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WO2021123665A1 - Détection de npr1 pour l'évaluation de l'activation des mécanismes de défense des plantes - Google Patents

Détection de npr1 pour l'évaluation de l'activation des mécanismes de défense des plantes Download PDF

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Publication number
WO2021123665A1
WO2021123665A1 PCT/FR2020/052533 FR2020052533W WO2021123665A1 WO 2021123665 A1 WO2021123665 A1 WO 2021123665A1 FR 2020052533 W FR2020052533 W FR 2020052533W WO 2021123665 A1 WO2021123665 A1 WO 2021123665A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
npr1
plant
seq
antibody
protein
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/FR2020/052533
Other languages
English (en)
Inventor
Alia DELLAGI
Camille VERLY
Loïc RAJJOU
Frédéric Giraud
Marie-Emmanuelle SAINT MACARY
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Staphyt
Institut des Sciences et Industries du Vivant et de lEnvironnement AgroParisTech
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Original Assignee
Staphyt
Institut des Sciences et Industries du Vivant et de lEnvironnement AgroParisTech
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Staphyt, Institut des Sciences et Industries du Vivant et de lEnvironnement AgroParisTech, Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement filed Critical Staphyt
Priority to BR112022012272A priority Critical patent/BR112022012272A2/pt
Priority to EP20848958.3A priority patent/EP4077393A1/fr
Publication of WO2021123665A1 publication Critical patent/WO2021123665A1/fr
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/415—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from plants

Definitions

  • the invention relates to antibodies directed specifically against the monomeric form of the NPR1 protein, as well as their use in methods for detecting the activation of the defenses of a plant by the detection or quantification of the monomeric form of the NPR1 protein.
  • An optical transmitter / receiver developed by the Force A company and called Multiplex®, allows the "dosage" of molecules, such as anthocyanins, flavonols, etc.
  • This portable tool enables rapid acquisition of easily usable data.
  • non-destructive measurements allow multiple measurements to be taken on the same organ, thus providing information on the evolution of responses over time.
  • the assayed markers are not very specific. These are secondary metabolism compounds specific to each variety of plants that have very diverse roles in the physiology and development of these plants.
  • qPFD Low Quantitative Density Chip: RT-PCR quantitative microplate / low density DNA chip
  • GUSTAVE GUS Technology for Analysis and Validate plant Elicitor
  • the GUS enzyme When the X-Gluc substrate (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-glucuronic acid, cyclohexylammonium) is supplied to the plant, the GUS enzyme will cleave this substrate and produce an insoluble blue precipitate). A blue coloration then appears if the marker gene is expressed, thus allowing spatial localization of the establishment of the defenses.
  • Use of this assay allows rapid screening for SDPs which are capable of activating defenses by easily visualizing expression of marker genes representing either of the two main known defense pathways. It is thus easy to see if the product is capable of activating plant defenses, but also to know what type of defense is activated.
  • Protection tests are also offered by multiple companies. These tests make it possible to observe in controlled conditions or in the field the effectiveness of an SDP in terms of protection against pathogens. These tests therefore make it possible to show the effectiveness of an SDP but in no way show the activation of the defenses by this product.
  • NPR1 protein is a key protein for plant immunity. It is necessary for the establishment of acquired systemic resistance (SAR) involving the phytohormone salicylic acid (SA) and induced systemic resistance (ISR) involving the pair of phytohormones jasmonic acid / ethylene (JA / Et) which are forms of immunity that can last up to several weeks or even months.
  • SAR acquired systemic resistance
  • ISR induced systemic resistance
  • the NPR1 protein is found in monomeric or oligomeric form in the plant cell.
  • the literature indicates that the level of concentration of the monomer is correlated with its activity.
  • Patent application WO9806748 describes acquired resistance polypeptides such as NPR1, capable of conferring on a plant expressing said polypeptide resistance to a phytopathogenic agent. Phenotypes of NPR1 mutants demonstrated the biological importance of the Arabidopsis thaliana NPR1 gene in controlling the defense response against a broad spectrum of pathogens.
  • An anti-NPR1 antibody is marketed by the company AGRISERA
  • Zhonglin Mou ET AL describe the role of NPRI in the acquired systemic resistance (SAR) of plants as well as the mechanisms allowing to confer on plants a broad spectrum immunity against pathogens.
  • Two antibodies were used. The first is a polyclonal antibody directed against the N-terminal part of NPR1 in Arabidopsis thaliana. The second is a monoclonal antibody directed against a peptide of 16 amino acids of the C-terminal part of NPR1 in Arabidopsis thaliana. This antibody binds to the monomeric and oligomeric form of NPR1 (“inducers of plant systemic acquired resistance regulate NPR1 function through redox changes gene expression through interaction with transcription”, Cell, June 27, 2003, pages 935-944).
  • the inventors have advantageously developed two consensus degenerate peptides, highly immunogenic, which have made it possible to generate antibodies making it possible to specifically target the active form of NPR1 in various plant species of agronomic interest.
  • the present invention therefore relates to anti-NPR1 antibodies directed specifically against the monomeric form of the NPR1 protein, preferably the present invention relates to anti-NPR1 antibodies directed specifically against a specific consensus sequence.
  • the inventors have in fact developed and used an immunization strategy making it possible to obtain antibodies specific for an active form of NPR1, ie, the monomeric form of the NPR1 protein. This approach has the advantage of showing the activation of plant defenses regardless of the hormonal pathway implemented, on different plants.
  • the antibodies according to the invention are not limited to the detection of NPR1 in Arabidopsis thaliana, but make it possible to target the monomeric form of NPR1 in different plant species.
  • NPR1 was chosen as an immunity marker making it possible to detect in a multi-specific and broad spectrum manner the activation of plant defenses, on the basis of consensus peptides allowing to be representative of a large part of the plant kingdom.
  • the present invention also relates to a method for detecting the activation of the defenses of a plant by the detection or quantification of the monomeric form of the NPR1 protein in a plant sample using an anti-NPR1 antibody according to the present invention. invention.
  • this method will allow the screening of molecules, potentially SDP, on all plants of agronomic interest, for the emergence of new active substances with SDP activity, to demonstrate the activation of plant defenses following the '' application of a product, to verify in situ the activation of defenses following the application of SDP, to select varieties highly receptive to SDP, to measure the activation of the defense mechanisms of plants before treatment, and to select a plant exhibiting a state of stimulation of natural defenses capable of conferring improved resistance to at least one biotic or abiotic stress.
  • the use of the specific anti-NPR1 antibodies according to the present invention makes it possible to detect, quantify and evaluate, in a simple, rapid and low-cost manner, the activation of the defense mechanisms of a plant, on the majority of plants of agronomic interest.
  • Fig. 1 represents the position of the two consensus degenerate peptides used to produce the antibodies according to the present invention and directed against the consensus NPR1 protein of different plant species.
  • Antipeptide 0 (antipepO) was produced using degenerate peptide 0 of consensus sequence SEQ ID NO 1 by injection of peptides of sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 in rabbits.
  • Antipeptide 1 was produced using degenerate peptide 1 of consensus sequence SEQ ID NO 6, by injection of peptides of sequences SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 , SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 in rabbits.
  • FIG. 2 represents the recombinant proteins (prot T, P and I) as a function of their positions relative to the NPR1 protein of A. thaliana.
  • FIG. 3 is a western blot performed using antipeptideO on plant extracts of A. thaliana whose defenses were activated using Bion® (1) or Salicylic Acid SA (2) or not activated using water (3).
  • a 37kDa band is only detected (1 and 2) when the defenses are activated and this band is not detected when the defenses are not activated (3).
  • FIG. 4 shows western blots carried out by hybridization of the various recombinant proteins with the anti-histidine tag antibody (1, 3 and 5) and with the antipeptideO (2, 4 and 6).
  • a band corresponding to the prot T is detected with the two antibodies (1 and 2).
  • Bands of the same size corresponding to prot P (3 and 4) as well as to prot I (5 and 6) are also hybridized with these same antibodies on the corresponding protein extracts. The same bands are therefore detected with these two antibodies when different forms of recombinant proteins having a histidine tag are used.
  • Fig. 5 shows western blots carried out by hybridization of the various recombinant proteins with the anti-histidine tag antibody (1, 3 and 5) and with the antipeptideO (2, 4 and 6).
  • a band corresponding to the prot T is detected with the two antibodies (1 and 2).
  • Bands of the same size corresponding to prot P (3 and 4) as well as to prot I (5 and 6) are also hybrid
  • FIG. 5 shows western blots performed by hybridization of extracts of A. thaliana, whether or not treated with different defense activators, with commercial anti-NPR1 antibody (1, 3 and 5) as well as with antipepO (2, 4 and 6).
  • Defenses involving the JA / Et pathway are activated using Methyl-Jasmonate (Me-JA), those involving the SA pathway are activated using SA.
  • Me-JA Methyl-Jasmonate
  • SA Sethyl-Jasmonate
  • plants treated with water are used. It is shown that the same band is found regardless of the antibody used and whether the defenses are activated using Me-JA (3 and 4) or using SA (5 and 6).
  • FIG.6 shows two western blots carried out by hybridization of extracts of A. thaliana whose defenses were activated using SA, with antipeptides 0 and 1 (antipepO and antipepl). The same band is found at 37kDa (1 and 2) regardless of the antipeptide used.
  • Fig. 7 shows two western blots carried out by hybridization of extracts of A. thaliana whose defenses were activated using SA, with antipeptides 0 and 1 (antipepO and antipepl). The same band is found at 37kDa (1 and 2) regardless of the antipeptide used.
  • Fig. 7 shows two western blots carried out by hybridization of extracts of A. thaliana whose defenses were activated using SA, with antipeptides 0 and 1 (antipepO and antipepl). The same band is found at 37kDa (1 and 2) regardless of the antipeptide used.
  • Fig. 7 shows two western blots carried out by hybridization of extracts of A
  • FIG. 7 shows western blots performed by hybridization of immunoprecipitation (IP) eluates with antipeptideO.
  • the antibodies used during the PI are released during elution and are therefore detected (1, 2 and 3). These antibodies enabled the 37kDa protein to be immunoprecipitated when extracts of A.thaliana whose defenses have been activated with SA are used (4 and 6).
  • AntipepO is also able to immunoprecipitate protP (5), on the other hand the commercial antibody does not allow it as shown by the absence of band at the expected size (7).
  • FIG. 8 shows the level of expression of a marker gene of the defenses (PR5) of different samples measured by qPCR (1, 2, 3 and 4) as well as the intensity of the 37kDa band detected by western blot on these same samples (5, 6, 7 and 8).
  • the amount of protein deposited does not explain the difference in intensity of these bands as shown by the Coomassie blue staining performed on the membrane (9).
  • the level of activation of the defenses measured by qPCR is correlated with the intensity of the band found in Western blot.
  • FIG. 9 shows a western blot carried out by hybridization of extracts of tomato, whose defenses have been stimulated or not by spraying SA, Me-JA or water, with antipepO.
  • a band is detected around 40kDa with greater intensity on extracts from plants treated with SA (2) and Me-JA (3) than on plants treated with water (1).
  • the amount of protein deposited does not explain the difference in intensity of these bands as shown by the Coomassie blue staining performed on the membrane (4).
  • the present invention therefore relates to an anti-NPR1 antibody characterized in that said antibody binds specifically to the monomeric form of the NPR1 protein.
  • the NPR1 protein (Non expressor of Pathogenesis Related protein 1), also known as nim1 and sai1, is a protein involved in various immune signaling pathways, in systemic acquired resistance (SAR), involving the phytohormone salicylic acid (SA) , induced systemic resistance (ISR) involving the pair of phytohormones jasmonic acid / ethylene (JA / Et) as well as local acquired resistance (LAR).
  • SAR systemic acquired resistance
  • ISR induced systemic resistance
  • JA / Et phytohormones jasmonic acid / ethylene
  • LAR local acquired resistance
  • NPR1 is present in dynamic equilibrium between high molecular weight oligomers (linked via intermolecular disulfide bridges), which are inactive, and monomers which are the active form of the protein.
  • the status of the protein is tightly controlled by redox changes in the plant cells that are triggered by external aggression such as temperature, UV radiation, infection, a pathogen or treatment with a substance such as salicylic acid (SA), or Methyl-Jasmonate (Me-Ja) or the Bion®.
  • SA salicylic acid
  • Bion® Bion®
  • the antibodies according to the present invention bind specifically to the monomeric form, i.e., to the active form of NPR1.
  • Anti-NPR1 antibodies recognize and bind specifically to the monomeric form of the NPR1 protein rather than the oligomeric form.
  • the term “anti-NPR1 antibody which binds specifically to the monomeric form of the NPR1 protein” is understood to mean an antibody which has a high affinity for its target molecule, ie, for the monomeric form of the protein. NPR1 protein.
  • the terms “specifically binds” or “specifically recognizes” are used herein to indicate that the antibody has the ability to recognize and interact with the monomeric form of NPR1, while having relatively few detectable interactions with it. the oligomeric form of NPR1.
  • the antibody binds specifically to the monomeric form of NPR1 if its affinity is significantly higher for the monomeric form of NPR1 than for the oligomeric form of NPR1, preferably, the anti-NPR1 antibody according to the present invention does not bind to the oligomeric form of NPR1.
  • antibody and “immunoglobulin” are equivalent and can be used interchangeably.
  • An antibody or immunoglobulin is a glycoprotein synthesized in response to an antigen, capable of recognizing and fixing the antigen responsible for its production.
  • antibody denotes immunoglobulins or immunologically active parts of immunoglobulin, that is to say molecules which contain an antigen binding site which immunospecifically binds to said antigen.
  • antibody encompasses not only whole antibody molecules, but also antibody fragments as well as variants (including derivatives) of antibodies.
  • immunoglobulin molecules have a basic structure made up of four polypeptide chains linked together by disulfide bonds. Each light chain is made up of approximately 220 amino acids and has a molecular weight of approximately 25 kilodaltons (kDa). Each heavy chain consists of approximately 400 amino acids and has a molecular weight of 50 to 70 kDa.
  • the heavy chains are structurally distinct. Both heavy chains and light chains contain two different regions.
  • the constant regions (CL and CH) have amino acid sequences that do not vary significantly between antibodies of the same class.
  • the variable regions (VL and VH) of antibodies have different sequences. Folded together, the variable regions (VL and VH) form the binding site of the antibody (Microbiology, L. Prescott 2002).
  • the anti-NPR1 antibody is a polyclonal antibody.
  • Polyclonal antibodies have the advantage of being generated quickly (for example in a few weeks), more easily and at a lower cost compared to monoclonal antibodies. In addition, because they recognize multiple epitopes, polyclonal antibodies generally have a broader spectrum of activity than monoclonal antibodies.
  • the polyclonal antibodies are preferably non-human polyclonal antibodies.
  • the polyclonal antibodies can be chosen from the group consisting of rabbit polyclonal antibodies, mouse polyclonal antibodies, rat polyclonal antibodies, guinea pig polyclonal antibodies, chicken polyclonal antibodies, goat polyclonal antibodies, polyclonal cow antibodies, polyclonal sheep antibodies and combinations thereof.
  • the polyclonal antibodies are polyclonal rabbit antibodies.
  • a person skilled in the art can use any technique to develop polyclonal or monoclonal antibodies directed specifically against the monomeric form of the NPR1 protein, so that said antibodies bind specifically to an NPR1 antigen.
  • antigen includes all substances such as proteins, nucleoproteins, polysaccharides, peptides and certain glycolipids which induce an immune reaction and which react with the products of these responses.
  • Each antigen can have several antigenic determinants or epitopes. Epitopes are the regions of the antibody that bind to the antigen binding site on a specific antigen (according to Microbiology, L. Prescott 2002).
  • the inventors of the present invention have advantageously carried out an alignment of the sequences of the NPR1 protein originating from several plant species (beet, alfalfa, cotton, cocoa, tomato, potato, castor, pepper, poplar, tobacco, sweet potato , papaya, vine, brown mustard, rapeseed, apple tree, etc.) as well as that of Arabidopsis thaliana [0051]
  • a consensus sequence of SEQ ID NO: 1 was then identified.
  • peptides are said to be degenerate because two or three amino acids of their sequence are variable, and consensus because the different sequences thus created correspond to the sequences of NPR1 conserved in different plant species. These synthetic peptides were thus used as an antigen to immunize rabbits and to produce the antibodies or antipeptides.
  • antipeptides could alternatively be used. It is in fact used to clarify that these are antibodies created using consensus degenerate peptides. These antipeptides are of the polyclonal type but the strategy implemented could just as well be carried out using monoclonal antibodies.
  • SEC ID NO: 1 The consensus sequence of SEC ID NO: 1 comprises two degenerate amino acids (X1 and X2):
  • X1 can be either a Valine (Val) or an Isoleucine (Ile), and X2 can be a Serine (Ser) or a Proline (Pro).
  • SEQ ID NO: 6 The consensus sequence of SEQ ID NO: 6 comprises three degenerate amino acids (X3 and X4 and X5):
  • X3 can be either a Valine (Val) or an Isoleucine (Ile)
  • X4 can be a Serine (Ser) or a Proline (Pro)
  • X5 can be a Serine (Ser) or a Proline (Pro).
  • the present invention also relates to an anti-NPR1 antibody characterized in that said antibody binds to at least one epitope of the monomeric form of NPR1, of sequence chosen from SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 , SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5.
  • the anti-NPR1 antibody is characterized in that said antibody binds to at least two epitopes of the monomeric form of NPR1 with a sequence chosen from SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5.
  • the anti-NPR1 antibody is characterized in that said antibody binds to at least three epitopes of the monomeric form of NPR1 of sequence chosen from SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5.
  • the anti-NPR1 antibody binds to an epitope of consensus sequence SEQ ID NO: 1 where X1 is a valine or an isoleucine and X2 is a serine or a proline.
  • the anti-NPR1 antibody binds to the sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 5 of the monomeric form of the protein NPR1.
  • the present invention also relates to an anti-NPR1 antibody characterized in that said antibody binds to at least one epitope of the monomeric form of NPR1 with a sequence chosen from SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14.
  • the anti-NPR1 antibody is characterized in that said antibody binds to at least two epitopes of the monomeric form of NPR1 with a sequence chosen from SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14.
  • the anti-NPR1 antibody is characterized in that said antibody binds to at least three epitopes of the monomeric form of NPR1 with a sequence chosen from SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14.
  • the anti-NPR1 antibody is characterized in that said antibody binds to at least four epitopes of the monomeric form of NPR1 with a sequence chosen from SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14.
  • the anti-NPR1 antibody is characterized in that said antibody binds to at least five epitopes of the monomeric form of NPR1 with a sequence chosen from SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14.
  • the anti-NPR1 antibody is characterized in that said antibody binds to at least six epitopes of the monomeric form of NPR1 with a sequence chosen from SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14.
  • the anti-NPR1 antibody is characterized in that said antibody binds to at least seven epitopes of the monomeric form of NPR1 with a sequence chosen from SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14.
  • the anti-NPR1 antibody binds to an epitope of consensus sequence SEQ ID NO: 6 where X3 is a valine or an isoleucine, X4 is a serine or a proline and X5 is a serine or a proline.
  • the anti-NPR1 antibody binds to the sequences SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 of the monomeric form of the NPR1 protein.
  • Polyclonal antibodies are preferably obtained or can be obtained from at least one biological sample of an animal immunized with at least one antigen preferably comprising or consisting of at least one sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and / or of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO:
  • the polyclonal antibodies can be obtained by immunizing a non-human animal with an antigenic composition comprising a mixture of antigens of sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4 and SEQ ID NO: 5 and / or a mixture of antigens of sequences SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14.
  • antipeptide 0 or "antipep 0" is understood to mean a non-human polyclonal antibody obtained by immunization of a non-human animal with an antigen composition comprising a mixture of peptides of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 , SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5.
  • antipeptide 1 or “antipep 1” is understood to mean a non-human polyclonal antibody obtained by immunization of a non-human animal with an antigen composition comprising a mixture of peptides of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 , SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:
  • Another object of the invention is a method for producing polyclonal antibodies as defined above, in which said method comprises the steps of:
  • - provide a biological sample from an animal immunized with at least one antigen preferably comprising or consisting of at least one sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and / or of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 ;
  • the present invention also relates to a method for detecting the activation of the defenses of a plant comprising the detection of the form monomeric of the NPR1 protein in a sample of said plant, using an anti-NPR1 antibody according to the present invention.
  • the use of the specific anti-NPR1 antibodies according to the present invention make it possible to target the active form of the NPR1 protein of different species of plants in order to detect the defenses put in place by the plants, and this for the majority. plants of agronomic interest.
  • activation of the defense mechanisms of plants is meant the development of a set of biological modifications which confer on this plant i) immediate resistance, in particular LAR (local acquired resistance), ii) induced systemic resistance ( ISR) and / or SAR (systemic acquired resistance) and / or iii) a pre-sensitization of the potentiation type thanks to which it becomes capable of reacting more effectively to a subsequent biotic or abiotic stress.
  • the activation of the defense mechanisms of plants also means the activated or non-activated state of the various molecular pathways involved in the natural defense mechanisms and in particular according to the pathway involving salicylic acid but also those involving the acid. jasmonique.
  • the activation of plant defense mechanisms also refers to stress resistance, that is, the ability of a plant to cope with biotic and / or abiotic stresses.
  • Biotic stress is caused by a living organism. These include any harmful organism affecting the health of a plant. These are all living organisms capable of attacking a cultivated plant. These include pests (insects, nematodes, spiders), disease-causing agents (fungi, oomycetes, bacteria, viruses, viroids) and all weeds (weeds). Mention may also be made of animals such as rodents or ruminants.
  • Abiotic stress is caused by environmental conditions (excluding living organisms) such as drought, cold, ultraviolet rays, etc. (Methodological guide for evaluating the effectiveness of Plant Defense Stimulators (SDP).
  • SDP Plant Defense Stimulators
  • plant is understood to mean, for example, a plant at any stage of development whatsoever, in particular an embryo or any other stage of the seedling or of the adult plant.
  • the plants are chosen from fruit trees, vegetable crops, vines, cereals and oilseeds, protein crops, oil-protein crops, tobacco, plants belonging to the Brassicaceae family and ornamental plants.
  • the plants will be chosen from Arabidopsis thaliana, beet, alfalfa, cotton, cocoa, tomato, potato, castor oil, chili, poplar, tobacco, sweet potato , papaya, vine, brown mustard, rapeseed, apple tree, wheat, strawberry, cabbage, salad.
  • sample is understood to mean any sample making it possible to detect and quantify the monomeric form of NPR1.
  • the sample can be obtained from the whole plant (e.g. a seed or a young plant), a part of the plant, or a plurality of plants or parts of plants, such as a batch of. plants or leaves. Those skilled in the art know how to obtain such samples for the detection and quantification of a protein.
  • part of the plant for example the pollen, the ova, the embryos, the aerial parts (stems and leaves), the leaves, the anthers, the stems, the petioles, the roots, the fruits, the seeds, flowers, buds, protoplasts, calluses, cells and cellular tissues.
  • the aerial parts will be used.
  • any means for detecting and / or quantifying the monomeric form of NPR1 in a sample can be used.
  • the monomeric form of the NPR1 protein can be detected and / or quantified in the method according to the present invention by Western blot, an ELISA test (Enzyme Link ImmunoSorbent Assay) or a strip test of the LFD type (Lateral Flow Device. or Lateral Flow Immunchromatograhic Assay).
  • the detection of the monomeric form of NPR1 by the specific antibodies according to the present invention makes it possible to identify a plant exhibiting an induction of the activation of its defense mechanisms.
  • the monomeric form of NPR1 will be quantified.
  • the quantification of the monomeric form of NPR1 can be expressed in an arbitrary unit to reflect the amount of the monomeric form of the NPR1 protein in the sample.
  • the value may consist of the concentration of the monomeric form of the NPR1 protein, measured by any method for quantifying proteins known to those skilled in the art, such as by Western blot.
  • the method for detecting / quantifying the activation of the defenses of a plant may comprise an additional step of comparison with a reference sample, in order to determine or quantify the state of activation of the defenses. of said plant.
  • reference sample means a sample obtained from a plant or parts of a plant whose state of activation of the defenses is known.
  • the reference samples can be derived from plants or parts of plants which are untreated or unstressed, or which are previously subjected to SDP or to biotic or abiotic stress.
  • active substance capable of activating the defenses of a plant or "Plant Defenses Stimulator” or “SDP” or “natural defenses stimulators” or “SDN” is understood to mean any substance or any non-living microorganism. pathogen, which applied to a plant, is capable of promoting a significantly higher resistance state compared to an untreated plant in the face of biotic or even abiotic stresses.
  • An SDP does not act generally not directly on pests, it is perceived by the plant as a warning message. This will react by preparing or setting up different defense mechanisms, which will help make it more resistant to pest attacks.
  • SDP a product effective on a plant-pathogen pair, not exhibiting noticeable direct effect on the pathogen at the dose effective on the plant, and capable of inducing, under these conditions, known defense markers ( PR proteins, lipoxygenase, phenylalanine ammonia-lyase, ).
  • SDPs are for example described in application WO2011 / 161388 and can be classified into two main families: i) compounds known as “direct stimulators”, which lead, once applied to the plant, to complete activation of the reactions of defense, whether or not there is the presence of pathogens, and ii) compounds known as “potentiators”, which trigger, after application to the plant, only the aforementioned “potentiation” phenomenon (the defense reactions only activate 'following an attack by a pathogen or stress).
  • Bion® can be sprayed on the plants or parts of plants, to obtain a reference sample representative of bacterial stress.
  • SA salicylic acid
  • Methyl-Jasmonate can be applied to the plant or part of a plant.
  • the plant or part of a plant can be exposed to UV radiation, heat, cold, etc.
  • water can be sprayed on the plants or parts of plants.
  • unstressed reference sample the plant or part of a plant can be isolated in a preserved and controlled environment.
  • an SDP can be applied to the plant or part of a plant.
  • detection of the monomeric form of the NPR1 protein will be significant for the activation of a plant's defenses.
  • the method according to the present invention makes it possible to detect and / or measure the activation of the defense mechanisms of plants by the detection and / or the quantification of the monomeric form of the NPR1 protein.
  • the method will make it possible to detect / measure the activation of plant defense mechanisms in the field before treatment to facilitate decision support and the positioning of SDP according to the reactivity of the targeted plants.
  • the method according to the invention also makes it possible to advantageously demonstrate the activation of the defenses following the application of a product as requested in the context of the method of the Biological Test Commission (CEB) on the "general principles of experimentation with stimulators of plant defenses ”(general method MG14), necessary for the approval process and regulating the marketing of the product.
  • CEB Bio Test Commission
  • this immunological detection and quantification technique can be used in different species of plants in order to be able to be widely used on different crops of agronomic interest.
  • the present invention also relates to a method of screening for active substances capable of activating the defenses of a plant comprising: a) treating a sample of said plant with at least one substance; b) detection in said sample of the monomeric form of the NPR1 protein according to the detection method according to the present invention.
  • the present invention also relates to a method of screening for active substances capable of activating the defenses of a plant comprising a) treating a sample of said plant with at least one substance; b) quantification in said sample of the monomeric form of the NPR1 protein according to the detection method according to the present invention.
  • the present screening method makes it possible to screen potentially SDP molecules in the laboratory in order to allow the emergence of new active substances with SDP activity.
  • the detection and / or quantification of the monomeric form of NPR1 by the antibodies according to the present invention will make it possible to determine the efficiency of a molecule as SDP.
  • the term "substance” means any substance or any non-pathogenic living microorganism, the properties of which of promoting a significantly higher state of resistance compared to an untreated plant in the face of biotic or even abiotic stresses are not. known.
  • the method according to the present invention thus makes it possible to screen any active compound or active, biological or chemical composition.
  • the detection of the monomeric form of the NPR1 protein will be indicative of the efficacy of the substance tested, and will make it possible to classify said substance as SDP.
  • the screening method may comprise an additional step of comparison, with a reference sample, of the monomeric form of the NPR1 protein according to the detection method according to the present invention.
  • the amount of the monomeric form of the NPR1 protein in the plant sample can be compared to the amount of the monomeric form of the NPR1 protein in the reference sample.
  • a significant increase in the amount of the monomeric form of the NPR1 protein in the plant sample compared to the reference sample is synonymous with the effectiveness of the substance as SDP and may allow it to be classified as said.
  • substance as SDP while the absence of significant variation may be synonymous with lack of efficacy as SDP.
  • the invention also relates to a method for evaluating the sensitivity of a plant to a molecule capable of stimulating the defenses of a plant comprising: a) treating a sample of said plant with a molecule capable of stimulating plant defenses; b) detection in said sample of the monomeric form of the NPR1 protein according to the present invention.
  • the invention also relates to a method of evaluating the sensitivity of a plant to a molecule capable of stimulating the defenses of a plant comprising: a) the treatment of a sample of said plant with a molecule capable of stimulate plant defenses; b) quantification in said sample of the monomeric form of the NPR1 protein according to the present invention.
  • the detection of the monomeric form of the NPR1 protein will make it possible to conclude on the sensitivity of the plant to the molecule capable of stimulating the defenses of a plant.
  • the method of evaluating the sensitivity of a plant to a molecule capable of stimulating the defenses of a plant could comprise an additional step of comparison with a reference sample, in order to determine or evaluate the state of activation of said plant from the concentration of the monomeric form of NPR1 obtained in the quantification step.
  • the amount of the monomeric form of the NPR1 protein in the plant sample can be compared to the amount of the monomeric form of the NPR1 protein in the reference sample.
  • a significant increase in the amount of the monomeric form of the NPR1 protein in the plant sample compared to the reference sample is indicative of the plant's sensitivity to the molecule capable of stimulating a plant's defenses.
  • the present evaluation method thus and advantageously makes it possible to select varieties highly receptive to SDP, in the context of varietal selection or else to optimize the plant variety / SDP pairs. [0135] Method for selecting a plant exhibiting improved resistance
  • the present invention also relates to a method for selecting a plant exhibiting a state of activation of the defenses capable of conferring on it an improved resistance to at least one biotic and / or abiotic stress comprising: i) the application of said stress (s) to a sample of said plant, ii) detection in said sample of the monomeric form of the NPR1 protein according to the detection method of the present invention.
  • the present invention also relates to a method for selecting a plant exhibiting a state of activation of the defenses capable of conferring on it an improved resistance to at least one biotic and / or abiotic stress comprising: i) the application of said or said stress to a sample of said plant, ii) quantification in said sample of the monomeric form of the NPR1 protein according to the detection method of the present invention.
  • the detection of the monomeric form of the NPR1 protein in the plant sample will be synonymous with improved resistance to at least one biotic and / or abiotic stress and will allow the plant to be selected for its activating properties. improved defenses.
  • the selection method may further comprise a step of comparison with a reference sample to determine or evaluate the state of stimulation of the natural defenses of the plant in order to select said plant if the plant has a state of activation of the plants.
  • defenses capable of giving it improved resistance to at least one biotic or abiotic stress.
  • a significantly increased concentration of the monomeric form of the NPR1 protein, in comparison with a reference sample not subjected to a stress and / or a SDP makes it possible to identify the plants or parts of plants exhibiting a state of. activation of defenses and improved resistance.
  • Kit for implementing the methods according to the invention [0140]
  • the present invention also relates to a kit for the implementation of detection, screening and activation methods according to the present invention comprising an anti-NPR1 antibody according to the invention.
  • the production of the consensus degenerate peptides and the antibodies according to the present invention was carried out by the company GENEPEP. For this, they first synthesized the two peptides (pepO) and (pep1) as represented in FIG. 1 on the basis of the two consensus sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 6.
  • the peptides of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, were used as an immunogen in order to induce an immune reaction directed against these peptides in the rabbit.
  • the peptides of sequences defined above were injected into 2 rabbits each and this 5 times during the life of the rabbits. All of their blood was then drawn in order to extract the serum containing the antibodies recognizing the injected peptides.
  • the rabbit serum obtained is used to purify the antipeptides (antipeptide 0 or antipepO and antipeptide 1 or antipepl) specific for the active form of NPR1, according to the following method:
  • the membrane is a 1.5 x5cm Polyvinylidene difluoride (PVFD) membrane activated beforehand for 10 min in absolute ethanol and then dried. This membrane is then transferred to a hemolysis tube and then saturated with 1 ml of 0.1% tween phosphate buffer (PBST) + 5% milk (Régilait® skimmed milk powder) with stirring for 1 hour at 4 ° C. A milliliter of corresponding serum is added thereto before incubation with shaking overnight at 4 ° C. The membrane is then washed 4 times with 2 ml of PBST, stirring for 15 min at 4 ° C.
  • PVFD Polyvinylidene difluoride
  • the antipeptides are then eluted by acid shock (1 ml of 50 mM glycine, 500 mM NaCl, 0.1% Tween 20, 1% BSA, pH 3) for 1 min with stirring at 4 ° C.
  • the 1 ml eluate is recovered and neutralized with 100 ml of 1M Tris Base. This elution is repeated 5 times, and eluates 2 and 3 (the most concentrated in antipeptide) are recovered in order to be concentrated.
  • Plants of A. thaliana are cultivated in soil for 3 weeks in a long day culture chamber (18h of light 60% hygrometry, 21 ° C during the day and 19 ° C at night) then are sprayed with water (negative control) of Bion ® 0.015% or 1mM Salicylic Acid (SA) (SA pathway activation control) or using 0.1 mM Methyl-Jasmonate (Me-JA) in 0.1% dimethylsulfoxide (DMSO) ( Jasmonic Acid (JA) pathway activation witness). The aerial parts of the plants are then harvested 48 hours after spraying and crushed in liquid nitrogen.
  • SA Salicylic Acid
  • Me-JA Methyl-Jasmonate
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • the total proteins of these plants are then extracted at a rate of 1 ml of extraction buffer (50 mM Tris-HCI pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl, 5 mM EDTA, 10% glycerol 4% lodoacetamide, 1X antiprotease (cOmpleteTM, Mini, EDTA-free Protease inhibitor Cocktail, ROCHE)) per mg of frozen powder.
  • the samples are thawed in the buffer by vortexing regularly and then centrifuged (10min, 14000g, 4 ° C). The supernatant is centrifuged again under the same conditions. The final supernatants are recovered and constitute the plant protein extracts used for the various experiments b) Extraction of proteins from other plants
  • Tomato plants were grown in a greenhouse for 4 weeks before being sprayed with SA, Me-JA or water to activate their defenses or not. The aerial parts of these plants are harvested after 48 hours, then powdered in liquid nitrogen and used to extract the proteins.
  • the total proteins of these plants are then extracted at a rate of 2mI of extraction buffer (Tris-Hcl pH7.550mM, NaCl 150mM, EDTA 0.5mM, Triton X1000.1%, nP40 0.2% 1X antiprotease (cOmpleteTM, Mini, EDTA -free Protease inhibitor Cocktail, ROCHE)) per mg powder.
  • the samples are resuspended in the buffer by vortexing regularly and then centrifuged (10 min, 14,000 g, 4 ° C). The supernatant is centrifuged again under the same conditions. The final supernatants are recovered and constitute the plant protein extracts used for the various experiments.
  • 10% acrylamide SDS page gels are used for the migration of protein extracts.
  • 30 ml of plant extract or 25 ml of immunoprecipitation eluate are incubated in 15 ml of Laemmli 2 ⁇ 10 min at 65 ° C. with stirring and then deposited per well.
  • the gels are then migrated in RB1X buffer at constant voltage (100 mV).
  • the proteins having been subjected to electrophoresis are then transferred onto PVFD membranes previously activated for 10 min in absolute ethanol, using the trans-blot® turbo TM transfer System from Bio-rad.
  • the membranes are then rinsed 3 times in phosphate-buffered saline + 1% Tween (PBST) and then saturated with milk protein in PBST + 5% milk (1 hour with 40 rpm stirring, room temperature). They are then incubated overnight in PBST + 5% milk overnight at 4% in the presence of the primary antibody (1/5000 °). The membranes are then washed in PBST (4 ⁇ 10 min + 1x 1 h, 40rpm, room temperature) and then incubated with the secondary antibody (anti-rabbit HRP from sigma, 1/10000, 1h 40rpm, room temperature).
  • PBST phosphate-buffered saline + 1% Tween
  • the membranes are then stained with Coomassie blue for 1 hour at room temperature with stirring at 35rpm.
  • the protein profiles are then revealed by decolorizing the membranes with a decolorizing solution of 10% acetic acid and 10% ethanol overnight at room temperature with stirring at 35rpm.
  • Magnetic beads coupled to protein A are used to perform immunoprecipitation (PI) of proteins A. thaliana or recombinant proteins using the antipeptide or a commercial antibody targeting NPR1 only in this plant species (Agrisera No. AS12 1854).
  • Beads are prepared for each IP. For this, 4 aliquots of 100mI of bead solution are placed in 1.5ml eppendorf tubes then placed on a magnetic rack for 2min. The supernatant is discarded and the beads are washed twice with 500 ml of PBST. The tubes are again placed on the magnetic rack for 2 min, the supernatant is removed and then 90 ml of PBST are placed there. Six microliters of commercial antibody (6pg) and 0.5mI of antipeptide (25pg) are added per tube (qs 100mI PBST) then the whole is incubated for 1 hour 30 minutes at room temperature with stirring on a wheel.
  • 6pg commercial antibody
  • 25pg 0.5mI of antipeptide
  • the supernatant is removed and the beads coupled to the antibodies are washed 3 times with 500 ml of PBST while stirring (5 min) on a wheel. The whole is then taken up in 100 ml of PBST.
  • the antibodies are then covalently linked to the proteins A of the beads by washing them twice for 10 min with stirring with 1 ml of crosslink buffer (200 mM triethanolamine pH 8.2).
  • the tubes are again placed on the magnetic support (2 min) then the supernatant is removed.
  • One milliliter of cross-link + DMP buffer 200 mM triethanolamine pH 8.2 + 20 mM dimethyl pimelimidate dihydrochloride
  • the covalent binding reaction is stopped by removing the supernatant (on a magnetic rack), by adding 1 ml of 50 mM Tris-HCl pH 7.5 (incubation for 15 min at RT with shaking on a wheel) then by washing 3 times 5 min with 500 ml of PBST.
  • the balls tied so covalent to the antibodies are then taken up in 10OmI of PBST and stored at 4 ° C. for the PIs.
  • the tubes are placed on the magnetic rack to remove the supernatant, 800mI of total protein d‘A. thaliana treated with SA or 150mI of recombinant protein (1 pg for each) are placed in the 4 tubes containing magnetic beads linked either to the commercial antibody or to the antipeptide.
  • the 4 tubes are incubated overnight at 4 ° C. on a wheel in order to hybridize the protein or proteins recognized by the antibodies to them.
  • the beads coupled to the antibodies themselves hybridized to the proteins are washed 5 times 5 min with 500 ml of PBST.
  • the proteins recognized by the antibodies are then eluted using 50mI laemmli + 100mM dithiothreitol (DTT) a first time 15min at room temperature (eluate 1) then a second time still using laemmli + 100mM DTT but for 1 hour at 95 ° C (eluate2). These different eluates are then used in WB and SDSpage.
  • DTT dithiothreitol
  • PCRs were carried out using the cDNAs of A. thaliana using standard primers known to those skilled in the art. These primers make it possible to amplify the DNA sequences encoding the three proteins aroused by integrating therein a TEV sequence at 5 ′ allowing the cleavage of the proteins by the TEV protease.
  • the attB1 and attB2 sequences were also added to the primers in order to integrate them respectively in 5 'and in 3' of the PCR products in order to assemble them in the vector pDONR207 by reaction of BP within the framework of cloning by the Gateway® technique.
  • the clones obtained were validated by sequencing (GATC biotech) and then used to purify the donor plasmids (pDONR207 + constructions) for further cloning.
  • the donor plasmids were then used for the recombination reaction (step LR of the Gateway® protocol) with the expression plasmids (PetG10-A) making it possible to add a sequence encoding a histidine tag 5 'of the various sequences of interest. and to translate these sequences into protein in an inducible manner (by adding Isopropyl bDl-thiogalactopyranoside (IPTG)).
  • IPTG Isopropyl bDl-thiogalactopyranoside
  • the expression plasmids obtained were then cloned into the bacterium E. coli dH5a in order to multiply and purify them, then they were cloned into E. coli Rosetta in order to produce the proteins with their histidine tag.
  • the different bacteria having the constructs of interest were cultured in 2I of lysogenic broth + Ampicillin 100pg / nnl + Chloramphenicol 34pg / ml, until having an optical density of 0.6 to 600nm, at 37 ° C.
  • the production of protein is then triggered by adding IPTG (0.5 mM for T and P and 1 mM for I).
  • IPTG 0.5 mM for T and P and 1 mM for I
  • the bacteria are taken 3 hours later for T and P and 4 hours later for I.
  • the cultures are separated into 6 times 40ml each and centrifuged (12000g 15min at 4 ° C).
  • the pellets are frozen in liquid nitrogen for the following steps.
  • the pellets are resuspended in denaturing lysis buffer because the recombinant proteins are in inclusion bodies (100mM NaH2PO4, 10mM pH8 tris, 250mM NaCl, 8M urea, 1mM DTT, 250mM imidazole, 1X antiprotease (cOmpleteTM, Mini , EDTA-free Protease inhibitor Cocktail, ROCHE)) then lysed by sonication (12 pulses of 20 s at 50% amplitude interspersed with a pause of 30 sec, on 2 ° ice). The extracts are then centrifuged (20,000g, 15min 4 ° C) to pellet the cell debris. The supernatants are recovered and used for the various experiments as a recombinant protein.
  • inclusion bodies 100mM NaH2PO4, 10mM pH8 tris, 250mM NaCl, 8M urea, 1mM DTT, 250mM imidazole, 1X antiprotease (cOmpleteTM, Mini
  • Plants of A. thaliana are cultivated in soil for 3 weeks in a long day culture chamber and then sprayed with water (negative control) with 0.015% Bion® (control for activation of the SA pathway). The aerial parts of the plants are then harvested 48 hours after spraying and crushed in liquid nitrogen.
  • RNAs are then extracted with trizol and then are assayed in order to start from 1 ⁇ g of RNA for the DNase and RT steps.
  • the DNA present in the samples is degraded using DNase (1 ⁇ g of RNA, 1 ⁇ l of 10X buffer with MgCl2, 1 ⁇ l of DNase, made up to 10 ⁇ l with DEPC water). The whole is incubated for 45 min at 37 ° C. in a water bath and then 1 ⁇ l of 50 mM EDTA is added before incubation for 10 min at 65 ° C., still in a water bath in order to inactivate the DNase. These DNase-treated RNAs are then used for the retro-transcription (RT) step.
  • RT retro-transcription
  • RNA Five microliters of RNA are incubated at 65 ° C. for 5 min in a water bath with 1 ⁇ l of primers and 6.5 ⁇ l of water treated with diethyl pyrocarbonate (DEPC). Then 4 ⁇ l of 5X RT buffer, 0.5 ⁇ l of Ribolock, 2 ⁇ l of 10 mM dNTPs and 1 ⁇ l of M-MuLV reverse transcriptase are added per tube before incubation for 1 h at 37 ° C. in a water bath. The reverse transcriptase is then inactivated for 10 min at 70 ° C. The cDNAs thus obtained are then diluted by 10 (addition of 180 ⁇ l of water) to be used during the quantitative PCR step. The qPCR reaction is carried out in 10mI, at a rate of 5mI of SybrGreen mix, 0.3mI of mixture of primers at 0.3mM, 2.4mI of water and 2.5mI of cDNA.
  • DEPC dieth
  • the qPCRs are performed using a CFX-96 Real Time PCR System thermal cycler from Bio-Rad.
  • the raw data obtained is processed using the Bio-Rad CFX manager software.
  • the quantity of normalized transcripts is then obtained by calculating the ratio between the data obtained for the defense genes of interest and for the constitutive gene used (here the gene encoding clathrin), taking into account the efficiency of the primers obtained at using the dilution range and their quantity expressed in arbitrary units
  • the objective of the present example is to show that the antibodies according to the present invention make it possible to detect an active form of NPR1.
  • Western blots were therefore made from extracts of A. Thaliana treated with Bion®, SA, or water.
  • a band is detected when the plants are treated with defense activators and is not detected when the plants are treated with water. This band is detected at a size of 37 kDa, as shown in Figure 3.
  • the various recombinant forms of NPR1 produced in E.coli are used in order to carry out tests.
  • Histidine tag Histidine tag
  • antipeptides make it possible to detect a band of the same size by western blot on protein extracts of A. thaliana elicited by SDP, SA, as shown in Figure 6.
  • the antibodies according to the present invention make it possible to specifically detect the active form of the NPR1 protein, unlike the commercial anti-NPR1 antibody which does not make it possible to discriminate the active form from the inactive form of NPR1.
  • the anti-NPR1 antibody thus cannot determine whether the defense mechanisms of plants are activated, since it indiscriminately detects the active and inactive forms of NPR1.
  • Example 2 Presence of the active form of NPR1 during the activation of different defense pathways
  • Example 3 Sensitivity of the method and advantage over the commercial antibody.
  • Antipeptide 0 as well as the commercial antibody were used to perform immunoprecipitation (IP) (Dynabeads TM Protein A, ThermoFisher No. 10001D) on extract of proteins from A. thaliana treated with SA. The 37 kDa band is observed on the electrophoresis of the PI eluate obtained with plant extracts whose defenses have been activated Figure 7.
  • IP immunoprecipitation
  • the antibodies according to the present invention exhibit improved sensitivity compared to a commercial anti-NPR1 antibody and make it possible to detect NPR1 when the commercial antibody does not detect it.
  • Example 4 Quantification of the activation of plant defenses by the antibody according to the present invention
  • the method according to the present invention makes it possible not only to detect the activation of plant defenses but also to quantify the level of activation of plant defenses.
  • Example 5 Detection of the activation of defenses in different plant species by the antibodies according to the present invention
  • a band detected turns out to be much more intense when the protein extract used comes from tomato plants treated with SA or Me-JA compared to the protein extract obtained from the batch of control plants treated with water and this as shown in Figure 9.
  • the use of the specific anti-NPR1 antibodies according to the present invention make it possible to target the active form of the NPR1 protein of different species of plants and also make it possible to detect the defenses of plants set up according to the route involving salicylic acid but also those involving the JA / Et pathway.

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Abstract

La présente invention concerne des anticorps anti-NPR1 dirigés spécifiquement contre la forme monomérique de la protéine NPR1. La présente invention concerne également une méthode de détection de l'activation des défenses d'une plante par la quantification de la forme 5 monomérique de la protéine NPR1 dans un échantillon de plante en utilisant un anticorps anti-NPR1 selon la présente invention.

Description

Description
Titre : Détection de NPR1 pour l’évaluation de l’activation des mécanismes de défense des plantes
Domaine technique
[0001] L’invention concerne des anticorps dirigés spécifiquement contre la forme monomérique de la protéine NPR1, ainsi que leur utilisation dans des méthodes de détection de l’activation des défenses d’une plante par la détection ou quantification de la forme monomérique de la protéine NPR1.
Technique antérieure
[0002] La réduction de l’usage des produits phytosanitaires conventionnels, prévue dans le plan Ecophyto 2025, se traduit par le développement de nouvelles stratégies pour des pratiques agricoles plus durables et plus respectueuses de l’environnement. Dans ce contexte, de nouvelles variétés moins dépendantes d’intrants sont destinées à apparaître et de nouvelles pratiques associées à ces variétés sont à mettre au point. Le développement de SDP (molécules capables de stimuler les défenses naturelles des plantes) est une stratégie qui attire de plus en plus l’attention. Les SDP peuvent être d’origine naturelle ou de synthèse, mais sont soumis dans les deux cas à la règlementation en vigueur concernant la mise sur le marché des produits phytopharmaceutiques (Règlement CE n°1107/2009).
[0003] Cependant, bien qu'ils constituent une stratégie prometteuse en faveur d'une agriculture plus durable, l’efficacité des SDP sur le terrain reste aléatoire et il n'existe pas ou peu d'outils pour évaluer leur capacité d'activation. Ainsi, de nombreux projets de produits SDP développés en laboratoire ne peuvent aboutir à des autorisations de mise sur le marché (AMM), par manque de moyens d’analyses et/ou en raison des résultats inexploitables des expérimentations menées en conditions naturelles. En pratique, les traitements à l’aide de SDP sont généralement positionnés en préventif et renouvelés car leur persistance d’action est limitée. Il arrive également que les plantes ne soient pas réceptives au moment du traitement (variétés, stade végétatif...). De plus, au-delà d’une certaine pression parasitaire, un traitement chimique d’appoint est recommandé (en mélange ou dissocié). Plusieurs tests en conditions semi-contrôlées ont infirmé les résultats d’études obtenus en laboratoire et ainsi plusieurs produits et molécules ont été mises au ban. Ce phénomène de discordance entre les résultats d’efficacité obtenus en conditions plus ou moins contrôlées (phytotron vs serre) est encore plus flagrant lorsque les essais se font en conditions naturelles (plein champ). En effet, les aléas climatiques sont inévitables et la pression parasitaire est parfois très variable. Les résultats de ces essais sont alors aléatoires, difficilement exploitables et leur reproductibilité est faible. Certains produits ont néanmoins réussi à prouver leur efficacité, mais il existe une disparité importante dans les méthodes d’évaluation des produits.
[0004] L’identification de molécules SDP efficaces ainsi que de variétés hautement réceptives requiert des outils de criblage fiables, efficaces et utilisables en routine. La mise au point d’une méthode fiable de détection de l’activation des mécanismes de défense des plantes est un enjeu majeur pour évaluer ce type de produits sur le terrain dans les meilleures conditions. Cet outil s’avère indispensable à plusieurs niveaux, tant pour tester la réceptivité des plantes aux sites d’expérimentations retenus que pour le suivi de l’efficacité des produits au cours du temps.
[0005] A l’heure actuelle il existe différentes méthodes de détection de l’activation des défenses des plantes par les SDP :
[0006] Un émetteur / récepteur optique, développé par la société Force A et appelé Multiplex® permet le "dosage" de molécules, type anthocyanes, flavonols, etc. Cet outil portatif permet l’acquisition rapide de données, facilement utilisables. De plus, les mesures non destructives permettent la réalisation de plusieurs mesures sur le même organe, apportant ainsi des informations sur l’évolution temporelle des réponses. Cependant, les marqueurs dosés sont peu spécifiques. Il s’agit composés du métabolisme secondaire propres à chaque variété de plantes qui ont des rôles très divers au niveau de la physiologie et du développement de ces plantes.
[0007] Il existe également un outil de diagnostic moléculaire développé par l’INRA d’Angers, appelé "qPFD" (Puce à Faible Densité Quantitative : RT-PCR quantitative en microplaque / puce à ADN de faible densité) qui permet d’évaluer des gènes cibles dont l’expression, seule ou en combinaison, renseigne sur l’état de stimulation des défenses naturelles des plantes (WO 2011/161388)..
[0008] Une méthode de criblage de produits potentiellement éliciteurs (GUSTAVE pour GUS Technology for Analysis and Validate plant Elicitor), a aussi été développée et est commercialisée par la Demanderesse. Le principe de ce test est d’utiliser des plantes exprimant un gène rapporteur codant une b- glucuronidase, le gène GUS. Celui-ci a été fusionné au promoteur de gènes connu pour être des marqueurs des deux principales voies de défense. Des plantes d’Arabidopsis transgéniques possédant une construction promoteur gènes marqueurs:GUS sont donc utilisées. Lorsque le substrat X-Gluc (5-bromo-4- chloro-3-indolyl- -D-glucuronic acid, cyclohexylammonium) est apporté à la plante, l’enzyme GUS va cliver ce substrat et produire un précipité bleu insoluble). Une coloration bleue apparaît alors si le gène marqueur est exprimé, permettant ainsi une localisation spatiale de la mise en place des défenses. L’utilisation de ce test permet de manière rapide de cribler des SDP qui sont capables d’activer les défenses en visualisant facilement l’expression de gènes marqueur représentant l’une ou l’autre des deux principales voies de défenses connues. Il est ainsi facile de constater si le produit est capable d’activer les défenses des plantes mais aussi de savoir quel type de défense est activé.
[0009] Des tests de protection sont aussi proposés par de multiples entreprises. Ces tests permettent d’observer en condition contrôlée ou au terrain l’efficacité d’un SDP en terme de protection vis-à-vis de pathogènes. Ces tests permettent donc de montrer l’efficacité d’un SDP mais ne montrent aucunement l’activation des défenses par ce produit.
[0010] Il apparaît d’après la littérature, que la protéine NPR1 est une protéine clé de l’immunité de la plante. Elle est nécessaire à la mise en place de la résistance systémique acquise (SAR) impliquant la phytohormone acide salicylique (SA) et de la résistance systémique induite (ISR) impliquant le couple de phytohormones acide jasmonique/éthylène (JA/Et) qui sont des formes d’immunité qui peuvent durer jusqu’à plusieurs semaines voire plusieurs mois. [0011] La protéine NPR1 se trouve sous forme monomérique ou oligomérique dans la cellule végétale. La littérature indique que le niveau de concentration du monomère est corrélé avec son activité.
[0012] La demande de brevet WO9806748 décrit des polypeptides de résistance acquise tels que NPR1, capables de conférer à une plante exprimant ledit polypeptide une résistance à un agent phytopathogène. Les phénotypes des mutants NPR1 ont démontré l'importance biologique du gène NPR1 d'Arabidopsis thaliana dans le contrôle de la réponse de défense contre un large spectre d'agents pathogènes. [0013] Un anticorps anti-NPR1 est commercialisé par la Société AGRISERA
(Agrisera n°AS12 1854). Cet anticorps nécessite cependant un traitement préalable avec de l’acide salicylique et ne permet pas de détecter NPR1 chez d’autres plantes que chez Arabidopsis thaliana. Par ailleurs, cet anticorps n’est pas spécifique et détecte NPR1 sans discrimination de son activité. Il détecte en effet la forme inactivée et activée de la protéine NPR1 sans distinction.
[0014] Zhonglin Mou ET AL décrivent le rôle de NPRI dans la résistance systémique acquise (SAR) des plantes ainsi que les mécanismes permettant de conférer aux plantes une immunité à large spectre contre les agents pathogènes. Deux anticorps ont été utilisés. Le premier est un anticorps polyclonal dirigé contre la partie N-terminal de NPR1 chez Arabidopsis thaliana. Le deuxième est un anticorps monoclonal dirigé contre un peptide de 16 acides aminés de la partie C- terminale de NPR1 chez Arabidopsis thaliana. Cet anticorps se lie à la forme monomérique et oligomérique de NPR1 (« inducers of plant systemic acquired résistance regulate NPR1 function through redox changes gene expression through interaction with transcription », Cell, 27 juin 2003, pages 935-944).
[0015] Toutefois, ces anticorps ne permettent de détecter NPR1 que chez Arabidopsis thaliana et ne permettent pas de cibler la forme active de NPR1 dans différentes espèces de plantes. Problème technique
[0016] Or, il est nécessaire de mettre au point une technique immunologique de détection et de quantification qui puisse être utilisée chez différentes espèces de plantes afin de pouvoir largement être mise en œuvre sur différentes cultures. En effet, et à ce jour, aucune technique immunologique de détection et de quantification simple, spécifique, rapide, bon marché et pouvant être appliquée chez différentes espèces de plantes, pour l’expérimentation «terrain» n’est disponible au vu de la littérature scientifique et/ou connue des professionnels de l’expérimentation. [0017] Il est ainsi nécessaire de mettre au point une méthode permettant de détecter, de quantifier et d’évaluer, de manière simple, rapide, à coût modéré, et à large spectre, l’activation des mécanismes de défense de plantes, et ce afin de, notamment, cribler des molécules potentiellement SDP, de démontrer et/ou vérifier l’activation des défenses des plantes suite à l’application d’une substance et sélectionner des variétés hautement réceptives aux SDP.
Exposé de l’invention
[0018] Les inventeurs ont avantageusement mis au point deux peptides dégénérés consensus, fortement immunogènes, qui ont permis de générer des anticorps permettant de spécifiquement cibler la forme active de NPR1 dans différentes espèces végétales d’intérêt agronomique.
[0019] La présente invention concerne donc des anticorps anti-NPR1 dirigés spécifiquement contre la forme monomérique de la protéine NPR1, préférentiellement la présente invention concerne des anticorps anti-NPR1 dirigés spécifiquement à l’encontre de séquence consensus spécifiques. [0020] Les inventeurs ont en effet développé et utilisé une stratégie d’immunisation permettant l’obtention d’anticorps spécifiques d’une forme active de NPR1, i.e., la forme monomérique de la protéine NPR1. Cette approche présente l’avantage de montrer l’activation des défenses des plantes quelle que soit la voie hormonale mise en œuvre, et ce, sur différentes plantes. Aussi, et avantageusement, les anticorps selon l’invention ne sont pas limités à la détection de NPR1 chez Arabidopsis thaliana, mais permettent de cibler la forme monomérique de NPR1 dans différentes espèces végétales.
[0021] Ainsi, et au sens de la présente invention, NPR1 a été choisi comme marqueur de l’immunité permettant de détecter de manière multi-spécifique et à large spectre l’activation des défenses des plantes, sur la base de peptides consensus permettant d’être représentatif d’une grande partie du règne végétal.
[0022] La présente invention concerne également une méthode de détection de l’activation des défenses d’une plante par la détection ou quantification de la forme monomérique de la protéine NPR1 dans un échantillon de plante en utilisant un anticorps anti-NPR1 selon la présente invention.
[0023] Avantageusement, cette méthode va permettre le criblage de molécules, potentiellement SDP, sur toutes les plantes d’intérêt agronomique, pour l’émergence de nouvelles substances actives à activité SDP, de démontrer l’activation des défenses des plantes suite à l’application d’un produit, de vérifier in situ l’activation des défenses suite à l’application de SDP, de sélectionner des variétés hautement réceptives aux SDP, de mesurer l’activation des mécanismes de défense des plantes avant traitement, et de sélectionner une plante présentant un état de stimulation des défenses naturelles susceptible de conférer une résistance améliorée à au moins un stress biotique ou abiotique. [0024] Ainsi et avantageusement, l’utilisation des anticorps anti-NPR1 spécifiques selon la présente invention permet de détecter, quantifier et d’évaluer, de manière simple, rapide et à coût modéré, l’activation des mécanismes de défense d’une plante, sur la majorité des plantes d’intérêt agronomique.
Brève description des dessins [0025] D’autres caractéristiques, détails et avantages de l’invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l’analyse des dessins annexés, sur lesquels :
Fig. 1 [0026] [Fig. 1] représente la position des deux peptides dégénérés consensus utilisés pour produire les anticorps selon la présente invention et dirigés contre la protéine NPR1 consensus de différentes espèces végétales. L’antipeptide 0 (antipepO) a été produit à l’aide du peptide 0 dégénéré de séquence consensus SEQ ID NO 1 par injection de peptides de séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5 chez le lapin. L’antipeptide 1 (antipepl) a lui été produit à l’aide du peptide 1 dégénéré de séquence consensus SEQ ID NO 6, par injection de peptides de séquences SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14 chez le lapin.
Fig. 2
[0027] [Fig. 2] représente les protéines recombinantes (prot T, P et I) en fonction de leurs positions par rapport à la protéine NPR1 d’A. thaliana.
Fig. 3
[0028] [Fig. 3] est un western blot effectué à l’aide de l’antipeptideO sur des extraits de plante d’A. thaliana dont les défenses ont été activées à l’aide de Bion® (1) ou d’Acide salicylique SA (2) ou non activées en utilisant de l’eau (3). Une bande de 37kDa n’est détectée (1 et 2) que lorsque les défenses sont activées et cette bande n’est pas détectée lorsque les défenses ne sont pas activées (3).
Fig. 4
[0029] [Fig. 4] montre des westerns blots effectués par hybridation des différentes protéines recombinantes avec l’anticorps anti-étiquette histidine (1, 3 et 5) et avec l’antipeptideO (2, 4 et 6). Une bande correspondant à la prot T est détectée avec les deux anticorps (1 et 2). Des bandes de même taille correspondant à la prot P (3 et 4) ainsi qu’à la prot I (5 et 6) sont aussi hybridées par ces mêmes anticorps sur les extraits protéiques correspondants. Les mêmes bandes sont donc détectées avec ces deux anticorps lorsque différentes formes de protéines recombinantes possédant une étiquette histidine sont utilisées. Fig. 5
[0030] [Fig. 5] montre des westerns blots effectués par hybridation d’extraits d’A. thaliana, traités ou non avec différents activateurs de défense, avec l’anticorps anti-NPR1 commercial (1, 3 et 5) ainsi que par l’antipepO (2, 4 et 6). Les défenses impliquant la voie du JA/Et sont activées à l’aide de Methyl-Jasmonate (Me-JA), celles impliquant la voie du SA sont activées à l’aide de SA. Afin d’obtenir un témoin négatif de l’activation des défenses, des plantes traitées à l’eau sont utilisées. Il est montré que la même bande est retrouvée quel que soit l’anticorps utilisé et ce que les défenses soit activées à l’aide de Me-JA (3 et 4) ou à l’aide de SA (5 et 6). Cette bande n’est pas retrouvée (ou avec une très faible intensité lorsque les plantes ont été traitées avec de l’eau (1 et 2). Ces différences d’intensités ne sont pas due à la quantité de protéines chargées comme le montre les profils protéiques correspondants (7 et 8) obtenus par coloration au bleu de Coomassie. Fig. 6
[0031] [Fig.6] représente deux westerns blots effectués par hybridation d’extraits d’A. thaliana dont les défenses ont été activées à l’aide de SA, avec les antipeptides 0 et 1 (antipepO et antipepl). La même bande est retrouvée à 37kDa (1 et 2) quel que soit l’antipeptide utilisé. Fig. 7
[0032] [Fig. 7] montre les westerns blots effectués par hybridation des éluats d’immunoprécipitation (IP) avec l’antipeptideO. Les anticorps utilisés lors de l’IP (antipepO et anticorps commercial (« commercial »)) sont décrochés lors de l’élution et sont donc détectés (1, 2 et 3). Ces anticorps ont permis d’immuno- précipiter la protéine de 37kDa lorsque des extraits d’A.thaliana dont les défenses ont été activées à l’aide de SA sont utilisés (4 et 6). L’antipepO est aussi capable d’immunoprécipiter la protP (5), par contre l’anticorps commercial ne le permet pas comme le montre l’absence de bande à la taille attendue (7).
Fig. 8 [0033] [Fig. 8] montre le niveau d’expression d’un gène marqueur des défenses (PR5) de différents échantillons mesuré en qPCR (1 , 2, 3 et 4) ainsi que l’intensité de la bande de 37kDa détectée en western blot sur ces mêmes échantillons (5, 6, 7 et 8). La quantité de protéines déposée n’explique pas la différence d’intensité de ces bandes comme le montre la coloration au bleu de Coomassie effectuée sur la membrane (9). Le niveau d’activation des défenses mesuré en qPCR est corrélé à l’intensité de la bande retrouvée en western blot.
Fig. 9
[0034] [Fig. 9] montre un western blot effectué par hybridation d’extraits de tomate, dont les défenses ont été stimulées ou non par pulvérisation de SA, de Me-JA ou d’eau, avec l’antipepO. Une bande est détectée autour de 40kDa avec une plus forte intensité sur les extraits de plantes traitées à l’aide de SA (2) et de Me-JA (3) que sur les plantes traitées à l’eau (1). La quantité de protéine déposée n’explique pas la différence d’intensité de ces bandes comme le montre la coloration au bleu de Coomassie effectuée sur la membrane (4).
Description détaillée
[0035] La présente invention concerne donc un anticorps anti-NPR1 caractérisé en ce que ledit anticorps se lie spécifiquement à la forme monomérique de la protéine NPR1.
[0036] NPR1
La protéine NPR1 (Non expressor of Pathogenesis Related protein 1), également connue sous le nom nim1 et sai1, est une protéine impliquée dans diverses voies de signalisation immunitaire, dans la résistance systémique acquise (SAR), impliquant la phytohormone acide salicylique (SA), la résistance systémique induite (ISR) impliquant le couple de phytohormones acide jasmonique/éthylène (JA/Et) ainsi que la résistance acquise locale (LAR).
[0037] NPR1 est présent en équilibre dynamique entre des oligomères de poids moléculaire élevé (liés par l'intermédiaire de ponts disulfures intermoléculaires), qui sont inactifs, et des monomères qui sont la forme active de la protéine. Le statut de la protéine est étroitement contrôlé par des modifications rédox dans les cellules végétales qui sont déclenchées par une agression extérieure telle la température, les rayonnements UV, une infection, un agent pathogène ou un traitement par une substance telle que l’acide salicylique (SA), ou le Methyl- Jasmonate (Me-Ja) ou le Bion®. NPR1 sous forme d’oligomère, i.e. sous forme inactive est séquestrée dans le cytosol. NPR1 passe d’un état d’oligomère à un état de monomère par réduction des ponts disulfures intermoléculaires. La protéine NPR1 sous forme de monomère, i.e., sous forme active, passe ensuite dans le noyau pour contrôler l’expression génique liée à la SAR (Mou et al., Inducers of Plant Systemic Acquired Résistance Regulate NPR1 Function through Redox Changes, Cell, Volume 113, Issue 7, 27 June 2003, pages 935-944).
[0038] Ainsi, les anticorps selon la présente invention se lient spécifiquement à la forme monomérique, i.e., à la forme active de NPR1.
[0039] Spécificité
Les anticorps anti-NPR1 reconnaissent et se lient spécifiquement à la forme monomérique de la protéine NPR1 plutôt que la forme oligomérique. Ainsi, au sens de la présente invention, on entend par « anticorps anti-NPR1 qui se lie spécifiquement à la forme monomérique de la protéine NPR1 » un anticorps qui présente une grande affinité pour sa molécule cible, i.e., pour la forme monomérique de la protéine NPR1.
[0040] Les termes « se lie spécifiquement » ou « reconnaît spécifiquement » sont ici utilisés pour indiquer que l’anticorps a la capacité de reconnaître et d’interagir avec la forme monomérique de NPR1, tout en ayant relativement peu d’interactions détectables avec la forme oligomérique de NPR1. L’anticorps se lie spécifiquement à la forme monomérique de NPR1 si son affinité est significativement plus élevée pour la forme monomérique de NPR1 que pour la forme oligomérique de NPR1, préférentiellement, l’anticorps anti-NPR1 selon la présente invention ne se lie pas à la forme oligomérique de NPR1.
[0041] Anticorps
Les termes «anticorps» et «immunoglobuline» sont équivalents et peuvent être utilisés de façon interchangeable. Un anticorps ou immunoglobuline est une glycoprotéine synthétisée en réponse à un antigène, capable de reconnaître et de fixer l’antigène responsable de sa production.
[0042] Ainsi, le terme « anticorps » désigne des immunoglobulines ou des parties immunologiquement actives d’immunoglobuline, c'est-à-dire des molécules qui contiennent un site de liaison à l’antigène qui se lie de manière immunospécifique audit antigène. En tant que tel, le terme anticorps englobe non seulement des molécules d'anticorps entières, mais également des fragments d'anticorps ainsi que des variants (y compris des dérivés) d'anticorps. Classiquement, les molécules d’immunoglobuline ont une structure de base faite de quatre chaînes polypeptidiques reliées entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaîne légère est constituée d’environ 220 acides aminés et possède une masse moléculaire d’environ 25 kilodaltons (kDa). Chaque chaîne lourde est constituée d’environ 400 acides aminés et possède une masse moléculaire de 50 à 70 kDa. Pour chaque classe, ou sous classe d’immunoglobulines, les chaînes lourdes sont structurellement distinctes. Les chaînes lourdes comme les chaînes légères contiennent deux régions différentes. Les régions constantes (CL et CH) ont des séquences d’acides aminés qui ne varient pas de façon significative entre les anticorps d’une même classe. Les régions variables (VL et VH) des anticorps possèdent des séquences différentes. Repliées ensemble, les régions variables (VL et VH) forment le site de fixation de l’anticorps (Microbiology, L. Prescott 2002).
[0043] Selon un mode de réalisation, l’anticorps anti-NPR1 est un anticorps polyclonal.
[0044] Les anticorps polyclonaux présentent l'avantage d'être générés rapidement (par exemple en quelques semaines), plus facilement et à moindre coût par rapport aux anticorps monoclonaux. De plus, comme ils reconnaissent plusieurs épitopes, les anticorps polyclonaux ont généralement un spectre d'activité plus large que les anticorps monoclonaux.
[0045] Les anticorps polyclonaux sont de préférence des anticorps polyclonaux non humains. [0046] Les anticorps polyclonaux peuvent être choisis dans le groupe constitué des anticorps polyclonaux de lapin, des anticorps polyclonaux de souris, des anticorps polyclonaux de rat, des anticorps polyclonaux de cobaye, des anticorps polyclonaux de poulet, des anticorps polyclonaux de chèvre, des anticorps polyclonaux de vache, des anticorps polyclonaux de mouton et leurs combinaisons.
[0047] Préférentiellement, les anticorps polyclonaux sont des anticorps polyclonaux de lapin.
[0048] L’homme du métier pourra utiliser toute technique pour mettre au point des anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés spécifiquement contre la forme monomérique de la protéine NPR1, afin que lesdits anticorps se lient spécifiquement à un antigène de NPR1.
[0049] Antigène
Le terme « antigène » s’entend de toutes substances telles que des protéines, des nucléoprotéines, des polysaccharides, des peptides et certains glycolipides qui induisent une réaction immunitaire et qui réagissent avec les produits de ces réponses. Chaque antigène peut avoir plusieurs déterminants antigéniques ou épitopes. Les épitopes sont les régions de l’anticorps qui se lient au site de fixation de l’antigène sur un antigène spécifique (selon Microbiology, L. Prescott 2002). [0050] Les inventeurs de la présente invention ont avantageusement réalisé un alignement des séquences de la protéine NPR1 provenant de plusieurs espèces végétales (betterave, luzerne, coton, cacao, tomate, pomme de terre, ricin, piment, peuplier, tabac, patate douce, papaye, vigne, moutarde brune, colza, pommier...) ainsi que celle d’Arabidopsis thaliana [0051] Par cet alignement multiple, une séquence consensus, de SEQ ID NO : 1 a alors été identifiée.
[0052] De plus, la partie « cachée » de la protéine, correspondant à une partie inaccessible sous sa forme oligomérique inactive, a également été identifiée (entre la cystéine 82 et la cystéine 216 pour la séquence d’A. thaliana) par bio- informatique, permettant de générer une deuxième séquence consensus de SEQ ID NO : 6.
[0053] Des peptides dégénérés consensus fondés sur l’alignement des différentes protéines NPR1, correspondant aux parties conservées de la partie cachée de NPR1,des principales espèces de plantes d’intérêt agronomique ont alors été synthétisés.
[0054] Ces peptides ont ensuite été injectés chez le lapin afin de produire des anticorps ou antipeptides.
[0055] Ces peptides sont dits dégénérés car deux ou trois acides aminés de leur séquence sont variables, et consensus car les différentes séquences ainsi créées correspondent aux séquences de NPR1 conservées chez différentes espèces végétales. Ces peptides synthétiques ont ainsi servi d’antigène afin d’immuniser des lapins et de produire les anticorps ou antipeptides.
[0056] Le terme « antipeptides » pourra alternativement être utilisé. Il est en effet utilisé afin de préciser qu’il s’agit d’anticorps créés en utilisant des peptides dégénérés consensus. Ces antipeptides sont de type polyclonaux mais la stratégie mise en œuvre pourrait aussi bien être réalisée à l’aide des anticorps monoclonaux.
[0057] Ainsi, deux séquences peptidiques consensus ciblant la forme active de la protéine NPR1 chez différentes espèces végétales ont ainsi pu être proposées, respectivement SEC ID NO : 1 et SEC ID NO : 6.
[0058] La séquence consensus de SEC ID NO : 1 comprend deux acides aminés dégénérés (X1 et X2) :
His Val His Arg Cys X1 Leu Ser Ala Arg Ser X2 Phe Phe, X1 pouvant être soit une Valine (Val) soit une Isoleucine (Ile), et X2 pouvant être une Sérine (Ser) ou une Proline (Pro).
[0059] 4 peptides de SEC ID NO : 2, 3, 4 et 5 ont été générés sur la base du peptide consensus de SEC ID NO : 1 et tels que ci-après reproduit :
[0060] [Tableau 1]
Figure imgf000016_0001
[0061] La séquence consensus de SEQ ID NO : 6 comprend trois acides aminés dégénérés (X3 et X4 et X5) :
His Ala Leu Gin Leu Leu Ser Asn Ser X3 Glu Ser X4 X5
X3 pouvant être soit une Valine (Val) soit une Isoleucine (Ile), X4 pouvant être une Serine (Ser) ou une Proline (Pro) et X5 pouvant être une Serine (Ser) ou une Proline (Pro).
[0062] 8 peptides de SEQ ID NO : 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14 ont été générés sur la base du peptide consensus de SEQ ID NO : 6 et tels que ci-après reproduit :
[0063] [Tableau 2]
Figure imgf000016_0002
[0064] Ainsi, la présente invention concerne également un anticorps anti-NPR1 caractérisé en ce que ledit anticorps se lie à au moins un épitope de la forme monomérique de NPR1, de séquence choisie parmi SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5. [0065] Selon un mode de réalisation, l’anticorps anti-NPR1 est caractérisé en ce que ledit anticorps se lie à au moins deux épitopes de la forme monomérique de NPR1 de séquence choisie parmi les SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5. [0066] Selon un mode de réalisation, l’anticorps anti-NPR1 est caractérisé en ce que ledit anticorps se lie à au moins trois épitopes de la forme monomérique de NPR1 de séquence choisie parmi les SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5.
[0067] Selon un mode de réalisation, l’anticorps anti-NPR1 se lie à un épitope de séquence consensus SEQ ID NO :1 où X1 est une valine ou une isoleucine et X2 est une sérine ou une proline.
[0068] Selon un mode de réalisation, l’anticorps anti-NPR1 se lie aux séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, et SEQ ID NO : 5 de la forme monomérique de la protéine NPR1. [0069] La présente invention concerne également un anticorps anti-NPR1 caractérisé en ce que ledit anticorps se lie à au moins un épitope de la forme monomérique de NPR1 de séquence choisie parmi les SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14. [0070] Selon un mode de réalisation, l’anticorps anti-NPR1 est caractérisé en ce que ledit anticorps se lie à au moins deux épitopes de la forme monomérique de NPR1 de séquence choisie parmi les SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14. [0071] Selon un mode de réalisation, l’anticorps anti-NPR1 est caractérisé en ce que ledit anticorps se lie à au moins trois épitopes de la forme monomérique de NPR1 de séquence choisie parmi les SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14. [0072] Selon un mode de réalisation, l’anticorps anti-NPR1 est caractérisé en ce que ledit anticorps se lie à au moins quatre épitopes de la forme monomérique de NPR1 de séquence choisie parmi les SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14.
[0073] Selon un mode de réalisation, l’anticorps anti-NPR1 est caractérisé en ce que ledit anticorps se lie à au moins cinq épitopes de la forme monomérique de NPR1 de séquence choisie parmi les SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14.
[0074] Selon un mode de réalisation, l’anticorps anti-NPR1 est caractérisé en ce que ledit anticorps se lie à au moins six épitopes de la forme monomérique de NPR1 de séquence choisie parmi les SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14.
[0075] Selon un mode de réalisation, l’anticorps anti-NPR1 est caractérisé en ce que ledit anticorps se lie à au moins sept épitopes de la forme monomérique de NPR1 de séquence choisie parmi les SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14.
[0076] Selon un mode de réalisation, l’anticorps anti-NPR1 se lie à un épitope de séquence consensus SEQ ID NO :6 où X3 est une valine ou une isoleucine, X4 est une serine ou une proline et X5 est une sérine ou une proline.
[0077] Selon un mode de réalisation, l’anticorps anti-NPR1 se lie aux séquences SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14 de la forme monomérique de la protéine NPR1.
[0078] Les anticorps polyclonaux sont de préférence obtenus ou peuvent être obtenus à partir d’au moins un échantillon biologique d’un animal immunisé avec au moins un antigène comprenant de préférence ou consistant en au moins une séquence de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5 et/ou de SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO :
11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14.
[0079] Dans un mode de réalisation, les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus par immunisation d’un animal non humain avec une composition antigénique comprenant un mélange d’antigènes de séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4 et SEQ ID NO : 5 et/ou un mélange d’antigènes de séquences SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14.
[0080] On entend par « antipeptide 0 » ou « antipep 0 » un anticorps polyclonal non humain obtenu par immunisation d’un animal non humain avec une composition antigène comprenant un mélange de peptides de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4 et SEQ ID NO : 5.
[0081] On entend par « antipeptide 1 » ou « antipep 1» un anticorps polyclonal non humain obtenu par immunisation d’un animal non humain avec une composition antigène comprenant un mélange de peptides de SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO :
12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14.
[0082] Un autre objet de l’invention est un procédé de production d’anticorps polyclonaux tels que définis ci-dessus, dans lequel ledit procédé comprend les étapes consistant à :
- fournir un échantillon biologique provenant d’un animal immunisé avec au moins un antigène comprenant de préférence ou consistant en au moins une séquence de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5 et/ou de SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10 SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14 ;
- collecter ou purifier les anticorps polyclonaux dudit échantillon biologique.
[0083] Méthode de détection de l’activation des défenses d’une plante
[0084] La présente invention concerne également une méthode de détection de l’activation des défenses d’une plante comprenant la détection de la forme monomérique de la protéine NPR1 dans un échantillon de ladite plante, en utilisant un anticorps anti-NPR1 selon la présente invention.
[0085] On peut également quantifier la forme monomérique de la protéine NPR1 dans un échantillon de ladite plante, en utilisant un anticorps anti-NPR1 selon la présente invention.
[0086] Avantageusement, l’utilisation des anticorps anti-NPR1 spécifiques selon la présente invention permettent de cibler la forme active de la protéine NPR1 de différentes espèces de plantes afin de détecter les défenses mises en place par les plantes, et ce pour la majorité des plantes d’intérêt agronomique.
[0087] Par « activation des mécanismes de défense des plantes » on entend le développement d’un ensemble de modifications biologiques qui confèrent à cette plante i) une résistance immédiate, notamment LAR (résistance acquise locale), ii) la résistance systémique induite (ISR) et/ou SAR (résistance acquise systémique) et/ou iii) une pré-sensibilisation du type potentialisation grâce à laquelle elle devient capable de réagir plus efficacement à un stress ultérieur biotique ou abiotique. L’activation des mécanismes de défense des plantes s’entend également de l’état activé ou non-activé des différentes voies moléculaires impliquées dans les mécanismes de défenses naturelles et notamment selon la voie impliquant l’acide salicylique mais aussi celles impliquant l’acide jasmonique. L’activation des mécanismes de défense des plantes s’entend également de la résistance au stress, c’est-à-dire de la faculté d’une plante à faire face aux stress biotiques et/ou abiotiques.
[0088] Un stress biotique est causé par un organisme vivant. On pourra citer tout organisme nuisible portant atteinte à l’état de santé d’une plante. Ce sont tous les organismes vivants capables d’agresser une plante cultivée. Il s’agit notamment des ravageurs (insectes, nématodes, araignées), des agents responsables de maladies (champignons, oomycètes, bactéries, virus, viroïdes) et toutes les mauvaises herbes (adventices). On pourra citer également les animaux tels que les rongeurs ou les ruminants.
[0089] Un stress abiotique est causé par les conditions environnementales (hors organismes vivants) tels que la sécheresse, le froid, les rayons ultraviolets... (Guide méthodologique d’évaluation de l’efficacité des Stimulateurs des Défenses des Plantes (SDP).
[0090] Par « plante », on entend par exemple un végétal à quelque stade de développement que ce soit, notamment embryon ou tout autre stade plantule ou de la plante adulte.
[0091] A titre illustratif, les plantes sont choisies parmi les arbres fruitiers, les cultures maraîchères, la vigne, les céréales et les oléagineux, les protéagineux, les oléo-protéagineux, le tabac, les plantes appartenant à la famille des Brassicaceae et les plantes ornementales. [0092] De manière préférée, les plantes seront choisies parmi Arabidopsis thaliana, la betterave, la luzerne, le coton, le cacao, la tomate, la pomme de terre, le ricin, le piment, le peuplier, le tabac, la patate douce, la papaye, la vigne, la moutarde brune, le colza, le pommier, le blé, la fraise, le chou, la salade.
[0093] De manière encore plus préférée, la plante sera la vigne. [0094] On entend par « échantillon », tout échantillon permettant de détecter et quantifier la forme monomérique de NPR1. L’échantillon peut être obtenu à partir de la plante entière (par exemple une semence ou un jeune plant), d’une partie de la plante, ou d’une pluralité de plantes ou de parties de plantes, tel qu’un lot de plantes ou de feuilles. L’homme du métier sait comment obtenir de tels échantillons pour la détection et la quantification d’une protéine.
[0095] Par partie de la plante, on entend par exemple le pollen, les ovules, les embryons, les parties aériennes (tiges et feuilles), les feuilles, les anthères, les tiges, les pétioles, les racines, les fruits, les graines, les fleurs, les bourgeons, les protoplastes, les cals, les cellules et tissus cellulaires. [0096] Préférentiellement, les parties aériennes seront utilisées.
[0097] L’homme du métier connaît les méthodes pour détecter et/ou quantifier la forme monomérique de la protéine NPR1 au moyen d’un anticorps donné à partir d’un échantillon donné. Ainsi, tout moyen pour détecter et/ou quantifier la forme monomérique de NPR1 dans un échantillon peut être utilisé. [0098] Typiquement, la forme monomérique de la protéine NPR1 pourra être détectée et/ou quantifiée dans la méthode selon la présente invention par Western blot, un test ELISA (Enzyme Link ImmunoSorbent Assay) ou un test bandelette de type LFD (Latéral Flow Device ou Latéral Flow Immunchromatograhic Assay).
[0099] Selon un mode de réalisation, la détection de la forme monomérique de NPR1 par les anticorps spécifiques selon la présente invention=pemnet d’identifier une plante présentant une induction de l’activation de ses mécanismes de défense.
[0100] Selon un mode de réalisation, la forme monomérique de NPR1 sera quantifiée. La quantification de la forme monomérique de NPR1 peut être exprimée en une unité arbitraire afin de refléter la quantité de la forme monomérique de la protéine NPR1 dans l’échantillon.
[0101] Selon un mode de réalisation, la valeur peut consister en la concentration de la forme monomérique de la protéine NPR1, mesurée par toute méthode de quantification des protéines connues par l’Flomme du métier, telle que par Western blot.
[0102] Selon un mode de réalisation, la méthode de détection/quantification de l’activation des défenses d’une plante pourra comprendre une étape supplémentaire de comparaison avec un échantillon référence, afin de déterminer ou quantifier l’état d’activation des défenses de ladite plante.
[0103] On entend par « échantillon référence » un échantillon obtenu à partir d’une plante ou de parties de plante dont l’état d’activation des défenses est connu. Ainsi, les échantillons de référence peuvent être issus de plantes ou de parties de plantes qui sont non traitées ou non-stressées, ou qui sont soumises préalablement à un SDP ou à un stress biotique ou abiotique.
[0104] On entend par « substance active capable d’activer les défenses d’une plante » ou « Stimulateur des Défenses des Plantes » ou « SDP » ou « stimulateurs des défenses naturelles » ou « SDN » toute substance ou tout microorganisme vivant non pathogène, qui appliqué sur une plante, est capable de promouvoir un état de résistance significativement plus élevé par rapport à une plante non traitée face à des stress biotiques voire abiotiques. Un SDP n’agit généralement pas directement sur les bioagresseurs, il est perçu par la plante comme un message d’alerte. Celle-ci va réagir en préparant ou en mettant en place différents mécanismes de défense, ce qui va concourir à la rendre plus résistante aux attaques de bioagresseurs. On peut ainsi considérer comme SDP, un produit efficace sur un couple plante-pathogène, ne présentant pas d’effet direct notable sur le pathogène à la dose efficace sur la plante, et capable d’induire dans ces conditions des marqueurs de défense connus (protéines PR, lipoxygénase, phénylalanine ammonia-lyase,...).
[0105] Des SDP sont par exemple décrits dans la demande WO2011/161388 et peuvent être classés selon deux principales familles : i) les composés dits « stimulateurs directes », qui entraînent, une fois appliqués sur la plante, une activation complète des réactions de défense, qu’il y ait ou non présence de pathogènes, et ii) les composés dits « potentialisateurs », qui déclenchent, après application sur la plante, uniquement le phénomène de « potentialisation » précité (les réactions de défense ne s’activant qu’à la suite d’une attaque par un agent pathogène ou un stress).
La plupart de ces produits SDP sont encore connus sous l’appellation de « éliciteurs » ou encore de « inducteurs de résistance ». [0106] Typiquement, les SDP homologués en France sont tels que ci-après décrits :
[0107] [tableau 3]
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
[0108] A titre illustratif, pour obtenir un échantillon de référence représentatif d’un stress biotique, on peut pulvériser du Bion® sur les plantes ou parties de plantes, pour obtenir un échantillon référence représentatif d’un stress bactérien.
[0109] A titre illustratif, pour obtenir un échantillon de référence représentatif de l’activation de la voie du SA, on peut appliquer de l’acide salicylique (SA) sur la plante ou partie de plante.
[0110] A titre illustratif, pour obtenir un échantillon de référence représentatif de l’activation de la voie acide jasmonique (JA), on peut appliquer du Methyl- Jasmonate sur la plante ou partie de plante. [0111] A titre illustratif, pour obtenir un échantillon de référence représentatif d’un stress abiotique, on peut exposer la plante ou partie de plante à des rayonnements UV, à la chaleur, au froid, ...
[0112] Pour obtenir un échantillon référence non traité, on peut pulvériser de l’eau sur les plantes ou parties de plantes. [0113] Pour obtenir un échantillon référence non stressé, on peut isoler la plante ou partie de plante dans un environnement préservé et contrôlé.
[0114] A titre illustratif, pour obtenir un échantillon référence représentatif d’un traitement avec un SDP, on peut appliquer un SDP sur la plante ou partie de plante. [0115] Typiquement, la détection de la forme monomérique de la protéine NPR1, sera significative de l’activation des défenses d’une plante.
[0116] Typiquement, une augmentation significative de la concentration de la forme monomérique de la protéine NPR1, en comparaison à un échantillon référence non stressé permet d’identifier une plante présentant une induction de l’activation de ses mécanismes de défense. [0117] Ainsi, et de manière générale, la méthode selon la présente invention permet de détecter et/ou mesurer l’activation des mécanismes de défense des plantes par la détection et/ou la quantification de la forme monomérique de la protéine NPR1. Typiquement, la méthode permettra de détecter/mesurer l’activation des mécanismes de défenses des plantes au champ avant traitement pour faciliter l’aide à la décision et le positionnement des SDP en fonction de la réactivité des plantes ciblées.
[0118] La méthode selon l’invention permet également de démontrer avantageusement l’activation des défenses suite à l’application d’un produit comme demandé dans le cadre de la méthode de la Commission des essais biologiques (CEB) sur les « principes généraux d’expérimentation des stimulateurs des défenses des plantes » (méthode générale MG14), nécessaire au processus d’homologation et réglementant la mise sur le marché du produit.
[0119] Avantageusement, cette technique immunologique de détection et de quantification peut être utilisée chez différentes espèces de plantes afin de pouvoir largement être mise en œuvre sur différentes cultures d’intérêt agronomique.
[0120] Méthode de criblage de SDP
La présente invention concerne également une méthode de criblage de substances actives capables d’activer les défenses d’une plante comprenant : a) le traitement d’un échantillon de ladite plante avec au moins une substance ; b) la détection dans ledit échantillon de la forme monomérique de la protéine NPR1 selon la méthode de détection selon la présente invention.
[0121] La présente invention concerne également une méthode de criblage de substances actives capables d’activer les défenses d’une plante comprenant a) le traitement d’un échantillon de ladite plante avec au moins une substance ; b) la quantification dans ledit échantillon de la forme monomérique de la protéine NPR1 selon la méthode de détection selon la présente invention.
[0122] Avantageusement, la présente méthode de criblage permet de cribler des molécules potentiellement SDP au laboratoire afin de permettre l’émergence de nouvelles substances actives à activité SDP. La détection et/ou quantification de la forme monomérique de NPR1 par les anticorps selon la présente invention va permettre de déterminer l’efficacité d’une molécule en tant que SDP.
[0123] Ainsi, il est possible de réaliser une discrimination entre i) les produits SDP qui activent effectivement les défenses des plantes, et ii) les produits qui sont dépourvus d’effet.
[0124] On entend par « substance », toute substance ou tout microorganisme vivant non pathogène, dont les propriétés de promotion d’un état de résistance significativement plus élevé par rapport à une plante non traitée face à des stress biotiques voire abiotiques ne sont pas connues. La méthode selon la présente invention permet ainsi de cribler tout composé actif ou composition active, biologique ou chimique.
[0125] A titre illustratif, la détection de la forme monomérique de la protéine NPR1 sera significative de l’efficacité de la substance testée, et permettra de classifier ladite substance en tant que SDP.
[0126] Selon un mode de réalisation, la méthode de criblage pourra comprendre une étape supplémentaire de comparaison avec un échantillon référence, de la forme monomérique de la protéine NPR1 selon la méthode de détection selon la présente invention.
[0127] Typiquement, la quantité de la forme monomérique de la protéine NPR1 de l’échantillon de plante pourra être comparée à la quantité de la forme monomérique de la protéine NPR1 de l’échantillon référence. Généralement, une augmentation significative de la quantité de la forme monomérique de la protéine NPR1 dans l’échantillon de plante par rapport à l’échantillon de référence est synonyme de l’efficacité de la substance en tant que SDP et pourra permettre de la classifier ladite substance en tant que SDP, tandis que l’absence de variation significative peut être synonyme d’absence d’efficacité en tant que SDP.
[0128] Méthode d’évaluation de la sensibilité d’une plante à un SDP
[0129] L’invention concerne également une méthode d’évaluation de la sensibilité d’une plante à une molécule capable de stimuler les défenses d’une plante comprenant : a) le traitement d’un échantillon de ladite plante avec une molécule capable de stimuler les défenses des plantes ; b) la détection dans ledit échantillon de la forme monomérique de la protéine NPR1 selon la présente invention.
[0130] L’invention concerne également une méthode d’évaluation de la sensibilité d’une plante à une molécule capable de stimuler les défenses d’une plante comprenant : a) le traitement d’un échantillon de ladite plante avec une molécule capable de stimuler les défenses des plantes ; b) la quantification dans ledit échantillon de la forme monomérique de la protéine NPR1 selon la présente invention.
[0131] Typiquement, la détection de la forme monomérique de la protéine NPR1 permettra de conclure sur la sensibilité de la plante à la molécule capable de stimuler les défenses d’une plante.
[0132] Selon un mode de réalisation, la méthode d’évaluation de la sensibilité d’une plante à une molécule capable de stimuler les défenses d’une plante pourra comprendre une étape supplémentaire de comparaison avec un échantillon référence, afin de déterminer ou évaluer l’état d’activation de ladite plante à partir de la concentration de la forme monomérique de NPR1 obtenue à l’étape de quantification.
[0133] Typiquement, la quantité de la forme monomérique de la protéine NPR1 de l’échantillon de plante pourra être comparée à la quantité de la forme monomérique de la protéine NPR1 de l’échantillon référence. Généralement, une augmentation significative de la quantité de la forme monomérique de la protéine NPR1 dans l’échantillon de plante par rapport à l’échantillon de référence est synonyme de sensibilité de la plante à la molécule capable de stimuler les défenses d’une plante.
[0134] La présente méthode d’évaluation permet ainsi et avantageusement, de sélectionner des variétés hautement réceptives aux SDP, dans le cadre de la sélection variétale ou bien d’optimiser les couples variétés de plantes/SDP. [0135] Méthode de sélection d’une plante présentant une résistance améliorée
La présente invention a également trait à une méthode pour sélectionner une plante présentant un état d’activation des défenses susceptible de lui conférer une résistance améliorée à au moins un stress biotique et/ou abiotique comprenant : i) l’application dudit ou desdits stress à un échantillon de ladite plante, ii) la détection dans ledit échantillon de la forme monomérique de la protéine NPR1 selon la méthode de détection de la présente invention.
[0136] La présente invention a également trait à une méthode pour sélectionner une plante présentant un état d’activation des défenses susceptible de lui conférer une résistance améliorée à au moins un stress biotique et/ou abiotique comprenant : i) l’application dudit ou desdits stress à un échantillon de ladite plante, ii) la quantification dans ledit échantillon de la forme monomérique de la protéine NPR1 selon la méthode de détection de la présente invention.
[0137] Typiquement, la détection de la forme monomérique de la protéine NPR1 dans l’échantillon de plante sera synonyme d’une résistance améliorée à au moins un stress biotique et/ou abiotique et permettra de sélectionner la plante pour ses propriétés d’activation des défenses améliorées.
[0138] La méthode de sélection pourra comprendre en outre une étape de comparaison avec un échantillon de référence pour déterminer ou évaluer l’état de stimulation des défenses naturelles de la plante afin de sélectionner ladite plante si la plante possède un état d’activation des défenses susceptible de lui conférer une résistance améliorée à au moins un stress biotique ou abiotique.
[0139] Typiquement, une concentration significativement augmentée de la forme monomérique de la protéine NPR1, en comparaison avec un échantillon de référence non soumises à un stress et/ou un SDP permet d’identifier les plantes ou parties de plantes présentant un état d’activation des défenses et une résistance améliorée.
[0140] Kit pour la mise en œuyre des méthodes selon l’invention
La présente invention concerne également un kit pour la mise en œuvre des méthodes de détection, criblage et activation selon la présente invention comprenant un anticorps anti-NPR1 selon l’invention.
Exemples
[0141] Matériels et Méthodes
[0142] Dans les exemples qui suivent, les matériels et méthodes ci-après détaillés ont été utilisés.
[0143] Immunisation
La production des peptides dégénérés consensus et des anticorps selon la présente invention a été effectuée par l’entreprise GENEPEP. Pour cela ils ont, en premier lieu, synthétisé les deux peptides (pepO) et (pep1) tel que représenté à la Figure 1 sur la base des deux séquences consensus de SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 6. Les peptides de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, ont été utilisés comme agent immunogène afin d’induire une réaction immunitaire dirigée contre ces peptides chez le lapin. Pour cela les peptides de séquences ci-avant définies ont été injectés dans 2 lapins chacun et ce à 5 reprises au cours de la vie des lapins. La totalité de leur sang a ensuite été prélevée afin d’en extraire le sérum contenant les anticorps reconnaissant les peptides injectés.
[0144] Purification et concentration des anticorps anti-NPR1 Le sérum de lapin obtenu est utilisé pour purifier les antipeptides (antipeptide 0 ou antipepO et antipeptide 1 ou antipepl) spécifiques de la forme active de NPR1, suivant la méthode suivante :
50mI de solution d’un mélange de peptides de séquence SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5 à 0.5mg/ml est déposé sur une membrane pour purifier l’antipeptideO et un mélange de peptide de séquence SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, à 0.5mg/ml est déposé sur une autre membrane pour purifier l’antipeptidel . Pour chaque mélange de peptides, la membrane est une membrane de Polyvinylidene difluoride (PVFD) de 1.5 x5cm préalablement activée 10min dans l’éthanol absolu puis séchée. Cette membrane est ensuite transférée dans un tube à hémolyse puis saturée à l’aide de 1ml de tampon phosphate tween 0,1% (PBST) + 5% lait (lait en poudre Régilait® écrémé) en agitation durant 1h à 4°C. Un millilitre de sérum correspondant y est ajouté avant incubation en agitation sur la nuit à 4°C. La membrane est alors lavée 4 fois avec 2ml de PBST en agitation 15min à 4°C. Les antipeptides sont ensuite élués par choc acide (1ml de 50mM glycine, 500mM NaCI, 0.1%Tween 20, 1% BSA, pH 3) durant 1min en agitation à 4°C. L’éluat de 1ml est récupéré et neutralisé avec 100mI de Tris Base 1M. Cette élution est répétée 5 fois, et les éluats 2 et 3 (les plus concentrés en antipeptide) sont récupérés pour être concentrés.
Cette opération est effectuée sur 10 membranes en parallèle et chaque membrane est utilisée 2 fois. 10ml de solution d’antipeptides sont donc obtenus pour les deux éluats d’intérêt. Deux fois 4 ml de chaque solution sont concentrés par ultrafiltration à l’aide du système d’ultrafiltration amicon 10kDa (10 000 rpm, 10min, 4°C) Entre 500 et 600mI de solution d’antipeptide concentrés sont ainsi produits pour chaque éluat.
[0145] Extraction des protéines de plantes a) Extraction des protéines d’A. thaliana
Des plantes d’A. thaliana sont cultivées en terre durant 3 semaines en chambre de culture jour long (18h de lumières 60% d’hygrométrie, 21 °C le jour et 19°C la nuit) puis sont pulvérisées avec de l’eau (témoin négatif) du Bion® 0.015% ou de l’Acide salicylique (SA) 1mM (témoin d’activation de la voie du SA) ou bien à l’aide de Methyl-Jasmonate (Me-JA) 0.1 mM dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) 0.1% (témoin d’activation de la voie Acide Jasmonique (JA)). Les parties aériennes des plantes sont alors récoltées 48h après pulvérisation et broyées dans l’azote liquide. Les protéines totales de ces plantes sont alors extraites à raison de 1 mI de tampon d’extraction (Tris-HCI pH 7,5 50mM, NaCI 150mM, MgCI 10mM, EDTA 5mM, glycerol 10% lodoacétamide 4%, antiprotéase 1X (cOmpleteTM, Mini, EDTA-free Protease inhibitor Cocktail, ROCHE)) par mg de poudre congelée. Les échantillons sont décongelés dans le tampon en vortexant régulièrement puis centrifugés (10min, 14000g, 4°C). Le surnageant est de nouveau centrifugé dans les mêmes conditions. Les surnageants finaux sont récupérés et constituent les extraits protéiques de plante utilisés pour les différentes expérimentations b) Extraction des protéines d’autre plantes
Des plantes de tomate ont été cultivées en serre durant 4 semaines avant d’être pulvérisées avec du SA, du Me-JA ou de l’eau afin d’activer ou non leurs défenses. Les parties aériennes de ces plantes sont récoltées 48h après puis réduites en poudre dans l’azote liquide et utilisées pour en extraire les protéines.
Les protéines totales de ces plantes sont alors extraites à raison de 2mI de tampon d’extraction (Tris-Hcl pH7.550mM, NaCI 150mM, EDTA 0.5mM, Triton X1000.1%, nP40 0.2% antiprotéase 1X (cOmpleteTM, Mini, EDTA-free Protease inhibitor Cocktail, ROCHE)) par mg de poudre. Les échantillons sont resuspendus dans le tampon en vortexant régulièrement puis centrifugés (10min, 14 000g, 4°C). Le surnageant est de nouveau centrifugé dans les mêmes conditions. Les surnageants finaux sont récupérés et constituent les extraits protéiques de plante utilisés pour les différentes expérimentations.
[0146] Westerns blots (WB)
Des gels de SDS page à 10% d’acrylamides sont utilisés pour la migration des extraits protéiques. 30mI d’extrait de plante ou 25mI d’éluat d’immunoprécipitation sont incubés dan 15mI de Laemmli 2X 10min à 65°C en agitation puis déposés par puits. Les gels sont alors mis à migrer dans du tampon RB1X en voltage constant (100mV). Les protéines ayant été soumises à l’électrophorèse, sont alors transférées sur membranes de PVFD préalablement activées 10min dans l’éthanol absolu, à l’aide du trans-blot® turbo™ transfer System de Bio-rad. Les membranes sont alors rincées 3 fois dans du tampon Phosphate salin + 1% Tween (PBST) puis saturées en protéine de lait dans du PBST + lait 5% (1h en agitation 40rpm, température ambiante). Elles sont alors incubées pendant la durée de la nuit dans du PBST+ 5% lait sur la nuit à 4% en présence de l’anticorps primaire (1/5 000°). Les membranes sont alors lavées dans du PBST (4 x 10min + 1x 1 h, 40rpm, température ambiante) puis incubées avec l’anticorps secondaire (anti-rabbit HRP de sigma, 1/10000, 1h 40rpm température ambiante). Elles sont alors de nouveau lavées dans du PBST (4 x 10min + 1x 1 h, 40rpm, température ambiante) avant d’être séchées 2min sur papier absorbant. Les protéines hybridées par l’anticorps primaire sont alors détectées par chimioluminescence à l’aide du LAS 4000 (Fujifilm) et du substrat Amersham ECL™ Prime (luminol + peroxyde) de chez GE Healthcare.
Les membranes sont ensuite colorées à l’aide de bleu de Coomassie durant 1h à température ambiante en agitation à 35rpm. Les profils protéiques sont alors révélés en décolorant les membranes à l’aide d’une solution de décoloration d’acide acétique 10% et éthanol 10% pendant la nuit à température ambiante en agitation à 35rpm.
[0147] Immunoprécipitation (IP)
Des billes magnétiques couplées à des protéines A (Dynabeads™ Protein A, ThermoFisher n°10001D) sont utilisées afin d’effectuer une immunoprécipitation (IP) des protéines d’A. thaliana ou de protéines recombinantes à l’aide de l’antipeptide ou d’un anticorps commercial ciblant NPR1 uniquement chez cette espèce végétale (Agrisera n° AS12 1854).
Des billes sont préparées pour chaque IP. Pour cela, 4 aliquotes de 100mI de solution de billes sont déposés dans des tubes eppendorf 1,5ml puis placés sur portoir magnétique durant 2min. Le surnageant est jeté et les billes sont lavées 2 fois avec 500ml de PBST. Les tubes sont de nouveau placés sur le portoir magnétique pendant 2min, le surnageant est enlevé puis 90mI de PBST y sont déposés. Six microlitres d’anticorps commercial (6pg) et 0.5mI d’antipeptide (25pg) sont ajoutés par tube (qsp 100mI PBST) puis le tout est incubé 1h30 à température ambiante en agitation sur roue. Le surnageant est enlevé et les billes couplées aux anticorps sont lavées 3 fois avec 500mI de PBST en agitation (5min) sur roue. Le tout est ensuite repris dans 100mI de PBST. Les anticorps sont ensuite liés de manière covalente aux protéines A des billes en les lavant 2 fois 10min en agitation avec 1ml de tampon de crosslink (200mM triethanolamine pH 8,2). Les tubes sont de nouveau placés sur le support magnétique (2min) puis le surnagent est retiré. Un millilitre de tampon de cross-link + DMP (200mM triethanolamine pH 8,2 + dimethyl pimelimidate dihydrochloride 20mM) est ajouté par tube puis les tubes sont incubés 30min en agitation à température ambiante. La réaction de liaison covalente est stoppée en enlevant le surnageant (sur portoir magnétique), en ajoutant 1ml de Tris-HCI 50mM pH 7,5 (incubation 15min à TA en agitation sur roue) puis en lavant 3 fois 5min avec 500mI de PBST. Les billes liées de manière covalente aux anticorps sont alors reprises dans 10OmI de PBST et conservées à 4°C pour les IP.
Les tubes sont placés sur le portoir magnétique pour retirer le surnageant, 800mI de protéines totales d‘A. thaliana traitées au SA ou 150mI de protéine recombinante (1 pg pour chaque) sont déposés dans les 4 tubes contenant des billes magnétiques liées soit à l’anticorps commercial soit à l’antipeptide. Les 4 tubes sont incubés pendant la nuit à 4°C sur roue pour hybrider la, ou les, protéines reconnues par les anticorps à ceux-ci. Les billes couplées aux anticorps eux même hybridés aux protéines sont lavées 5 fois 5 min avec 500mI de PBST. Les protéines reconnues par les anticorps sont alors éluées à l’aide de 50mI laemmli + dithiothréitol (DTT) 100mM une première fois 15min à température ambiante (éluat 1) puis une deuxième fois toujours à l’aide de laemmli +DTT 100mM mais pendant 1h à 95°C (éluat2). Ces différent éluats sont ensuite utilisés en WB et SDSpage.
[0148] Production de protéines recombinantes Clonage
La phase codante de la protéine NPR1 d’A.thaliana, ainsi que des sous parties de celle-ci, ont été clonées dans la bactérie E. Coli par la technique de clonage Gateway®. Trois différentes constructions ont ainsi été effectuées. La première permet de produire la protéine NPR1 entière ou totale (prot T) soit une protéine de 560 acides aminés. La seconde permet de produire une protéine partielle (prot P) correspond aux 260 acides aminés en Nter de NPR1. La troisième permet de produire uniquement la parte inaccessible de NPR1 sous sa forme inactive soit les 140 acides aminés situés entre la cystéine 82 et la cystéine 216 de NPR1 (appelée prot I pour protéine d’intérêt) et ce tel que représenté à la Figure 2.
[0149] Des PCR ont été effectuées en utilisant comme matrice les ADNc d’A. thaliana à l’aide des amorces classiques et connues de l’homme du métier. Ces amorces permettent d’amplifier les séquences d’ADN codant pour les trois protéines suscitées en y intégrant en 5’ une séquence TEV permettant le clivage des protéines par la protéase TEV. Les séquences attB1 et attB2 ont aussi été ajoutées aux amorces afin de les intégrer respectivement en 5’ et en 3’ des produits de PCR afin de les assembler dans le vecteur pDONR207 par réaction de BP dans le cadre du clonage par la technique Gateway®. Les clones obtenus ont été validés par séquençage (GATC biotech) puis utilisés pour purifier les plasmides donneurs (pDONR207 + constructions) pour la suite du clonage. Les plasmides donneurs ont ensuite été utilisés pour la réaction de recombinaison (étape LR du protocole Gateway®) avec les plasmides d’expression (PetG10-A) permettant de rajouter une séquence codant pour une étiquette histidine en 5’ des différentes séquences d’intérêt et de traduire ces séquences en protéine de manière inductible (par ajout d’Isopropyl b-D-l-thiogalactopyranoside (IPTG)). Les plasmides d’expression obtenus ont ensuite été clonés dans la bactérie E. coli dH5a afin de les multiplier et de les purifier puis ils ont été clonés dans E. coli Rosetta afin de produire les protéines avec leur étiquette histidine.
Une séquence représentant la protéine NPR1 d’A. thaliana entière (Pro T) incluant en Nterminal une étiquette histidine suivit des acides aminés correspondant à la séquence attB1 nécessaire au clonage avec la méthode Gateway® ainsi que la séquence de clivage de la TEV protéase pour l’obtention de la protéine NPR1 entière ou totale (prot T).
[0150] Une séquence représentant la séquence de la protéine NPR1 d’A. thaliana partielle (Pro P) incluant en Nterminal une étiquette histidine suivit des acides aminés correspondant à la séquence attB1 nécessaire au clonage avec la méthode Gateway® ainsi que la séquence de clivage de la TEV protéase pour l’obtention de la protéine NPR1 partielle (prot P).
[0151] Une séquence représentant la séquence de la partie inaccessible sous la forme inactive de la protéine NPR1 d’A. thaliana partielle (Pro I) incluant en Nterminal une étiquette histidine suivit des acides aminés correspondant à la séquence attB1 nécessaire au clonage avec la méthode Gateway® ainsi que la séquence de clivage de la TEV protéase pour l’obtention de la protéine NPR1 d’intérêt (prot I). b) Production des protéines
Les différentes bactéries possédant les constructions d’intérêt ont été cultivées dans 2I de bouillon lysogène + Ampicilline 100pg/nnl + Chloramphénicol 34pg/ml, jusqu’à avoir une densité optique de 0,6 à 600nm, à 37°C. La production de protéine est alors déclenchée par ajout d’IPTG (0,5mM pour T et P et 1 mM pour I). Les bactéries sont prélevées 3h plus tard pour T et P et 4h plus tard pour I. Les cultures sont séparées en 6 fois 40ml chacune et centrifugées (12000g 15min à 4°C). Les culots sont congelés dans l’azote liquide pour les étapes suivantes.
Les culots sont re-suspendus dans un tampon de lyse dénaturant car les protéines recombinantes sont dans des corps d’inclusion (NaH2P04 100mM, tris 10mM pH8, NaCI 250mM, urée 8M, DTT 1 mM, imidazole 250mM, antiprotéase 1X (cOmpleteTM, Mini, EDTA-free Protease inhibitor Cocktail, ROCHE)) puis lysés par sonication (12 puises de 20 s à 50% d'amplitude entrecoupés de pause de 30 sec, sur glace 2°). Les extraits sont ensuite centrifugés (20 000g, 15min 4°C) pour culotter les débris cellulaires. Les surnageants sont récupérés et utilisés pour les différentes expérimentations comme protéine recombinante.
[0152] Analyse de l’expression de gènes par q-RT-PCR
Des plantes d’A. thaliana sont cultivées en terre durant 3 semaines en chambre de culture jour long puis sont pulvérisées avec de l’eau (témoin négatif) du Bion® 0.015% (témoin d’activation de la voie du SA). Les parties aériennes des plantes sont alors récoltées 48h après pulvérisation et broyées dans l’azote liquide.
Les ARNs sont ensuite extraits au trizol puis sont dosés afin de partir de 1 pg d’ARN pour les étapes de DNase et RT. L’ADN présent dans les échantillons est dégradé à l’aide de DNase (1 pg d’ARN, 1 pl de tampon 10X avec du MgCI2, 1 pl de DNase, complétés à 10pl avec de l’eau DEPC). Le tout est incubé 45 min à 37°C dans un bain Marie puis 1 pl d’EDTA à 50mM est rajouté avant incubation 10min à 65°C toujours dans un bain Marie afin d’inactiver la DNase. Ces ARNs traités à la DNase sont alors utilisés pour l’étape de rétro-transcription (RT). Cinq microlitres d’ARN sont incubés à 65°C pendant 5 min dans un bain Marie avec 1 pl d’amorces et 6.5pl d’eau traitée avec du diéthyl pyrocarbonate (DEPC). Puis 4pl de tampon de RT 5X, 0.5pl de Ribolock, 2pl de dNTPs à 10mM et 1 pl de transcriptase inverse M-MuLV sont ajoutés par tube avant incubation 1 h à 37°C dans un bain marie. La transcriptase inverse est ensuite inactivée durant 10min à 70°C. Les ADNc ainsi obtenus sont alors dilués par 10 (ajout de 180pl d’eau) pour être utilisés lors de l’étape de PCR quantitative. La réaction de qPCR se fait dans 10mI, à raison de 5mI de mix SybrGreen, 0.3mI de mélange d’amorces à 0.3mM, 2.4mI d’eau et 2.5mI d’ADNc.
Les qPCRs sont effectuées à l’aide d’un thermocycleur CFX-96 Real Time PCR System de chez Bio-Rad. Les données brutes obtenues sont traitées à l’aide du logiciel Bio-Rad CFX manager. La quantité de transcrits normalisée est ensuite obtenue en effectuant le rapport entre les données obtenues pour les gènes de défense d’intérêt et pour le gène constitutif utilisé (ici le gène codant pour la clathrine) en tenant compte de l’efficacité des amorces obtenues à l’aide de la gamme de dilution et de leur quantité exprimée en unité arbitraire
[0153] Exemple 1 : Détection de la forme active de NPR1 par les anticorps anti-NPR1 selon la présente invention
[0154] L’objectif du présent exemple est de montrer que les anticorps selon la présente invention, permettent de détecter une forme active de NPR1. Des western blots ont donc été réalisés à partir d’extraits d’A. Thaliana traitées avec du Bion®, du SA, ou de l’eau. Dans les western blots effectués avec ces extraits de plantes, une bande est détectée lorsque les plantes sont traitées par des activateurs de défense et n’est pas détectée lorsque les plantes sont traitées avec de l’eau. Cette bande est détectée à une taille de 37 kDa, et ce tel que représenté à la Figure 3.
[0155] Afin de montrer que la bande détectée correspond bien à la protéine NPR1, un séquençage a été effectué sur des bandes découpées sur un gel d’acrylamide réalisé en parallèle avec un Western blot, par séquençage peptidique effectuée par la plateforme PAPPSO (UMR MICALIS, PAPPSO, bâtiment 526, Domaine de Vilvert 78352, Jouy en Josas cedex). Entre 100 et 160 protéines sont alors identifiées au niveau de la bande détectée par Western blot dont la protéine NPR1 . NPR1 est donc bien présente au niveau de la bande détectée par Western blot (à la taille de 37 kDa).
[0156] De plus, des Western blots ont été effectués avec les mêmes extraits de plante en utilisant en parallèle l’antipeptide 0 (antipep 0) ainsi qu’anticorps commercial ciblant NPR1 uniquement chez A. thaliana (Agrisera n° AS12 1854). Une bande à la même taille que la bande observée en Western blot en utilisant les anticorps développés dans cette invention est détectée, lorsque l’anticorps commercial est utilisé, et ce tel que représenté à la Figure 5.
[0157] Afin de montrer que l’antipeptide développé est capable de s’hybrider à la protéine NPR1, les différentes formes de NPR1 recombinantes produites chez E.coli (incluant la partie active ciblée de la protéine) sont utilisées afin d’effectuer des westerns blots avec l’antipeptide (antipep 0) ou avec un anticorps spécifique de l’étiquette Histidine (His) utilisé chez ces mêmes protéines recombinantes (His- tag). Ces différentes formes de la protéine sont toutes les trois détectées avec chacun des anticorps, et ce à leur taille attendue (voir Figure 4).
[0158] De plus, les deux antipeptides (antipep 0 et antipepl) permettent de détecter une bande à la même taille en western blot sur des extraits protéiques d’A. thaliana élicités par un SDP, le SA, et ce tel que démontré sur la Figure 6.
[0159] Ainsi, et avantageusement, les anticorps selon la présente invention, permettent de détecter spécifiquement la forme active de la protéine NPR1, contrairement à l’anticorps commercial anti-NPR1 qui ne permet pas de discriminer la forme active de la forme inactive de NPR1. L’anticorps anti-NPR1 ne permet ainsi pas de déterminer si les mécanismes de défense des plantes sont activés, puisqu’il détecte indistinctement la forme active et la forme inactive de NPR1 .
[0160] De plus, l’immunisation avec différents peptides synthétiques, basés sur deux peptides dégénérés consensus différents, correspondants à des séquences consensus inter-espèces de NPR1 permet d’obtenir différents antipeptides détectant la même bande. De manière très avantageuse, ces anticorps permettent de cibler la forme active de NPR1 chez différentes espèces végétales, et ce contrairement à l’anticorps commercial anti-NPR1 qui ne cible que la protéine NPR1 d’A. thaliana.
[0161] Exemple 2 : Présence de la forme active de NPR1 lors de l’activation de différentes voies de défense
[0162] Afin de montrer que cette forme active de NPR1 est présente dans le deux voies hormonales de défense activées (voie impliquant le SA ou impliquant le couple JA/Et), des western blots ont été effectuées en utilisant des plantes d’A.thaliana traitées avec du SA, du Me-JA, ou de l’eau. La bande observée à 37kDa en western blot à l’aide des anticorps produits (antipepO) est détectée que l’on active les défenses à l’aide de SA ou à l’aide de Me-JA, et ce tel que représenté à la Figure 5. Ces résultats sont cohérents avec la littérature scientifique qui met en évidence l’implication de la protéine NPR1 dans les deux voies systémiques de défense des plantes que sont la résistance systémique acquise (SAR) et induite (ISR) (Pieterse et al. 1998).
[0163] Le même type de résultat est obtenu lorsque des extraits de tomates sont utilisés à la place des extraits d’A. thaliana et ce tel que représenté à la Figure 9.
[0164] Exemple 3 : Sensibilité de la méthode et avantage par rapport à l’anticorps commercial.
[0165] L’antipeptide 0 ainsi que l’anticorps commercial ont été utilisés pour effectuer une immunoprécipitation (IP) (Dynabeads™ Protein A, ThermoFisher n°10001D) sur extrait de protéines d’A. thaliana traitées à l’aide de SA. La bande de 37 kDa est observée sur l’électrophorèse de l’éluat d’IP obtenu avec des extraits de plante dont les défenses ont été activées Figure7.
[0166] Ces anticorps ont aussi été utilisés pour immunoprécipiter la protéine recombinante P de taille connue. Cette protéine est détectée en Western-blot sur l’éluât d’IP obtenu avec l’antipeptideO, mais pas avec celui obtenu en utilisant l’anticorps commercial, et ce tel que représenté à la Figure 7.
[0167] Ainsi, et avantageusement, les anticorps selon la présente invention présentent une sensibilité améliorée par rapport à un anticorps anti-NPR1 commercial et permettent de détecter NPR1 quand l’anticorps commercial ne le détecte pas.
[0168] Exemple 4 : Quantification de l’activation des défenses de plantes par l’anticorps selon la présente invention
[0169] Afin de montrer que les antipeptides peuvent permettre une quantification relative de l’activation des défenses, des extraits d’A. thaliana, connus pour avoir un niveau d’activation des défenses différentes (observé en qPCR sur des gènes rapporteurs des différentes voies de défense), ont été utilisés en western blot (WB). L’intensité de la bande détectée est corrélée avec le niveau d’activation des défenses observé en qPCR, et ce tel que représenté à la Figure 8.
[0170] Ainsi et avantageusement, la méthode selon la présente invention permet non seulement de détecter l’activation des défenses des plantes mais également de quantifier le niveau d’activation des défenses des plantes.
[0171] Exemple 5 : Détection de l’activation des défenses chez différentes espèces végétales par les anticorps selon la présente invention
[0172] Pour montrer que la stratégie d’utiliser des peptides dégénérés peut permettre d’obtenir des anticorps capables de détecter l’activation des défenses chez différentes espèces végétales, de extraits protéiques de plantes de tomates traitées avec du SA, du Me-JA ou de l’eau ont été analysés en western blot.
[0173] Une bande détectée se révèle beaucoup plus intense lorsque l’extrait protéique utilisé provient de plants de tomate traitées avec du SA ou du Me-JA comparé à l’extrait protéique issu du lot de plantes témoin traitées à l’eau et ce tel que représenté à la Figure 9.
[0174] Avantageusement, l’utilisation des anticorps anti-NPR1 spécifiques selon la présente invention permettent de cibler la forme active de la protéine NPR1 de différentes espèces de plantes et permettent de plus de détecter les défenses des plantes mises en place selon la voie impliquant l’acide salicylique mais aussi celles impliquant la voie du JA/Et..

Claims

Revendications
[Revendication 1] Anticorps anti-NPR1 caractérisé en ce que ledit anticorps se lie spécifiquement à la forme monomérique de la protéine NPR1.
[Revendication 2] Anticorps anti-NPR1 selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit anticorps est un anticorps polyclonal.
[Revendication 3] Anticorps anti-NPR1 selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit anticorps se lie à un épitope de séquence consensus SEQ ID NO :1 , où X1 est une valine ou une isoleucine et X2 est une sérine ou une proline.
[Revendication 4] Anticorps anti-NPR1 selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit anticorps se lie à l’épitope de séquence consensus SEQ ID NO :6, où X3 est une valine ou une isoleucine, X4 est une serine ou une proline et X5 est une sérine ou une proline.
[Revendication 5] Méthode de détection de l’activation des défenses d’une plante comprenant la détection de la forme monomérique de la protéine NPR1 dans un échantillon de ladite plante en utilisant un anticorps selon l’une quelconque des revendications 1 à 4.
[Revendication 6] Méthode de détection selon la revendication 5, caractérisée en ce que la forme monomérique de la protéine NPR1 est détectée par Western blot, par un test ELISA ou par un test bandelette de type LFD.
[Revendication 7] Méthode de détection selon la revendication 5 ou 6 caractérisée en ce que l’échantillon est un échantillon des parties aériennes de ladite plante.
[Revendication 8] Méthode de criblage de substances actives capables d’activer les défenses d’une plante comprenant : a) le traitement d’un échantillon de ladite plante avec au moins une substance ; b) la détection dans ledit échantillon de la forme monomérique de la protéine NPR1 selon la méthode de détection selon l’une quelconque des revendications 5 à 7.
[Revendication 9] Méthode d’évaluation de la sensibilité d’une plante à une molécule capable de stimuler les défenses d’une plante, comprenant : a) le traitement d’un échantillon de ladite plante avec une molécule capable de stimuler les défenses des plantes ; b) la détection dans ledit échantillon de la forme monomérique de la protéine NPR1 selon la méthode de détection selon l’une quelconque des revendications 5 à 7.
[Revendication 10] Méthode pour sélectionner une plante présentant un état d’activation des défenses susceptible de lui conférer une résistance améliorée à au moins un stress biotique et/ou abiotique comprenant : i) l’application dudit ou desdits stress à un échantillon de ladite plante, ii) la détection dans ledit échantillon de la forme monomérique de la protéine NPR1 selon la méthode de détection selon l’une quelconque des revendications 5 à 7.
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