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WO2021161893A1 - 分析方法、分析システム、及び分析用表面 - Google Patents

分析方法、分析システム、及び分析用表面 Download PDF

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Publication number
WO2021161893A1
WO2021161893A1 PCT/JP2021/004130 JP2021004130W WO2021161893A1 WO 2021161893 A1 WO2021161893 A1 WO 2021161893A1 JP 2021004130 W JP2021004130 W JP 2021004130W WO 2021161893 A1 WO2021161893 A1 WO 2021161893A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cell
molecule
analysis
linker
target capture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2021/004130
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
真寛 松本
和博 中川
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sony Group Corp
Original Assignee
Sony Group Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sony Group Corp filed Critical Sony Group Corp
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Priority to JP2022500356A priority patent/JP7647736B2/ja
Priority to US17/760,350 priority patent/US20230066282A1/en
Priority to EP21753086.4A priority patent/EP4105340A4/en
Publication of WO2021161893A1 publication Critical patent/WO2021161893A1/ja
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Priority to JP2025033736A priority patent/JP2025087797A/ja
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/02—Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • This technology relates to analytical methods, analytical systems, and analytical surfaces. More specifically, the present technology relates to an analytical method, an analytical system, and an analytical surface for obtaining the type and amount of components contained in a cell in association with the position information of the cell.
  • the type and amount of mRNA contained in the cells constituting the living tissue are measured.
  • the position information of the cell is also important. Therefore, several methods have been proposed so far for associating and acquiring the position information of cells contained in living tissues with the information of mRNA contained in the cells.
  • Non-Patent Document 1 discloses a method called Spatial transcriptomics. Probes used in this procedure include cleavage sites, T7 amplification and sequencing handles, Spatial barcodes, UMIs, and mRNA capture regions (FIG. 2 of the same article).
  • a tissue section is placed on a slide glass on which the probe is fixed, mRNA in the tissue section is captured by the molecule, and the cDNA is reverse transcribed to synthesize cDNA.
  • the synthesized cDNA is cleaved at the cleavage site, collected in a tube, and subjected to an analysis step such as sequencing.
  • an object of this technique is to provide a method capable of associating cell position information with cell components with single cell resolution.
  • the present technology includes an imaging step of imaging a sample in a state where a molecule containing a linker, a barcode sequence, and a target capture portion that can be cleaved by a stimulus is overlapped with a surface fixed via the linker.
  • the association step of associating the position of the cell with the barcode sequence of the molecule at the position
  • a cleavage step of selectively stimulating the position of the cell to cleave the linker of the molecule at the position A binding step of binding the molecule released from the surface by the cleavage to a component of the cell via a target capture portion of the molecule.
  • the specimen may include a tissue sample.
  • the position of the cell may be selectively stimulated so that the linker of the molecule at a position other than the position of the cell does not cleave.
  • the stimulus may be a light stimulus.
  • the binding step may include a moving step of moving the molecule towards the cell by applying an electric or magnetic field or centrifugal force.
  • the binding step may include a migration step of moving the molecule towards the cell by natural diffusion.
  • the binding step may include an incubation step for binding the molecule to the constituents of the cell.
  • the analytical method of the present technology may further include an analytical step of analyzing the conjugate of the molecule and the constituents of the cell after the binding step. In the analysis step, a sequencing treatment may be performed on the conjugate.
  • the analysis step may include a two-dimensional mapping step of performing two-dimensional mapping based on the association result in the association step using the analysis result and the sample image.
  • the present technology includes an analytical substrate having a surface in which a molecule containing a linker, a barcode sequence, and a target capture portion, which can be cleaved by a stimulus, is fixed via the linker.
  • An imaging device that captures a sample overlaid on the analysis substrate, and an imaging device.
  • An association part that associates the position of the selected cell in the sample image obtained by the imaging with the barcode sequence of the molecule at the position, and
  • a stimulus-imparting device that selectively stimulates the position of the cells, Including A conjugate in which a molecule released from the surface by the stimulus and a component of the cell are bound via a target capture portion of the molecule is used as an analysis target. It also provides an analysis system.
  • the specimen may include a tissue sample.
  • the stimulus-imparting device may be configured to selectively stimulate the position of the cell without cleaving the linker contained in the molecule at a position other than the position of the cell.
  • the stimulus applying device may be a light irradiation device.
  • the analysis system applies an electric field, a magnetic field, or a centrifugal force for moving the molecule released from the surface by the stimulation by the stimulation applying device toward the cell, or an electric field applying device or a magnetic field applying device or a centrifugal force. It may include an application device.
  • the analytical system may further include an incubation device for promoting the binding of the molecule released from the surface by the application of stimulation by the stimulation application device to the constituents of the cell.
  • the analysis system may further include an analyzer that analyzes the conjugate of the molecule and the constituents of the cell released from the surface by subjecting the stimulus by the stimulator.
  • the analyzer may be a sequencer.
  • the analysis system may further include a two-dimensional mapping unit that performs two-dimensional mapping based on the association result by the association unit using the analysis result by the analyzer and the sample image obtained by the imaging.
  • a molecule containing a cleaving linker, a barcode sequence, and a target capture part is fixed via the linker, and
  • the bar code sequence is used to provide information about the position where the molecule containing the bar code sequence is fixed.
  • a surface for analysis is also provided.
  • a specimen is imaged in a state where a molecule containing a linker, a barcode sequence, and a target capture part, which can be cleaved by a stimulus, is superimposed on a surface fixed via the linker. Then, using the sample image obtained by the imaging, the position of the cell contained in the sample is associated with the bar code sequence of the molecule at the position. After the association is made, the location of the cell to be analyzed is stimulated to cleave the linker of the molecule present at that location. The cleavage releases the molecule from the surface, and the molecule binds to the constituents of the cell to be analyzed via the target capture site.
  • the molecule thus bound to the constituents of the cell has a barcode sequence, and the barcode sequence is associated with the position of the cell. Therefore, by performing analysis on molecules bound to cell constituents (for example, identification of cell constituents and identification of barcode sequences), information on cell constituents is obtained in association with cell position information. be able to. Further, in the analysis method, a sample image is also acquired as described above. Therefore, for example, data on cell constituents can be mapped to a sample image.
  • the specimen may be an immobilized specimen, for example, a frozen section or an FFPE section.
  • the sample may be, for example, a tissue sample, and in particular, a living tissue sample.
  • the position of the cell is selectively stimulated, the molecule present at that position is released from the surface, and the molecule is bound to the constituent components of the cell. More preferably, in the cleavage step, the position of the cell is selectively stimulated so that the linker of the molecule at a position other than the position of the cell is not cleaved, whereby the cell composition at single cell resolution. It allows analysis of components (eg mRNA or protein). That is, the analysis method of the present technology may be an analysis method that analyzes the constituent components of cells contained in a specimen with single-cell resolution. Furthermore, the bar code sequence associated with the cell position information enables comprehensive analysis of the constituents of each cell for various cells contained in the sample.
  • a specific region can be designated based on the morphological information and immunostaining information of cells in the tissue sample, cut out with a laser or the like, and then subjected to mRNA analysis.
  • the expression information of mRNA in a tissue sample can be comprehensively performed for each cell contained in the tissue sample without cutting out the tissue sample.
  • the analysis method of the present technology may be an analysis method that analyzes the constituent components of a plurality of cells contained in a specimen with single-cell resolution.
  • Figure 1 shows an example of the flow chart of the analysis method of this technology.
  • the analysis method of the present technology may include an imaging target preparation step S101, an imaging step S102, an association step S103, a cleavage step S104, a coupling step S105, and an analysis step S106. These steps will be described below.
  • the imaging target in the imaging step S102 described later is prepared.
  • the imaging target may be a laminate obtained by stacking a sample on a surface in which a molecule containing a linker, a barcode sequence, and a target capture portion that can be cleaved by a stimulus is fixed via the linker.
  • an analytical substrate for example, a slide glass
  • a substrate on which the sample 103 is placed is a substrate on which the sample 103 is placed. It is superposed on 104 (eg, slide glass, etc.).
  • the superposition may be performed so that the surface 101 and the sample 103 face each other.
  • the surface 101 and the sample 103 may be brought into contact with each other via a buffer or the like.
  • the laminate of the analysis substrate 102 and the substrate 104 may be immersed in a buffer such as PBS.
  • the positional relationship between the substrates 102 and 104 can be fixed so that the positional relationship between the superposed surface 101 and the sample 103 is not changed in the steps described later (particularly, the imaging step S102 to the bonding step S105).
  • Molecule 100 includes a stimulatingly cleaveable linker, bar code sequence and target capture.
  • a molecule that is, a molecule containing the linker, the barcode sequence, and the target capture
  • the target-capturing molecule is a name used to mean a molecule used in the present technology, and is used in the present specification to refer to the molecule after capturing the target, for example, and a cleavage step described later. Can also be used to refer to the molecule after the linker has cleaved in.
  • the target capture molecule may be, for example, either a single molecule or a complex molecule.
  • a single molecule may mean, for example, one type of molecule having a plurality of functions, for example, as a nucleic acid portion configured as the linker, a nucleic acid moiety configured as the barcode sequence, and the target capture portion. It may be one nucleic acid (eg, DNA or RNA) containing the constituent nucleic acid moieties.
  • the complex molecule may be, for example, a molecular assembly composed of two or more kinds of molecules (for example, a conjugate of two or more kinds of molecules), for example, a nucleic acid portion configured as the linker and the barcode sequence.
  • the molecule 100 shown in FIG. 3 includes a linker 1, a recovery sequence section 2, an amplification sequence section 3, a barcode sequence section 4, a UMI (Unique molecular identifier) section 5, and a target capture section 6. Further, the molecule 100 is fixed to the surface 101 via the linker 1.
  • the recovery sequence part 2, the amplification sequence part 3, the barcode sequence part 4, and the UMI part 5 may be configured as a series of nucleic acids (particularly DNA).
  • the target capture unit 6 When the target capture unit 6 is a nucleic acid, in addition to the recovery sequence unit 2, the amplification sequence unit 3, the barcode sequence unit 4, and the UMI unit 5, the target capture unit 6 also has a series of nucleic acids (particularly, particularly). It may be configured as DNA). In these cases, for example, the end close to the fixed portion of the surface 101 and the molecule 100 may be the 5'end and the other end may be the 3'end. The components of the molecule 100 will be described below.
  • Linker 1 may be a linker that can be cleaved by a stimulus, for example, a linker that can be cleaved by a light stimulus or a temperature stimulus, and preferably a linker that can be cleaved by a light stimulus.
  • Photostimulation is particularly suitable for selectively stimulating a specific position in the cleavage step described below.
  • Linker 1 is any one selected from among arylcarbonylmethyl groups, nitroaryl groups, coumarin-4-ylmethyl groups, arylmethyl groups, metal-containing groups, and other groups, for example, as a linker that can be cleaved by photostimulation.
  • these groups for example, those described in Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy, Chem. Rev. 2013, 113, 119-191 may be used.
  • the arylcarbonylmethyl group may be a phenacyl group, an o-alkylphenacyl group, or a p-hydroxyphenacyl group.
  • the nitroaryl group may be, for example, an o-nitrobenzyl group, an o-nitro-2-phenethyloxycarbonyl group, or an o-nitroanilide.
  • the arylmethyl group may be, for example, one in which a hydroxy group has been introduced or one in which no hydroxy group has been introduced.
  • the linker 1 When the linker 1 is a linker that can be cleaved by light stimulation, the linker may be cleaved by light having a wavelength of 360 nm or more.
  • the linker may preferably be a linker that is cleaved at an energy of 0.5 ⁇ J / ⁇ m 2 or less. (Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology, Nat Methods. 2015 Jan; 12 (1): 23-6. Doi: 10.1038 / nmeth.3219.).
  • a linker that is cleaved by light of the above wavelength or the above energy it is possible to reduce cell damage (particularly DNA or RNA cleavage) that may occur when light stimulation is applied.
  • the linker 1 When the linker 1 is a linker that can be cleaved by a temperature stimulus, the linker 1 may contain, for example, a temperature-responsive polymer.
  • the temperature-responsive polymer can change from hydrophilic to hydrophobic or from hydrophobic to hydrophilic, for example, in response to temperature changes. Due to such changes, the target capture molecule can be released from surface 1.
  • the linker may be a linker that is cleaved by light in the short wavelength region, specifically, light in the wavelength region of 360 nm to 410 nm, or light in the near infrared region or infrared region, specifically. It may be a linker that is cleaved by light in a wavelength region of 800 nm or more. If the linker is a linker that is efficiently cleaved by light having a wavelength in the visible light region, it may be difficult to handle the surface for analysis. Therefore, the linker is preferably a linker that is cleaved by the light in the short wavelength region or the light in the near infrared region or the infrared region.
  • the recovery sequence unit 2 contains nucleic acid used for recovering the molecule 100 released from the surface 101 in the analysis step described later.
  • the nucleic acid may be DNA or RNA, in particular DNA.
  • the sequence of nucleic acid contained in the recovery sequence portion 2 is complementary to the sequence of nucleic acid 8 immobilized on the beads 9.
  • the bead 9 on which a plurality of nucleic acids 8 are immobilized can efficiently recover the molecule 100 having the recovery sequence portion 2.
  • the base sequence of the nucleic acid contained in the recovery sequence unit 2 may be appropriately set by those skilled in the art.
  • the amplification sequence unit 3 may include, for example, a nucleic acid having a primer sequence used for amplification of nucleic acid or a promoter sequence used for transcription of nucleic acid in the analysis step described later.
  • the nucleic acid may be DNA or RNA, in particular DNA.
  • the amplification sequence unit 3 may have both a primer sequence and a promoter sequence.
  • the primer sequence may be, for example, a PCR handle.
  • the promoter sequence may be, for example, a T7 promoter sequence.
  • the barcode sequence unit 4 contains a nucleic acid having a barcode sequence.
  • the nucleic acid may be DNA or RNA in particular, and more particularly DNA.
  • the barcode sequence is used, for example, to identify the location of the target capture molecule on the surface 101.
  • the barcode sequence can be used as an identifier to distinguish a target capture molecule containing a certain barcode sequence from a target capture molecule containing another barcode sequence.
  • the barcode sequence may be associated with information regarding the position where the target capture molecule containing the barcode sequence is fixed (hereinafter, also referred to as “position information”).
  • the position information may be for specifying a position on the surface 101, and is, for example, information about XY coordinates, but is not limited thereto.
  • An ID number may be assigned to the barcode array associated with the location information.
  • the ID number can be used in the steps after the imaging step.
  • the ID number may have a one-to-one correspondence with the bar code sequence, and may be used as data corresponding to the bar code sequence in the steps after the imaging step.
  • a plurality of target capture molecules immobilized in a certain region of the surface 101 may have the same barcode sequence.
  • the certain area is associated with the barcode sequence.
  • the target capture molecule containing the barcode sequence can be associated with the location of one cell.
  • the surface used in the analysis method of the present technology may have a plurality of regions in which a plurality of target capture molecules having the same barcode sequence are fixed.
  • the barcode array may be different for each region.
  • the size of each region can be preferably smaller than the size of the cells, for example 50 ⁇ m or less, preferably 10 ⁇ m or less, more preferably 5 ⁇ m or less.
  • a target capture molecule containing a barcode sequence of known sequence can be immobilized in a predetermined region.
  • the surface 101 has a plurality of regions, and a plurality of target capture molecules immobilized on each of the plurality of regions may contain the same barcode sequence.
  • the plurality of regions may be set smaller than the size of the cell to be analyzed.
  • each of the plurality of regions can be associated with the barcode sequence contained in the plurality of target capture molecules fixed in each region.
  • the region in which the target capture molecule containing the same barcode sequence is fixed is also referred to as a spot in the present specification.
  • the spot size can be, for example, 50 ⁇ m or less, preferably 10 ⁇ m or less, more preferably 5 ⁇ m or less.
  • the surface 101 configured as described above has a barcode sequence contained in a certain target capture molecule and a position where the target capture molecule exists at the time when the target capture molecule is immobilized on the surface 101. Can be associated with.
  • biotin is bound to the linker 1 of the target capture molecule and streptavidin is bound to the surface 101 on which the target capture molecule is fixed, and the biotin and the streptavidin are bound to each other.
  • the target capture molecule is immobilized on the surface 101.
  • target capture molecules containing a barcode sequence may be randomly placed on the surface 101.
  • the barcode contained in the fixed target capture molecule is read to read the barcode contained in a certain target capture molecule.
  • the sequence is associated with the location where the target capture molecule is located.
  • the reading can be performed by a method such as Sequencing By Synthesis, sequencing by ligation, or sequencing by hybridization.
  • beads for example, gel beads
  • the beads for example, gel beads
  • the size of the beads can be, for example, 50 ⁇ m or less, preferably 10 ⁇ m or less, more preferably 5 ⁇ m or less.
  • a combination of, for example, biotin and streptavidin may be used to attach the target capture molecule to the beads (eg, gel beads).
  • biotin is bound to the linker 1 of the target capture molecule
  • streptavidin is bound to the beads
  • the biotin and the streptavidin are bound to immobilize the target capture molecule on the beads.
  • the surface 101 may be provided with a plurality of recesses.
  • One spot or one bead according to the embodiment may be arranged in each of the plurality of recesses.
  • the spots or beads can be more easily placed on the surface 101 in the plurality of recesses.
  • the size of the recess is preferably a size in which one bead can be inserted, for example.
  • the shape of the recess may be circular, elliptical, hexagonal, or quadrangular, but is not limited thereto.
  • the surface state of the surface portion of the surface 101 on which the spot or the beads are arranged may be different from that of other surface portions.
  • the surface portion on which the spot or the beads are arranged may be hydrophilic and the other surface portion may be hydrophobic, or the other surface portion may be hydrophobic and have a convex portion. You may.
  • the method for imparting hydrophilicity to the surface include reactive ion etching in the presence of oxygen and irradiation with deep ultraviolet light in the presence of ozone. In these methods, a mask through which the portion imparting hydrophilicity is penetrated can be used.
  • a silicone spray spray-on-silicone
  • Techspray 2101-12S or the like
  • a mask through which the portion imparting hydrophobicity is penetrated can be used.
  • the target capture molecule can also be synthesized on a substrate by using, for example, a DNA microarray production technique.
  • a molecule for target capture can be synthesized at a specific position by using a technique such as DMD (Digital Mircomirror Device), a liquid crystal shutter, or a spatial optical phase modulator used in photolithography.
  • DMD Digital Mircomirror Device
  • a liquid crystal shutter or a spatial optical phase modulator used in photolithography.
  • the method for the synthesis is described in, for example, Basic Concepts of Microarrays and Potential Applications in Clinical Microbiology, CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, Oct. 2009, p. 611-633.
  • the target capture molecule When the target capture molecule is synthesized on the substrate by the synthesis, the information on the position where the target capture molecule is synthesized is acquired when the target capture molecule is synthesized, and the barcode sequence and the position information are obtained. Is associated with. At that time, an ID number may be assigned.
  • any of the target capture molecules immobilized on the surface may contain a common oligo sequence.
  • a nucleic acid having a sequence complementary to the oligo sequence and fluorescently labeled it is possible to confirm the position where the target capture molecule is fixed (particularly, the position of the spot or the position of the bead). It can be confirmed, especially in the dark field.
  • the fluorescent label makes it easy to grasp the position where the target capture molecule is fixed.
  • the UMI part 5 may contain nucleic acids, in particular DNA or RNA, and more particularly DNA.
  • the UMI part 5 may have a sequence of, for example, 5 to 30 bases, particularly 6 to 20 bases, and more particularly 7 to 15 bases.
  • the UMI part 5 may be configured to have different sequences from each other among the target capture molecules immobilized on the surface 101. For example, when the UMI part has a nucleic acid sequence of 10 bases, the type of UMI sequence is 4 to the 10th power, that is, 1 million or more.
  • the UMI part 5 can be used to quantify the target molecule. For example, a UMI sequence is added to the cDNA obtained by reverse transcription of mRNA.
  • cDNAs obtained by amplifying a cDNA transcribed from one mRNA molecule have the same UMI sequence, but many obtained by amplifying a cDNA transcribed from another mRNA molecule having the same sequence as the mRNA.
  • the cDNA has a different UMI sequence. Therefore, the number of copies of mRNA can be determined by counting the number of types of UMI sequences having the same cDNA sequence.
  • the UMI part 5 may be configured to have different sequences from each other among a plurality of target capture molecules containing the same barcode sequence immobilized on the spot or the beads. That is, the plurality of target capture molecules immobilized on the spot or the beads may have the same barcode sequence but different UMIs from each other.
  • the target capture unit 6 includes components for capturing molecules contained in cells.
  • the component can be, for example, a nucleic acid or protein.
  • the nucleic acid may be, for example, a poly T sequence in order to comprehensively capture the mRNA contained in the cell.
  • the nucleic acid may have a sequence complementary to the target sequence.
  • the component is a protein
  • the protein may be, for example, an antibody.
  • the component may be an aptamer or a molecularly imprinted polymer.
  • the target capture unit 6 may include two or more types of components for capturing molecules contained in cells.
  • the target capture unit 6 may contain both proteins and nucleic acids, for example both antibodies and poly T sequences. This allows both protein and mRNA to be detected simultaneously.
  • the surface 101 may preferably be the surface of a transparent substrate.
  • the substrate may be entirely transparent, or only the portion on which the target capture molecule is immobilized may be transparent.
  • the surface of the substrate is preferably flat in order to make good contact with the specimen.
  • the transparent substrate may be, for example, a glass substrate or a resin substrate.
  • the substrate may be, for example, a slide glass.
  • Specimen 4 may be, for example, a sample containing cells, and more particularly an immobilized sample containing cells.
  • the specimen may be a living tissue specimen, in particular a frozen tissue specimen or an FFPE (formalin-fixed paraffin-embedded) specimen, and more particularly a frozen tissue section or an FFPE section.
  • the sample 4 may be mounted on a substrate, for example, and may be a surface of a transparent substrate in particular.
  • the substrate may be entirely transparent, or only the portion on which the specimen is placed may be transparent.
  • the transparent substrate may be, for example, a glass substrate or a resin substrate.
  • the substrate may be, for example, a slide glass.
  • the surface of the substrate is preferably flat in order to make good contact with the surface on which the target capture molecule is immobilized.
  • Specimen 4 may be stained to facilitate the segmentation of cells described below.
  • the staining may be, for example, cell membrane staining, HE (Hematoxylin Eosin) staining, DAPI staining, or a combination of two or more of these.
  • HE Hematoxylin Eosin
  • DAPI staining a cell membrane staining reagent that is incorporated into a lipid bilayer and emits fluorescence may be used, and the reagent may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the HE stain is used for brightfield observation and can be used, for example, to identify cell morphology.
  • the DAPI staining can be used for nuclear staining.
  • the sample 103 is imaged in a state where the surface 101 and the sample 103 are overlapped with each other.
  • the imaging can be performed with a resolution that can be recognized by the individual cells contained in the sample 103.
  • the image sensor 110 may be, for example, a CCD or CMOS.
  • the image pickup may be performed by, for example, the image pickup element 110 via the objective lens 111. That is, the image captured can be a microscope image.
  • the magnification of the objective lens 111 may be appropriately selected according to the size of the cells.
  • the imaging may be an imaging in a bright field or a dark field, or both a bright field image and a dark field image may be performed.
  • the imaging may be performed once or multiple times, eg, once or multiple times for a portion of the area selected by the user or control unit, or to cover the entire or part of the sample 103. It may be performed once or multiple times.
  • the image pickup by the image pickup device 110 can be controlled by a control unit (not shown) connected to the image pickup device 110.
  • the control unit may be composed of, for example, a hard disk, a CPU, and a memory, and the function of the control unit can be realized by, for example, a general-purpose computer or an information processing device. Further, the control unit may be provided in the image pickup device 110.
  • the image pickup device including the control unit may be configured as, for example, a one-chip semiconductor device having a laminated structure in which a plurality of dies (for example, two or three dies) are laminated. One of the dies includes a plurality of pixels arranged two-dimensionally side by side.
  • the remaining dies may be equipped with components (eg, CPU and memory) for realizing the functions of the control unit.
  • the image sensor including the control unit for example, the image sensor disclosed in International Publication No. 2018/051809 can be mentioned.
  • an image sensor provided with a control unit as the image sensor, various processes can be performed without outputting the sample image data to the outside of the image sensor, which leads to high speed of information processing.
  • the image pickup device 110 can transmit the sample image data obtained by the image pickup to the control unit.
  • the control unit receives the sample image data and uses the sample image data in the subsequent steps. Further, the sample image data received by the control unit may be stored in, for example, a storage unit connected to the control unit.
  • the storage unit may be a general-purpose storage device. When the control unit performs the subsequent steps, the sample image data can be acquired from the storage unit.
  • the position of the cell and the bar code sequence of the target capture molecule at the position are associated with each other by using the sample image obtained by the imaging in the imaging step S102.
  • the association may be made via the location information previously associated with the barcode array.
  • the cell position and the ID number may be associated with each other. Thereby, the cell position and the barcode sequence can be associated with each other via the ID number.
  • the position of the cell may mean the area occupied by the cell in the sample image.
  • Image processing on the sample image may be performed to identify the region, for example cell segmentation.
  • Cell segmentation facilitates the identification of target-capturing molecules present at the location of the cell.
  • the position information of the cell to be analyzed among the cells in the sample image is acquired.
  • the cell position information may be acquired using the image data obtained by the above segmentation. Since the sample image is taken by superimposing the surface 101 and the sample 103, the position information of the cell corresponds to the position information of the target capture molecule at the position of the cell.
  • the position information of the target capture molecule is associated with the barcode sequence included in the target capture molecule in the imaging target preparation step S101. Therefore, by acquiring the position information of the cell in the sample image, the position of the cell can be associated with the barcode sequence contained in the target capture molecule at the position.
  • the association can be made so that one barcode sequence is not associated with the location of two or more cells.
  • one barcode sequence is not associated with the location of two or more cells.
  • the bar code sequence of the target capture molecule immobilized on the one spot is not associated with any position of the two or more cells.
  • the cells in the tissue sample can be visually recognized as shown in the center of FIG. It will be possible.
  • the specimen is imaged so as to be superimposed on the surface for analysis, and is imaged in a state where a large number of circular spots are overlapped, for example, as shown on the right side of FIG. In each circular spot, there are a plurality of target capture molecules having the same barcode sequence. On the right side of FIG. 4, a large number of circular spots are shown for better understanding, but these spots may not be visible or may be visible in the image acquired by the image sensor. When the position of the spot cannot be confirmed in the sample image, the position of the spot may be displayed in the sample image by image processing.
  • the association is performed with respect to the spot indicated by the solid circle. ..
  • the solid circle exists within the region of the image of one cell.
  • spots existing in the region of the image of one cell can be the target of association.
  • the dotted circle overlaps, for example, two or more cells, straddles the cell and the region outside the cell, or exists outside the region of the cell image. These dotted circles do not have to be associated.
  • the association step S103 can be performed, for example, by the control unit.
  • the control unit may associate the location of a cell with the bar code sequence of the molecule at the location of the cell for all or some of the cells present in the sample image.
  • the control unit can identify the cells with which the associations are made, for example, based on cell characteristics (shape, size, color, or pattern, or a combination thereof). For example, in the image shown in the center of FIG. 4, for the cell shown in dark gray, the cell position is associated with the bar code sequence of the target capture molecule at that position, while the cell shown in light gray.
  • the association may be made only for a specific type of cell, such as not making the association.
  • the association step S103 can be performed without outputting the sample image data to the outside of the image sensor. As a result, the association step S103 can be processed at a higher speed.
  • the association step S103 may be performed based on the user operation. For example, from among the cells existing in the sample image, the user selects the cells that he / she wishes to associate with, for example, by clicking the mouse. Then, for the cell selected by the user, the control unit can associate the position of the cell with the barcode sequence of the target capture molecule at the position.
  • the position of the cell is selectively stimulated to cleave the linker of the molecule at the position.
  • the stimulation applying device 130 can irradiate the position of the selected cell with light.
  • the position where the stimulus is given may be the position of a part of the cells associated in the association step S103, or may be the position of all the cells associated with the association.
  • the location of the cell is selectively stimulated so that the linker of the target capture molecule located at a location other than the location of the cell is not cleaved.
  • the stimulus-imparting device 130 is preferably configured to selectively irritate in this way. That is, in the cleavage step S104, the linker of the target capture molecule containing the unassociated barcode sequence does not have to be cleaved.
  • all the spots shown by the solid circles associated with each other may be stimulated.
  • stimulation may be applied to all positions of the associated cells.
  • it is shown at the position indicated by the solid circle spot in the cell indicated by dark gray, or by the solid circle spot in the cell indicated by light gray.
  • the stimulus may be given to the position where the stimulus is applied. In this way, the location of some of the associated cells (particularly certain types of cells) may be stimulated.
  • the stimulus is applied to the position indicated by the solid circle spot in one or more cells selected from the associated cells. You can. In this way, the position of some of the associated cells (particularly selected cells) may be stimulated.
  • Cleavage of the linker in step S104 releases the target capture molecule from the surface 101.
  • the cleavage of the linker 1 of the molecule 100 releases the molecule 100 from the surface 101.
  • the stimulus may be, for example, a light stimulus or a temperature stimulus (also referred to as a thermal stimulus), and may be a light stimulus.
  • Light stimulation is particularly suitable for selectively stimulating a specific narrow area.
  • the cleavage step S104 may be performed by, for example, the control unit. More specifically, the control unit can drive a stimulus-imparting device to selectively irradiate a cell position.
  • a stimulus applying device that can be adopted will be described below.
  • a light irradiation device can be used as the stimulation application device 130.
  • the light irradiation device may be, for example, a DMD (Digital Micromirror Device) or a liquid crystal display device.
  • the micromirrors that make up the DMD can irradiate a selected position on the surface 101 with light.
  • the liquid crystal display device may be, for example, a reflective liquid crystal display, and SXRD (Sony Corporation) can be mentioned as a specific example. By controlling the liquid crystal of the liquid crystal display device, it is possible to irradiate a selected position on the surface 101 with light.
  • a liquid crystal shutter or a spatial light modulator may be used to selectively apply light stimulation to the position of cells. These also make it possible to give a light stimulus to the selected position.
  • the wavelength of the irradiated light may be appropriately selected by those skilled in the art depending on the type of linker contained in the target capture molecule.
  • a combination of infrared light and an infrared light absorbing material can be used to selectively give a temperature stimulus to the cell position.
  • an infrared laser light generator can be adopted as the stimulus applying device.
  • a substrate 102 having a surface 101 is formed from an infrared light absorbing material, and the cell position is selectively irradiated with infrared light by an infrared laser light generator, thereby selectively stimulating the cell position with temperature. Can be given.
  • the target capture molecule released from the surface 101 by cleavage in step S104 is bound to the constituent components of the cell via the target capture portion of the target capture molecule.
  • the cell component 7 can bind to the target capture portion 6 of the target capture molecule 100 in the cell.
  • the binding step S105 may include a moving step of moving the target capturing molecule toward the cell by applying an electric field, a magnetic field, or a centrifugal force.
  • an electric field can be applied by arranging a laminate of substrates 102 and 104 between facing electrodes.
  • a metal thin film having a thickness that does not interfere with bright-field observation or dark-field observation (particularly fluorescence observation) or a transparent electrode such as ITO (Indium Tin Oxide) may be arranged on the substrate 102 and the substrate 104.
  • a device known in the art may be adopted as an electric field applying device for applying an electric field, a magnetic field applying device for applying a magnetic field, or a centrifugal force applying device for applying a centrifugal force.
  • the centrifugal force applying device include a swing rotor type centrifugal force applying device.
  • the application of electric or magnetic fields or centrifugal force by these devices may be controlled by, for example, a control unit.
  • the binding step S105 may include a transfer step of moving the target capture molecule toward the cell by natural diffusion.
  • a transfer step of moving the target capture molecule toward the cell by natural diffusion.
  • the transfer step preferably comprises applying an electric field, which can increase the probability that the liberated target capture molecule will be incorporated into the cell.
  • the binding step S105 may include an incubation step for binding the target capture molecule to the constituents of the cell.
  • the time and temperature of the incubation step may be selected depending on the target capture unit and the cell components captured by the target capture unit.
  • the incubation step can be performed, for example, with the surface 101 and the sample filled with a buffer.
  • the target capture unit and the cell constituent are both nucleic acids, for example, in a constant temperature bath at 30 ° C. to 40 ° C., particularly 30 ° C. to 37 ° C., for example, 5 hours to 30 hours, particularly 16 hours to Incubation can be done in 24 hours.
  • the target capture unit is an antibody and the cell component is a component captured by the antibody, for example, at 0 ° C. to 30 ° C., particularly 4 ° C. to room temperature (for example, 25 ° C.), for example, 5 hours. Incubation can be performed for up to 30 hours, especially 16 to 24 hours.
  • the target capture molecule may be taken up into the cell or may bind to the cell surface. Then, the target capture molecule binds to a component of the cell via the target capture portion of the target capture molecule. The surface 101 and the sample 103 are then separated and the unbound target capture molecules are removed by washing. As a washing method, the sample 103 may be immersed in a buffer or the like.
  • the conjugate produced by the binding of the target capture molecule and the cell constituent in the binding step S105 can be analyzed.
  • analysis can be performed using the analyzer 200.
  • a sequencing process may be performed on the conjugate, and the analyzer 200 may be a sequencer.
  • the sequencing process can be performed, for example, when the cell component is a nucleic acid, particularly DNA or RNA, more particularly mRNA.
  • the sequencing process may be performed by a sequencer, or may be performed by a next-generation sequencer or a sequencer by the Sanger method. In order to perform comprehensive analysis of the cells constituting the tissue at a higher speed, the sequencing process can be performed by a next-generation sequencer.
  • the analysis step may further include a step of preparing a nucleic acid (for example, cDNA) to be sequenced and a step of purifying the nucleic acid.
  • a library for performing next-generation sequencing treatment may be prepared.
  • recovery sequence 2 can be used, for example, as shown in FIG. 3 (D).
  • the molecule 100 to which the cell constituent 7 is bound can be recovered by using the beads 9 on which the nucleic acid having a sequence complementary to the nucleic acid sequence contained in the recovery sequence portion 2 is fixed.
  • the laminate of the substrates 102 and 104 after binding in the binding step S105 can be washed with a buffer such as PBS to remove unbound target capture molecules. Then, the substrate 102 is removed from the substrate 104, and the cells incorporating the target capture molecule may be subjected to, for example, a cDNA synthesis step of synthesizing cDNA from mRNA and an amplification step of amplifying the synthesized cDNA. .. Prior to the cDNA synthesis step and the amplification step, a lysis step of lysing the cells may be performed. By recovering the conjugate of the target capture molecule and the target after the dissolution step, the cDNA synthesis step and the amplification step can be performed more efficiently.
  • a buffer such as PBS
  • a purification step of purifying the nucleic acid obtained in the preparation step may be performed.
  • the purification step may include decomposition treatment of components other than nucleic acids using an enzyme such as proteinase K.
  • a nucleic acid recovery process may be performed in the purification step.
  • a commercially available nucleic acid purification reagent may be used, and examples thereof include magnetic beads such as AM PureXP.
  • intracellular dsDNA can also be recovered, but dsDNA can be prevented from being sequenced in the sequencing process. For example, by including the adapter sequence for sequencing processing (particularly for next-generation sequencing processing) in the target capture molecule, only the nucleic acid containing the adapter sequence can be sequenced.
  • the cell constituents can be analyzed for each cell based on the result of the sequencing treatment. For example, in the analysis step S106, the sequence of mRNA contained in the cell and / or the number of copies of each mRNA can be determined for each cell. Further, in the analysis step S106, the type and / or number of antigens or the type and / or number of transcription factors can be determined for each cell. Such analysis of cell components for each cell can be performed based on the barcode sequence in the sequence determined by the sequence treatment. For example, an array containing the same barcode sequence is selected from a large number of sequences determined by sequence processing. Sequences containing the same barcode sequence are based on target capture molecules incorporated into a single cell. Therefore, analyzing the cell constituents for each barcode sequence means analyzing the cell constituents for each cell.
  • the analysis step S106 may include a two-dimensional mapping step of performing two-dimensional mapping based on the association result in the association step S103 using the analysis result and the sample image.
  • the analysis result of the cell constituents for each cell can be mapped to the sample image obtained in the imaging step based on the position information associated with the barcode sequence.
  • the mapping for example, as shown in FIG. 2 (E), a sample image (above (E) in FIG. 2) and a mapping image showing the distribution of types of cell constituents at each position in the sample image ( (Under (E) in FIG. 2) can be obtained. From the image obtained by the mapping, it is possible to grasp which cell at which position contains which molecule and in what amount. That is, it is possible to combine the position information obtained by imaging and the quantitative information obtained by sequence analysis, and it is possible to comprehensively analyze the molecules in the tissue sample while retaining the spatial information by single cell resolution.
  • Figure 5 shows an example of a block diagram of the analysis system of this technology.
  • the analysis system 10 of the present technology includes an analysis substrate 102, an image sensor 110, a control unit 120, a storage unit 125, and a stimulus application device 130.
  • the analysis substrate 102, the image sensor 110, and the stimulus applying device 130 are described in the above 1. It may be as described in the above, and the description also applies to the present embodiment.
  • the control unit 120 is described in 1. above. It may be the control unit described in the above, and the description also applies to the present embodiment.
  • the control unit 120 may include, for example, an image processing unit 121, an association unit 122, and a stimulus control unit 123. These will be described in more detail below.
  • the image processing unit 121 processes the sample image acquired by the image sensor 110.
  • the image processing unit 121 is, for example, described in 1. above.
  • the cell segmentation described in the above can be performed.
  • the image processing unit 121 can identify the cells to be associated in the association step from the cells existing in the sample image.
  • the identification can be made, for example, based on cell characteristics (shape, size, color, or pattern, or a combination thereof).
  • the identification may be performed based on the color data in the image. For example, a cell that emits a certain fluorescence can be identified as a cell to be associated in the association step.
  • the association unit 122 associates the position of the cell with the bar code sequence of the target capture molecule at the position of the cell.
  • the association may be made using the image obtained by the above segmentation. For example, the association unit 122 acquires cell position data based on a sample image, identifies a barcode sequence to which position data corresponding to the position data is assigned, and associates the barcode sequence with the cell position. sell.
  • the association unit 122 may associate the position of a cell with the bar code sequence of the target capture molecule at the position of the cell for all cells in the sample image, or some cells in the sample image. You may go about. For example, the association unit 122 may make the association only for some types of cells among all the cells existing in the sample image, or may make the association only for the cells existing in a part region.
  • the stimulus control unit 123 causes the stimulus applying device 130 to selectively stimulate the position of the cell associated with the association unit 122.
  • the stimulus control unit 123 may drive the stimulus application device 130 to stimulate all or a part of the cells associated by the association unit 122.
  • the stimulus-imparting device 130 is preferably configured to selectively stimulate the cell position without cleaving the linker contained in the target capture molecule at a position other than the cell position. ..
  • the stimulus applying device 130 preferably has the above 1. This is the light irradiation device described in the above.
  • the control unit 120 may be composed of, for example, a hard disk, a CPU, and a memory, and the function of the control unit can be realized in, for example, a general-purpose computer or an information processing device.
  • the functions of the image processing unit 121, the association unit 122, and the stimulus control unit 123 can also be realized by a general-purpose computer or an information processing device.
  • the control unit 120 may be provided in the image sensor 110.
  • an image sensor provided with a control unit as the image sensor, various processes can be performed without outputting the sample image data to the outside of the image sensor, which leads to high speed of information processing.
  • the processing by the image processing unit 121, the association unit 122, and the stimulus control unit 123 described above can be performed at higher speed.
  • an electric field or a magnetic field for moving the target capture molecule released from the surface of the analysis substrate 102 toward the cell by applying the stimulus by the stimulus application device 130 is applied. It may include an electric or magnetic field applying device or a centrifugal force applying device that applies centrifugal force. The device allows the target capture molecule to be more efficiently taken up by the cell.
  • the analysis system 10 is described in 1. above.
  • the incubation device may include, for example, a constant temperature bath.
  • the analysis system 10 is described in 1. above.
  • an analyzer for analyzing the conjugate of the target capture molecule released from the surface of the analysis substrate 102 and the cell constituent component by the application of the stimulus by the stimulus application device 130 may be further included.
  • the analyzer can be, for example, a sequencer.
  • the sequencer may be, for example, a next-generation sequencer or a sequencer that performs sequencing by the Sanger method.
  • the analysis system 10 may further include a two-dimensional mapping unit that performs two-dimensional mapping based on the association result by the association unit using the analysis result by the analyzer and the sample image.
  • the two-dimensional mapping unit may be configured as one element of the control unit 120, for example, 1.
  • the two-dimensional mapping step described in the above can be performed.
  • the two-dimensional mapping unit can map information about, for example, cell components to a sample image.
  • the information about the constituents of the cell may be, for example, the type or amount of the constituents of the cell. From the image obtained by the mapping, it is possible to grasp which cell at which position contains which molecule and in what amount. That is, it is possible to combine the position information obtained by imaging and the quantitative information obtained by sequence analysis, and it is possible to comprehensively analyze the molecules in the tissue sample while retaining the spatial information by single cell resolution.
  • the analysis system 10 may further include an output unit.
  • the output unit may include, for example, a display device and / or a printing device.
  • the control unit 120 can output an image obtained by performing an analysis method according to the present technology, such as a sample image acquired by the image sensor 110 and a mapping image generated by the two-dimensional mapping unit, to the output unit. Further, the control unit 120 can output the analysis result (for example, the sequencing processing result) by the analyzer to the output unit.
  • a target capture molecule containing a cleavable linker, a barcode sequence, and a target capture portion is fixed via the linker, and the barcode sequence is a molecule containing the barcode sequence.
  • an analytical surface used to provide information about the fixed position. Examples of the surface for analysis include the above 1. It is the surface 101 of the analysis substrate 102 described in the above, and the description of the surface also applies to the present embodiment.
  • the present technology can also have the following configuration.
  • An imaging step in which a sample is imaged in a state where a molecule containing a linker, a barcode sequence, and a target capture portion that can be cleaved by a stimulus is overlapped with a surface fixed via the linker.
  • the association step of associating the position of the cell with the barcode sequence of the molecule at the position
  • a cleavage step of selectively stimulating the position of the cell to cleave the linker of the molecule at the position.
  • a binding step of binding the molecule released from the surface by the cleavage to a component of the cell via a target capture portion of the molecule.
  • Analytical methods including.
  • [2] The analytical method according to [1], wherein the sample contains a tissue sample.
  • [3] The analysis according to [1] or [2], wherein in the cleavage step, the position of the cell is selectively stimulated so that the linker of the molecule at a position other than the position of the cell is not cleaved. Method.
  • [4] The analysis method according to any one of [1] to [3], wherein the stimulus is a light stimulus.
  • the binding step includes a moving step of moving the molecule toward the cell by applying an electric field, a magnetic field, or a centrifugal force.
  • [6] The analysis method according to any one of [1] to [4], wherein the binding step includes a moving step of moving the molecule toward the cell by natural diffusion.
  • [9] The analysis method according to [8], wherein the sequencing process is performed on the conjugate in the analysis step.
  • Analysis system [12] The analytical system according to [11], wherein the sample contains a tissue sample. [13] The stimulus-imparting device is configured to selectively stimulate the position of the cell without cleaving the linker contained in the molecule at a position other than the position of the cell. [11] ] Or [12].
  • the analysis system according to any one of [11] to [13], wherein the stimulus applying device is a light irradiation device.
  • An electric field or magnetic field or a magnetic field applying device for applying an electric field, a magnetic field, or a centrifugal force for moving the molecules released from the surface by the stimulation applied by the stimulation applying device toward the cells.
  • the analytical system further includes an incubation device for promoting the binding of the molecule released from the surface by the stimulus applied by the stimulus-imparting device to the constituents of the cell [11] to [15]. ]
  • the analysis system further includes an analyzer that analyzes a combination of the molecule released from the surface and a constituent of the cell by applying a stimulus by the stimulus-imparting device [11] to [16].
  • the analysis system described in any one of. [18]
  • the analysis system further includes a two-dimensional mapping unit that performs two-dimensional mapping based on the association result by the association unit using the analysis result by the analysis device and the sample image obtained by the imaging. 17] or [18].
  • a molecule containing a cleavable linker, a barcode sequence, and a target capture part is fixed via the linker, and The bar code sequence is used to provide information about the position where the molecule containing the bar code sequence is fixed. Analytical surface.

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Abstract

シングルセル分解能で細胞の位置情報と細胞成分とを関連付けることを可能とする手法を提供することを目的とする。　本技術は、刺激によって開裂可能なリンカーとバーコード配列と標的捕捉部とを含む分子が前記リンカーを介して固定されている表面と重ねた状態で標本を撮像する撮像工程と、前記撮像により得られた標本画像を用いて、細胞の位置と当該位置にある分子のバーコード配列とを関連付ける関連付け工程と、前記細胞の位置に選択的に刺激を与えて、当該位置にある前記分子のリンカーを開裂させる開裂工程と、前記開裂によって前記表面から遊離した前記分子を、当該分子の標的捕捉部を介して前記細胞の構成成分に結合させる結合工程と、を含む分析方法を提供する。

Description

分析方法、分析システム、及び分析用表面
　本技術は、分析方法、分析システム、及び分析用表面に関する。より詳細には、本技術は、細胞に含まれる成分の種類及び量を細胞の位置情報と関連付けて取得するための分析方法、分析システム、及び分析用表面に関する。
　生体組織を分析するために、生体組織を構成する細胞に含まれるｍＲＮＡの種類及び量を測定することが行われている。生体組織の分析においては、細胞に含まれるｍＲＮＡの種類及び量に加えて、当該細胞の位置情報も重要である。そこで、生体組織に含まれる細胞の位置情報と当該細胞に含まれるｍＲＮＡの情報とを関連付けて取得するための手法がこれまでにいくつか提案されている。
　例えば、下記非特許文献１には、Spatial transcriptomicsと呼ばれる手法が開示されている。当該手法において用いられるプローブは、開裂部位、Ｔ７増幅及びシークエンシングハンドル、Spatial barcode、ＵＭＩ、及びｍＲＮＡ捕捉領域を含む（同文献の図２）。当該手法では、当該プローブが固定されたスライドガラス上に組織切片が配置され、当該組織切片中のｍＲＮＡが当該分子により捕捉され、そして、逆転写されてｃＤＮＡが合成される。合成されたcDNAは、開裂部位で開裂され、チューブに回収され、シーケンスなどの分析工程に供される。
Patrik L. Stahl et al., Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics, Science, 1 July 2016, Vol.353, Issue 6294, pp.78-82
　細胞の位置情報と当該細胞に含まれる成分の情報との関連付けを、生体組織を構成する細胞毎に行うことができれば、生体組織のより詳細な分析が可能となると考えられる。そこで、本技術は、シングルセル分解能で細胞の位置情報と細胞成分とを関連付けることを可能とする手法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、特定の分析方法によって上記課題を解決できることを見出した。
　すなわち、本技術は、刺激によって開裂可能なリンカーとバーコード配列と標的捕捉部とを含む分子が前記リンカーを介して固定されている表面と重ねた状態で標本を撮像する撮像工程と、
　前記撮像により得られた標本画像を用いて、細胞の位置と当該位置にある分子のバーコード配列とを関連付ける関連付け工程と、
　前記細胞の位置に選択的に刺激を与えて、当該位置にある前記分子のリンカーを開裂させる開裂工程と、
　前記開裂によって前記表面から遊離した前記分子を、当該分子の標的捕捉部を介して前記細胞の構成成分に結合させる結合工程と、
　を含む分析方法を提供する。
　前記標本は組織サンプルを含みうる。
　前記開裂工程において、前記細胞の位置以外の位置にある分子のリンカーが開裂しないように、前記細胞の位置に選択的に刺激が与えられてよい。
　前記刺激は、光刺激であってよい。
　前記結合工程は、電場又は磁場又は遠心力の印可によって前記分子を前記細胞に向かって移動させる移動工程を含みうる。
　前記結合工程は、自然拡散によって前記分子を前記細胞に向かって移動させる移動工程を含みうる。
　前記結合工程は、前記分子と前記細胞の構成成分とを結合させるためのインキュベート工程を含みうる。
　本技術の分析方法は、前記結合工程後に、前記分子と前記細胞の構成成分との結合体に対する分析を行う分析工程をさらに含みうる。
　前記分析工程において、前記結合体に対するシークエンシング処理が行われてよい。
　前記分析工程は、前記分析結果と前記標本画像とを用いて、前記関連付け工程における関連付け結果に基づき２次元マッピングを行う２次元マッピング工程を含みうる。
　また、本技術は、刺激によって開裂可能なリンカーとバーコード配列と標的捕捉部とを含む分子が前記リンカーを介して固定されている表面を有する分析用基板と、
　前記分析用基板に重ねられた標本を撮像する撮像装置と、
　前記撮像により得られた標本画像中の選択された細胞の位置と当該位置にある分子のバーコード配列とを関連付ける関連付け部と、
　前記細胞の位置に選択的に刺激を与える刺激付与装置と、
　を含み、
　前記刺激によって前記表面から遊離した分子と前記細胞の構成成分とが前記分子の標的捕捉部を介して結合した結合体を分析対象として用いる、
　分析システムも提供する。
　前記標本は組織サンプルを含みうる。
　前記刺激付与装置は、前記細胞の位置以外の位置にある分子に含まれるリンカーを開裂させることなく、前記細胞の位置に選択的に刺激が与えられるように構成されていてよい。
　前記刺激付与装置は光照射装置であってよい。
　前記分析システムは、前記刺激付与装置による刺激の付与によって前記表面から遊離した前記分子を前記細胞に向かって移動させるための電場又は磁場又は遠心力を印可する電場印可装置又は磁場印可装置又は遠心力印加装置を含みうる。
　前記分析システムは、前記刺激付与装置による刺激の付与によって前記表面から遊離した前記分子が前記細胞の構成成分と結合することを促すためのインキュベーション装置をさらに含みうる。
　前記分析システムは、前記刺激付与装置による刺激の付与によって前記表面から遊離した前記分子と前記細胞の構成成分との結合体を分析する分析装置をさらに含みうる。
　前記分析装置はシークエンサーであってよい。
　前記分析システムは、前記分析装置による分析結果と前記撮像により得られた標本画像とを用いて、前記関連付け部による関連付け結果に基づき２次元マッピングを行う２次元マッピング部をさらに含みうる。
　また、本技術は、開裂可能なリンカーとバーコード配列と標的捕捉部とを含む分子が前記リンカーを介して固定されており、且つ、
　前記バーコード配列が、当該バーコード配列を含む分子が固定されている位置に関する情報を与えるために用いられる、
　分析用表面も提供する。
本技術に従う分析方法のフロー図の一例である。 本技術に従う分析方法に含まれる各工程における操作を説明するための模式図である。 本技術に従う分析方法において用いられる分析用表面及び当該表面に固定される分子を示す模式図である。 本技術に従う方法に含まれる関連付け工程を説明するための模式図である。 本技術に従う分析システムの一例のブロック図である。
　以下、本技術を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態を示したものであり、本技術の範囲がこれらの実施形態のみに限定されることはない。なお、本技術の説明は以下の順序で行う。
１．第１の実施形態（分析方法）
（１）第１の実施形態の説明
（２）第１の実施形態の例
（２－１）撮像対象用意工程
（２－２）撮像工程
（２－３）関連付け工程
（２－４）開裂工程
（２－５）結合工程
（２－６）分析工程
２．第２の実施形態（分析システム）
３．第３の実施形態（分析用表面）
１．第１の実施形態（分析方法）
（１）第１の実施形態の説明
　本技術の分析方法において、標本が、刺激によって開裂可能なリンカーとバーコード配列と標的捕捉部とを含む分子が前記リンカーを介して固定されている表面と重ねられた状態で撮像される。そして、当該撮像により得られた標本画像を用いて、標本に含まれる細胞の位置と当該位置にある分子のバーコード配列とが関連付けられる。当該関連付けが行われた後に、分析対象とする細胞の位置に刺激が与えられて、当該位置に存在する分子のリンカーが開裂される。当該開裂により、前記表面から前記分子が遊離し、そして、当該分子が、分析対象とする細胞の構成成分と標的捕捉部を介して結合する。
　このように細胞の構成成分と結合した分子は、バーコード配列を有し、且つ、当該バーコード配列は当該細胞の位置と関連付けられている。そのため、細胞の構成成分と結合した分子に対する分析（例えば細胞の構成成分の特定及びバーコード配列の特定など）を行うことによって、細胞の構成成分に関する情報を、細胞の位置情報と関連付けて取得することができる。さらに、当該分析方法では、上記のとおり標本画像も取得される。そのため、例えば標本画像に、細胞の構成成分に関するデータをマッピングすることができる。
　本技術において、標本は、固定化された標本であってよく、例えば凍結切片又はＦＦＰＥ切片であってもよい。従来技術の分析方法は、凍結切片又はＦＦＰＥ切片のいずれかのみについて適用可能であるものが多いが、本技術の分析方法は、これら切片の両方に対して適用することができる。前記標本は、例えば組織サンプルであってよく、特には生体組織サンプルであってよい。
　本技術の分析方法では、細胞の位置に選択的に刺激が与えられて、その位置に存在する分子が表面から遊離し、そして、細胞の構成成分と結合する。より好ましくは、前記開裂工程において、前記細胞の位置以外の位置にある分子のリンカーが開裂しないように、前記細胞の位置に選択的に刺激が与えられる、これにより、シングルセル分解能での細胞構成成分（例えばｍＲＮＡ又はタンパク質）の分析が可能となる。すなわち、本技術の分析方法は、標本に含まれる細胞の構成成分を、シングルセル分解能で分析する分析方法であってよい。
　さらに、細胞の位置情報と関連付けられたバーコード配列によって、各細胞の構成成分の分析を、標本に含まれる種々の細胞に対して網羅的に行うことができる。例えば、従来技術による組織サンプル中のｍＲＮＡの分析においては、組織サンプル中の細胞の形態情報や免疫染色情報に基づいて特定の領域を指定し、レーザーなどで切り出してからｍＲＮＡ分析に付されうる。本技術では、組織サンプルの切り出しなどを行うことなく、組織サンプル中のｍＲＮＡの発現情報を、当該組織サンプルに含まれる細胞毎に網羅的に行うことができる。すなわち、本技術の分析方法は、標本に含まれる複数の細胞の構成成分をシングルセル分解能で分析する分析方法であってよい。
（２）第１の実施形態の例
　本技術の分析方法のフロー図の一例を図１に示す。図１に示されるとおり、本技術の分析方法は、撮像対象用意工程Ｓ１０１、撮像工程Ｓ１０２、関連付け工程Ｓ１０３、開裂工程Ｓ１０４、結合工程Ｓ１０５、及び分析工程Ｓ１０６を含みうる。以下でこれらの工程について説明する。
（２－１）撮像対象用意工程
　撮像対象用意工程Ｓ１０１において、後述の撮像工程Ｓ１０２における撮像対象が用意される。撮像対象は、刺激によって開裂可能なリンカーとバーコード配列と標的捕捉部とを含む分子が前記リンカーを介して固定されている表面に標本が重ねられて得られた積層物であってよい。
　撮像対象用意工程Ｓ１０１において、例えば図２の（Ａ）に示されるとおり、複数の分子１００が固定された表面１０１を有する分析用基板（例えばスライドガラスなど）１０２が、標本１０３が乗せられた基板（例えばスライドガラスなど）１０４に重ね合わせられる。当該重ね合わせは、表面１０１と標本１０３とが向かい合うように行われてよく、例えば表面１０１と標本１０３はバッファーなどを介して接触されてよい。また、表面１０１と標本１０３とが重ねられた後に、例えばＰＢＳなどのバッファー中に、分析用基板１０２と基板１０４との積層物が浸漬されてよい。
　当該重ね合わされた表面１０１及び標本１０３の位置関係が後述の工程（特には撮像工程Ｓ１０２～結合工程Ｓ１０５）において変更されないように、基板１０２及び１０４の位置関係が固定されうる。
　分子１００は、刺激によって開裂可能なリンカーとバーコード配列と標的捕捉部とを含む。
　本明細書内において、分子（すなわち前記リンカーと前記バーコード配列と前記標的捕捉とを含む分子）は、標的を捕捉するために用いられる分子であり、標的捕捉用分子とも呼ばれうる。標的捕捉用分子は、本技術において用いられる分子を意味するための名称であり、本明細書内において、例えば標的を捕捉した後の前記分子を言及するために用いられ、また、後述の開裂工程において前記リンカーが開裂した後の前記分子を言及するためにも用いられうる。標的捕捉用分子は、例えば単一分子（single molecule）及び複合分子（complex molecule）のいずれであってもよい。単一分子は、例えば複数の機能を有する１種類の分子を意味してよく、例えば前記リンカーとして構成されている核酸部分、前記バーコード配列として構成されている核酸部分、及び前記標的捕捉部として構成されている核酸部分を含む１つの核酸（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）であってよい。複合分子は、例えば２種以上の分子からなる分子集合体（例えば２種以上の分子の結合物）であってよく、例えば前記リンカーとして構成されている核酸部分及び前記バーコード配列として構成されている核酸部分を含む核酸と、前記標的捕捉部として構成されているポリペプチド（例えばタンパク質若しくはその一部、又はオリゴペプチドなど）と、の結合体であってよい。
　分子１００の構造の例を、図３を参照しながら説明する。図３に示される分子１００は、リンカー１、回収用配列部２、増幅用配列部３、バーコード配列部４、ＵＭＩ（Unique molecular identifier）部５、及び標的捕捉部６を含む。また、分子１００は、リンカー１を介して、表面１０１に固定されている。
　回収用配列部２、増幅用配列部３、バーコード配列部４、及びＵＭＩ部５は、一続きの核酸（特にはＤＮＡ）として構成されてよい。標的捕捉部６が核酸である場合は、回収用配列部２、増幅用配列部３、バーコード配列部４、及びＵＭＩ部５に加えて、標的捕捉部６も、一続きの核酸（特にはＤＮＡ）として構成されてよい。これらの場合、例えば表面１０１と分子１００との固定部分に近い端が５’末端であり、他方の端が３’末端でありうる。
　分子１００の構成要素について以下で説明する。
　リンカー１は、刺激によって開裂可能なリンカーであってよく、例えば光刺激又は温度刺激によって開裂可能なリンカーであり、好ましくは光刺激によって開裂可能なリンカーである。光刺激は、後述の開裂工程において特定の位置に選択的に刺激を与えるために特に適している。
　リンカー１は、例えば光刺激によって開裂可能なリンカーとして、アリールカルボニルメチル基、ニトロアリール基、クマリン－４－イルメチル基、アリールメチル基、金属含有基、及びその他の基うちから選ばれるいずれか一つを含みうる。これらの基として、例えばPhotoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology:Reaction Mechanisms and Efficacy, Chem. Rev. 2013, 113, 119-191に記載されているものが用いられてよい。
　例えば、前記アリールカルボニルメチル基は、フェナシル基、ｏ－アルキルフェナシル基、又はｐ－ヒドロキシフェナシル基であってよい。前記ニトロアリール基は、例えば、ｏ－ニトロベンジル基、ｏ－ニトロ－２－フェネチルオキシカルボニル基、又はｏ－ニトロアニリドであってよい。前記アリールメチル基は、例えば、ヒドロキシ基を導入されたものであってよく、又は、導入されていないものであってもよい。
　リンカー１が光刺激によって開裂可能なリンカーである場合に、当該リンカーは、好ましくは３６０ｎｍ以上の波長の光によって開裂されるものであってよい。当該リンカーは、好ましくは０．５μＪ／μｍ２以下のエネルギーで切断されるリンカーであってよい。（Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology, Nat Methods. 2015 Jan;12(1):23-6. doi: 10.1038/nmeth.3219.）。上記波長の光又は上記エネルギーで切断されるリンカーを採用することによって、光刺激を与えるときに生じうる細胞ダメージ（特にはＤＮＡ又はＲＮＡの切断など）を低減することができる。
　リンカー１が温度刺激によって開裂可能なリンカーである場合、リンカー１は例えば温度応答性高分子を含みうる。温度応答性高分子は、例えば温度変化に応じて親水性から疎水性へと変化し又は疎水性から親水性へと変化しうる。このような変化によって、標的捕捉用分子は表面１から遊離されうる。
　特に好ましくは、当該リンカーは、短波長領域の光、具体的には３６０ｎｍ～４１０ｎｍの波長領域の光によって開裂されるリンカーであってよく、又は、近赤外領域若しくは赤外領域の光、具体的には８００ｎｍ以上の波長領域の光によって開裂されるリンカーであってよい。当該リンカーが、可視光領域の波長の光で効率よく切断されるリンカーである場合は、分析用表面の取扱いが難しくなりうる。そのため、当該リンカーは、上記短波長領域の光又は上記近赤外領域若しくは赤外領域の光によって開裂されるリンカーであることが好ましい。
　回収用配列部２は、後述の分析工程において、表面１０１から遊離した分子１００を回収するために用いられる核酸を含む。当該核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであってよく、特にはＤＮＡである。例えば、図３の（Ｄ）に示されるように、回収用配列部２に含まれる核酸の配列は、ビーズ９に固定された核酸８の配列と相補的である。核酸８を複数固定されたビーズ９によって、回収用配列部２を有する分子１００を効率的に回収することができる。回収用配列部２に含まれる核酸の塩基配列は、当業者により適宜設定されてよい。
　増幅用配列部３は、例えば、後述の分析工程において核酸の増幅のために用いられるプライマー配列若しくは核酸の転写のために用いられるプロモーター配列を有する核酸を含みうる。当該核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであってよく、特にはＤＮＡである。増幅用配列部３は、プライマー配列及びプロモーター配列の両方を有していてもよい。前記プライマー配列は、例えばＰＣＲハンドルであってよい。前記プロモーター配列は、例えばＴ７プロモーター配列であってよい。
　バーコード配列部４は、バーコード配列を有する核酸を含む。当該核酸は、特にはＤＮＡ又はＲＮＡであってよく、より特にはＤＮＡである。バーコード配列は、例えば、表面１０１上における標的捕捉用分子の存在位置を特定するために用いられる。バーコード配列は、或るバーコード配列を含む標的捕捉用分子を、他のバーコード配列を含む標的捕捉用分子と区別可能とするための識別子として用いられうる。バーコード配列は、当該バーコード配列を含む標的捕捉用分子が固定されている位置に関する情報（以下「位置情報」ともいう）と関連付けられていてよい。位置情報は、表面１０１上の位置を特定するためのものであってよく、例えばＸＹ座標に関する情報であるが、これに限定されない。位置情報と関連付けられたバーコード配列には、ＩＤナンバーが割り当てられてよい。当該ＩＤナンバーは、撮像工程以降の工程において用いられうる。当該ＩＤナンバーは、バーコード配列と１対１で対応するものであってよく、撮像工程以降の工程において、バーコード配列に対応するデータとして用いられてもよい。
　表面１０１のうちの或る領域内に固定された複数の標的捕捉用分子が同じバーコード配列を有しうる。これにより、当該或る領域と当該バーコード配列とが関連付けられる。当該或る領域のサイズを、細胞のサイズよりも小さく設定することによって、当該バーコード配列を含む標的捕捉用分子を、１つの細胞が存在する位置に関連付けることができる。このように、本技術の分析方法において用いられる表面は、同じバーコード配列を有する複数の標的捕捉用分子が固定された領域を複数有しうる。領域毎にバーコード配列は異なってよい。各領域のサイズは、好ましくは細胞のサイズより小さく、例えば５０μｍ以下、好ましくは１０μｍ以下、より好ましくは５μｍ以下でありうる。
　本技術の一つの実施態様において、配列が既知のバーコード配列を含む標的捕捉用分子が、所定の領域に固定されうる。例えば、表面１０１は、複数の領域を有し、当該複数の領域のそれぞれに固定された複数の標的捕捉用分子は、同じバーコード配列を含みうる。当該複数の領域は、分析対象である細胞のサイズよりも小さく設定されうる。このように構成された表面１０１に関して、前記複数の領域のそれぞれと、各領域に固定されている複数の標的捕捉用分子に含まれるバーコード配列とを、関連づけることができる。
　このように同じバーコード配列を含む標的捕捉用分子が固定されている領域を、本明細書内においてスポットともいう。スポットのサイズは、例えば５０μｍ以下、好ましくは１０μｍ以下、より好ましくは５μｍ以下でありうる。
　以上のように構成された表面１０１は、標的捕捉用分子が表面１０１に固定化された時点で、或る標的捕捉用分子に含まれるバーコード配列と当該或る標的捕捉用分子が存在する位置とを関連付けることができる。当該固定のために、例えば標的捕捉用分子のリンカー１にビオチンが結合され且つ標的捕捉用分子が固定される表面１０１にストレプトアビジンが結合され、そして、前記ビオチン及び前記ストレプトアビジンが結合することによって、前記標的捕捉用分子が表面１０１に固定化される。
　本技術の他の実施態様において、表面１０１に、バーコード配列を含む標的捕捉用分子が、ランダムに配置されてもよい。この場合、バーコード配列を含む標的捕捉用分子が表面１０１に固定された後に、固定された標的捕捉用分子に含まれるバーコード配列を読み取ることで、或る標的捕捉用分子に含まれるバーコード配列と、当該或る標的捕捉用分子が存在する位置とが、関連付けられる。当該読み取りは、例えばSequencing By Synthesis、sequencing by ligation、又はsequencing by hybridizationなどの手法により行うことができる。
　この実施態様において、例えば同じバーコード配列を含む複数の標的捕捉用分子が結合したビーズ（例えばゲルビーズ）が用いられてよく、当該ビーズ（例えばゲルビーズ）が表面１０１に固定されうる。ビーズ（例えばゲルビーズ）のサイズは、例えば５０μｍ以下、好ましくは１０μｍ以下、より好ましくは５μｍ以下でありうる。標的捕捉用分子をビーズ（例えばゲルビーズ）に結合させるために、例えばビオチンとストレプトアビジンとの組合せが用いられてよい。例えば、標的捕捉用分子のリンカー１にビオチンが結合され且つビーズにストレプトアビジンが結合され、そして、前記ビオチン及び前記ストレプトアビジンが結合することによって、前記標的捕捉用分子がビーズに固定化される。
　表面１０１には、複数の凹部が設けられていてもよい。当該複数の凹部のそれぞれに、前記実施態様における１つのスポット又は１つのビーズが配置されてよい。当該複数の凹部におって、当該スポット又は当該ビーズを、より容易に表面１０１に配置することができる。凹部のサイズは、例えばビーズが一つ入るサイズであることが好ましい。凹部の形状は、円形、楕円形、六角形、又は四角形であってよいがこれらに限定されない。
　また、表面１０１のうち、前記スポット又は前記ビーズが配置される表面部分の表面状態が、他の表面部分と異なっていてもよい。例えば、前記スポット又は前記ビーズが配置される表面部分が親水性であり、その他の表面部分が疎水性であってよく、又は、その他の表面部分が疎水性を有し且つ凸部を有していてもよい。表面に親水性を付与するため手法として、例えば、酸素存在下での反応性イオンエッチング及びオゾン存在下で深紫外光の照射などが挙げられる。これらの手法において、親水性を付与する部分が貫通されたマスクが用いられうる。また、表面に疎水性を付与するための手法として、シリコーンスプレー（spray-on-silicone）を挙げることができ、例えばTechspray 2101-12Sなどが用いられてよい。疎水性を付与する場合においても、例えば疎水性を付与する部分が貫通されたマスクを用いられうる。
　例えばＤＮＡマイクロアレイ作製技術などを用いて、基板上で前記標的捕捉用分子を合成することもできる。例えば、フォトリソグラフィーに用いられるＤＭＤ（Digital Mircomirror Device）、液晶シャッター、又は空間光位相変調器などの技術を用いて、特定の位置に標的捕捉用分子を合成することができる。当該合成のための手法は、例えばBasic Concepts of Microarrays and Potential Applications in Clinical Microbiology, CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, Oct. 2009, p. 611-633に記載されている。なお、当該合成により前記標的捕捉用分子を基板上で合成する場合、標的捕捉用分子が合成される際に当該標的捕捉用分子が合成される位置の情報を取得し、バーコード配列と位置情報とが関連付けられる。その際に、ＩＤナンバーが付与されてもよい。
　本技術の一つの実施態様において、表面に固定されている標的捕捉用分子のいずれもが、共通のオリゴ配列を含みうる。当該オリゴ配列に相補的な配列を有し且つ蛍光標識された核酸を用いることで、標的捕捉用分子が固定されている位置（特には前記スポットの位置又は前記ビーズの位置）を確認することができ、特には暗視野において確認することができる。また、表面に上記で述べた凹部又は凸部が無い場合、標的捕捉用分子が固定されている位置が把握しにくくなりうる。前記蛍光標識は、この場合において、標的捕捉用分子が固定されている位置を把握しやすくする。
　ＵＭＩ部５は、核酸を含んでよく、特にはＤＮＡ又はＲＮＡを含んでよく、より特にはＤＮＡを含む。ＵＭＩ部５は、例えば５塩基～３０塩基、特には６塩基～２０塩基、より特には７塩基～１５塩基の配列を有しうる。
　ＵＭＩ部５は、表面１０１に固定された標的捕捉用分子間で互いに異なる配列を有するように構成されうる。例えばＵＭＩ部が１０塩基の核酸配列を有する場合、ＵＭＩ配列の種類は、４の１０乗、すなわち１００万以上である。
　ＵＭＩ部５は、標的分子を定量するために用いられうる。例えば、ｍＲＮＡを逆転写して得られるｃＤＮＡにＵＭＩ配列が付加される。１つのｍＲＮＡ分子から転写されたｃＤＮＡを増幅して得られる多数のｃＤＮＡは同じＵＭＩ配列を有するが、当該ｍＲＮＡと同じ配列を有する他のｍＲＮＡ分子から転写されたｃＤＮＡを増幅して得られる多数のｃＤＮＡは異なるＵＭＩ配列を有する。そのため、同じｃＤＮＡ配列を有するＵＭＩ配列の種類の数を数えることで、ｍＲＮＡのコピー数を決定することができる。
　例えば、ＵＭＩ部５は、前記スポット又は前記ビーズに固定された同じバーコード配列を含む複数の標的捕捉用分子間で互いに異なる配列を有するように構成されうる。すなわち、前記スポット又は前記ビーズに固定された複数の標的捕捉用分子は、同じバーコード配列を有する一方で、互いに異なるＵＭＩを有しうる。
　標的捕捉部６は、細胞に含まれる分子を捕捉するための構成要素を含む。当該構成要素は、例えば核酸又はタンパク質でありうる。当該構成要素が核酸である場合、当該核酸は、細胞に含まれるｍＲＮＡを網羅的に捕捉するために、例えばポリＴ配列であってよい。代替的には、当該核酸は、標的配列に相補的な配列を有しうる。当該構成要素がタンパク質である場合、当該タンパク質は例えば抗体であってよい。当該構成要素は、アプタマー又は分子鋳型ポリマー（Molecular Imprinted Polymer）であってもよい。
　標的捕捉部６は、細胞に含まれる分子を捕捉するための２種類以上の構成要素を含んでいてもよい。標的捕捉部６は、タンパク質及び核酸の両方を含んでよく、例えば抗体とポリＴ配列の両方を含みうる。これにより、タンパク質とｍＲＮＡの両方を同時に検出することができる。
　表面１０１は、好ましくは透明な基板の表面でありうる。当該基板は、その全体が透明であってよく、又は、標的捕捉用分子が固定される部分だけが透明であってもよい。基板の表面は、標本との接触を良好に行うために、好ましくは平面である。当該透明の基板は、例えばガラス製の基板又は樹脂製の基板でありうる。当該基板は例えばスライドガラスであってよい。透明であることによって、後述の撮像工程において標本を撮像することができる。また、透明であることによって、後述の関連付け工程において関連付けが行いやすい。
　標本４は、例えば細胞を含む標本であってよく、より特には細胞を含む固定化された標本でありうる。標本は、生体組織標本であってよく、特には凍結組織標本又はＦＦＰＥ（formalin-fixed paraffin-embedded）標本であってよく、より特には凍結組織切片又はＦＦＰＥ切片でありうる。標本４は、例えば基板に載せられていてよく、特には透明な基板の表面でありうる。当該基板は、その全体が透明であってよく、又は、標本が載せられる部分だけが透明であってもよい。当該透明の基板は、例えばガラス製の基板又は樹脂製の基板でありうる。当該基板は例えばスライドガラスであってよい。当該基板の表面は、標的捕捉用分子が固定されている表面との接触を良好に行うために、好ましくは平面である。
　標本４は、後述の細胞のセグメンテーションをより容易に行うために染色されてよい。当該染色は、例えば細胞膜染色、ＨＥ（Hematoxylin Eosin）染色、若しくはＤＡＰＩ染色、又はこれらのうちの２以上の組合せであってよい。前記細胞膜染色のために、脂質二重膜に取り込まれて蛍光を発する細胞膜染色試薬が用いられてよく、試薬は当業者により適宜選択されてよい。前記ＨＥ染色は、明視野観察のために用いられ、例えば細胞形態を特定するために用いられうる。前記ＤＡＰＩ染色は、核染色のために用いられうる。
（２－２）撮像工程
　撮像工程Ｓ１０２において、例えば図２の（Ｂ）に示されるように、表面１０１と標本１０３とが重ねられた状態で、標本１０３が撮像される。当該撮像は、標本１０３に含まれる個々の細胞が認識できるような分解能で行われうる。撮像素子１１０は、例えばＣＣＤ又はＣＭＯＳであってよい。
　当該撮像は、例えば、撮像素子１１０によって対物レンズ１１１を介して行われてよい。すなわち、撮像される画像は、顕微鏡画像でありうる。対物レンズ１１１の倍率は、細胞のサイズに応じて適宜選択されてよい。
　前記撮像は、明視野若しくは暗視野での撮像であってよく、又は、明視野の撮像及び暗視野の撮像の両方が行われてもよい。前記撮像は１回又は複数回行われてよく、例えばユーザ若しくは制御部により選択された一部の領域について１回又は複数回行われてよく、又は、標本１０３の全域又は一部を網羅するように１回又は複数回行われてもよい。
　撮像素子１１０による前記撮像は、撮像素子１１０に接続された制御部（図示されていない）により制御されうる。前記制御部は、例えば、ハードディスク、ＣＰＵ、及びメモリにより構成されてよく、例えば汎用のコンピュータ又は情報処理装置により制御部の機能が実現されうる。
　また、前記制御部は、撮像素子１１０内に備えられていてもよい。制御部を備えている撮像素子は、例えば、複数のダイ（例えば２枚又は３枚のダイ）が積層された積層構造を有する１チップの半導体装置として構成されてよい。当該ダイのうちの１つが、２次元に並んで配列された複数の画素を含む。残りのダイに、制御部の機能を実現させるための構成要素（例えばＣＰＵ及びメモリなど）が搭載されうる。前記制御部を含む撮像素子の例として、例えば国際公開第２０１８／０５１８０９号に開示された撮像素子を挙げることができる。前記撮像素子として制御部を備えている撮像素子を用いることによって、標本画像データを撮像素子の外部に出力することなく各種処理を行うことができ、これは情報処理の高速化をもたらす。
　撮像素子１１０は、撮像により得られた標本画像データを前記制御部に送信しうる。前記制御部は、標本画像データを受信し、以降の工程において当該標本画像データを使用する。
　また、前記制御部が受信した標本画像データは、例えば前記制御部に接続された記憶部に格納されてもよい。前記記憶部は、汎用の記憶装置であってよい。前記制御部が、以降の行程を行う場合に、前記記憶部から標本画像データを取得しうる。
（２－３）関連付け工程
　関連付け工程Ｓ１０３において、撮像工程Ｓ１０２における撮像により得られた標本画像を用いて、細胞の位置と当該位置にある標的捕捉用分子のバーコード配列とが関連付けられる。当該関連付けは、バーコード配列に予め関連付けられた位置情報を介して行われてよい。各バーコード配列にＩＤナンバーが付与されている場合は、細胞の位置とＩＤナンバーとが関連付けられてもよい。これにより、細胞の位置とバーコード配列とが、ＩＤナンバーを介して関連付けられうる。
　前記細胞の位置は、標本画像中において当該細胞が占める領域を意味しうる。当該領域を特定するために、標本画像に対する画像処理が行われてよく、例えば細胞のセグメンテーションが行われうる。細胞のセグメンテーションによって、細胞の位置に存在する標的捕捉用分子を特定しやすくなる。
　例えば、関連付け工程Ｓ１０３において、前記標本画像中の細胞のうちの分析対象である細胞の位置情報が取得される。細胞の位置情報は、上記セグメンテーションにより得られた画像データを用いて取得されてよい。当該標本画像は、表面１０１と標本１０３とが重ねられて撮像されたものであるので、当該細胞の位置情報は、当該細胞の位置にある標的捕捉用分子の位置情報に対応する。ここで、標的捕捉用分子の位置情報は、上記で述べたとおり、撮像対象用意工程Ｓ１０１において、当該標的捕捉用分子に含まれるバーコード配列に関連付けられている。そのため、標本画像中の細胞の位置情報を取得することで、前記細胞の位置と、当該位置にある標的捕捉用分子に含まれるバーコード配列とを関連付けることができる。
　好ましくは、前記関連付けは、１つのバーコード配列が、２以上の細胞の位置に関連付けられないように行われうる。例えば、上記で述べた１つのスポットに、２以上の細胞が存在する場合がある。この場合、好ましくは、当該１つのスポットに固定されている標的捕捉用分子のバーコード配列は、当該２以上の細胞のいずれの位置にも関連付けられない。
　表面上のスポットのうち、関連付けが行われるスポットと関連付けが行われないスポットの区別の仕方の例を、図４を参照しながら説明する。
　図４の左に示される組織の標本画像のうちの一部を拡大することで又は当該一部の拡大画像をより取得することで、図４の中央に示されるとおり組織サンプル中の細胞が視認可能となる。標本は分析用表面と重ねられて撮像されており、例えば図４の右に示されるように、多数の円形スポットが重なった状態で撮像されている。各円形スポットには、同じバーコード配列を有する複数の標的捕捉用分子が存在する。
　図４の右では、より良い理解のために、多数の円形スポットが示されているが、これらスポットは、撮像素子により取得された画像中には確認できなくてよく又は確認できてもよい。
　なお、標本画像中にスポットの位置が確認できない場合において、画像処理によって、標本画像中にスポットの位置を表示させてもよい。
　図４の中央の標本画像中には、２種類の細胞が存在することが確認でき、１種類の細胞が濃いグレーにより示されており、他の種類の細胞が薄いグレーにより示されている。これら２種類の細胞に関して細胞の位置と当該位置に存在する標的捕捉用分子のバーコード配列とを関連付ける場合、例えば図４の右に示されるとおり、実線の円で示されるスポットについて関連付けが行われる。実線の円は、１つの細胞の像の領域内に存在する。このように、１つの細胞の像の領域内に存在するスポットが、関連付けの対象となりうる。
　一方で、点線の円は、例えば２つ以上の細胞に重なっていたり、細胞と細胞の外の領域にまたがっていたり、又は、細胞の像の領域外に存在している。これら点線の円は、関連付けの対象とされなくてよい。
　関連付け工程Ｓ１０３は、例えば前記制御部により行われうる。例えば、前記制御部は、標本画像中に存在する細胞のうち、全て又は一部の種類の細胞に関して、細胞の位置と当該細胞の位置にある分子のバーコード配列とを関連付けうる。一部の種類の細胞に関して関連付けが行われる場合、前記制御部は、例えば細胞の特徴（形状、サイズ、色、若しくは模様、又はこれらの組合せ）に基づき、関連付けが行われる細胞を特定しうる。例えば、図４の中央に示される画像のうち、濃いグレーにより示される細胞について細胞の位置と当該位置にある標的捕捉用分子のバーコード配列との関連付けを行う一方で、薄いグレーにより示される細胞については当該関連付けを行わないなど、特定の種類の細胞についてだけ関連付けが行われてもよい。
　また、前記撮像素子として、制御部を備えている撮像素子を用いる場合、標本画像データを撮像素子の外部に出力することなく、関連付け工程Ｓ１０３を行うことができる。これにより、関連付け工程Ｓ１０３をより高速に処理することができる。
　関連付け工程Ｓ１０３は、ユーザ操作に基づき行われてもよい。例えばユーザが標本画像中に存在する細胞のうちから、関連付けを行うことを希望する細胞を、例えばマウスのクリックなどにより選択する。そして、ユーザにより選択された細胞について、前記制御部が、細胞の位置と当該位置にある標的捕捉用分子のバーコード配列とを関連付けうる。
（２－４）開裂工程
　開裂工程Ｓ１０４において、細胞の位置に選択的に刺激を与えて、当該位置にある分子のリンカーを開裂させる。例えば図２の（Ｃ）に示されるよう刺激付与装置１３０によって、選択された細胞の位置に光が照射されうる。
　刺激が与えられる位置は、関連付け工程Ｓ１０３において関連付けが行われた細胞のうちの一部の細胞の位置であってよく、又は、前記関連付けが行われた細胞の全ての位置であってもよい。好ましくは、当該細胞の位置以外の位置にある標的捕捉用分子のリンカーが開裂しないように、当該細胞の位置に選択的に刺激が与えられる。刺激付与装置１３０は、好ましくは、このように選択的に刺激を与えるように構成されている。すなわち開裂工程Ｓ１０４において、関連付けが行われなかったバーコード配列を含む標的捕捉用分子のリンカーは開裂されなくてよい。
　例えば、図４の右に示される画像のうち、関連付けが行われた実線の円で示されるスポットの全てに、刺激が与えられてよい。このように、関連付けが行われた細胞の全ての位置に刺激が与えられてよい。
　代替的には、図４の右に示される画像のうち、濃いグレーにより示される細胞中の実線の円スポットで示される位置に、又は、薄いグレーにより示される細胞中の実線の円スポットで示される位置に、刺激が与えられてよい。このように、関連付けが行われた細胞のうちの一部の細胞（特には或る種類の細胞）の位置に刺激が与えられてよい。
　代替的には、図４の右に示される画像のうち、関連付けが行われた細胞のうちから選択される１つ又は複数の細胞中の実線の円スポットで示される位置に、刺激が与えられてよい。このように、関連付けが行われた細胞のうちの一部の細胞（特には選択された細胞）の位置に刺激が与えられてよい。
　ステップＳ１０４におけるリンカーの開裂によって、標的捕捉用分子が表面１０１から遊離する。例えば図３の（Ｂ）に示されるように、分子１００のリンカー１が開裂することによって、分子１００が、表面１０１から遊離する。
　前記刺激は、例えば光刺激又は温度刺激（熱刺激ともいう）であってよく、好ましくは光刺激でありうる。光刺激は、特定の狭い範囲に選択的に刺激を与えるために特に適している。
　開裂工程Ｓ１０４は、例えば前記制御部により行われてよい。より具体的には、前記制御部が、刺激付与装置を駆動して細胞の位置に選択的に刺激を付与させうる。採用されうる刺激付与装置の例を以下に説明する。
　細胞の位置に選択的に光刺激を与えるために、刺激付与装置１３０として光照射装置が用いられ得る。光照射装置は、例えばＤＭＤ（Digital Micromirror Device）又は液晶ディスプレイデバイスであってよい。ＤＭＤを構成するマイクロミラーによって、表面１０１のうちの選択された位置に光を照射することができる。液晶ディスプレイデバイスは、例えば反射型液晶ディスプレイであってよく、具体的な例としてはＳＸＲＤ（ソニー株式会社）を挙げることができる。液晶ディスプレイデバイスの液晶を制御することによって、表面１０１のうちの選択された位置に光を照射することができる。
　また、細胞の位置に選択的に光刺激を与えるために、液晶シャッター又は空間光変調器が用いられてもよい。これらによっても、選択された位置に光刺激を与えることができる。
　照射される光の波長は、標的捕捉用分子に含まれるリンカーの種類に応じて当業者により適宜選択されてよい。
　細胞の位置に選択的に温度刺激を与えるために、例えば赤外光と赤外光吸収材料との組合せが用いられうる。この場合、刺激付与装置としては例えば赤外レーザ光生成装置が採用されうる。例えば表面１０１を有する基板１０２を赤外光吸収材料から形成し、そして、赤外レーザ光生成装置により細胞の位置に選択的に赤外光を照射することによって、当該位置に選択的に温度刺激を与えることができる。
（２－５）結合工程
　結合工程Ｓ１０５において、ステップＳ１０４における開裂によって表面１０１から遊離した前記標的捕捉用分子を、当該標的捕捉用分子の標的捕捉部を介して前記細胞の構成成分に結合させる。
　例えば図２の（Ｃ）の１点鎖線により囲まれた模式的な拡大図に示されるように、光を照射された位置にある標的捕捉用分子のリンカーだけが開裂し、その直下にある細胞内へと取り込まれる。そして、例えば図３の（Ｃ）に示されるように、当該細胞内で、標的捕捉用分子１００の標的捕捉部６に細胞構成成分７が結合しうる。
　結合工程Ｓ１０５は、電場又は磁場又は遠心力の印可によって前記標的捕捉用分子を前記細胞に向かって移動させる移動工程を含みうる。例えば標的捕捉用分子に含まれる核酸はネガティブチャージを有するので、ポジティブチャージによって当該標的捕捉用分子を細胞に向かって移動させることができる。例えば、基板１０２及び基板１０４の積層物を、向かい合う電極の間に配置することによって、電場が印可されうる。また、基板１０２及び基板１０４に明視野観察又は暗視野観察（特には蛍光観察）を妨げない厚さの金属薄膜又はＩＴＯ（Indium Tin Oxide）などの透明電極が配置されていてもよい。電場を印可する電場印可装置、磁場を印可する磁場印可装置、又は、遠心力を印可する遠心力印可装置として、当技術分野で既知の装置が採用されてよい。遠心力印可装置として、例えばスイングローター式の遠心力印可装置が挙げられる。これら装置による電場又は磁場又は遠心力の印可は、例えば制御部によって制御されてもよい。
　結合工程Ｓ１０５は、自然拡散によって前記標的捕捉用分子を前記細胞に向かって移動させる移動工程を含んでもよい。
　前記移動工程において、電場又は磁場又は遠心力の印可と自然拡散との組み合わせが用いられてもよい。移動工程は、好ましくは電場の印可を含み、これにより、前記遊離した標的捕捉用分子が細胞に取り込まれる確率を高めることができる。
　結合工程Ｓ１０５は、前記標的捕捉用分子と前記細胞の構成成分とを結合させるためのインキュベート工程を含みうる。インキュベート工程の時間及び温度は、標的捕捉部及び当該標的捕捉部により捕捉される細胞構成成分に応じて、選択されてよい。インキュベート工程は、例えば表面１０１と標本との間をバッファーで満たした状態で行われうる。例えば、当該標的捕捉部及び当該細胞構成成分がいずれも核酸である場合、例えば３０℃～４０℃、特には３０℃～３７℃の恒温槽で、例えば５時間～３０時間、特には１６時間～２４時間にインキュベートが行われうる。例えば、当該標的捕捉部が抗体であり及び当該細胞構成成分が当該抗体により捕捉される成分である場合、例えば０℃～３０℃、特には４℃～室温（例えば２５℃）で、例えば５時間～３０時間、特には１６時間～２４時間インキュベートが行われうる。
　結合工程Ｓ１０５において、前記標的捕捉用分子は、細胞内に取り込まれてよく又は細胞表面に結合しうる。そして、前記標的捕捉用分子は、前記標的捕捉用分子の標的捕捉部を介して、細胞の構成成分と結合する。その後、表面１０１と標本１０３は引き離され、未結合の標的捕捉用分子は、洗浄によって除去される。洗浄法としては、標本１０３をバッファーに浸漬する等でよい。
（２－６）分析工程
　分析工程Ｓ１０６において、結合工程Ｓ１０５における標的捕捉用分子と細胞構成成分との結合により生成された結合体に対する分析が行われうる。図２の（Ｄ）に示されるように、分析装置２００を用いて分析が行われうる。例えば、分析工程Ｓ１０６において、前記結合体に対するシークエンシング処理が行われてよく、分析装置２００はシークエンサーであってよい。当該シークエンシング処理は、例えば前記細胞構成成分が、核酸、特にはＤＮＡ又はＲＮＡ、より特にはｍＲＮＡである場合に行われうる。シークエンシング処理は、シークエンサーにより行われてよく、次世代型シークエンサー又はサンガー法によるシークエンサーにより行われよい。組織を構成する細胞の網羅的な解析をより高速に行うために、シークエンシング処理は次世代型シークエンサーにより行われうる。
　分析工程においてシークエンシング処理を行うために、分析工程はさらにシークエンシング処理の対象となる核酸（例えばｃＤＮＡなど）の調製工程及び核酸の精製工程を含みうる。これら調製工程及び精製工程によって、例えば次世代型シークエンシング処理を行うためのライブラリーが調製されてよい。
　ライブラリーの調製において、例えば図３の（Ｄ）に示されるように、回収用配列部２が用いられうる。回収用配列部２に含まれる核酸配列と相補的な配列を有する核酸が固定されたビーズ９を用いて、細胞構成成分７を結合した分子１００が回収されうる。
　前記調製工程において、結合工程Ｓ１０５における結合後の基板１０２及び１０４の積層物が、例えばＰＢＳなどのバッファーを用いて洗浄されて、未結合の標的捕捉用分子が除去されうる。そして次に、基板１０２が基板１０４から取り外され、標的捕捉用分子を取り込んだ細胞に対して、例えばｍＲＮＡからのｃＤＮＡを合成するｃＤＮＡ合成工程及び合成されたｃＤＮＡを増幅する増幅工程が行われうる。前記ｃＤＮＡ合成工程及び前記増幅工程の前に、細胞を溶解する溶解工程が行われてよい。当該溶解工程後に標的捕捉用分子と標的との結合体を回収することで、前記ｃＤＮＡ合成工程及び前記増幅工程をより効率的に行うことができる。
　前記調製工程後に、当該調製工程において得られた核酸を精製する精製工程が行われてよい。当該精製工程は、例えばプロテイナーゼＫなどの酵素を用いた核酸以外の成分の分解処理を含みうる。また、当該精製工程において、核酸回収処理が行われてよい。核酸回収処理において、例えば市販入手可能な核酸精製用試薬が用いられてよく、その例として例えばAMPure XPなどの磁気ビーズを挙げることができる。なお、当該精製工程において、細胞内のdsDNAも回収されうるが、シークエンシング処理においてdsDNAはシークエンスされないようにすることができる。例えば、標的捕捉用分子にシークエンシング処理用（特には次世代型シークエンシング処理用）のアダプター配列を含めることで、当該アダプター配列を含む核酸だけをシークエンスすることができる。
　分析工程Ｓ１０６において、シークエンシング処理結果に基づき、細胞毎に細胞構成成分が分析されうる。例えば、分析工程Ｓ１０６において、細胞毎に、細胞に含まれるｍＲＮＡの配列及び／又は各ｍＲＮＡのコピー数が決定されうる。また、分析工程Ｓ１０６において、細胞毎に、抗原の種類及び／又は数、又は、転写因子の種類及び／又は数が決定されうる。このような細胞毎の細胞構成成分の分析は、シークエンス処理により決定された配列中のバーコード配列に基づき行われうる。例えばシークエンス処理により決定された多数の配列のうちから、同じバーコード配列を含む配列が選択される。同じバーコード配列を含む配列は、１つの細胞に取り込まれた標的捕捉用分子に基づくものである。そのため、バーコード配列毎に細胞構成成分を分析することは、細胞毎に細胞構成成分を分析することを意味する。
　分析工程Ｓ１０６は、前記分析の結果と前記標本画像とを用いて、関連付け工程Ｓ１０３における関連付け結果に基づき２次元マッピングを行う２次元マッピング工程を含みうる。例えば、分析工程Ｓ１０６において、細胞毎の細胞構成成分の分析結果は、バーコード配列に関連付けられた位置情報に基づき、前記撮像工程において得られた標本画像にマッピングされうる。当該マッピングによって、例えば図２の（Ｅ）に示されるように、標本画像（図２の（Ｅ）の上）と、標本画像中の各位置における細胞構成成分の種類の分布を示すマッピング画像（図２の（Ｅ）の下）が得られうる。当該マッピングにより得られた画像から、どの位置にあるどの細胞が、どの分子をどの程度の量で含むかを把握することができる。すなわち、イメージングにより得た位置情報とシーケンス解析によって得た定量情報を組み合わせることができ、single cell resolutionで空間情報を保持したまま、組織サンプル内分子の網羅的解析が可能となる。
２．第２の実施形態（分析システム）
　本技術の分析システムのブロック図の一例を図５に示す。図５に示されるとおり、本技術の分析システム１０は、分析用基板１０２、撮像素子１１０、制御部１２０、記憶部１２５、及び刺激付与装置１３０を含む。
　分析用基板１０２、撮像素子１１０、及び刺激付与装置１３０は、上記１．において説明したとおりのものであってよく、その説明が本実施形態についてもあてはまる。
　制御部１２０は、上記１．において説明した制御部であってよく、その説明が本実施形態についてもあてはまる。制御部１２０は、例えば画像処理部１２１、関連付け部１２２、及び刺激制御部１２３を含みうる。これらについて以下でより詳細に説明する。
　画像処理部１２１は、撮像素子１１０により取得された標本画像を処理する。画像処理部１２１は、例えば上記１．において述べた細胞のセグメンテーションを行いうる。また、画像処理部１２１は、標本画像中に存在する細胞のうちから、前記関連付け工程において関連付けが行われる細胞を特定しうる。当該特定は、例えば細胞の特徴（形状、サイズ、色、若しくは模様、又はこれらの組合せ）に基づき行われうる。当該特定は、画像中の色データに基づき行われてもよい。例えば、或る蛍光を発する細胞を、関連付け工程において関連付けが行われる細胞として特定しうる。
　関連付け部１２２は、細胞の位置と当該細胞の位置にある標的捕捉用分子のバーコード配列とを関連付ける。当該関連付けは、上記セグメンテーションにより得られた画像を用いて行われてもよい。
　例えば、関連付け部１２２は、標本画像に基づき細胞の位置データを取得し、当該位置データに対応する位置データを割り当てられているバーコード配列を特定し、当該バーコード配列を当該細胞の位置と関連付けうる。
　関連付け部１２２は、細胞の位置と当該細胞の位置にある標的捕捉用分子のバーコード配列との関連付けを、標本画像中の全ての細胞について行ってよく、又は、標本画像中の一部の細胞について行ってもよい。例えば、関連付け部１２２は、標本画像中に存在する全ての細胞のうち、一部の種類の細胞についてだけ前記関連付けを行い、又は、一部の領域に存在する細胞についてだけ前記関連付けを行いうる。
　刺激制御部１２３は、刺激付与装置１３０に、関連付け部１２２により関連付けされた細胞の位置に選択的に刺激を与えさせる。刺激制御部１２３は、関連付け部１２２により関連付けされた細胞のうちの全て又は一部について刺激を与えるよう刺激付与装置１３０を駆動しうる。刺激付与装置１３０は、好ましくは、前記細胞の位置以外の位置にある標的捕捉用分子に含まれるリンカーを開裂させることなく、前記細胞の位置に選択的に刺激が与えられるように構成されている。刺激付与装置１３０は、好ましくは上記１．において述べた光照射装置である。
　制御部１２０は、例えば、ハードディスク、ＣＰＵ、及びメモリにより構成されてよく、例えば汎用のコンピュータ又は情報処理装置において制御部の機能が実現されうる。画像処理部１２１、関連付け部１２２、及び刺激制御部１２３の機能も、汎用のコンピュータ又は情報処理装置により実現されうる。
　制御部１２０は、上記（２－２）において述べとおり、撮像素子１１０内に備えられていてもよい。前記撮像素子として制御部を備えている撮像素子を用いることによって、標本画像データを撮像素子の外部に出力することなく各種処理を行うことができ、これは情報処理の高速化をもたらす。例えば、上記で述べた画像処理部１２１、関連付け部１２２、及び刺激制御部１２３による処理をより高速に行うことができる。
　分析システム１０は、上記１．において述べた結合工程Ｓ１０５を行うために、例えば、刺激付与装置１３０による刺激の付与によって分析用基板１０２の表面から遊離した標的捕捉用分子を細胞に向かって移動させるための電場又は磁場を印可する電場又は磁場印可装置又は遠心力を印可する遠心力印可装置を含みうる。当該装置によって、標的捕捉用分子がより効率的に細胞に取り込まれる。
　分析システム１０は、上記１．において述べた結合工程Ｓ１０５を行うために、刺激付与装置１３０による刺激の付与によって分析用基板１０２の表面から遊離した標的捕捉用分子が細胞構成成分と結合することを促すためのインキュベーション装置をさらに含みうる。当該インキュベーション装置は例えば恒温槽を含みうる。
　分析システム１０は、上記１．において述べた分析工程Ｓ１０６を行うために、刺激付与装置１３０による刺激の付与によって分析用基板１０２の表面から遊離した標的捕捉用分子と細胞構成成分との結合体を分析する分析装置をさらに含みうる。当該分析装置は、例えばシークエンサーでありうる。当該シークエンサーは、例えば次世代型シークエンサーであってよく又はサンガー法によるシークエンシングを行うシークエンサーであってもよい。
　分析システム１０は、前記分析装置による分析結果と前記標本画像とを用いて、前記関連付け部による関連付け結果に基づき２次元マッピングを行う２次元マッピング部をさらに含みうる。当該２次元マッピング部は、制御部１２０の一要素として構成されてよく、例えば上記１．において述べた２次元マッピング工程を行いうる。当該２次元マッピング部によって、例えば細胞の構成成分に関する情報が標本画像にマッピングされうる。当該細胞の構成成分に関する情報は、例えば細胞の構成成分の種類又は量であってよい。当該マッピングにより得られた画像から、どの位置にあるどの細胞が、どの分子をどの程度の量で含むかを把握することができる。すなわち、イメージングにより得た位置情報とシーケンス解析によって得た定量情報を組み合わせることができ、single cell resolutionで空間情報を保持したまま、組織サンプル内分子の網羅的解析が可能となる。
　分析システム１０はさらに出力部を含んでよい。当該出力部は、例えば表示装置及び／又は印刷装置を含みうる。制御部１２０は、例えば撮像素子１１０により取得された標本画像及び前記二次元マッピング部により生成されたマッピング画像など、本技術に従う分析方法を行うことによって得られる画像を当該出力部に出力させうる。また、制御部１２０は、前記分析装置による分析結果（例えばシークエンシング処理結果など）を当該出力部に出力させうる。
３．第３の実施形態（分析用表面）
　本技術は、開裂可能なリンカーとバーコード配列と標的捕捉部とを含む標的捕捉用分子が前記リンカーを介して固定されており、且つ、前記バーコード配列が、当該バーコード配列を含む分子が固定されている位置に関する情報を与えるために用いられる、分析用表面も提供する。前記分析用表面の例は、上記１．において説明した分析用基板１０２の表面１０１であり、当該表面についての説明が本実施形態についてもあてはまる。
　なお、本技術は、以下のような構成をとることもできる。
〔１〕刺激によって開裂可能なリンカーとバーコード配列と標的捕捉部とを含む分子が前記リンカーを介して固定されている表面と重ねた状態で標本を撮像する撮像工程と、
　前記撮像により得られた標本画像を用いて、細胞の位置と当該位置にある分子のバーコード配列とを関連付ける関連付け工程と、
　前記細胞の位置に選択的に刺激を与えて、当該位置にある前記分子のリンカーを開裂させる開裂工程と、
　前記開裂によって前記表面から遊離した前記分子を、当該分子の標的捕捉部を介して前記細胞の構成成分に結合させる結合工程と、
　を含む分析方法。
〔２〕前記標本は組織サンプルを含む、〔１〕に記載の分析方法。
〔３〕前記開裂工程において、前記細胞の位置以外の位置にある分子のリンカーが開裂しないように、前記細胞の位置に選択的に刺激が与えられる、〔１〕又は〔２〕に記載の分析方法。
〔４〕前記刺激が、光刺激である、〔１〕～〔３〕のいずれか一つに記載の分析方法。
〔５〕前記結合工程が、電場又は磁場又は遠心力の印可によって前記分子を前記細胞に向かって移動させる移動工程を含む、〔１〕～〔４〕のいずれか一つに記載の分析方法。
〔６〕前記結合工程が、自然拡散によって前記分子を前記細胞に向かって移動させる移動工程を含む、〔１〕～〔４〕のいずれか一つに記載の分析方法。
〔７〕前記結合工程が、前記分子と前記細胞の構成成分とを結合させるためのインキュベート工程を含む、〔１〕～〔６〕のいずれか一つに記載の分析方法。
〔８〕前記結合工程後に、前記分子と前記細胞の構成成分との結合体に対する分析を行う分析工程をさらに含む、〔１〕～〔７〕のいずれか一つに記載の分析方法。
〔９〕前記分析工程において、前記結合体に対するシークエンシング処理が行われる、〔８〕に記載の分析方法。
〔１０〕前記分析工程が、前記分析結果と前記標本画像とを用いて、前記関連付け工程における関連付け結果に基づき２次元マッピングを行う２次元マッピング工程を含む、〔８〕又は〔９〕に記載の分析方法。
〔１１〕刺激によって開裂可能なリンカーとバーコード配列と標的捕捉部とを含む分子が前記リンカーを介して固定されている表面を有する分析用基板と、
　前記分析用基板に重ねられた標本を撮像する撮像装置と、
　前記撮像により得られた標本画像中の選択された細胞の位置と当該位置にある分子のバーコード配列とを関連付ける関連付け部と、
　前記細胞の位置に選択的に刺激を与える刺激付与装置と、
　を含み、
　前記刺激によって前記表面から遊離した分子と前記細胞の構成成分とが前記分子の標的捕捉部を介して結合した結合体を分析対象として用いる、
　分析システム。
〔１２〕前記標本は組織サンプルを含む、〔１１〕に記載の分析システム。
〔１３〕前記刺激付与装置が、前記細胞の位置以外の位置にある分子に含まれるリンカーを開裂させることなく、前記細胞の位置に選択的に刺激が与えられるように構成されている、〔１１〕又は〔１２〕に記載の分析システム。
〔１４〕前記刺激付与装置が光照射装置である、〔１１〕～〔１３〕のいずれか一つに記載の分析システム。
〔１５〕前記分析システムが、前記刺激付与装置による刺激の付与によって前記表面から遊離した前記分子を前記細胞に向かって移動させるための電場又は磁場又は遠心力を印可する電場印可装置又は磁場印可装置又は遠心力印加装置を含む、〔１１〕～〔１４〕のいずれか一つに記載の分析システム。
〔１６〕前記分析システムが、前記刺激付与装置による刺激の付与によって前記表面から遊離した前記分子が前記細胞の構成成分と結合することを促すためのインキュベーション装置をさらに含む、〔１１〕～〔１５〕のいずれか一つに記載の分析システム。
〔１７〕前記分析システムが、前記刺激付与装置による刺激の付与によって前記表面から遊離した前記分子と前記細胞の構成成分との結合体を分析する分析装置をさらに含む、〔１１〕～〔１６〕のいずれか一つに記載の分析システム。
〔１８〕前記分析装置がシークエンサーである、〔１７〕に記載の分析システム。
〔１９〕前記分析システムが、前記分析装置による分析結果と前記撮像により得られた標本画像とを用いて、前記関連付け部による関連付け結果に基づき２次元マッピングを行う２次元マッピング部をさらに含む、〔１７〕又は〔１８〕に記載の分析システム。
〔２０〕開裂可能なリンカーとバーコード配列と標的捕捉部とを含む分子が前記リンカーを介して固定されており、且つ、
　前記バーコード配列が、当該バーコード配列を含む分子が固定されている位置に関する情報を与えるために用いられる、
　分析用表面。
１００　分子
１０１　分析用表面
１０２　基板
１０３　標本
１０４　基板
１１０　撮像素子
１２０　制御部
１３０　刺激付与装置

Claims (20)

  1. 　刺激によって開裂可能なリンカーとバーコード配列と標的捕捉部とを含む分子が前記リンカーを介して固定されている表面と重ねた状態で標本を撮像する撮像工程と、
    　前記撮像により得られた標本画像を用いて、細胞の位置と当該位置にある分子のバーコード配列とを関連付ける関連付け工程と、
    　前記細胞の位置に選択的に刺激を与えて、当該位置にある前記分子のリンカーを開裂させる開裂工程と、
    　前記開裂によって前記表面から遊離した前記分子を、当該分子の標的捕捉部を介して前記細胞の構成成分に結合させる結合工程と、
    　を含む分析方法。
  2. 　前記標本は組織サンプルを含む、請求項１に記載の分析方法。
  3. 　前記開裂工程において、前記細胞の位置以外の位置にある分子のリンカーが開裂しないように、前記細胞の位置に選択的に刺激が与えられる、請求項１に記載の分析方法。
  4. 　前記刺激が、光刺激である、請求項１に記載の分析方法。
  5. 　前記結合工程が、電場又は磁場又は遠心力の印可によって前記分子を前記細胞に向かって移動させる移動工程を含む、請求項１に記載の分析方法。
  6. 　前記結合工程が、自然拡散によって前記分子を前記細胞に向かって移動させる移動工程を含む、請求項１に記載の分析方法。
  7. 　前記結合工程が、前記分子と前記細胞の構成成分とを結合させるためのインキュベート工程を含む、請求項１に記載の分析方法。
  8. 　前記結合工程後に、前記分子と前記細胞の構成成分との結合体に対する分析を行う分析工程をさらに含む、請求項１に記載の分析方法。
  9. 　前記分析工程において、前記結合体に対するシークエンシング処理が行われる、請求項８に記載の分析方法。
  10. 　前記分析工程が、前記分析結果と前記標本画像とを用いて、前記関連付け工程における関連付け結果に基づき２次元マッピングを行う２次元マッピング工程を含む、請求項８に記載の分析方法。
  11. 　刺激によって開裂可能なリンカーとバーコード配列と標的捕捉部とを含む分子が前記リンカーを介して固定されている表面を有する分析用基板と、
    　前記分析用基板に重ねられた標本を撮像する撮像装置と、
    　前記撮像により得られた標本画像中の選択された細胞の位置と当該位置にある分子のバーコード配列とを関連付ける関連付け部と、
    　前記細胞の位置に選択的に刺激を与える刺激付与装置と、
    　を含み、
    　前記刺激によって前記表面から遊離した分子と前記細胞の構成成分とが前記分子の標的捕捉部を介して結合した結合体を分析対象として用いる、
    　分析システム。
  12. 　前記標本は組織サンプルを含む、請求項１１に記載の分析システム。
  13. 　前記刺激付与装置が、前記細胞の位置以外の位置にある分子に含まれるリンカーを開裂させることなく、前記細胞の位置に選択的に刺激が与えられるように構成されている、請求項１１に記載の分析システム。
  14. 　前記刺激付与装置が光照射装置である、請求項１１に記載の分析システム。
  15. 　前記分析システムが、前記刺激付与装置による刺激の付与によって前記表面から遊離した前記分子を前記細胞に向かって移動させるための電場又は磁場又は遠心力を印可する電場印可装置又は磁場印可装置又は遠心力印加装置を含む、請求項１１に記載の分析システム。
  16. 　前記分析システムが、前記刺激付与装置による刺激の付与によって前記表面から遊離した前記分子が前記細胞の構成成分と結合することを促すためのインキュベーション装置をさらに含む、請求項１１に記載の分析システム。
  17. 　前記分析システムが、前記刺激付与装置による刺激の付与によって前記表面から遊離した前記分子と前記細胞の構成成分との結合体を分析する分析装置をさらに含む、請求項１１に記載の分析システム。
  18. 　前記分析装置がシークエンサーである、請求項１７に記載の分析システム。
  19. 　前記分析システムが、前記分析装置による分析結果と前記撮像により得られた標本画像とを用いて、前記関連付け部による関連付け結果に基づき２次元マッピングを行う２次元マッピング部をさらに含む、請求項１７に記載の分析システム。
  20. 　開裂可能なリンカーとバーコード配列と標的捕捉部とを含む分子が前記リンカーを介して固定されており、且つ、
    　前記バーコード配列が、当該バーコード配列を含む分子が固定されている位置に関する情報を与えるために用いられる、
    　分析用表面。
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