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WO2021170963A1 - Méthode d'identification de composés utiles pour le traitement d'un cancer - Google Patents

Méthode d'identification de composés utiles pour le traitement d'un cancer Download PDF

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Publication number
WO2021170963A1
WO2021170963A1 PCT/FR2021/050335 FR2021050335W WO2021170963A1 WO 2021170963 A1 WO2021170963 A1 WO 2021170963A1 FR 2021050335 W FR2021050335 W FR 2021050335W WO 2021170963 A1 WO2021170963 A1 WO 2021170963A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
compound
interaction
chchd4
aif
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2021/050335
Other languages
English (en)
Inventor
Catherine Brenner
Nazanine Modjtahedi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut Gustave Roussy (IGR)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Paris Saclay
Original Assignee
Institut Gustave Roussy (IGR)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Paris Saclay
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Gustave Roussy (IGR), Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Universite Paris Saclay filed Critical Institut Gustave Roussy (IGR)
Priority to US17/802,550 priority Critical patent/US20230221321A1/en
Priority to JP2022551713A priority patent/JP7679392B2/ja
Priority to EP21714639.8A priority patent/EP4111200A1/fr
Priority to CA3169127A priority patent/CA3169127A1/fr
Publication of WO2021170963A1 publication Critical patent/WO2021170963A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4747—Apoptosis related proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the invention relates to a method of identifying compounds useful for the treatment of cancer, based on the evaluation of the ability of the compound to modulate the interaction between the AIF protein and the CHCHD4 protein.
  • Mitochondria are major players in cell metabolism via, among other things, their ability to produce ATR, produce different metabolites and macromolecules, produce and detoxify reactive oxygen species and modulate cell death. For this reason, targeting mitochondrial activity in order to affect the metabolism of cancer cells is an avenue of interest in the treatment of cancers. However, the mitochondrial molecular mechanisms likely to provide therapeutic benefit have yet to be determined.
  • AIF Apoptosis Inducing Factor
  • CHCHD4 coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 4
  • the inventors have developed an identification method, based on the evaluation of the capacity of a compound to inhibit the interaction between the protein.
  • AIF and the CHCHD4 protein The hypothesis of the inventors would be that a compound inhibiting the formation of the complex AIF / CHCHD4 would be able to affect cancer cells whose survival and proliferation depend on mitochondrial activity.
  • the method developed by the inventors has proved to be particularly effective since it has made it possible to identify compounds having anti-cancer properties.
  • the present method has the advantage of being applicable to high throughput screening, thereby facilitating the identification of compounds potentially useful for the treatment of cancer.
  • One aspect of the invention therefore relates to a method of identifying a compound potentially useful for the treatment of cancer, characterized in that it comprises the evaluation of the capacity of said compound to inhibit the interaction between the protein AIF and the CHCHD4 protein, said compound being identified as potentially useful for the treatment of cancer if it inhibits said interaction.
  • the method comprises:
  • the compound is identified as potentially useful for the treatment of cancer if it inhibits by at least 50%, 60%, 70%, 80%, or at least 90% the interaction between the AIF protein and the CHCHD4 protein.
  • the interaction between the AIF protein and the CHCHD4 protein can be measured by means of a homogeneous amplified luminescence proximity assay (ALPHA) or a surface plasmon resonance (SPR) assay.
  • APHA amplified luminescence proximity assay
  • SPR surface plasmon resonance
  • the method according to the invention can comprise the confirmation, in a cell or non-human animal model of cancer, of the anticancer properties of the identified compound.
  • the method comprises:
  • kits for the identification of a compound potentially useful for the treatment of cancer characterized in that it comprises:
  • Means suitable for measuring the interaction between the AIF protein and the CHCHD4 protein can be means suitable for a homogeneous amplified luminescence proximity test (ALPHA).
  • the buffer suitable for the experiment measuring the interaction between the AIF protein and the CHCHD4 protein comprises phosphate buffered saline (PBS) and bovine serum albumin (BSA).
  • said compound capable of inhibiting the interaction between the AIF protein and the CHCHD4 protein consists of the sequence of SEQ ID NO: 4 or any functional variant having at least 70%, 80%, 90%, or at least 99% identity with the sequence of SEQ ID NO: 4.
  • FIG. 1 AIF103-613 and CHCHD4 titration by Alphascreen.
  • the titration of the CHCHD4 protein against the AIF 103 -613 protein by the ALPHAscreen technology leads to a bell-shaped response called the Hook effect.
  • Figure 2 Inhibition of the interaction of AIF103-613 / CHCHD4.
  • TH mean (negative control signal) - 5 * SD (negative control signal).
  • the Y axis corresponds to the normalized signal , that is, the signal calculated as a percentage of the mean.
  • Figure 3 SPR analysis of the compounds identified by Alphascreen.
  • A Validation by SPR of thioridrazine and mitoxantrone using the Alphascreen test as inhibitors of the AIF 103-613 / CHCHD4 interaction.
  • the 10 ⁇ M compounds were incubated for 20 min with AIF in DPBS at pH 7.4 at room temperature. Then, the mixture was injected for 3 minutes at a rate of 30 ⁇ L per minute on the CHCHD4 protein.
  • the 3 ⁇ M N27 peptide served as a positive control.
  • One aspect of the invention relates to a method of identifying a compound potentially useful for the treatment of cancer, characterized in that it comprises evaluating the ability of a compound to inhibit the interaction between AIF protein and the CHCHD4 protein, said compound being identified as potentially useful for the treatment of cancer if it inhibits said interaction.
  • One aspect of the invention relates in particular to a method of screening a library of compounds to identify a compound potentially useful for the treatment of cancer, characterized in that it comprises the evaluation of the capacity of the compounds of said library compounds to inhibit the interaction between the AIF protein and the CHCHD4 protein, said compounds being identified as potentially useful for the treatment of cancer if they inhibit said interaction.
  • the method according to the invention comprises:
  • the protein AIF (for "Apoptosis Inducing Factor") is a flavoprotein present in the mitochondria and which promotes apoptosis when it is released from the mitochondria.
  • the AIF protein can be of any origin, preferably of animal origin, in particular a mammal, more preferably of human origin.
  • the AIF protein corresponds to the natural human AIF protein whose NCBI sequence reference is “NP 004199.1”, or any functional variant thereof such as AIF2 which is a specific brain isoform.
  • the AIF protein according to the invention can correspond to the natural human polypeptide of sequence SEQ ID NO: 1, or any functional variant.
  • the expression "functional variant” which refers to the AIF protein denotes any polypeptide derived from the structure of the AIF protein and retaining the capacity for binding to the CHCHD4 protein, in particular to the CHCHD4 protein of SEQ ID NO: 2.
  • the functional variants can be natural or synthetic variants such as fragments, mutants or deletants.
  • the functional variant of the AIF protein corresponds to a polypeptide having a sequence identity of at least 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or at least 95% with the AIF protein of sequence SEQ ID NO: 1.
  • the CHCHD4 protein (also called “mitochondrial intermembrane space import and assembly protein 40” or “MIA40”) is a protein which participates in protein import into the intermembrane space of the mitochondria.
  • the CHCHD4 protein can be of any origin, preferably of animal origin, in particular a mammal, more preferably of human origin.
  • the CHCHD4 protein corresponds to the natural CHCHD4 protein human whose NCBI sequence reference is "NR 001091972.1".
  • the CHCHD4 protein according to the invention can correspond to the natural human polypeptide of sequence SEQ ID NO: 2 or any functional variant.
  • the expression “functional variant” which refers to the CHCHD4 protein denotes any polypeptide derived from the structure of the CHCHD4 protein and retaining the capacity for binding to the AIF protein, in particular to the AIF protein of SEQ ID NO: 1.
  • the variants functional can be natural or synthetic variants such as fragments, mutants or deletants.
  • the functional variant of the CHCHD4 protein corresponds to a polypeptide having a sequence identity of at least 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or at least 95% with the CHCHD4 protein of sequence SEQ ID NO: 2.
  • the functional variant of the AIF protein is deleted or truncated relative to the AIF protein of SEQ ID NO: 1.
  • the functional variant of the AIF protein can correspond to a polypeptide of which the transmembrane part. of the AIF protein was deleted.
  • the functional variant of the AIF protein corresponds to a polypeptide of sequence SEQ ID NO: 3, or to a polypeptide having a sequence identity of at least 50%, 60%, 70%, 80% , 90%, or at least 95% with the polypeptide of sequence SEQ ID NO: 3.
  • the AIF and CHCHD4 proteins can be modified, as long as this does not prevent the interaction between the two proteins.
  • the AIF and / or CHCHD4 proteins can be fused to a fragment serving as a label (or "tag").
  • Any conventional label can be used, as long as it does not prevent the interaction between the two proteins.
  • any label suitable for a homogeneous amplified luminescence proximity assay (ALPHA) or a surface plasmon resonance (SPR) assay can be used.
  • the AIF and / or CHCHD4 proteins can be fused to a Histidine tag corresponding to a motif made up of several histidine residues, or to a GST tag corresponding to the glutathione-S-transferase protein.
  • the compounds capable of being identified by the process of the invention can be compounds of various nature, structure and origin.
  • Compounds likely to be identified can in particular be biological, chemical, synthetic compounds, etc. They can in particular be compounds of nucleic, peptide, lipid or carbohydrate nature. They may also be banks, in particular chemical libraries, banks of proteins, peptides, nucleic acids or natural substances, etc.
  • the compound to be tested can be brought into contact with the AIF protein and the CHCHD4 protein in any suitable support and in particular on a plate, in a tube or a flask, a membrane, etc.
  • the bringing into contact can be carried out in a multi-well plate which allows numerous and varied tests to be carried out in parallel.
  • typical supports are microtiter plates and more particularly 96 or 384 well (or more) plates, easy to handle.
  • the amount (or concentration) of test compound can be adjusted by the user depending on the type of compound, the length of the incubation period, etc.
  • the concentration of the compound to be tested can vary from 1nM to 1MM. It is of course possible to test other concentrations without deviating from the present invention.
  • Each compound can, moreover, be tested, in parallel, at different concentrations.
  • the amount (or concentration) of AIF and CHCHD4 proteins can vary and be adjusted by the user. In particular, the concentration of AIF and CHCHD4 proteins is adjusted to allow optimal interaction between the two proteins, in the absence of the compound to be tested.
  • the contact between the proteins and the compound to be tested can be maintained for example between a few minutes and several hours or days, particularly between 30 minutes and 72 hours, more particularly between 1 and 5 hours.
  • test compound can be pre-incubated with the AIF protein, for a certain period of time, before being brought into contact with the CHCHD4 protein.
  • test compound can be preincubated with the CHCHD4 protein, for a certain period of time, before being brought into contact with the AIF protein.
  • duration of the pre-incubation with either protein perhaps a few minutes, or several hours or days, more particularly between 5 and 60 minutes, more particularly between 5 and 30 minutes.
  • the interaction of the AIF and CHCHD4 proteins, in the presence or absence of the test compound, can be measured using any technique known to those skilled in the art making it possible to measure or quantify the interaction between two proteins.
  • interaction means the association or physicochemical bond between the two proteins.
  • the interaction between two proteins can result from covalent and / or non-covalent bonds.
  • Non-covalent bonds include in particular electrostatic, ionic, hydrogen, hydrophobic bonds, as well as Van der Waals forces.
  • the method according to the invention comprises measuring the interaction of the AIF and CHCHD4 proteins, on the one hand in the absence of the test compound, and on the other hand in the presence of the test compound.
  • the two measurements can be carried out consecutively or simultaneously.
  • the two interaction measures, in the presence or in the absence of the test compound are then compared.
  • the compound is identified as potentially useful for the treatment of cancer if it inhibits by at least 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or at least 90% the interaction between the AIF protein and the CHCHD4 protein.
  • the compound is identified as potentially useful for the treatment of cancer if it inhibits by at least 50%, 60%, 70%, 80%, or at least 90% the interaction between the protein AIF and the CHCHD4 protein.
  • the compound is identified as potentially useful for the treatment of cancer if it inhibits by at least 50% the interaction between the AIF protein and the CHCHD4 protein.
  • the measurement of the interaction of the AIF and CHCHD4 proteins in the presence or in the absence of the test compound can be carried out by means of any technique which makes it possible to measure or quantify the interaction between two proteins, for example by means of '' a homogeneous amplified luminescence proximity test (ALPHA), a surface plasmon resonance (SPR) test, a thermal shift assay (TSA) method, an immunoprecipitation method, a test isothermal calorimetric titration (ITC), a fluorescence resonance energy transfer test (FRET), a polarization test of fluorescence or an ELISA test.
  • ALPHA homogeneous amplified luminescence proximity test
  • SPR surface plasmon resonance
  • TSA thermal shift assay
  • ITC test isothermal calorimetric titration
  • FRET fluorescence resonance energy transfer test
  • polarization test of fluorescence or an ELISA test a polarization test of fluorescence or an ELISA test.
  • the technique for measuring the interaction of AIF and CHCHD4 proteins is applicable to high throughput screening.
  • the ALPHA technology also known under the trade names AlphaScreen® and AlphaLISA®, makes it possible to measure the interaction of two molecules bio-conjugated with donor beads and acceptor beads.
  • the donor beads contain a photosensitive molecule, such as phthalocyanine, which converts ambient oxygen to singlet oxygen after excitation at 680 nm. Singlet oxygen can diffuse up to about 200 nm in solution. If an acceptor bead is in this distance, energy is transferred from singlet oxygen to thioxene derivatives in the acceptor bead, resulting in light emission at 520-620nm (AlphaScreen®) or at 615nm (AlphaLISA®).
  • the singlet oxygen returns to ground state and no luminescent signal is produced.
  • one protein is conjugated to the donor beads, and the other protein is conjugated to the acceptor beads.
  • the donor bead is brought close to the acceptor bead, and the excitation of the donor bead leads to the emission of a quantifiable light signal from the acceptor bead.
  • the light signal is measured using a reader compatible with ALPHA technology such as the plate reader EnVision® or EnSpire®.
  • the interaction is measured by means of the AlphaScreen® test.
  • the test compound is identified as potentially useful for the treatment of cancer if the measurement of the light signal is lower in the presence of said compound than in the absence of said compound.
  • the compound is identified as potentially useful for the treatment of cancer if it inhibits by at least 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or at least 90% the light signal measured in the absence of the compound to be tested.
  • the compound is identified as potentially useful for the treatment of cancer if it inhibits by at least 50%, 60%, 70%, 80%, or at least 90% the light signal measured in l absence of the test compound.
  • the compound is identified as potentially useful for the treatment of cancer if it inhibits by at least 50% the light signal measured in the absence of the test compound.
  • the AIF protein can be conjugated to the donor bead and the CHCHD4 protein to the acceptor bead, and vice versa: the AIF protein can be conjugated to the acceptor bead and the CHCHD4 protein to the donor bead.
  • the donor beads and the acceptor beads are covered with molecules or functional groups allowing their conjugation with one or the other of the AIF or CHCHD4 proteins.
  • the proteins can be fused to tags allowing their conjugation on the donor or acceptor beads.
  • the AIF protein or the CHCHD4 protein can be fused to a histidine tag allowing its conjugation on a nickel coated bead, or to a GST tag allowing its conjugation on a glutathione coated bead.
  • the method comprises:
  • the measurement of the interaction of the AIF and CHCHD4 proteins in the presence or in the absence of the compound to be tested is measured by means of a surface plasmon resonance (SPR) test such as the Biacore® test.
  • SPR surface plasmon resonance
  • one of the two proteins is attached to a surface (sensor chip), while the other is delivered to the surface via a continuous flow of buffer using a microfluidic system.
  • the interaction of proteins is followed by surface plasmon resonance, which detects changes in mass at the surface.
  • steps of contacting (a), measuring the interaction (b) and comparing (c) of the method of the invention as described above can be repeated.
  • steps (a), (b), (c) can be repeated using, for each repetition, the same technique for measuring the interaction between the AIF and CHCHD4 proteins, or a different measurement technique.
  • Repeating steps (a), (b), (c) has the advantage of refining the screening process and confirming the ability of the compound to inhibit the interaction between the AIF and CHCHD4 proteins.
  • steps (a), (b), (c) can be carried out in duplicate, triplicate, quadruplicate or quintuplicate.
  • steps (a), (b), (c) of the method of the invention can be repeated using the same technique for measuring protein interaction, for example ALPHA technology, but varying, for each repetition, the concentration of the compound to be tested.
  • Varying the concentration of the compound to be tested has the advantage of specifying the inhibitory capacities of the compound identified, for example by determining the effect-dose relationship of the compound. Measuring the interaction of the AIF and CHCHD4 proteins, by varying the concentration of the compound to be tested makes it possible in particular to determine the median inhibitory concentration (050) of said compound. The 050 gives an indication of the concentration of the compound necessary to inhibit by 50% the interaction between the proteins AIF and CHCHD4 and thus makes it possible to evaluate the effectiveness of said compound in inhibiting the interaction.
  • the method comprises:
  • the method comprises in this order:
  • steps (a), (b), (c) as described above in which the interaction of the AIF and CHCHD4 proteins is measured by means of an ALPHA test by a screening experiment at high throughput using a library of compounds to be tested;
  • the method of the invention comprises carrying out steps (a), (b), (c) as described above, in which the compound is a compound capable of inhibiting l interaction between the AIF protein and the CHCHD4 protein.
  • the use of a compound to inhibit the interaction between the AIF protein and the CHCHD4 protein can thus serve as a positive control, allowing the experiment to be validated.
  • said compound capable of inhibiting the interaction between the AIF protein and the CHCHD4 protein consists of the sequence of SEQ ID NO: 4, or consists of the sequence of SEQ ID NO: 4 or any functional variant having at least 70%, 80%, 90%, or at least 99% identity with the sequence of SEQ ID NO: 4.
  • functional variant is here understood any variant of the sequence SEQ ID NO: 4 capable of inhibiting the interaction between the AIF protein and the CHCHD4 protein.
  • said compound capable of inhibiting the interaction between the AIF protein and the CHCHD4 protein is selected from the group consisting of: disulfiram, bromocriptine or one of its salts such as bromocriptine mesylate, thioridazine or one of its salts such as thioridazine hydrochloride, Chicago sky blue 6B, mitoxantrone or one of its salts such as mitoxantrone dihydrochloride, rifapentine, tetraethylenepentamine or one of its salts such as tetraethylenepentamine pentachlorhydrate, nisoldipine, merbromine, thiethylperazine or one of its salts such as thiethylperazine dimalate and benidipine or one of its salts such as benidipine hydrochloride.
  • the method of the invention comprises a step of comparison of the inhibition of the interaction of the AIF and CHCHD4 proteins obtained in the presence of the compound to be tested and of the inhibition of the interaction obtained in the presence of the compound capable of inhibiting the interaction between the AIF protein and the CHCHD4 protein.
  • the compound is identified as potentially useful in the treatment of cancer if the inhibition obtained with the compound corresponds to at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% or at least. less 90% of the inhibition obtained with the positive control, namely with the N27 peptide.
  • the compound is identified as potentially useful in the treatment of cancer if the inhibition obtained with the compound corresponds to at least 50% of the inhibition obtained with the positive control, namely with the N27 peptide.
  • the method of the invention further comprises a step of confirming, in a cell or non-human animal model of cancer, the anticancer properties of the compound identified as capable of inhibiting the interaction between the AIF proteins and CHCHD4.
  • the method of the invention comprises a step of administering the compound identified in an animal model of cancer, then a step of analyzing the anticancer properties of said compound.
  • Any animal model of cancer can be used, the animal preferably being a mammal.
  • the animal can be a mouse, a rat, a pig, a rabbit, a chicken, or a non-human primate.
  • the method of the invention comprises a step of bringing the compound identified into contact with a cell model of cancer, then a step of analyzing the cytotoxic properties of said compound.
  • a cell model of cancer can be a two-dimensional (2D) or three-dimensional (3D) cultured cell model.
  • Any cell model of cancer can be used, such as a cancer cell line.
  • the identified compound can be contacted with the cancer lines A549, MCF7, or HCT116.
  • kits for the identification of a compound potentially useful for the treatment of cancer characterized in that it comprises:
  • the AIF protein can be of any origin, preferably of animal origin, in particular a mammal, more preferably of human origin.
  • the AIF protein corresponds to the natural human AIF protein, the NCBI sequence reference of which is “NP 004199.1”, or any functional variant thereof.
  • the AIF protein according to the invention can correspond to the natural human polypeptide of sequence SEQ ID NO: 1, or any functional variant, such as AIF2 which is a specific isoform of the brain.
  • F “functional variant” which refers to the AIF protein denotes any polypeptide derived from the structure of the AIF protein and retaining the capacity for binding to the CHCHD4 protein, in particular to the CHCHD4 protein of SEQ ID NO: 2.
  • Fes functional variants can be natural or synthetic variants such as fragments, mutants, or deletants.
  • the functional variant of the AIF protein corresponds to a polypeptide having a sequence identity of at least 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or at least 95% with the AIF protein of sequence SEQ ID NO: 1.
  • the CHCHD4 protein can be of any origin, preferably of animal origin, in particular a mammal, more preferably of human origin.
  • the CHCHD4 protein corresponds to the natural human CHCHD4 protein, the NCBI sequence reference of which is “NR 001091972.1”.
  • the CHCHD4 protein according to the invention can correspond to the natural human polypeptide of sequence SEQ ID NO: 2 or any functional variant.
  • the expression “functional variant” which refers to the CHCHD4 protein denotes any polypeptide derived from the structure of the CHCHD4 protein and retaining the capacity for binding to the AIF protein, in particular to the AIF protein of SEQ ID NO: 1.
  • the variants functional can be natural or synthetic variants such as fragments, mutants or deletants.
  • the functional variant of the CHCHD4 protein corresponds to a polypeptide having a sequence identity of at least 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or at least 95% with the CHCHD4 protein of sequence SEQ ID NO: 2.
  • the functional variant of the AIF protein is deleted or truncated relative to the AIF protein of SEQ ID NO: 1.
  • the functional variant of the AIF protein can correspond to a polypeptide of which the transmembrane part. of the AIF protein was deleted.
  • the functional variant of the AIF protein corresponds to a polypeptide of sequence SEQ ID NO: 3.
  • the AIF and CHCHD4 proteins can be modified, as long as this does not prevent the interaction between the two proteins.
  • the AIF and / or CHCHD4 proteins can be fused to a fragment serving as a label (or "tag"). Any conventional label can be used, as long as it does not prevent the interaction between the two proteins.
  • the AIF and / or CHCHD4 proteins can be fused to a Histidine tag corresponding to a motif consisting of several histidine residues, or to a GST tag corresponding to the glutathione-S-transferase protein.
  • AIF protein and the CHCHD4 protein any means, for example any reagent, compound, material, support or composition, necessary for the implementation of the measurement technique. the interaction between said proteins.
  • the means suitable for measuring the interaction between the AIF protein and the CHCHD4 protein can be means suitable for any technique making it possible to measure or quantify the interaction between two proteins.
  • the kit can include means adapted to a homogeneous amplified luminescence proximity test (ALPHA), a surface plasmon resonance (SPR) test, a thermal shift assay (TSA) method, an immunoprecipitation method, an isothermal calorimetric titration test (ITC) , a fluorescence resonance energy transfer (FRET) test, a fluorescence polarization test and / or an ELISA test.
  • APHA homogeneous amplified luminescence proximity test
  • SPR surface plasmon resonance
  • TSA thermal shift assay
  • ITC isothermal calorimetric titration test
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the means suitable for measuring the interaction between the AIF protein and the CHCHD4 protein are applicable to high throughput screening.
  • the kit comprises means suitable for an ALPHA test and / or an SPR test.
  • the kit comprises means suitable for measuring the interaction of the AIF and CHCHD4 proteins by an ALPHA test.
  • the kit can include:
  • - donor beads capable of emitting reactive oxygen species, such as singlet oxygen, when excited at a given wavelength, preferably around 680 nm;
  • - acceptor beads capable of emitting a light signal, preferably between 520 nm and 620 nm, following the reaction with reactive oxygen species, such as singlet oxygen; the donor and acceptor beads further being able to conjugate with either AIF or CHCHD4 proteins.
  • the donor beads and the acceptor beads are covered with molecules or functional groups allowing their conjugation with one or the other of the AIF or CHCHD4 proteins.
  • the donor and acceptor beads can be covered with a layer of nickel, glutathione, streptavidin, protein A, G, L or antibodies.
  • the donor beads are coated with nickel and the acceptor beads are coated with glutathione.
  • the donor beads included in the kit are conjugated beforehand with one or the other of the AIF or CHCHD4 proteins.
  • the acceptor beads included in the kit previously conjugated to one or the other of the AIF or CHCHD4 proteins.
  • the donor and acceptor beads are beads obtained from the commercial Alphascreen® or Alphalisa® (Perkinelmer) test.
  • the kit as described above can comprise a buffer suitable for the experiment measuring the interaction between the AIF protein and the CHCHD4 protein.
  • buffer is meant any solution in which the AIF and CHCHD4 proteins are brought into contact, the test compound and optionally the means suitable for measuring the interaction of the proteins.
  • the buffer is chosen so as not to inhibit the interaction between the AIF and CHCHD4 proteins.
  • the buffer can also serve as a negative control when performing the method of the invention.
  • the kit comprises a buffer suitable for an ALPHA test.
  • the buffer comprises phosphate buffered saline (PB S) and bovine serum albumin (BSA).
  • PB S phosphate buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • the buffer comprises PBS and 0.1% BSA.
  • the kit as described above can comprise a compound capable of inhibiting the interaction between the AIF protein and the CHCHD4 protein.
  • the compound capable of inhibiting the interaction between the AIF protein and the CHCHD4 protein can thus serve as a positive control, making it possible to validate the experiment measuring the interaction between the AIF and CHCHD4 proteins, during the implementation of the method of the invention.
  • said compound capable of inhibiting the interaction between the AIF protein and the CHCHD4 protein consists of the sequence of SEQ ID NO: 4. or any functional variant having at least 70%, 80%, 90%, or at least 99% identity with the sequence of SEQ ID NO: 4.
  • functional variant is meant here any variant of the sequence SEQ ID NO: 4 capable of inhibiting the interaction between the AIF protein and the CHCHD4 protein.
  • said compound capable of inhibiting the interaction between the AIF protein and the CHCHD4 protein is selected from the group consisting of: disulfiram, bromocriptine or one of its salts such as bromocriptine mesylate, thioridazine or one of its salts such as thioridazine hydrochloride, Chicago sky blue 6B, mitoxantrone or one of its salts such as mitoxantrone dihydrochloride, rifapentine, tetraethylenepentamine or one of its salts such as tetraethylenepentamine pentachlorhydrate, nisoldipine, merbromine, thiethylperazine or one of its salts such as thiethylperazine dimalate and benidipine or one of its salts such as benidipine hydrochloride.
  • the kit as described above can further comprise any support suitable for the experiment of measuring the interaction between the AIF protein and the CHCHD4 protein.
  • the support can be chosen from a plate, a tube, a flange, a membrane, etc.
  • the support can be a multiwell plate, which makes it possible to carry out, in parallel, numerous and varied tests.
  • the typical supports are microtiter plates and more particularly 96 or 384 well (or more) plates, easy to handle.
  • An aspect of the invention further relates to the use of the kit as described above, in a method of identifying a compound potentially useful for the treatment of cancer.
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a compound identified by the method as described above, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • one aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a compound capable of inhibiting the interaction between the AIF and CHCHD4 proteins, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • pharmaceutically acceptable vehicle should be understood to mean any substance other than the active principle in a medicament. Its addition is intended to confer physicochemical and / or biochemical characteristics to promote oral, sublingual, respiratory, rectal, nasal, intestinal, parenteral administration, by intravenous injection, intraperitoneally, intramuscularly, subcutaneously, or other particular consistency or taste characteristics, to the final product, preferably avoiding covalent chemical interactions with the active principles.
  • compositions of the invention can be in the form of simple or sugar-coated tablets, sublingual tablets, gelatin capsules, glossettes, capsules, tablets, injectable preparations, aerosols, nasal drops, suppositories, creams. , ointments or dermal gels.
  • Another aspect of the invention relates to a compound identified by the method as described above, for its use as a medicament.
  • one aspect of the invention relates to a compound capable of inhibiting the interaction between the AIF and CHCHD4 proteins, for its use as a medicament.
  • one aspect of the invention relates to a compound identified by the method as described above, for its use in a method of treating cancer.
  • one aspect of the invention relates to a compound capable of inhibiting the interaction between the AIF and CHCHD4 proteins, for its use in a method of treating cancer.
  • the compound capable of inhibiting the interaction between the AIF and CHCHD4 proteins is selected from the group consisting of: Chicago sky blue 6b, rifapentine, nisoldipine, merbromine, thiethylperazine or one of its salts such as thiethylperazine dimalate, and benidipine or one of its salts such as benidipine hydrochloride.
  • the method of treatment may comprise the administration of the compound capable of inhibiting the interaction between the AIF and CHCHD4 proteins or of the pharmaceutical composition comprising said compound, alone or in combination with any anti-cancer treatment such as radiotherapy, chemotherapy. and immunotherapy.
  • the method of treatment may comprise the administration of said compound capable of inhibiting the interaction between the AIF and CHCHD4 proteins, in combination with the administration of a chemotherapeutic agent.
  • the administration of the compound capable of inhibiting the interaction between the AIF and CHCHD4 proteins can be carried out before, simultaneously, or after the administration of the chemotherapeutic agent.
  • chemotherapeutic agent is meant a chemical which can be used to destroy a cancer cell, or to slow, stop or reverse the growth of a cancer cell.
  • the term “subject” or “patient” denotes an animal, preferably a mammal, in particular a human being, regardless of his age or sex, suffering from cancer.
  • the term includes domestic animals as well as laboratory animals such as non-human primates, felines, canines, equines, pigs, cattle, goats, sheep, rabbits, rats and mice.
  • the patient to be treated is a human being.
  • the term "cancer” refers to any type of malignant tumor.
  • the malignant tumor may be a primary tumor or a secondary tumor (i.e. metastasis).
  • the tumor may correspond to a solid malignant tumor, which includes, for example, carcinomas, adenocarcinomas, sarcomas, melanomas, mesotheliomas, blastomas or cancer of blood cells such as leukemias, lymphomas and blood cells. myeloma. Cancer can for example correspond to cancer of the skin, lung, bladder, kidney, digestive cancer (colon, pancreas, liver), ovarian, brain, face and neck, etc.
  • treatment includes curative and / or preventive treatment.
  • Curative treatment refers to the reduction, amelioration, stabilization and / or elimination of a symptom of the disease, or the inhibition of the progression of a symptom of the disease.
  • Preventive treatment refers to any of the following effects: preventing or delaying the onset of a given disorder, reducing the development, risk of development, incidence or severity of a disorder, increasing the time it takes to develop onset of symptoms and / or patient survival.
  • Another aspect of the invention relates to the use in academic research of a compound identified by the method as described above, for its use as a compound for disrupting mitochondrial import and / or cell metabolism.
  • said compound capable of inhibiting the interaction between the AIF protein and the protein CHCHD4 is selected from the group consisting of: disulfiram, bromocriptine or one of its salts such as bromocriptine mesylate, thioridazine or one of its salts such as thioridazine hydrochloride, Chicago sky blue 6B, mitoxantrone or a of its salts such as mitoxantrone dihydrochloride, rifapentine, tetraethylenepentamine or one of its salts such as tetraethylenepentamine pentachlorhydrate, nisoldipine, merbromine, thiethylperazine or one of its salts such as thiethhylpidiperazine dimalate or benedip
  • the proteins AIF 103-613 fragment 103-613 of the protein AIF and CHCHD4 were produced in bacteria BL21 + DE3 (RIPL), via a 3 hour induction with 0.5 mM IPTG at 37 ° C. .
  • the bacteria were transformed according to the recommendations of the supplier (Agilent).
  • the proteins were then purified. Total protein concentration was determined by a Bradford assay kit. The purity of expression was also evaluated on polyacrylamide gel in the presence of SDS.
  • a method for identifying compounds capable of inhibiting the interaction between AIF and CHCHD4 proteins and suitable for high throughput screening includes the use of:
  • an AlphaScreen® kit comprising donor beads and acceptor beads capable of conjugating to the AIF and CHCHD4 proteins
  • N27 peptide corresponding to the 27 amino acids of the N-ter end of the CHCHD4 protein, as described in Hangen et al, 2015;
  • BSA bovine serum albumin
  • PBS phosphate buffered saline
  • the ALPHA assay was first performed at high throughput, using 384-well white microplates (Greiner, part number 781075), using 25 ⁇ L of total volume per well. Proteins, positive control and beads were diluted in 0.1% BSA / PBS solution. All distributions were performed with an electronic multipette, then the plates were centrifuged (200 g, 1 min). The plates were sealed and incubated in the dark in a room at 23 ° C.
  • a library of 1,280 small molecules supplied by Prestwick Chemicals was screened.
  • This bank includes compounds with various chemical and pharmacological properties, which are already approved by health agencies such as the FDA (Food and Drug Administration) or 1 ⁇ MEA (European Medicines Evaluation Agency).
  • Each compound in the library is diluted in a 0.1% DMSO solution and used at a concentration of 10 ⁇ M.
  • Second, 5 ⁇ L of AIF 103-613 proteins were incubated with the compounds for 20 min before adding 5 LIL of CHCHD4 for 2 h.
  • 16 wells correspond to the positive control and 16 wells correspond to the negative control.
  • the positive control corresponds to the measurement of the interaction of the proteins AIF 103-613 and CHCHD4 in the presence of peptide N27 (equivalent to the minimum signal).
  • the negative control corresponds to the measurement of the interaction of the proteins AIF 103-613 and CHCHD4 in the presence of the buffer (0.1% BSA / PBS) (equivalent to the maximum signal).
  • CV is defined as the ratio of the standard deviation (SD) divided by the mean of each control:
  • S / N is the ratio corresponding to the mean of the negative controls, divided by the mean of the positive controls:
  • the Z 'factor evaluates the signal amplitude of a test, by measuring the difference between positive and negative controls, and taking into account the standard deviations (SD): Each series of measurements is validated if CV ⁇ 15%, S / N> 10 and factor Z '> 0.5 [Goktug et al., Drug Discovery, 2013 doilO.5772 / 52508],
  • the compounds are selected if the signal obtained in the presence of the compound is below the following TH threshold:
  • the ALPHA test is repeated manually using another batch of compound powder.
  • Each compound is tested at 10 ⁇ M and 30 ⁇ M due to the Hook effect specific to ALPHAscreen technology and in order to select the compounds giving a signal located in the ascending part of the Hook bell and therefore active at low dose with a view to drug development.
  • the compound is selected if:
  • the effect-dose relationship of the compound is determined. This makes it possible to determine the median inhibitory concentration (050) of said compound.
  • Some of the compounds identified by means of the Alpha test as described above were tested by surface plasmon resonance (Biacore TM T 100, GE Healthcare Life Sciences).
  • the CHCHD4 protein was covalently immobilized on a dextran matrix comprising COOH functional carboxyl groups (S-series CM5® sensor chip, GE Healthcare Life Sciences, 29149603).
  • the compounds (at 10 ⁇ M) were pre-incubated for 20 min with the AIF protein, at room temperature in DPBS buffer at pH 7.4 (Sigma, D8577). Then, the mixture of compound and AIF protein was injected for 3 min at 30 ⁇ L per minute at 25 ° C.
  • a negative control was carried out by injecting the AIF protein alone at 1 ⁇ M (diluted in 0.1% DMSO / PBS).
  • a positive control was carried out by injecting a mixture of peptide at N27 (at 3 ⁇ M) and of AIF protein.
  • a compound is validated if it is capable of significantly reducing the interaction between AIF 103-613 and CHCHD4, i.e. if the inhibition obtained with the compound corresponds to at least 50% of the inhibition obtained with the positive control, namely with the peptide N27.
  • the sensorgrams were analyzed using the BIAevaluation software (version 2.0.4).
  • the effect of the compounds on the metabolism of a non-small cell lung cancer cell line (A549) was tested using Seahorse technology (XFe96, Agilent) and cell death was assessed by measurement of release of lactate dehydrogenase (LDH, Promega).
  • LDH lactate dehydrogenase
  • the cells seeded in 96-well microplates (20,000 cells / well) were treated with the compounds in dose response (0.03; 0.1; 0.3; 1; 3; 10 ⁇ M) for 3 h in DMEM medium without serum then mitochondrial respiration (OXPHOS) and glycolysis were measured in real time.
  • OXPHOS mitochondrial respiration
  • the culture supernatant was taken to analyze cell death and the number of cells was determined by counting after labeling the cells with DAPI using a fluorescence microscope (Zeiss). The number of cells per well at the end of the experiment was then used to normalize the results obtained by the Seahorse.
  • Prestwick library (1280 molecules) was screened using 4 384-well plates (Plate # 1 to # 4).
  • the Prestwick compound library comprising 1280 molecules, was screened using 4 384-well plates, as described above.
  • the compounds were selected on the basis of the signal obtained in Alphascreen® in the presence of the compound at a concentration of 10 ⁇ M. In particular, the compound is selected if the signal obtained at 1 O ⁇ M is less than a threshold value
  • TH mean (negative control signal) - 5 * SD (negative control signal)).
  • 148 were selected, ie 12% of the library of compounds (cf. FIG. 2). The 148 selected compounds were tested again using a manually performed ALPHA assay as described above. Of the 148 compounds tested, 11 compounds were finally selected. For the 11 selected compounds:
  • the signal obtained at 30 ⁇ M is lower than the signal obtained at 10 ⁇ M.
  • Table 2 below lists the 11 compounds selected by ALPHA screen. The CAS numbers and chemical structures of each compound are reported in Table 2 below. Table 2a
  • the inhibition of the interaction of the AIF and CHCHD4 proteins by thioridazine and mitoxantrone was analyzed by means of a surface plasmon resonance test (cf. FIG. 3).
  • a compound is considered to inhibit the interaction of the AIF and CHCHD4 proteins if the inhibition obtained with the compound corresponds to at least 50% of the inhibition obtained with the positive control, namely with the N27 peptide.
  • the surface plasmon resonance test confirmed that thioridazine and mitoxantrone are able to inhibit the interaction between AIF and CHCHD4 proteins. 3) Confirmation of the cytotoxic properties of the compounds
  • Table 4 below demonstrates the cytotoxic properties of certain compounds towards non-small cell lung cancer cells (human cell line A549).
  • the concentration of compound indicated in the “toxicity” column represents the lowest dose tested for which a toxicity greater than 20% was measured.
  • the table shows that a 3 hour treatment with the compounds induces cytotoxicity of A549 cells in the concentration range tested (see method described above).
  • experiments have shown that the compounds act on energy metabolism either by modulating glycolysis or modulating mitochondrial activity.

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Abstract

L'invention concerne une méthode d'identification de composés utiles pour le traitement d'un cancer, basée sur l'évaluation de la capacité du composé à moduler l'interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4.

Description

Méthode d’identification de composés utiles pour le traitement d'un cancer Domaine technique
L’invention concerne une méthode d’identification de composés utiles pour le traitement d’un cancer, basée sur l’évaluation de la capacité du composé à moduler l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4.
Arrière-plan technologique
Lors du processus de cancérogénèse, le métabolisme des cellules cancéreuses est reprogrammé de manière à favoriser la croissance des cellules tumorales, améliorer leurs capacités de réparation, d’invasion et leur résistance aux traitements anticancéreux. Les mitochondries sont des acteurs majeurs du métabolisme cellulaire via, entre autres, leur capacité à produire de l'ATR, produire différents métabolites et macromolécules, produire et détoxifïer les espèces réactives de l’oxygène et moduler la mort cellulaire. Pour cette raison, cibler l’activité mitochondriale afin d’affecter le métabolisme des cellules cancéreuses constitue une piste d’intérêt dans le traitement des cancers. Cependant, les mécanismes moléculaires mitochondriaux susceptibles de fournir un bénéfice thérapeutique restent encore à déterminer.
Pour fonctionner, la mitochondrie doit importer entre 1500 et 2000 protéines codées par le génome nucléaire grâce à des machineries protéiques particulières. Ainsi, AIF (Apoptosis Inducing Factor) et CHCHD4 (coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 4) sont deux protéines exprimées dans l’espace inter-membranaire qui une fois associées forment une machinerie d’import pour différentes protéines possédant des motifs à cystéine.
L’interaction AIF/CHCHD4 a été décrite dans l’article Hangen et al. 2015 in vitro et in cellulo. Cet article démontre notamment que la fonction de la protéine AIF dans la biogenèse des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale est médiée par son interaction physique et fonctionnelle avec CHCHD4.
Résumé de l’invention
Avec comme objectif d’identifier de nouveaux composés utiles pour le traitement d’un cancer, les inventeurs ont mis au point une méthode d’identification, basée sur l’évaluation de la capacité d’un composé à inhiber l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4. L’hypothèse des inventeurs serait qu’un composé inhibant la formation du complexe AIF/CHCHD4 serait capable d’affecter les cellules cancéreuses dont la survie et la prolifération dépendent de l’activité mitochondriale.
La méthode mise au point par les inventeurs s’est révélée particulièrement efficace puisqu’elle a permis d’identifier des composés possédant des propriétés anti-cancéreuses. De plus, la présente méthode présente l’avantage d’être applicable au criblage à haut débit, facilitant ainsi l’identification de composés potentiellement utiles pour le traitement du cancer.
Un aspect de l’invention concerne donc un procédé d’identification d’un composé potentiellement utile pour le traitement d’un cancer, caractérisé en ce qu’il comprend l’évaluation de la capacité dudit composé à inhiber l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4, ledit composé étant identifié comme potentiellement utile pour le traitement d’un cancer s’il inhibe ladite interaction.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé comprend :
(a) la mise en contact de la protéine AIF et de la protéine CHCHD4 en présence et en l’absence dudit composé ;
(b) la mesure de l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4, en présence et en l’absence dudit composé ; et
(c) la comparaison de la mesure de ladite interaction en présence et en l’absence dudit composé; ledit composé étant identifié comme potentiellement utile pour le traitement d’un cancer si la mesure de ladite interaction est moins élevée en présence dudit composé qu’en l’absence dudit composé.
Dans un mode de réalisation particulier, le composé est identifié comme potentiellement utile pour le traitement d’un cancer s’il inhibe d’au moins 50%, 60%, 70%, 80%, ou d’au moins 90% l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4.
La mesure de l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4 peut être effectuée au moyen d’un test homogène de proximité à luminescence amplifiée (ALPHA) ou d’un test de résonance plasmonique de surface (SPR). En outre, le procédé selon l’invention peut comprendre la confirmation, dans un modèle cellulaire ou animal non humain de cancer, des propriétés anticancéreuses du composé identifié. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé comprend :
(i) la détermination de la capacité dudit composé à inhiber l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4, au moyen d’un test homogène de proximité à luminescence amplifiée (ALPHA);
(ii) la détermination de la capacité dudit composé à inhiber l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4, au moyen d’un test de résonance plasmonique de surface (SPR) ; et
(iii) la confirmation, dans un modèle cellulaire ou animal non humain de cancer, des propriétés anticancéreuses du composé identifié.
Un autre aspect de l’invention concerne un kit pour l’identification d’un composé potentiellement utile pour le traitement d’un cancer, caractérisé en ce qu’il comprend :
- une protéine AIF ;
- une protéine CHCHD4 ;
- des moyens adaptés à la mesure de l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4;
- optionnellement un tampon adapté à l’expérience de mesure de ladite interaction ; et
- optionnellement un composé capable d’inhiber l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4.
Les moyens adaptés à la mesure de l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4 peuvent être des moyens adaptés à un test homogène de proximité à luminescence amplifiée (ALPHA). Dans un mode particulier de réalisation, le tampon adapté à l’expérience de mesure de l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4 comprend du tampon phosphate salin (PBS) et de l’albumine de sérum bovin (BSA). Dans un mode particulier de réalisation, ledit composé capable d’inhiber l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4 consiste en la séquence de SEQ ID NO :4 ou tout variant fonctionnel ayant au moins 70%, 80%, 90%, ou au moins 99% d’identité avec la séquence de SEQ ID NO :4.
Brève description des figures
Figure 1: titrage AIF103-613 et CHCHD4 par Alphascreen. Le titrage de la protéine CHCHD4 contre la protéine AIF 103 -613 par la technologie ALPHAscreen conduit à une réponse en forme de cloche appelée effet de Hook.
Figure 2: inhibition de l’interaction de AIF103-613/CHCHD4. La banque Prestwick constitué de 1280 composés a été criblée, au moyen d’un test Alphascreen à une concentration de 10μM. Les composés sélectionnés sont identifiés par des carrés blancs, les points noirs correspondent aux composés non sélectionnés. Le composé est sélectionné si le signal brut obtenu en présence du composé est inférieur à une valeur seuil TH (TH = moyenne (signal du contrôle négatif) - 5 * SD (signal du contrôle négatif). L’axe des Y correspond au signal normalisé, à savoir le signal calculé comme pourcentage de la moyenne.
Figure 3: analyse par SPR des composés identifiés par Alphascreen. (A) Validation par SPR de la thioridrazine et de la mitoxantrone au moyen du test Alphascreen comme inhibiteurs de Tinteraction AIF 103-613 / CHCHD4. Les composés à 10 μM ont été incubés pendant 20 min avec AIF dans du DPBS à pH 7,4 à température ambiante. Ensuite, le mélange a été injecté pendant 3 minutes à raison de 30 μL par minute sur la protéine CHCHD4. Le peptide N27 à 3 μM a servi de contrôle positif. (B) Sensorgrammes par résonance plasmonique de surface (SPR), permettant de suivre la liaison de AIF 103-613 à CHCHD4 en présence de chlorhydrate de thioridazine ou de dichlorhydrate de mitoxantrone. Le chlorhydrate de thioridazine et le dichlorhydrate de mitoxantrone ont été testés à des concentrations croissantes allant de 0,5 μM à 50 μM.
Description détaillée
1- Procédé d’identification
Un aspect de l’invention concerne un procédé d’identification d’un composé potentiellement utile pour le traitement d’un cancer, caractérisé en ce qu’il comprend l’évaluation de la capacité d’un composé à inhiber l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4, ledit composé étant identifié comme potentiellement utile pour le traitement d’un cancer s’il inhibe ladite interaction. Un aspect de l’invention concerne notamment un procédé de criblage d’une banque de composés pour identifier un composé potentiellement utile pour le traitement d’un cancer, caractérisé en ce qu’il comprend l’évaluation de la capacité des composés de ladite banque de composés à inhiber l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4, lesdits composés étant identifiés comme potentiellement utiles pour le traitement d’un cancer s’ils inhibent ladite interaction.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon l’invention comprend :
(a) la mise en contact de la protéine AIF et de la protéine CHCHD4 en présence et en l’absence dudit composé ; (b) la mesure de l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4, en présence et en l’absence dudit composé ; et
(c) la comparaison de la mesure de ladite interaction en présence et en l’absence dudit composé; ledit composé étant identifié comme potentiellement utile pour le traitement d’un cancer si la mesure de ladite interaction est moins élevée en présence dudit composé qu’en l’absence dudit composé.
Protéines AIF et CHCHD4
L’interaction physique et directe des protéines AIF et CHCHD4 a été démontrée dans l’article de Hangen et al., 2015.
La protéine AIF (pour «Apoptosis Inducing Factor») est une flavoprotéine présente dans les mitochondries et qui promeut l’apoptose lorsqu’elle est libérée de la mitochondrie. Dans le cadre de la présente invention, la protéine AIF peut être de n’importe quelle origine, de préférence d’origine animale en particulier un mammifère, plus préférentiellement d’origine humaine. Dans un mode de réalisation particulier, la protéine AIF correspond à la protéine AIF naturelle humaine dont la référence de séquence NCBI est « NP 004199.1 », ou tout variant fonctionnel de celle-ci tel que AIF2 qui est une isoforme cerveau spécifique. En particulier, la protéine AIF selon l’invention peut correspondre au polypeptide humain naturel de séquence SEQ ID NO :1, ou tout variant fonctionnel. L’expression « variant fonctionnel » qui fait référence à la protéine AIF désigne tout polypeptide dérivé de la structure de la protéine AIF et conservant la capacité de liaison à la protéine CHCHD4, notamment à la protéine CHCHD4 de SEQ ID NO :2. Les variants fonctionnels peuvent être des variants naturels ou synthétiques tels que des fragments, mutants ou délétants. De préférence, le variant fonctionnel de la protéine AIF correspond à un polypeptide ayant une identité de séquence d’au moins 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou au moins 95% avec la protéine AIF de séquence SEQ ID NO :1.
La protéine CHCHD4 (également dénommée « mitochondrial intermembrane space import and assembly protein 40» ou « MIA40 ») est une protéine qui participe à l’import protéique, dans l’espace intermembranaire des mitochondries. Dans le cadre de la présente invention, la protéine CHCHD4 peut être de n’importe quelle origine, de préférence d’origine animale en particulier un mammifère, plus préférentiellement d’origine humaine. Dans un mode de réalisation particulier, la protéine CHCHD4 correspond à la protéine CHCHD4 naturelle humaine dont la référence de séquence NCBI est « NR 001091972.1 ». En particulier, la protéine CHCHD4 selon l’invention peut correspondre au polypeptide humain naturel de séquence SEQ ID NO :2 ou tout variant fonctionnel. L’expression « variant fonctionnel » qui fait référence à la protéine CHCHD4 désigne tout polypeptide dérivé de la structure de la protéine CHCHD4 et conservant la capacité de liaison à la protéine AIF, notamment à la protéine AIF de SEQ ID NO : 1. Les variants fonctionnels peuvent être des variants naturels ou synthétiques tels que des fragments, mutants ou délétants. De préférence, le variant fonctionnel de la protéine CHCHD4 correspond à un polypeptide ayant une identité de séquence d’au moins 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou au moins 95% avec la protéine CHCHD4 de séquence SEQ ID NO :2.
Dans un mode de réalisation particulier, le variant fonctionnel de la protéine AIF est délété ou tronqué par rapport à la protéine AIF de SEQ ID NO : 1. En particulier, le variant fonctionnel de la protéine AIF peut correspondre à un polypeptide dont la partie transmembranaire de la protéine AIF a été délétée. Dans un mode de réalisation particulier, le variant fonctionnel de la protéine AIF correspond à un polypeptide de séquence SEQ ID NO :3, ou à un polypeptide ayant une identité de séquence d’au moins 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou au moins 95% avec le polypeptide de séquence SEQ ID NO:3.
Les protéines AIF et CHCHD4 peuvent être modifiées, à condition que cela n’empêche pas l’interaction entre les deux protéines. Par exemple, pour les besoins de l’expérience de mesure de leur interaction, les protéines AIF et/ou CHCHD4 peuvent être fusionnées à un fragment servant d’étiquette (ou « tag »). N’importe quelle étiquette conventionnelle peut être utilisée, à condition qu’elle n’empêche pas l’interaction entre les deux protéines. En particulier, toute étiquette adaptée à un test homogène de proximité à luminescence amplifiée (ALPHA) ou à un test de résonance plasmonique de surface (SPR) peut être utilisée. Plus particulièrement, les protéines AIF et/ou CHCHD4 peuvent être fusionnées à une étiquette Histidine correspondant à un motif constitué de plusieurs résidus histidine, ou à une étiquette GST correspondant à la protéine glutathion-S-transférase.
Composé à tester
Les composés susceptibles d’être identifiés par le procédé de l’invention peuvent être des composés de nature, structure et origine variées. Les composés susceptibles d’être identifiés peuvent notamment être des composés biologiques, chimiques, synthétiques, etc... Il peut notamment s’agir de composés de nature nucléique, peptidique, lipidique ou glucidique. Il peut s’agir également de banques, notamment de chimiothèques, de banques de protéines, de peptides, d’acides nucléiques ou de substances naturelles, etc...
Mise en contact du composé à tester avec les protéines AIF et CHCHD4
Le composé à tester peut être mis en contact avec la protéine AIF et la protéine CHCHD4 dans tout support approprié et notamment sur une plaque, dans un tube ou une flasque, une membrane, etc...En particulier, la mise en contact peut être réalisée dans une plaque multipuits ce qui permet de conduire, en parallèle, des essais nombreux et variés. Parmi les supports typiques on trouve des plaques de microtitration et plus particulièrement des plaques 96 ou 384 puits (ou plus), faciles à manipuler.
La quantité (ou la concentration) de composé à tester peut être ajustée par l’utilisateur selon le type de composé, la durée de la période d’incubation, etc. En particulier, la concentration du composé à tester peut varier de lnM à ImM. Il est bien sûr possible de tester d’autres concentrations sans dévier de la présente invention. Chaque composé peut, de plus, être testé, en parallèle, à différentes concentrations. De même, la quantité (ou concentration) en protéines AIF et CHCHD4 peut varier et être ajustée par l’utilisateur. En particulier, la concentration en protéines AIF et CHCHD4 est ajustée pour permettre une interaction optimale entre les deux protéines, en l’absence du composé à tester.
Le contact entre les protéines et le composé à tester peut être maintenu par exemple entre quelques minutes et plusieurs heures ou jours, particulièrement entre 30 minutes et 72 heures, plus particulièrement entre 1 et 5 heures.
L’ordre d’addition de la protéine AIF, de la protéine CHCHD4 et du composé à tester lors de leur mise en contact peut être adapté par l’homme du métier. En particulier, le composé à tester peut être pré -incubé avec la protéine AIF, pendant une certaine durée, avant d’être mis en contact avec la protéine CHCHD4. Alternativement, le composé à tester peut être pré-incubé avec la protéine CHCHD4, pendant une certaine durée, avant d’être mis en contact avec la protéine AIF. La durée de la pré-incubation avec l’une ou l’autre des protéines, peut-être de quelques minutes, ou de plusieurs heures ou jours, plus particulièrement entre 5 et 60 minutes, plus particulièrement entre 5 et 30 minutes.
Mesure de l’interaction des protéines AIF et CHCHD4
L’interaction des protéines AIF et CHCHD4, en présence ou en l’absence du composé à tester, peut être mesurée selon n’importe quelle technique connue de l’homme du métier permettant de mesurer ou quantifier l’interaction entre deux protéines.
Le terme « interaction » signifie l’association ou la liaison physico-chimique entre les deux protéines. L’interaction entre deux protéines peut résulter de liaisons covalentes et/ou non- covalentes. Les liaisons non-covalentes comprennent notamment les liaisons électrostatiques, ioniques, hydrogènes, hydrophobes, ainsi que les forces de Van der Waals.
Le procédé selon l’invention comprend la mesure de l’interaction des protéines AIF et CHCHD4, d’une part en l’absence du composé à tester, et d’autre part en présence du composé à tester. Les deux mesures peuvent être réalisées consécutivement ou simultanément. Les deux mesures d’interaction, en présence ou en l’absence du composé à tester sont par la suite comparées. Dans un mode de réalisation particulier, le composé est identifié comme potentiellement utile pour le traitement d’un cancer s’il inhibe d’au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou d’au moins 90%1’ interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4. De préférence, le composé est identifié comme potentiellement utile pour le traitement d’un cancer s’il inhibe d’au moins 50%, 60%, 70%, 80%, ou d’au moins 90% l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4. Dans un mode de réalisation particulier, le composé est identifié comme potentiellement utile pour le traitement d’un cancer s’il inhibe d’au moins 50% l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4.
La mesure de l’interaction des protéines AIF et CHCHD4 en présence ou en l’absence du composé à tester peut être effectuée au moyen de n’importe quelle technique permettant de mesurer ou quantifier l’interaction entre deux protéines, par exemple au moyen d’un test homogène de proximité à luminescence amplifiée (ALPHA), d’un test de résonance plasmonique de surface (SPR), d’une méthode de thermal shift assay (TSA), d’une méthode d’immunoprécipitation, d’un test de titration calorimétrique isotherme (ITC), d’un test de transfert d'énergie par résonance en fluorescence (FRET), d’un test de polarisation de fluorescence ou d’un test ELISA. Dans un mode de réalisation particulier, la mesure de l’interaction des protéines AIF et CHCHD4 est effectuée au moyen d’un test ALPHA ou SPR.
De préférence, la technique de mesure de l’interaction des protéines AIF et CHCHD4 est applicable au criblage à haut débit.
Dans un mode de réalisation particulier, la mesure de l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4 est effectuée au moyen d’un test homogène de proximité à luminescence amplifiée (ALPHA). La technologie ALPHA est une technique très sensible basée sur la détection de chimiluminescence qui permet de cribler une large gamme d’interactions et d’activités biologiques et qui convient également au criblage à haut débit (voir, par exemple, Eglen RM et al. The use of AlphaScreen technology in HTS: current status. Curr Chem Genomics. 2008;1:2-10 ; Ullman EF et al. Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994;91(12):5426-5430 ; Yasgar A et al. AlphaScreen-Based Assays: Ultra-High-Throughput Screening for Small-Molecule Inhibitors of Challenging Enzymes and Protein-Protein Interactions. Methods Mol Biol. 2016;1439:77-98 ; Seethala and Prabhavathi, "Homogeneous Assays: AlphaScreen, Handbook of Drug Screening," Marcel Dekkar Pub. 2001, pp. 106-110.).
La technologie ALPHA, également connue sous les noms commerciaux AlphaScreen® et AlphaLISA®, permet de mesurer l'interaction de deux molécules bio-conjuguées à des billes donneuses et des billes acceptrices. Les billes donneuses contiennent une molécule photosensible, telle que la phtalocyanine, qui convertit l'oxygène ambiant en oxygène singulet après excitation à 680 nm. L’oxygène singulet peut diffuser jusqu’à environ 200 nm en solution. Si une bille acceptrice est dans cette distance, l’énergie est transférée de l’oxygène singulet à des dérivés du thioxène dans la bille acceptrices, ce qui conduit à une émission de lumière à 520-620 nm (AlphaScreen®) ou à 615 nm (AlphaLISA®). Si la bille donneuse n’est pas à proximité d’une bille acceptrice, l’oxygène singulet retourne à l’état fondamental et aucun signal luminescent n'est produit. Dans un essai d'interaction protéine/protéine, une protéine est conjuguée aux billes donneuses, et l'autre protéine est conjuguée aux billes acceptrices. Ainsi, quand les deux protéines interagissent, la bille donneuse est amenée à proximité de la bille acceptrice, et l’excitation de la bille donneuse conduit à l’émission d’un signal lumineux quantifiable de la part de la bille acceptrice. La mesure du signal lumineux est effectuée au moyen d’un lecteur compatible avec la technologie ALPHA tel que le lecteur de plaque EnVision® ou EnSpire®. Dans un mode de réalisation particulier, la mesure de l’interaction est effectuée au moyen du test AlphaScreen®.
L’intensité du signal lumineux permet donc de quantifier l’interaction des protéines dans un échantillon. Ainsi, le composé à tester est identifié comme potentiellement utile pour le traitement d’un cancer si la mesure du signal lumineux est moins élevée en présence dudit composé qu’en l’absence dudit composé. Dans un mode de réalisation particulier, le composé est identifié comme potentiellement utile pour le traitement d’un cancer s’il inhibe d’au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou d’au moins 90% le signal lumineux mesuré en l’absence du composé à tester. De préférence, le composé est identifié comme potentiellement utile pour le traitement d’un cancer s’il inhibe d’au moins 50%, 60%, 70%, 80%, ou d’au moins 90% le signal lumineux mesuré en l’absence du composé à tester. Dans un mode de réalisation particulier, le composé est identifié comme potentiellement utile pour le traitement d’un cancer s’il inhibe d’au moins 50% le signal lumineux mesuré en l’absence du composé à tester.
Dans le cadre de la présente invention, la protéine AIF peut être conjuguée à la bille donneuse et la protéine CHCHD4 à la bille acceptrice, et inversement : la protéine AIF peut être conjuguée à la bille acceptrice et la protéine CHCHD4 à la bille donneuse. Dans un mode de réalisation particulier, les billes donneuses et les billes acceptrices sont recouvertes de molécules ou groupes fonctionnels permettant leur conjugaison avec l’une ou l’autre des protéines AIF ou CHCHD4.
Les protéines peuvent être fusionnées à des étiquettes permettant leur conjugaison sur les billes donneuses ou acceptrices. Par exemple, la protéine AIF ou la protéine CHCHD4 peut être fusionnée à une étiquette histidine permettant sa conjugaison sur une bille recouverte de Nickel, ou à une étiquete GST permettant sa conjugaison sur une bille recouverte de glutathion.
Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, le procédé comprend:
(a’) la mise en contact d’une protéine AIF, d’une protéine CHCHD4, d’une bille donneuse et d’une bille acceptrice, en présence ou en l’absence d’un composé candidat ;
(b’) l’excitation de la bille donneuse à une longueur d’onde donnée, de préférence à une longueur d’onde d’environ 680 nm ;
(c’) la mesure du signal lumineux émis par la bille acceptrice, le signal lumineux ayant de préférence une longueur d’onde entre 520 et 620 nm ; (d’) la comparaison de la mesure du signal lumineux en présence et en l’absence du composé ; dans lequel la bille donneuse est capable de se conjuguer à la protéine AIF et la bille acceptrice à la protéine CHCHD4, ou dans lequel la bille donneuse est capable de se conjuguer à la protéine CHCHD4 et la bille acceptrice à la protéine AIF ; ledit composé étant identifié comme potentiellement utile pour le traitement d’un cancer si la mesure du signal lumineux est moins élevée en présence dudit composé qu’en l’absence dudit composé.
Dans un autre mode réalisation, la mesure de l’interaction des protéines AIF et CHCHD4 en présence ou en l’absence du composé à tester est mesurée au moyen d’un test de résonance plasmonique de surface (SPR) tel que le test Biacore®. Au cours d’une expérience SPR une des deux protéines est fixée sur une surface (sensor chip), alors que l’autre est délivrée sur la surface via un flux continu de tampon au moyen d’un système de micro fluidique. L’interaction des protéines est suivie par résonance plasmonique de surface, qui détecte les changements de masse au niveau de la surface.
Dans un mode de réalisation particulier, les étapes de mise en contact (a), de mesure de l’interaction (b) et de comparaison (c) du procédé de l’invention telles que décrites ci-dessus peuvent être répétées. En particulier, les étapes (a), (b), (c) peuvent être répétées en utilisant, pour chaque répétition, la même technique de mesure de l’interaction entre les protéines AIF et CHCHD4, ou une technique de mesure différente. La répétition des étapes (a), (b), (c) a pour avantage d’affiner le procédé de criblage et confirmer la capacité du composé à inhiber l’interaction entre les protéines AIF et CHCHD4. Par exemple, pour chaque composé à tester, les étapes (a), (b), (c) peuvent être réalisées en duplicat, triplicat, quadruplicat ou en quintuplicat.
En outre, les étapes (a), (b), (c) du procédé de l’invention peuvent être répétées en utilisant la même technique de mesure de l’interaction protéique, par exemple la technologie ALPHA, mais en faisant varier, pour chaque répétition, la concentration du composé à tester. Faire varier la concentration du composé à tester a pour avantage de préciser les capacités d’inhibition du composé identifié, en déterminant par exemple la relation effet-dose du composé. Mesurer l’interaction des protéines AIF et CHCHD4, en faisant varier la concentration du composé à tester permet notamment de déterminer la concentration inhibitrice médiane (050) dudit composé. La 050 donne une indication de la concentration du composé nécessaire pour inhiber de 50% l’interaction entre les protéines AIF et CHCHD4 et permet ainsi d’évaluer l’efficacité dudit composé à inhiber l’interaction.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé comprend :
- la mise en œuvre des étapes (a), (b), (c) telles que décrites ci-dessus, dans lesquelles l’interaction des protéines AIF et CHCHD4 est mesurée au moyen d’un test ALPHA ; et
- la répétition des étapes (a), (b), (c) telles que décrites ci-dessus, dans lesquelles l’interaction des protéines AIF et CHCHD4 est mesurée au moyen d’un test SPR.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé comprend dans cet ordre :
- la mise en œuvre des étapes (a), (b), (c) telles que décrites ci-dessus, dans lesquelles l’interaction des protéines AIF et CHCHD4 est mesurée au moyen d’un test ALPHA par une expérience de criblage à haut débit utilisant une banque de composés à tester ;
- la sélection des composés capables d’inhiber d’au moins 50% l’interaction des protéines AIF et CHCHD4 ;
- la détermination de l’effet-dose pour chaque composé sélectionné comprenant la répétition des étapes (a), (b), (c) telles que décrites ci-dessus en faisant varier la concentration du composé sélectionné et en mesurant l’interaction des protéines AIF et CHCHD4 au moyen d’un test ALPHA ; et
- la répétition des étapes (a), (b), (c) telles que décrites ci-dessus avec les composés sélectionnés, dans lesquelles l’interaction des protéines AIF et CHCHD4 est mesurée au moyen d’un test SPR.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de l’invention comprend la mise en œuvre des étapes (a), (b), (c) telles que décrites ci-dessus, dans lequel le composé est un composé capable d’inhiber l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4. L’utilisation d’un composé d’inhiber l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4 peut ainsi servir de contrôle positif, permettant de valider l’expérience.
Dans un mode particulier de réalisation, ledit composé capable d’inhiber l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4 consiste en la séquence de SEQ ID NO :4 , ou consiste en la séquence de SEQ ID NO :4 ou tout variant fonctionnel ayant au moins 70%, 80%, 90%, ou au moins 99% d’identité avec la séquence de SEQ ID NO :4. Par « variant fonctionnel » est ici entendu tout variant de la séquence SEQ ID NO :4 capable d’inhiber l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4.
Dans un mode particulier de réalisation, ledit composé capable d’inhiber l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4 est sélectionné dans le groupe constitué par : le disulfïrame, la bromocriptine ou un de ses sels tel que le mésylate de bromocriptine, la thioridazine ou un de ses sels tel que le chlorhydrate de thioridazine, le Chicago sky blue 6B, la mitoxantrone ou un de ses sels tel que le dichlorhydrate de mitoxantrone, la rifapentine, la tétraéthylènepentamine ou un de ses sels tel que le pentachlorhydrate de tétraéthylènepentamine, la nisoldipine, la merbromine, la thiéthylpérazine ou un de ses sels tel que le dimalate de thiéthylpérazine et la bénidipine ou un de ses sels tel que le chlorhydrate de bénidipine.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de l’invention comprend une étape de comparaison de l’inhibition de l’interaction des protéines AIF et CHCHD4 obtenue en présence du composé à tester et de l’inhibition de l’interaction obtenue en présence du composé capable d’inhiber l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4. Dans un mode de réalisation particulier, le composé est identifié comme potentiellement utile dans le traitement du cancer si l’inhibition obtenue avec le composé correspond à au moins 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou au moins 90% de l’inhibition obtenue avec le contrôle positif, à savoir avec le peptide N27. En particulier, le composé est identifié comme potentiellement utile dans le traitement du cancer si l’inhibition obtenue avec le composé correspond à au moins 50% de l’inhibition obtenue avec le contrôle positif, à savoir avec le peptide N27.
Confirmation des propriétés anticancéreuses du composé
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de l’invention comprend en outre une étape de confirmation dans un modèle cellulaire ou animal non humain de cancer, des propriétés anticancéreuses du composé identifié comme capable d’inhiber l’interaction entre les protéines AIF et CHCHD4.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de l’invention comprend une étape d’administration du composé identifié dans un modèle animal de cancer, puis une étape d’analyse des propriétés anticancéreuses dudit composé. Tout modèle animal de cancer peut être utilisé, l' animal étant de préférence un mammifère. En particulier, l’animal peut être une souris, un rat, un cochon, un lapin, un poulet, ou un primate non humain.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de l’invention comprend une étape de mise en contact du composé identifié avec un modèle cellulaire de cancer, puis une étape d’analyse des propriétés cytotoxiques dudit composé. Il peut s’agir d’un modèle cellulaire cultivé en deux dimensions (2D) ou trois dimensions (3D). Tout modèle cellulaire de cancer peut être utilisé, telle qu’une lignée cellulaire cancéreuse. Par exemple, le composé identifié peut être mis en contact avec les lignées cancéreuses A549, MCF7, ou HCT116.
2- Kit
Un autre aspect de l’invention concerne un kit pour l’identification d’un composé potentiellement utile pour le traitement d’un cancer, caractérisé en ce qu’il comprend :
- une protéine AIF ;
- une protéine CHCHD4 ; et
- des moyens adaptés à la mesure de l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4.
Dans le cadre de la présente invention, la protéine AIF peut être de n’importe quelle origine, de préférence d’origine animale en particulier un mammifère, plus préférentiellement d’origine humaine. Dans un mode de réalisation particulier, la protéine AIF correspond à la protéine AIF naturelle humaine dont la référence de séquence NCBI est « NP 004199.1 », ou tout variant fonctionnel de celle-ci. En particulier, la protéine AIF selon l’invention peut correspondre au polypeptide humain naturel de séquence SEQ ID NO :1, ou tout variant fonctionnel, tel que AIF2 qui est une iso forme spécifique du cerveau. F’ expression « variant fonctionnel » qui fait référence à la protéine AIF désigne tout polypeptide dérivé de la structure de la protéine AIF et conservant la capacité de liaison à la protéine CHCHD4, notamment à la protéine CHCHD4 de SEQ ID NO :2. Fes variants fonctionnels peuvent être des variants naturels ou synthétiques tels que des fragments, mutants, ou délétants. De préférence, le variant fonctionnel de la protéine AIF correspond à un polypeptide ayant une identité de séquence d’au moins 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou au moins 95% avec la protéine AIF de séquence SEQ ID NO :1.
Dans le cadre de la présente invention, la protéine CHCHD4 peut être de n’importe quelle origine, de préférence d’origine animale en particulier un mammifère, plus préférentiellement d’origine humaine. Dans un mode de réalisation particulier, la protéine CHCHD4 correspond à la protéine CHCHD4 naturelle humaine dont la référence de séquence NCBI est « NR 001091972.1 ». En particulier, la protéine CHCHD4 selon l’invention peut correspondre au polypeptide humain naturel de séquence SEQ ID NO :2 ou tout variant fonctionnel. L’expression « variant fonctionnel » qui fait référence à la protéine CHCHD4 désigne tout polypeptide dérivé de la structure de la protéine CHCHD4 et conservant la capacité de liaison à la protéine AIF, notamment à la protéine AIF de SEQ ID NO : 1. Les variants fonctionnels peuvent être des variants naturels ou synthétiques tels que des fragments, mutants ou délétants. De préférence, le variant fonctionnel de la protéine CHCHD4 correspond à un polypeptide ayant une identité de séquence d’au moins 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou au moins 95% avec la protéine CHCHD4 de séquence SEQ ID NO :2.
Dans un mode de réalisation particulier, le variant fonctionnel de la protéine AIF est délété ou tronqué par rapport à la protéine AIF de SEQ ID NO : 1. En particulier, le variant fonctionnel de la protéine AIF peut correspondre à un polypeptide dont la partie transmembranaire de la protéine AIF a été délétée. Dans un mode de réalisation particulier, le variant fonctionnel de la protéine AIF correspond à un polypeptide de séquence SEQ ID NO :3.
Les protéines AIF et CHCHD4 peuvent être modifiées, à condition que cela n’empêche pas l’interaction entre les deux protéines. Par exemple, pour les besoins de l’expérience de mesure de leur interaction, les protéines AIF et/ou CHCHD4 peuvent être fusionnées à un fragment servant d’étiquette (ou « tag »). N’importe quelle étiquette conventionnelle peut être utilisée, à condition qu’elle n’empêche pas l’interaction entre les deux protéines. En particulier, les protéines AIF et/ou CHCHD4 peuvent être fusionnées à une étiquette Histidine correspondant à un motif constitué de plusieurs résidus histidine, ou à une étiquette GST correspondant à la protéine glutathion-S-transférase.
Par « moyens adaptés à la mesure de l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4 », on entend tout moyen par exemple tout réactif, composé, matériau, support ou composition, nécessaire à la mise en œuvre de la technique de mesure de l’interaction entre lesdites protéines.
Les moyens adaptés à la mesure de l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4, peuvent être des moyens adaptés à toute technique permettant de mesurer ou quantifier l’interaction entre deux protéines. Par exemple, le kit peut comprendre des moyens adaptés à un test homogène de proximité à luminescence amplifiée (ALPHA), un test de résonance plasmonique de surface (SPR), une méthode de thermal shift assay (TSA), une méthode d’immuno-précipitation, un test de titration calorimétrique isotherme (ITC), un test de transfert d'énergie par résonance en fluorescence (FRET), un test de polarisation de fluorescence et / ou un test ELISA.
De préférence, les moyens adaptés à la mesure de l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4 sont applicables au criblage à haut débit.
Dans un mode de réalisation particulier, le kit comprend des moyens adaptés à un test ALPHA et / ou à un test SPR.
Dans un mode de réalisation préféré, le kit comprend des moyens adaptés à la mesure de l’interaction des protéines AIF et CHCHD4 par un test ALPHA. En particulier, le kit peut comprendre :
- une protéine AIF ;
- une protéine CHCHD4 ;
- des billes donneuses capables d’émettre des espèces réactives de l'oxygène, telles que des oxygènes singulets, lorsqu’elles sont excitées à une longueur d’onde donnée, de préférence d’environ 680 nm ; et
- des billes acceptrices capables d’émettre un signal lumineux, de préférence entre 520 nm et 620 nm, suite à la réaction avec des espèces réactives de l’oxygène, telles que des oxygènes singulets ; les billes donneuses et acceptrices étant en outre capables de se conjuguer avec l’une ou l’autre des protéines AIF ou CHCHD4.
Dans un mode de réalisation particulier, les billes donneuses et les billes acceptrices sont recouvertes de molécules ou groupes fonctionnels permettant leur conjugaison avec l’une ou l’autre des protéines AIF ou CHCHD4. En particulier, les billes donneuses et acceptrices peuvent être recouvertes d’une couche de Nickel, de Glutathion, de streptavidine, de protéine A, G, L ou d’anticorps. Dans un mode de réalisation particulier, les billes donneuses sont recouvertes de Nickel et les billes acceptrices sont recouvertes de glutathion. Dans un mode de réalisation particulier, les billes donneuses comprises dans le kit sont préalablement conjuguées à l’une ou l’autre des protéines AIF ou CHCHD4. Dans un mode de réalisation particulier, les billes acceptrices comprises dans le kit préalablement conjuguées à l’une ou l’autre des protéines AIF ou CHCHD4.
Dans un mode de réalisation particulier, les billes donneuses et acceptrices sont des billes issues du test commercial Alphascreen ® ou Alphalisa® (Perkinelmer).
Optionnellement, le kit tel que décrit ci-dessus peut comprendre un tampon adapté à l’expérience de mesure de l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4. Par « tampon » on entend toute solution dans laquelle sont mis en contact les protéines AIF et CHCHD4, le composé à tester et éventuellement les moyens adaptés à la mesure de l’interaction des protéines. Le tampon est choisi de manière à ne pas inhiber l’interaction entre les protéines AIF et CHCHD4. Ainsi, le tampon peut également servir de contrôle négatif lors de la mise en œuvre du procédé de l’invention.
Dans un mode de réalisation particulier, le kit comprend un tampon adapté à un test ALPHA.
Dans un mode de réalisation particulier, le tampon comprend du tampon phosphate salin (PB S) et de l’albumine de sérum bovin (BSA). Dans un mode de réalisation particulier, le tampon comprend du PBS et 0,1% de BSA.
Optionnellement, le kit tel que décrit ci-dessus peut comprendre un composé capable d’inhiber l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4. Le composé capable d’inhiber l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4 peut ainsi servir de contrôle positif, permettant de valider l’expérience de mesure de l’interaction entre les protéines AIF et CHCHD4, lors de la mise en œuvre du procédé de l’invention.
Dans un mode particulier de réalisation, ledit composé capable d’inhiber l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4 consiste en la séquence de SEQ ID NO :4. ou tout variant fonctionnel ayant au moins 70%, 80%, 90%, ou au moins 99% d’identité avec la séquence de SEQ ID NO :4. Par « variant fonctionnel » est ici entendu tout variant de la séquence SEQ ID NO :4 capable d’inhiber l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4. Dans un mode particulier de réalisation, ledit composé capable d’inhiber l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4 est sélectionné dans le groupe constitué par : le disulfïrame, la bromocriptine ou un de ses sels tel que le mésylate de bromocriptine, la thioridazine ou un de ses sels tel que le chlorhydrate de thioridazine, le Chicago sky blue 6B, la mitoxantrone ou un de ses sels tel que le dichlorhydrate de mitoxantrone, la rifapentine, la tétraéthylènepentamine ou un de ses sels tel que le pentachlorhydrate de tétraéthylènepentamine, la nisoldipine, la merbromine, la thiéthylpérazine ou un de ses sels tel que le dimalate de thiéthylpérazine et la bénidipine ou un de ses sels tel que le chlorhydrate de bénidipine.
Le kit tel que décrit ci-dessus peut en outre comprendre tout support adapté à l’expérience de mesure de l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4. Par exemple, le support peut être choisi parmi une plaque, un tube, une flasque, une membrane, etc... En particulier, le support peut être une plaque multipuits ce qui permet de conduire, en parallèle, des essais nombreux et variés. Parmi les supports typiques on trouve des plaques de microtitration et plus particulièrement des plaques 96 ou 384 puits (ou plus), faciles à manipuler.
Un aspect de l’invention concerne en outre l’utilisation du kit tel que décrit ci-dessus, dans une méthode d’identification d’un composé potentiellement utile pour le traitement d’un cancer.
4- Composition
Un autre aspect de l’invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un composé identifié par le procédé tel que décrit ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Ainsi, un aspect de l’invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un composé capable d’inhiber l’interaction entre les protéines AIF et CHCHD4, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Par véhicule pharmaceutiquement acceptable, il faut comprendre toute substance autre que le principe actif dans un médicament. Son addition est destinée à conférer des caractéristiques physico-chimiques et/ou biochimiques pour favoriser l’administration par voie orale, sublinguale, respiratoire, rectale, nasale, intestinale, parentérale, par injection intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée, ou d’autres caractéristiques de consistance ou gustatives particulières, au produit final, en évitant de préférence les interactions, chimiques covalentes avec les principes actifs.
Les compositions pharmaceutiques de l’invention peuvent être sous forme de comprimés simples ou dragéifiés, de comprimés sublinguaux, de gélules, de glossettes, de capsules, de tablettes, de préparations injectables, d’aérosols, de gouttes nasales, de suppositoires, de crèmes, pommades ou gels dermiques.
5- Utilisations
Un autre aspect de l’invention concerne un composé identifié par le procédé tel que décrit ci- dessus, pour son utilisation en tant que médicament. Ainsi, un aspect de l’invention concerne un composé capable d’inhiber l’interaction entre les protéines AIF et CHCHD4, pour son utilisation en tant que médicament.
En particulier, un aspect de l’invention concerne un composé identifié par le procédé tel que décrit ci-dessus, pour son utilisation dans une méthode de traitement du cancer. Ainsi, un aspect de l’invention concerne un composé capable d’inhiber l’interaction entre les protéines AIF et CHCHD4, pour son utilisation dans une méthode de traitement du cancer.
Dans un mode de réalisation particulier, le composé capable d’inhiber l’interaction entre les protéines AIF et CHCHD4 est sélectionné dans le groupe constitué par : le Chicago sky blue 6b, la rifapentine, la nisoldipine, la merbromine, la thiéthylpérazine ou un de ses sels tel que le dimalate de thiéthylpérazine, et la bénidipine ou un de ses sels tel que le chlorhydrate de bénidipine.
Il est ainsi décrit une méthode de traitement d’un cancer chez un sujet, comprenant l’administration audit sujet d’un composé capable d’inhiber l’interaction entre les protéines AIF et CHCHD4 ou de la composition pharmaceutique comprenant ledit composé.
Fa méthode de traitement peut comprendre l’administration du composé capable d’inhiber l’interaction entre les protéines AIF et CHCHD4 ou de la composition pharmaceutique comprenant ledit composé, seule ou en combinaison avec tout traitement anti-cancéreux tels que la radiothérapie, la chimiothérapie et l’immunothérapie. En particulier, la méthode de traitement peut comprendre l’administration dudit composé capable d’inhiber l’interaction entre les protéines AIF et CHCHD4, en combinaison avec l’administration d’un agent chimio thérapeutique. L’administration du composé capable d’inhiber l’interaction entre les protéines AIF et CHCHD4 peut être effectuée préalablement, simultanément, ou postérieurement à l’administration de l’agent chimiothérapeutique. On entend par "agent chimiothérapeutique" un produit chimique qui peut être utilisé pour détruire une cellule cancéreuse, ou pour ralentir, arrêter ou inverser la croissance d’une cellule cancéreuse.
Dans le contexte de l'invention, le terme "sujet" ou "patient" désigne un animal, de préférence un mammifère, en particulier un être humain, quel que soit son âge ou son sexe, souffrant de cancer. Le terme inclut les animaux domestiques ainsi que les animaux de laboratoire tels que les primates non humains, les félins, les canidés, les équidés, les porcins, les bovins, les chèvres, les moutons, les lapins, les rats et les souris. De préférence, le patient à traiter est un être humain.
Tel qu’utilisé ici, le terme "cancer" désigne n’importe quel type de tumeur maligne. La tumeur maligne peut correspondre à une tumeur primitive ou à une tumeur secondaire (c'est-à-dire une métastase). En outre, la tumeur peut correspondre à une tumeur maligne solide, qui comprend par exemple des carcinomes, des adénocarcinomes, des sarcomes, des mélanomes, des mésothéliomes, des blastomes ou à un cancer des cellules sanguines tel que les leucémies, les lymphomes et les myélomes. Le cancer peut par exemple correspondre à un cancer de la peau, du poumon, de la vessie, du rein, à un cancer digestif (côlon, pancréas, foie), de l’ovaire, du cerveau, de la face et du cou, etc.
Le terme “traitement” comprend un traitement curatif et/ou préventif. Un traitement curatif fait référence à la réduction, amélioration, stabilisation et/ou élimination d’un symptôme de la maladie, ou encore à l’inhibition de la progression d’un symptôme de la maladie. Un traitement préventif fait référence à l’un quelconque des effets suivants : empêcher ou retarder l’apparition d’un trouble donné, réduire le développement, le risque de développement, l'incidence ou la gravité d’un trouble, augmenter le délai d'apparition des symptômes et/ou la survie du patient.
Un autre aspect de l’invention concerne l’utilisation en recherche académique d’un composé identifié par le procédé tel que décrit ci-dessus, pour son utilisation en tant que composé pour perturber l’import mitochondrial et/ou le métabolisme cellulaire. Dans un mode particulier de réalisation, ledit composé capable d’inhiber l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4 est sélectionné dans le groupe constitué par : le disulfïrame, la bromocriptine ou un de ses sels tel que le mésylate de bromocriptine, la thioridazine ou un de ses sels tel que le chlorhydrate de thioridazine, le Chicago sky blue 6B, la mitoxantrone ou un de ses sels tel que le dichlorhydrate de mitoxantrone, la rifapentine, la tétraéthylènepentamine ou un de ses sels tel que le pentachlorhydrate de tétraéthylènepentamine, la nisoldipine, la merbromine, la thiéthylpérazine ou un de ses sels tel que le dimalate de thiéthylpérazine et la bénidipine ou un de ses sels tel que le chlorhydrate de bénidipine.
Exemples
MATERIELS ET METHODES Abréviations anglais/français:
AIF apoptosis-inducing factor BSA bovine sérum albumin
CHCHD4 Coiled-Coil-Helix-Coiled-Coil-Helix (CHCH) Domain 4
050 concentration inhibitrice médiane
CV coefficient de variation
DMSO dimethyl sulfoxide
GST Glutathione S-transferase
HIS histidine
HTS High Throughput Screening
MEF Mouse embryonic fïbroblast
PB S phosphate buffer saline
RT room température
RU résonance unit
S/B signal over background ratio
SD standard deviation/déviation standard
SPR surface plasmon résonance
TH threshold/seuil
Expression protéique et purification
Les protéines AIF 103-613 (fragment 103-613 de la protéine AIF) et CHCHD4 ont été produites dans des bactéries BL21 + DE3 (RIPL), via une induction de 3 heures avec de l'IPTG 0,5 mM à 37°C. Les bactéries ont été transformées selon les recommandations du fournisseur (Agilent). Les protéines ont ensuite été purifiées. La concentration totale en protéines a été déterminée par un kit de dosage Bradford. La pureté de l’expression a également été évaluée sur gel de polyacrylamide en présence de SDS.
Test de l’interaction des protéines ATT et CHCHD4 et identification de composés modulant cette interaction au moyen d’un test Alpha
Une méthode permettant l’ identification de composés capables d’inhiber l’interaction entre les protéines AIF et CHCHD4 et adapté au criblage à haut débit a été mise au point. Cette méthode comprend l’utilisation :
- des protéines AIF 103-613 et CHCHD4 précédemment produites ;
- d’un kit AlphaScreen® (PerkinElmer) comprenant des billes donneuses et des billes acceptrices capables de se conjuguer aux protéines AIF et CHCHD4 ;
- d’un contrôle positif : le peptide N27 (correspondant aux 27 acides aminés de l’extrémité N- ter de la protéine CHCHD4, tel que décrit dans Hangen et al, 2015 ;
- d’un contrôle négatif : solution d’albumine de sérum bovin (BSA) à 0,1% dans du tampon phosphate salin (PBS)
- d’une banque de composés à tester : la banque de composés chimiques Prestwick (Prestwick Chemical Library®).
Le test ALPHA a d’abord été réalisé à haut débit, à l'aide de microplaques blanches à 384 puits (Greiner, référence 781075), en utilisant 25 μL de volume total par puits. Les protéines, le témoin positif et les billes ont été dilués dans une solution de 0,1% BSA/PBS. Toutes les distributions ont été effectuées avec une multipette électronique, puis les plaques ont été centrifugées (200 g, 1 min). Les plaques ont été fermées hermétiquement et incubées à l’obscurité dans une pièce à 23°C.
Une banque de 1,280 petites molécules fournie par Prestwick Chemicals (Prestwick Chemical Library®) a été criblée. Cette banque comprend des composés aux propriétés chimiques et pharmacologiques diverses, qui sont déjà approuvés par les agences de santé telle que la FDA (Food and Drug Administration) ou 1ΈMEA (Agence Européenne d'Evaluation du Médicament). Chaque composé de la banque est dilué dans une solution de DMSO à 0.1% et utilisé à une concentration de 10 μM. Tout d’abord, 5 μL de composé à 10 μM, de N27 à 3 μM (contrôle positif) ou de 0,1% BSA/PBS (contrôle négatif) ont été ajoutés dans les puits. Deuxièmement, 5 μL de protéines AIF 103-613 ont été incubés avec les composés pendant 20 min avant l'ajout de 5 LIL de CHCHD4 pendant 2 h. Troisièmement, 10 μL d'un mélange de billes donneuses et de billes acceptrices à 5 μg / mL ont été incubés pendant 3 h. L’analyse des résultats a été effectuée au moyen d’un lecteur de plaques multimodes EnSpire® (Perkin Elmer). L’interaction des protéines AIF et CHCHD4 est révélée par détection d’un signal lumineux par le lecteur de plaques.
Analyse des données du test ALPHA
Pour chaque expérience de mesure de l’interaction des protéines AIF et CHCHD4, 3 mesures validant la qualité de l’expérience ont été effectuées : le coefficient de variation des contrôles (CV), le rapport signal/bruit de fond (S/B) et le facteur Z’ tel que décrit ci-dessous.
Pour chaque plaque de 384 puits, 16 puits correspondent au contrôle positif et 16 puits correspondent au contrôle négatif. Le contrôle positif correspond à la mesure de l’interaction des protéines AIF 103-613 et CHCHD4 en présence du peptide N27 (équivaut au signal minimal). Le contrôle négatif correspond à la mesure de l’interaction des protéines AIF 103- 613 et CHCHD4 en présence du tampon (0.1 % BSA/PBS) (équivaut au signal maximal).
CV est défini comme le rapport de l’écart type (SD) divisé par la moyenne de chaque contrôle:
Figure imgf000024_0001
S/B est le ratio correspondant à la moyenne des contrôles négatifs, divisée par la moyenne des contrôles positifs :
Figure imgf000024_0002
Le facteur Z’ factor évalue l’amplitude du signal d’un essai, en mesurant la différence entre les contrôles positifs et négatifs, et en tenant en compte des écarts types (SD) :
Figure imgf000024_0003
Chaque série de mesure est validée si CV < 15%, S/B > 10 et le facteur Z’ > 0.5 [Goktug et al., Drug Discovery, 2013 doilO.5772/52508],
Suite au criblage à haut débit, les composés sont sélectionnés si le signal obtenu en présence du composé est inférieur au seuil TH suivant :
TH = moyenne (signal du contrôle négatif) - 5 * SD (signal du contrôle négatif)
Pour chaque composé précédemment sélectionné, le test ALPHA est répété manuellement en utilisant un autre lot de poudre des composés.
Chaque composé est testé à 10μM et 30μM en raison de l’effet de Hook particulier à la technologie ALPHAscreen et afin de sélectionner les composés donnant un signal situé dans la partie ascendante de la cloche de Hook et donc actifs à basse dose dans une perspective de développement de médicament.
Le composé est sélectionné si :
- le signal obtenu en présence du composé est inférieur au seuil TH tel que décrit ci-dessus ; et
- que le signal obtenu à 30μM est inférieur au signal obtenu à 10μM.
De plus, pour chaque composé ainsi sélectionné, la relation effet-dose du composé est déterminée. Ceci permet de déterminer la concentration inhibitrice médiane (050) dudit composé.
Validation des composés inhibant l’interaction des protéines ATF et CHCHD4 au moyen d’un test SPR
Certains des composés identifiés au moyen du test Alpha tel que décrit ci-dessus ont été testés par résonance plasmonique de surface (Biacore ™ T 100, GE Healthcare Life Sciences). La protéine CHCHD4 a été immobilisée de manière covalente sur une matrice de dextran comprenant des groupes carboxyle fonctionnels COOH (Sérié S CM5® sensor chip, GE Healthcare Life Sciences, 29149603). Pour réaliser le criblage, les composés (à 10 μM) ont été pré-incubés pendant 20 min avec la protéine AIF, à température ambiante dans un tampon DPBS à pH 7,4 (Sigma, D8577). Ensuite, le mélange du composé et de la protéine AIF a été injecté pendant 3 min à 30 μL par minute à 25°C. Un contrôle négatif a été réalisé en injectant la protéine AIF seule à 1 μM (diluée dans 0,1% DMSO/PBS). Un contrôle positif a été effectué en injectant un mélange de peptide à N27 (à 3 μM) et de protéine AIF. Un composé est validé s’il est capable de diminuer de manière significative l’interaction entre AIF 103-613 et CHCHD4, c’est-à-dire si l’inhibition obtenue avec le composé correspond à au moins 50% de l’inhibition obtenue avec le contrôle positif, à savoir avec le peptide N27. Les sensorgrammes ont été analysés à l'aide du logiciel BIAevaluation (version 2.0.4).
Effet des hits sur le métabolisme énergétique cellulaire et leur cytotoxicité
L’effet des composés sur le métabolisme d’une lignée cellulaire de cancer du poumon non à petite cellule (A549) a été testé à l’aide de la technologie Seahorse (XFe96, Agilent) et la mort cellulaire a été évaluée par mesure du relargage de la lactate déshydrogénase (LDH, Promega). Les cellules ensemencées en microplaques 96 puits (20.000 cellules/puit) ont été traitées par les composés en dose réponse (0,03 ; 0,1 ; 0,3 ; 1 ; 3 ; 10 μM) pendant 3h en milieu DMEM sans sérum puis la respiration mitochondriale (OXPHOS) et la glycolyse ont été mesurées en temps réel. En fin d’expérience, le surnageant de culture a été prélevé pour analyser la mort cellulaire et le nombre de cellules a été déterminé par comptage après marquage des cellules au DAPI à l’aide d’un microscope à fluorescence (Zeiss). Le nombre de cellules par puit en fin d’expérience a alors été utilisé pour normaliser les résultats obtenus par le Seahorse.
RESULTATS
Mise au point du protocole et optimisation pour le criblage haut débit.
Les concentrations en protéines AIF 103 -613 et CHCHD4 nécessaires pour obtenir un signal optimal en Alphascreen® ont été évaluées. La figure 1 montre que le signal optimal est obtenu avec AIF 103-613 et CHCHD4 est dépendant de la dose. Puis les lots de protéines, peptide et réactifs ont été vérifiés lors d’une expérience préliminaire et obtenir un Z’>0,5 (non présenté).
Résumé des statistiques obtenues par criblage à haut débit en plaques 384 puits
Puis la banque Prestwick (1280 molécules) a été criblée à l’aide de 4 plaques 384 puits (Plate #1 à #4).
Avant le criblage lui-même, tous les réactifs (protéines, billes tampons) et matériels (plaques, cônes, pipetteur) sont soumis à un contrôle qualité appelé « test de validation pré-criblage » et un certain nombre de critères sont analysés. Comme indiqué ci-dessus, chaque série de mesure est validée si CV < 15%, S/B > 10 et le facteur Z’ > 0.5. Les données statistiques obtenues par criblage à haut débit en plaques 384 puits sont détaillées dans le tableau 1 suivant : Tableau 1
Figure imgf000027_0001
Identification de composés inhibant l’interaction entre les protéines AIF et CHCHD4 1) Identification des composés au moyen d’un test ALPHA
La banque de composés Prestwick, comprenant 1280 molécules a été criblée à l’aide de 4 plaques 384 puits, comme décrit ci-dessus. Les composés ont été sélectionnés sur la base du signal obtenu en Alphascreen® en présence du composé à une concentration de IOμM. En particulier, le composé est sélectionné si le signal obtenu à 1 OμM est inférieur à une valeur seuil
TH (TH = moyenne (signal du contrôle négatif) - 5 * SD (signal du contrôle négatif)). Sur les 1280 composés analysés, 148 ont été sélectionnés, soit 12% de la banque de composés (cf. figure 2). Les 148 composés sélectionnés ont de nouveau été testés au moyen d’un test ALPHA réalisé manuellement, tel que décrit ci-dessus. Sur les 148 composés testés, 11 composés ont finalement été sélectionnés. Pour les 11 composés sélectionnés :
- le signal obtenu à 10μM est inférieur à la valeur seuil TH ; et
- le signal obtenu à 30μM est inférieur au signal obtenu à 10μM.
Le tableau 2 suivant liste les 11 composés sélectionnés par ALPHA screen. Les numéros CAS et les structures chimiques de chaque composé sont rapportés dans le tableau 2 suivant. Tableau 2a
Figure imgf000028_0001
Tableau 2b
Figure imgf000029_0001
Tableau 2c
Figure imgf000029_0002
Les propriétés anti-cancéreuses de certains de ces composés ont déjà été démontrées, validant ainsi le procédé de criblage de la présente invention. Par exemple, les propriétés anticancéreuses de la thioridazine sont décrites dans l’article de Shen et al., 2017. De plus, la mitoxantrone est commercialisée comme anti-cancéreux (sous le nom de Novantrone®), notamment dans le traitement du cancer du sein métastatique, du lymphome non-hodgkinien ou encore de la leucémie myéloïde aiguë (LM A).
Le tableau 3 suivant liste les 050 des 11 composés identifiés, obtenues manuellement à l’aide du test en Alphascreen :
Tableau 3
Figure imgf000030_0001
2) Confirmation de l’inhibition de l’interaction des protéines AIF et CHCHD4 au moyen d’un test SPR
L’inhibition de l’interaction des protéines AIF et CHCHD4 par la thioridazine et la mitoxantrone a été analysée au moyen d’un test par résonance plasmonique de surface (cf. figure 3). Un composé est considéré comme inhibant l’interaction des protéines AIF et CHCHD4 si l’inhibition obtenue avec le composé correspond à au moins 50% de l’inhibition obtenue avec le contrôle positif, à savoir avec le peptide N27. Le test par résonnance plasmonique de surface a confirmé que la thioridazine et la mitoxantrone sont capables d’inhiber l’interaction entre les protéines AIF et CHCHD4. 3) Confirmation des propriétés cytotoxiques des composés
Le tableau 4 ci-après démontre les propriétés cytotoxiques de certains composés envers des cellules de cancer du poumon non à petites cellules (lignée cellulaire humaine A549). La concentration de composé indiquée dans la colonne « toxicité » représente la plus faible dose testée pour laquelle une toxicité supérieure à 20% a été mesurée.
Tableau 4
Figure imgf000031_0001
Le tableau montre qu’un traitement de 3h par les composés induit une cytotoxicité des cellules A549 dans la gamme de concentration testée (cf. méthode décrite ci-dessus). De plus, les expériences ont démontré que les composés agissent sur le métabolisme énergétique que ce soit par modulation de la glycolyse ou par modulation de l’activité mitochondriale.
Ainsi, ces résultats confirment les propriétés anticancéreuses des composés identifiés par la méthode de criblage.
Références Hangen, E., et al., Interaction between AIF and CHCHD4 régulâtes respiratory chain biogenesis. Molecular cell, 2015. 58(6): p. 1001-1014.
Shen, J., et al., Thioridazine has potent antitumor effects on lung cancer stem-like cells. Oncology letters, 2017. 13(3): p. 1563-1568.

Claims

Revendications
1. Procédé d’identification d’un composé potentiellement utile pour le traitement d’un cancer, caractérisé en ce qu’il comprend l’évaluation de la capacité d’un composé à inhiber l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4, ledit composé étant identifié comme potentiellement utile pour le traitement d’un cancer s’il inhibe ladite interaction.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu’il comprend :
(a) la mise en contact de la protéine AIF et de la protéine CHCHD4 en présence et en l’absence dudit composé ;
(b) la mesure de l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4, en présence et en l’absence dudit composé ; et
(c) la comparaison de la mesure de ladite interaction en présence et en l’absence dudit composé; ledit composé étant identifié comme potentiellement utile pour le traitement d’un cancer si la mesure de ladite interaction est moins élevée en présence dudit composé qu’en l’absence dudit composé.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit composé est identifié comme potentiellement utile pour le traitement d’un cancer s’il inhibe d’au moins 50%, 60%, 70%, 80% ou d’au moins 90%, l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4.
4. Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que la mesure de l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4 est effectuée au moyen d’un test homogène de proximité à luminescence amplifiée (ALPHA), d’un test de résonance plasmonique de surface (SPR), d’une méthode de thermal shift assay (TSA), d’une méthode d’immuno-précipitation, d’un test de titration calorimétrique isotherme (ITC), d’un test de transfert d'énergie par résonance en fluorescence (FRET), d’un test de polarisation de fluorescence ou d’un test ELISA, de préférence au moyen d’un test homogène de proximité à luminescence amplifiée (ALPHA) ou d’un test de résonance plasmonique de surface (SPR).
5. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre la confirmation, dans un modèle cellulaire ou animal non humain de cancer, des propriétés anticancéreuses du composé identifié.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant :
(i) la détermination de la capacité dudit composé à inhiber l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4, au moyen d’un test homogène de proximité à luminescence amplifiée (ALPHA) ;
(ii) la détermination de la capacité dudit composé à inhiber l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4, au moyen d’un test de résonance plasmonique de surface (SPR) ; et
(iii) la confirmation, dans un modèle cellulaire ou animal non humain de cancer, des propriétés anticancéreuses du composé identifié.
7. Kit pour l’identification d’un composé potentiellement utile pour le traitement d’un cancer, caractérisé en ce qu’il comprend :
- une protéine AIF ;
- une protéine CHCHD4 ;
- des moyens adaptés à la mesure de l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4;
- optionnellement un tampon adapté à l’expérience de mesure de ladite interaction ; et
- optionnellement un composé capable d’inhiber l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4.
8. Kit selon la revendication 7, dans lequel les moyens adaptés à la mesure de l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4 sont des moyens adaptés à un test homogène de proximité a luminescence amplifiée (ALPHA).
9. Kit selon la revendication 7 ou 8, dans lequel ledit tampon comprend du tampon phosphate salin (PBS) et de l’albumine de sérum bovin (BSA).
10. Kit selon l’une quelconque des revendications 7 à 9, dans lequel ledit composé capable d’inhiber l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4 consiste en la séquence de SEQ ID NO :4 ou tout variant fonctionnel ayant au moins 70%, 80%, 90%, ou au moins 99% d’identité avec la séquence de SEQ ID NO :4.
11. Kit selon l’une quelconque des revendications 7 à 9 dans lequel ledit composé capable d’inhiber l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4 est sélectionné dans le groupe constitué par : disulfïrame, mésylate de bromocriptine, chlorhydrate de thioridazine, Chicago sky blue 6B, Dichlorhydrate de mitoxantrone, rifapentine, pentachlorhydrate de tétraéthylènepentamine, Nisoldipine, merbromine, dimalate de thiéthylpérazine et chlorhydrate de benidipine.
12. Composé capable d’inhiber l’interaction entre la protéine AIF et la protéine CHCHD4, pour son utilisation dans le traitement d’un cancer, dans lequel le composé est sélectionné dans le groupe constitué par : chicago sky blue 6B, rifapentine, nisoldipine, merbromine, thiéthylpérazine dimalate, et benidipine hydrochloride.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013067036A1 (fr) * 2011-10-31 2013-05-10 Rutgers, The State University Of New Jersey Inhibiteurs directs de l'interaction keap1-nrf2 en tant que modulateurs de l'inflammation par anti-oxydant
WO2014118296A1 (fr) * 2013-01-31 2014-08-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Procédés de traitement de troubles mitochondriaux et de troubles neurodégénératifs

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2030021B1 (fr) 2006-05-18 2012-11-21 Andreas Reichert Procédé pour diagnostiquer un dysfonctionnement mitochondrial
EP2170374A2 (fr) 2007-07-03 2010-04-07 Andreas Reichert Procédé de traitement de maladies liées à un dysfonctionnement mitochondrial

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013067036A1 (fr) * 2011-10-31 2013-05-10 Rutgers, The State University Of New Jersey Inhibiteurs directs de l'interaction keap1-nrf2 en tant que modulateurs de l'inflammation par anti-oxydant
WO2014118296A1 (fr) * 2013-01-31 2014-08-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Procédés de traitement de troubles mitochondriaux et de troubles neurodégénératifs

Non-Patent Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"NCBI", Database accession no. NP001091972.1
DANIELE BANO ET AL: "Apoptosis-Inducing Factor (AIF) in Physiology and Disease: The Tale of a Repented Natural Born Killer", EBIOMEDICINE, vol. 30, 1 April 2018 (2018-04-01), pages 29 - 37, XP055739029, ISSN: 2352-3964, DOI: 10.1016/j.ebiom.2018.03.016 *
EGLEN RICHARD M ET AL: "The use of AlphaScreen technology in HTS: current status", CURRENT CHEMICAL GENOMICS, BENTHAM OPEN, NL, vol. 1, 1 January 2008 (2008-01-01), pages 2 - 10, XP008176468, ISSN: 1875-3973, [retrieved on 20080225], DOI: 10.2174/1875397300801010002 *
EGLEN RM ET AL.: "The use of AlphaScreen technology in HTS: current status", CURR CHEM GENOMICS, vol. 1, 2008, pages 2 - 10, XP008176468, DOI: 10.2174/1875397300801010002
GOKTUG ET AL., DRUG DISCOVERY, 2013
HANGEN EMILIE ET AL: "Interaction between AIF and CHCHD4 Regulates Respiratory Chain Biogenesis", MOLECULAR CELL, vol. 58, no. 6, 18 June 2015 (2015-06-18), pages 1001 - 1014, XP029211946, ISSN: 1097-2765, DOI: 10.1016/J.MOLCEL.2015.04.020 *
HANGEN ET AL., IN VITRO ET IN CELLULO, 2015
HANGEN, E. ET AL.: "Interaction between AIF and CHCHD4 regulates respiratory chain biogenesis", MOLECULAR CELL, vol. 58, no. 6, 2015, pages 1001 - 1014, XP029211946, DOI: 10.1016/j.molcel.2015.04.020
L. P. SAUNDERS ET AL: "Identification of small-molecule inhibitors of autotaxin that inhibit melanoma cell migration and invasion", MOLECULAR CANCER THERAPEUTICS, vol. 7, no. 10, 1 October 2008 (2008-10-01), pages 3352 - 3362, XP055044409, ISSN: 1535-7163, DOI: 10.1158/1535-7163.MCT-08-0463 *
LUKE W THOMAS ET AL: "CHCHD4 regulates a proliferation-EMT switch in tumour cells, through respiratory complex I mediated metabolism.", BIORXIV, 7 January 2019 (2019-01-07), XP055739024, Retrieved from the Internet <URL:https://www.biorxiv.org/content/10.1101/513531v1.full.pdf> DOI: 10.1101/513531 *
NAZANINE MODJTAHEDI ET AL: "Metabolic epistasis among apoptosis-inducing factor and the mitochondrial import factor CHCHD4", CELL CYCLE, vol. 14, no. 17, 29 July 2015 (2015-07-29), US, pages 2743 - 2747, XP055739017, ISSN: 1538-4101, DOI: 10.1080/15384101.2015.1068477 *
RAO SHUAN ET AL: "AIF-regulated oxidative phosphorylation supports lung cancer development", CELL RESEARCH, NATURE PUBLISHING GROUP, GB, CN, vol. 29, no. 7, 27 May 2019 (2019-05-27), pages 579 - 591, XP036917540, ISSN: 1001-0602, [retrieved on 20190527], DOI: 10.1038/S41422-019-0181-4 *
REINHARDT CAMILLE ET AL: "AIF meets the CHCHD4/Mia40-dependent mitochondrial import pathway", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA. MOLECULAR BASIS OF DISEASE, AMSTERDAM, NL, vol. 1866, no. 6, 24 February 2020 (2020-02-24), XP086116877, ISSN: 0925-4439, [retrieved on 20200224], DOI: 10.1016/J.BBADIS.2020.165746 *
SEETHALAPRABHAVATHI: "Homogeneous Assays: AlphaScreen, Handbook of Drug Screening", 2001, MARCEL DEKKAR PUB, pages: 106 - 110
SHEN, J. ET AL.: "Thioridazine has potent antitumor effects on lung cancer stem-like cells", ONCOLOGY LETTERS, vol. 13, no. 3, 2017, pages 1563 - 1568
ULLMAN EF ET AL.: "Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence", PROC NATL ACAD SCI USA., vol. 91, no. 12, 1994, pages 5426 - 5430, XP000882828, DOI: 10.1073/pnas.91.12.5426
YASGAR A ET AL.: "AlphaScreen-Based Assays: Ultra-High-Throughput Screening for Small-Molecule Inhibitors of Challenging Enzymes and Protein-Protein Interactions", METHODS MOL BIOL., vol. 1439, 2016, pages 77 - 98

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