WO2021174322A1

WO2021174322A1 - Método para preparação de uma formulação para indução de uma resposta imunológica de uma planta a um patógeno e formulação

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Publication number: WO2021174322A1
Application number: PCT/BR2020/050068
Authority: WO
Inventors: Fernando MARTINS FONSECA REIS; Gustavo Henrique RECCHIA
Original assignee: Genica Inovacao Biotecnologica SA
Current assignee: Genica Inovacao Biotecnologica SA
Priority date: 2020-03-04
Filing date: 2020-03-04
Publication date: 2021-09-10
Anticipated expiration: 2022-09-04
Also published as: EP4115735A1; GB202214320D0; US20250255309A1; BR112022017759A2; GB2609114A; EP4115735A4; GB2609114B

Abstract

MÉTODO PARA PREPARAÇÃO DE UMA FORMULAÇÃO PARA INDUÇÃO DE UMA RESPOSTA IMUNOLÓGICA DE UMA PLANTA A UM PATÓGENO E FORMULAÇÃO A presente invenção refere-se a um método para a preparação de uma formulação que tem como princípio ativo compostos de oligogalacturonídeos de cadeias lineares de resíduos de [1→4]-α-D-ácido galacturônico com Grau de Polimerização entre 3-8 unidades. Esta formulação visa o tratamento foliar de uma planta ao induzir a resistência sistêmica adquirida (SAR), diminuindo a susceptibilidade dela ao patógeno Phakopsora pachyrhiz, causador da doença, comumente conhecida como, ferrugem asiática.

Description

MÉTODO PARA PREPARAÇÃO DE UMA FORMULAÇÃO PARA INDUÇÃO DE UMA RESPOSTA IMUNOLÓGICA DE UMA PLANTA A UM PATÓGENO E FORMULAÇÃO

CAMPO TÉCNICO

[001]. A presente invenção refere-se a um método para a preparação de uma formulação que tem como princípio ativo compostos de oligogalacturonídeos de cadeias lineares de resíduos de [l->4]-a-D-ácido galacturônico com Grau de Polimerização entre 3-8 unidades. Esta formulação visa o tratamento foliar de uma planta ao induzir a resistência sistémica adquirida (SAR), diminuindo a susceptibilidade dela ao patógeno Phakopsora pachyrhiz, causador da doença, comumente conhecida como, ferrugem asiática.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002]. Atualmente, o controle da ferrugem asiática ocorre pelos seguintes métodos: seguir o vazio sanitário (período mínimo de 60 dias sem plantas vivas de soja no campo); utilizar cultivares com gene(s) de resistência; realizar semeadura no início da época recomendada; utilizar cultivares precoces (escape); e realizar aplicações de fungicidas químicos.

[003]. Este controle químico tem sido feito através da utilização de fungicidas sítio-específicos (que atuam sobre um único ponto do metabolismo do fungo), e multissítios (com atuação em mais de um ponto do metabolismo do fungo). Uma vez que esses fungicidas são específicos em sua toxicidade, eles podem ser absorvidos pelas plantas e tendem a ter propriedades sistémicas (McGrath, 2004; EMBRAPA Circular Técnica 144).

[004]. Os fungicidas atuais pertencem aos seguintes grupos: inibidores da desmetilação (IDM, “triazóis” - tebuconazol, ciproconazol, protioconazol, difenoconazol, epoxiconazol e tetraconazol), inibidores da quinona externa (IQe, “estrobilurinas” - azoxistrobina, trifloxistrobina, picoxistrobina, metominostrobina e piraclostrobina), inibidores da succinato desidrogenase (ISDH, “carboxamidas” - fluxapiroxade, bixafen, benzovindiflupir, fluindapir e impirfluxam), ditiocarbamato (mancozebe), cloronitrila (clorotalonil) e inorgânico (oxicloreto de cobre) (Godoy et a/., 2017a; EMBRAPA Circular Técnica 138). O número de fungicidas registrados para o controle da ferrugem asiática da soja aumentaram de cinco em 2002, para 117 em 2015 (Godoy et a/., 2016).

[005]. Desde os primeiros anos de uso para o controle da doença, os fungicidas têm diferenciado intensamente em sua eficácia, sendo que populações resistentes de Phakopsora pachyrhiz menos sensíveis a estas moléculas são frequentemente identificadas (FRAC, 2017; Klosowski et al., 2015; Schmitz et al., 2013; Simões et al., 2017). Além disso, a forte dependência dessa ferramenta é fonte constante de preocupação quanto aos riscos à saúde do aplicador e ao meio ambiente. Dentre os critérios adotados para a aplicação, recomenda-se: o uso de mais de um grupo de fungicidas por ciclo, com diferentes modos de ação; dar prioridade para as aplicações durante os estágios de florescimento, formação das vagens e granação, visando os períodos de maior susceptibilidade; em condições severas de epidemia, realizar de três a cinco aplicações em intervalos de 10 dias (Sinclair e Hartman, 1995); e realizar aplicações preventivas ainda no período vegetativo, no pré-fechamento das linhas de semeadura, considerando clima e prevendo a infecção (Deuner et al., 2009).

[006]. Por outro lado, os oligogalacturonídeos (doravante também denominados por sua sigla OGs) têm demonstrado a capacidade de elicitar diversas respostas de defesa na planta, incluindo a indução da transcrição de genes essenciais para este processo (Ferrari et al. 2003). Nas plantas, a degradação da pectina que compõe a parede celular por microrganismos invasores leva à liberação destes oligômeros de resíduos de [l->4]-a-D-ácido galacturônico cujo acúmulo irá desencadear tais processos de defesa. No entanto, OGs também demonstraram afetar diversos aspectos do crescimento e desenvolvimento das plantas (Darvill et al., 1992), tais como a elongação de segmentos do caule de ervilhas (Branca et al., 1988), o florescimento (Marfà et al., 1991) e a organogênese de raízes em explantes de tabaco (Bellicampi et al., 1993), um processo associado ao antagonismo de OGs com o fito-hormônio auxina. Além disso, OGs são também considerados sinais endógenos quando liberados em baixa quantidade como consequência do remodelamento da parede celular durante o desenvolvimento das células vegetais (Ferrari et al., 2003). Consequentemente, a forma como as plantas conseguem discriminar entre baixas doses fisiológicas de OGs e altas quantidades produzidas durante a interação com patógenos ainda não foi devidamente elucidada. Assim, é vital seguir as recomendações de dosagem e posicionamento das aplicações para que aspectos importantes do desenvolvimento e preparação da planta não sejam comprometidos.

[007]. Na plântula Arabidopsis, as respostas desencadeadas por OGs sobrepõem àquelas ativadas por MAMPs (do inglês, microbial associated molecular patterns, ou padrões moleculares associados a microrganismos). Os transcritomas de plântulas tratadas com OGs e flg22 (peptídeo relacionado ao epítopo ativo de flagelina), indicam uma ampla sobreposição de respostas nos primeiros momentos após o tratamento (30-60 min). Estes efetores ativam uma série de respostas que são independentes das vias de sinalização mediadas por etileno, ácido salicílico (AS) e jasmonato (JA) e induzem a fosforilação de duas proteínas MAP Kinases, AtMPK3 e AtMPK6, a segunda necessária para a expressão precoce de genes de defesa e para a indução de resistência contra o patógeno Botrytis cinerea. Além disso, OGs e flg22 produzem uma resposta oxidativa mediada pela enzima (NADPH)- oxidase AtRbohD, que é parcialmente responsável pela subsequente deposição de calose.

[008]. A preparação de OGs in vivo por plantas de Arabidosis foi explorada ao expressar uma proteína quimérica derivada da fusão de uma poligalacturonases obtida do fungo Fusarium phyllophillum (FpPG) e de uma PGIP de Phaseolus vulgaris (PvPGIP2). Ao expressarem a construção quimérica sob o controle de promotores regulados por b-estradiol e pelo gene R conservado PR-1, acumularam OGs ativos, com Grau de Polimerização variando de 6-13, ampliando a resistência ao ataque do fungo Botrytis cinerea e das bactérias Pseudomonas syringae e Pectobacterium carotovorum.

[009]. Diante do supracitado, verificou-se a necessidade de sintetizar in vitro em larga escala de OGs tendo como propósito a formulação de um produto indutor de resistência para o tratamento foliar de uma cultura de interesse agrícola, como por exemplo a soja.

[0010]. Não há no estado da técnica, qualquer menção de OGs para a indução de resposta imune sistémica na cultura da soja, para diminuir a susceptibilidade da cultura ao ataque por Phakopsora pachyrhiz, o fungo causador da ferrugem asiática. Ademais, não existem relatos de produtos comerciais possuindo OGs como princípio ativo.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[0011]. Assim, é objeto da presente invenção proporcionar um método para preparação de uma formulação contendo oligômeros de [l->4]-a-D-ácido galacturônico, com Grau de Polimerização entre 3-8, para o tratamento foliar de plantas, nos estágios de desenvolvimento fenológico em que se encontram mais susceptíveis ao ataque do patógeno. A formulação elicita uma ampla gama de respostas de defesa que incluem os acúmulos de fitoalexinas, glucanases e quitinases, deposição de calose, de espécies reativas de oxigénio e de óxido nítrico. [0012]. A presente invenção não se refere a uma alternativa aos tratamentos químicos convencionais disponíveis hoje no mercado. Ela oferece uma ferramenta adicional no controle da doença, no sentido em que permite que sejam alcançados os níveis de controle desejados com um menor número de aplicações de fungicidas químicos por ciclo da cultura.

[0013]. A presente invenção refere-se a um método para preparação de uma formulação para indução de uma resposta imunológica de uma planta a um patógeno, compreendendo as etapas de:

(a) purificar compostos de oligogalacturonídeos, a partir do produto da hidrólise enzimática parcial do ácido-poligalacturônico durante o processo de refino da pectina, em que a reação de hidrólise é realizada por um complexo de pectinases (pectina metil-esterases, endopoligalacturonases e exopoligalacturonases), obtidas de Aspergillus niger, em uma temperatura que varia de 26°C a 36°C, agitação que varia de 100 a 200 rpm e pH entre 3,8 e 4,5;

(b) ferver a solução obtida a uma temperatura de 100 °C por 10 min para inativação enzimática;

(c) diluir a solução obtida a 0,5% com solução de NaOAc 50mM;

(d) adicionar EtOH a solução obtida, obtendo uma solução com concentração de

11%;

(e) manter a solução da etapa (d) incubada por 16 horas a uma temperatura de 4 °C para precipitação dos oligogalacturonídeos;

(f) centrifugar a solução da etapa (e) a 30.000 g por 30 min, obtendo uma formulação contendo oligogalacturonídeos em pó sólido e solúvel em água;

(g) ressuspender o composto em água de modo a se obter uma solução com concentração de 1 mg x mL·¹ x ha^·1; e

(h) aplicar o composto em uma planta suscetível a um patógeno.

[0014]. Durante a etapa (a) do método da presente invenção a concentração enzimática é de 100 U, a temperatura é de 30 °C, a agitação é de 150 rpm e o pH é de 4,00 a 4,05.

[0015]. Já na etapa (g) do método da presente invenção é aplicada sobre a planta elicitando uma resposta de defesa na planta ao induzir a transcrição de genes essenciais para este processo.

[0016]. O patógeno biotrófico a ser tratado pelo método da presente invenção é Phakopsora pachyrhiz e a planta a ser tratada é preferencialmente a soja.

[0017]. Através do método da presente invenção obtêm-se uma formulação compreendo como princípio ativo o composto de estrutura molecular

que se refere a compostos de oligogalacturonídeos de cadeias lineares de resíduos de [l->4]-a-D-ácido galacturônico com Grau de Polimerização entre 3-8 (Fórmula química: (CeHsOejn).

[0018]. A formulação em questão ainda compreende:

- de 70 a 80% de ácido-poligalacturônico inativo;

- de 10 a 15% de fração ativa de oligômeros com Grau de Polimerização entre 3- 8 unidade;

- de 10 a 12% de NaOAc;

- de 0,1 a 0,5% de enzima inativada composta por complexo pectinases de pectina metil-esterases, endo- e exo- poligalacturonases, isoladas de Aspergillus niger e

- de 0,01 a 0,05 % de proteína carreadora inativada de BSA.

[0019]. Preferencialmente, a formulação compreende:

- 74,71% de ácido-poligalacturônico inativo;

- 14,01% de fração ativa de oligômeros com Grau de Polimerização entre 3-8 unidade;

- 10.99% de NaOAc;

- 0,26% de enzima inativada composta por complexo pectinases de pectina metil-esterases, endo- e exo- poligalacturonases, isoladas de Aspergillus niger; e

- 0,03% de proteína carreadora inativada de BSA.

[0020]. A maior parte das respostas de defesa e efeitos sobre o desenvolvimento vegetal exercidos pelos OGs requerem um Grau de Polimerização específico. Desta forma, se torna evidente que para a ativação de padrões específicos de resposta, OGs com Grau de Polimerização também específicos são requeridos, sendo que para a presente proposta fica estabelecido que OGs com Grau de Polimerização entre 3-8 são necessários para a ativação de resposta imunológica na soja capaz de reduzir a progressão da infecção pelo fungo Phakopsora pachyrhiz, causador da doença ferrugem asiática da soja. Importante enfatizar que o Grau de Polimerização entre 3-8 tem ação indutora de resistência frente a outras doenças provocadas pela infecção por microrganismos, em especial aqueles cujo parasitismo tem caráter biotrófico, não somente visando a cultura da soja, mas também outras culturas de interesse agrícola.

[0021]. Por fim, a presente invenção visa o desenvolvimento de um produto único, com fins de indução de resistência, porém a formulação aqui obtida pode ser incorporada como um aditivo para a formulação de outros produtos comerciais como fertilizantes, indutores de crescimento, ou mesmo fungicidas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0022]. Figura 1 - Fotos das plantas da cultivar Conquista-MG decorridos 30 dias de aplicação da formulação de oligômeros obtida pela presente invenção e inoculação com suspensão contento 5 x 10⁵ esporos/ml de Phakopsora pachyrhiz.

[0023]. Figura 2 - Fotos de teste de germinação de esporos de Phakopsora pachyrhiz em meio ágar-água 1,5% coletados 25 dias após a inoculação.

[0024]. Figura 3 - Gráfico demostrando a curva de progressão da severidade de ferrugem asiática da soja em termos de percentual (%) de área foliar contaminada em plantas da cultivar K-5616.

[0025]. Figura 4 - Fotos das plantas da cultivar Monsoy IPRO M8372 IPRO após 19 dias de tratamento com a formulação de oligômeros obtida pela presente invenção.

[0026]. Figura 5 - Gráfico demostrando o cálculo da área abaixo da curva de progressão da doença (AACPD) para o índice que indica o nível de susceptibilidade da doença após os tratamentos em plantas da cultivar K-5616.

[0027]. Figura 6 - Gráfico com dados médios de produtividade da cultivar K- 5616 obtidos na área de estudo em Guarapuava (PR) para a Safra 2018/19.

[0028]. Figura 7 - Gráfico com o grau da severidade de ferrugem asiática da soja em termos de percentual (%) de área foliar contaminada em plantas da cultivar Agroeste 3730 Intacta.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0029]. Como já mencionado, havia uma necessidade de se desenvolver uma solução inovadora, rentável e segura para o controle e manejo da ferrugem asiática da soja. Assim, a presente invenção versa sobre métodos para obtenção de uma formulação de oligômeros que ativem os mecanismos de defesa da planta contra o iminente ataque do patógeno, criando uma ferramenta adicional para o manejo da doença que permite a diminuição no número de aplicações de fungicidas. Neste caso, o foco deixa de ser o controle químico do inoculo feito pelos fungicidas tradicionais (com elevado potencial de toxicidade e que oferecem riscos à saúde humana, animal e ao ambiente) e passa a ser a planta. Assim, são diminuídos os riscos inerentes à seleção de populações resistentes de Phakopsora pachyrhiz frente a exposição contínua aos mesmos grupos de moléculas que constituem a base da formulação destes fungicidas.

[0030]. Assim, desenvolveu-se a presente invenção que tem como objetivo um método para fabricação de uma formulação de oligômeros com compostos de cadeias lineares de resíduos de [l->4]-a-D-ácido galacturônico, com Grau de Polimerização entre 3-8 unidades.

[0031]. Essa formulação de oligômeros obtida pelo método em questão é preferencialmente um produto sólido (Pó-seco), solúvel em água, para aplicação foliar na cultura da soja, induzindo a resistência na planta frente ao ataque pelo patógeno Phakopsora pachyrhiz.

[0032]. É importante destacar que embora a formulação de oligômeros tenha potencial de ativar respostas imunológicas sistémicas, este tipo de resposta tende a ter um caráter transiente, sendo necessária uma exposição contínua a molécula efetora para que perdure por um período mais prolongado. No entanto, oligômeros possuem um outro papel fundamental na fisiologia vegetal. Sendo um produto direto da degradação da pectina, composto essencial da parede celular, variações apoplásticas na concentração dessas moléculas podem ativar a transdução de sinais citoplasmáticos que afetam diretamente a expressão de genes relacionados ao desenvolvimento celular, com potencial impacto no desenvolvimento e preparação da planta. Desta forma, é vital atentar para a concentração final do produto em solução, e que as aplicações sejam conduzidas somente nos períodos de maior susceptibilidade da cultura ao patógeno, afim de evitar sobrecarregar a planta - transição do vegetativo para reprodutivo (V7/8), florescimento (Rl), formação das vagens (R3) e granação (R5).

[0033]. Como o foco do tratamento é a planta e não o fungo, é fundamental que o controle químico com fungicidas, embora em menor escala, ainda seja mantido visando impedir um aumento da pressão de inoculo no campo. Esta estratégia oferece uma ferramenta adicional no combate à doença, no sentido em que permite que sejam alcançados os níveis de controle desejados com um menor número de aplicações de fungicidas químicos por ciclo da cultura, diminuindo impactos negativos provocados por fitotoxidade, risco à saúde humana e contaminação do ambiente.

Testes realizados

[0034]. Todos os testes foram conduzidos com plantas de soja mantidas em câmaras de crescimento controlado (24+1 °C, fotoperíodo 14/10 horas, intensidade luminosa de 280 pmol x rrr² x s-¹), sendo as aplicações foliares do composto (lmg/ml) realizadas com aspersor manual, no estágio V4 de desenvolvimento fenológico da planta, cerca de 12 horas antes da inoculação com solução de 5 x 10⁵ esporos/ml de Phakopsora pachyrhiz.

[0035]. As plantas receberam um acompanhamento diário ao longo de todo o período de experimento, sendo a escala de notas visual proposta por Godoy et al. (2006), empregada para verificar a progressão de severidade da doença (%). Vale ainda ressaltar, que para as provas de conceito as plantas eram mantidas somente até o estágio de florescimento (Rl) em virtude de as dimensões da câmara de crescimento não comportarem as plantas para além deste estágio de desenvolvimento.

[0036]. As plantas controle são aquelas não tratadas pela formulação de oligômeros obtida pela presente invenção ou fungicida.

Teste 1

[0037]. Foram submetidas plantas da cultivar Conquista-MG, bastante suscetíveis à doença. Decorridos 11 dias após a inoculação, somente as pústulas presentes nas plantas não tratadas apresentaram esporulação; plantas tratadas com a formulação de oligômeros da presente invenção produziram em média 26,3 x 105 esporos/ml, enquanto que para as plantas controle não tratadas a contagem foi de 94 x 105 esporos/ml de Phakopsora pachyrhiz, ou seja, 3,58 vezes mais esporos.

[0038]. A viabilidade desses esporos também foi estimada. Os esporos obtidos foram inoculados em meio ágar-água e avaliados após 25 dias. Para as plantas tratadas com a formulação de oligômeros da presente invenção, apenas 49,6% dos esporos germinaram (Figura 2a), enquanto para as plantas controle não tratadas essa taxa foi maior 73% (Figura 2b).

[0039]. Decorridos 30 dias do tratamento, as plantas da cultivar Conquista-MG tratadas com a formulação de oligômeros da presente invenção apresentavam no máximo 7% da área foliar com lesões (Figura la), enquanto que plantas controle não tratadas apresentavam até 78% da área com lesões (Figura lb).

Teste 2

[0040]. Foram submetidas plantas da cultivar IPRO M8372, com potencial intermediário de susceptibilidade a doença. Ao final do experimento (19 dias), todas as plantas inoculadas exibiam algum sintoma de doença. No entanto, a severidade da doença se mostrou diferente entre ambos os tratamentos. Para as plantas tratadas com a formulação de oligômeros da presente invenção, 80% das folhas contaminadas apresentaram entre 0,2 - 2% de sua área total com lesões (Figura 4a), já dentre as folhas não tratadas, 80% apresentaram de 2-18% de sua área com lesões (Figura 4b). 0 máximo de contaminação em folhas tratadas foi de 7%.

Teste 3

[0041]. Realizado na região de Guarapuava (PR). Ali foram considerados três tratamentos de aplicação do composto: (i) uma aplicação no pré-florescimento (V7/8), (ii) uma aplicação no início da formação das vagens (R3), e (iii) duas aplicações de formulação de oligômeros da presente invenção em ambos os estágios de desenvolvimento (V7/8 + R3), sempre em consórcio com fungicidas químicos seguindo o calendário padrão de aplicação da área experimental na fazenda (Tabela 1).

Tabela 1. Rotina de aplicação de fungicidas em teste de eficiência agronómico realizado na região do município de Guarapuava (PR) na Safra 2018/19.

[0042]. A cultivar adotada foi a K-5616. 0 sistema de delineamento experimental foi de parcelas subdivididas com aleatorização em sistema fatorial. Foram definidas 24 parcelas, divididas em quatro blocos, subdivididas de acordo com o estágio de desenvolvimento fenológico da planta onde seria feita a aplicação da formulação de oligômeros obtida pela presente invenção. As parcelas (blocos) tiveram dimensões de 5 x 3 (m), contendo 7 linhas, sendo as duas linhas mais externas e 0,50 m de cada lado utilizados como borda para isolamento das parcelas. Os tratamentos foram inteiramente casualizados. Foi utilizada uma densidade populacional média de 300 mil plantas x ha^·1. A dose final de aplicação da formulação de oligômeros obtida pela presente invenção foi de lmg/ml, correspondendo a 16,8% em 100L/ha.

[0043]. Em virtude da forte presença da doença na região, foi possível a coleta de dados de severidade de doença (%) ao longo dos meses de fevereiro e março de 2019. Através do Gráfico da Figura 3 é possível averiguar a curva de progressão da severidade de ferrugem asiática da soja em termos de percentual (%) de área foliar contaminada em plantas da cultivar K-5616.

[0044]. A avalição semanal foi realizada de acordo com escala visual de notas proposta por Godoy et al. (2006), onde cinco tratamentos foram conduzidos: (i) controle sem nenhuma forma de controle da doença; (ii) uma aplicação da formulação de oligômeros obtida pela presente invenção, no estágio V7 de desenvolvimento da planta com mais quatro aplicações de fungicida; (iii) duas aplicações da formulação de oligômeros obtida pela presente invenção, nos estágios V7 e R3 de desenvolvimento da planta com mais quatro aplicações de fungicida; (iv) uma aplicação da formulação de oligômeros obtida pela presente invenção, no estágio R3 de desenvolvimento da planta com mais quatro aplicações de fungicida; e (v) quatro aplicações de fungicida.

[0045]. Para os demais tratamentos, parcelas que receberam duas aplicações da formulação de oligômeros da presente invenção (V7/8 + R3) em consórcio com a aplicação padrão de fungicidas mostraram os menores níveis de severidade de doença (49,1%). Aplicações únicas se mostraram mais eficientes quando realizadas durante o estágio reprodutivo, quando a planta encontra-se sob maior pressão de inoculo (54,3% para aplicação em R3), sendo que a aplicação somente em V7/8 exibiu níveis similares de controle (75,6%) as parcelas em que só foi feita a aplicação padrão de fungicidas (80,7%).

[0046]. A Figura 5 ilustra o resultado um gráfico com o cálculo da área abaixo da curva de progressão da doença (AACPD) para o índice que indica o nível de susceptibilidade da doença após os tratamentos em plantas da cultivar K-5616. cultivadas na região do município de Guarapuava (PR) durante a Safra 2018/19.

[0047]. A Figura 6 é um gráfico que demonstra os dados médios de produtividade da cultivar K-5616 obtidos na área de estudo em Guarapuava (PR) para a Safra 2018/19. Na Figura 6a está representada a Produtividade média de sacas de soja por hectare de área plantada (sc x ha-¹); na Figura 6b está representada a produtividade média em quilos de soja por hectare de área plantada (kgx há ¹).

Teste 4

[0048]. Realizado na região de Piracicaba (SP), foram considerados cinco tratamentos de aplicação do composto: (i) uma aplicação no pré-florescimento (V7/8); (ii) uma aplicação no início da formação das vagens (R3), (iii) uma aplicação no enchimento de grãos (R5); e (iv) e (v) duas aplicações, em V7/8 + R3, e em R3 + R5, respectivamente.

[0049]. Além disso, foram adotadas parcelas onde só foram feitas aplicações de formulação de oligômeros da presente invenção, somente uma aplicação de fungicida (Fox^®, Bayer) em Rl, e parcelas com ambos os tratamentos.

[0050]. A cultivar adotada foi a Agroeste 3730 Intacta. O sistema de delineamento experimental foi de parcelas subdivididas com aleatorização em sistema fatorial. Foram definidas 96 parcelas, divididas em quatro blocos, subdivididas de acordo com o estágio de desenvolvimento fenológico da planta onde seria feita a aplicação da formulação de oligômeros obtida pela presente invenção e/ou fungicida. As parcelas (blocos) tiveram dimensões de 5 x 3 (m), contendo 7 linhas, sendo as duas linhas mais externas e 0,50 m de cada lado utilizados como borda para isolamento das parcelas. Os tratamentos foram inteiramente casualizados. Foi utilizada uma densidade populacional média de 300 mil plantas x ha^·1. A dose final de aplicação da formulação de oligômeros obtida pela presente invenção foi de lmg/ml, correspondendo a 16,8% em 100L/ha.

[0051]. Em virtude da forte estiagem na região durante as duas primeiras semanas de dezembro/2018, e ao longo de todo o mês de janeiro/2019, as plantas sofreram um forte impacto sobre o desenvolvimento. Visando minimizar efeitos de fito- toxicidade em decorrência das temperaturas elevadas, apenas uma aplicação de fungicida foi realizada em 13/fev (0,4 L/ha). Em decorrência das chuvas terem se intensificado somente no final do mês de março/2019, a ferrugem só foi registrada no final do ciclo de desenvolvimento da cultura (16/03/2019), sendo que somente uma avaliação de severidade de doença (%) foi possível.

[0052]. Pelo gráfico da Figura 7 é possível verificar o grau da severidade de ferrugem asiática da soja em termos de percentual (%) de área foliar contaminada em plantas da cultivar Agroeste 3730 Intacta. Conclusão

[0053]. Estes dados comprovam que o tratamento da soja com frações biologicamente ativas da formulação de oligômeros da presente invenção afeta a colonização por Phakopsora pachyrhiz, tendo impacto direto sobre a progressão da severidade (%) da doença no campo.

[0054]. Conclui-se, portanto, que a presente invenção é inovadora e ecologicamente sustentável, ao fazer uso de um efetor químico com ocorrência natural em plantas para o tratamento de uma doença cujo manejo é realizado quase que exclusivamente a base de fungicidas químicos com elevado grau de toxicidade e que oferecem riscos à saúde humana, animal e ao ambiente. A adição dessa ferramenta às técnicas de manejo integrado da doença, principalmente em complemento com as práticas usuais de controle químico, oferece a possibilidade de redução no número das aplicações de fungicidas ao longo do ciclo de desenvolvimento da cultura.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. MÉTODO PARA PREPARAÇÃO DE UMA FORMULAÇÃO PARA INDUÇÃO DE UMA RESPOSTA IMUNOLOGICA de uma planta a um patógeno, caracterizado pelo fato de que compreende:

(c) diluir a solução obtida a 0,5% com solução de NaOAc 50mM;

11%;

(g) ressuspender o composto em água de modo a se obter uma solução com concentração de 1 mg x mL ¹ x ha^·1; e

(h) aplicar o composto em uma planta suscetível a um patógeno.

2. MÉTODO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (a) a concentração enzimática é de 100 U, a temperatura é de 30°C, a agitação é de 150 rpm e o pH é de 4,00 a 4,05.

3. MÉTODO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução da etapa (g) é aplicada sobre a planta elicitando uma resposta de defesa na planta ao induzir a transcrição de genes essenciais para este processo.

4. MÉTODO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o patógeno biotrófico é Phakopsora pachyrhizi.

5. FORMULAÇÃO, caracterizada pelo fato de que é obtida pelo método tal como descrito pelas reivindicações de 1 a 4, em que possui como princípio ativo oligômeros de resíduos de [l->4]-a-D-ácido galacturônico, contendo Grau de Polimerização entre 3-8 unidades.

6. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicaçãoõ, caracterizada pelo fato de que compreende: