む様々な動物において起こり得る。本明細書中で使用される場合、「増殖性疾患」は、良性腫瘍、悪性腫瘍及び他の増殖性疾患を含む。「増殖性疾患」の例としては、造血性障害（例えば骨髄増殖性障害など）、悪性腫瘍（例えば脳腫瘍、前立腺癌、頭頚部癌、口腔癌、乳癌、膵癌および消化器癌など）が挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書において、「腫瘍」とは、生体内の制御に反して自律的に過剰に増殖することによってできる組織塊を意味する。「腫瘍」は病理学的に悪性所見を有さない「良性腫瘍」と、周囲の組織に浸潤し、または転移を起こす「悪性腫瘍」を包含する。
（本発明の金ナノ粒子の合成方法）
　本発明の金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）は、公知の方法により調製することができる。例えば、Ｊ．　Ｐｈｙｓ．　Ｃｈｅｍ．　Ｃ　２０１１，ｖｏｌ．１１５，ｐｐ．４５０２４５０６に記載の方法を用いることができるが、これに限定されない。金ナノ粒子のサイズは、当業者に周知の方法により任意に設定することができ、製造した粒子のサイズを測定することができる。例えば、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いた顕微鏡法を用いることができるが、これに限定されない。
　本発明の金ナノ粒子を悪性腫瘍治療剤として使用する場合、金ナノ粒子のサイズは悪性腫瘍の種類および状態、所望の薬理効果などに基づいて、適宜選択することが可能である。好ましくは、金ナノ粒子のサイズは、腫瘍組織内で十分な拡散を示す一方、腫瘍を灌流する毛細血管内には流入、および腫瘍外の他臓器には拡散が広範に及ばない範囲で調整される。一態様において、金ナノ粒子のサイズは０．５nm以上、０．６nm以上、０．７nm以上、０．８nm以上、０．９nm以上、１nm以上、２nm以上、３nm以上、４nm以上、５nm以上、６nm以上、７nm以上、８nm以上、９nm以上、１０nm以上、１１nm以上、１２nm以上、１３nm以上、１４nm以上、１５nm以上、２０nm以上、２５nm以上または３０nm以上であることが好ましい。一態様において、金ナノ粒子のサイズは１１０nm以下、１００nm以下、９０nm以下、８０nm以下、７０nm以下、６０nm以下、５０nm以下、４０nm以下または３０nm以下であることが好ましい。一態様において、金ナノ粒子のサイズは１．０nm～１１０nmであることが好ましい。また、別の態様において、金ナノ粒子のサイズは５nm～３０nmであることが好ましい。
　金ナノ粒子とアルファ線放出核種の結合は、公知の方法により行うことができる。特に金はハロゲン元素と安定な結合を形成することが知られており（Ｄｚｉａｗｅｒ　Ｌ　ｅｔ　ａｌ．　ＲＳＣ　ａｄｖａｎｃｅｓ，２０１７，Ｖｏｌ．７，ｐｐ．４１０２４－４１０３２）、アルファ線放出核種としてＡｔ－２１１のようなハロゲンアルファ線放出核種を用いる場合、金ナノ粒子とハロゲンアルファ線放出核種を混合することで、金ナノ粒子とアルファ線放出核種を結合することができる。
（本発明の金ナノ粒子の修飾）
　本発明の金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）の表面を修飾することにより、生体内での金ナノ粒子の挙動を調整することができる。例えば、ポリエチレングリコール、糖類、ペプチド（タンパク質）やその他の高分子によって金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）の表面を修飾することにより、腫瘍組織内における金ナノ粒子に凝集抑制、細胞標的化、細胞膜透過促進、細胞膜吸着亢進などの機能を付与することができる。このような金ナノ粒子の修飾には、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、ポリオールなどの炭化水素系ポリマー、ポリエチレンイミン、シリカゲル、ペプチド、抗体、タンパク質、脂質、複合脂質、糖鎖、複合糖質、テルペン、テルペノイドおよびウイルス様粒子を用いることができるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明の金ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によって修飾される。本発明に用いるＰＥＧとしては、エチレンオキシドと水の縮合重合によって得られる様々なポリマーであって、生体材料に使用されることの知られた様々な構造を有するものを使用することができ、化学的反応性を持つ末端基を持たないＰＥＧ、化学的反応性を持つ末端基を１つ有する単官能性ＰＥＧ、化学的反応性を持つ末端基を２つ有する二官能性ＰＥＧ、直鎖状のＰＥＧ、マルチアーム型ＰＥＧ、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基、チオール基、カルボキシ基のような反応性を示す末端基を持つＰＥＧなどを使用できるが、これらに限定されない（Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍ，２０１５，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．４，ｐｐ．３９０－３９２）。互いに機能を阻害しない範囲において、複数種の修飾を組み合わせることもできる。
　本発明の金ナノ粒子の修飾に用いられる高分子のサイズは、治療対象の腫瘍の種類および状態、所望の効果等に応じて当業者が適宜設定することができる。例えば、ＰＥＧを用いる場合、ジエチレングリコール以上の任意のポリマーを用いることができ、その分子量は特に限定されないが、例えば１００以上、２００以上、３００以上、４００以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、１，０００以上、１，５００以上、２，０００以上、２，５００以上、３，０００以上、３，５００以上、４，０００以上、４，５００以上、５，０００以上、６，０００以上であってよく、７，０００以下、８，０００以下、９，０００以下、１０，０００以下、１１，０００以下、１２，０００以下、１３，０００以下、１４，０００以下、１５，０００以下、１６，０００以下、１７，０００以下、１８，０００以下、１９，０００以下、２０，０００以下であってよい。より具体的には、１００～２０，０００、２００～１９，０００、３００～１８，０００、４００～１７，０００、５００～１６，０００、１，０００～１５，０００、２，０００～１２，０００、３，０００～１０，０００、４，０００～９，０００、５，０００～８，０００、５，５００～７，０００、６，０００程度のＰＥＧを用いることができる。ＰＥＧの分子量は、組み合わせて用いる修飾に応じて調整され得る。このような修飾は、公知の方法により行うことができる（例えば、Ｇｏｌｄ　Ｂｕｌｌ．２０１１，ｖｏｌ．４４，ｐｐ．９９－１０５）。
（本発明の金ナノ粒子の運搬体）
　本発明の金ナノ粒子を細胞に投与する場合、細胞への取り込みを調節する様々な物質を併用することができる。例えば、細胞膜を通過するウイルス粒子内に金ナノ粒子を封入することにより、効率的に細胞内へ金ナノ粒子を送達することができる。また、ポリエチレンイミンなど、金ナノ粒子表面がカチオン電荷になるような化合物で修飾することにより、金ナノ粒子の細胞透過性が向上する。また、細胞特異的な取り込みが起こる抗体などで表面を修飾することによって、金ナノ粒子の細胞内への取り込みが向上する。特定の細胞内への取り込みを向上させる標的化分子として、増殖性疾患細胞が特異的に有する物質に結合する分子、例えば、増殖性疾患細胞において特異的に発現するタンパク質を抗原とする抗体またはその抗原結合断片、例えばＣＤ１９、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２０、ＣＤ４５、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＣＤＨ１７を抗原とする抗体またはその抗原結合断片、増殖性疾患細胞において特異的に発現する受容体に結合するリガンドまたはその断片、たとえば神経膠腫において発現するＮＫ１受容体のリガンドであるサブスタンスＰまたはその断片、たとえば、Ｎ末端５～１１アミノ酸からなるペプチド、その他腫瘍標的化機能を有するペプチド、例えば腫瘍標的化機能を有する環状ペプチドｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］（Ｖｉｖｉｔｉｄｅ（Ｋｅｎｔｕｃｋｙ，ＵＳＡ））などを用いることができる。上記標的化分子は、アルファ線放出核種結合金ナノ粒子に直接結合させることもでき、また、上記表面修飾分子または他の運搬体を介して結合させることもできる。
（医薬組成物および治療方法）
　本発明のアルファ線放出核種の結合した金ナノ粒子は、増殖性疾患などを治療するための医薬として提供される。本発明のアルファ線放出核種の結合した金ナノ粒子を含む医薬は、様々な増殖性疾患の治療に有効であり、例えば、脳腫瘍、前立腺癌、頭頚部癌、口腔癌、乳癌および消化器癌等の悪性腫瘍の治療に適用することができる。本発明のアルファ線放出核種の結合した金ナノ粒子は、腫瘍組織内に優れた拡散特性を有する一方で、腫瘍組織外への移行が少ない。したがって、脳腫瘍など、多くの血管を伴う悪性腫瘍の治療においても、他臓器の放射線被ばくを抑制しながら、効果的に悪性腫瘍を治療することが可能である。
　本発明はまた、アルファ線放出核種の結合した金ナノ粒子を用いて、増殖性疾患などを治療する方法を提供する。
　上記悪性腫瘍の治療は、原発性悪性腫瘍の進行抑制、退縮、排除、転移の抑制、再発の防止を含む。
　本発明のアルファ線放出核種の結合した金ナノ粒子は、ヒトまたは他の哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなどに対して投与することができる。本発明の金ナノ粒子を含む組成物の投与経路は、当業者が適宜選択することができ、投与経路に合わせた剤型により提供される。一態様において、本発明のアルファ線放出核種の結合した金ナノ粒子は、腫瘍などの病変に局所投与することが好ましい。この場合、注射針などを用いて、病変内に注入することにより投与することができる（腫瘍内投与）。例えば、エコー画像で観察しつつ、腫瘍組織の中心部に腫瘍体積と同体積のアルファ線放出核種結合金ナノ粒子含有液剤を、１分間かけて注入すること等ができる。
　局所投与として、上記のような腫瘍組織内注入に加えて、当業者に自明な他の方法を利用することができる。例えば、病変を栄養する動脈内にカテーテルなどを用いて金ナノ粒子を超選択的に投与することができる（超選択的動脈内投与）。当該超選択的動脈内投与では、近年発展が目覚ましい、カテーテルを用いた手技を応用することができる。当該投与方法により、病変組織に直接侵襲を加えずに、病変組織に隈なくかつ排他的に薬剤を投与することが可能となる。また、腫瘍摘出腔や腹腔、胸腔等の腔内に播種した病変に対して、金ナノ粒子を腔内散布することによって投与することもできる（腔内投与）。当該腔内投与では、播種病変に高濃度の薬剤を投与することができる。当該投与方法は、手術後の摘出腔への再発予防投与として有用である。
　金ナノ粒子の最適な粒子径を選択することにより、これら局所投与されアルファ線放出核種結合金ナノ粒子は、増殖性疾患細胞への特異的な標的化分子を利用することを必須とせず、一旦増殖性疾患組織内に到達すると組織内で均一な分布を示す一方、組織外部周辺の毛細血管への流出は最小限に抑制される。したがって、増殖性疾患細胞に対して効果的な増殖抑制効果を得つつ、全身への放射線被ばくを抑制することができる。
　本発明の医薬組成物または治療法に使用するアルファ線放出核種結合金ナノ粒子は、本発明の目的に反しない範囲で、前記表面修飾により修飾されていてもよく、修飾されていなくともよい。好ましくは、前記アルファ線放出核種結合金ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの炭化水素系ポリマーによって表面修飾される。本発明の医薬組成物または治療法に使用するアルファ線放出核種結合金ナノ粒子は、特定の増殖性疾患細胞に親和性を有する標的化分子、例えば、抗体、その他のタンパク質、ペプチド、低分子化合物などを利用することなく、増殖性疾患細胞に対して優れた増殖抑制効果を得つつ、全身への放射線被ばくを抑制することができる。一態様において、本発明の本発明の医薬組成物または治療法に使用するアルファ線放出核種結合金ナノ粒子は、標的化分子の結合していない炭化水素系ポリマーによって表面修飾されている。
　一態様において、本発明の本発明の医薬組成物または治療法に使用するアルファ線放出核種結合金ナノ粒子は、標的化分子の結合していない炭化水素系ポリマーおよび、標的化分子の結合している同一または異なる炭化水素系ポリマーによって表面修飾されている。当該標的化分子の結合していない炭化水素系ポリマーの割合は、本発明の目的に反しない範囲で調整することができる。標的化分子の結合していない炭化水素系ポリマーの割合は、表面修飾をする炭化水素系ポリマー全体の分子数の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％であってもよい。
　（アルファ線放出核種結合金ナノ粒子の粒子径を選択する方法）
　本発明は一態様において、局所投与により増殖性疾患を治療するために最適な、アルファ線放出核種結合金ナノ粒子の粒子径を選択する方法を提供する。当該方法は、（１）０．５～１１０ナノメートルの異なる粒子径を有するアルファ線放出核種結合金ナノ粒子を準備する工程、（２）前記各粒子径を有するアルファ線放出核種結合金ナノ粒子を、それぞれインビボの増殖性疾患組織内に投与する工程、（３）前記投与された増殖性疾患組織内のアルファ線分布、および全身アルファ線分布を確認する工程、（４）増殖性疾患組織内のアルファ線分布および、全身アルファ線分布に基づいて、粒子径を選択する工程、を包含する。
　前記方法は、増殖性疾患組織を有するモデル動物、担がんモデル動物など、増殖性疾患組織を移植および増殖させたモデル動物などを用いて実施することが可能である。前記増殖性疾患組織内のアルファ線分布および全身アルファ線分布の評価は、当業者に公知の方法を用いて実施することができる。例えば、シンチグラフィー分析またはオートラジオグラフィー分析などを用いた画像解析により前記評価を実施することができる。当該評価により、増殖性疾患組織内で比較的均一なアルファ線分布を示す一方、増殖性疾患組織外で低レベルのアルファ線分布を示す全身アルファ線分布を示す金ナノ粒子径を選択することが好ましい。
　具体的な増殖性疾患組織内アルファ線分布の均一度、増殖性疾患組織外のアルファ線分布レベルについては、所望の効果に従って、当業者が公知の統計指標を用いて特定することができる。増殖性疾患組織内アルファ線分布の均一度については、例えば、シンチグラフィーやオートラジオグラフィーにより得られた放射能分布を視覚的に評価することができる。あるいは、テクスチャー解析を実施し、エントロピー等の値を指標とし、当該値が低い場合に均一度がより高いものとして評価する。これら評価において、均一度がより高いことが好ましい。増殖性疾患組織外のアルファ線分布レベルに関しては、例えば、シンチグラムやＳＰＥＣＴによる各臓器の放射能計測を行うことで評価することができる。各臓器の放射能計測値は画像から計測可能である。計測された測定値がゼロに近いことが好ましい。放射能が計測される場合はＯＬＩＮＤＡ／ＥＸＭ等の専用ソフトウェアを用いて被ばく量を算出し、当該被ばく量が低いことが好ましい。
　上記測定、評価の結果、より高い増殖性疾患組織内アルファ線分布の均一度をもたらし、より低い増殖性疾患組織外のアルファ線分布レベルをもたらす金ナノ粒子の粒子径を選択する。
　本発明の方法において、前記工程（４）に加えて、（５）投与動物の体重変化、および／または増殖性疾患組織の増殖抑制効果を評価し、これらの評価に基づいて粒子径を選択してもよい。増殖性疾患組織の増殖抑制効果は、例えばアルファ線結合金ナノ粒子投与後の増殖性疾患組織の体積変化および／または投与後一定期間経過後の増殖性疾患組織の質量を対照と比較することにより行うことができる。
　前記増殖性疾患組織内への投与は、組織中心部への注入、組織を栄養する動脈内への超選択的投与、および組織の存在する腔内への薬剤散布からなる群から選択することができる。インビボの増殖性疾患組織は、対象に移植された異種増殖性疾患組織であってもよい。
　前記金ナノ粒子の表面はポリエチレングリコール、ポリエーテル、ポリオールなどの炭化水素系ポリマー、ポリエチレンイミン、シリカゲル、ペプチド、抗体、タンパク質、脂質、複合脂質、糖鎖、複合糖質、テルペン、テルペノイドおよびウイルス様粒子から選択される分子により修飾されていてもよい。一態様において、表面修飾は、２，０００～２０,０００の分子量を有するポリエチレングリコールにより修飾されていてもよい。
　前記増殖性疾患は悪性腫瘍であり、固形癌であってもよい。前記固形癌は脳腫瘍、内分泌腫瘍、前立腺癌、頭頚部癌、口腔癌、乳癌、婦人科癌、皮膚癌、膵癌および消化器癌から選択されてもよい。
　本発明の方法により選択された粒子径を有するアルファ線放出核種結合金ナノ粒子は、一旦増殖性疾患組織内に到達すると組織内で均一な分布を示す一方、組織外部周辺の毛細血管への流出は最小限に抑制される。したがって、本発明の方法により、増殖性疾患細胞に対して十分な増殖抑制効果を得つつ、全身への放射線被ばくを抑制する医薬の有効成分として、優れた特性を備える金ナノ粒子の粒子径を選択することができる。
　（アルファ線放出核種結合金ナノ粒子の粒子径を選択して製造する方法）
　本発明は一態様において、局所投与により増殖性疾患を治療するために最適な粒子径を有するアルファ線放出核種結合金ナノ粒子を製造する方法を提供する。当該方法は、上記アルファ線放出核種結合金ナノ粒子の粒子径を選択する方法に基づいて粒子径を選択する工程を含み、当該選択された粒子径を有する金ナノ粒子を用いて、アルファ線放出核種結合金ナノ粒子を製造する。
　本発明の方法により製造されたアルファ線放出核種結合金ナノ粒子は、一旦増殖性疾患組織内に到達すると組織内で均一な分布を示す一方、組織外部周辺の毛細血管への流出は最小限に抑制される。したがって、本発明の方法により、増殖性疾患細胞に対して十分な増殖抑制効果を得つつ、全身への放射線被ばくを抑制する医薬の有効成分として、優れた特性を備える金ナノ粒子を製造することができる。
　以下実施例を用いてさらに詳細に本発明を説明するが、本発明の範囲は、下記実施例に限定されない。
（１）ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧの合成
　金ナノ粒子合成のための原料として、テトラクロロ金（ＩＩＩ）酸四水和物（キシダ化学株式会社（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ））を用いた。金ナノ粒子のＰＥＧ標識化のために、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルチオール（Ｍｎ ６，０００）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ，ＬＬＣ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ））を用いた。
　合成したＰＥＧ標識金ナノ粒子の品質は、透過型電子顕微鏡　（ＴＥＭ）（　ＪＥＭ－２１００，　ＪＥＯＬ　Ｌｔｄ．　（Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ））イメージングにより確認した。ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧの放射能は、ゲルマニウム半導体検出器（ＢＥ－２０２０，　Ｍｉｒｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　（Ｃａｎｂｅｒｒａ），　Ｉｎｃ．　（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ，　ＵＳＡ））により測定した。
　ＡｕＮＰの合成に、以下水溶液Ａ－Ｅを用いた。
水溶液Ａ：　テトラクロロ金（ＩＩＩ）酸（０．１７％　ｗ／ｖ）水溶液２ｍＬに、水８ｍＬを加え、調整した。
水溶液Ｂ：　アスコルビン酸（１％　ｗ／ｖ）水溶液０．５ｍＬとクエン酸三ナトリウム（０．８８％　ｗ／ｖ）水溶液０．２５ｍＬを混合し、水９．２５ｍＬを加え、調整した。
水溶液Ｃ：　テトラクロロ金（ＩＩＩ）酸（０．１７％　ｗ／ｖ）水溶液８ｍＬに、水２ｍＬを加え、調整した。
水溶液Ｄ：　アスコルビン酸（１％　ｗ／ｖ）水溶液２ｍＬとクエン酸三ナトリウム（０．８８％　ｗ／ｖ）水溶液１ｍＬを混合し、水７ｍＬを加え、調整した。
　ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧのラットやマウスへの投与は、生理食塩水によって適宜希釈した後に行った。
（１－１）５ｎｍ　ＡｕＮＰの準備
５ｎｍ　ＡｕＮＰは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ，ＬＬＣ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ））より購入した。
（１－２）１３ｎｍ　ＡｕＮＰの合成
　テトラクロロ金（ＩＩＩ）酸（０．１７％　ｗ／ｖ）水溶液２．５ｍＬに、水４７．５ｍＬを加えた。加え終えた後、攪拌しながら１００度以上に昇温した。昇温後、クエン酸三ナトリウム（０．８８％　ｗ／ｖ）とクエン酸（０．０５％　ｗ／ｖ）を混合した水溶液２ｍＬを加え、さらに５分間同じ温度で攪拌した。攪拌後、室温に戻し、１３ｎｍ　ＡｕＮＰを得た。ＴＥＭイメージングにより、ＡｕＮＰの平均粒子径が１３ｎｍ（１３．１±１．４ｎｍ）であることを確認した。
（１－３）３０ｎｍ　ＡｕＮＰの合成
　１３ｎｍ　ＡｕＮＰ水溶液５ｍＬに、水１５ｍＬを加え、調整した。調整した水溶液を攪拌しながら、０．２５ｍＬ／ｍｉｎの流速で水溶液ＡとＢを別々のシリンジから同時に加えた。加え終えた後、攪拌しながら１００度以上に昇温し、さらに３０分同じ温度で攪拌した。攪拌後、室温に戻し、３０ｎｍ　ＡｕＮＰを得た。ＴＥＭイメージングにより、ＡｕＮＰの平均粒子径が３０ｎｍ（３０．８±２．７ｎｍ）であることを確認した。
（１－４）６０ｎｍ　ＡｕＮＰの合成
　３０ｎｍ　ＡｕＮＰ水溶液５ｍＬに、水１５ｍＬを加え、調整した。調整した水溶液を攪拌しながら、０．２５ｍＬ／ｍｉｎの流速で水溶液ＡとＢを別々のシリンジから同時に加えた。加え終えた後、攪拌しながら１００度以上に昇温し、さらに３０分同じ温度で攪拌した。攪拌後、室温に戻し、６０ｎｍ　ＡｕＮＰを得た。ＴＥＭイメージングにより、ＡｕＮＰの平均粒子径が６０ｎｍであることを確認した。
（１－５）１２０ｎｍ　ＡｕＮＰの合成
　６０ｎｍ　ＡｕＮＰ水溶液２０ｍＬを攪拌しながら、０．２５ｍＬ／ｍｉｎの流速で水溶液ＣとＤを別々のシリンジから同時に加えた。加え終えた後、攪拌しながら１００度以上に昇温し、さらに３０分同じ温度で攪拌した。攪拌後、室温に戻し、１２０ｎｍ　ＡｕＮＰを得た。ＴＥＭイメージングにより、ＡｕＮＰの平均粒子径が１２０ｎｍ（１２０．７±１３．３ｎｍ）であることを確認した。
（１－６）５ｎｍ、１３ｎｍ、３０ｎｍ、１２０ｎｍ　ＡｕＮＰのＰＥＧ修飾
　５ｎｍ、１３ｎｍ、３０ｎｍ、１２０ｎｍ　ＡｕＮＰ水溶液にそれぞれ、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルチオール（Ｍｎ ６，０００）を終濃度０．１ｍｇ／ｍＬになるように加えた。その後、室温で２時間攪拌した。攪拌後、５ｎｍ　ＡｕＮＰ－ＰＥＧ水溶液に対し限外ろ過（１００００　Ｇ、１０分）を行い、蒸留水を加えた。この操作を合わせて３回行い、不純物を取り除いた５ｎｍ　ＡｕＮＰ－ＰＥＧ水溶液を得た。１３ｎｍ　ＡｕＮＰ－ＰＥＧ水溶液、３０ｎｍ　ＡｕＮＰ－ＰＥＧ水溶液、１２０ｎｍ　ＡｕＮＰ－ＰＥＧ水溶液に対しては、遠心分離（１００００　Ｇ、１時間）によりＡｕＮＰ－ＰＥＧを沈殿させた。その後、デカンテーションにより上澄み液を取り除き、取り除いた溶液と同じ量の蒸留水を加えた。この操作を合わせて２回行い、不純物を取り除いた１３ｎｍ　ＡｕＮＰ－ＰＥＧ水溶液、３０ｎｍ　ＡｕＮＰ－ＰＥＧ水溶液、１２０ｎｍ　ＡｕＮＰ－ＰＥＧ水溶液を得た。ＴＥＭイメージングにより、ＡｕＮＰ表面がＰＥＧにより修飾されていることを確認した。
（１－７）ＡｕＮＰ－ＰＥＧのＡｔ－２１１標識化
（５ｎｍ　ＡｕＮＰ－ＰＥＧのＡｔ－２１１標識化）
　５ｎｍ　ＡｕＮＰ－ＰＥＧ水溶液に、Ａｔ－２１１水溶液を加え、室温で１５分間振とうした。振とう後、５ｎｍ　ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧ（５ｎｍ　ｍＰＥＧ－Ｓ－ＡｕＮＰ［２１１Ａｔ］）水溶液（約４２．３ＭＢｑ／ｍＬ）を得た。
（１３ｎｍ　ＡｕＮＰ－ＰＥＧのＡｔ－２１１標識化）
　１３ｎｍ　ＡｕＮＰ－ＰＥＧ水溶液に、Ａｔ－２１１水溶液を加え、室温で１５分間振とうした。振とう後、１３ｎｍ　ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧ（１３ｎｍ　ｍＰＥＧ－Ｓ－ＡｕＮＰ［２１１Ａｔ］）水溶液（約４０．７ＭＢｑ／ｍＬ）を得た。
（３０ｎｍ　ＡｕＮＰ－ＰＥＧのＡｔ－２１１標識化）
　３０ｎｍ　ＡｕＮＰ－ＰＥＧ水溶液に、Ａｔ－２１１水溶液を加え、室温で１５分間振とうした。振とう後、３０ｎｍ　ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧ（３０ｎｍ　ｍＰＥＧ－Ｓ－ＡｕＮＰ［２１１Ａｔ］）水溶液（約３９．０ＭＢｑ／ｍＬ）を得た。
（１２０ｎｍ　ＡｕＮＰ－ＰＥＧのＡｔ－２１１標識化）
　１２０ｎｍ　ＡｕＮＰ－ＰＥＧ水溶液に、Ａｔ－２１１水溶液を加え、室温で１５分間振とうした。振とう後、１２０ｎｍ　ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧ（１２０ｎｍ　ｍＰＥＧ－Ｓ－ＡｕＮＰ［２１１Ａｔ］）水溶液（約３９．９ＭＢｑ／ｍＬ）を得た。
　各サイズのＡｕＮＰ（Ａｔ）－ＰＥＧ水溶液の質量濃度をＩＣＰ－ＯＥＳ　（Ｏｐｔｉｍａ　８３００，　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｉｎｃ．（Ｗａｌｔｈａｍ，　ＵＳＡ））を用いて測定し、粒子濃度を計算した。これらの値を用いて、インビトロおよびインビボ実験モデルに投与するＡｕＮＰ（Ａｔ）－ＰＥＧ水溶液における粒子濃度を調整し、投与する放射線量を概ね揃えた。なお、インビトロ実験では蒸留水で濃度を調整し、インビボ実験では生理食塩水で濃度を調整した。
　インビトロ実験では、下記に述べるとおり連続希釈して投与し、インビボ実験においては、動物当たりの投与量が下記表１に示す放射線用量となるように調製して投与した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（１－８）５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］の合成
５ｎｍ　ＡｕＮＰ水溶液に、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルチオール（Ｍｎ　３５０）（Ｂｉｏｃｈｅｍｐｅｇ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ））とｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］（Ｖｉｖｉｔｉｄｅ（Ｋｅｎｔｕｃｋｙ，ＵＳＡ））を溶解した水溶液を加えた。ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルチオール（Ｍｎ　３５０）とｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］の終濃度は、それぞれ０．１ｍＭになるように調整した。その後、室温で２時間攪拌した。攪拌後、５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］水溶液に対し限外ろ過（１００００　Ｇ、１０分）を行い、蒸留水を加えた。この操作を合わせて３回行い、不純物を取り除いた５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］水溶液を得た。５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］水溶液にＡｔ－２１１水溶液を加え、室温で１５分間振とうした。振とう後、５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］（５ｎｍ　ｍＰＥＧ－Ｓ－ＡｕＮＰ［２１１Ａｔ］－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］）（約５８．５　ＭＢｑ／ｍＬ）を得た。
（２）インビトロ細胞毒性試験
（２－１）腫瘍細胞
　Ｃ６グリオーマ細胞およびＰＡＮＣ－１細胞（ＴＡＣＣ（Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡ））を使用した。これらの細胞を，１０％のウシ胎児血清（ＧｉｂｃｏＴＭ，　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，（ＣＡ　ＵＳＡ））および１％のペニシリン―ストレプトマイシン溶液（富士フイルム和光純薬株式会社（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ））を含むＤＭＥＭ培地（富士フイルム和光純薬株式会社（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用い、３７℃、５％ＣＯ２添加の条件で加湿培養器にて培養した。
（２－２）試験方法
　Ｃ６グリオーマ細胞（１００μＬ培地中２×１０４細胞／ウェル）およびＰＡＮＣ－１細胞（１００μＬ培地中１×１０４細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに播種し、１日培養した。粒子径の異なるＡｕＮＰ－ＰＥＧ（放射線核種無し）と、ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ＰＥＧを合成し、各粒子径を有するＡｕＮＰ（Ａｔ）－ＰＥＧの１ｍＬ当たりの放射線用量が概ね同一になるように試験溶液を調製した。調整した試験溶液を連続希釈して、０～１ＭＢｑ／ｍＬの放射線用量となるように、それぞれのウェルに加えた（２５μＬ／ウェル）。２４時間培養後、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ　８　（ＣＣＫ８）（同仁化学研究所，（Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ））を用いて、４５０ｎｍのマイクロプレートリーダで細胞の生存率を測定した。
（２－３）結果
　５ｎｍ、１３ｎｍ、３０ｎｍまたは１２０ｎｍの放射核種を付加しないＡｕＮＰ－ＰＥＧで処理したＣ６グリオーマ細胞を２４時間培養したところ、高濃度で処理した場合でも、細胞の生存率に影響はなかった。すなわち、放射線核種を付加していないＡｕＮＰ－ＰＥＧは、粒子径および濃度によらず、毒性を有していなかった。一方、１２０ｎｍの粒子径を有する、Ａｔ－２１１を付加した１２０ｎｍ　ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ＰＥＧを、放射線量１ＭＢｑ／ｍＬ投与したＣ６グリオーマおよびＰＡＮＣ－１細胞では、著明な生存率の低下が確認された。
　Ｃ６グリオーマをＡｕＮＰ－ＰＥＧと２４時間培養した結果、５ｎｍ、１３ｎｍ、３０ｎｍおよび１２０ｎｍのＡｕＮＰ（Ａｔ）－ＰＥＧはＣ６グリオーマ細胞内に内在化したものの、５ｎｍ、１３ｎｍおよび３０ｎｍのＡｕＮＰ（Ａｔ）－ＰＥＧは、１２０ｎｍのＡｕＮＰ（Ａｔ）－ＰＥＧと比して、濃度が高い場合でないと細胞内在化が観察されなかった。一方、１２０ｎｍのＡｕＮＰ（Ａｔ）－ＰＥＧのみが溶液中で沈殿することが観察され、１２０ｎｍのＡｕＮＰ（Ａｔ）－ＰＥＧでは、ウェル中でＡｕＮＰ－ＰＥＧの細胞周辺局所濃度が上昇していると考えられた。以上の結果から、ＡｕＮＰ－ＰＥＧおよびＡｕＮＰ（Ａｔ）－ＰＥＧは、濃度依存的に細胞内に取り込まれることが推察された。なお、Ｃ６グリオーマ細胞に替えて、ＰＡＮＣ－１細胞に対して行った実験でも、同様の結果が得られ、ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ＰＥＧの細胞毒性は、細胞種に依存しないことが示唆された。
（３）動物モデル
　（３－１）ラット
　雄のヌードラット（Ｆ３４４／ＮＪｃｌ－ｒｎｕ／ｒｎｕ（ＣＬＥＡ　Ｊａｐａｎ，Ｉｎｃ．（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）））（７週齢）を用いた。
　（３－２）マウス
　雄のヌードマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ　Ｓｌｃ－ｎｕ／ｎｕ（Ｊａｐａｎ　ＳＬＣ，Ｉｎｃ．（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）））（５週齢）を用いた。
　（３－３）腫瘍細胞
　グリオーマ細胞として、Ｎ－ｎｉｔｒｏｓｏｍｅｔｈｙｌｕｒｅａの導入によって得られたラットの神経膠腫のセルラインであるＣ６グリオーマ細胞を使用した（理研ＢＲＣより入手）。Ｃ６グリオーマ細胞は、１０％のウシ胎児血清を加えたＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｊａｐａｎ，（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ））を用い、３７℃、５％ＣＯ２添加の条件で加湿培養器にて培養した。
　膵癌細胞として、ヒト膵癌細胞ＰＡＮＣ－１を使用した（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手）。ＰＡＮＣ－１は、Ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ｍｅｄｉｕｍ　ＲＰＭＩ１６４０　ｗｉｔｈ　Ｌ－グルタミンとフェノールレッド（富フイルム和光純薬株式会社（Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ））、１０％　熱非活性化ウシ胎児血清および１％ペニシリン―ストレプトマイシンを含む、ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。
　（３－４）ラットへの腫瘍細胞の移植
　Ｃ６グリオーマ細胞０．９ｘ１０＾７個／５０μｌＭＥＭに５０μｌ　ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ））を添加し、２．０％　ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ　ｉｎ　ｏｘｙｇｅｎを用いた麻酔下でラットの両側背部皮下に移植した。
　ヒト膵癌ＰＡＮＣ－１細胞１．０×１０＾７個／５０μｌ　ＲＰＭＩ１６４０に５０μｌ　ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ））を添加し、マウスの左肩皮下に移植した。
　（３－５）ＡｕＮＰの投与
　Ｃ６グリオーマ細胞移植１３日後のラット（ｎ＝１１）を、２．０％　ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ　ｉｎ　ｏｘｙｇｅｎを用いて麻酔下で腫瘍内薬剤投与を行った。生理食塩水（ｎ＝３）、径１２０ｎｍのＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧ＋生理食塩水（ｎ＝４）、径３０ｎｍのＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧ＋生理食塩水（ｎ＝４）をそれぞれ腫瘍体積と等しくなるよう準備し、両側腫瘍内にそれぞれ約１分程度かけて緩徐に投与した。投与に際しては超音波装置（ＰｒｏＳｏｕｎｄ　α６，Ｈｉｔａｃｈｉ－Ａｌｏｋａ　Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｌｔｄ．　（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ））のリニアプローブを用い、注射器（Ｍｙｊｅｃｔｏｒ　２９Ｇ，Ｔｅｒｕｍｏ　Ｃｏ．Ｌｔｄ．（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ））の針先を腫瘍の中心に留置して行った。放射性薬剤に関しては、腫瘍当たりの投与時の投与放射能は１．４±０．５ＭＢｑであった。投与後に、アルファ線サーベイメータ（ＴＣＳ－２３２Ｂ，Ｈｉｔａｃｈｉ　Ｃｏ．Ｌｔｄ．（Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ））を用いて、放射性薬剤の皮膚への逆流による汚染が無いことを確認した。
　５ｎｍ、１３ｎｍ、３０ｎｍ、１２０ｎｍのＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧをラットに投与した試験では、Ｃ６グリオーマ細胞移植１３日後のラット（ｎ＝１２）を、２．０％　ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ　ｉｎ　ｏｘｙｇｅｎを用いて麻酔下で腫瘍内薬剤投与を行った。生理食塩水（３匹、６腫瘍）、放射線核種を付加しない３０ｎｍＡｕＮＰ－ＰＥＧ＋生理食塩水（３匹、６腫瘍）、１２０ｎｍＡｕＮＰ（Ａｔ）－ＰＥＧ＋生理食塩水（４匹、８腫瘍）、３０ｎｍＡｕＮＰ（Ａｔ）－ＰＥＧ＋生理食塩水（４匹、８腫瘍）、１３ｎｍＡｕＮＰ（Ａｔ）－ＰＥＧ＋生理食塩水（３匹、６腫瘍）、５ｎｍＡｕＮＰ（Ａｔ）－ＰＥＧ＋生理食塩水（３匹、６腫瘍）をそれぞれ腫瘍体積と等しくなるよう準備した。対照動物に対して、同様に、生理食塩水（３匹、６腫瘍）および放射線核種を付加しない３０ｎｍＡｕＮＰ－ＰＥＧ＋生理食塩水（３匹、６腫瘍）を準備した。これら試験溶液を、それぞれ約１分程度かけて緩徐に投与した。投与に際しては超音波装置（ＰｒｏＳｏｕｎｄ　α６，Ｈｉｔａｃｈｉ－Ａｌｏｋａ　Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｌｔｄ．　（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ））のリニアプローブを用い、注射器（Ｍｙｊｅｃｔｏｒ　２９Ｇ，Ｔｅｒｕｍｏ　Ｃｏ．Ｌｔｄ．（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ））の針先を腫瘍の中心に留置して行った。放射性薬剤に関しては、腫瘍当たりの投与時の投与放射能は１．４±０．４ＭＢｑであった（表１）。投与後に、アルファ線サーベイメータ（ＴＣＳ－２３２Ｂ，Ｈｉｔａｃｈｉ　Ｃｏ．Ｌｔｄ．（Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ））を用いて、放射性薬剤の皮膚への逆流による汚染が無いことを確認した。
　（３－６）オートラジオグラフィー
　平均径１２０ｎｍのＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧを投与したラット（ｎ＝１）および径３０ｎｍのＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧを投与したラット（ｎ＝１）について、投与翌日にそれらの腫瘍をすべて摘出し、－８０℃にて速やかに凍結した。腫瘍摘出後にラットは過剰量のｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ投与にて安楽死させた。クリオスタット（ＣｒｙｏＳｔａｒ　ＮＸ７０，　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．（ＭＡ，ＵＳＡ））で厚さ３０μｍ程度に薄切し、スライドグラスに貼り付けた。その後、凍結切片は速やかにドライヤーにて乾燥させたのち、約１時間イメージングプレートとのコンタクトを行った。イメージングはｎｏｎｃｏｎｆｏｃａｌ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｍｏｄｅ　ｌａｓｅｒ　ｓｃａｎｎｅｒ（Ｔｙｐｈｏｏｎ　ＦＬＡ　７０００，ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ））を用いて行った。
　（３－７）シンチグラフィー分析
　ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧを投与したラットに関して、投与４ｈ後、および１９時間から２１時間後にシンチグラムを行った。シンチグラムはｇａｍｍａ　ｃａｍｅｒａ（Ｅ．ｃａｍ，　Ｓｉｅｍｅｎｓ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｅｒｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））にｌｏｗ－ｅｎｅｒｇｙ，ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｐａｒａｌｌｅｌ－ｈｏｌｅ　ｃｏｌｌｉｍａｔｏｒを装着して行った。ラットは２．０％　ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ　ｉｎ　ｏｘｙｇｅｎを用いた麻酔下で伏臥位（ｐｒｏｎｅ）にてベッドに固定し、４時間後は１０分間、１９時間後以降は３０分間撮像を行い、１２８×１２８　ｍａｔｒｉｘ　ｓｉｚｅの前面および後面のプラナー画像を得た。
　（３－８）統計
　統計計算はＳＰＳＳ　１７．０を用いて行った。腫瘍質量の比較はｏｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ、Ｌｅｖｅｎｅの検定を行ったうえで、Ｔｕｋｅｙ’ｓ　ＨＳＤ検定にて後検定を行った。
　すべての実験は、大阪大学動物実験委員会の承認を得た上で、大阪大学動物実験規程に従って施行された。実験の結果は、ＡＲＲＩＶＥ（Ａｎｉｍａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ　ｉｎ　Ｖｉｖｏ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）ガイドラインに準拠して報告している。
（４）皮下移植神経膠腫へのＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧの注入
　（４－１）シンチグラフィー分析
　Ｃ６グリオーマ細胞移植ラットの両側の腫瘍に、生理食塩水のみ、１２０ｎｍ　ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧ＋生理食塩水、または３０ｎｍ　ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧ＋生理食塩水を注入した。投与後４時間および１９時間後にシンチグラフィー分析を行った。１２０ｎｍ　ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧ（図１）および３０ｎｍ　ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧ（図２）の結果を示す。
　１２０ｎｍ　ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧおよび３０ｎｍ　ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧのいずれにおいても、腫瘍以外の部位にシグナルは検出されなかった。
　一方、１２０ｎｍ　ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧは腫瘍組織内に点状に集積した（図１）のに対して、３０ｎｍ　ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧは腫瘍組織内で拡散することが観察された（図２）。
　参考実験として、同様のＡｕＮＰ―ＰＥＧにガンマ線核種であるＩ－１２３を結合させたＡｕＮＰ（Ｉ－１２３）ＰＥＧを投与した場合の結果を図３に示す。Ｉ－１２３とＡｕＮＰの結合は不安定であり、左側の皮下腫瘍（矢印）に注入１．５時間後Ｉ－１２３はＡｕＮＰから比較的速やかに分離し、血管内に流入し全身に分布する（図３）。
（４－２）オートラジオグラフィー
　１２０ｎｍ　ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧまたは３０ｎｍ　ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧを注入したラットから、注入翌日に腫瘍組織を取り出し、オートラジオグラフィーを行った。結果を図に示す（図４）。１２０ｎｍ　ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧは腫瘍辺部に集中して局在していたのに対して（図４Ｂ）、３０ｎｍ　ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧは腫瘍全体に分布することが確認された（図４Ａ）。なお、ＰＥＧにより修飾されていない３０ｎｍ　ＡｕＮＰ（Ａｔ）では、腫瘍内の分布がやや偏る傾向がみられた（図５）。
（４－３）腫瘍増殖抑制効果
　ラットにおける皮下移植Ｃ６グリオーマモデルを用いて、５ｎｍ、１３ｎｍ、３０ｎｍおよび１２０ｎｍ　ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧの抗腫瘍作用を比較した。
　生理食塩水のみ、または５ｎｍ、１３ｎｍ、３０ｎｍおよび１２０ｎｍ　ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧを生理食塩水とともに腫瘍に注入後、ラットを３８日または３９日間経過観察し、経過中、２．０％　ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ　ｉｎ　ｏｘｙｇｅｎを用いた麻酔下で、体重測定および腫瘍サイズの測定を行った。また、投与４０日後に腫瘍を摘出し、腫瘍の質量を計測した。実験後、動物は過剰量のｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ投与にて安楽死させた。
　腫瘍サイズの変化を図６に、体重の変化を図７に、取り出した腫瘍の質量の比較を図８に示す。
　各粒子径のＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧを投与したラットにおける腫瘍サイズ自体を比較したところ、これらのＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧの間では、粒子径が小さいＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧを投与したラットの腫瘍ほど、腫瘍サイズ増加が少なく、５ｎｍ　ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧを投与したラットで、腫瘍サイズ増加が最も少なかった（図６）。なお、体重変化に著明な差はなかった（図７）。投与後４０日後の時点でラットから取り出した腫瘍組織の質量を測定すると、粒子径が小さいＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧを投与したラットの腫瘍ほど質量が少なく、５ｎｍ　ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧを投与したラットの腫瘍質量が最も少なかった（図８）。Ａｔ－２１１を付加しなかった３０ｎｍ　ＡｕＮＰ－ＰＥＧを投与したラットでは、腫瘍質量は生理食塩水を投与したものとほぼ同じであった。本結果から、ＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧ粒子は、５ｎｍといった小さい粒子径を有することにより、優れた抗腫瘍効果を奏することが確認された。
　５ｎｍＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧ粒子について、上記（３－１）と同様に、両側皮下腫瘍に５ｎｍＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧ粒子を注入後、４時間、１９時間、４２時間後にシンチグラフィー分析を行ったところ、図９に示す結果を得た。本結果から、５ｎｍといった小さい粒子径を有するＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧ粒子は、腫瘍組織内に滞留し、腫瘍組織外への拡散は限定的であることが確認された。
　理論に縛られるものではないが、５ｎｍといった小さい粒子径を有するＡｕＮＰ（Ａｔ）ＰＥＧ粒子は、優れた腫瘍組織内拡散特性を有する一方で、その腫瘍組織からの拡散は限定的であることが、優れた抗腫瘍効果をもたらすと考えられる。本実験結果により、増殖性疾患細胞に特異的な標的化分子を利用しなくても、粒子径の調整によって、腫瘍組織内に均一に分布しつつ腫瘍組織外への拡散が限定的であるという、放射線放出治療薬として極めて優れた特性を有するアルファ線金ナノ粒子を製造し得ることが確認された。
　（４－４）膵癌組織に対する腫瘍増殖抑制効果
　ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＳｌｃ－ｎｕ／ｎｕ）（雄　５週齢）１２匹の左肩に、ヒト膵癌ＰＡＮＣ－１細胞を移植した。移植１４日後に、６匹には１３ｎｍのＡｕＮＰ（Ａｔ）ｍＰＥＧを、６匹にはコントロールとして未標識の１３ｎｍのＡｕＮＰｍＰＥＧを投与した。投与方法はラットと同様であった。投与後３９日間、腫瘍サイズ、マウス体重を測定した。移植４０日後に、腫瘍を摘出し、マウスを安楽死させた。
　シンチグラフィーにより、投与、４２時間後までに、放射線放出核種は腫瘍以外には分布しないことが確認された。また、ＡｕＮＰ（Ａｔ）ｍＰＥＧを投与したマウスではコントロールと比して、腫瘍の増殖能は著明に低下していた（図１０）。一方、コントロールのマウスの体重は、ＡｕＮＰ（Ａｔ）ｍＰＥＧを投与した群と比して有意に低下していた（ｐ＝０．００６）（図１１）。
　摘出した腫瘍の質量を比較すると、ＡｕＮＰ（Ａｔ）ｍＰＥＧを投与した群ではコントロールと比して有意に腫瘍質量が小さかった（図１２）。（ｐ＝０．００６）。本実験により、本発明のＡｕＮＰ（Ａｔ）ｍＰＥＧの局所投与は、膵癌に治療においても有効であることが確認された。
（５）皮下移植モデルに対する選択的動脈内投与
　８Ｗ齢のヌードラット（Ｆ３４４／ＮＪｃｌ－ｒｎｕ／ｒｎｕ（ＣＬＥＡ　Ｊａｐａｎ，Ｉｎｃ．（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ））４匹にＣ６予備実験として動脈の血管支配を明らかにするために、ラットの左大腿動脈の分枝に直視下でカテーテルを挿入し、ジアグノグリーン（ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ　ｇｒｅｅｎ）を適量注入し組織の染色を視覚的に評価することによって、左大腿遠位部内側部の皮下が当該動脈の支配領域であることを確認した。Ｃ６細胞は染色を認めた左大腿内側皮下に移植した。
　移植１４日後にイソフルラン麻酔下で鼠径部を切開し、直視下で同大腿動脈分枝に末梢に向けてカテーテルを留置した。その後、ドルミカム：０．３ｍｌ（ｍｉｄａｚｏｌａｍ　１．５ｍｇ）、セラクタール：０．３ｍｌ（ｘｙｌａｚｉｎｅ　６ｍｇ）およびベトルファール：０．４ｍｌ（ｂｕｔｏｒｐｈａｎｏｌ　ｔａｒｔｒａｔｅ　０．８ｍｇ）を加えた薬剤０．０７ｍｌ／１００ｇを筋肉内投与し麻酔した。その後、２匹のラットに対して、脈拍、血圧を一時的に低下させ、血液の流速を低下させる目的で尾静脈よりアデノスキャン：０．７ｍｌ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ：２ｍｇ）をボーラス投与し、直後に、大腿動脈に留置したカテーテルより、５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］　３．３ＭＢｑを０．３ｍｌの生理食塩水に溶解し緩徐に（１．５分程度かけて）投与した。５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］（５ｎｍ　ｍＰＥＧ―Ｓ－ＡｕＮＰ［２１１Ａｔ］－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］）の構造を図１３に示す。
　投与後、カテーテルを抜去し、大腿動脈を結紮した。コントロール群の２匹のラットに対しては、大腿動脈を結紮する手術を施行し、閉創した。投与９時間後、１４時間後に、Ａｔを投与したラットに関してシンチグラフィーにて薬剤の全身分布を評価した。ＲＩはいずれの時点でも、腫瘍、肝、および脾に集積しており、その他の臓器には明らかな集積を認めなかった（図１４）。その後、体重変化、腫瘍体積の観察を行ったところ（図１５、図１６）、Ａｔを投与したラットとコントロールとの間に明らかな体重差は認められなかった（図１５）。一方、腫瘍体積の観察結果において、Ａｔを投与したラットとコントロールに比して、腫瘍の増殖が抑制されていることを確認した（図１６）。本実験により、５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］の選択的経動脈投与によって、腫瘍の増殖が抑制されることが明らかになった。当該結果は、本発明のアルファ線放出核種と結合した特定の粒子径を有する金ナノ粒子が、病変を栄養する動脈内への超選択的投与によって、優れた増殖性疾患治療効果を奏することを示している。
（６）腹膜播種モデルに対する腹腔内投与の実験
　８Ｗ齢６匹（Ａ群）、および９Ｗ齢６匹（Ｂ群）の雄のヌードマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ　Ｓｌｃ－ｎｕ／ｎｕ（Ｊａｐａｎ　ＳＬＣ，Ｉｎｃ，（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）））に蛍光タンパク質遺伝子を導入したＣ６細胞１×１０７を腹腔内移植した。Ａ群で移植１４日後に、Ｂ群で移植７日後に、それぞれ３匹のマウスに２６Ｇ針で５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］を０．９８±０．１９ＭＢｑ／０．２ｍｌ腹腔内投与した。両群それぞれ３匹のコントロール動物には、２６Ｇ針で生理食塩水を０．２ｍｌ腹腔内投与した。
　投与９時間後、１４時間後に、シンチグラフィーにて薬剤の全身分布を評価した（図１７）。いずれの時点でも、ＲＩは腹腔内に局在し、他臓器には分布が認められなかった。Ａ群のコントロール動物１匹に腫瘍の生着が認められなかったので、この動物を除外した。その他のすべての動物で腫瘍の生着が認められた。Ａ群の平均死亡時期は、コントロール：投与１０．５日後、Ａｔ：投与１５．３日後であった（図１８）。Ｂ群では、すべての動物が移植３２日後（投与２３日後）まで生存した。Ｂ群に関して、体重変化、蛍光イメージャによる腹腔の観察を行ったところ、コントロール動物では薬剤投与動物に比して、腹水増加によると考えられる体重増加を認めた（図１９）。
　移植４週後（投与１７日後）において、コントロール動物では腹腔内に腫瘤を蝕知し、蛍光イメージャによる観察では同部に蛍光を認めた。一方Ａｔ投与動物では、腫瘤を蝕知しないか、小結節を蝕知し、同部に軽度の蛍光を認めた。移植３２日後（投与２３日後）に腫瘍摘出を行い、摘出腫瘍の質量を比較したところ、コントロール動物では、Ａｔ投与動物に比して腫瘍の広がり、質量が大きかった（図２０～２４）。また、摘出腫瘍には不均一ではあるものの、蛍光が認められた（図２３）。本実験により、５ｎｍ　ＰＥＧ－ＡｕＮＰ（Ａｔ）－ｃ［ＲＧＤｆＫ（Ｃ）］の腹腔内投与によって、Ｃ６腹膜播種病変の進行を抑制できることが明らかになった。当該結果は、本発明のアルファ線放出核種と結合した特定の粒子径を有する金ナノ粒子が、腔内散布による投与によって、優れた増殖性疾患治療効果を奏することを示している。
　以上の実験結果は、本発明の、アルファ線放出核種と結合した、特定の粒子径を有する金ナノ粒子を局所投与することにより、様々な増殖性疾患を安全かつ効果的に治療し得ることを示している。なお、当該範囲以下の粒子径を有する金ナノ粒子を用いた場合には、腫瘍組織外への流出が生じ得ることが確認されている。

Claims (9)

  1. 　Ａｔ－２１１と結合した、０．５～１１０ナノメートルの粒子径を有する金ナノ粒子を含有し、局所投与されることを特徴とする、増殖性疾患を治療するための医薬。
  2. 　金ナノ粒子の表面がポリエチレングリコール、ポリエーテル、ポリオール、ポリエチレンイミン、シリカゲル、ペプチド、抗体、タンパク質、脂質、複合脂質、糖鎖、複合糖質、テルペン、テルペノイドおよびウイルス様粒子から選択される分子により修飾されている、請求項１に記載の医薬。
  3. 　前記表面修飾が、特定の細胞に対する標的化分子を結合していない分子を含む、請求項２に記載の医薬。
  4. 　前記表面修飾が、特定の細胞に対する標的化分子を結合していない分子が、２，０００～２０,０００の平均分子量を有するポリエチレングリコールである、請求項３に記載の医薬。
  5. 　前記金ナノ粒子の粒子径は、０．５～１３ナノメートルである、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬。
  6. 　局所投与が、病変内への注入、病変を栄養する動脈内への超選択的投与、および腔内散布からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬。
  7. 　前記増殖性疾患が脳腫瘍、内分泌腫瘍、前立腺癌、頭頚部癌、口腔癌、乳癌、婦人科癌、皮膚癌、膵癌および消化器癌からなる群から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬。
  8. 　０．５～１１０ナノメートルの粒子径を有し、Ａｔ－２１１と結合し、特定の細胞に対する標的化分子と結合していないポリエチレングリコールによる表面修飾を含む金ナノ粒子。
  9. 　（１）０．５～１１０ナノメートルの異なる粒子径を有するＡｔ－２１１結合金ナノ粒子を準備する工程、
    　（２）前記各粒子径を有するＡｔ－２１１結合金ナノ粒子を、それぞれインビボの増殖性疾患組織内に投与する工程、
    　（３）前記投与された増殖性疾患組織内のアルファ線分布、および全身アルファ線分布を確認する工程、
    　（４）増殖性疾患組織内のアルファ線分布および、全身アルファ線分布に基づいて粒子径を選択する工程
    　を含む、局所投与により増殖性疾患を治療するために最適な粒子径を有するＡｔ－２１１結合金ナノ粒子を製造する方法。
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