WO2021210779A1

WO2021210779A1 - 자가 프라이머 구조를 가진 헤어핀 프로브를 활용한 등온 증폭기술을 이용한 표적핵산 검출방법

Info

Publication number: WO2021210779A1
Application number: PCT/KR2021/002664
Authority: WO
Inventors: 박현규; 송자연; 정유진; 이서영
Original assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST; Bionano Health Guard Research Center
Current assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST; Bionano Health Guard Research Center
Priority date: 2020-04-14
Filing date: 2021-03-04
Publication date: 2021-10-21
Anticipated expiration: 2022-10-14
Also published as: KR102359986B1; KR20210127375A

Abstract

본 발명은 자가 프라이머 구조를 가진 헤어핀 프로브를 활용한 등온 증폭기술 (Self-priming hairpin-utilized isothermal amplification, SPHIA)을 이용하여 표적핵산을 검출하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 SPHIA 기술을 이용한 표적핵산 검출방법은 기존의 EXPAR 기술의 증폭방법이 표적핵산으로 길이가 짧고 3'-OH 말단을 갖는 표적핵산만을 검출가능했던 단점을 해결하여, 증폭 산물의 양성 피드백 시스템을 통해 500mer 이상의 길이를 가지는 표적핵산도 높은 검출효율로 검출할 수 있는 장점이 있다.

Description

자가 프라이머 구조를 가진 헤어핀 프로브를 활용한 등온 증폭기술을 이용한 표적핵산 검출방법

본 발명은 자가 프라이머 구조를 가진 헤어핀 프로브를 활용한 등온 증폭기술(Self-priming hairpin-utilized isothermal amplification, SPHIA)을 이용하여 표적핵산을 검출하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 핵산 등온증폭에 사용할 수 있는 표적핵산 검출을 위한 자가 프라이머 구조를 가지는 헤어핀 프로브 및 이를 이용한 표적핵산의 검출방법에 관한 것이다.

중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하 PCR) 기술은 표적핵산의 증폭 및 검출을 위해 가장 널리 사용되는 기술이다. 하지만, PCR 반응을 구현하기 위해서는 정교한 온도 조절이 필수적으로 요구되며, 이를 위한 온도 조절장치의 탑재로 인해 PCR 장비의 부피가 커지고 가격이 비싸진다는 단점을 가지고 있다. 최근 현장검사 (point-of-care testing, POCT) 기술 개발에 대한 수요가 증대되면서, 온도 조절장치를 필요로 하는 PCR 기술의 단점을 해결하여 소형화를 구현할 수 있는 대체 기술에 대한 관심이 높아지고 있다.

이러한 기술 흐름에 발맞추어, 1990년대 초부터 온도 조절과정 없이 일정한 온도에서 핵산증폭이 가능한 등온 핵산증폭기술들 (nucleic acid sequence-based amplification (NASBA); helicase-dependent amplification (HDA); recombinase polymerase amplification (RPA); strand displacement amplification (SDA); loop-mediated isothermal amplification (LAMP); rolling circle amplification (RCA); exponential amplification reaction (EXPAR))이 활발히 개발되어 왔다(Van Ness et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 100, 4504, 2003).

상기의 여러 등온 핵산증폭기술 중에서도 EXPAR 기술은 약 30 분의 짧은 반응 시간 내 최대 10⁸배의 표적핵산증폭 효율을 구현함으로써, POCT 기술로서의 높은 활용 가능성을 보유한 기술로 간주되어 왔다. 구체적으로, EXPAR 기술은 절단 효소 인식 염기서열 (템플릿의 중심)과 표적핵산 상보 염기서열 (템플릿의 양 말단)이 수식된 템플릿과 표적핵산의 혼성화 반응 후, 절단 효소와 DNA 중합효소의 작용으로 인해 이중가닥 DNA 산물이 지수함수적으로 증폭되는 기술이다. 하지만, EXPAR 기술은 표적핵산을 프라이머로 사용하여 템플릿을 증폭시키기 때문에, 길이가 짧고 3'-OH 말단을 갖는 표적핵산만을 검출 가능하다는 단점이 있으며, 이로 인해, EXPAR 기술의 표적물질은 주로 microRNA에 한정되어 사용되어 왔다.

이에, 본 발명자들은 표적핵산의 길이에 구애 받지 않으면서, 우수한 검출효율을 가지는 등온증폭 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 자가 프라이머 구조를 형성하고 있는 제1 헤어핀 프로브와 표적 모방 핵산을 생성하는 제2 헤어핀 프로브를 이용하여, 표적핵산을 검출하는 경우, 증폭산물의 양성 피드백 시스템을 통해 500mer 이상의 길이를 가지는 표적핵산도 높은 효율로 검출할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 표적핵산 검출을 위한 자가 프라이머 구조를 가지는 제1 헤어핀 프로브를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 표적핵산 검출을 위한 표적 모방 핵산을 생성하는 제2 헤어핀 프로브를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 자가 프라이머 구조를 가지는 제1 헤어핀 프로브 및 상기 표적 모방 핵산을 생성하는 제2 헤어핀 프로를 이용한 표적핵산의 검출방법을 제공하는데 있다.

본 발명이 또 다른 목적은 상기 자가 프라이머 구조를 가지는 제1 헤어핀 프로브 및 상기 표적 모방 핵산을 생성하는 제2 헤어핀 프로를 포함하는 표적핵산 검출용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명은 또 다른 목적은 상기 자가 프라이머 구조를 가지는 제1 헤어핀 프로브 및 상기 표적 모방 핵산을 생성하는 제2 헤어핀 프로브를 포함하는 표적핵산 검출용 키트를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음 구성요소를 포함하고, 표적핵산 검출을 위한 자가 프라이머 구조를 가지는 제1 헤어핀 프로브를 제공한다:

(i) 표적핵산과 상보적인 서열을 포함하는 헤어핀 프로브의 스템(stem)에 위치하는 X 부위;

(ii) 상기 X 부위와 연결되고, 표적핵산과 상보적인 서열을 가지고, 헤어핀 프로브의 루프(loop)에 위치하는 L 부위;

(iii) 상기 L 부위에 연결되고, 상기 X 부위의 일부와 상보적인 서열을 포함하여 헤어핀 프로브의 스템을 형성하는 헤어핀의 자가 헤어핀 프라이머의 a 부위;

(iv) 상기 자가 헤어핀 프라이머의 a 부위와 연결되고 상기 X 부위의 일부와 상보적인 서열을 포함하여 헤어핀 프로브의 스템을 형성하는 자가 헤어핀 프라이머의 b 부위;

(v) 헤어핀 프로브의 3' 말단에 위치하고, 자가 헤어핀 프라이머의 b 부위에 연결되고, 상기 자가 헤어핀 프라이머의 a 부위와 상보적인 서열을 포함하는 자가 헤어핀 프라이머의 a' 부위; 및

(vi) 상기 X 부위와 연결되고, 절단효소 인식서열을 가지는 N 부위; 및

(vii) 헤어핀 브로브의 5' 말단에 위치하고, 상기 절단효소 인식 도메인과 연결되고, 트리거와 상보적인 서열을 포함하는 T' 부위.

본 발명은 또한, 다음 구성요소를 포함하고, 표적핵산 검출을 위한 표적 모방 핵산을 생성하는 제2 헤어핀 프로브를 제공한다:

(i) 표적핵산과 상보적인 서열을 포함하는 헤어핀 프로브의 스템(stem)에 위치하는 S 부위;

(ii) 상기 S 부위와 연결되고, 표적핵산과 상보적인 서열을 가지고 헤어핀 프로브의 루프(loop)에 위치하는 L2 부위;

(iii) 상기 L2 부위에 연결되고, 상기 S 부위의 상보적인 서열을 포함하여 헤어핀 프로브의 스템을 형성하는 S' 부위;

(iv) 상기 S' 부위에 연결되고, 절단효소 인식서열을 가지는 N 부위; 및

(v) 헤어핀 브로브의 5' 말단에 위치하고, 상기 절단효소 인식 도메인과 연결되고, 트리거와 상보적인 서열을 포함하는 T' 부위.

본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 표적핵산의 검출방법을 제공한다:

(a) 표적핵산 함유 시료, 상기 자가 프라이머 구조를 가지는 제1 헤어핀 프로브, 상기 표적 모방 핵산을 생성하는 제2 헤어핀 프로브, 핵산 중합효소, 절단효소 및 dNTP를 포함하는 조성물을 반응시켜, 이중가닥 DNA 산물을 생성시키는 단계; 및

(b) 상기 생성된 이중가닥 DNA 산물을 분석하여 표적핵산을 검출하는 단계.

본 발명은 또한, 상기 자가 프라이머 구조를 가지는 제1 헤어핀 프로브, 상기 표적 모방 핵산을 생성하는 제2 헤어핀 프로브, 핵산 중합효소, 절단효소 및 dNTP를 포함하는 표적핵산 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 자가 프라이머 구조를 가지는 제1 헤어핀 프로브, 상기 표적 모방 핵산을 생성하는 제2 헤어핀 프로브, 핵산 중합효소, 절단효소 및 dNTP를 포함하는 표적핵산 검출용 키트를 제공한다.

도 1은 본 SPHIA 기술의 반응을 도식화한 것이다. 보다 구체적으로, (a) 헤어핀 프로브 1의 5' 말단에 트리거 결합 도메인(T')과 절단 효소 인식 도메인(N)이 위치해 있고, 스템(X)과 루프(L)에 표적핵산 상보 염기 서열이 위치해 있고, 3' 말단에 자가 프라이머 구조가 수식된 헤어핀 프로브 1이 표적핵산의 혼성화 반응에 의해 열리는 단계; 열린 헤어핀 프로브에서 스템 부분의 자가 프라이머 구조가 노출되어 스템(a)과 3' 말단 부위(a')가 자가 헤어핀 프라이머를 형성하게 되는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 자가 헤어핀 프라이머에서 DNA 중합효소에 의해 중합반응이 일어나 중간 생성물이 형성되는 단계; 이 단계에서 표적핵산은 떨어져 나와 다시 헤어핀 프로브 1을 여는데 재사용 될 수 있는 단계; (c) 절단 효소 및 DNA 중합효소의 복합적 작용으로 상기 (b)의 중간 생성물로부터 트리거(T)가 생성되는 단계; (d) 상기의 단계에서 생성된 트리거(T)가 헤어핀 프로브 2의 3' 말단(T')에 결합하는 단계; (e) 트리거(T)가 헤어핀 프로브 2를 주형으로 DNA 중합효소에 의해 연장됨에 따라 이중가닥 DNA 산물 (최종 생성물)이 생성되는 단계; (f) 절단 효소 및 DNA 중합효소의 복합적 작용으로 표적 모방 핵산이 생성되며, 표적 모방 핵산은 다시 헤어핀 프로브 1에 결합하여 반응 1을 촉진하는 단계를 나타낸 것이다.

도 2는 본 SPHIA 기술의 양성 피드백 시스템 모식도를 나타낸 것이다. 반응 1의 생성물 (트리거)이 반응 2를 촉진시키고, 반응 2의 생성물 (표적 모방 핵산)이 반응 1을 촉진시키는 양성 피드백 시스템을 모식화한 것이다. 반응 1에서 DNA 중합효소에 의한 중합 반응 과정에서 표적핵산이 떨어져 나가 재사용되는 과정도 포함되어 있다.

도 3은 본 발명의 SPHIA 기술에 이용되는 헤어핀 프로브 1의 모식도를 나타낸 것이다. 헤어핀 프로브 1과 표적핵산이 혼성화하여 자가 헤어핀 프라이머를 형성하는 것을 모식화한 것이다. 헤어핀 프로브 1의 구조는, 5' 말단에 트리거에 상보적인 도메인 (T')과 절단 효소 인식 도메인(N)이 위치해 있고, 스템 (X)과 루프(L)에 표적핵산 상보 염기 서열이 위치해 있고, 3' 말단은 자가 프라이머 구조로 이루어져 있다. 헤어핀 프로브가 표적핵산에 의해 열리게 되고, 헤어핀 프로브의 스템 (a)과 3' 말단 부분(a')이 상보적인 서열로 이루어져 있으므로, 자가 헤어핀 프라이머 구조를 형성하게 된다.

도 4는 본 발명의 SPHIA 기술에 이용되는 헤어핀 프로브 2의 모식도를 나타낸 것이다. 헤어핀 프로브 2의 3' 말단에 트리거에 상보적인 도메인 (T')과 절단 효소 인식 도메인(N)이 위치해 있고, 스템 (S) 과 루프 (L2)는 표적핵산 상보 염기 서열로 이루어져 있다. 헤어핀 프로브 2와 트리거가 혼성화한 후, DNA 중합효소에 의한 중합반응을 통해서 생성되는 이중 가닥 최종 생성물은 표적핵산의 서열을 포함하고 있다.

도 5는 본 SPHIA 기술의 유효성을 검증하기 위하여 수행된 실험 결과를 나타낸 것이다. 보다 구체적으로 다양한 조건에 따른 형광 신호 발생 여부를 실험적으로 확인한 결과를 보여준다. 또한, 다양한 조건에 따라서 생성된 증폭 산물을 전기영동을 통해 확인한 실험 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 본 SPHIA 기술의 표적핵산 검출 민감도 실험 결과를 나타낸 것이다 (T_t: 시료의 역치형광신호값 도달 시간).

도 7은 본 SHIA 기술의 특이도를 입증한 것이다. 표적핵산으로부터의 다양한 염기 부정합 (mismatch) 구분 성능 실험 결과를 나타낸 것이다. D value는 표적핵산으로부터의 염기 부정합 구분 능력을 나타내는 지표이며, 다음의 관계식을 통해 정의되는 것을 특징으로 할 수 있다.

D value = (T_t(Blank)- T_t(NT))/(T_t(Blank)- T_t(Target))

(T_t(NT): 비표적핵산이 포함된 시료의 역치형광신호값 도달 시간; T_t(Blank): 핵산이 포함되지 않은 시료의 역치형광신호값 도달 시간; T_t(Target): 표적핵산이 포함된 시료의 역치형광신호값 도달 시간)

도 8은 본 SPHIA 기술의 실질적인 응용도를 입증한 것이다. Asymmetric PCR을 통해 얻은 긴 단일 가닥 구조의 핵산을 시료로 사용하여 형광 신호를 측정한 결과 짧은 핵산 시료와 유사한 경향의 신호 값을 얻었다.

도 9는 본 SPHIA 기술의 RNA 타겟 적용성을 입증한 것이다. 표적핵산을 DNA가 아닌 단일 가닥 구조의 RNA로 대체한 후 실험을 진행한 결과, 오직 표적 RNA를 포함하고 있는 샘플에서만 증대된 형광 신호를 확인할 수 있었고, 증폭 산물이 형성되는 것을 전기영동을 통해 확인할 수 있었다.

발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 표적핵산을 현장에서 검출할 수 있는 POCT (point-of-care testing) 기술을 발전시키고, 시장경쟁력을 선점할 수 있는 기술을 개발하고자, 핵산의 절단 및 중합 반응 시스템을 기반으로 하는 등온 핵산증폭 반응을 통해서 새로운 표적핵산 검출방법을 개발하였다.

본 발명에서 제공하는 SPHIA 기술을 이용한 표적핵산 검출방법은, 종래의 EXPAR 기술로 대표되는 표적핵산 검출방법이 가지고 있던 단점을 해결할 수 있는 등온 증폭기술이다. 보다 구체적으로, 본 발명에서는 표적핵산 존재 시 헤어핀 프로브 1의 3' 말단 스템 부분이 자가 헤어핀 프라이머 형성함으로써, 증폭반응을 일으키는 것을 특징으로 할 수 있다. 증폭반응 과정에서 생성되는 증폭산물이 양성 피드백 시스템을 촉진시켜, 향상된 등온증폭 효율을 구현할 수 있다는 점에서 본 발명의 의의가 있다. 더불어, 헤어핀 구조 기반의 표적핵산 인식 시스템 도입을 통해, 표적핵산에 대한 우수한 특이도를 갖는 기술적 방법을 제공하는데 본 기술의 의의가 있다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 본 발명은 다음 구성요소를 포함하고, 표적핵산 검출을 위한 자가 프라이머 구조를 가지는 제1 헤어핀 프로브에 관한 것이다:

(ii) 상기 X 부위와 연결되고, 표적핵산과 상보적인 서열을 가지고 헤어핀 프로브의 루프(loop)에 위치하는 L 부위;

다른 관점에서, 본 발명은 다음 구성요소를 포함하고, 표적핵산 검출을 위한 표적 모방 핵산을 생성하는 제2 헤어핀 프로브에 관한 것이다:

본 발명의 자가 프라이머 구조를 가지는 제1 헤어핀 프로브의 구조를 도 3에 나타내었다. 본 발명의 제1 헤어핀 프로브의 5' 말단은 트리거와 상보적인 서열(T')로 구성되어 있으며, 상기 트리거 상보 부위는 절단효소 인식부위를 사이에 두고 X 부위와 연결된다. 표적핵산과 제1 헤어핀 프로브의 혼성화 시에 자가 프라이머에 의해 트리거 부위가 합성되면 절단효소에 의해 절단되어, 트리거(T)가 생성되며, 상기 생성된 트리거(T)는 제2 헤어핀 프로브의 트리거 상보 부위에 결합하여 헤어핀 프로브에서 표적모방 핵산이 생성되도록 유도하게 된다.

본 발명에서, 상기 제1 헤어핀 프로브의 L 부위는 상기 X 부위에 위치하는 표적핵산과 상보적인 서열과 이어지는 표적핵산과 상보적인 서열을 가지고 있다. 상기 제2 헤어핀 프로브의 L2 부위는 상기 S 부위에 위치하는 표적핵산과 상보적인 서열과 이어지는 표적핵산과 상보적인 서열을 가지고 있다.

본 발명에서 표적핵산이 존재하는 경우, 제1 헤어핀 프로브의 신장에 의하여 중간 생성물과 트리거(T)가 생성되는 반응 1과정이 진행되며, 상기 트리거(T)가 제2 헤어핀 프로브와 결합하여, 중합효소에 의해 표적 모방 핵산을 생성하는 반응 2과정이 진행된다(도 1 참조).

(a) 헤어핀 프로브 1의 5' 말단에 트리거 결합 도메인(T')과 절단 효소 인식 도메인(N)이 위치해 있고, 스템(X)과 루프(L)에 표적핵산 상보 염기 서열이 위치해 있고, 3' 말단에 자가 프라이머 구조가 수식된 헤어핀 프로브 1이 표적핵산의 혼성화 반응에 의해 열리는 단계; 열린 헤어핀 프로브에서 스템 부분의 자가 프라이머 구조가 노출되어 스템(a)과 3' 말단 부위(a')가 자가 헤어핀 프라이머를 형성하게 되는 단계(도 1의 a);

(b) 상기 (a) 단계의 자가 헤어핀 프라이머에서 DNA 중합효소에 의해 중합반응이 일어나 중간 생성물이 형성되는 단계; 이 단계에서 표적핵산은 떨어져 나와 다시 헤어핀 프로브 1을 여는데 재사용 될 수 있는 단계(도 1의 b);

(c) 절단 효소 및 DNA 중합효소의 복합적 작용으로 상기 (b)의 중간 생성물로부터 트리거(T)가 생성되는 단계(도 1의 c);

(d) 상기의 단계에서 생성된 트리거(T)가 헤어핀 프로브 2의 3' 말단(T')에 결합하는 단계(도 1의 d);

(e) 트리거(T)가 헤어핀 프로브 2를 주형으로 DNA 중합효소에 의해 연장됨에 따라 이중가닥 DNA 산물 (최종 생성물)이 생성되는 단계(도 1의 e);

(f) 절단 효소 및 DNA 중합효소의 복합적 작용으로 표적 모방 핵산이 생성되며, 표적 모방 핵산은 다시 헤어핀 프로브 1에 결합하여 반응 1을 촉진하는 단계(도 1의 f)를 나타낸 것이다.

본 발명의 일 양태에서는, 다양한 농도 (100 aM ~1 nM)의 표적핵산를 포함하는 분석 시료를 이용하여, 본 발명에 따른 SPHIA 반응을 수행한 결과, 본 발명의 기술의 표적핵산 검출 한계 (limit of detection, LOD)는 28.9 aM인 것을 확인하였으며, 본 발명에서 제안하는 SPHIA 기술이 기존 EXPAR 기술과 필적할 만한 성능을 보유하고 있음을 확인하였다(도 6).

본 발명의 다른 양태에서는, SPHIA 기술을 통해, 임의의 핵산 염기서열 (random sequence)을 구분할 수 있을 뿐만 아니라 1 ~ 3 개의 염기 부정합까지 성공적으로 구분할 수 있음을 확인할 수 있었으며(도 7), 이를 통해, 본 발명에서 제안하는 SPHIA 기술이 뛰어난 특이도를 보유하고 있음을 확인하였다.

본 발명이 또 다른 양태에서는, 실시예 1에 기재된 반응 조건을 이용하여 본 발명의 SPHIA 기술의 실용성을 검증하기 위해 asymmetric PCR을 이용하여 긴 길이의 단일 가닥 구조의 핵산 DNA를 얻은 후, SPHIA 기술의 유효성을 확인하였다.

본 발명이 또 다른 양태에서는, 다양한 길이와 종류의 DNA(합성 59mer DNA, 221mer 단일가닥 DNA, 548mer 단일가닥 DNA)를 제작하고, 이를 표적핵산으로 사용하여, 상기 표적핵산에 대한 헤어핀 프로브를 제작하여, SPHIA 반응을 수행하였을 때, 500mer이상의 긴 길이의 핵산도 짧은 길이의 합성 59mer DNA와 유사한 효율로 검출할 수 있는 것을 확인하였다.

본 발명의 또 다른 양태에서는 표적핵산으 로Respiratory syncytial virus의 RNA를 사용하여, 헤어핀 프로브를 디자인하여 SPHIA 증폭반응을 수행한 결과, 표적 RNA를 포함하고 있는 샘플에서만 증대된 형광 신호를 확인할 수 있었고, 증폭 산물이 형성되는 것을 전기영동을 통해 재차 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 SPHIA 기술이 RNA 또한 검출할 수 있다는 것을 확인하였다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 표적핵산의 검출방법에 관한 것이다:

본 발명에서 표적핵산이 존재하는 경우, 앞서 설명한 바와 같이, 상기 자가 프라이머 구조를 가지는 제1 헤어핀 프로브의 신장에 의하여 중간생성물이 생성되게 되며, 절단효소에 의해 중간생성물로부터 트리거가 생성되고, 상기 생성된 트리거와 표적 모방 핵산을 생성하는 제2 헤어핀 프로브의 트리거 상보 부위에 트리거가 혼성화된 후 중합효소에 의하여 신장이 일어나게 되며, 절단효소에 의해 표적모방핵산과 트리거가 생성되게 된다. 상기 트리거는 다시 제2 헤어핀 프로브와 결합하여 혼성화 및 신장이 진행되고, 상기 표적모방핵산 끼리 혼성화에 의하여 최종 생성물인 이중가닥 DNA 산물이 생성되게 되며, 상기 이중가닥 DNA 산물을 분석하여 표적핵산을 검출할 수 있다.

상기 이중가닥 DNA 산물은 전기영동을 통하여 생성 유무를 확인할 수 있고, dsDNA를 검출할 수 있는 형광염료나 그 밖의 방법을 통해서 탐지할 수 있다.

본 발명에 있어서, 표적핵산은 DNA, RNA 또는 DNA/RNA 일 수 있다.

본 발명의 일 양태에서는 dsDNA를 검출할 수 있는 형광염료로 SYBR Green I을 사용하였으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 자가 프라이머 구조를 가지는 제1 헤어핀 프로브, 상기 표적 모방 핵산을 생성하는 제2 헤어핀 프로브, 핵산 중합효소, 절단효소 및 dNTP를 포함하는 표적핵산 검출용 조성물에 관한 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 자가 프라이머 구조를 가지는 제1 헤어핀 프로브, 상기 표적 모방 핵산을 생성하는 제2 헤어핀 프로브, 핵산 중합효소, 절단효소 및 dNTP를 포함하는 표적핵산 검출용 키트에 관한 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. SPHIA 기술 반응 조건 확립

본 실시예에서 사용한 표적핵산과 제1 헤어핀 프로브 및 제2 헤어핀 프로브의 서열은 표 1에 나타내었으며, SPHIA 반응 용액 제조 과정은 다음과 같다.

SPHIA 반응 용액(최종 20 μL)은 dNTPs (10 mM each) 0.4 μL, 헤어핀 프로브 1 (1 μM) 5 μL, 헤어핀 프로브 2 (100 nM) 5 μL 및 다양한 농도의 표적핵산 2 μL를 반응 완충 용액에 첨가하여 제작하였으며, 상기 반응 완충 용액은 1X CutSmart buffer (50 mM KAc (pH 7.9), 20 mM Tris-Ac, 10 mM Mg(Ac)₂, 100 μg/ml BSA) 와 1X NEBuffer 2 (50 mM Tris-HCl (pH 7.9), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT)를 포함하도록 하였다. 이후, 상기 반응 용액에 Klenow fragment (3'→5' exo-) (5 unit/μL) 0.5 μL, Nt.alwi (10 unit/μL) 1 μL를 첨가한 후, 37 ℃에서 30초 간격으로 SYBR Green I으로부터 발생하는 형광 세기를 측정하여, 최종 이중가닥 DNA 생성량을 분석하였다.

실시예 2. SPHIA 기술의 유효성 검증

실시예 1에서 사용한 동일한 반응 조건을 이용하여 다양한 반응 조건 (1~4)애소 본 기술의 유효성 검증 실험을 진행하였다.

(1) 헤어핀 프로브 1 + 표적핵산 + DNA 중합효소 + 절단 효소

(2) 헤어핀 프로브 1 + 헤어핀 프로브 2 + 표적핵산 + DNA 중합효소

(3) 헤어핀 프로브 1 + 헤어핀 프로브 2 + 표적핵산 + DNA 중합효소 + 절단 효소

(4) 헤어핀 프로브 1 + 헤어핀 프로브 2 + DNA 중합효소 + 절단 효소

다양한 반응 조건 (1~4)에 따른 실험을 수행한 결과, 도 5의 a에 나타난 바와 같이, 표적핵산, 헤어핀 프로브 1, 헤어핀 프로브 2, DNA 중합효소, 절단 효소를 모두 포함하는 반응 조건인 (3)에서 월등히 높은 형광 신호가 발생하는 것을 확인하였다.

또한, 전기영동을 이용한 유효성 검증 실험을 통해, 반응 조건 (3)에서만 다량의 이중가닥 DNA 산물이 생성됨을 확인하였다(도 5b).

실시예 3. SPHIA 기술의 민감도 검증

실시예 1에서 언급된 반응 조건을 이용하여 본 발명의 기술의 민감도 검증 실험을 진행하였다.

다양한 농도 (100 aM ~1 nM)의 표적핵산를 포함하는 분석 시료 (20 μL)를 제조한 후, SPHIA 반응을 수행한 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 기술의 표적핵산 검출 한계 (limit of detection, LOD)는 28.9 aM인 것을 확인하였다. 본 실험 결과를 통해, 본 발명에서 제안하는 SPHIA 기술이 기존 EXPAR 기술과 필적할 만한 성능을 보유하고 있음을 확인하였다.

실시예 4. SPHIA 기술의 표적핵산 검출 특이도 검증

본 발명의 SPHIA 기술의 표적핵산 검출 특이도를 확인하기 위하여, 표적핵산으로부터의 다양한 염기 부정합(mismatch) 구분 성능을 확인하였다.

표적핵산 이외의 핵산 임의의 핵산서열과 표적핵산과 1 ~ 3 개의 염기 부정합을 가지는 서열(도 7b)을 이용하여 실험을 수행하였으며,

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, SPHIA 기술을 통해, 임의의 핵산 염기서열 (random sequence)을 구분할 수 있을 뿐만 아니라 1 ~ 3 개의 염기 부정합까지 성공적으로 구분할 수 있음을 확인할 수 있었다.

D value는 표적핵산으로부터의 염기 부정합 구분 능력을 나타내는 지표이며, 다음의 관계식을 통해 정의되는 것을 특징으로 할 수 있다.

D value = (T_t(Blank)- T_t(NT))/(T_t(Blank)- T_t(Target))

본 결과를 통해, 본 발명에서 제안하는 SPHIA 기술이 뛰어난 특이도를 보유하고 있음을 확인하였다.

실시예 5. SPHIA 기술의 실용성 검증

실시예 1에 기재된 반응 조건을 이용하여 본 발명의 SPHIA 기술의 실용성을 검증하기 위해 asymmetric PCR을 이용하여 긴 길이의 단일 가닥 구조의 핵산 DNA를 얻은 후, SPHIA 기술의 유효성을 확인하였다.

다양한 길이와 종류의 DNA(합성 59mer DNA, 221mer 단일가닥 DNA, 548mer 단일가닥 DNA)를 제작하고, 이를 표적핵산으로 사용하여, 상기 표적핵산에 대한 헤어핀 프로브를 제작하여, 반응을 수행하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, asymmetric PCR을 통해서 생성된 긴 길이의 핵산도 짧은 길이의 합성 59mer DNA와 유사한 효율로 검출되는 것을 확인하였다.

실시예 6. SPHIA 기술의 RNA 타겟 적용성 검증

본 발명에 따른 SPHIA 기술을 이용하여 표적 RNA를 검출할 수 있다는 것을 확인하였다.

표적핵산으로는 Respiratory syncytial virus의 RNA를 선정하여 헤어핀 프로브를 디자인하여 SPHIA 증폭반응을 수행하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 오직 표적 RNA를 포함하고 있는 샘플에서만 증대된 형광 신호를 확인할 수 있었고, 증폭 산물이 형성되는 것을 전기영동을 통해 재차 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 SPHIA 기술이 RNA 또한 검출할 수 있다는 것을 확인하였다.

본 발명의 SPHIA 기술을 이용한 표적핵산 검출방법은 기존의 EXPAR 기술의 증폭방법이 표적핵산으로 길이가 짧고 3'-OH 말단을 갖는 표적핵산만을 검출가능했던 단점을 해결하여, 증폭 산물의 양성 피드백 시스템을 통해 500mer 이상의 길이를 가지는 표적핵산도 높은 효율로 검출할 수 있는 장점이 있다..

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

전자파일 첨부하였음.

Claims

다음 구성요소를 포함하고, 표적핵산 검출을 위한 자가 프라이머 구조를 가지는 제1 헤어핀 프로브:

(i) 표적핵산과 상보적인 서열을 포함하는 헤어핀 프로브의 스템(stem)에 위치하는 X 부위;

(ii) 상기 X 부위와 연결되고, 표적핵산과 상보적인 서열을 가지고 헤어핀 프로브의 루프(loop)에 위치하는 L 부위;

(iii) 상기 L 부위에 연결되고, 상기 X 부위의 일부와 상보적인 서열을 포함하여 헤어핀 프로브의 스템을 형성하는 헤어핀의 자가 헤어핀 프라이머의 a 부위;

(iv) 상기 자가 헤어핀 프라이머의 a 부위와 연결되고 상기 X 부위의 일부와 상보적인 서열을 포함하여 헤어핀 프로브의 스템을 형성하는 자가 헤어핀 프라이머의 b 부위;

(v) 헤어핀 프로브의 3' 말단에 위치하고, 자가 헤어핀 프라이머의 b 부위에 연결되고, 상기 자가 헤어핀 프라이머의 a 부위와 상보적인 서열을 포함하는 자가 헤어핀 프라이머의 a' 부위; 및

(vi) 상기 X 부위와 연결되고, 절단효소 인식서열을 가지는 N 부위; 및

(vii) 헤어핀 브로브의 5' 말단에 위치하고, 상기 절단효소 인식 도메인과 연결되고, 트리거와 상보적인 서열을 포함하는 T' 부위.
다음 구성요소를 포함하고, 표적핵산 검출을 위한 표적 모방 핵산을 생성하는 제2 헤어핀 프로브:

(i) 표적핵산과 상보적인 서열을 포함하는 헤어핀 프로브의 스템(stem)에 위치하는 S 부위;

(ii) 상기 S 부위와 연결되고, 표적핵산과 상보적인 서열을 가지고 헤어핀 프로브의 루프(loop)에 위치하는 L2 부위;

(iii) 상기 L2 부위에 연결되고, 상기 S 부위의 상보적인 서열을 포함하여 헤어핀 프로브의 스템을 형성하는 S' 부위;

(iv) 상기 S' 부위에 연결되고, 절단효소 인식서열을 가지는 N 부위; 및

(v) 헤어핀 브로브의 5' 말단에 위치하고, 상기 절단효소 인식 도메인과 연결되고, 트리거와 상보적인 서열을 포함하는 T' 부위.
다음 단계를 포함하는 표적핵산의 검출방법:

(a) 표적핵산 함유 시료, 제1항의 자가 프라이머 구조를 가지는 제1 헤어핀 프로브, 제2항의 표적 모방 핵산을 생성하는 제2 헤어핀 프로브, 핵산 중합효소, 절단효소 및 dNTP를 포함하는 조성물을 반응시켜, 이중가닥 DNA 산물을 생성시키는 단계; 및

(b) 상기 생성된 이중가닥 DNA 산물을 분석하여 표적핵산을 검출하는 단계.
제3항에 있어서, 표적핵산은 DNA, RNA 및 DNA/RNA로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 이중가닥 DNA 산물 분석은 이중가닥 DNA를 인식하는 형광신호 물질로 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항의 자가 프라이머 구조를 가지는 제1 헤어핀 프로브, 제2항의 표적 모방 핵산을 생성하는 제2 헤어핀 프로브, 핵산 중합효소, 절단효소 및 dNTP를 포함하는 표적핵산 검출용 조성물.
제1항의 자가 프라이머 구조를 가지는 제1 헤어핀 프로브, 제2항의 제2 헤어핀 프로브, 핵산 중합효소, 절단효소 및 dNTP를 포함하는 표적핵산 검출용 키트.