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WO2021132591A1 - エクソン５０のスキッピングを誘導するアンチセンス核酸 - Google Patents

エクソン５０のスキッピングを誘導するアンチセンス核酸 Download PDF

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WO2021132591A1
WO2021132591A1 PCT/JP2020/048803 JP2020048803W WO2021132591A1 WO 2021132591 A1 WO2021132591 A1 WO 2021132591A1 JP 2020048803 W JP2020048803 W JP 2020048803W WO 2021132591 A1 WO2021132591 A1 WO 2021132591A1
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WO
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antisense oligomer
exon
pharmaceutically acceptable
acceptable salt
hydrate
Prior art date
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由輝子 塩谷
裕太 砂土居
玲子 脇
奏萌 鞭馬
武田　伸一
吉嗣 青木
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Nippon Shinyaku Co Ltd
National Center of Neurology and Psychiatry
Original Assignee
Nippon Shinyaku Co Ltd
National Center of Neurology and Psychiatry
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    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/33—Alteration of splicing

Definitions

  • the present invention relates to an antisense oligomer that induces skipping of the 50th exon of the human dystrophin gene and a pharmaceutical composition containing the antisense oligomer.
  • DMD Duchenne muscular dystrophy
  • Infants show almost the same motor function as healthy people, but muscle weakness is seen from around 4 to 5 years old. After that, muscle weakness of DMD patients progresses, and DMD patients become unable to walk by about 12 years old, and die from heart failure or respiratory failure in their 20s.
  • the dystrophin gene is located on the X chromosome and is a huge gene consisting of 2.2 million bases of DNA. It is transcribed from DNA to the pre-mRNA, and the intron is further removed by splicing, and 79 exons are bound to make the mRNA corresponding to the translation region 11,058 bases. This mRNA is translated into 3,685 amino acids to produce the dystrophin protein.
  • Dystrophin proteins are involved in maintaining muscle cell membrane stability and are required to make muscle cells less fragile. Since the dystrophin gene of DMD patients has a mutation, the dystrophin protein having a function in muscle cells is hardly expressed.
  • the structure of the muscle cell cannot be maintained, and a large amount of calcium ions flow into the muscle cell. As a result, a reaction similar to inflammation occurs, and fibrosis progresses, making it difficult for muscle cells to regenerate.
  • Becker-type muscular dystrophy is also caused by a mutation in the dystrophin gene, but its symptoms are generally milder than DMD, and the progression of muscle weakness is slower, often in adulthood, although it presents with muscle weakness due to muscle atrophy. Onset.
  • the difference in clinical symptoms between DMD and BMD is believed to be due to whether mutations disrupt or maintain the amino acid reading frame when dystrophin mRNA is translated into dystrophin protein (non-patented). Document 1). That is, in DMD, the dystrophin protein having a function is hardly expressed due to the mutation that shifts the amino acid reading frame, but in BMD, a part of exons is deleted due to the mutation, but the amino acid reading frame is maintained. Therefore, an incomplete but functional dystrophin protein is produced.
  • Exon skipping method is expected as a treatment method for DMD.
  • This method is a method of repairing the amino acid reading frame of dystrophin mRNA by modifying splicing and inducing the expression of a partially restored dystrophin protein (Non-Patent Document 2).
  • the amino acid sequence portion that is the target of exon skipping will be lost. Therefore, the dystrophin protein expressed by this treatment is shorter than that of the normal one, but the function of stabilizing muscle cells is partially retained because the amino acid reading frame is maintained. Therefore, exon skipping is expected to cause DMD to exhibit symptoms similar to milder BMD.
  • the exon skipping method has been clinically tested in human DMD patients through animal experiments with mice and dogs.
  • Exon skipping can be induced by binding of an antisense nucleic acid that targets either or both of the 5'or 3'splice sites, or the inside of the exon. Exons are included in the mRNA only if both splice sites are recognized by the spliceosome complex. Therefore, exon skipping can be induced by targeting the splice site with antisense nucleic acid. In addition, it is thought that SR protein binding to the exon splicing enhancer (ESE) is necessary for exons to be recognized by the splicing mechanism, and targeting the ESE can also induce exon skipping. it can.
  • ESE exon splicing enhancer
  • Non-Patent Document 3 Since mutations in the dystrophin gene differ depending on the DMD patient, antisense nucleic acids are required according to the location and type of gene mutation. So far, Antisense nucleic acids that induce exon skipping for all 79 exons have been produced by Steve Wilton et al. Of the University of Western Australia (Non-Patent Document 3), and 39 types by Annemieek Artsma-Rus et al. In the Netherlands. An antisense nucleic acid that induces exon skipping for exons has been produced (Non-Patent Document 4).
  • Non-Patent Document 5 About 4% of all DMD patients are considered to be treatable by skipping the 50th exon (hereinafter referred to as "exon 50") (Non-Patent Document 5). In recent years, studies targeting exon 50 of the dystrophin gene for exon skipping have been reported by a plurality of research institutes including the applicant (Patent Documents 1 to 6 and Non-Patent Document 6).
  • a novel antisense oligomer that highly efficiently induces skipping of exon 50 of the dystrophin gene is desired. Further, an antisense oligomer is desired, which maintains the activity of inducing the skipping of exon 50 of the dystrophin gene with high efficiency and has excellent physical characteristics (for example, solubility) as a medicine.
  • the present inventors have administered an antisense oligomer having the nucleotide sequence shown in any of SEQ ID NOs: 3 to 5 to humans. It has been found that the skipping of exon 50 of the dystrophin gene is highly efficiently induced. It was also found that the antisense oligomer has excellent solubility while inducing highly efficient skipping of exon 50 of the human dystrophin gene. The present inventors have completed the present invention based on this finding.
  • the present invention is as follows. [1] The following (a) to (d): (A) Antisense oligomer containing any of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3 to 5; (B) Exon 50 of the human dystrophin gene, which contains a base sequence in which 1 to 5 bases are deleted, substituted, inserted, and / or added to any of the base sequences of SEQ ID NOs: 3 to 5. Antisense oligomer with activity to induce skipping; (C) An antisense oligomer containing a base sequence having 80% or more sequence identity with respect to any of the base sequences of SEQ ID NOs: 3 to 5 and having an activity of inducing skipping of exon 50 of the human distrophin gene.
  • an antisense oligomer that hybridizes under stringent conditions with an oligonucleotide consisting of a base sequence complementary to any of the base sequences of SEQ ID NOs: 3 to 5, and is an exon 50 of the human distrophin gene.
  • An antisense oligomer selected from the group consisting of antisense oligomers having an activity of inducing skipping, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof.
  • An antisense oligomer that hybridizes under highly stringent conditions with an oligonucleotide consisting of a base sequence complementary to any of the base sequences of SEQ ID NOs: 3 to 5 and (h) an exon of the human distrophin gene.
  • An antisense oligomer selected from the group consisting of antisense oligomers having an activity of inducing skipping of 50 or a pharmaceutically acceptable salt thereof or a hydrate thereof.
  • the antisense oligomer It is an antisense oligomer having a nucleotide sequence having 90% or more sequence identity with respect to any of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3 to 5 and having an activity of inducing skipping of exon 50 of the human distrophin gene.
  • Stuff. [6] The sugar moiety of at least one nucleotide constituting the oligonucleotide has an -OH group at the 2'position of OR, R, R'OR, SH, SR, NH 2 , NHR, NR 2 , N 3 , CN, F.
  • the above R indicates alkyl or aryl, and the above R'indicates alkylene.
  • the phosphate binding moiety of at least one nucleotide constituting the oligonucleotide is selected from the group consisting of a phosphorothioate bond, a phosphorodithioate bond, an alkylphosphonate bond, a phosphoramidate bond, and a boranephosphate bond.
  • the 5'end is the following chemical formulas (1) to (3): The antisense oligomer according to [8] or [9] above, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof, which is the basis of any of the above. [11] The antisense oligomer according to any one of the above [1] to [10], a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof, wherein the length of the antisense oligomer is 19 or 20 bases. [12] A pharmaceutical composition for treating muscular dystrophy, which comprises the antisense oligomer according to any one of the above [1] to [11], a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof.
  • a method for treating muscular dystrophy which comprises the step of administering the pharmaceutical composition of the above to a patient with muscular dystrophy.
  • the pharmaceutical composition according to any one of. [22] The antisense oligomer according to [21] above or a pharmaceutically acceptable salt thereof or a hydrate thereof, or a pharmaceutical composition, wherein the patient with muscular dystrophy is a human in the treatment.
  • PMO No. The skipping efficiency of exon 50 of the human dystrophin gene in human rhabdomyosarcoma cells (RD cells) of antisense oligomers 1 and 2 is shown.
  • PMO No. The skipping efficiency of exon 50 of the human dystrophin gene in RD cells of antisense oligomers 1, 3, and 4 is shown.
  • PMO No. The skipping efficiency of exon 50 of the human dystrophin gene in RD cells of antisense oligomers 1, 5, 6 and 7 is shown.
  • the present invention provides an antisense oligomer (hereinafter referred to as "the antisense oligomer of the present invention") that efficiently skips the 50th exon of the human dystrophin gene.
  • the "gene” includes cDNA, pre-mRNA and mRNA in addition to the genomic gene.
  • the gene is a pre-mRNA, i.e. pre-mRNA.
  • the human dystrophin gene is located at locus Xp21.2.
  • the human dystrophin gene has a size of 2.2 million base pairs and is the largest known human gene.
  • the coding region of the human dystrophin gene is only 14 kb, and the coding region is dispersed in the dystrophin gene as 79 exons (Roberts, RG., Et al., Genomics, 16: 536-538 (Roberts, RG., Et al., Genomics, 16: 536-538). 1993); Koenig, M., et al., Cell 53 219-228, 1988).
  • Pre-mRNA a transcript of the human dystrophin gene, is spliced to produce 14 kb of mature mRNA.
  • the nucleotide sequence of the human wild-type dystrophin gene is known (GenBank Accession No. NM_004006).
  • the nucleotide sequence containing the exon 50 of the human wild-type dystrophin gene and the sequence near the 5'end of the intron 50 is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the antisense oligomer of the present invention was prepared for the purpose of modifying a protein encoded by a DMD-type dystrophin gene into a BMD-type dystrophin protein by skipping the exon 50 of the human dystrophin gene. Therefore, the exon 50 of the dystrophin gene, which is the target of exon skipping of the antisense oligomer, includes not only the wild type but also the mutant type.
  • the antisense oligomer of the present invention is the antisense oligomer according to any one selected from the group consisting of the following (a) to (d).
  • the antisense oligomer of the present invention is specifically the antisense oligomer according to any one selected from the group consisting of the following (e) to (h).
  • E An antisense oligomer consisting of any of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3 to 5;
  • F 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, or 1 base is deleted and / or substituted with respect to any of the base sequences of SEQ ID NOs: 3 to 5.
  • An antisense oligomer consisting of a base sequence and having an activity of inducing skipping of exon 50 of the human dystrophin gene; (G) Sequence identity of 80% or more, 84% or more, 85% or more, 89% or more, 90% or more, 94% or more, or 95% or more with respect to any of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3 to 5.
  • An antisense oligomer consisting of a base sequence having a nucleotide sequence of, and having an activity of inducing skipping of exon 50 of the human distrophin gene; and (h) an oligo consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 3 to 5.
  • An antisense oligomer that hybridizes with nucleotides under high stringent conditions and has the activity of inducing exon 50 skipping of the human distrophin gene.
  • the antisense oligomers (b) to (d) and the antisense oligomers (f) to (h) are specifically variants of the antisense oligomer of (a) and the antisense oligomer of (e), respectively. Yes, it is intended to deal with mutations (eg, polymorphisms) in the dystrophin gene of patients.
  • the "antisense oligomer that hybridizes under stringent conditions” refers to, for example, all or a part of an oligonucleotide having a base sequence complementary to any of the base sequences of SEQ ID NOs: 3 to 5. Refers to an antisense oligomer obtained by using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a southern hybridization method, or the like, using the above as a probe.
  • Hybridization methods include, for example, “Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001” and “Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 1987", etc. You can use the method described in.
  • the "stringent condition” may be any of a low stringent condition, a medium stringent condition, and a high stringent condition.
  • the "low stringent condition” is, for example, a condition of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 32 ° C.
  • the “medium stringent conditions” are, for example, 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 42 ° C. or 5 ⁇ SSC, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl ( The conditions are pH 7.5), 50% formamide, and 42 ° C.
  • “High stringent conditions” are, for example, (1) 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C., (2) 0.2 ⁇ SSC, 0.1%. SDS, 60 ° C, (3) 0.2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 62 ° C, (4) 0.2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 65 ° C, or (5) 0.1 ⁇ SSC , 0.1% SDS, 65 ° C., but is not limited to this. Under these conditions, it can be expected that an antisense oligomer having a higher sequence identity can be efficiently obtained as the temperature is raised.
  • sequence identity means the identity of a pair of two nucleic acids in the entire range of the base sequence to be compared, and is created by using a mathematical algorithm known in the technical field of the present invention. It is represented by the percentage of matching bases in the optimal alignment of the base sequences.
  • an antisense oligomer consisting of a base sequence having "80% sequence identity" with respect to an antisense oligomer consisting of a certain 20-base base sequence is 16 with respect to the above-mentioned 20-base antisense oligomer. It means an antisense oligomer having the same base as more than a base.
  • a commercially available kit for example, Alkaline Direct Labeling and Detection System (GE Healthcare) can be used.
  • the incubation with the labeled probe was performed overnight according to the protocol attached to the kit, and then the membrane was subjected to a primary wash buffer containing 0.1% (w / v) SDS under 55 ° C. conditions. After washing, hybridized antisense oligomers can be detected.
  • the probe when preparing a probe based on all or part of a base sequence complementary to any of the base sequences of SEQ ID NOs: 3 to 5, a commercially available reagent (for example, PCR Labeling Mix (Roche Diagnostics) ) Etc.), the probe can be labeled with digoxigenin (DIG), and hybridization can be detected using a DIG nucleic acid detection kit (Roche Diagnostics).
  • DIG digoxigenin
  • the antisense oligomer that can be hybridized is 90% or more of the base sequence of any of SEQ ID NOs: 3 to 5 when calculated using the default parameters by homology search software such as FASTA and BLAST. , 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99 Antisense oligomers with sequence identity of 3.3% or higher, 99.4% or higher, 99.5% or higher, 99.6% or higher, 99.7% or higher, 99.8% or higher, or 99.9% or higher. Can be given.
  • sequence identity is determined by FASTA (Science 227 (4693): 1435-1441, (1985)) and the algorithm BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) by Carlin and Arthur (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264). -2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993) can be used for determination.
  • Programs called blastn, blastx, tblastn and tblastx based on the BLAST algorithm have been developed (Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990).
  • BLAST and Gapped BLAST programs use the default parameters of each program.
  • “Inducing (enabling) skipping of the 50th exon of the human dystrophin gene” means a site corresponding to exon 50 and / or its adjacent intron of a transcript of the human dystrophin gene (eg, pre-mRNA).
  • exon 50 is excluded when the transcript is spliced, for example, in the case of a DMD patient lacking exon 51, it corresponds to the 3'end of exon 49. This means that the base sequence corresponding to the 5'end of exon 52 is linked to the base sequence to form a mature mRNA in which no frame shift of codons has occurred.
  • DMD patients with a mutation in the dystrophin gene that is the target of exon 50 skipping can be treated by exon 50 skipping.
  • DMD patients include DMD patients having a frameshift mutation due to a deletion of exson at least in the vicinity of exon 50 and having a dystrophin gene whose amino acid reading frame is modified by skipping exxon 50. More specifically, for example, DMD patients having a frameshift mutation due to having a deletion of the dystrophin gene exxon 51, 51-53, 51-55, 51-57, etc. can be mentioned.
  • binding means that when the antisense oligomer of the present invention and a transcript of the human dystrophin gene are mixed, they hybridize under physiological conditions to form a double strand.
  • physiological conditions mean conditions adjusted to a pH, salt composition, and temperature similar to those in a living body.
  • the condition is 25 to 40 ° C., preferably 37 ° C., pH 5 to 8, preferably pH 7.4, and the sodium chloride concentration is 150 mM.
  • Whether or not skipping of the exon 50 of the human dystrophin gene has occurred is determined by introducing the antisense oligomer of the present invention into dystrophin-expressing cells (for example, human dystrophin myoma cells) and using the total RNA of the dystrophin-expressing cells to determine whether or not human dystrophin is skipped. It can be confirmed by RT-PCR amplification of the peripheral region of exon 50 of the gene mRNA and performing nested PCR or sequence analysis on the PCR amplification product.
  • dystrophin-expressing cells for example, human dystrophin myoma cells
  • the skipping efficiency ES (unit:%) was such that the mRNA of the human dystrophin gene was recovered from the test cells, and among the mRNA, the amount of polynucleotide "A" in the band skipped by exon 50 and the amount of polynucleotide "A” skipped by exon 50 were not skipped.
  • the amount of polynucleotide "B” in the band can be measured and calculated according to the following formula (1) based on the measured values of these "A" and "B". For the calculation of skipping efficiency, International Publication No. 2012/029986 can be referred to.
  • the antisense oligomer of the present invention exons with an efficiency of 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more. Skip 50.
  • Examples of the antisense oligomer of the present invention include 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 or 35. Examples thereof include oligonucleotides, morpholino oligomers, and peptide nucleic acid (PNA) oligomers having a base length. The length of the antisense oligomer is preferably 16 to 25 bases, 16 to 23 bases, 19 bases or 20 bases, and morpholino oligomer is preferable.
  • oligonucleotide of the present invention is an antisense oligomer of the present invention having a nucleotide as a constituent unit, and such a nucleotide may be a ribonucleotide, a deoxyribonucleotide, or a modified nucleotide. Good.
  • a modified nucleotide means a ribonucleotide or a deoxyribonucleotide in which all or part of the nucleobase, sugar moiety, and phosphate binding moiety that composes the ribonucleotide or deoxyribonucleotide is modified.
  • examples of the nucleobase include adenine, guanine, hypoxanthine, cytosine, thymine, uracil, and modified bases thereof.
  • modified bases include, for example, pseudouracil, 3-methyluracil, dihydrouracil, 5-alkylcytocin (eg, 5-methylcitosin), 5-alkyluracil (eg, 5-ethyluracil), 5-halouracil (5).
  • 6-azapyrimidine 6-alkylpyrimidine (6-methyluracil), 2-thiouracil, 4-thiouracil, 4-acetylcitosine, 5- (carboxyhydroxymethyl) uracil, 5'-carboxymethylaminomethyl -2-thiouracil, 5-carboxymethylaminomethyluracil, 1-methyladenine, 1-methylhypoxanthin, 2,2-dimethylguanine, 3-methylcytosine, 2-methyladenine, 2-methylguanine, N6-methyladenine , 7-Methylguanine, 5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil, 5-methylaminomethyluracil, 5-methylcarbonylmethyluracil, 5-methyloxyuracil, 5-methyl-2-thiouracil, 2-methylthio-N6- Examples include, but are not limited to, isopentenyladenin, uracil-5-oxyacetic acid, 2-thiocitosine, purine, 2,
  • Modifications of the sugar moiety include, for example, modification of the 2'position of ribose and modification of other moieties of sugar.
  • the modification of the 2'position of ribose for example, the -OH group at the 2'position of ribose is OR, R, R'OR, SH, SR, NH 2 , NHR, NR 2 , N 3 , CN, F, Cl. , Br, I can be mentioned.
  • R represents alkyl or aryl.
  • Modifications of other portions of sugar include, for example, those in which the O at the 4'position of ribose or deoxyribose is replaced with S, those in which the 2'and 4'positions of sugar are crosslinked, for example, LNA (Locked Nucleic Acid). ) Or ENA (2'-O, 4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids) and the like, but are not limited thereto.
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • ENA 2'-O, 4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids
  • the phosphodiester bond is a phosphorothioate bond, a phosphorodithioate bond, an alkylphosphonate bond, a phosphoramidate bond, and a boranophosphate bond (Enya et al: Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008). , 18, 9154-9160) (see, for example, Patent Republishing Publication Nos. 2006/129594 and 2006/038608).
  • alkyl a linear or branched alkyl having 1 to 6 carbon atoms is preferable. Specific examples thereof include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl, tert-pentyl, n-hexyl and isohexyl. Be done.
  • the alkyl may be substituted, and examples of such substituents include halogen, alkoxy, cyano, and nitro, and 1 to 3 of these may be substituted.
  • the cycloalkyl is preferably a cycloalkyl having 5 to 12 carbon atoms. Specific examples thereof include cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, cyclodecyl and cyclododecyl.
  • examples of the halogen include fluorine, chlorine, bromine and iodine.
  • Alkoxy includes linear or branched alkoxy having 1 to 6 carbon atoms, for example, methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, n-butoxy, isobutoxy, sec-butoxy, tert-butoxy, n-. Examples thereof include pentyloxy, isopentyloxy, n-hexyloxy, isohexyloxy and the like. In particular, alkoxy having 1 to 3 carbon atoms is preferable.
  • the aryl is preferably an aryl having 6 to 10 carbon atoms. Specifically, for example, phenyl, ⁇ -naphthyl, ⁇ -naphthyl can be mentioned. Phenyl is particularly preferable.
  • the aryl may be substituted, and examples of such substituents include alkyl, halogen, alkoxy, cyano, and nitro, and 1 to 3 of these may be substituted.
  • the alkylene a linear or branched alkylene having 1 to 6 carbon atoms is preferable.
  • examples of the acyl include linear or branched alkanoyl or aloyl.
  • alkanoyl include formyl, acetyl, 2-methylacetyl, 2,2-dimethylacetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, pentanoyl, 2,2-dimethylpropionyl, hexanoyl and the like.
  • aloyl include benzoyl, toluoil, and naphthoyl. Such aloyl may be substituted at a substitutable position or may be substituted with an alkyl.
  • the oligonucleotide of the present invention preferably has a group represented by the following general formula as a constituent unit in which the -OH group at the 2'position of ribose is replaced with methoxy and the phosphate binding moiety is a phosphorothioate bond.
  • Antisense oligomer In the formula, Base represents a nucleobase.
  • the oligonucleotide of the present invention can be easily synthesized using various automatic synthesizers (for example, AKTA oligopilot plus 10/100 (GE Healthcare)), or can be easily synthesized by a third party organization (for example, Promega, Inc.). It can also be manufactured by outsourcing to Takara Co., Ltd. or Nippon Bioservice Co., Ltd.).
  • automatic synthesizers for example, AKTA oligopilot plus 10/100 (GE Healthcare)
  • a third party organization for example, Promega, Inc.
  • It can also be manufactured by outsourcing to Takara Co., Ltd. or Nippon Bioservice Co., Ltd.).
  • the morpholino oligomer of the present invention is an antisense oligomer of the present invention having a group represented by the following general formula as a constituent unit.
  • Base is synonymous with the above; W represents a group represented by any of the following equations.
  • X represents -CH 2 R 1 , -O-CH 2 R 1 , -S-CH 2 R 1 , -NR 2 R 3 or F;
  • R 1 represents H, alkyl;
  • R 2 and R 3 represent H, alkyl, cycloalkyl, or aryl, the same or different;
  • Y 1 represents O, S, CH 2 or NR 1 ;
  • Y 2 represents O, S or NR 1 ;
  • Z represents O or S.
  • Examples of the morpholinomonomer compound used for the synthesis of the morpholino oligomer of the present invention include the following morpholinomonomer compound (A), morpholinomonomer compound (C), morpholinomonomer compound (T), and morpholinomonomer compound (G). However, it is not limited to these.
  • the morpholino oligomer is preferably an oligomer having a group represented by the following formula as a constituent unit (phosphologiamidate morpholino oligomer (hereinafter referred to as “PMO”)).
  • PMO phosphologiamidate morpholino oligomer
  • Base, R 2 and R 3 have the same meanings as described above.
  • the morpholino oligomer of the present invention includes nucleobases, morpholino ring moieties, phosphate binding moieties, and all or part of the 3'end and / or 5'end that make up such oligomers.
  • Modifications of the phosphate binding moiety include, for example, phosphorodiamidate binding, phosphorothioate binding, phosphorodithioate binding, alkylphosphonate binding, phosphoroamidate binding, borane phosphate bond (Enya et al., Bioorganic & Medicinal). Chemistry, 2008, 18, 9154-9160) can be mentioned (see, for example, Patent Republishing Publications 2006/129594 and 2006/038608).
  • Morpholine oligomers can be prepared, for example, in accordance with WO 1991/090333 or WO 2009/064471.
  • the PMO can be produced according to the method described in WO 2009/064471, or can be produced according to the method shown below.
  • PMO manufacturing method As one aspect of the PMO, for example, a compound represented by the following general formula (I) (hereinafter referred to as PMO (I)) can be mentioned.
  • PMO (I) a compound represented by the following general formula (I) (hereinafter referred to as PMO (I))
  • PMO (I) a compound represented by the following general formula (I)
  • each Base, R 2 and R 3 are synonymous with the above;
  • n is any integer in the range 1-99, preferably any integer in the range 15-34, 15-24 or 15-22, more preferably 18 or 19. is there.
  • n is any integer in the range 1-99, preferably any integer in the range 15-34, 15-24 or 15-22, more preferably 18 or 19. is there.
  • PMO (I) can be produced according to a known method, and can be produced, for example, by carrying out the following steps.
  • the compounds and reagents used in the following steps are not particularly limited as long as they are generally used in the production of PMO.
  • all the following steps can be carried out by the liquid phase method or the solid phase method (manual or using a commercially available solid phase automatic synthesizer).
  • a method using an automatic synthesizer is desirable from the viewpoint of simplification of the operation procedure and accuracy of synthesis.
  • Step A By allowing an acid to act on the compound represented by the following general formula (II) (hereinafter referred to as compound (II)), the compound represented by the following general formula (III) (hereinafter referred to as compound (III)). .) The process of manufacturing.
  • n, R 2 and R 3 are synonymous with the above; Each BP independently represents a nucleobase that may be protected; T represents a trityl group, a monomethoxytrityl group, or a dimethoxytrityl group; L represents hydrogen, an acyl, or a group represented by the following general formula (IV) (hereinafter referred to as a group (IV)).
  • nucleobase related to BP
  • the same “nucleobase” as Base can be mentioned.
  • the amino group or hydroxyl group of the nucleobase related to BP may be protected.
  • the protecting group for such an amino group is not particularly limited as long as it is used as a protecting group for a nucleic acid, and specifically, for example, benzoyl, 4-methoxybenzoyl, acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, and phenylacetyl. , Phenoxyacetyl, 4-tert-butylphenoxyacetyl, 4-isopropylphenoxyacetyl, (dimethylamino) methylene.
  • the protecting group for the hydroxyl group includes, for example, 2-cyanoethyl, 4-nitrophenethyl, phenylsulfonylethyl, methylsulfonylethyl, trimethylsilylethyl, and 1 to 5 electron-withdrawing groups at arbitrary substitutable positions.
  • the “solid phase carrier” is not particularly limited as long as it is a carrier that can be used for the solid phase reaction of nucleic acid, and for example, (i) reagents that can be used for the synthesis of morpholino nucleic acid derivatives (for example, dichloromethane, acetonitrile, tetrazole, etc. It is almost insoluble in N-methylimidazole, pyridine, anhydrous acetic acid, lutidine, trifluoroacetic acid), is chemically stable to reagents that can be used for the synthesis of (ii) morpholino nucleic acid derivatives, and (iii) is chemically modified.
  • morpholino nucleic acid derivatives for example, dichloromethane, acetonitrile, tetrazole, etc. It is almost insoluble in N-methylimidazole, pyridine, anhydrous acetic acid, lutidine, trifluoroacetic acid
  • swellable polystyrene for example, aminomethylpolystyrene resin 1% divinylbenzene crosslinked (200 to 400 mesh) (2.4 to 3.0 mmol / g) (manufactured by Tokyo Kasei Co., Ltd.), Aminomethylated Polystyrene Resin ⁇ HCl [ Divinylbenzene 1%, 100-200 mesh] (manufactured by Peptide Research Institute), non-swelling polystyrene (eg, Primer Support (manufactured by GE Healthcare)), PEG chain-linked polystyrene (eg, NH 2- PEG resin) Watanabe Kagaku Co., Ltd.), TentaGel resin), polystyrene (for example, aminomethylpolystyrene resin 1% divinylbenzene crosslinked (200 to 400 mesh) (2.4 to 3.0 mmol / g) (manufactured by Tokyo Kasei Co., Ltd
  • This step can be carried out by allowing an acid to act on compound (II).
  • Examples of the "acid” that can be used in this step include trifluoroacetic acid, dichloroacetic acid, and trichloroacetic acid.
  • the amount of the acid used is, for example, preferably in the range of 0.1 molar equivalent to 1000 molar equivalent, preferably in the range of 1 molar equivalent to 100 molar equivalent, relative to 1 mol of compound (II).
  • an organic amine can be used together with the acid.
  • the organic amine is not particularly limited, and examples thereof include triethylamine.
  • the amount of the organic amine used is, for example, preferably in the range of 0.01 molar equivalent to 10 molar equivalent, preferably in the range of 0.1 molar equivalent to 2 molar equivalent, relative to 1 mol of acid. ..
  • a salt or mixture of an acid and an organic amine is used in this step, for example, a salt or a mixture of trifluoroacetic acid and triethylamine can be mentioned, and more specifically, with respect to 2 equivalents of trifluoroacetic acid.
  • a mixture of 1 equivalent of triethylamine can be mentioned.
  • the acid that can be used in this step can also be diluted with an appropriate solvent so as to have a concentration in the range of 0.1% to 30%.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, acetonitrile, alcohols (ethanol, isopropanol, trifluoroethanol, etc.), water, or a mixture thereof.
  • the reaction temperature in the above reaction is, for example, preferably in the range of 10 ° C. to 50 ° C., more preferably in the range of 20 ° C. to 40 ° C., and further preferably in the range of 25 ° C. to 35 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of acid used and the reaction temperature, but is usually in the range of 0.1 minutes to 24 hours. Preferably, it is in the range of 1 minute to 5 hours.
  • a base can be added to neutralize the acid present in the system, if necessary.
  • the “base” is not particularly limited, and examples thereof include diisopropylethylamine.
  • the base can also be used by diluting it with a suitable solvent so that the concentration is in the range of 0.1% (v / v) to 30% (v / v).
  • the solvent used in this step is not particularly limited as long as it is not involved in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, acetonitrile, alcohols (ethanol, isopropanol, trifluoroethanol, etc.), water, or a mixture thereof.
  • the reaction temperature is, for example, preferably in the range of 10 ° C.
  • reaction time varies depending on the type of base used and the reaction temperature, but is usually preferably in the range of 0.1 minutes to 24 hours, preferably in the range of 1 minute to 5 hours.
  • Step 1 A step of producing a compound represented by the following general formula (VI) (hereinafter referred to as compound (VI)) by allowing an acylating agent to act on the compound represented by the following general formula (V).
  • a compound represented by the following general formula (VI) hereinafter referred to as compound (VI)
  • an acylating agent to act on the compound represented by the following general formula (V).
  • This step can be carried out by introducing a known linker using compound (V) as a starting material.
  • the compound represented by the following general formula (VIa) can be produced by carrying out a method known as an esterification reaction using compound (V) and succinic anhydride.
  • BP and T are synonymous with the above.
  • Step 2 A step of producing compound (IIa) by reacting compound (VI) with a solid phase carrier by allowing a condensing agent or the like to act on the compound (VI).
  • B P, R 4, T, linker, solid support, as defined above. This step can be produced by a method known as a condensation reaction using compound (VI) and a solid phase carrier.
  • n 2 to 99 (preferably any integer in the range 16 to 35, 16 to 25 or 16 to 23, preferably 19 or 20), L.
  • the compound represented by the following general formula (IIa2), which is based on (IV), uses the compound (IIa) as a starting material, and desires step A and step B according to the method for producing PMO described in the present specification.
  • n'is 1 to 98 in a particular embodiment, n'is, for example, 1 to 34, 1 to 24, 1 to 23, 1 to 22, 1 to 21, 1 to 20, 1 to 19, 1 to 18; 1 to 17, 1 to 16, 1 to 15).
  • Step B A step of producing a compound represented by the following general formula (VII) (hereinafter referred to as compound (VII)) by allowing a morpholino monomer compound to act on compound (III) in the presence of a base.
  • VII general formula
  • This step can be carried out by allowing the morpholino monomer compound to act on the compound (III) in the presence of a base.
  • Examples of the morpholinomonomer compound include a compound represented by the following general formula (VIII). [In the formula, BP , R 2 , R 3 , and T are synonymous with the above. ]
  • Examples of the "base” that can be used in this step include diisopropylethylamine, triethylamine, and N-ethylmorpholine. The amount of the base used is, for example, appropriately in the range of 1 molar equivalent to 1000 molar equivalents, preferably in the range of 10 molar equivalents to 100 molar equivalents, relative to 1 mol of compound (III).
  • the morpholinomonomer compound and base that can be used in this step can also be diluted with an appropriate solvent so as to have a concentration of 0.1% to 30%.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include N, N-dimethylimidazolidone, N-methylpiperidone, DMF, dichloromethane, acetonitrile, terrorahydrofuran, or a mixture thereof.
  • the reaction temperature is, for example, preferably in the range of 0 ° C. to 100 ° C., more preferably in the range of 10 ° C. to 50 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of base used and the reaction temperature, but is usually in the range of 1 minute to 48 hours, preferably in the range of 30 minutes to 24 hours.
  • an acylating agent can be added as needed.
  • the "acylating agent” include acetic anhydride, chloride acetate, and phenoxyacetic anhydride.
  • the acylating agent can also be used, for example, diluted with an appropriate solvent so as to have a concentration in the range of 0.1% to 30%.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, acetonitrile, tetrahydrofuran, alcohols (ethanol, isopropanol, trifluoroethanol, etc.), water, or a mixture thereof.
  • bases such as pyridine, lutidine, colisine, triethylamine, diisopropylethylamine, and N-ethylmorpholine can be used together with the acylating agent.
  • the amount of the acylating agent used is preferably in the range of 0.1 molar equivalent to 10000 molar equivalent, and more preferably in the range of 1 molar equivalent to 1000 molar equivalent.
  • the amount of the base used is, for example, preferably in the range of 0.1 molar equivalent to 100 molar equivalent, preferably in the range of 1 molar equivalent to 10 molar equivalent, relative to 1 mol of the acylating agent.
  • the reaction temperature of this reaction is preferably in the range of 10 ° C.
  • reaction time varies depending on, for example, the type of acylating agent used and the reaction temperature, but is usually preferably in the range of 0.1 minutes to 24 hours, preferably in the range of 1 minute to 5 hours.
  • Step C In the compound (VII) produced in step B, a step of removing a protecting group using a deprotecting agent to produce a compound represented by the general formula (IX).
  • a step of removing a protecting group using a deprotecting agent to produce a compound represented by the general formula (IX).
  • This step can be carried out by allowing a deprotecting agent to act on compound (VII).
  • Examples of the "deprotecting agent” include concentrated aqueous ammonia and methylamine.
  • the "deprotecting agent” that can be used in this step is, for example, diluted with water, methanol, ethanol, isopropyl alcohol, acetonitrile, tetrahydrofuran, DMF, N, N-dimethylimidazolidone, N-methylpiperidone or a mixed solvent thereof. It can also be used. Of these, ethanol is preferable.
  • the amount of the deprotecting agent used is, for example, preferably in the range of 1 mol equivalent to 100,000 molar equivalents, preferably in the range of 10 molar equivalents to 1000 molar equivalents, relative to 1 mol of compound (VII). Is.
  • the reaction temperature is, for example, appropriately in the range of 15 ° C. to 75 ° C., preferably in the range of 40 ° C. to 70 ° C., and more preferably in the range of 50 ° C. to 60 ° C.
  • the deprotection reaction time varies depending on the type of compound (VII), reaction temperature, etc., but is appropriately in the range of 10 minutes to 30 hours, preferably in the range of 30 minutes to 24 hours, and more preferably 5 It is in the range of hours to 20 hours.
  • Step D A step of producing PMO (I) by allowing an acid to act on the compound (IX) produced in step C.
  • This step can be carried out by adding an acid to compound (IX).
  • Examples of the "acid” that can be used in this step include trichloroacetic acid, dichloroacetic acid, acetic acid, phosphoric acid, hydrochloric acid and the like.
  • the amount of the acid used for example, it is appropriate to use the solution so that the pH is in the range of 0.1 to 4.0, and more preferably in the range of 1.0 to 3.0.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include acetonitrile, water, and a mixed solvent thereof.
  • the reaction temperature is preferably in the range of 10 ° C. to 50 ° C., more preferably in the range of 20 ° C. to 40 ° C., and even more preferably in the range of 25 ° C. to 35 ° C.
  • the deprotection reaction time varies depending on the type of compound (IX), reaction temperature, etc., but is preferably in the range of 0.1 minutes to 5 hours, preferably in the range of 1 minute to 1 hour, and more preferably. Is in the range of 1 to 30 minutes.
  • PMO (I) are conventional separation and purification means from the reaction mixture obtained in this step, for example, extraction, concentration, neutralization, filtration, centrifugation, recrystallization, reversed phase column chromatography from C 8 C 18, It can be obtained by using means such as cation exchange column chromatography, anion exchange column chromatography, gel filtration column chromatography, high-speed liquid chromatography, dialysis, and limit filtration alone or in combination, and a desired PMO (I) can be obtained. ) Can be isolated and purified (see, eg, WO 1991/09033).
  • a mixed solution of, for example, 20 mM triethylamine / acetate buffer and acetonitrile can be used as the elution solvent.
  • purifying PMO (I) by ion exchange chromatography for example, a mixed solution of 1 M saline solution and 10 mM sodium hydroxide aqueous solution can be used.
  • the peptide nucleic acid is an antisense oligomer of the present invention having a group represented by the following general formula as a constituent unit. (In the formula, Base is synonymous with the above.)
  • Peptide nucleic acids can be produced, for example, according to the following literature. 1) P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt, Science, 254, 1497 (1991) 2) M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg, Jacs., 114, 1895 (1992) 3) K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt, J. Org. Chem., 59, 5767 (1994) 4) L.
  • the 5'end may be a group according to any of the following chemical formulas (1) to (3). It is preferably (3) -OH.
  • the groups represented by the above (1), (2) and (3) are referred to as “group (1)”, “group (2)” and “group (3)”, respectively.
  • the stereochemistry of the phosphorus atom may contain a compound that is optically pure.
  • a person skilled in the art can obtain a pure optically active substance from a mixture of isomers (International Publication No. 2017/024264).
  • the antisense oligomer of the present invention may be synthesized as a pure optically active substance.
  • a person skilled in the art can control the synthesis reaction to obtain a pure optically active substance (Publication Patent Publication No. 2018-537952).
  • the antisense oligomer of the present invention is a complex with a functional peptide aimed at improving efficacy (for example, a membrane-permeable peptide aimed at improving transport efficiency to target cells). It may be formed (International Publication No. 2008/036127, International Publication No. 2009/005793, International Publication No. 2012/150960, International Publication No. 2016/187425, International Publication No. 2018/118662. , International Publication No. 2018/118599, International Publication No.
  • the binding site is not particularly limited, but it is preferable that the 5'-terminal or 3'-terminal of the antisense oligomer is bound to the amino-terminal or carboxyl-terminal of the functional peptide.
  • the antisense oligomer of the present invention and the functional peptide may form a complex via a linker.
  • the linker is not particularly limited, but the 5'end or 3'end of the antisense oligomer is bound to one end of the linker, and the amino terminus or carboxyl terminus of the functional peptide is bound to the other end of the linker. Is preferable. In addition, additional amino acids may be present between the functional peptide and the linker.
  • the antisense oligomer of the present invention can induce skipping of exon 50 with high efficiency even when its length is shorter than that of the antisense oligomer according to the prior art.
  • the antisense oligomer of the present invention has excellent solubility while maintaining the activity of inducing skipping of exon 50 with high efficiency. Therefore, any DMD patient with a mutation in the dystrophin gene that is subject to skipping of Exxon 50 (eg, frameshift mutation, missense mutation / nonsense mutation in Exxon 50, etc.) will have the antisense of the invention. It is predicted that the administration of oligomers can alleviate the symptoms of muscle dystrophy with high efficiency.
  • the symptoms of muscular dystrophy can be alleviated with high efficiency by administering the antisense oligomer of the present invention to a DMD patient having a predetermined mutant dystrophin gene lacking an exon at least in the vicinity of exon 50. ..
  • the predetermined mutant dystrophin gene is a dystrophin gene in which the reading frame of an amino acid is modified when at least an exon near exon 50 is deleted to have a frameshift mutation and the exon 50 is omitted (when skipped). Means. DMD patients with frameshift mutations due to having deletions of exons 51, 51-53, 51-55, 51-57, etc. can be mentioned.
  • the pharmaceutical composition containing the antisense oligomer of the present invention is subjected to DMD patients (patients having a mutation that in-frames with Exxon 50 skipping, for example, Exxon 51-deficient patients, Exxon 51-53 deletion). It is predicted that administration to patients, exxon 51-55 deficient patients, exxon 51-57 deficient patients, etc.) can alleviate the symptoms of muscular dystrophy with high efficiency.
  • DMD patients patients having a mutation that in-frames with Exxon 50 skipping, for example, Exxon 51-deficient patients, Exxon 51-53 deletion.
  • administration to patients, exxon 51-55 deficient patients, exxon 51-57 deficient patients, etc. can alleviate the symptoms of muscular dystrophy with high efficiency.
  • the pharmaceutical composition containing the antisense oligomer of the present invention is used, the same therapeutic effect can be obtained even with a small dose as compared with the oligomer according to the prior art, so that side effects can be reduced and
  • composition of the present invention a pharmaceutical composition for treating muscular dystrophy containing the antisense oligomer of the present invention, a pharmaceutically acceptable salt or hydrate thereof as an active ingredient (hereinafter, referred to as "composition of the present invention").
  • composition of the present invention a pharmaceutically acceptable salt or hydrate thereof as an active ingredient
  • the present invention also provides a method for treating muscular dystrophy, which comprises the step of administering the antisense oligomer of the present invention to a DMD patient.
  • the antisense oligomer of the present invention may be administered as the pharmaceutical composition for treating muscular dystrophy. Furthermore, the present invention provides the use of the antisense oligomer of the present invention in the production of a pharmaceutical composition for treating muscular dystrophy, and the antisense oligomer of the present invention for use in the treatment of muscular dystrophy.
  • Examples of pharmaceutically acceptable salts of the antisense oligomers of the invention contained in the compositions of the invention include alkali metal salts such as sodium salts, potassium salts, lithium salts, calcium salts, magnesium salts and the like. Alkaline earth metal salts; metal salts such as aluminum salts, iron salts, zinc salts, copper salts, nickel salts, cobalt salts; ammonium salts; t-octylamine salts, dibenzylamine salts, morpholin salts, glucosamine salts, phenylglycine Alkyl ester salt, ethylenediamine salt, N-methylglucamine salt, guanidine salt, diethylamine salt, triethylamine salt, dicyclohexylamine salt, N, N'-dibenzylethylenediamine salt, chloroprocine salt, prokine salt, diethanolamine salt, N-benzyl -Organic amine salts such as phenethylamine salt
  • Hydrochlorides Inorganic acid salts such as nitrates, perchlorates, sulfates, phosphates; Lower alcan sulfonates such as methane sulfonates, trifluoromethane sulfonates, ethane sulfonates; benzene Alyl sulfonates such as sulfonates, p-toluene sulfonates; organics such as acetates, malates, fumarates, succinates, citrates, tartrates, oxalates, maleates.
  • Acid salts examples include glycine salts, lysine salts, arginine salts, ornithine salts, glutamate salts, amino acid salts such as asparaginate salts. These salts can be produced by known methods. Alternatively, the antisense oligomer of the invention contained in the composition of the invention may be in the form of its hydrate.
  • the administration form of the composition of the present invention is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable administration form, and can be selected according to the treatment method, but from the viewpoint of ease of delivery to muscle tissue, intravenously.
  • Intra-arterial administration, intra-arterial administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, oral administration, intra-tissue administration, transdermal administration and the like are preferable.
  • the dosage form that the composition of the present invention can take is not particularly limited, and examples thereof include various injections, oral preparations, drip infusions, inhalants, ointments, lotions, and the like.
  • the composition of the invention can include a carrier that facilitates delivery of the oligomer to muscle tissue.
  • a carrier is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, and examples thereof include a cationic carrier such as a cationic liposome and a cationic polymer, or a carrier utilizing a viral envelope. ..
  • cationic liposomes include liposomes formed containing 2-O- (2-diethylaminoethyl) carbamoyl-1,3-O-dioreoilglycerol and phospholipids as essential constituents (hereinafter, "liposomes A").
  • Examples of the cationic polymer include JetSI (registered trademark) (manufactured by Qbiogene) and Jet-PEI (registered trademark) (polyethyleneimine, manufactured by Qbiogene).
  • Examples of the carrier using the virus envelope include GenomeOne (registered trademark) (HVJ-E liposome, manufactured by Ishihara Sangyo Co., Ltd.).
  • the pharmaceutical device described in Japanese Patent No. 2924179, the cationic carrier described in Patent Republishing Publication No. 2006/129594 and Patent Republishing Publication No. 2008/096690 can also be used.
  • US Pat. Nos. 4,235,871, 4,737,323, WO 96/14057 "New RRC, Liposomes: A practical approach, IRL Press, Oxford (1990) pages 33-" 104 ”etc. can be referred to.
  • the concentration of the antisense oligomer of the present invention contained in the composition of the present invention varies depending on the type of carrier and the like, but in one embodiment, the range of 0.1 nM to 100 ⁇ M is appropriate, and the concentration is in the range of 100 nM to 10 ⁇ M. Is preferable.
  • the weight ratio of the antisense oligomer of the present invention to the carrier (carrier / antisense oligomer of the present invention) contained in the composition of the present invention varies depending on the properties of the oligomer, the type of the carrier, and the like. The range of 1 to 100 is suitable, and the range of 0.1 to 10 is preferable.
  • composition of the present invention may be in the form of an aqueous solution.
  • the composition of the present invention contains the antisense oligomer of the present invention in an amount of 2.5 to 500 mg / mL, 5 to 450 mg / mL, 10 to 400 mg / mL, 15 to 350 mg / mL, 20 to 300 mg / mL.
  • the composition of the present invention contains the antisense oligomer of the present invention in an amount of 10 to 100 mg / mL, 15 to 95 mg / mL, 20 to 80 mg / mL, 25 to 75 mg / mL, 30 to 70 mg / mL, 35 to 65 mg.
  • the composition of the present invention may be in a dry form.
  • the composition of the present invention in a dry form containing 125 mg or 250 mg of the antisense oligomer of the present invention in a dry form is added to 0.5 mL to 100 mL of water.
  • the antisense oligomer concentration of the present invention of 1.25 mg / mL to 250 mg / mL or 2.5 mg / mL to 500 mg / mL
  • preferably mixed with 1 mL to 50 mL of water 2.
  • composition of the present invention may optionally contain a pharmaceutically acceptable additive.
  • additives include, for example, emulsifying aids (eg, fatty acids having 6 to 22 carbon atoms and pharmaceutically acceptable salts thereof, albumin, dextran), stabilizers (eg, cholesterol, phosphatidic acid, sucrose, mannitol, etc.).
  • Sorbitol, xylitol Sorbitol, xylitol
  • isotonic agents eg sodium chloride, glucose, maltose, lactose, sucrose, trehalose, mannitol, sorbitol, xylitol
  • pH regulators eg hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, acetic acid, sodium hydroxide
  • Potassium hydroxide Triethanolamine
  • the composition of the present invention can be prepared by adding the antisense oligomer of the present invention to the dispersion liquid of the carrier and stirring appropriately. Further, the additive can be added in an appropriate step before or after the addition of the antisense oligomer of the present invention.
  • the aqueous solvent that can be used when adding the antisense oligomer of the present invention is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, and for example, water for injection. , Distilled water for injection, electrolyte solution such as physiological saline, and sugar solution such as glucose solution and maltose solution. Further, conditions such as pH and temperature in such a case can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the composition of the present invention can be, for example, a liquid preparation or a lyophilized preparation thereof.
  • the lyophilized preparation can be prepared by freeze-drying the composition of the present invention having the form of a liquid agent by a conventional method. For example, after appropriately sterilizing the composition of the present invention having the form of a liquid preparation, a predetermined amount is dispensed into a vial, and pre-freezing is performed under the condition of about -40 to -20 ° C for about 2 hours. Then, the primary drying can be performed at about 0 to 10 ° C. under reduced pressure, and then the secondary drying can be performed at about 15 to 25 ° C. under reduced pressure to freeze-dry. Then, in general, the inside of the vial can be replaced with nitrogen gas and stoppered to obtain a lyophilized preparation of the composition of the present invention.
  • the lyophilized preparation of the composition of the present invention can generally be redissolved and used by adding an arbitrary suitable solution (resolving solution).
  • a suitable solution include water for injection, physiological saline, and other general infusion solutions.
  • the amount of this redissolved solution varies depending on the intended use and is not particularly limited, but 0.5 to 2 times the amount of the solution before freeze-drying, or 500 mL or less is appropriate.
  • the dose of the composition of the present invention should be determined in consideration of the type of antisense oligomer of the present invention contained, the dosage form, the patient's condition such as age and body weight, the route of administration, and the nature and degree of the disease.
  • the amount of the antisense oligomer of the present invention for adults is generally in the range of 0.1 mg to 10 g / human, preferably in the range of 1 mg to 1 g / human per day. Is the target. This value may also vary depending on the type of target disease, dosage form, and target molecule. Therefore, in some cases, less than this may be sufficient, and conversely, higher doses may be required. It can also be administered once to several times a day or at intervals of one to several days.
  • composition of the present invention a pharmaceutical composition containing a vector capable of expressing the oligonucleotide of the present invention and the above-mentioned carrier can be mentioned.
  • Such an expression vector may express a plurality of oligonucleotides of the present invention.
  • a pharmaceutically acceptable additive can be added to the composition.
  • concentration of the expression vector contained in the composition varies depending on the type of carrier and the like, but in one embodiment, the range of 0.1 nM to 100 ⁇ M is appropriate, and the concentration of 100 nM to 10 ⁇ M is preferable. ..
  • the weight ratio of the expression vector to the carrier (carrier / expression vector) contained in the composition varies depending on the properties of the expression vector, the type of carrier, etc., but is appropriately in the range of 0.1 to 100, and is 0. The range of 1 to 10 is preferable. Further, the content of the carrier contained in the composition is the same as that of the composition of the present invention containing the antisense oligomer of the present invention, and the preparation method thereof is also the case of the composition of the present invention. Is similar to.
  • Example 1 Production of antisense oligomer
  • H50_109-129 is antisense when the base at the 5'end of exon 50 of the human dystrophin gene is the first base and the bases following the 3'side are numbered in order. It is shown that the oligomer targets the sequence of the 109th to 129th bases. Since the total length of the exon 50 is 109 bases, in this example, the 110th to 130th base sequences in the target base sequence are the base sequences in the intron 50.
  • Example 2 Exon skipping activity test of antisense oligomer
  • In vitro test of exxon 50 skipping of human dystrophin gene (1) Test method Each of Table 1 for 3.5 ⁇ 10 5 RD cells (human dystrophin myoma cell line, CCL-136, purchased from ATCC) Antisense oligomers 0.1-1 ⁇ M were introduced by Nucleoctor II (Lonza) using Amaxa Cell Line Nucleofector Kit L. T-030 was used as the pulse program for introduction.
  • the RD cells after introduction are mixed in 2 mL of Eagle's minimal essential medium (EMEM) medium (manufactured by Sigma, the same applies hereinafter) containing 10% fetal bovine serum (FBS) (manufactured by Invitrogen) at 37 ° C. and 5% CO.
  • EMEM Eagle's minimal essential medium
  • FBS fetal bovine serum
  • the cells were cultured under two conditions for three nights.
  • PBS manufactured by Nissui, the same applies hereinafter
  • Buffer RA1 manufactured by Takara Bio Inc.
  • 2-mercaptoethanol manufactured by Nacalai Tesque
  • One-Step RT-PCR was performed on 400 ng of the extracted total RNA using a QIAGEN OneStep RT-PCR Kit (manufactured by Qiagen) and a thermal cycler.
  • the reaction solution was prepared according to the protocol attached to the above kit.
  • As the thermal cycler TakaRa PCR Thermal Cycler Dice Touch (manufactured by Takara Bio Inc.) was used.
  • the RT-PCR program used is as follows.
  • forward primer 5'-AACAACCGGATGTGGAAGAG -3'(SEQ ID NO: 9)
  • Reverse primer 5'-TTGGAGATGGGCAGTTTCCTT -3'(SEQ ID NO: 10)
  • PMO No. 3 and 4 and PMO No. Since the degree of duplication of the target base sequences in 5 to 7 is large, PMO No. 5 for skipping exon 50.
  • the effectiveness of 3 and 4 is noteworthy. From this result, it was shown that the antisense oligomer of the present invention can induce skipping of exon 50 with high efficiency even when its length is shorter than that of the prior art.
  • Example 3 Solubility test of antisense oligomer
  • Solubility test of antisense oligomer in physiological saline Among the antisense oligomers having high skipping efficiency ES in Example 2, the total length is as short as 19 to 20 mer and the synthesis is easy.
  • a solubility test in physiological saline was conducted.
  • Test method 45 ⁇ L of physiological saline was added to a sample bottle containing 4.5 mg of each of the above antisense oligomers, and the mixture was stirred using ultrasonic waves and vortex to prepare a 100 mg / mL aqueous saline solution. The sequence was allowed to stand at room temperature for 24 hours, and those without precipitation were evaluated as highly soluble sequences.
  • the antisense oligomer of the present invention induces skipping of exon 50 in RD cells with extremely high efficiency. Therefore, the antisense oligomers of the invention are very useful in the treatment of DMD.

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Abstract

本明細書において、ヒトジストロフィン遺伝子の第５０番目のエクソンを、高効率にスキッピングさせる薬剤が提供される。また、本明細書において、ヒトジストロフィン遺伝子の第５０番目のエクソンのスキッピングを誘導するアンチセンスオリゴマーが提供される。

Description

エクソン５０のスキッピングを誘導するアンチセンス核酸
　本発明は、ヒトジストロフィン遺伝子の第５０番目のエクソンのスキッピングを誘導するアンチセンスオリゴマー及び該アンチセンスオリゴマーを含む医薬組成物に関する。
　デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は出生男子約３，５００人に１人が発症する最も頻度の高い重篤な遺伝性進行性筋萎縮症である。乳幼児期には健常者とほとんど変わらない運動機能を示すが、４～５歳頃から筋力低下がみられる。その後、ＤＭＤ患者の筋力低下は進行し、ＤＭＤ患者は１２歳頃までに歩行不能になり、２０歳代で心不全または呼吸器不全により死に至る。現在、ＤＭＤに対する十分な治療法はなく、有効な治療薬の開発が強く求められている。
　ＤＭＤの原因はジストロフィン遺伝子の変異であることが知られている。ジストロフィン遺伝子はＸ染色体に存在し、２２０万塩基のＤＮＡから成る巨大な遺伝子である。ＤＮＡからｍＲＮＡ前駆体に転写され、さらにスプライシングによりイントロンが除かれ７９個のエクソンが結合して翻訳領域に対応するｍＲＮＡは１１，０５８塩基になる。このｍＲＮＡから３，６８５のアミノ酸に翻訳され、ジストロフィンタンパク質が生成される。ジストロフィンタンパク質は筋細胞の膜安定性の維持に関与しており、筋細胞を壊れにくくするために必要である。ＤＭＤ患者のジストロフィン遺伝子は変異を有するため、筋細胞において機能を持つジストロフィンタンパク質が殆ど発現されない。そのため、ＤＭＤ患者体内では、筋細胞の構造を維持できなくなり、多量のカルシウムイオンが筋細胞内に流れ込む。その結果、炎症に似た反応が生じ、線維化が進むために筋細胞が再生されにくくなる。
　ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）もジストロフィン遺伝子の変異が原因であるが、その症状は筋萎縮による筋力低下を呈するものの一般にＤＭＤと比較して軽く、筋力低下の進行も遅く、多くの場合、成人期に発症する。ＤＭＤとＢＭＤとの臨床症状の違いは、変異によりジストロフィンのｍＲＮＡがジストロフィンタンパク質へと翻訳される際のアミノ酸読み取り枠が破壊されるか、あるいは維持されるかによるものと考えられている（非特許文献１）。つまり、ＤＭＤでは、アミノ酸読み取り枠がずれる変異を有することにより、機能を持つジストロフィンタンパク質がほとんど発現しないが、ＢＭＤでは変異によりエクソンの一部は欠失しているが、アミノ酸読み取り枠は維持されているために不完全ながらも機能を有するジストロフィンタンパク質が産生される。
　ＤＭＤの治療法として、エクソンスキッピング法が期待されている。この方法は、スプライシングを改変することでジストロフィンのｍＲＮＡのアミノ酸読み取り枠を修復し、部分的に機能を回復したジストロフィンタンパク質の発現を誘導する方法である（非特許文献２）。エクソンスキッピングの対象となるアミノ酸配列部分は失われることになる。そのためこの治療で発現されるジストロフィンタンパク質は正常のものより短くなるが、アミノ酸読み取り枠が維持されるために筋細胞を安定化する機能が部分的に保持される。従って、エクソンスキッピングにより、ＤＭＤは、より軽症のＢＭＤと同じような症状を呈するようになると期待されている。エクソンスキッピング法は、マウスやイヌによる動物実験を経て、ヒトＤＭＤ患者に対する臨床試験が行われている。
　エクソンスキッピングは、５’又は３’スプライス部位のいずれか若しくは両方、又はエクソンの内部を標的とするアンチセンス核酸の結合により誘導することができる。エクソンは両方のスプライス部位がスプライソソーム複合体によって認識された場合のみｍＲＮＡに包含される。従って、スプライス部位をアンチセンス核酸でターゲッティングすることにより、エクソンスキッピングを誘導することができる。また、エクソンがスプライシングの機構に認識されるためにはエクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）へのＳＲタンパク質の結合が必要であると考えられており、ＥＳＥをターゲッティングすることでもエクソンのスキッピングを誘導することができる。
　ジストロフィン遺伝子の変異はＤＭＤ患者によって異なるため、遺伝子変異の場所や種類に応じたアンチセンス核酸が必要になる。これまでに、西オーストラリア大学のＳｔｅｖｅ　Ｗｉｌｔｏｎらによって７９個全てのエクソンに対してエクソンスキッピングを誘導するアンチセンス核酸が作製されており（非特許文献３）、オランダのＡｎｎｅｍｉｅｋｅ　Ａａｒｔｓｍａ－Ｒｕｓらによって３９種類のエクソンに対してエクソンスキッピングを誘導するアンチセンス核酸が作製されている（非特許文献４）。
　全ＤＭＤ患者の４％程度は、第５０番目のエクソン（以下、「エクソン５０」という）をスキッピングすることで治療可能と考えられている（非特許文献５）。近年では、ジストロフィン遺伝子のエクソン５０をエクソンスキッピングのターゲットとした研究について、出願人も含めた複数の研究機関から報告がなされている（特許文献１～６及び非特許文献６）。
国際公開第２０１３／１００１９０号 国際公開第２００４／０４８５７０号 国際公開第２００６／００００５７号 国際公開第２０１０／０５０８０２号 国際公開第２０１０／０４８５８６号 国際公開第２０１１／０５７３５０号
Monaco A. P. et al., Genomics 2:90-95 (1988) Matsuo M., Brain and Development 18:167-172 (1996) Wilton S. D. et al., Molecular Therapy 15:1288-96 (2007) Annemieke Aartsma-Rus et al., Neuromuscular Disorders 12:S71-S77 (2002) Bladen C. L. et al., Human Mutation 36:395-402 (2015) Bo Wu et al., PLosOne 6(5):e19906（2011）
　上記のような状況において、ジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピングを高効率に誘導する新規アンチセンスオリゴマーが望まれる。また、ジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピングを高効率に誘導する活性を維持しつつ、かつ医薬として優れた物性（例えば溶解性）を有するアンチセンスオリゴマーが望まれる。
　本発明者らは、上記文献に記載の技術内容及びジストロフィン遺伝子の構造などを詳細に研究した結果、配列番号３～５のいずれかに示す塩基配列を有するアンチセンスオリゴマーを投与することにより、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピングを高効率に誘導することを見出した。また、前記アンチセンスオリゴマーは、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピングを高効率に誘導しつつ、かつ優れた溶解性を有することを見出した。本発明者らは、この知見に基づき、本発明を完成させた。
　即ち、本発明は、以下のとおりである。
［１］
　下記（ａ）～（ｄ）：
（ａ）配列番号３～５のいずれかの塩基配列を含むアンチセンスオリゴマー；
（ｂ）配列番号３～５のいずれかの塩基配列に対して１～５個の塩基が欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列を含み、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピングを誘導する活性を有するアンチセンスオリゴマー；
（ｃ）配列番号３～５のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピングを誘導する活性を有するアンチセンスオリゴマー；および
（ｄ）配列番号３～５のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピングを誘導する活性を有するアンチセンスオリゴマー
からなる群から選択されるアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物。
［２］
　以下の（ｅ）～（ｈ）：
（ｅ）配列番号３～５のいずれかの塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー；
（ｆ）配列番号３～５のいずれかの塩基配列に対して１～５個の塩基が欠失および／または置換された塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピングを誘導する活性を有するアンチセンスオリゴマー；
（ｇ）配列番号３～５のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピングを誘導する活性を有するアンチセンスオリゴマー；および
（ｈ）配列番号３～５のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピングを誘導する活性を有するアンチセンスオリゴマー
からなる群から選択されるアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物。
［３］
　前記アンチセンスオリゴマーが、
　配列番号３～５のいずれかの塩基配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピングを誘導する活性を有するアンチセンスオリゴマー
である、上記［１］又は［２］に記載のアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物。
［４］
　オリゴヌクレオチドである、上記［１］～［３］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物。
［５］
　前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも１つのヌクレオチドの糖部分及び／又はリン酸結合部分が修飾されている、上記［４］に記載のアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物。
［６］
　前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも１つのヌクレオチドの糖部分が、２’位の－ＯＨ基が、ＯＲ、Ｒ、Ｒ’ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群より選択されるいずれかの基で置換されたリボースである、上記［４］又は［５］に記載のアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物。
（上記Ｒは、アルキル又はアリールを示し、上記Ｒ’は、アルキレンを示す。）
［７］
　前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも１つのヌクレオチドのリン酸結合部分が、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、及びボラノフォスフェート結合からなる群から選択されるいずれか１つのものである、上記［４］～［６］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物。
［８］
　モルホリノオリゴマーである、上記［１］～［３］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物。
［９］
　ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、上記［８］に記載のアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物。
［１０］
　５’末端が、下記化学式（１）～（３）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  
のいずれかの基である、上記［８］又は［９］に記載のアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物。
［１１］
　アンチセンスオリゴマーの長さが１９または２０塩基である、上記［１］～［１０］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物。
［１２］
　上記［１］～［１１］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物を含む、筋ジストロフィー治療用医薬組成物。
［１３］
　さらに医薬的に許容可能な担体を含む、上記［１２］に記載の医薬組成物。
［１４］
　筋ジストロフィー患者に投与するための上記［１２］または［１３］に記載の医薬組成物であって、前記患者が、ジストロフィン遺伝子にエクソン５０のスキッピングの対象となる変異を有する患者である、医薬組成物。
［１５］
　前記患者が、少なくともエクソン５０近傍のエクソンの欠失によるフレームシフト突然変異を有するとともにエクソン５０のスキッピングによりアミノ酸の読み取り枠が修正されるジストロフィン遺伝子を有する、上記［１４］に記載の医薬組成物。
［１６］
　前記患者が、ジストロフィン遺伝子にエクソン５１、５１－５３、５１－５５、または５１－５７の欠失によるフレームシフト突然変異を有する、上記［１４］または［１５］に記載の医薬組成物。
［１７］
　前記患者がヒトである、上記［１４］～［１６］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１８］
　筋ジストロフィー治療用医薬の製造における上記［１］～［１１］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物の使用。
［１９］
　上記［１］～［１１］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物の有効量、または上記［１２］～［１６］のいずれかに記載の医薬組成物を、筋ジストロフィー患者に投与する工程を含む、筋ジストロフィーの治療方法。
［２０］
　前記患者がヒトである、上記［１９］に記載の治療方法。
［２１］
　筋ジストロフィーの治療に使用するための、上記［１］～［１１］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物、または上記［１２］～［１６］のいずれかに記載の医薬組成物。
［２２］
　前記治療において、筋ジストロフィー患者がヒトである、上記［２１］に記載のアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物、または医薬組成物。
　本発明により、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピングを高効率に誘導するアンチセンスオリゴマーを提供することができる。また、本発明により、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピングを高効率に誘導する活性を維持しつつ、かつ優れた溶解性を有するアンチセンスオリゴマーを提供することができる。
ＰＭＯ　Ｎｏ．１および２のアンチセンスオリゴマーの、ヒト横紋筋肉腫細胞（ＲＤ細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピング効率を示す。 ＰＭＯ　Ｎｏ．１、３、および４のアンチセンスオリゴマーの、ＲＤ細胞におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピング効率を示す。 ＰＭＯ　Ｎｏ．１、５、６および７のアンチセンスオリゴマーの、ＲＤ細胞におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピング効率を示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
１．アンチセンスオリゴマー
　本発明は、ヒトジストロフィン遺伝子の第５０番目のエクソンを高効率にスキッピングするアンチセンスオリゴマー（以下、「本発明のアンチセンスオリゴマー」という）を提供する。
［ヒトジストロフィン遺伝子の第５０番目のエクソン］
　本発明において、「遺伝子」には、ゲノム遺伝子以外に、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体及びｍＲＮＡも含まれる。好ましくは、遺伝子は、ｍＲＮＡ前駆体、即ち、ｐｒｅ－ｍＲＮＡである。
　ヒトゲノムにおいて、ヒトジストロフィン遺伝子は遺伝子座Ｘｐ２１．２に存在する。ヒトジストロフィン遺伝子は、２２０万塩基対のサイズを有しており、既知のヒト遺伝子としては最大の遺伝子である。但し、ヒトジストロフィン遺伝子のコード領域はわずか１４ｋｂに過ぎず、該コード領域は７９個のエクソンとしてジストロフィン遺伝子内に分散している（Roberts, RG., et al., Genomics, 16: 536-538 (1993); Koenig, M., et al., Cell 53 219-228,1988）。ヒトジストロフィン遺伝子の転写物であるｐｒｅ－ｍＲＮＡは、スプライシングを受けて１４ｋｂの成熟ｍＲＮＡを生成する。ヒトの野生型ジストロフィン遺伝子の塩基配列は公知である（GenBank Accession No. NM_004006）。
　ヒトの野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン５０とイントロン５０の５’端付近の配列とを含む塩基配列を配列番号１に示す。
［アンチセンスオリゴマー］
　本発明のアンチセンスオリゴマーは、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピングにより、ＤＭＤ型ジストロフィン遺伝子でコードされるタンパク質を、ＢＭＤ型ジストロフィンタンパク質に改変することを目的として作製されたものである。従って、アンチセンスオリゴマーのエクソンスキッピングの対象となるジストロフィン遺伝子のエクソン５０には、野生型だけではなく、変異型も含まれる。
　本発明のアンチセンスオリゴマーは、具体的には以下の（ａ）～（ｄ）からなる群から選択されるいずれかに記載のアンチセンスオリゴマーである。
（ａ）配列番号３～５のいずれかの塩基配列を含むアンチセンスオリゴマー；
（ｂ）配列番号３～５のいずれかの塩基配列に対して１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、または１個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列を含み、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピングを誘導する活性を有するアンチセンスオリゴマー；
（ｃ）配列番号３～５のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上、８４％以上、８５％以上、８９％以上、９０％以上、９４％以上、または９５％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピングを誘導する活性を有するアンチセンスオリゴマー；および
（ｄ）配列番号３～５のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピングを誘導する活性を有するアンチセンスオリゴマー
　別の態様として、本発明のアンチセンスオリゴマーは、具体的には以下の（ｅ）～（ｈ）からなる群から選択されるいずれかに記載のアンチセンスオリゴマーである。
（ｅ）配列番号３～５のいずれかの塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー；
（ｆ）配列番号３～５のいずれかの塩基配列に対して１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、または１個の塩基が欠失および／または置換された塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピングを誘導する活性を有するアンチセンスオリゴマー；
（ｇ）配列番号３～５のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上、８４％以上、８５％以上、８９％以上、９０％以上、９４％以上、または９５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピングを誘導する活性を有するアンチセンスオリゴマー；および
（ｈ）配列番号３～５のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピングを誘導する活性を有するアンチセンスオリゴマー
　上記（ｂ）～（ｄ）のアンチセンスオリゴマーおよび（ｆ）～（ｈ）のアンチセンスオリゴマーは、具体的にはそれぞれ（ａ）のアンチセンスオリゴマーおよび（ｅ）のアンチセンスオリゴマーの変異体であり、患者のジストロフィン遺伝子の変異（例えば、多型）などに対応することを念頭に置いたものである。
　本明細書中、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴマー」とは、例えば、配列番号３～５のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるアンチセンスオリゴマーをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、"Sambrook ＆ Russell， Molecular Cloning： A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001"及び"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆Sons 1987-1997"などに記載されている方法を利用することができる。
　本明細書中、「ストリンジェントな条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」とは、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」とは、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃又は５×ＳＳＣ、１％　ＳＤＳ、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」とは、例えば、（１）５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃、（２）０．２×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、６０℃、（３）０．２×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、６２℃、（４）０．２×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、６５℃、又は（５）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃の条件であるが、これに限定されるものではない。これらの条件において、温度を上げるほど高い配列同一性を有するアンチセンスオリゴマーが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。ここで、「配列同一性」とは、ある２つの核酸のペアについて、比較対象とする塩基配列の全範囲における同一性をいい、本発明の技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて作成された塩基配列の最適なアラインメントにおいて一致する塩基の割合（％）によって表される。例えば、ある２０塩基の塩基配列からなるアンチセンスオリゴマーに対して、「８０％の配列同一性」を有する塩基配列からなるアンチセンスオリゴマーとは、前記の２０塩基のアンチセンスオリゴマーに対して、１６塩基以上の同一の塩基を有するアンチセンスオリゴマーを意味する。
　なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばＡｌｋｐｈｏｓ　Ｄｉｒｅｃｔ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを５５℃の条件下で０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたアンチセンスオリゴマーを検出することができる。あるいは、配列番号３～５のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列の全部又は一部に基づいてプローブを作製する際に、市販の試薬（例えば、ＰＣＲラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノスティクス社）等）を用いて該プローブをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ラベルした場合には、ＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を用いてハイブリダイゼーションを検出することができる。
　上記以外にハイブリダイズ可能なアンチセンスオリゴマーとしては、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号３～５のいずれかの塩基配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上の配列同一性を有するアンチセンスオリゴマーをあげることができる。
　なお、配列同一性は、ＦＡＳＴＡ（Science 227 (4693): 1435-1441, (1985)）や、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎやｔｂｌａｓｔｘと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。ｂｌａｓｔｎを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
　「ヒトジストロフィン遺伝子の第５０番目のエクソンのスキッピングを誘導する（可能にする）」とは、ヒトジストロフィン遺伝子の転写物（例えば、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）のエクソン５０および／またはその隣接イントロンに相当する部位に本発明のアンチセンスオリゴマーが結合することにより、該転写物がスプライシングを受ける際にエクソン５０の除外が起こり、例えばエクソン５１が欠失したＤＭＤ患者の場合、エクソン４９の３’末端に相当する塩基配列にエクソン５２の５’末端に相当する塩基配列が連結し、コドンのフレームシフトが起こっていない成熟ｍＲＮＡが形成されることを意味する。
　したがって、ジストロフィン遺伝子にエクソン５０のスキッピングの対象となる変異を有するＤＭＤ患者であれば、エクソン５０のスキッピングにより治療が可能である。そのようなＤＭＤ患者としては、例えば、少なくともエクソン５０近傍のエクソンの欠失によるフレームシフト突然変異を有するとともにエクソン５０のスキッピングによりアミノ酸の読み取り枠が修正されるジストロフィン遺伝子を有するＤＭＤ患者が挙げられ、より具体的には、例えば、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１、５１－５３、５１－５５、５１－５７等の欠失を有することによるフレームシフト突然変異を有するＤＭＤ患者が挙げられる。
　ここで、前記「結合」は、本発明のアンチセンスオリゴマーとヒトジストロフィン遺伝子の転写物とを混合した場合に、生理的条件下で両者がハイブリダイズして二本鎖を形成することを意味する。上記「生理的条件下」とは、生体内と類似のｐＨ、塩組成、温度に調節された条件を意味する。例えば、２５～４０℃、好ましくは３７℃、ｐＨ５～８、好ましくは、ｐＨ７．４であって、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭの条件が挙げられる。
　ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピングが生じたか否かは、ジストロフィン発現細胞（例えば、ヒト横紋筋肉腫細胞）に本発明のアンチセンスオリゴマーを導入し、上記ジストロフィン発現細胞のｔｏｔａｌ　ＲＮＡから、ヒトジストロフィン遺伝子のｍＲＮＡのエクソン５０の周辺領域をＲＴ－ＰＣＲ増幅し、該ＰＣＲ増幅産物に対してｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ又はシークエンス解析を行うことにより確認することができる。　スキッピング効率ＥＳ（単位：％）は、ヒトジストロフィン遺伝子のｍＲＮＡを被検細胞から回収し、該ｍＲＮＡのうち、エクソン５０がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「Ａ」と、エクソン５０がスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量「Ｂ」を測定し、これら「Ａ」及び「Ｂ」の測定値に基づき、以下の式（１）に従って計算することができる。スキッピング効率の計算については、国際公開第２０１２／０２９９８６号を参照することができる。
　　ＥＳ＝１００×Ａ／（Ａ＋Ｂ）・・・（１）
 
　好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴマーは、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上の効率でエクソン５０をスキッピングする。
　本発明のアンチセンスオリゴマーとしては、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５　塩基の長さを有する、オリゴヌクレオチド、モルホリノオリゴマー、又はペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ：ＰＮＡ）オリゴマーを挙げることができる。アンチセンスオリゴマーの長さとしては、１６～２５塩基、１６～２３塩基、１９塩基又は２０塩基の長さが好ましく、モルホリノオリゴマーが好ましい。
　上記オリゴヌクレオチド（以下、「本発明のオリゴヌクレオチド」という）は、ヌクレオチドを構成単位とする本発明のアンチセンスオリゴマーであり、かかるヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドのいずれであってもよい。
　修飾ヌクレオチドとは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを構成する核酸塩基、糖部分、及びリン酸結合部分の全部又は一部が修飾されているものをいう。
　本発明において、核酸塩基としては、例えば、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、シトシン、チミン、ウラシル又はそれらの修飾塩基を挙げることができる。かかる修飾塩基としては、例えば、シュードウラシル、３－メチルウラシル，ジヒドロウラシル、５－アルキルシトシン（例えば、５－メチルシトシン）、５－アルキルウラシル（例えば、５－エチルウラシル）、５－ハロウラシル（５－ブロモウラシル）、６－アザピリミジン、６－アルキルピリミジン（６－メチルウラシル）、２－チオウラシル、４－チオウラシル、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）　ウラシル、５’－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、１－メチルアデニン、１－メチルヒポキサンチン、２，２－ジメチルグアニン、３－メチルシトシン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、Ｎ６－メチルアデニン、７－メチルグアニン、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メチルカルボニルメチルウラシル、５－メチルオキシウラシル、５－メチル－２－チオウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸、２－チオシトシン、プリン、２，６－ジアミノプリン、２－アミノプリン、イソグアニン、インドール、イミダゾール、キサンチン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　糖部分の修飾としては、例えば、リボースの２’位の修飾及び糖のその他の部分の修飾を挙げることができる。リボースの２’位の修飾としては、例えば、リボースの２’位の－ＯＨ基をＯＲ、Ｒ、Ｒ’ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉに置換する修飾を挙げることができる。ここで、Ｒはアルキル又はアリールを表す。Ｒ’はアルキレンを表す。
　糖のその他の部分の修飾としては、例えば、リボース又はデオキシリボースの４’位のＯをＳに置換したもの、糖の２’位と４’位を架橋したもの、例えば、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）又はＥＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　リン酸結合部分の修飾としては、例えば、ホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、ボラノフォスフェート結合（Enya et al: Bioorganic & Medicinal Chemistry,2008, 18, 9154-9160）に置換する修飾を挙げることができる（例えば、特許再公表公報第２００６／１２９５９４号及び第２００６／０３８６０８号を参照）。
　本発明において、アルキルとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素数１～６のアルキルが好ましい。具体的には、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、イソヘキシルが挙げられる。当該アルキルは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが１～３個置換されていてもよい。
　本発明において、シクロアルキルとしては、炭素数５～１２のシクロアルキルが好ましい。具体的には、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロデシル、シクロドデシルが挙げられる。
　本発明において、ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。
　アルコキシとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素数１～６のアルコキシ、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ｎ－ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｎ－ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシ等を挙げることができる。とりわけ、炭素数１～３のアルコキシが好ましい。
　本発明において、アリールとしては、炭素数６～１０のアリールが好ましい。具体的には、例えば、フェニル、α－ナフチル、β－ナフチルを挙げることができる。とりわけフェニルが好ましい。当該アリールは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、アルキル、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが１～３個置換されていてもよい。
　本発明において、アルキレンとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素数１～６のアルキレンが好ましい。具体的には、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、２－（エチル）トリメチレン、１－（メチル）テトラメチレンを挙げることができる。
　本発明において、アシルとしては、直鎖状若しくは分枝鎖状のアルカノイル、又はアロイルを挙げることができる。アルカノイルとしては、例えば、ホルミル、アセチル、２－メチルアセチル、２，２－ジメチルアセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ペンタノイル、２，２－ジメチルプロピオニル、ヘキサノイル等が挙げられる。アロイルとしては、例えば、ベンゾイル、トルオイル、ナフトイルを挙げることができる。かかるアロイルは置換可能な位置において置換されていてもよく、アルキルで置換されていてもよい。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、リボースの２’位の－ＯＨ基がメトキシで置換され、リン酸結合部分がホスホロチオエート結合である、下記一般式で表される基を構成単位とする本発明のアンチセンスオリゴマーである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  
 
（式中、Ｂａｓｅは、核酸塩基を表す。）
　本発明のオリゴヌクレオチドは、各種自動合成装置（例えば、ＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ　１０／１００（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を用いて容易に合成することが可能であり、あるいは、第三者機関（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｔａｋａｒａ社、又は日本バイオサービス社）等に委託して作製することもできる。
　本発明のモルホリノオリゴマーは、下記一般式で表される基を構成単位とする本発明のアンチセンス
オリゴマーである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
  
 
（式中、Ｂａｓｅは、前記と同義であり；
　Ｗは、以下のいずれかの式で表わされる基を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
  
 
（式中、Ｘは、－ＣＨ２Ｒ１、－Ｏ－ＣＨ２Ｒ１、－Ｓ－ＣＨ２Ｒ１、－ＮＲ２Ｒ３又はＦを表し；
　Ｒ１は、Ｈ、アルキルを表し；
　Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、又は、アリールを表し；
　Ｙ１は、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２又はＮＲ１を表し；
　Ｙ２は、Ｏ、Ｓ又はＮＲ１を表し；
　Ｚは、Ｏ又はＳを表す。））
 
　本発明のモルホリノオリゴマーの合成に使用するモルホリノモノマー化合物の例としては、下記のモルホリノモノマー化合物（Ａ）、モルホリノモノマー化合物（Ｃ）、モルホリノモノマー化合物（Ｔ）、及びモルホリノモノマー化合物（Ｇ）が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
 
　モルホリノオリゴマーは、好ましくは、以下の式で表わされる基を構成単位とするオリゴマー（ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（以下、「ＰＭＯ」という））である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
  
 
（式中、Ｂａｓｅ、Ｒ２、Ｒ３は、前記と同義である。）
 
　本発明モルホリノオリゴマーは、かかるオリゴマーを構成する核酸塩基、モルホリノ環部分、リン酸結合部分、３’末端及び／又は５’末端の全部又は一部が修飾されているものを含む。
　リン酸結合部分の修飾としては、例えば、ホスホロジアミデート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、ボラノフォスフェート結合（Enya et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry,2008, 18, 9154-9160）に置換する修飾を挙げることができる（例えば、特許再公表公報第２００６／１２９５９４号及び第２００６／０３８６０８号を参照）。
　モルホリノオリゴマーは、例えば、国際公開第１９９１／００９０３３号、又は国際公開第２００９／０６４４７１号に従って製造することができる。特に、ＰＭＯは、国際公開第２００９／０６４４７１号に記載の方法に従って製造するか、又は以下に示す方法に従って製造することができる。
［ＰＭＯの製法］
　ＰＭＯの１つの態様として、例えば、次の一般式（Ｉ）で表される化合物（以下、ＰＭＯ（Ｉ）という。）を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
  
 
［式中、各Ｂａｓｅ、Ｒ２、Ｒ３は、前記と同義であり；
　ｎは、１～９９の範囲内にある任意の整数であり、好ましくは、１５～３４、１５～２４又は１５～２２の範囲内にある任意の整数であり、より好ましくは、１８又は１９である。］
　ＰＭＯ（Ｉ）は、公知の方法に従い製造することができるが、例えば、下記工程の操作を実施することにより製造することができる。
　下記工程に使用されている化合物及び試薬は、ＰＭＯの製造に一般的に使用されているものであれば特に限定されない。
　また、下記のすべての工程は、液相法又は固相法（マニュアル又は市販の固相自動合成機を用いる）で実施することができる。固相法でＰＭＯを製造する場合、操作手順の簡便化及び合成の正確性の点から自動合成機を用いる方法が望ましい。
（１）工程Ａ：
　次の一般式（ＩＩ）で表される化合物（以下、化合物（ＩＩ）という。）に酸を作用させることによって、次の一般式（ＩＩＩ）で表される化合物（以下、化合物（ＩＩＩ）という。）を製造する工程。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
  
 
［式中、ｎ、Ｒ２、Ｒ３は、前記と同義であり；
　各ＢＰは，独立して、保護されていてもよい核酸塩基を表し；
　Ｔは、トリチル基、モノメトキシトリチル基、又はジメトキシトリチル基を表し；
　Ｌは、水素、アシル、又は次の一般式（ＩＶ）で表される基（以下、基（ＩＶ）という。）を表す。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
  
 
　ＢＰに係る「核酸塩基」としては、Ｂａｓｅと同じ「核酸塩基」を挙げることができる。但し、ＢＰに係る核酸塩基のアミノ基又は水酸基は保護されていてもよい。
　かかるアミノ基の保護基としては、核酸の保護基として使用されるものであれば特に制限されず、具体的には、例えば、ベンゾイル、４－メトキシベンゾイル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル、４－イソプロピルフェノキシアセチル、（ジメチルアミノ）メチレンを挙げることができる。水酸基の保護基としては、例えば、２－シアノエチル、４－ニトロフェネチル、フェニルスルホニルエチル、メチルスルホニルエチル、トリメチルシリルエチル、置換可能な任意の位置で１～５個の電子吸引性基で置換されていてもよいフェニル、ジフェニルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、メチルフェニルカルバモイル、１－ピロリジニルカルバモイル、モルホリノカルバモイル、４－（ｔｅｒｔ－ブチルカルボキシ）ベンジル、４－［（ジメチルアミノ）カルボキシ］ベンジル、４－（フェニルカルボキシ）ベンジルを挙げることができる（例えば、国際公開第２００９／０６４４７１号公報参照）。
　「固相担体」としては、核酸の固相反応に使用しうる担体であれば特に制限されないが、例えば、（ｉ）モルホリノ核酸誘導体の合成に使用しうる試薬（例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、テトラゾール、Ｎ－メチルイミダゾール、ピリジン、無水酢酸、ルチジン、トリフルオロ酢酸）にほとんど溶解せず、（ｉｉ）モルホリノ核酸誘導体の合成に使用しうる試薬に対して化学的に安定であり、（ｉｉｉ）化学修飾ができ、（ｉｖ）望ましいモルホリノ核酸誘導体の装填ができ、（ｖ）処理中にかかる高圧に耐える十分な強度をもち、（ｖｉ）一定の粒径範囲と分布であるものが望ましい。具体的には、膨潤性ポリスチレン（例えば、アミノメチルポリスチレン樹脂　１％ジビニルベンゼン架橋（２００～４００メッシュ）（２．４～３．０ｍｍｏｌ／ｇ）（東京化成社製）、Ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ　Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ　Ｒｅｓｉｎ・ＨＣｌ［ジビニルベンゼン１％，１００～２００メッシュ］（ペプチド研究所社製））、非膨潤性ポリスチレン（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ　Ｓｕｐｐｏｒｔ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製））、ＰＥＧ鎖結合型ポリスチレン（例えば、ＮＨ２－ＰＥＧ　ｒｅｓｉｎ（渡辺化学社製）、ＴｅｎｔａＧｅｌ　ｒｅｓｉｎ）、定孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｐｏｒｅ　ｇｌａｓｓ；ＣＰＧ）（例えば、ＣＰＧ社製）、オキサリル化－定孔ガラス（例えば、Ａｌｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１９，１５２７（１９９１）を参照）、ＴｅｎｔａＧｅｌ支持体－アミノポリエチレングリコール誘導体化支持体（例えば、Ｗｒｉｇｈｔら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．３４，３３７３（１９９３）を参照）、Ｐｏｒｏｓ－ポリスチレン／ジビニルベンゼンのコポリマーを挙げることができる。
　「リンカー」としては、通常核酸やモルホリノ核酸誘導体を連結するために使用される公知のものを用いることができるが、例えば、３－アミノプロピル、スクシニル、２，２’－ジエタノールスルホニル、ロングチェーンアルキルアミノ（ＬＣＡＡ）を挙げることができる。
　本工程は、化合物（ＩＩ）に酸を作用させることにより実施することができる。
　本工程に使用しうる「酸」としては、例えば、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸又はトリクロロ酢酸を挙げることができる。酸の使用量としては、例えば、化合物（ＩＩ）１モルに対して０．１モル当量～１０００モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは１モル当量～１００モル当量の範囲内である。
　また、前記酸と一緒に、有機アミンを使用することができる。有機アミンとしては、特に限定されるものではないが、例えば、トリエチルアミンを挙げることができる。有機アミンの使用量は、例えば、酸１モルに対して、０．０１モル当量～１０モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは、０．１モル当量～２モル当量の範囲内である。
　本工程において酸と有機アミンとの塩又は混合物を使用する場合には、例えば、トリフルオロ酢酸とトリエチルアミンの塩又は混合物を挙げることができ、より具体的には、トリフルオロ酢酸２当量に対してトリエチルアミン１当量を混合したものを挙げることができる。
　本工程に使用しうる酸は、０．１％～３０％の範囲内の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、アルコール類（エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノールなど）、水又はこれらの混合物を挙げることができる。
　上記反応における反応温度は、例えば、１０℃～５０℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、２０℃～４０℃の範囲内であり、さらに好ましくは、２５℃～３５℃の範囲内である。
　反応時間は、使用する酸の種類、反応温度によって異なるが、通常０．１分～２４時間の範囲内が適当である。好ましくは、１分～５時間の範囲内である。
　また、本工程が終了した後、必要に応じて、系中に存在する酸を中和するために塩基を添加することができる。「塩基」としては、特に限定されないが、例えば、ジイソプロピルエチルアミンが挙げられる。塩基は、０．１％（ｖ／ｖ）～３０％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。
　本工程に用いる溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ジクロロメタン、アセトニトリル、アルコール類（エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノールなど）、水又はこれらの混合物を挙げることができる。反応温度は、例えば、１０℃～５０℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、２０℃～４０℃の範囲内であり、さらに好ましくは、２５℃～３５℃の範囲内である。
　反応時間は、使用する塩基の種類、反応温度によって異なるが、通常０．１分～２４時間の範囲内が適当であり、好ましくは、１分～５時間の範囲内である。
　なお、化合物（ＩＩ）において、ｎ＝１であって、Ｌが基（ＩＶ）である、次の一般式（ＩＩａ）で表される化合物（以下、化合物（ＩＩａ）という。）は、以下の方法に従って製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
  
 
［式中、ＢＰ、Ｔ、リンカー、固相担体は、前記と同義である。］
工程１：
　次の一般式（Ｖ）で表される化合物にアシル化剤を作用させることによって、次の一般式（ＶＩ）で表される化合物（以下、化合物（ＶＩ）という。）を製造する工程。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
  
 
［式中、ＢＰ、Ｔ、リンカーは、前記と同義であり；
　Ｒ４は、水酸基、ハロゲン、カルボキシル基、又は、アミノを表す。］
　本工程は、化合物（Ｖ）を出発原料として、公知のリンカーの導入反応により実施することができる。
　特に、次の一般式（ＶＩａ）で表される化合物は、化合物（Ｖ）と無水コハク酸とを用いてエステル化反応として知られた方法を実施することにより製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
  
 
［式中、ＢＰ、Ｔは、前記と同義である。］
工程２：
　化合物（ＶＩ）に縮合剤等を作用させることによって、固相担体と反応させ、化合物（ＩＩａ）を製造する工程。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
  
 
［式中、ＢＰ、Ｒ４、Ｔ、リンカー、固相担体は、前記と同義である。］
　本工程は、化合物（ＶＩ）と固相担体とを用いて縮合反応として知られた方法により製造することができる。
　化合物（ＩＩ）において、ｎ＝２～９９（好ましくは１６～３５、１６～２５又は１６～２３の範囲内にある任意の整数であり、好ましくは、１９又は２０である）であって、Ｌが基（ＩＶ）である、次の一般式（ＩＩａ２）で表される化合物は、化合物（ＩＩａ）を出発原料とし、本明細書に記載のＰＭＯの製法にかかる工程Ａ及び工程Ｂを所望の回数繰り返し実施することにより製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
  
 
［式中、ＢＰ、Ｒ２、Ｒ３、Ｔ、リンカー、固相担体は、前記と同義であり；
　ｎ’は、１～９８（特定の態様ではｎ’は、例えば、１～３４、１～２４、１～２３、１～２２、１～２１、１～２０、１～１９、１～１８、１～１７、１～１６、１～１５である）を表す。］
（２）工程Ｂ：
　化合物（ＩＩＩ）に塩基存在下にモルホリノモノマー化合物を作用させることによって、次の一般式（ＶＩＩ）で表される化合物（以下、化合物（ＶＩＩ）という。）を製造する工程。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
  
 
［式中、各ＢＰ、Ｌ、ｎ、Ｒ２、Ｒ３、Ｔは、前記と同義である。］
　本工程は、化合物（ＩＩＩ）に塩基存在下にモルホリノモノマー化合物を作用させることにより実施することができる。
　モルホリノモノマー化合物としては、例えば、次の一般式（ＶＩＩＩ）で表される化合物を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
  
 
［式中、ＢＰ、Ｒ２、Ｒ３、Ｔは前記と同義である。］
　本工程に使用しうる「塩基」としては、例えば、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、又は、Ｎ－エチルモルホリンを挙げることができる。塩基の使用量としては、例えば、化合物（ＩＩＩ）１モルに対して、１モル当量～１０００モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは１０モル当量～１００モル当量の範囲内である。
　本工程に使用しうるモルホリノモノマー化合物および塩基は、０．１％～３０％の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルイミダゾリドン、Ｎ－メチルピペリドン、ＤＭＦ、ジクロロメタン、アセトニトリル、テロラヒドロフラン、又はこれらの混合物を挙げることができる。
　反応温度は、例えば、０℃～１００℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、１０℃～５０℃の範囲内である。
　反応時間は、使用する塩基の種類、反応温度によって異なるが、通常１分～４８時間の範囲内が適当であり、好ましくは、３０分～２４時間の範囲内である。
　さらに本工程の終了後、必要に応じて、アシル化剤を添加することができる。「アシル化剤」としては、例えば、無水酢酸、酢酸クロライド、フェノキシ酢酸無水物を挙げることができる。アシル化剤は、例えば、０．１％～３０％の範囲内の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、アルコール類（エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノールなど）、水又はこれらの混合物を挙げることができる。
　また、必要であれば、アシル化剤と一緒に、例えば、ピリジン、ルチジン、コリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－エチルモルホリン等の塩基を使用することができる。アシル化剤の使用量としては、０．１モル当量～１００００モル当量の範囲内が好ましく、１モル当量～１０００モル当量の範囲内がより好ましい。塩基の使用量としては、例えば、アシル化剤１モルに対して、０．１モル当量～１００モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは１モル当量～１０モル当量の範囲内である。
　本反応の反応温度は、１０℃～５０℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、１０℃～５０℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、２０℃～４０℃の範囲内であり、さらに好ましくは、２５℃～３５℃の範囲内である。反応時間は、例えば、使用するアシル化剤の種類、反応温度によって異なるが、通常０．１分～２４時間の範囲内が適当であり、好ましくは、１分から５時間の範囲内である。
（３）工程Ｃ：
　工程Ｂにおいて製造される化合物（ＶＩＩ）において、脱保護剤を用いて保護基を脱離し、一般式（ＩＸ）で表される化合物を製造する工程。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
  
 
［式中、Ｂａｓｅ、ＢＰ、Ｌ、ｎ、Ｒ２、Ｒ３、Ｔは、前記と同義である。］
　本工程は、化合物（ＶＩＩ）に脱保護剤を作用させることにより実施することができる。
　「脱保護剤」としては、例えば、濃アンモニア水、メチルアミンを挙げることができる。本工程に使用しうる「脱保護剤」は、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ＤＭＦ、Ｎ，Ｎ－ジメチルイミダゾリドン、Ｎ－メチルピペリドン又はこれらの混合溶媒で希釈して使用することもできる。中でも、エタノールが好ましい。脱保護剤の使用量としては、例えば、化合物（ＶＩＩ）１モルに対して、例えば、１モル当量～１０００００モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは１０モル当量～１０００モル当量の範囲内である。
　反応温度は、例えば、１５℃～７５℃の範囲内が適当であり、好ましくは４０℃～７０℃の範囲内であり、より好ましくは５０℃～６０℃の範囲内である。脱保護反応時間は、化合物（ＶＩＩ）の種類、反応温度等によって異なるが、１０分～３０時間の範囲内が適当であり、好ましくは３０分～２４時間の範囲内であり、より好ましくは５時間～２０時間の範囲内である。
（４）工程Ｄ：
　工程Ｃにおいて製造される化合物（ＩＸ）に酸を作用させることによって、ＰＭＯ（Ｉ）を製造する工程。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
  
 
［式中、Ｂａｓｅ、ｎ、Ｒ２、Ｒ３、Ｔは、前記と同義である。］
　本工程は、化合物（ＩＸ）に酸を加えることによって実施することができる。
　本工程において使用しうる「酸」としては、例えば、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、酢酸、リン酸及び塩酸等を挙げることができる。酸の使用量としては、例えば、溶液のｐＨが０．１～４．０の範囲内になるように使用するのが適当であり、より好ましくは１．０～３．０の範囲内になるように使用する。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、アセトニトリル、水、又はこれらの混合溶媒を挙げることができる。
　反応温度は、１０℃～５０℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、２０℃～４０℃の範囲内であり、さらに好ましくは、２５℃～３５℃の範囲内である。脱保護反応時間は、化合物（ＩＸ）の種類、反応温度等によって異なるが、０．１分～５時間の範囲内が適当であり、好ましくは１分～１時間の範囲内であり、より好ましくは１分～３０分の範囲内である。
　ＰＭＯ（Ｉ）は、本工程で得られた反応混合物から通常の分離精製手段、例えば、抽出、濃縮、中和、濾過、遠心分離、再結晶、Ｃ８からＣ１８の逆相カラムクロマトグラフィー、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析、限界ろ過などの手段を単独若しくは組み合わせて用いることにより得ることができ、所望のＰＭＯ（Ｉ）を単離精製することができる（例えば、国際公開第１９９１／０９０３３号を参照）。
　逆相クロマトグラフィーを用いてＰＭＯ（Ｉ）を精製する場合には、溶出溶媒として、例えば２０ｍＭのトリエチルアミン／酢酸緩衝液とアセトニトリルの混合溶液を使用することができる。
　また、イオン交換クロマトグラフィーを用いてＰＭＯ（Ｉ）を精製する場合には、例えば、１Ｍの食塩水と１０ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液の混合溶液を使用することができる。
　ペプチド核酸は、下記一般式で表される基を構成単位とする本発明のアンチセンスオリゴマーである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
  
 
（式中、Ｂａｓｅは、前記と同義である。）
　ペプチド核酸は、例えば、以下の文献に従って製造することができる。
１）P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt，Science, 254, 1497 (1991)
２）M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg，Jacs., 114, 1895 (1992)
３）K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt，J. Org. Chem., 59, 5767 (1994)
４）L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K. H. Petersen, H. F. Hansen, T. Koch, M. Egholm，O. Buchardt, P. E. Nielsen, J. Coull, R. H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175 (1995)
５）T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80 (1997)
　また、本発明のアンチセンスオリゴマーは、５’末端が、下記化学式（１）～（３）のいずれかの基であってもよい。好ましくは（３）－ＯＨである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
  
 
　以下、上記（１）、（２）及び（３）で示される基を、それぞれ「基（１）」、「基（２）」及び「基（３）」と呼ぶ。
　本発明のアンチセンスオリゴマーは、リン酸結合部分のリン原子が不斉中心となるため、リン原子の立体化学が光学的に純粋な化合物を含むものであってもよい。当業者であれば純粋な光学活性体を異性体の混合物から得ることができる（国際公開第２０１７／０２４２６４号）。また、本発明のアンチセンスオリゴマーは、純粋な光学活性体として合成したものであってもよい。当業者であれば合成反応を制御して純粋な光学活性体を得ることができる（公表特許公報第２０１８－５３７９５２号）。
２．ペプチド結合型アンチセンスオリゴマー
　本発明のアンチセンスオリゴマーは、有効性の向上を目的とした機能性ペプチド（例えば、標的細胞への輸送効率の向上を目的とした膜透過性ペプチド）との複合体を形成しているものであってもよい（国際公開第２００８／０３６１２７号、国際公開第２００９／００５７９３号、国際公開第２０１２／１５０９６０号、国際公開第２０１６／１８７４２５号、国際公開第２０１８／１１８６６２号、国際公開第２０１８／１１８５９９号、国際公開第２０１８／１１８６２７号、J. D. Ramsey, N. H. Flynn, Pharmacology & Therapeutics 154, 78-86 (2015)、M. K. Tsoumpra et al., EBioMedicine, https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2019.06.036）。結合部位は特に限定されないが、アンチセンスオリゴマーの５’端または３’端と機能性ペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端が結合していることが好ましい。
　また、別の態様として、本発明のアンチセンスオリゴマーと機能性ペプチドは、リンカーを介して複合体を形成していてもよい。リンカーは特に限定されないが、アンチセンスオリゴマーの５’端または３’端とリンカーの一方の端が結合し、機能性ペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端とリンカーのもう一方の端が結合していることが好ましい。また、機能性ペプチドとリンカーの間には、付加的なアミノ酸が存在していてもよい。
３．医薬組成物
　本発明のアンチセンスオリゴマーは、従来技術に係るアンチセンスオリゴマーと比較してその長さが短い場合であっても、エクソン５０のスキッピングを高効率に誘導することができる。また、本発明のアンチセンスオリゴマーは、エクソン５０のスキッピングを高効率に誘導する活性を維持しつつ、かつ優れた溶解性を有する。したがって、ジストロフィン遺伝子にエクソン５０のスキッピングの対象となる変異（例えば、フレームシフト突然変異、エクソン５０の中でのミスセンス突然変異／ナンセンス突然変異など）を有するＤＭＤ患者であれば、本発明のアンチセンスオリゴマーを投与することによって、高効率に筋ジストロフィーの症状を緩和することができると予測される。例えば、少なくともエクソン５０近傍のエクソンを欠失した所定の変異ジストロフィン遺伝子を有するＤＭＤ患者に本発明のアンチセンスオリゴマーを投与することによって、高効率に筋ジストロフィーの症状を緩和することができると予測される。なお、所定の変異ジストロフィン遺伝子とは、少なくともエクソン５０近傍のエクソンを欠失してフレームシフト突然変異を有するとともにエクソン５０を省いた場合（スキップした場合）にアミノ酸の読み取り枠が修正されるジストロフィン遺伝子を意味する。エクソン５１、５１－５３、５１－５５、５１－５７等の欠失を有することによるフレームシフト突然変異を有するＤＭＤ患者が挙げられる。
　より具体的に述べると、本発明のアンチセンスオリゴマーを含む医薬組成物をＤＭＤ患者（エクソン５０スキッピングでｉｎ－ｆｒａｍｅ化する変異を有する患者、例えば、エクソン５１欠失患者、エクソン５１－５３欠失患者、エクソン５１－５５欠失患者、エクソン５１－５７欠失患者等）に投与することにより、高効率に筋ジストロフィーの症状を緩和することができると予測される。例えば、本発明のアンチセンスオリゴマーを含む医薬組成物を用いる場合、従来技術に係るオリゴマーと比べて少量の投与量でも同程度の治療効果を得られるため、副作用を軽減することができ、かつ経済的である。
　また、本発明のアンチセンスオリゴマーは、エクソン５０のスキッピングを高効率に誘導する活性を維持しつつ、かつ優れた溶解性を有するため、医薬組成物の調製において有用である。
　そこで、別の実施態様として、本発明のアンチセンスオリゴマー、その医薬的に許容可能な塩又は水和物を有効成分とする、筋ジストロフィー治療用医薬組成物（以下、「本発明の組成物」という）を提供する。
　また、本発明は、本発明のアンチセンスオリゴマーを、ＤＭＤ患者に投与する工程を含む、筋ジストロフィーの治療方法を提供する。
　当該治療方法において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、前記筋ジストロフィー治療用医薬組成物として投与してもよい。
　さらに、本発明は、筋ジストロフィー治療用医薬組成物の製造における本発明のアンチセンスオリゴマーの使用、及び筋ジストロフィー治療に使用するための本発明のアンチセンスオリゴマーを提供する。
　本発明の組成物に含まれる本発明のアンチセンスオリゴマーの医薬的に許容可能な塩の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩；ｔ－オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジル－フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機アミン塩；弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、沃化水素酸塩のようなハロゲン化水素酸塩；硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩；ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩；酢酸塩、リンゴ酸塩、フマール酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩などの有機酸塩；グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩などが挙げられる。これらの塩は、公知の方法で製造することができる。あるいは、本発明の組成物に含まれる本発明のアンチセンスオリゴマーは、その水和物の形態にあってもよい。
　本発明の組成物の投与形態は、医薬的に許容可能な投与形態であれば特に制限されず、治療方法に応じて選択することができるが、筋組織への送達容易性の観点から、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経口投与、組織内投与、経皮投与等が好ましい。また、本発明の組成物が取り得る剤型としては、特に制限されないが、例えば、各種の注射剤、経口剤、点滴剤、吸入剤、軟膏剤、ローション剤等を挙げることができる。
　本発明のアンチセンスオリゴマーを筋ジストロフィー患者に投与する場合、本発明の組成物は、該オリゴマーの筋組織への送達を促進する担体を含むことができる。このような担体は、医薬的に許容可能なものであれば特に制限されず、その例として、カチオン性リポソーム、カチオン性ポリマー等のカチオン性担体、またはウイルスエンベロープを利用した担体を挙げることができる。カチオン性リポソームとしては、例えば、２－Ｏ－（２－ジエチルアミノエチル）カルバモイル－１，３－Ｏ－ジオレオイルグリセロールとリン脂質とを必須構成成分として形成されるリポソーム（以下、「リポソームＡ」という）、オリゴフェクトアミン（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、リポフェクチン（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、リポフェクトアミン（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＤＭＲＩＥ－Ｃ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）（Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ＴｒａｎｓＩＴ　ＴＫＯ（登録商標）（Ｍｉｒｕｓ社製）、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ　ＩＩ（Ｌｏｎｚａ）を挙げることができる。それらの中で、リポソームＡが好ましい。カチオン性ポリマーとしては、例えば、ＪｅｔＳＩ（登録商標）（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社製）、Ｊｅｔ－ＰＥＩ（登録商標）（ポリエチレンイミン、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社製）を挙げることができる。ウイルスエンベロープを利用した担体としては、例えば、ＧｅｎｏｍｅＯｎｅ（登録商標）（ＨＶＪ－Ｅリポソーム、石原産業社製）を挙げることができる。あるいは、特許２９２４１７９号に記載の医薬デバイス、特許再公表公報第２００６／１２９５９４号及び特許再公表公報第２００８／０９６６９０号に記載のカチオン性担体を用いることもできる。
　詳細については米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，７３７，３２３号、国際公開第９６／１４０５７号、“New RRC, Liposomes: A practical approach, IRL Press, Oxford (1990) pages 33-104”等を参照することができる。
　本発明の組成物に含まれる本発明のアンチセンスオリゴマーの濃度は、担体の種類等によって異なるが、一態様において、０．１ ｎＭ～１００ μＭの範囲内が適当であり、１００ｎＭ～１０μＭの範囲内が好ましい。また、本発明の組成物に含まれる本発明のアンチセンスオリゴマーと担体との重量比（担体／本発明のアンチセンスオリゴマー）は、該オリゴマーの性質及び該担体の種類等によって異なるが、０．１～１００の範囲内が適当であり、０．１～１０の範囲内が好ましい。
本発明の組成物は、水溶液の形態であってもよい。その場合、本発明の組成物は、本発明のアンチセンスオリゴマーを、２．５～５００ｍｇ／ｍＬ、５～４５０ｍｇ／ｍＬ、１０～４００ｍｇ／ｍＬ、１５～３５０ｍｇ／ｍＬ、２０～３００ｍｇ／ｍＬ、２０～２５０ｍｇ／ｍＬ、２０～２００ｍｇ／ｍＬ、２０～１５０ｍｇ／ｍＬ、２０～１００ｍｇ／ｍＬ、２０～５０ｍｇ／ｍＬ、２０～４０ｍｇ／ｍＬ、２０～３０ｍｇ／ｍＬ、２３～２７ｍｇ／ｍＬ、２４～２６ｍｇ／ｍＬ、又は２５ｍｇ／ｍＬの濃度で含んでいてもよい。または、本発明の組成物は、本発明のアンチセンスオリゴマーを、１０～１００ｍｇ／ｍＬ、１５～９５ｍｇ／ｍＬ、２０～８０ｍｇ／ｍＬ、２５～７５ｍｇ／ｍＬ、３０～７０ｍｇ／ｍＬ、３５～６５ｍｇ／ｍＬ、４０～６０ｍｇ／ｍＬ、４５～５５ｍｇ／ｍＬ、４７～５３ｍｇ／ｍＬ、４８～５２ｍｇ／ｍＬ、４９～５１ｍｇ／ｍＬ、又は５０ｍｇ／ｍＬの濃度で含んでいてもよい。

　本発明の組成物は、乾燥形態であってもよい。その場合、水溶液形態の本発明の組成物を調製するために、例えば１２５ｍｇ又は２５０ｍｇの乾燥形態の本発明のアンチセンスオリゴマーを含む乾燥形態の本発明の組成物を、０．５ｍＬ～１００ｍＬの水と混合して（１．２５ｍｇ／ｍＬ～２５０ｍｇ／ｍＬ又は２．５ｍｇ／ｍＬ～５００ｍｇ／ｍＬの本発明のアンチセンスオリゴマー濃度に相当する）、好ましくは１ｍＬ～５０ｍＬの水と混合して（２．５ｍｇ／ｍＬ～１２５ｍｇ／ｍＬ又は５ｍｇ／ｍＬ～２５０ｍｇ／ｍＬの本発明のアンチセンスオリゴマー濃度に相当する）、より好ましくは５ｍＬ～１０ｍＬの水と混合して（１２．５ｍｇ／ｍＬ～２５ｍｇ／ｍＬ又は２５ｍｇ／ｍＬ～５０ｍｇ／ｍＬの本発明のアンチセンスオリゴマー濃度に相当する）用いてもよい。
　本発明の組成物には、本発明のアンチセンスオリゴマーと上述した担体以外に、任意に医薬的に許容可能な添加剤を配合することができる。かかる添加剤として、例えば、乳化補助剤（例えば、炭素数６～２２の脂肪酸やその医薬的に許容可能な塩、アルブミン、デキストラン）、安定化剤（例えば、コレステロール、ホスファチジン酸、スクロース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール）、ｐＨ調整剤（例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン）を挙げることができる。これらを一種又は二種以上使用することができる。本発明の組成物中の当該添加剤の含有量は、９０重量％以下が適当であり、７０重量％以下が好ましく、５０重量％以下がより好ましい。
　本発明の組成物は、担体の分散液に本発明のアンチセンスオリゴマーを加え、適当に攪拌することにより調製することができる。また、添加剤は、本発明のアンチセンスオリゴマーの添加前でも添加後でも適当な工程で添加することができる。本発明の組成物が水溶液の形態である場合、本発明のアンチセンスオリゴマーを添加する際に用い得る水性溶媒としては、医薬的に許容可能なものであれば特に制限されず、例えば、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水等の電解質液、ブドウ糖液、マルトース液等の糖液を挙げることができる。また、かかる場合のｐＨ及び温度等の条件は、当業者が適宜選択することができる。
　本発明の組成物は、例えば、液剤やその凍結乾燥製剤とすることができる。本発明の組成物の乾燥形態の一態様として、当該凍結乾燥製剤は、常法により、液剤の形態を有している本発明の組成物を凍結乾燥処理することにより調製することができる。例えば、液剤の形態を有している本発明の組成物を適当な滅菌を行った後、所定量をバイアル瓶に分注し、約－４０～－２０℃の条件で予備凍結を２時間程度行い、約０～１０℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約１５～２５℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥することができる。そして、一般的にはバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓して本発明の組成物の凍結乾燥製剤を得ることができる。
　本発明の組成物の凍結乾燥製剤は、一般には任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によって再溶解し使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、生理食塩水、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途等によって異なり特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の０．５～２倍量、又は５００ｍＬ以下が適当である。
　本発明の組成物を投与する際の用量としては、含有される本発明のアンチセンスオリゴマーの種類、剤形、年齢や体重等の患者の状態、投与経路、疾患の性質と程度を考慮した上で調製することが望ましいが、成人に対して本発明のアンチセンスオリゴマーの量として、１日当たり０．１ｍｇ～１０ｇ／ヒトの範囲内が、好ましくは１ ｍｇ～１ ｇ／ヒトの範囲内が一般的である。この数値は標的とする疾患の種類、投与形態、標的分子によっても異なる場合がある。従って、場合によってはこれ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とするときもある。また１日１回から数回の投与又は１日から数日間の間隔で投与することができる。
　本発明の組成物の別の態様として、本発明のオリゴヌクレオチドを発現し得るベクターと上述した担体とを含む医薬組成物を挙げることができる。かかる発現ベクターは、複数の本発明のオリゴヌクレオチドを発現し得るものであってもよい。当該組成物には、本発明のオリゴマーを含有する本発明の組成物と同様に、医薬的に許容可能な添加剤を添加することができる。当該組成物中に含まれる発現ベクターの濃度は、担体の種類等によって異なるが、一態様において、０．１ ｎＭ～１００ μＭの範囲内が適当であり、１００ ｎＭ～１０ μＭの範囲内が好ましい。当該組成物中に含まれる発現ベクターと担体との重量比（担体／発現ベクター）は、発現ベクターの性質、担体の種類等によって異なるが、０．１～１００の範囲内が適当であり、０．１～１０の範囲内が好ましい。また、当該組成物中に含まれる担体の含有量は、本発明のアンチセンスオリゴマーを含有する本発明の組成物の場合と同様であり、その調製方法等に関しても、本発明の組成物の場合と同様である。
　以下に、実施例及び試験例を掲げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は実施例に示される範囲に限定されるものではない。
［実施例１：アンチセンスオリゴマーの製造］
　国際公開第２０１３／１００１９０号に記載の方法に従い、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０および／またはその３’側隣接イントロンであるイントロン５０の一部の塩基配列を標的とする、表１に示すアンチセンスオリゴマー（ＰＭＯ　Ｎｏ．１～７（配列番号２～８））を合成した。各アンチセンスオリゴマーの全長は１９～２１ｍｅｒである。各アンチセンスオリゴマーの分子量の理論値およびＥＳＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる実測値も示す。
　表１中において、例えば「Ｈ５０＿１０９－１２９」は、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０の５’末端の塩基を１番目の塩基とし、３’側に続く塩基に順番に番号を付した場合に、アンチセンスオリゴマーが１０９番目～１２９番目の塩基の配列を標的とするものであることを示す。なお、エクソン５０の全長は１０９塩基であるため、この例では標的塩基配列中の１１０番目～１３０番目の塩基の配列は、イントロン５０中の塩基配列である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
  
 
［実施例２：アンチセンスオリゴマーのエクソンスキッピング活性試験］
ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０スキッピングのＩｎ　ｖｉｔｒｏ試験
（１）試験方法
　ＲＤ細胞（ヒト横紋筋肉腫細胞株、ＣＣＬ－１３６、ＡＴＣＣより購入）３．５×１０５個に対して、表１の各アンチセンスオリゴマー０．１～１μＭをＡｍａｘａ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅ　Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ　Ｋｉｔ　Ｌを用いてＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ　ＩＩ（Ｌｏｎｚａ）により導入した。導入のためのパルスプログラムはＴ－０３０を用いた。
　導入後のＲＤ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（インビトロジェン社製）を含むＥａｇｌｅ’ｓ　ｍｉｎｉｍａｌ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地（シグマ社製、以下同じ）２　ｍＬ中、３７℃、５％ＣＯ２条件下で三晩培養した。
　導入後のＲＤ細胞をＰＢＳ（ニッスイ社製、以下同じ）で１回洗浄した後、１％の２－メルカプトエタノール（ナカライテスク社製）を含むＢｕｆｆｅｒ　ＲＡ１（タカラバイオ社製）３５０μＬを上記細胞に添加し、数分間室温に放置して上記細胞を溶解させ、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）　Ｆｉｌｔｅｒ（タカラバイオ社製）上に回収した。１１，０００×ｇで１分間遠心し、ホモジネートを作製した。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）　ＲＮＡ（タカラバイオ社製）に添付のプロトコールに従って上記細胞から全ＲＮＡを抽出した。抽出した全ＲＮＡの濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ　ＯＮＥ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いて測定した。
　抽出した全ＲＮＡ　４００ ｎｇに対し、ＱＩＡＧＥＮ　ＯｎｅＳｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）およびサーマルサイクラーを用いてＯｎｅ－Ｓｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲを行った。上記キットに添付のプロトコールに従って、反応液を調製した。サーマルサイクラーはＴａＫａＲａ　ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ　Ｔｏｕｃｈ（タカラバイオ社製）を用いた。用いたＲＴ－ＰＣＲのプログラムは、以下の通りである。
 
　　50℃、30分間：逆転写反応
　　95℃、15分間：ポリメラーゼ活性化、逆転写酵素不活性化、cDNA熱変性
　　[94℃、30秒間；60℃、30秒間；72℃、1分間]×35サイクル：PCR増幅
　　72℃、10分間：最終伸長反応
 
　ＲＴ－ＰＣＲに使用したフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列は以下の通りである。
 
　フォワードプライマー：5’- AACAACCGGATGTGGAAGAG -3’　（配列番号９）
　リバースプライマー：5’- TTGGAGATGGCAGTTTCCTT -3’　（配列番号１０）
　上記ＰＣＲの反応産物１μＬをＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（アジレント社製）、及びＭｕｌｔｉＮＡ（島津製作所製）を用いて解析した。
　エクソン５０がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「Ａ」と、エクソン５０がスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量「Ｂ」を、バンドのシグナル強度として測定した。これら「Ａ」及び「Ｂ」の測定値に基づき、上述の式（１）に従って、スキッピング効率を求めた。
（２）試験結果
　各アンチセンスオリゴマーについて得られたエクソン５０のスキッピング効率の結果を図１～３に示す。また、これらの結果より算出した、各アンチセンスオリゴマーが５０％のスキッピング効率ＥＳを示す有効濃度（ＥＣ５０）の値を下記表２～４に示す。本試験により、各アンチセンスオリゴマーのうち、ＰＭＯ　Ｎｏ．１～４はスキッピング効率ＥＳが高くＥＣ５０の値が低いため、エクソン５０を有効にスキッピングさせることが判明した。
　また、ＰＭＯ　Ｎｏ．３及び４と同様に全長が１９ｍｅｒと短いアンチセンスオリゴマーのうち、ＰＭＯ　Ｎｏ．５～７はスキッピング効率が低くＥＣ５０の値が高かった。ＰＭＯ　Ｎｏ．３及び４とＰＭＯ　Ｎｏ．５～７は標的とする塩基配列の重複の程度も大きいことから、エクソン５０のスキッピングに対するＰＭＯ　Ｎｏ．３及び４の有効性は特筆すべきものである。
　この結果により、本発明のアンチセンスオリゴマーは、従来技術と比較してその長さが短い場合であっても、エクソン５０のスキッピングを高効率に誘導することができることが示された。
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
  
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
  
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
  
 
［実施例３：アンチセンスオリゴマーの溶解性試験］
アンチセンスオリゴマーの生理食塩水に対する溶解性試験
　実施例２でスキッピング効率ＥＳが高かったアンチセンスオリゴマーのうち、全長が１９～２０ｍｅｒと短く合成が簡便であるＰＭＯ　Ｎｏ．２、３、４の各アンチセンスオリゴマーについて、医薬用途への有用性をさらに検証するため、生理食塩水に対する溶解性試験を行った。
（１）試験方法
　４．５　ｍｇの上記各アンチセンスオリゴマーが入ったサンプル瓶に生理食塩水４５μＬを加え、超音波とボルテックスを使って撹拌し、１００　ｍｇ／ｍＬの生理食塩水溶液とした。室温で２４時間放置し、沈殿が生じないものを溶解性が高い配列と評価した。
（２）試験結果
　試験した各アンチセンスオリゴマーは、全て生理食塩水に対して１００　ｍｇ／ｍＬ以上の溶解性を示した。これらのアンチセンスオリゴマーは、エクソン５０のスキッピング効率が高く、生理食塩水に対する溶解性も高いため、医薬としての利用価値が高いアンチセンスオリゴマーである。
　以上の結果より、本発明のアンチセンスオリゴマーは、ジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピングを高効率に誘導する活性を維持しつつ、かつ医薬として優れた物性を有することが示された。
　試験例に示す実験結果から、本発明のアンチセンスオリゴマーは、ＲＤ細胞において、著しく高い効率でエクソン５０のスキッピングを誘導することが示された。したがって、本発明のアンチセンスオリゴマーは、ＤＭＤの治療において、非常に有用である。
　配列番号１～１０：合成核酸

Claims (22)

  1. 　下記（ａ）～（ｄ）：
    （ａ）配列番号３～５のいずれかの塩基配列を含むアンチセンスオリゴマー；
    （ｂ）配列番号３～５のいずれかの塩基配列に対して１～５個の塩基が欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列を含み、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピングを誘導する活性を有するアンチセンスオリゴマー；
    （ｃ）配列番号３～５のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピングを誘導する活性を有するアンチセンスオリゴマー；および
    （ｄ）配列番号３～５のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピングを誘導する活性を有するアンチセンスオリゴマー
    からなる群から選択されるアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物。
  2. 　以下の（ｅ）～（ｈ）：
    （ｅ）配列番号３～５のいずれかの塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー；
    （ｆ）配列番号３～５のいずれかの塩基配列に対して１～５個の塩基が欠失および／または置換された塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピングを誘導する活性を有するアンチセンスオリゴマー；
    （ｇ）配列番号３～５のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピングを誘導する活性を有するアンチセンスオリゴマー；および
    （ｈ）配列番号３～５のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピングを誘導する活性を有するアンチセンスオリゴマー
    からなる群から選択されるアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物。
  3. 　前記アンチセンスオリゴマーが、
    　配列番号３～５のいずれかの塩基配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピングを誘導する活性を有するアンチセンスオリゴマー
    である、請求項１又は２に記載のアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物。
  4. 　オリゴヌクレオチドである、請求項１～３のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物。
  5. 　前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも１つのヌクレオチドの糖部分及び／又はリン酸結合部分が修飾されている、請求項４に記載のアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物。
  6. 　前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも１つのヌクレオチドの糖部分が、２’位の－ＯＨ基が、ＯＲ、Ｒ、Ｒ’ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群より選択されるいずれかの基で置換されたリボースである、請求項４又は５に記載のアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物。
    （上記Ｒは、アルキル又はアリールを示し、上記Ｒ’は、アルキレンを示す。）
  7. 　前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも１つのヌクレオチドのリン酸結合部分が、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、及びボラノフォスフェート結合からなる群から選択されるいずれか１つのものである、請求項４～６のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物。
  8. 　モルホリノオリゴマーである、請求項１～３のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物。
  9. 　ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、請求項８に記載のアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物。
  10. 　５’末端が、下記化学式（１）～（３）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
      
     
    のいずれかの基である、請求項８または９に記載のアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物。
  11. 　アンチセンスオリゴマーの長さが１９または２０塩基である、請求項１～１０のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物。
  12. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物を含む、筋ジストロフィー治療用医薬組成物。
  13. 　さらに医薬的に許容可能な担体を含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
  14. 　筋ジストロフィー患者に投与するための請求項１２または１３に記載の医薬組成物であって、前記患者が、ジストロフィン遺伝子にエクソン５０のスキッピングの対象となる変異を有する患者である、医薬組成物。
  15. 　前記患者が、少なくともエクソン５０近傍のエクソンの欠失によるフレームシフト突然変異を有するとともにエクソン５０のスキッピングによりアミノ酸の読み取り枠が修正されるジストロフィン遺伝子を有する、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 　前記患者が、ジストロフィン遺伝子にエクソン５１、５１－５３、５１－５５、または５１－５７の欠失によるフレームシフト突然変異を有する、請求項１４または１５に記載の医薬組成物。
  17. 　前記患者がヒトである、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  18. 　筋ジストロフィー治療用医薬の製造における請求項１～１１のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物の使用。
  19. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物の有効量、または請求項１２～１６のいずれか１項に記載の医薬組成物を、筋ジストロフィー患者に投与する工程を含む、筋ジストロフィーの治療方法。
  20. 　前記患者がヒトである、請求項１９に記載の治療方法。
  21. 　筋ジストロフィーの治療に使用するための、請求項１～１１のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物、または請求項１２～１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  22. 　前記治療において、筋ジストロフィー患者がヒトである、請求項２１に記載のアンチセンスオリゴマーもしくはその医薬的に許容可能な塩またはそれらの水和物、または医薬組成物。 
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