WO2021162126A1 - 腫瘍細胞におけるアスパラギン酸合成の阻害剤、腫瘍細胞のスフェロイド形成阻害剤、腫瘍細胞の転移抑制剤、解糖系阻害剤の作用増強剤、並びに腫瘍の転移の抑制および／または予防用医薬組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】従来公知の腫瘍細胞の転移抑制剤に代替でき、かつ安全性の高い腫瘍細胞の転移抑制剤を提供する。 【解決手段】明細書に記載の化学式１Ａまたは化学式１Ｂで表される化合物を、腫瘍細胞におけるアスパラギン酸合成阻害剤、腫瘍細胞のスフェロイド形成阻害剤、または、解糖系阻害剤の作用増強剤として用いる。これらの剤は、非常に強力な腫瘍細胞の転移抑制剤としての機能を有する。

Description

腫瘍細胞におけるアスパラギン酸合成の阻害剤、腫瘍細胞のスフェロイド形成阻害剤、腫瘍細胞の転移抑制剤、解糖系阻害剤の作用増強剤、並びに腫瘍の転移の抑制および／または予防用医薬組成物

　本発明は、腫瘍細胞におけるアスパラギン酸合成の阻害剤、腫瘍細胞のスフェロイド形成阻害剤、腫瘍細胞の転移抑制剤、解糖系阻害剤の作用増強剤、並びに腫瘍の転移の抑制および／または予防用医薬組成物に関する。

　現在、がんは死亡原因の上位であり、また、年々その患者数は増加傾向にある。その中で、腫瘍細胞に対する増殖抑制効果を有する天然物由来の抽出物が見出され、従来の抗がん剤と比べて安全性が高いことから、副作用の少ない細胞増殖抑制剤およびこれらの成分を含有する抗腫瘍剤（抗がん剤、制がん剤とも呼ばれる）、さらにはがんの予防用の健康食品を提供することが期待されている。

　また、イヌなどのペットにおいても、近年、家族の一員であるとみなす傾向にあり、２００１年の調査では、全体の６４％の人が「ペットも家族の一員である」と考え、ライフスタイルが人間に近いものとなっている。その一方で、ペットの平均寿命が延びたことに伴い、腫瘍性疾患が増加している。特にイヌやネコでは、高齢でのがんによる死亡率が高く、犬種・猫種によってはがんの発症率がヒトよりも高い場合もある。がんの治療法は、人間と同様、外科手術、化学療法、薬物療法、放射線療法、免疫療法などがある。しかしながら、ペットは、人間と同様、がんに罹患していても初期段階では症状が現れることが少なく、かなり進行してようやく食欲不振やリンパ腫の腫れなどの症状が現れることが多い。また、たとえがんを外科手術などにより除去したとしても、がん転移の可能性は否定できないため、抗がん剤の投与や定期検査を行う必要がある。しかしながら、ペットは人間のようにその重要性を認識できないため、抗がん剤の投与や定期検査自体がペットにとってはかなりの負担となり、飼い主にとってもストレスになる。

　このため、がん治療後における腫瘍細胞の転移を抑制できる薬剤が求められている。例えば、特許文献１によれば、ＭＡＳＴ２０５（セリンスレオニンキナーゼ）に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを有効成分として含む腫瘍細胞の転移抑制剤が提案されている。

　ところで、従来、脂環式化合物であるペタシンおよびＳ－ペタシンが悪性黒色腫に対する抗がん作用を有することが知られている（特許文献２）。特許文献２によれば、これらの化合物はメラニン色素生成に必要な酵素・タンパク質のマスター転写因子であるＭＩＴＦを抑制してメラニン産生を抑制することにより、上記抗がん作用を発現しているものと推測されている。

　また、従来、同様に脂環式化合物であるペタシン、Ｓ－ペタシン、ネオペタシンおよびネオ－Ｓ－ペタシンが、胃がん、大腸がんおよび白血病の増殖抑制作用を有することも知られている（特許文献３）。特許文献３によれば、これらの化合物は上記の各種腫瘍細胞におけるアポトーシスを誘導することにより、上記増殖抑制作用を発現しているものと推測されている。

　さらに、非特許文献１には、フキノトウ抽出物が様々な癌細胞株（Ｋ５６２，Ｔ２４，Ａ２０５８，ＤＬＤ－１）において２３－４７％まで生存細胞を減少させたこと、活性成分としてペタシン、ネオペタシン、ネオ－Ｓ－ペタシンおよびＳ－ペタシンを同定し、これら成分が同様の細胞増殖抑制能を有していたこと、イヌメラノーマの３症例にフキノトウ抽出物を経口投与し、１症例は転移性肺病変の退縮を示したことが記載されている。ただし、非特許文献１における上記開示は、フキノトウ抽出物が「メラノーマの肺転移を抑制するための転移抑制剤」として機能したことを意味しない。言い換えれば、非特許文献１の上記開示は、あくまでもフキノトウ抽出物が「（原発巣であるメラノーマ病巣からの転移によって生じた）肺の癌病巣における癌細胞の増殖を抑制した」ことを示しているに過ぎない。よって、非特許文献１の上記開示からは「フキノトウ抽出物が「原発巣であるメラノーマ病巣からの肺への転移を抑制しているか否か」を判断することはできない。

　また、非特許文献２には、ペタシンが結腸癌細胞株の増殖を阻害したこと、および、その遊走や浸潤を抑制したことが開示されている。

特開２００８－３０８４０７号公報 特開２０１４－１９８６８３号公報 特開２０１８－１６８１１９号公報

平島一輝ほか，フキノトウ抽出物の抗がん活性 Anti-neoplastic activity of Petasites japonicus extract，第77回日本癌学会学術総会抄録集，2018年，Vol.77，p.692[P-1125] LYU, X. et al.，Inhibitory effects of petasin on human colon carcinoma cells mediated by inactivation of Akt/mTOR pathway，Chinese medical journal，２０１９年，Vol.132, No.9，pp.1071-1078

　特許文献１に記載の腫瘍細胞の転移抑制剤は核酸分子である。しかしながら、核酸分子は、近年、その安全性への不安から、一般的に使用されるまでに至っておらず、むしろ食品に「組換体不使用」などの表示がなされ、その使用が控えられる傾向にある。

　本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、従来公知の腫瘍細胞の転移抑制剤に代替でき、かつ安全性の高い腫瘍細胞の転移抑制剤を提供することを目的とする。

　本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意研究を行った。その過程において、種々の化合物について腫瘍細胞に対する転移抑制効果を探索したところ、驚くべきことに、特許文献３に開示されている化合物であるネオペタシンが、非常に強力な腫瘍細胞の転移抑制作用を示すことを見出した。また、ネオペタシンがこのように強力な転移抑制作用を示すメカニズムについても検討を進めたところ、腫瘍細胞におけるアスパラギン酸合成や腫瘍細胞によるスフェロイドの形成を強力に阻害することによって上述したような転移抑制作用を示していることが判明した。そしてこれらの知見に基づき、本発明者らは本発明を完成させるに至った。

　すなわち、本発明の一形態によれば、下記化学式１Ａまたは下記化学式１Ｂで表される化合物（好ましくは、ペタシンまたはネオペタシン）を有効成分として含有する、腫瘍細胞におけるアスパラギン酸合成阻害剤が提供される（第１の形態）：

式中、Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基または置換されていてもよい炭化水素基である。また、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方は単結合であり、他方は二重結合である。

　本発明の他の形態によれば、上述した化合物（好ましくは、ペタシンまたはネオペタシン）を有効成分として含有する、腫瘍細胞のスフェロイド形成阻害剤が提供される（第２の形態）。

　本発明のさらに他の形態によれば、上述した各剤の少なくとも１つを含む、腫瘍細胞（例えば、悪性黒色腫の細胞）の、（例えば、肺への）転移抑制剤が提供される。

　本発明のさらに他の形態によれば、上述した化合物（好ましくは、ペタシンまたはネオペタシン）を有効成分として含有する、解糖系阻害剤の作用増強剤が提供される。

　本発明のさらに他の形態によれば、上述したいずれかの形態に係る剤を含む、腫瘍の転移の抑制および／または予防用医薬組成物が提供される。

　本発明のさらに他の形態によれば、上述した化合物（好ましくは、ペタシンまたはネオペタシン）を有効成分として含有する、腫瘍細胞転移抑制用飲食品組成物が提供される。

　本発明によれば、従来公知の腫瘍細胞の転移抑制剤に代替でき、かつ安全性の高い腫瘍細胞の転移抑制剤が提供される。

後述する実施例の試験例１において、ペタシン、Ｓ－ペタシン、ネオペタシンおよびネオ－Ｓ－ペタシンの、マウスまたはイヌ由来の悪性黒色腫細胞に対する増殖抑制作用を評価した結果を示すグラフである。 後述する実施例の試験例１において、ネオペタシンの、マウス悪性黒色腫細胞に対する増殖抑制作用を評価した結果を示すグラフである。 後述する実施例の試験例１において、正常ヒト皮膚由来線維芽細胞に対するネオペタシンの作用を、腫瘍細胞に対する作用と比較した結果を示すグラフである。 後述する実施例の試験例２において、ネオペタシンの転移抑制効果をマウス悪性黒色腫肺転移モデルを用いて調べた結果を示すグラフおよび摘出された肺の写真である。 後述する実施例の試験例２において、ネオペタシンまたはコーン油を投与したモデルマウスを解剖した際に、各臓器（心臓、肺の正常部位、大脳、腎臓、肝臓、脾臓）の組織から切片を作製して観察した結果を示す顕微鏡写真である。 後述する実施例の試験例３において、２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ＤＧ）の腫瘍細胞に対する制がん作用に対してネオペタシンが及ぼす影響を調べた結果を示すグラフである。 後述する実施例の試験例４において、ネオペタシンがＢ１６Ｆ１０細胞のスフェロイド形成能に及ぼす影響を、スフェロイド形成アッセイにより調べた結果を示す顕微鏡写真である。 後述する実施例の試験例５において、ネオペタシンが腫瘍細胞の遊走作用に及ぼす影響を、スクラッチ創傷治癒アッセイにより調べた結果を示す顕微鏡写真である。 後述する実施例の試験例６において、ネオペタシン処置により影響を受けるシグナル伝達経路を、マイクロアレイを用いたＫＥＧＧ　Ｐａｔｈｗａｙ解析により調べた結果を示すグラフである。 図６に示されている変動ｐａｔｈｗａｙのうち、特に変動が大きかった遺伝子を示すヒートマップである。 後述する実施例の試験例７において、ネオペタシンで処置したＢ１６Ｆ１０細胞のメタボローム解析（アミノ酸）を行った結果を示すヒートマップである。 後述する実施例の試験例８において、ネオペタシンがＢ１６Ｆ１０細胞のミトコンドリアに与える影響を評価した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 後述する実施例の試験例８において、ネオペタシンがＢ１６Ｆ１０細胞のミトコンドリアに与える影響をイメージサイトメーターを用いて評価した結果を示すグラフである。 後述する実施例の試験例８において、ネオペタシン（３μＭ）およびメトホルミン（５０００μＭ）のそれぞれによって処置した細胞を、電子顕微鏡を用いて観察した結果を示す写真である。 後述する実施例の試験例９において、ネオペタシン処置によってミトコンドリアの呼吸鎖を構成する複合体Ｉ、複合体ＩＩ、複合体ＩＩ／ＩＩＩ、複合体ＩＶおよび複合体Ｖのそれぞれの相対活性がどの程度低下するかを調べた結果を示すグラフである。 後述する実施例の試験例１０において、ネオペタシン処置細胞における様々ながん関連タンパク質の発現の変化をウエスタンブロット法により調べた結果を示す電気泳動写真である。 後述する実施例の試験例１１において、ネオペタシンまたはメトホルミンで処置したＢ１６Ｆ１０細胞における様々ながん代謝・増殖・転移関連タンパク質（ＡＭＰＫ、ＦＡＫ、Ａｋｔ、ＥＲＫ１／２）の発現の経時的な変化をウエスタンブロット法により調べた結果を示す電気泳動写真である。 後述する実施例の試験例１２において、原発腫瘍からの肺転移のすべてのプロセスを生じるマウス自然転移モデルを作製した際の処置の手順を示す図である。 後述する実施例の試験例１２において、ネオペタシンの転移抑制効果をマウス自然転移モデルを用いて調べた結果を示す、摘出された肺の肉眼写真である。 後述する実施例の試験例１２において、ネオペタシンの転移抑制効果をマウス自然転移モデルを用いて調べた結果（肺転移巣の計数結果）を示すグラフである。 後述する実施例の試験例１２において、ネオペタシンの転移抑制効果をマウス自然転移モデルを用いて調べた結果を示す、摘出された腋窩リンパ節の写真である。 後述する実施例の試験例１２において、ネオペタシンの転移抑制効果をマウス自然転移モデルを用いて調べた結果（腋窩リンパ節の重量の測定結果）を示すグラフである。 後述する実施例の試験例１２において、ネオペタシンをマウス自然転移モデルに投与した際のマウスの体重に及ぼす影響を調べた結果を示すグラフである。 後述する実施例の試験例１３において、ｉｎ ｖｉｔｒｏでマウスメラノーマ由来のＢ１６Ｆ１０細胞に対し、ネオペタシン（ＮＰ）を３μＭの濃度であらかじめ作用させた後、生細胞数を一律にそろえてマウスに尾静脈注射し、その後は一切治療を行わず、２週間の無治療期間の後に肺に形成された転移巣の数を計数した際のプロトコールである。 後述する実施例の試験例１３の結果を示すグラフおよび摘出肺の観察写真である。 後述する実施例の試験例１４において、フキノトウ抽出物（Whole Extract）に加えて、ペタシン、ネオペタシン、Ｓ－ペタシンおよびＳ－ネオペタシンについての細胞増殖抑制アッセイにおけるＩＣ_５０値を測定した結果を示すグラフである。

　以下、本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。本明細書において、範囲を示す「Ｘ～Ｙ」は、ＸおよびＹを含み、「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０～２５℃）／相対湿度４０～５０％ＲＨの条件で行う。

　本発明の第１の形態は、上述した化学式１Ａまたは化学式１Ｂで表される化合物を有効成分として含有する、腫瘍細胞におけるアスパラギン酸合成阻害剤である。また、本発明の第２の形態は、上述した化学式１Ａまたは化学式１Ｂで表される化合物を有効成分として含有する、腫瘍細胞のスフェロイド形成阻害剤である。

　［有効成分として用いられる化合物］
　ここではまず、有効成分として用いられる下記化学式１Ａまたは化学式１Ｂで表される化合物（以下、「本発明の化合物」とも称する）について説明する。なお、本発明において「化学式１Ａまたは化学式１Ｂで表される化合物を含有する」とは、化学式１Ａで表される化合物を含有する形態、化学式１Ｂで表される化合物を含有する形態、さらには、化学式１Ａで表される化合物と化学式１Ｂで表される化合物とをともに含有する形態のいずれをも含む概念である。また、「置換基を有していてもよい炭化水素基」とは、炭化水素が、ヘテロ原子（酸素原子や窒素原子、硫黄原子等）を介してシクロヘキシル骨格に結合している形態を含む概念である。

　化学式１Ａおよび化学式１Ｂにおいて、Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基または置換されていてもよい炭化水素基である。また、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方は単結合であり、他方は二重結合である。

　本明細書において、化学式１Ａまたは化学式１Ｂで表される化合物は、下記化学式２Ａまたは化学式２Ｂで表される化合物であることが好ましい。

　化学式２Ａおよび化学式２Ｂにおいて、Ｒ_３は、水素原子または置換されていてもよい炭化水素基である。また、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方は単結合であり、他方は二重結合である。

　また、本明細書において、化学式１Ａまたは化学式１Ｂで表される化合物は、下記化学式３Ａで表される化合物であることが好ましい。

　化学式３Ａにおいて、Ｒ_４は、水素または置換基を有していてもよい炭化水素基である。また、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方は単結合であり、他方は二重結合である。

　さらに、本明細書においては、各種の活性の強さの観点から、化学式１Ａまたは化学式１Ｂで表される化合物は、下記化学式４Ａ～化学式６Ａのいずれかで表される化合物であることが好ましく、化学式４Ａで表される化合物（ペタシン）または化学式５Ａで表される化合物（ネオペタシン）がより好ましい。さらには、活性が非常に強いという観点からは、化学式５Ａで表される化合物（ネオペタシン）が最も好ましい。

　なお、上述した本発明に係る化合物は、本願出願時の技術常識を参酌することにより、常法に従って合成してもよいし、天然物からの抽出が可能であればそのような抽出物から精製されたものであってもよい。

　［本発明の各形態に係る用途］
　続いて、上述した本発明の各形態に係る用途について、説明する。

　上述したように、ペタシンやＳ－ペタシンは悪性黒色腫に対する抗がん作用を有することが知られており（特許文献２）、また、ペタシン、Ｓ－ペタシン、ネオペタシンおよびネオ－Ｓ－ペタシンは、胃がん、大腸がんおよび白血病の増殖抑制作用を有することが知られている（特許文献３）。しかしながら、特許文献２および特許文献３には、本発明の化合物が示すこのような腫瘍細胞に対する増殖抑制作用が、腫瘍細胞におけるミトコンドリア呼吸鎖複合体Ｉの阻害やアスパラギン酸合成の阻害、種々のがん関連分子の発現の抑制などの作用機序によって引き起こされることについては何ら開示されていない。

　これに対し、本発明者らは、本発明に係る化合物が、腫瘍細胞に対して種々の作用を発現することを初めて見出し、本発明を完成させるに至った。

　まず、本発明者らが検討を進めたところ、本発明の化合物が非常に強力な腫瘍細胞に対する転移抑制作用を示すことを、マウス悪性黒色腫肺転移モデルを用いたｉｎ　ｖｉｖｏでの実験により見出した。そして、マウス高転移悪性黒色腫細胞株であるＢ１６Ｆ１０細胞を用いた腫瘍細胞肺転移試験により、本発明の化合物が非常に強い腫瘍細胞の遊走抑制作用を示すことも確認した（後述する試験例２）。すなわち、本発明の一形態によれば、上述した本発明に係る化合物の少なくとも１つを有効成分として含有する、腫瘍細胞の転移抑制剤が提供される。同様に、本発明によれば、上述した本発明に係る化合物（好ましくは、ネオペタシン）を、それを必要とする患者に投与することを含む、腫瘍細胞の転移を抑制する方法も提供される。また、本発明によれば、腫瘍細胞の転移の抑制に用いるための、上述した本発明に係る化合物（好ましくは、ネオペタシン）もまた、提供される。さらに、本発明によれば、上述した本発明に係る化合物（好ましくは、ネオペタシン）の、腫瘍細胞の転移の抑制への応用もまた、提供される。

　本明細書において、「細胞の遊走」または「細胞遊走」とは、細胞がその運動能により元の位置から別の位置へと動くことを意味する。つまり、腫瘍細胞の遊走とは、腫瘍細胞が能動的に移動する現象である。腫瘍細胞の遊走は、がんの転移においても生じる現象である。本発明の一形態に係る腫瘍細胞の転移抑制剤は、この腫瘍細胞の遊走を抑制・阻害することで、腫瘍細胞が発生した場所（原発巣）から遊走（移動）して、遠隔部位に再びがんまたは腫瘍を形成する現象（転移）を抑制・阻害できると考えられる。なお、細胞遊走の種類としては、細胞がケモカインなどの走化性因子の濃度勾配によって遊走するケモタキシス（Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ、走化性）、細胞が細胞接着サイトもしくは、細胞外マトリックスに結合した走化性因子の濃度勾配に従って遊走するハプトタキシス（Ｈａｐｔｏｔａｘｉｓ、走触性）、細胞が創傷の間を渡って遊走する創傷治癒（Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ）、および細胞が細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分解やタンパク質分解を介して、ＥＣＭを通って近接する組織へ移動する細胞浸潤（Ｉｎｖａｓｉｏｎ）がある。このため、腫瘍細胞に対する遊走抑制効果は、公知の方法、例えば、ラッフル膜の形成阻害、創傷治癒アッセイを用いて、または市販の細胞遊走測定システムを用いて評価できる。本明細書では、腫瘍細胞の転移抑制効果を、腫瘍細胞の遊走抑制効果により評価し、具体的には創傷治癒アッセイを用いて評価する（後述する実施例の試験例５）。

　本発明に係る腫瘍細胞の転移抑制剤は、腫瘍細胞の遊走を抑制・阻害することで、腫瘍細胞の転移を抑制および／または予防することができる。本明細書において、「腫瘍細胞の転移」とは、腫瘍細胞が原発巣から分離して、別の組織や臓器に移動し、そこで増殖することを意味する。また、「腫瘍細胞の転移の抑制」または「腫瘍細胞転移抑制」とは、腫瘍細胞が発生した場所（原発巣）から移動（遊走）して、遠隔部位に再び腫瘍を形成する現象（転移）を抑制することを意味する。ここで一般に、「抗がん剤」とは、がん病巣を有する患者に対して投与されて当該がん病巣におけるがん細胞の増殖を抑制するためのものである。これに対し、本明細書に記載の「腫瘍細胞の転移阻害剤」とは、がん病巣から他の組織へのがん細胞の転移を抑制するためのものであり、ある剤ががん細胞の増殖を抑制するか否かは、当該剤が「転移抑制剤」であるか否かとは無関係である。そして、「抗がん剤」の投与対象はがん病巣を有する患者であるのに対し、「転移抑制剤」の投与対象は、がん病巣を有する患者のみならず、外科的手術や放射線療法などによって（少なくとも見かけ上は）がん病巣を有していない患者に対して投与されることも十分に想定される。このことは、例えば、日本がん転移学会ウェブサイトの「がん転移Ｑ＆Ａ」の「Ｑ８：転移したがんは治りにくいと聞きますがどうしてですか？」に対する回答、ＵＲＬ：http://jamr.umin.ac.jp/qa/a08.html（最終アクセス日は令和３年２月１２日）に、「抗がん剤は正常の組織にも障害を与えてしまうので、投与量を増やすことができないという問題があります。一方、転移は癌にしかみられない現象なので、将来、副作用の殆どない転移のみをブロックする抗がん剤が開発されるのではないかと期待されています。そのような転移阻害剤ができれば、原発巣は手術で転移は転移阻害剤でという夢のような治療ができるのではと期待されています。」との記載があることからも明らかである。このように、「腫瘍細胞の転移抑制剤」と「抗がん剤」とでは、投与対象が異なることが十分に想定されることから、これらは「投与のタイミング等の用法が特定された特定の疾病への適用」の点において区別され得るものである。

　また、「抗がん剤により腫瘍細胞の増殖が抑制されると、腫瘍細胞の転移も抑制される」との命題も正しくない。このことは、例えば、Paez-Ribes, M. et al. Antiangiogenic Therapy Elicits Malignant Progression of Tumors to Increased Local Invasion and Distant Metastasis. Cancer Cell 15, (2008).の記載からも明らかである。すなわち、同文献には、抗ＶＥＧＦＲ２阻害剤であるスニチニブ（Sunitinib）でマウスを処置したところ、原発腫瘍の増殖が抑制された一方で、リンパ節および肺への腫瘍細胞の転移が促進されたことが記載されている（同文献のFigure 3）。このことから、「抗がん剤により腫瘍細胞の増殖が抑制されると、腫瘍細胞の転移も抑制される」という命題は常に正しいとは限らず、むしろ逆の結果を招く場合もあることがわかる。

　ここで、腫瘍細胞の転移抑制の対象となるがんの種類は、特に限定されない。例えば、神経系のがん（例えば、脳腫瘍、頚がん）；消化器系のがん（例えば、口腔がん、咽頭がん、食道がん、胃がん、肝がん、胆嚢がん、胆道がん、脾臓がん、大腸がん、小腸がん、十二指腸がん、結腸がん、結腸腺がん、直腸がん、膵臓がん、肝臓がん）；筋骨格系のがん（例えば、肉腫、骨肉種、骨髄腫）；泌尿器系のがん（例えば、膀胱がん、腎がん）；生殖器系のがん（例えば、乳がん、子宮がん、卵巣がん、精巣がん、前立腺がん）；呼吸器系のがん（例えば、肺がん）；造血器系のがん（例えば、急性または慢性骨髄性白血病、急性前骨髄性白血病、急性または慢性リンパ性白血病等の白血病、悪性リンパ腫（リンパ肉腫）、血管肉腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、原発性骨髄線維症、血管外膜細胞腫）；甲状腺がん、副甲状腺がん、舌がん、悪性黒色腫（メラノーマ）、肥満細胞腫、皮膚組織球腫、脂肪腫、毛包腫瘍、皮膚乳頭腫、皮脂腺腫、基底細胞がんなどが挙げられる。これらのうち、本発明に係る腫瘍細胞の転移抑制の対象としては、好ましくは造血器系のがん、消化器系のがん、生殖器系のがん、悪性黒色腫（メラノーマ）、肥満細胞腫および基底細胞がんであり、より好ましくは悪性黒色腫（メラノーマ）である。また、本発明に係る腫瘍細胞の転移抑制は、腫瘍細胞の肺への転移の抑制であることが好ましい。

　ところで、２－デオキシグルコース（2-Deoxyglucose；２－ＤＧ）などの解糖系阻害剤は、グルコースと競合してＧＬＵＴ１を介してがん細胞に取り込まれ、がん細胞の解糖系を阻害することによりがん細胞の増殖速度を低下させることが知られている。ここで、本発明者らの検討によれば、上述した化学式１Ａまたは化学式１Ｂで表される化合物（例えば、ネオペタシン）は、２－デオキシ－Ｄ－グルコースなどの解糖系阻害剤とともに腫瘍細胞に適用されると、解糖系阻害剤の作用を増強する効果を発現することが判明した（後述する試験例３）。したがって、本発明の一形態によれば、上述した化学式１Ａまたは化学式１Ｂで表される化合物を有効成分として含有する、解糖系阻害剤の作用増強剤もまた、提供される。同様に、本発明によれば、上述した本発明に係る化合物（好ましくは、ネオペタシン）を、それを必要とする患者に解糖系阻害剤とともに投与することを含む、解糖系阻害剤の作用を増強する方法も提供される。また、本発明によれば、解糖系阻害剤の作用の増強に用いるための、上述した本発明に係る化合物（好ましくは、ネオペタシン）もまた、提供される。さらに、本発明によれば、上述した本発明に係る化合物（好ましくは、ネオペタシン）の、解糖系阻害剤の作用の増強への応用もまた、提供される。なお、本形態において、本発明に係る化合物（好ましくは、ネオペタシン）は、解糖系阻害剤と併用されて用いられることにより解糖系阻害剤の作用を増強するものである。

　ここで、本発明に係る有効成分とともに用いられうる解糖系阻害剤について特に制限はなく、解糖系を阻害する作用を有する物質（例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など）自体であっても、当該物質を含む剤であってもよいが、例えば、上述した２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ＤＧ）のほか、フッ化ナトリウム、リチウムヨード酢酸などが挙げられる。

　本発明のさらに他の形態によれば、上述した本発明に係る化合物、または上述した本発明に係る腫瘍細胞の転移抑制剤を含む、腫瘍の転移の抑制および／または予防用医薬組成物が提供される。同様に、本発明によれば、上述した本発明に係る化合物（好ましくは、ネオペタシン）および製薬上許容できる添加剤を含む、腫瘍細胞の転移を抑制するための医薬組成物も提供される。また、本発明によれば、腫瘍細胞の転移の抑制に用いるための、上述した本発明に係る化合物（好ましくは、ネオペタシン）を含む医薬もまた、提供される。

　上述のとおり、本発明の一形態は、本発明に係る化合物、または上述した本発明に係る腫瘍細胞の転移抑制剤を含む、腫瘍の転移の抑制および／または予防用医薬組成物に関する。本発明に係る化合物、または上述した本発明に係る腫瘍細胞の転移の抑制および／または予防用医薬組成物は、上述した種々の腫瘍の転移の抑制および／または予防の用途に用いられうるが、特に悪性黒色腫（メラノーマ）の転移の抑制または予防に用いられることが好ましい。また、他の観点から、本発明に係る腫瘍細胞の転移の抑制および／または予防用医薬組成物は、腫瘍細胞の肺への転移を抑制および／または予防するのに用いられることが好ましい。なお、「腫瘍細胞の転移の予防」または「腫瘍細胞転移予防」とは、がんや腫瘍の転移を防止もしくは遅延させる、またはがんや腫瘍の転移の危険性を低下させることを意味する。さらに、上述したように、本発明に係る有効成分は解糖系阻害剤の作用を増強する効果を有していることから、本発明に係る医薬組成物は、解糖系阻害剤と併用されて投与されることが好ましい。

　本発明に係る化合物が腫瘍細胞に対して増殖抑制活性や転移抑制活性を示す作用機序を明らかにすることを目的として、本発明者らがさらに検討を進めたところ、本発明の化合物は、腫瘍細胞におけるアスパラギン酸合成を阻害する作用を有することが判明した（後述する実施例の試験例６および試験例７）。すなわち、本発明の一形態によれば、上述した本発明に係る化合物の少なくとも１つを有効成分として含有する、アスパラギン酸合成阻害剤が提供される。同様に、本発明によれば、上述した本発明に係る化合物（好ましくは、ネオペタシン）を、それを必要とする患者に投与することを含む、アスパラギン酸の合成を阻害する方法も提供される。また、本発明によれば、アスパラギン酸の合成の阻害に用いるための、上述した本発明に係る化合物（好ましくは、ネオペタシン）もまた、提供される。さらに、本発明によれば、上述した本発明に係る化合物（好ましくは、ネオペタシン）の、アスパラギン酸の合成の阻害への応用もまた、提供される。このことから、本発明の化合物は、腫瘍細胞におけるアスパラギン酸の合成を阻害することによって、腫瘍細胞に対する増殖抑制活性や転移抑制活性を示しているものと考えられる。なお、本形態に係る「アスパラギン酸の合成の阻害」は、好ましくは腫瘍細胞の転移を抑制するためのもの（すなわち、腫瘍細胞の転移を抑制することを目的としたもの）である。

　また、本発明者らは、本発明に係る化合物は、腫瘍細胞のスフェロイドの形成を阻害する作用を有することも判明した（後述する実施例の試験例４）。すなわち、本発明の一形態によれば、上述した本発明に係る化合物の少なくとも１つを有効成分として含有する、腫瘍細胞のスフェロイド形成阻害剤が提供される。同様に、本発明によれば、上述した本発明に係る化合物（好ましくは、ネオペタシン）を、それを必要とする患者に投与することを含む、腫瘍細胞のスフェロイドの形成を阻害する方法も提供される。また、本発明によれば、腫瘍細胞のスフェロイドの形成の阻害に用いるための、上述した本発明に係る化合物（好ましくは、ネオペタシン）もまた、提供される。さらに、本発明によれば、上述した本発明に係る化合物（好ましくは、ネオペタシン）の、腫瘍細胞のスフェロイドの形成の阻害への応用もまた、提供される。このことから、本発明の化合物は、腫瘍細胞のスフェロイドの形成を阻害することによっても、腫瘍細胞に対する増殖抑制活性や転移抑制活性を示しているものと考えられる。なお、本形態に係る「腫瘍細胞のスフェロイドの形成の阻害」は、好ましくは腫瘍細胞の転移を抑制するためのもの（すなわち、腫瘍細胞の転移を抑制することを目的としたもの）である。

　さらに、本発明に係る化合物が腫瘍細胞においてアスパラギン酸の合成を阻害する作用機序を明らかにすることを目的として、本発明者らがさらに検討を進めたところ、本発明の化合物は、腫瘍細胞におけるミトコンドリアの呼吸鎖を構成する複合体Ｉを阻害する作用を有することが判明した（後述する実施例の試験例８および試験例９）。したがって、本発明の化合物が腫瘍細胞におけるアスパラギン酸合成を阻害する作用機序の少なくとも１つは、ミトコンドリアの呼吸鎖の複合体Ｉを阻害することによるものであると考えられる。

　また、本発明者らの検討によれば、本発明の化合物は、腫瘍細胞において種々のがん関連分子（タンパク質）（例えば、Ａｋｔ、ＥＲＫ１／２、ＦＡＫ、もしくはＳＴＡＴ３のリン酸化（活性化）型、または、ＡＭＰＫ、ｍＴＯＲ、ＡＣＣ、ＧＳＫ３ｂなど）の発現を抑制する作用を有することも判明した（後述する実施例の試験例１０および試験例１１）。このことから、上述したような種々のがん関連分子（タンパク質）の発現抑制もまた、腫瘍細胞に対する増殖抑制作用や転移抑制作用の発現に関与しているものと考えられる。

　上述したように、本発明に係る腫瘍細胞の転移の抑制および／または予防用医薬組成物は、本発明に係る腫瘍細胞の転移抑制剤を含む。また、本発明に係る腫瘍細胞の転移抑制剤は、上述した本発明に係る腫瘍細胞におけるミトコンドリア呼吸鎖複合体Ｉ阻害剤、腫瘍細胞におけるアスパラギン酸合成阻害剤、腫瘍細胞におけるＡｋｔ、ＥＲＫ１／２、ＦＡＫ、もしくはＳＴＡＴ３のリン酸化（活性化）型またはＡＭＰＫ、ｍＴＯＲ、ＡＣＣ、ＧＳＫ３ｂの発現抑制剤、あるいは、腫瘍細胞のスフェロイド形成阻害剤の少なくとも１つを含む。したがって、本発明に係る腫瘍細胞の転移の抑制および／または予防用医薬組成物は、上述した化学式１Ａまたは化学式１Ｂで表される化合物を有効成分として含有する。当該医薬組成物は、従来と同様の剤形で使用できる。すなわち、本形態に係る医薬組成物は、化学式１Ａまたは化学式１Ｂで表される化合物を賦形剤などの製薬上許容できる添加剤と混合して非経口投与、経口投与または外部投与に適した医薬品などの形態で使用することができる。

　当該医薬組成物の治療対象は、特に制限されないが、哺乳動物や鳥類、好ましくはがんに罹患した哺乳動物や鳥類である。ここで、哺乳動物は、ヒト、サル、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン等の霊長類、ならびにマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ラクダ、ヤギなどの非ヒト哺乳動物双方を包含する。鳥類としては、ニワトリ、ウズラ、ハトなどが挙げられる。これらのうち、好ましくは、ヒト、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタであり、より好ましくは、ヒトおよびイヌ、ネコ、ウサギ等のペット動物である。すなわち、本発明の好ましい実施形態によると、本発明に係る腫瘍細胞の転移の抑制および／または予防用医薬組成物は、ヒト、またはペット動物に経口的に投与されて使用されることが好ましく、ヒトまたはイヌ、ネコ、ウサギからなる群より選択される少なくとも一種のペット動物に経口的に投与されて使用されることがより好ましい。本発明のより好ましい実施形態によると、本発明に係る腫瘍細胞の転移の抑制および／または予防用医薬組成物は、ヒト、イヌ、またはネコに経口的に投与されて使用される。

　上記医薬組成物は、経口剤、外用剤、注射剤、吸入剤、点鼻・点眼剤等として提供されることができ、これらの使用方法に応じて、錠剤、液剤、注射剤、軟膏、クリーム、ローション、エアゾール剤、座剤等の所望の剤形にすることができる。また、必要に応じて賦形剤、基剤、乳化剤、安定剤、溶解助剤、矯味剤、保存剤、芳香剤、着色剤、コーティング剤などを適宜配合することができる。

　上記医薬組成物の投与量は、治療上有効な量を考慮して決定されるが、投与経路；患者の病気の性質；患者のサイズ、体重、表面積、年齢および性別；投与される他の薬剤；ならびに主治医の判断などによって異なる。適当な投与量は、有効成分として１日当たり、例えば１～５００ｍｇ／ｋｇ体重である。様々な利用できる上記医薬組成物の様々な投与経路の異なる有効性を考慮すると、必要な投与量は広範に変化しうると予想される。これらの投与量レベルの変動は、当該分野において既知の最適に関する標準的な経験上の手順を用いて調節できる。特に経口によるデリバリーでは、適当なデリバリーベヒクル（例えば、ポリマーミクロ粒子または移植可能な装置）への上記医薬組成物のカプセル化により、デリバリー効率が上がる。また、上記投与量は、１日１回または複数回に分けてもよい。または、場合によっては、より低い頻度（例えば、週もしくは月単位）で投与されてよい。加えて、同一患者であっても、患者の症状や重篤度に応じて、投与量は変化しうる。

　本明細書において、「治療上有効な量」とは、本明細書で使用される場合、いずれの医療にも適用可能な妥当な便益／リスク比で、何らかの所望の抑制効果を生じるのに有効な有効成分または医薬組成物の量を意味する。例えば、本発明に係る上記医薬組成物の投与量は、対象疾患、投与対象、投与経路などにより差異はあるが、上記医薬組成物を経口投与する場合、用量は対象となる者の体重等の条件によって容易に変動しうるため、当業者によって適宜選択されうる。また、最終的には、主治医が患者の症状や重篤度などを考慮して、適宜選択する。

　本明細書において、「製薬上許容できる」とは、正しい医学的判断の範囲内で、妥当な便益／リスク比に見合って、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応等の問題や合併症なしに、治療対象（ヒト、哺乳動物など）の組織に接触しての使用に好適な、化合物、材料、組成物、および／または投薬形態を指すために使用される。

　製薬上許容できる担体とは、体の一器官または一部から体の別の器官または一部へ本発明の生殖器系のがんの転移抑制／予防剤を運搬または輸送することに関与する液体または固体の充填剤、希釈剤、補形薬、溶剤またはカプセル化材料のような、製薬上許容できる材料、組成物または賦形剤を意味する。各担体は、剤形の他の成分と適合し、患者に有害でないという意味で「許容できる」ものでなければならない。製薬上許容できる担体としては、以下に制限されないが、ラクトース、グルコースおよびスクロースのような糖；トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプンのようなデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースのようなセルロースおよびその誘導体；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバターおよび座薬ワックスのような補形薬；落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油のような油；プロピレングリコールのようなグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールのようなポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルのようなエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムのような緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張食塩液；リンガー溶液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液；ならびに薬物処方で使用される他の非毒性の適合物質が挙げられる。いくつかの実施形態では、薬物製剤は非発熱性である。すなわち、患者の体温を上昇させないものが望ましい。その他、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムのような湿潤剤、乳化剤および潤滑剤、ならびに着色剤、放出剤、被覆剤、甘味料、香味剤および香料、保存料および酸化防止剤が本発明の生殖器系のがんの転移抑制／予防剤中に含まれてもよい。

　製薬上許容できる酸化防止剤としては、以下に制限されないが、アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等のような水溶性酸化防止剤；パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α－トコフェロール等のような油溶性酸化防止剤；ならびにクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等のような金属キレート剤が挙げられる。

　本発明に係る医薬組成物は、経口、経鼻、局所（口内および舌下を含む）、直腸、膣および／または非経口投与に等の様々な剤形で使用できるが、好ましくは経口投与である。剤形は、単位投薬形態で都合よく差し出されてもよく、薬学分野で周知のいかなる方法によって調製されてもよい。担体材料と組み合わせて単一投薬形態を作製することができる活性成分の量は、治療されるホスト、特定の投与方式に応じて変わるであろう。担体材料と組み合わせて単一投薬形態を作製することができる活性成分の量は一般に、治療効果を生じる化合物の量であるが、一般に、有効成分（化学式１Ａまたは化学式１Ｂで表される化合物）の量は、医薬組成物の全量に対して、約０．１～約９９重量％であり、好ましくは約１～約７０重量％であり、より好ましくは約５～約５０重量％である。

　これらの剤形または組成物を調製する方法は、本発明に係る有効成分を担体と、任意に１つまたは複数の副成分と結びつけるステップを含む。一般に、剤形は本発明に係る１つまたは複数の有効成分を液体担体、もしくは微粉化した固体担体、またはその両方と均一かつ緊密に結びつけ、必要であれば製品を成形することによって調製される。

　例えば、経口投与に好適な剤形は、カプセル、サシェ（ｓａｃｈｅｔ）、丸薬、錠剤、ロゼンジ（味付けされた主薬、通常はスクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカント、を用いる）、粉末、顆粒の形態でもよく、または水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油もしくは油中水液体乳剤として、またはエリキシルもしくはシロップとして、または香錠（ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアゴムのような不活性基剤を用いる）および／または含嗽剤等としてでもよく、それぞれ活性成分として所定量の本発明に係る有効成分の化合物を含む。本発明に係る医薬組成物は、巨丸剤、舐剤、またはペーストとして投与されてもよい。

　経口投与のための固体投薬形態（カプセル、錠剤、丸薬、糖衣錠、粉末薬、顆粒剤等）では、有効成分は、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムのような１つまたは複数の製薬上許容できる担体、および／または以下のもののいずれかと混合される：デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸のような充填剤または増量剤；例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアラビアゴムのような粘結剤；グリセロールのような保湿剤；寒天、炭酸カルシウム、バレイショまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムのような崩壊剤；パラフィンのような溶解遅延剤；４級アンモニウム化合物のような吸収促進剤；セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールのような湿潤剤；カオリンおよびベントナイト粘土のような吸収剤；タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物のような潤滑剤；ならびに着色剤。カプセル、錠剤および丸薬の場合、これらは緩衝剤を含んでもよい。同様の種類の固体組成物が、ラクトースまたは乳糖のような補形薬と、高分子量ポリエチレングリコール等とを用いたソフトおよびハード充填ゼラチンカプセル内の充填剤としても使用可能である
　また、錠剤は、圧縮または成形によって、任意に１つまたは複数の副成分とともに、作製されうる。圧縮された錠剤は、粘結剤（例えば、ゼラチンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、保存料、崩壊剤（例えば、グリコール酸ナトリウムデンプンもしくは架橋型カルボキシメチルセルロースナトリウム）、表面活性剤または分散剤を用いて調製されうる。成形タブレットは、不活性液体希釈剤で湿潤化された粉末化合物の混合物を好適な機械で成形することによって作製されうる。

　糖衣錠、カプセル、丸薬および顆粒剤のような、本発明に係る医薬組成物の錠剤等の固体投薬形態は、任意に、刻み目を付けられ、または薬物調剤分野において周知の腸溶性被膜等の被膜および殻を用いて調製されてもよい。それらは、例えば、所望の放出プロフィールを提供するための種々の比率でのヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはミクロスフェアを用いて、内部の有効成分の徐放性または制御された放出を提供するように調剤されてもよい。それらは、例えば、細菌保持フィルターを通す濾過によって、または使用直前に滅菌水等の滅菌注射可能媒質に溶解することができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことによって、滅菌してもよい。これらの組成物は、任意に乳白剤を含んでもよく、胃腸管のある特定の部分のみで、またはそこで優先的に、任意に遅延したやり方で、１つまたは複数の有効成分を放出する組成であってもよい。使用可能な埋込み組成物の例として、ポリマー物質およびワックスがある。有効成分は、適当であれば１つまたは複数の上記の補形薬とともに、マイクロカプセル化された形態であってもよい。

　本発明に係る医薬組成物の経口投与のための液体投薬形態としては、製薬上許容できる乳剤、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルがある。液体投薬形態は、活性成分に加えて、例えば水や他の溶媒のような当技術分野で一般に使用される不活性希釈剤、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブタジエングリコール、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルのような可溶化剤および乳化剤、およびそれらの混合物を含んでもよい。また、不活性希釈剤の他に、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味料、香味剤、着色剤、香料および保存剤のような補助薬を含んでもよい。懸濁液は、活性化合物に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにそれらの混合物のような懸濁剤を含んでもよい。

　直腸または膣投与のための本発明に係る医薬組成物の剤形は、座薬として提示されうる。この座薬は、例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、座薬ワックスまたはサリチル酸塩を含む１つまたは複数の好適な非刺激性補形薬または担体と、本発明の１つまたは複数の有効成分とを混合することによって調製することが可能であり、室温で固体であるが、体温では液体であるため、直腸または膣腔で融解し、活性化合物を放出することになる。膣投与に好適な剤形はまた、当技術分野で適当であることが知られているような担体を含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、発泡またはスプレー剤形も含む。

　本発明に係る医薬組成物の局所的または経皮的投与の投薬形態は、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入薬を含む。有効成分は、製薬上許容できる基材と、および必要であれば保存料、緩衝液、または推進剤と、滅菌条件下で混合してもよい。軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、有効成分に加えて、動物脂または植物脂、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはそれらの混合物のような補形薬を含んでもよい。

　粉末およびスプレーは、有効成分に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物のような補形薬を含んでもよい。スプレーは、塩化フッ化炭化水素や、ブタンおよびプロパンのような揮発性非置換炭化水素のような通例の高圧ガスをさらに含んでもよい。

　経皮的パッチは、本発明に係る医薬組成物を、体に制御して配送するという更なる利点を有する。このような投薬形態は、適当な媒質に本発明に係る有効成分を溶解または分散させることによってなされうる。吸収増進剤を用いて、皮膚を横切る本発明に係る有効成分を含有する物質のフラックスを上昇させることも可能である。このようなフラックスの速さは、速さ制御膜を設けるか、またはポリマーマトリックスもしくはゲル中に化合物を分散させるかのいずれかによって制御することができる。

　非経口投与に好適な本発明に係る医薬組成物は、当該組成物とともに、１つまたは複数の製薬上許容できる滅菌等張水溶液または非水溶液、分散剤、懸濁液もしくは乳剤、または使用直前に滅菌注射可能溶液または分散剤中で戻すことが可能な滅菌粉末を含み、これは酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、調剤を目的レシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁剤もしくは濃縮剤を含みうる。

　本発明に係る医薬組成物において使用可能な好適な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、およびそれらの好適な混合物、オリーブ油のような植物油、ならびにオレイン酸エチルのような注射可能有機エステルがある。固有の流動性は、例えば、レシチンのような被覆材料の使用によって、分散剤の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。

　本発明に係る医薬組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤のような補助薬を含んでもよい。微生物の活動の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、ソルビン酸フェノール等の種々の抗菌剤および抗真菌剤の含有によって確保しうる。糖、塩化ナトリウム等の等張剤を組成物に含めると望ましいかもしれない。さらに、注射可能薬物形態の持続性吸収が、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる作用物質の含有により引き起こされうる。

　本発明のさらに他の形態は、本発明に係る医薬組成物を腫瘍細胞の転移を抑制する必要のある患者に投与することを含む、腫瘍細胞の転移を抑制および／または予防する方法に関する。さらに、好ましい一実施形態は、本発明に係る医薬組成物を、がん摘出後の腫瘍細胞の転移を抑制する必要のある患者に投与することを含む、がん摘出後の腫瘍細胞の転移を抑制および／または予防する方法に関する。

　本発明のさらに他の形態によれば、上述した化学式１Ａまたは化学式１Ｂで表される化合物を有効成分として含有する、腫瘍細胞転移抑制用飲食品組成物が提供される。

　腫瘍細胞転移抑制用飲食品組成物の形態は、特に制限されず、液状、ゲル状あるいは固形状の食品（例えばジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、粉末状または液状の乳製品、パン、クッキー等）に添加したり、必要に応じてデキストリン、乳糖、澱粉等の賦形剤や香料、色素等とともにペレット、錠剤、顆粒等に加工したりしてもよい。また、上述した化学式１Ａまたは化学式１Ｂで表される化合物の少なくとも１つをゼラチン等で被覆してカプセルに成形加工して健康食品や栄養補助食品等として利用できる。腫瘍細胞転移抑制用飲食品組成物に含まれる上記化合物（有効成分）の配合量は、当該食品や組成物の種類や状態等により一律に規定し難いが、食品の全重量に対して、０．０１～９０重量％、より好ましくは０．１～８０重量％である。このような配合量であれば、風味を損なうことなく、上記化合物（有効成分）による効能を十分発揮できる。また、食品を容易に調製できる。

　ここで、「飲食品組成物」とは、人間等の哺乳動物（ペットを含む）による摂取を意図した組成物を意味する。例えば、ペットフード組成物は、ペットによる摂取を意図した飲食品組成物である。飲食品組成物は、当技術分野において広く知られている。ペットフード組成物は、栄養的にバランスがとれていてもまたとれていなくてもよく、サプリメント（例えば、エサ）の他に、毎日の食事に適した栄養的にバランスがとれた組成物であってもよい。ここで、「栄養的にバランスのとれた」とは、本発明の組成物が、ペット栄養学分野において適切な量および割合で、生命を維持するために必要な既知の栄養素を有することを意味する。

　本発明の好ましい実施形態において、腫瘍細胞転移抑制用飲食品組成物は、ヒト用健康食品またはペットフード組成物である。

　ここで、本発明に係る化学式１Ａまたは化学式１Ｂで表される化合物（有効成分）をヒトへの健康食品（ヒト用健康食品）またはペットフード組成物に添加・使用する場合の、当該化合物（有効成分）の添加量（含有量）は、特に制限されないが、健康食品またはペットフード組成物（固形分換算）に対して、好ましくは０．０１～３０重量％、より好ましくは０．０５～２０重量％程度になるような量である。または、上記化合物を、１日に合計重量として、好ましくは０．１～１０００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１～５００ｍｇ／ｋｇ体重程度投与されるような量である。このような量であれば、十分な腫瘍細胞の転移抑制効果を達成できる。また、上記したような量であれば、ペットの嗜好を阻害することがなく、ペットは与えられたペットフード全量を摂取する。

　ペットフード組成物は、本発明に係る有効成分を含むこと以外は従来と同様の成分を含む。例えば、ペットフード組成物は、本発明に係る有効成分に加えて、単糖類、オリゴ糖、多糖類、食物繊維、デンプン類（例えば、ワキシーコーンデンプン、コーンデンプン、小麦デンプン、米デンプン、糯米デンプン、馬鈴薯デンプン、甘露デンプン、タピオカデンプン、サゴデンプン、これらに化学的処理を施したものや化学修飾した加工デンプン）や穀物類（例えば、とうもろこし、大麦、小麦、ライ麦、ソルガム、米、ひえ、あわ、アマラサンサス、キヌア）等の炭水化物源；牛、豚、羊、うさぎ、カンガルー等の畜肉や獣肉、その副生成物および加工品、鶏、七面鳥、うずら等の鳥肉、その副生成物および家屋品、魚、白身魚等の魚肉、その副生成物および加工品、ミートミール、ミートボーン、チキンミール、ポータリーミール、フィッシュミール等の上記原料のレタリング等の、動物性タンパク質源；大豆タンパク質、小麦タンパク質、小麦グルテン、コーングルテン等の、植物性のタンパク質源；α－シトステロール、β－シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール、α－シトスタノール、β－シトスタノール、スチグマスタノール、カンペスタノール、シクロアルテノール等のフリー体、これらの脂肪酸エステル、フェルラ酸エステル、桂皮酸エステル等のエステル体等の植物ステロール；米ぬか、ふすま等のぬか類、大豆粕等の粕類、野菜エキス等の野菜、ビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｄ、Ｅ、ナイアシン、パントテン酸、カロチン等のビタミン類などが挙げられる。上記に加えて、一般的にペットフード組成物に使用されるゲル化剤、保型剤、ｐＨ調整剤、調味料、防腐剤、栄養補強剤等の他の添加剤を含有してもよい。上記他の添加剤に加えてまたは上記他の添加剤に代えて、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、エトキシキン、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）、プロピルガレートなどの抗酸化剤を併用することも可能である。上記した各成分の添加量（含有量）は特に制限されず、従来と同様の量が適用できる。

　ペットフード組成物は、従来公知の方法によって製造される。例えば、本発明に係る有効成分および前記した必要成分を混合し、所望の形態にすることにより製造できる。一例としては、上記の有効成分、穀物、肉ミール並びに鉄および銅等のミネラル成分とともに、必要であればクエン酸またはクエン酸塩を混合し、十分混合した後に、水や水蒸気で加水しながらエクストルーダーによって押出成型をする。その後に、好ましくは水分を１０％以下になるまで熱風乾燥させて、ペットフード組成物を製造する。なお、ペットフード組成物が二重結合を二つ以上有る脂肪酸を含有する油脂を含む場合には、熱風乾燥させた後、コーティングするのが望ましい。

　ペットフードとしては、ドライタイプ、ウェットタイプ、セミモイストタイプ、ジャーキータイプ、ビスケットタイプ、ガムタイプ、粒状、粉状、スープ状等いずれの形態であってもよいが、ドライタイプであることが保存の簡便性から好ましい。ドライタイプのペットフードとしては、キブル形状、平板形状、骨形状などが挙げられる。ペットの噛み易さや扱いやすい形状を得るなどの観点からは、嵩密度が１００ｋｇ／ｍ^３以上、好ましくは３００ｋｇ／ｍ^３以上であり、そして９００ｋｇ／ｍ^３以下、好ましくは７００ｋｇ／ｍ^３以下であり、または、１００～９００ｋｇ／ｍ^３、特に３００～７００ｋｇ／ｍ^３であることが好ましい。また、ペットフードは、袋詰め、箱詰め、パック詰め、缶詰、レトルトパウチされた形態で提供され得る。

　以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。

　（試験例１）
　ペタシン、Ｓ－ペタシン、ネオペタシンおよびネオ－Ｓ－ペタシンの４種の化合物について、以下の手法により、マウスまたはイヌ由来の悪性黒色腫細胞に対する増殖抑制作用を評価した。

　Ｂ１６Ｆ１０細胞（マウス悪性黒色腫細胞）は、ＪＣＲＢ細胞バンク（国立研究開発法人　医薬基盤・健康・栄養研究所）より入手した。また、ＣＭｅＣ１細胞（イヌ悪性黒色腫細胞）は、東京大学大学院農学生命科学研究科獣医外科学研究室より入手した。さらに、Ａ２０５８細胞（ヒト悪性黒色腫細胞）は、ＪＣＲＢ細胞バンク（国立研究開発法人　医薬基盤・健康・栄養研究所）より入手した。それぞれ、Ｂ１６Ｆ１０細胞はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて、ＣＭｅＣ１細胞はＲＰＭＩ （ロズウェルパーク記念研究所）培地（ＲＰＭＩ１６４０）を用いて、Ａ２０５８細胞はＥ－ＭＥＭ培地を用いて、３７℃のインキュベーター（空気／ＣＯ_２＝９５／５（ｖ／ｖ））内で培養した。

　まず、ＣＭｅＣ１細胞（イヌ悪性黒色腫細胞）を、０．５×１０^５細胞／ｍＬとなるように６ウェルプレートに播種し、その２４時間後に、上記の４種の化合物のそれぞれ（終濃度は０．０１～１００μｇ／ｍＬ）を培地中に０．１％の割合で懸濁して７２時間インキュベートした。培養開始の７２時間後に、トリパンブルー染色法により生存細胞数を計測した。この際、陰性対照区（ＤＭＳＯ処置）における生存細胞数を１００％とした場合の相対的な細胞数として、生存細胞（Ｃｅｌｌ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　％）を算出した。そして、グラフパッドプリズムソフトウェアシステム（グラフパッドソフトウェア社）を用いＩＣ_５０を算出した。

　結果を図１Ａおよび下記の表１に示す。図１Ａおよび表１に示すように、上記４種の化合物のすべてがＣＭｅＣ１細胞に対して増殖抑制作用を示したが、なかでもネオペタシンが最も強い活性（ＩＣ_５０＝０．９９μＭ（０．３１４μｇ／ｍＬ））を示した。

　また、Ｂ１６Ｆ１０細胞（マウス悪性黒色腫細胞）を用いてネオペタシンについて同様の実験を行った結果を図１Ｂに示す。図１Ｂに示すように、ネオペタシンはＢ１６Ｆ１０細胞に対しても強い増殖抑制活性（ＩＣ_５０＝０．４９３μＭ（０．１５６μｇ／ｍＬ））を示した。このようなネオペタシンの増殖抑制活性は極めて低く、古典的抗がん剤（シスプラチンの活性（Ｂ１６Ｆ１０細胞に対するＩＣ_５０が５μｇ／ｍＬ）と比較しても極めて高い増殖抑制活性を示すことがわかる。

　さらに、正常ヒト皮膚由来線維芽細胞であるＡＳＦ４－１細胞およびヒト悪性黒色腫細胞であるＡ２０５８細胞を用いて上記と同様の試験を行った結果を、Ｂ１６Ｆ１０細胞を用いた場合と比較して図１Ｃに示す。図１Ｃに示すように、ネオペタシンのＡＳＦ４－１細胞（正常細胞）に対するＩＣ_５０値は、腫瘍細胞であるＡ２０５８細胞およびＢ１６Ｆ１０細胞に対するＩＣ_５０値よりも１０００倍以上大きかった。このことから、ネオペタシンは正常細胞に対してほとんど増殖抑制作用を示さず、腫瘍細胞に対して選択的に増殖抑制作用を示すことがわかる。

　（試験例２）
　マウス悪性黒色腫肺転移モデルを用いて、ネオペタシンの腫瘍細胞に対する転移抑制効果を調べた。具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６週齢、メス）を日本ＳＬＣ（浜松）より購入した。次いで、Ｂ１６Ｆ１０細胞を尾静脈より０．２５×１０^６細胞／１００μＬ　ＰＢＳの量で静脈投与した。そして、細胞を播種させた日からネオペタシン（５０ｍｇ／ｋｇ）を２日ごと１回（合計５回）腹腔内投与した。投与開始から１０日後に解剖を行って肺を摘出して、肺表面に認められる転移巣の数を計測した。なお、グラフパッドプリズムソフトウェアシステム（グラフパッドソフトウェア社）を用い、ステューデントＴ検定を用いてＰ値を算出した。

　結果を図２Ａに示す。図２Ａにおいて、「Neopetasin」はネオペタシン投与群（コーン油懸濁ネオペタシン）を意味し、「Vehicle」は陰性対照区（コーン油投与群）を示す。図２Ａに示す結果から、ネオペタシン処置によってマウス悪性黒色腫肺転移モデルにおける肺転移が極めて強力に抑制されたことがわかる。

　また、上記でネオペタシンまたはコーン油を投与したモデルマウスを解剖した際に、各臓器（心臓、肺の正常部位、大脳、腎臓、肝臓、脾臓）の組織から切片を作製し、顕微鏡を用いて観察した。結果を図２Ｂに示す。図２Ｂに示すように、ネオペタシン投与による組織形態学的な変化は観察されなかった。この結果は、試験例１において上述したｉｎ　ｖｉｔｒｏでのネオペタシンの腫瘍細胞に対する作用の特異性と一致するものである。

　（試験例３）
　解糖系阻害剤である２－デオキシグルコース（2-Deoxyglucose；２－ＤＧ）は、グルコースと競合してＧＬＵＴ１を介してがん細胞に取り込まれ、がん細胞の解糖系を阻害することによりがん細胞の増殖速度を低下させることが知られている。本試験例では、このような２－ＤＧの腫瘍細胞に対する制がん作用に対してネオペタシンが及ぼす影響を調べた。

　具体的には、まず、Ｂ１６Ｆ１０細胞を０．５×１０^５細胞／ｍＬの量で６ウェルプレートに播種した。次いで、播種から２４時間経過後に、２－ＤＧ（濃度は３ｍＭから３ｎＭまで変化させた）に加えて、０．３μＭまたは３μＭの濃度のネオペタシンで同時に処置した。そして、この処置から３６時間後に試験例１と同様の手法により細胞生存率を測定した。なお、陰性対照区としては、ＤＭＳＯを投与して同様の実験を行った。

　結果を図３に示す。図３に示すように、陰性対照区においては２－ＤＧの作用によって濃度依存的に細胞生存率が低下することが確認された。そして、このような２－ＤＧの制がん作用は、ネオペタシンの添加によってやはり濃度依存的に増強されたことがわかる。解糖系阻害剤である２－ＤＧと相乗効果を示すことから、ネオペタシンはミトコンドリア呼吸鎖複合体Ｉを阻害することで抗がん活性を示していると考えられる。さらに、ネオペタシンは、従来活性が低く抗がん活性を示すことができなかった２－ＤＧのような既存のがん代謝阻害剤の効果を増強する効果も有していることが示された。このように、ネオペタシン等の本願所定の化合物が２－ＤＧのような解糖系阻害剤の作用を増強するということについては、本願発明者らが実際に実験を行ってみて初めて見出したことである。そして、このような効果は当業者が予測することができなかった顕著なものであって、本願発明が先行技術から自明的に導くことができなかったことを示すものである。すなわち、本発明者らの検討によれば、ネオペタシンはミトコンドリア複合体Iを抑制し（試験例８および試験例９）、酸化的リン酸化の阻害（試験例１０）と、さらにはアスパラギン酸の合成阻害を誘導する（試験例６および試験例７）ことが判明している。そしてその結果として細胞におけるＡＴＰの産生は極端に低下するため、細胞は解糖系を優位に作動させることによってＡＴＰの産生を維持しようとする。つまり、ネオペタシンが細胞に作用することで当該細胞は解糖系依存的な状態になるものと考えられる。本発明者らは、この事実を証明することを目的として解糖系阻害剤である２－ＤＧを用いた実験を行ったのであり、実際に２－ＤＧに対する細胞の感受性が高まっていることを確認することで、上記の事実（ネオペタシンの作用によって細胞が解糖系依存的な状態に変化していること）を実証したのである。このことから、本発明者らは上述した一連の実験の結果としていわば副次的に「ネオペタシンが２－ＤＧ等の解糖系阻害剤の作用を増強する（言い換えれば、ネオペタシンの作用によって細胞の解糖系阻害剤に対する感受性が高まる）」という事実を見出したと言える。もちろん、細胞によって解糖系依存度は異なるものの、ネオペタシンの作用によって細胞の解糖系阻害剤に対する感受性が向上することは明らかである。そして、この事実の発見により、本願発明はネオペタシンを解糖系阻害剤と併用することで解糖系阻害剤の作用を増強するという新たな技術を提供することが可能となったのである。

　（試験例４）
　Ｂ１６Ｆ１０細胞について、ネオペタシンの存在下でスフェロイド形成アッセイを行い、ネオペタシンが当該細胞のスフェロイド形成能に及ぼす影響を調べた。

　具体的には、Ｂ１６Ｆ１０細胞を０．３×１０^５細胞／ｍＬの量でスフェロイド形成用９６ウェルプレートに１００μＬずつ播種した。その際、０．３μＭまたは３μＭの濃度のネオペタシンを培地に添加した。ネオペタシンの添加から、２４時間、４８時間および７２時間経過後に、位相差顕微鏡を用いて細胞の写真を撮影した。なお、陰性対照区としては、ＤＭＳＯを投与して同様の実験を行った。

　結果を図４に示す。図４に示すように、陰性対照区においてはスフェロイドの形成が確認されたが、ネオペタシンで処置した細胞は、スフェロイドを形成することができなかったことがわかる。

　（試験例５）
　ネオペタシンが腫瘍細胞の遊走作用に及ぼす影響を調べる目的で、スクラッチ創傷治癒アッセイを行った。

　具体的には、まず、Ｂ１６Ｆ１０細胞を１．０×１０^５細胞／ｍＬの量で６ウェルプレートに播種した。次いで、播種から２４時間後に、２００μＬチップを使用してスクラッチを作成した。その後、ネオペタシン（濃度０．３μＭ）を含む培地に交換し、さらに７２時間培養して、細胞の写真を撮影した。なお、陰性対照区としては、ネオペタシンを含有しない培地に交換して同様の実験を行った。

　結果を図５に示す。図５に示すように、陰性対照区においては、７２時間培養後にスクラッチ部分に腫瘍細胞が遊走している様子が確認された。これに対し、ネオペタシンで処置することにより、スクラッチ部分への腫瘍細胞の遊走が抑制されていることがわかる。

　なお、上述した非特許文献２には、ペタシンが結腸癌細胞株の増殖を阻害したことに加えて、その遊走や浸潤を抑制したことが開示されている。しかしながら、ある化合物が腫瘍細胞の遊走や浸潤を抑制することが見出されたとしても、当該化合物が腫瘍細胞の転移を実際に抑制し得るか否かについては、実際に実験を行ってみて初めて確認できることである。

　（試験例６）
　ネオペタシンが腫瘍細胞に対して増殖抑制活性や転移抑制活性を示す作用機序を明らかにすることを目的として、ネオペタシンがＢ１６Ｆ１０細胞のミトコンドリアに与える影響を評価した。ネオペタシン処置により影響を受けるシグナル伝達経路を、マイクロアレイを用いたＫＥＧＧ　Ｐａｔｈｗａｙ解析により調べた。具体的には、Ａ２０５８細胞を０．５×１０^５細胞／ｍＬとなるように６ウェルプレートに播種し、その２４時間後に、ネオペタシン（終濃度は３μＭ）を培地中に懸濁して８時間インキュベートした。このようにしてネオペタシン（３μＭ）で８時間処置したＡ２０５８細胞をセルスクレイパーで回収した。なお、陰性対照区にはＤＭＳＯを投与して同様の実験を行った。次いで、ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ　Ｇ３　Ｈｕｍａｎ　ＣＧＨ　マイクロアレイ　８ｘ６０Ｋ（Ａｇｉｌｅｎｔ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）を使用してデータを収集し、各サンプルについて得られた生データを７５パーセンタイルの値で正規化（ｇｌｏｂａｌ　ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）した。そして、Ｇｅｎｅ　Ｓｅｔ　Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＳＥＡ、ブロード研究所、マサチューセッツ工科大学、マサチューセッツ州，アメリカ合衆国）を用いてＫＥＧＧ，Ｒｅａｃｔｏｍｅ，ＧＯに登録されているｐａｔｈｗａｙを検索した。

　結果を図６に示す。図６には、上記の検索でヒットしたｐａｔｈｗａｙのうち、Ｆａｌｓｅ－ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　ｒａｔｅ（ＦＤＲ）のｑ－ｖａｌｕｅがｑ＜０．２５であったものが示されている。また、図６に示すｐａｔｈａｙのうち、特に有意な変動を示した上から６つのものではｑ－ｖａｌｕｅがｑ＜０．０５であった。図６に示す結果から、ネオペタシン処置によってアミノ酸代謝に関与する分子の発現が大きく変動することがわかる。

　また、図６に示されている変動ｐａｔｈｗａｙのうち、特に変動が大きかった遺伝子を示すヒートマップを図７に示す。図７において、発現が上昇した遺伝子は赤色、発現が低下した遺伝子群は青色、中間の変化を示した遺伝子群は白色で示されている。図７に示すように、変動ｐａｔｈｗａｙに含まれる分子のうち、特にアスパラギンシンテダーゼ（ＡＳＮＳ；asparagine synthetase）およびシスタチオニンガンマライアーゼ（ＣＴＨ；cystathionine gamma-lyase）の著しい変動が認められた。なお、ヒートマップを描出する際には、変動ｐａｔｈｗａｙに含まれる遺伝子群を抽出し、ｌｏｇ変換したシグナルデータについて、ＪＭＰ　ｖｅｒｓｉｏｎ　１２．２．０（ＳＡＳ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｉｎｃ．）を用いてウォード法によりクラスター分析した。

　（試験例７）
　ネオペタシンで処置したＢ１６Ｆ１０細胞のメタボローム解析（アミノ酸）を行った。具体的には、試験例１と同様の手法によりネオペタシン（３μＭ）で処置したＢ１６Ｆ１０細胞について、処置から９時間および４８時間後のそれぞれの時点で細胞を回収し、キャピラリー電気泳動－飛行時間型質量分析計（ＣＥ－ＴＯＦＭＳ）を用いてアミノ酸濃度を測定した。なお、サンプル中のアミノ酸濃度は内部標準検量法に従って測定し、サンプル中の内部標準濃度を２５μＭとして算出した。また、解析にはＭａｓｔｅｒ　Ｈａｎｄｓ　ｖｅｒ．２．１７．３．１８（慶應義塾大学先端生命科学研究所）を使用した。

　結果を図８に示す。図８において、サンプル中に含まれているアミノ酸濃度の変化はＦｏｌｄ－ｃｈａｎｇｅとして計算されヒートマップとして示されている。そして、サンプル中の濃度が高いほど赤色で示され、濃度が低いほど青色で示され、検出限界以下であったものは空白として示されている。図８に示す結果から、ネオペタシン処置によってアスパラギン酸（Ａｓｐ）のサンプル中濃度がネオペタシンによる処置後９時間の時点においてすでに強く低下していることがわかる。

　（試験例８）
　ネオペタシンが腫瘍細胞においてアスパラギン酸の合成を阻害する作用機序を明らかにすることを目的として、ネオペタシンがＢ１６Ｆ１０細胞のミトコンドリアに与える影響を評価した。具体的には、試験例１と同様の手法によりネオペタシン（３μＭ）で４８時間処置したＢ１６Ｆ１０細胞を、膜電位に依存してミトコンドリアを標識するＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国）を使用して染色した。なお、陽性対照区として、ネオペタシンに代えて、ミトコンドリア呼吸鎖複合体Ｉ阻害剤（ミトコンドリア毒）として知られているメトホルミンを５０００μＭの濃度で用いて同様の実験を行った。

　続いて、上記のようにして染色した細胞を、蛍光顕微鏡にて撮影した（図９Ａ）。また、イメージサイトメーター（Ｔａｌｉ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国）を用いて、当該細胞の蛍光強度と細胞数の分布との関係を計測した（図９Ｂ）。

　図９Ａおよび図９Ｂに示すように、ネオペタシン（３μＭ）およびメトホルミン（５０００μＭ）のいずれの化合物によって処置された細胞においても蛍光強度の増強（蛍光ピークが強い方に遷移）が認められた。このことから，これらの化合物はミトコンドリアの数または膜電位に影響を与えていることが示唆された。なお、メトホルミンに比べてネオペタシンの活性は１０００倍以上高い。

　上記の結果を受けて、上記においてネオペタシン（３μＭ）およびメトホルミン（５０００μＭ）のそれぞれによって処置した細胞を、電子顕微鏡を用いて観察した。なお、陰性対照区にはＤＭＳＯを投与して同様の実験を行った。

　結果を図９Ｃに示す。図９Ｃに示すように、ネオペタシン（３μＭ）で処置した細胞においては大部分のミトコンドリアが空胞化しており、ミトコンドリアが大きな障害を受けていることが確認された。これに対し、メトホルミン処置細胞においては、５０００μＭと極めて高濃度で処置したにもかかわらず、ミトコンドリアに対する影響は軽度であった。この結果から、ネオペタシンの腫瘍細胞におけるアスパラギン酸の合成阻害作用は、極めて強力なミトコンドリア毒として作用することによるものであることが示唆された。

　（試験例９）
　ネオペタシンのミトコンドリア毒としての作用点を明らかにすることを目的として、ミトコンドリアの呼吸鎖を構成する各複合体（複合体Ｉ～複合体Ｖ）のそれぞれの活性にネオペタシンが及ぼす影響を調べた。

　具体的には，ＭｉｔｏＣｈｅｃｋ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ，　ＭＩ，ＵＳＡ）を使用して、ネオペタシン処置によってミトコンドリアの呼吸鎖を構成する複合体Ｉ、複合体ＩＩ、複合体ＩＩ／ＩＩＩ、複合体ＩＶおよび複合体Ｖのそれぞれの相対活性がどの程度低下するかを調べた。なお、陰性対照区としてはＤＭＳＯを投与して同様の実験を行った。また、陽性対照区としては、ロテノン（複合体Ｉ）、ＴＴＦＡ（複合体ＩＩ）、アンチマイシンＡ（複合体ＩＩ／ＩＩＩ）、ＫＣＮ（複合体ＩＶ）およびオリゴマイシン（複合体Ｖ）をそれぞれ投与して同様の実験を行った。

　結果を図１０に示す。図１０に示すように、ネオペタシンはミトコンドリア呼吸鎖複合体Ｉの相対活性のみを選択的に低下させた。このことから、ネオペタシンはミトコンドリアの呼吸鎖複合体Ｉを阻害することにより、ミトコンドリア毒として作用していることが示された。

　（試験例１０）
　ウエスタンブロット法を用いて、ネオペタシン処置細胞における様々ながん関連タンパク質の発現の変化を調べた。

　ＫＭｅＣ細胞（イヌ悪性黒色腫細胞）は、東京大学大学院農学生命科学研究科獣医外科学研究室より入手した。ＫＭｅＣ細胞はＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、３７℃のインキュベーター（空気／ＣＯ_２＝９５／５（ｖ／ｖ））内で培養した。

　まず、それぞれの細胞を、０．５×１０^５細胞／ｍＬとなるように６ウェルプレートに播種し、その２４時間後に、ネオペタシン（終濃度は３μＭ）を培地中に懸濁して５６時間インキュベートした。このようにしてネオペタシン（３μＭ）で５６時間処置したＢ１６Ｆ１０細胞をセルスクレイパーで回収した。なお、陰性対照区にはＤＭＳＯを投与して同様の実験を行った。

　次いで、氷冷した溶解バッファー（１０ｍＭトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１％（ｗ／ｖ）ＮＰ－４０、０．１％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、および１％（ｗ／ｖ）プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ－アルドリッチ社）中で細胞をホモジナイズし、氷上で２０分間静置した。ホモジネートを１３，０００ｒｐｍで２０分間（４℃）遠心分離した後、上清をウエスタンブロッティング用試料として採取した。試料中のタンパク質含有量は、ＤＣプロテインアッセイキット（バイオラッド社製）を用いて測定した。試料（５μｇのタンパク質量）を１０．０または１２．５％（ｗ／ｖ）のポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜（パーキンエルマーライフサイエンス社）に転写した。５％（ｗ／ｖ）脱脂乳液（０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）で調製）中で１時間インキュベートして非特異的結合をブロックした。その後、２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンおよび０．０１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含有するＴＢＳ－Ｔで適度に希釈した１次抗体と共に、４℃にて膜を一晩インキュベートした。次いで、ＰＢＳ－Ｔで膜を３回洗浄し、２次抗体（ＨＲＰ－結合抗マウスまたはウサギＩｇＧ抗体、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）と共に室温でさらにインキュベートした。次いで、ＰＢＳ－Ｔで膜を３回洗浄した。免疫ブロットは、アマシャムＥＣＬプラスウエスタンブロッティング検出試薬（ＧＥヘルスケア社）を用いて可視化した。抗β－アクチン抗体（シグマ－アルドリッチ社）を用いて同じ膜を再インキュベートすることにより、β－アクチンを内部標準として用いた。

　結果を図１１に示す（図１１において、「Ｃ」は陰性対照区を示し、「Ｎ」はネオペタシン処置した細胞の結果を示す）。図１１に示すように、ネオペタシンはＡ２０５８細胞およびＫＭｅＣ細胞の双方において、広範ながん関連分子を阻害することが示された。すなわち、図１１に示す結果によれば、ネオペタシン処置細胞では、がんの増殖・転移に関係する分子群（Ａｋｔ、ＥＲＫ１／２、ＦＡＫ、ＳＴＡＴ３）のリン酸化（活性化型）の低下、がん代謝を調節する分子群（ＡＭＰＫ、 ｍＴＯＲ、ＡＣＣ、ＧＳＫ３ｂ）の変化、アポトーシス誘導（ＰＡＲＰの分解）などが生じていることがわかる。

　（試験例１１）
　ウエスタンブロット法を用いて、ネオペタシンまたはメトホルミンで処置したＢ１６Ｆ１０細胞における様々ながん代謝・増殖・転移関連タンパク質（ＡＭＰＫ、ＦＡＫ、Ａｋｔ、ＥＲＫ１／２）の発現の経時的な変化を調べた。

　具体的には、試験例１と同様の手法によりネオペタシン（３μＭ）またはメトホルミン（５０００μＭ）で処置したＢ１６Ｆ１０細胞について、これらの化合物による処置から３時間、８時間、２４時間および５６時間後のそれぞれの時点で細胞を回収し、試験例１０と同様の手法によりウエスタンブロット法による各種タンパク質の含有量の測定を行った。なお、陰性対照区にはＤＭＳＯを投与して同様の実験を行った。

　結果を図１２に示す（図１２において、「Ｃ」は陰性対照区を示し、「ＮＰ」はネオペタシン処置した細胞の結果を示し、「Ｍｅｔ」はメトホルミン処置した細胞の結果を示す）。図１２に示す結果によれば、ネオペタシン処置後、がん代謝を調節するマスターレギュレーターであるＡＭＰＫが最も早い段階（３時間）で変化し，転移接着に関連するＦＡＫが次に不活化され、最終的にがんの転移・増殖・細胞死を制御する中心的分子であるＡｋｔ、ＥＲＫが不活化されていることがわかる。このことから、ネオペタシンは，がんの代謝を調節することで腫瘍細胞に対する増殖抑制作用や転移抑制作用を発揮することが示唆された。

　（試験例１２）
　一般に転移のプロセスは原発腫瘍の形成、血管・リンパ管浸潤、肺への定着・増殖という経過をたどる。ここで、試験例２において作製したモデルは、腫瘍細胞の血管内侵入後の動態のみを検証するものであり、実際の臨床例において生じる転移現象はそれ以外にも原発腫瘍からの血管・リンパ管浸潤やそれ以外のプロセスをも含む。そこで本試験例では、マウスに皮下腫瘍（原発腫瘍）を発生させ、そこから腫瘍細胞が全ての転移プロセスをたどって肺に転移するモデル（自然転移モデル）を作製した。そして、このような自然転移モデルに対してネオペタシンを投与することにより、上記と同様の転移抑制作用を示すかどうかを調べた。

　具体的には、まず、自然転移モデルを作製するために、ヌードマウス（ＢＡＬＢｃ　ｎｕ／ｎｕ、メス、４週齢、日本ＳＬＣより購入）にマウス由来転移性乳がん細胞Ｊｙｇ－ＭＣ（Ｂ）を皮下接種した。２４日間インキュベーションの後、ネオペタシン（ＮＰ）を５０ ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与し、１６日間で合計６回処置した（０, ２, ４, ６, １０, １４日時点でそれぞれ接種）。なお、この際の処置の手順を図１３に示す。

　その結果、自然転移モデルにおいてもネオペタシンは転移抑制作用を発揮することが確認された。具体的に、ネオペタシン処置群では、対照群に比較して肺転移巣の有意な減少を認めた。なお、各群のマウスから摘出した肺の肉眼写真を図１４に示し、それぞの肺の表層における転移巣の数を比較したグラフを図１５に示す。

　また，リンパ向性転移に対する影響を調べるために、腋窩リンパ節の重量を測定した。その結果、ネオペタシン（ＮＰ）処置はリンパ節転移に対しても抑制効果を示すことがわかった。なお、各群のマウスから摘出した腋窩リンパ節の肉眼写真を図１６に示す。図１６において＊は腋窩リンパ節を示し、矢頭は原発腫瘍を示す。また、各群におけるすべての腋窩リンパ節または腫大した腋窩リンパ節のそれぞれについてリンパ節の重量を測定した結果を図１７に示す。

　本試験例において作製したモデルにおいて、リンパ節転移は半数程度の頻度で起こる現象であったことから、リンパ節腫大が認められなかった例を除外して重量を比較した。その結果、ＮＰ処置群においてはその腫大の程度および重量が低下していることがわかった。以上に加えて、今回の投与条件では、ＮＰ処置による体重減少や血液検査の異常・変動といった副作用は認められなかった（図１８）。

　以上のことから、より複雑なプロセスを含む自然転移モデルにおいてもネオペタシンは強い抗転移効果を示すことが裏付けられた。自然転移モデルは実際の臨床例において生じる現象と同等の転移メカニズムを有していることから、本試験例の結果を踏まえれば実際の臨床例においてもネオペタシンは強力な抗転移効果を発現できることが予想される。

　（試験例１３）
　「抗がん剤により腫瘍細胞の増殖が抑制されると、腫瘍細胞の転移も抑制される」との命題が正しくないことを確認する目的で、以下の実験を行った。本試験例では、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、マウスメラノーマ由来のＢ１６Ｆ１０細胞に対し、ネオペタシン（ＮＰ）を３μＭの濃度であらかじめ作用させた。その後、生細胞数を一律にそろえてマウスに尾静脈注射し、その後は一切治療を行わず、２週間の無治療期間の後に肺に形成された転移巣の数を計数した。本試験例のプロトコールを図１９に示し、本試験例の結果を示すグラフおよび摘出肺の観察写真を図２０に示す。図２０に示すグラフおよび観察写真によれば、ネオペタシン（ＮＰ）投与群では無治療期間の後にも転移巣の形成は観察されなかったのに対し、コントロール（ＤＭＳＯ投与群）では多くの転移巣が形成されたことがわかる。ここで、仮にネオペタシン（ＮＰ）が腫瘍細胞に対する増殖抑制効果の一環として肺転移病巣の数を減少させている（つまり、増殖抑制効果の一環として肺転移を抑制している）とすると、増殖抑制効果が発揮されない無治療期間の間に、ネオペタシン（ＮＰ）投与群およびコントロール（ＤＭＳＯ投与群）の双方で同等の転移巣の形成が見られるはずである。しかしながら、現実には上述したようにネオペタシン（ＮＰ）投与群では無治療期間の経過後であっても新たな転移巣の形成は確認されていない。したがって、ネオペタシン（ＮＰ）は腫瘍細胞の増殖抑制効果とは独立した別個の作用として、腫瘍細胞の転移抑制効果を発揮していることがわかる。この事実は、「抗がん剤により腫瘍細胞の増殖が抑制されると、腫瘍細胞の転移も抑制される」という命題は常に正しいとは限らないということを示していると言える。また、本試験例の結果や、上述した文献（Paez-Ribes, M. et al. Antiangiogenic Therapy Elicits Malignant Progression of Tumors to Increased Local Invasion and Distant Metastasis. Cancer Cell 15, (2008).）のFigure 3の結果からは、腫瘍細胞の増殖と腫瘍細胞の転移が異なる機構を介して行われていることも強く示唆される。

　（試験例１４）
　本試験例では、フキノトウ抽出物（Whole Extract）に加えて、ペタシン、ネオペタシン、Ｓ－ペタシンおよびＳ－ネオペタシンについての細胞増殖抑制アッセイにおけるＩＣ_５０値を測定した。結果を図２１に示す。図２１に示す結果から、ネオペタシンは他の３つの化合物よりも優れた細胞増殖抑制活性を示すことがわかる。また、図１Ｃにも示されているように、ネオペタシンは正常ヒト皮膚由来線維芽細胞であるＡＳＦ４－１細胞に対して細胞毒性を示さない。このように、正常細胞に対しては細胞毒性を示すことなく腫瘍細胞の転移抑制活性を示すネオペタシンは、本発明に係る化合物のなかでもとりわけ腫瘍細胞の転移抑制剤として極めて優位性の高いものであると言える。

　（まとめ）
　上述した各試験例に示す結果をまとめると、まず、マウス高転移悪性黒色腫細胞株であるＢ１６Ｆ１０細胞を用いた腫瘍細胞肺転移試験を行ったところ、ネオペタシン投与はＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞の肺転移を阻害することが判明した。また、この転移抑制作用は、自然転移マウスモデルにおいても同様に発現することが確認された。なお、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの抗腫瘍効果の特異性と一致して、ネオペタシン投与は肝臓腎臓脾臓などにほとんど毒性を示さなかった。効果発現機序の検索を進めたところ，ネオペタシンは腫瘍代謝を破綻させ、特にアスパラギン酸合成を１０分の１以下にまで阻害することがわかった。ここで、アスパラギン酸はミトコンドリアで合成されるアミノ酸であり、核酸やタンパク質の合成に必須のアミノ酸である。このように、ネオペタシンは第一義的にはアミノ酸代謝を破綻させることによって作用を発現していると考えられるが、ひいてはエネルギー代謝、さらには解糖系からもペントースリン酸回路を介して核酸の合成を強く抑制する。また、ＦＡＫの発現を著しく低下させることで、細胞の運動や形態変化を障害する。以上のことから、ネオペタシンは腫瘍細胞の転移先での増殖と適応に必要な栄養素であるアスパラギン酸の合成を強力に阻害することで、腫瘍細胞の転移能を阻害しているものと考えられる。

　また、上記のようなネオペタシンによるアスパラギン酸の合成阻害作用は、ミトコンドリア呼吸鎖複合体Ｉを直接かつ強力に阻害することによるものであることも判明した。また、このようなネオペタシンの活性はメトホルミンやフェンホルミンに比べて１０００～１００００倍以上高いことも判明した。

　この出願は、２０２０年２月１３日に出願された、日本国特許出願第２０２０－０２２８２７号に基づくものであり、その内容は参照により全体として本明細書に引用されている。

Claims (17)

1. 　下記化学式１Ａまたは下記化学式１Ｂで表される化合物を有効成分として含有する、腫瘍細胞におけるアスパラギン酸合成阻害剤：
   

   

   
   式中、Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基または置換されていてもよい炭化水素基である。また、点線で示されている隣接する２つの化学結合のうち、一方は単結合であり、他方は二重結合である。
2. 　前記化合物がペタシンまたはネオペタシンである、請求項１に記載の阻害剤。
3. 　請求項１に記載の化合物を有効成分として含有する、腫瘍細胞のスフェロイド形成阻害剤。
4. 　前記化合物がペタシンまたはネオペタシンである、請求項３に記載のスフェロイド形成阻害剤。
5. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の剤を含む、腫瘍細胞の転移抑制剤。
6. 　前記腫瘍細胞が、悪性黒色腫の細胞である、請求項５に記載の転移抑制剤。
7. 　前記腫瘍細胞の肺への転移を抑制する、請求項５または６に記載の転移抑制剤。
8. 　請求項１に記載の化合物を有効成分として含有する、解糖系阻害剤の作用増強剤。
9. 　前記化合物がペタシンまたはネオペタシンである、請求項８に記載の作用増強剤。
10. 　前記解糖系阻害剤が２－デオキシ－Ｄ－グルコースである、請求項８または９に記載の作用増強剤。
11. 　請求項８～１０のいずれか１項に記載の作用増強剤を含む、腫瘍の転移の抑制および／または予防用医薬組成物。
12. 　解糖系阻害剤と併用されて投与される、請求項１１に記載の医薬組成物。
13. 　前記解糖系阻害剤が２－デオキシ－Ｄ－グルコースである、請求項１２に記載の医薬組成物。
14. 　ヒト、またはペット動物に経口的に投与されて使用される、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
15. 　請求項１に記載の化合物を有効成分として含有する、腫瘍細胞転移抑制用飲食品組成物。
16. 　前記化合物がペタシンまたはネオペタシンである、請求項１５に記載の飲食品組成物。
17. 　ヒト用健康食品またはペットフード組成物である、請求項１６に記載の飲食品組成物。

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