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WO2021153524A1 - ウイルスの不活化方法、乾燥羊膜の製造方法及び乾燥羊膜 - Google Patents

ウイルスの不活化方法、乾燥羊膜の製造方法及び乾燥羊膜 Download PDF

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WO2021153524A1
WO2021153524A1 PCT/JP2021/002520 JP2021002520W WO2021153524A1 WO 2021153524 A1 WO2021153524 A1 WO 2021153524A1 JP 2021002520 W JP2021002520 W JP 2021002520W WO 2021153524 A1 WO2021153524 A1 WO 2021153524A1
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WO
WIPO (PCT)
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virus
amniotic membrane
inactivating
depressurizing
microwave
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Ceased
Application number
PCT/JP2021/002520
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English (en)
French (fr)
Inventor
素典 岡部
淑子 吉田
京子 林
雅彦 荒川
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sakura Seiki Co Ltd
Original Assignee
Sakura Seiki Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to JP2021527055A priority patent/JP7202582B2/ja
Priority to EP21748220.7A priority patent/EP4043557A4/en
Priority to CN202180011172.7A priority patent/CN115023496A/zh
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a method for inactivating a virus, a method for producing a dried amniotic membrane, and a dried amniotic membrane.
  • Capsid is a protein shell that surrounds the virus genome and is denatured by heat treatment at 56 ° C for 30 minutes or 100 ° C for 5 minutes to inactivate the virus.
  • heat treatment for example, in "liquid heat treatment” in which a plasma fractionated product in a solution state is heat-treated at 60 ° C. for 10 hours to inactivate the virus, and a blood coagulation factor preparation, the drug solution is vacuum freeze-dried and then "65 ° C.”
  • a “dry heat treatment” is performed in which the heat treatment is carried out under the condition of "for 96 hours”.
  • Microwaves are used as one of the heating means when inactivating a virus, and it is known that the virus is inactivated by microwave heating. Attempts have also been made to inactivate the influenza virus attached to the mask in a microwave oven using microwave heating (Patent Document 1).
  • vacuum drying in order to prevent the temperature of the dried product from dropping due to water evaporation, raise the temperature before putting it in the container, warm the entire container, and warm the dried product with radiant heat, on the heater plate inside the container.
  • a method such as placing a dried product in a container and warming it by heat conduction is common.
  • Patent Document 2 a method / apparatus for producing a dried product, which is heated by using microwaves and far infrared rays in combination under a vacuum having a low boiling point, shortens the drying time, and has extremely little oxidation.
  • regenerative medicine materials such as human or animal cells / tissues
  • virus inactivation / removal treatment it is required to be carried out in principle.
  • inactivation of viruses such as foods is generally required.
  • amniotic membrane is a membrane that nurtures a foetation and is discarded after childbirth, but it has long been used as a wound dressing because of its anti-inflammatory effect.
  • cryopreserved amniotic membrane has been used as a material for regenerative medicine in the field of ophthalmology.
  • studies have been made toward the practical application of dried amniotic membrane (hyper-dry dried amniotic membrane) produced by drying amniotic membrane under reduced pressure using far infrared rays and microwaves in combination.
  • microwave irradiation under reduced pressure in the manufacturing process of hyperdry dried amniotic membrane is a useful method as a means for virus inactivation of regenerative medicine materials, and further, microwave irradiation under reduced pressure is used. , It was found that it is also useful in general foods other than regenerative medicine materials.
  • the virus can be inactivated by irradiating various articles with microwaves under reduced pressure.
  • the virus can be inactivated as it dries in the process of producing the hyper-dry dried amniotic membrane.
  • FIG. 1 is a graph showing the inactivation of poliovirus.
  • FIG. 2 is a graph showing the inactivation of influenza virus.
  • FIG. 3 is a graph showing the inactivation of the herpes type 1 virus.
  • FIG. 4 is a graph showing the inactivation of the herpes type 1 virus.
  • FIG. 5 is a graph showing the inactivation of poliovirus.
  • FIG. 6 is a schematic view of a virus inactivating device.
  • the depressurization means 0.1 Kp to 6 in the container within the low vacuum (vacuum degree: 100 Pascal (0.1 Kp) or more) of the vacuum category defined by Japanese JIS (Japanese Industrial Standards). It is a slight depressurization of .0 Kp, preferably 0.3 Kpa to 5.5 Kpa. Further, the depressurization is preferably repeated a plurality of times in the range of 0.1 Kp to 6.0 Kp, and more preferably repeated a plurality of times in the range of 0.3 Kpa to 5.5 Kpa.
  • the microwave is a radio wave having a frequency of 300 MHz to 300 GHz (wavelength is 1 m to 1 mm), and what is used in the present invention is ITU (international telecommunications) for industrial, scientific, and medical purposes.
  • the radio wave has a frequency (ISM frequency) assigned by the Union), but is not particularly limited, but a microwave in the 2450 MHz band used in a microwave oven or the like is preferable.
  • Examples of the oscillating tube that generates microwaves include a magnetron with a built-in small and lightweight permanent magnet, and its output is 300 W to 10 kW. The preferred output is preferably 1 kW to 3 kW.
  • the output of the microwave at the time of irradiation with the microwave may be 100 W or more, preferably 100 W to 300 W. Further, at the time of microwave irradiation, the object (material for regenerative medicine, etc.) may be separately irradiated with far infrared rays.
  • the virus inactivated by the present invention is not particularly limited, and examples thereof include viruses having envelopes such as simple herpes virus, influenza virus, and human immunodeficiency virus; and viruses having no envelope such as norovirus, rotavirus, and adenovirus. Be done.
  • Examples of the device for carrying out the method of the present invention include a device having a configuration in which a schematic diagram is shown in FIG. Hereinafter, this device will be described.
  • a rotary table 12 is arranged in the processing tank 10, and the rotary table 12 is rotated by a motor 16 mounted outside the processing tank 10.
  • a vacuum pump 18 is arranged outside the processing tank 10, and an electromagnetic valve 20 is provided in the middle of a pressure reducing pipe 22 connecting the processing tank 10 and the vacuum pump 18.
  • a depressurizing pipe 28 provided with a filter 24 for filtering the sucked outside air and an electromagnetic valve 26 for sucking and repressurizing the outside air into the decompressed processing tank 10 treats the pressure. It is connected to the tank 10. Further, as a means for heating the amniotic membrane placed on the rotary table 12 of the treatment tank 10, a far-infrared heater 14 is arranged in the treatment tank 10, and an object placed on the rotary table 12 is provided. A microwave irradiation device 30 is provided on the outside of the processing tank 10 so that the microwave can be irradiated to the surface.
  • the installation temperature of the heating means is a temperature that does not destroy the cell tissue constituting the object, preferably 50 ° C. or lower.
  • an object for which the virus is to be inactivated is placed on the rotary table 12. While the rotary table 12 on which the object is placed is continuously rotated by the motor 16, the object is continuously heated by the far-infrared heater 14 as a heating means.
  • the vacuum pump 18 as a decompression means is driven and the solenoid valve 20 is opened to put the inside of the processing tank 10 in a decompressed state.
  • the solenoid valve 26 as the pressure restoring means is closed.
  • the microwave irradiation device 30 As the microwave irradiation device 30, a magnetron having an output of 1.5 KW is used. Further, the temperature of the far-infrared heater 14 is set to 50 ° C., and far-infrared rays are continuously irradiated to the object from the start to the end. Further, when the object is not placed in the processing tank 10, the maximum decompression reaching pressure by the vacuum pump 18 is set to 0.4 kPa. Place the object on the tray. Further, after placing this tray on the rotary table 12 in the processing tank 10, the rotary table 12 is rotated. The rotary table 12 continuously rotates from the start to the end.
  • the far-infrared heater 14 is turned on, the vacuum pump 18 is driven, and the solenoid valve 20 is opened to start a depressurizing operation for depressurizing the inside of the processing tank 10. Since the decompression rate decreases after a while from the start of decompression, when the maximum decompression reaching pressure reaches 0.90 kPa, the vacuum pump 18 is stopped, the solenoid valve 20 is closed, the solenoid valve 26 is opened, and dust and dirt are removed by the filter 24.
  • the repressurization operation of introducing the air filtered by the bacteria into the treatment tank 10 is started, and the pressure in the treatment tank 10 is repressurized to 4.53 kPa.
  • the magnetron as the microwave irradiation device 30 is turned on to irradiate the object on the rotary table 12 with microwaves.
  • the magnetron After heating with the far-infrared heater 14 and irradiating with microwaves for 3 minutes, the magnetron is turned off and the far-infrared heater 14 is turned on while the decompression operation is restarted.
  • the decompression operation After the inside of the processing tank 10 is decompressed to 0.62 kPa by the restarted decompression operation, the decompression operation of repressurizing the inside of the processing tank 10 to 4.63 kPa, and the heating and microwave irradiation by the far infrared heater 14 are performed for 3 minutes. conduct.
  • the decompression operation, the heating operation, and the recompression operation are performed a total of 6 times to complete the virus inactivation.
  • This end is determined by the maximum decompression reaching pressure in the processing tank 10 by the fifth depressurizing operation and the maximum depressurizing reaching pressure when the object is not placed in the processing tank 10. That is, when the maximum decompression reaching pressure of the sixth decompression operation reaches 0.40 kPa and becomes equal to the maximum depressurizing reaching pressure when the object is not placed in the processing tank 10, it is determined to end. ..
  • HSV-1 KOS strain Quantification of herpes simplex virus type 1 (HSV-1) HSV-1 KOS strain was infected with Vero cells (African green monkey kidney-derived cells), MEM medium supplemented with 2% fetal bovine serum was added, and CO2 was added. Incubate in an incubator. After confirming that CPE (pathological changes in cells caused by virus growth) have sufficiently appeared after 20 to 24 hours, the culture is transferred to a freezer at -80 ° C and frozen three times. After the thawing treatment, the solution is transferred to a tube and centrifuged (3,000 rpm, 4 ° C., 10 minutes) to obtain a supernatant.
  • Vero cells African green monkey kidney-derived cells
  • MEM medium medium supplemented with 2% fetal bovine serum was added
  • CO2 was added. Incubate in an incubator. After confirming that CPE (pathological changes in cells caused by virus growth) have sufficiently appeared after 20 to 24 hours, the culture is transferred to a freezer at -
  • Viral load measurements were performed by plaque assay. That is, after infecting Vero cells cultured 100 to 107 times with PBS (phosphate buffered physiological saline) in layers in a 35 mm dish in advance, the medium for plaque assay (0.8% methylcellulose and 2). % MEM medium supplemented with bovine fetal serum), placed in a CO2 incubator and cultured for 2 days, cells were fixed and stained with crystal violet solution, and the detected plaques were counted under a microscope. rice field.
  • PBS phosphate buffered physiological saline
  • poliovirus type 1 Sabin strain, which is a vaccine strain of Pol-1, is infected with Vero cells, MEM medium supplemented with 2% fetal bovine serum is added, and the mixture is placed in a CO2 incubator. Incubate. After confirming that CPE is sufficiently appearing after 20 to 24 hours, the medium is transferred to a tube and centrifuged (3,000 rpm, 4 ° C., 10 minutes) to obtain a supernatant. The supernatant is dispensed into microtubes and stored at -80 ° C. Viral load measurements were performed by plaque assay.
  • the medium for plaque assay (0.8% methylcellulose and 2).
  • % MEM medium supplemented with bovine fetal serum placed in a CO2 incubator and cultured for 2 days, cells were fixed and stained with crystal violet solution, and the detected plaques were counted under a microscope. rice field.
  • IFV influenza A virus
  • MDCK cells canine kidney-derived cells
  • MEM medium supplemented with 2% fetal bovine serum
  • the medium is transferred to a tube and centrifuged (3,000 rpm, 4 ° C., 10 minutes) to obtain a supernatant.
  • the supernatant is dispensed into microtubes and stored at -80 ° C. Viral load measurements were performed by plaque assay.
  • a virus solution diluted 100 to 107 times with PBS phosphate buffered physiological saline
  • PBS phosphate buffered physiological saline
  • a medium for plaque assay 2% agarose and 2).
  • % MEM medium supplemented with bovine fetal serum placed in a CO2 incubator and cultured for 2 days, cells were fixed and stained with crystal violet solution, and the detected plaques were counted under a microscope. rice field.
  • ⁇ Virus inactivation> Using the apparatus shown in FIG. 6, the virus in the virus solution was inactivated under the following conditions of vacuum, far infrared rays, and microwaves. -Tank heating: 50 ° C, F. I. R: 50 ° C., Stop valve: 37%, Maximum ultimate pressure 0.34 kPa Free operation Maximum ultimate pressure 0.33 kPa ⁇ Inactivation method (1) Decompression 180 sec (2) Restoration pressure 30 sec (stop valve opening 37%) Microwave input 0.1kW-180sec (recovery pressure continues) (3) Decompression 180 sec After (4), the repetition of (2) and (3) (5) The completion of inactivation is performed manually after confirming the ultimate pressure after 180 sec decompression of (3) (0.30 to 0.35 kPa). The pressure is restored to atmospheric pressure and the process ends.
  • FIG. 1 shows the inactivated state of poliovirus.
  • 1 nothing is done
  • 2 microwave 0W + far infrared rays
  • 3 microwave 100W + far infrared rays
  • 4 microwave 200W + far infrared rays
  • 5 microwave 300W + far infrared rays.
  • FIG. 2 shows the inactivated state of influenza virus.
  • 1 nothing is done
  • 2 microwave 0W + far infrared rays
  • 3 microwave 100W + far infrared rays
  • 4 microwave 200W + far infrared rays
  • 5 microwave 300W + far infrared rays.
  • FIG. 3 shows the inactivated state of the herpes type 1 virus.
  • 1 nothing is done
  • 2 microwave 0W + far infrared rays
  • 3 microwave 100W + far infrared rays
  • 4 microwave 200W + far infrared rays
  • 5 microwave 300W + far infrared rays.
  • far-infrared rays alone have some effect, but it can be seen that the combination of microwaves and far-infrared rays has a high effect of virus inactivation regardless of the output of microwaves.
  • the infectivity of the virus is reduced to several percent by decompression and far infrared rays, but further reduced by microwave irradiation, and the combined use of both causes the virus to be finally inactivated to 0.5% or less. That is, the infectivity of the virus can be reduced to 1/200 to 1/1000 by controlling the three elements of vacuum, far infrared rays, and microwaves.
  • FIG. 4 shows the inactivated state of the herpes type 1 virus when far infrared rays are not irradiated.
  • 1 nothing is done
  • 2 microwave 100W
  • 3 microwave 100W + far infrared rays.
  • FIG. 5 shows the inactivated state of poliovirus when far infrared rays are not irradiated.
  • 1 nothing is done
  • 2 microwave 100W
  • 3 microwave 100W + far infrared rays.
  • a method for producing a dried amniotic membrane as a regenerative medicine material inactivated by a virus will be described using the apparatus shown in FIG.
  • a raw amniotic membrane that wraps the foetation of an animal including a human is placed.
  • a human-derived amniotic membrane particularly a raw amniotic membrane separated from a placenta delivered by cesarean section in a sterile state, can be preferably used.
  • the raw amniotic membrane is spread out in a sheet shape and placed on the rotary table 12 in the treatment tank 10.
  • the raw amniotic membrane is spread out in a sheet shape and placed on the water-absorbing paper spread on the rotary table 12 in the treatment tank 10. This is because the raw amniotic membrane can be easily dehydrated. In this way, while the rotary table 12 on which the raw amniotic membrane is placed is continuously rotated by the motor 16, the raw amniotic membrane is continuously heated by the far-infrared heater 14 as a heating means.
  • the vacuum pump 18 as a decompression means is driven and the solenoid valve 20 is opened to bring the inside of the treatment tank 10 into a decompression state.
  • the solenoid valve 26 as the pressure restoring means is closed.
  • the drive of the vacuum pump 18 as the depressurizing means is stopped, and the solenoid valve 20 is closed to end the depressurizing step.
  • the solenoid valve 26 as the repressurizing means is opened, and the repressurizing step of sucking the outside air into the processing tank 10 to repressurize the inside of the processing tank 10 is started.
  • the repressurization step is executed so that the pressure inside the processing tank 10 becomes a predetermined pressure (for example, 4.63 kPa).
  • the magnetron as the microwave irradiation device 30 is turned on to irradiate the amniotic membrane on the rotary table 12 with microwaves.
  • the far-infrared irradiation by the far-infrared heater 14 is constantly performed during the depressurizing step and the depressurizing step.
  • the magnetron is turned off and the pressure recovery step is completed.
  • the decompression process is restarted while the far-infrared heater 14 is turned on.
  • the far-infrared heater 14 is in the process of reducing the pressure inside the processing tank 10 to a predetermined pressure (for example, 0.62 kPa) by the restarted depressurizing step, and then returning the inside of the processing tank 10 to a predetermined pressure (for example, 4.63 kPa). Warming and microwave irradiation for 3 minutes.
  • the operations of the depressurizing step, the heating and the repressurizing step are repeated 6 times in total to complete the virus inactivation.
  • the amniotic membrane is dehydrated and dried without destroying the epithelial cells, basement membrane and connective tissue that compose the amniotic membrane, and at the same time, the virus is inactivated and immersed in water or a buffer solution for re-implantation.
  • the virus is inactivated and immersed in water or a buffer solution for re-implantation.
  • it is possible to produce a virus-inactivated dry amniotic membrane in which epithelial cells, basement membrane and connective tissue are retained, similar to the raw amniotic membrane.
  • microwave irradiation is performed during the decompression step after decompressing the inside of the treatment tank 10 to a predetermined pressure
  • microwave irradiation is depressurized. It may be performed during the stroke or both during the depressurization step and during the decompression step.
  • the virus inactivating method of the present invention is useful as a virus inactivating method when a biological material such as amniotic membrane is dried and produced. Further, it can be applied to the inactivation of the regenerative medicine material itself, the inactivation when the regenerative medicine material is dried, and further to the food processing.

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Abstract

ウイルス不活化を行う為の技術の開発を課題とする。　解決手段として、種々の物品に対して、マイクロ波照射を行うことによってウイルスを不活性化させる。

Description

ウイルスの不活化方法、乾燥羊膜の製造方法及び乾燥羊膜
　本発明は、ウイルスの不活化方法、乾燥羊膜の製造方法及び乾燥羊膜に関する。
　カプシドは、ウイルスゲノムを取り囲むタンパク質の殻であり、５６℃３０分あるいは１００℃５分の加熱処理で変性し、ウイルスは不活化される。この応用として、例えば、溶液状態の血漿分画製剤を６０℃で１０時間加熱処理しウイルスを不活化させる「液状加熱処理」および血液凝固因子製剤等では、薬液を真空凍結乾燥後、「６５℃、９６時間」の条件で加熱処理する「乾燥加熱処理」が行われている。
　ウイルスの不活性化を行うに際してマイクロ波が加熱手段の一つとして用いられており、マイクロ波加熱によりウイルスが不活化されることが知られている。また、マイクロ波加熱を利用する電子レンジでマスクに付着したインフルエンザウイルスの不活化する試みもなされている（特許文献１）。
　一方、野菜・果物等の乾燥に関し、乾燥させる対象物（野菜・果物等）を密閉容器に入れ、水蒸気分圧差を人工的に大きくするために真空ポンプで減圧排気する方法、「真空乾燥（減圧乾燥）」が知られている。真空乾燥では、水分蒸発に伴う乾燥物の温度低下を防ぐため、容器内に入れる前に温度を上げておく、容器全体を暖めて、幅射熱で乾燥物を暖める、容器内のヒータ板上に乾燥物を置き熱伝導で暖める等の方法が一般的である。また、沸点の低い真空下でマイクロ波と遠赤外線を併用した加熱を行い、乾燥時間を短縮し、酸化が極めて少ない乾燥品の製造法・製造装置が知られている（特許文献２）。
特開２０１１－１５８２２ 特開２０００－２２０９６３
　ヒト又は動物の細胞・組織等の再生医療用材料は、製造工程中にウイルス等の感染性物質を不活化／除去する工程を設定することが困難であることが多いとされている。しかし、ウイルス不活化／除去処理が可能であれば、原則、実施することが求められている。
さらに、再生医療用材料以外にも食品など一般的にウイルスの不活性化が求められている。
　羊膜は胎児を育成する膜であり、出産後には廃棄されるが、抗炎症効果があるとして古くから創傷の被覆材として利用されていた。近年、凍結保存された羊膜は、眼科領域の再生医療用材料として利用されている。一方、羊膜を、減圧下に遠赤外線とマイクロ波を併用して乾燥して製造される乾燥羊膜（ハイパードライ乾燥羊膜）の実用化に向けた検討がなされている。
　本発明者らは、ハイパードライ乾燥羊膜の製造工程における減圧下のマイクロ波照射が、再生医療用材料のウイルス不活化の手段として有用な方法であることを見出し、さらに減圧下のマイクロ波照射が、再生医療用材料以外の一般的な食品などにおいても有用であることを見出した。
　種々の物品に対して減圧下においてマイクロ波照射を行うことによってウイルスを不活性化させることができる。
　また、ハイパードライ乾燥羊膜の製造過程において乾燥とともにウイルスの不活化を行うことができる。
図１は、ポリオウイルスの不活化を示すグラフである。 図２は、インフルエンザウイルスの不活化を示すグラフである。 図３は、ヘルペス1型ウイルスの不活化を示すグラフである。 図４は、ヘルペス1型ウイルスの不活化を示すグラフである。 図５は、ポリオウイルスの不活化を示すグラフである。 図６は、ウイルス不活化装置の概略図である。
以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明において、減圧とは、日本のＪＩＳ（日本工業規格）で定められた真空の区分の低真空（真空度：１００パスカル（０.１Ｋｐ）以上）の内、容器内を０.１Ｋｐ～６.０Ｋｐの微減圧とすることであり、好ましくは、０.３Ｋｐａ～５.５Ｋｐａとすることである。また、減圧は、０. １Ｋｐ～６.０Ｋｐの範囲で複数回繰り返し行うことが好ましく、０.３Ｋｐａ～５.５Ｋｐａの範囲で複数回繰り返し行うことがさらに好ましい。
　本発明においてマイクロ波とは、周波数が３００ＭＨｚから３００ＧＨｚ（波長が１ｍから１ｍｍ）の電波であり、本発明で使用されるのは、工業用、科学用、医療用を目的としてＩＴＵ（国際電気通信連合）が割り当てた周波数（ＩＳＭ周波数）の電波であれば、特に限定されないが、電子レンジ等で使用される、２４５０ＭＨｚ帯のマイクロ波が好ましい。
　マイクロ波を発生させる発振管としては、例えば、小形軽量永久磁石内蔵マグネトロンが挙げられ、その出力は、３００Ｗ～１０ｋＷである。好ましい出力はものとして１ｋＷ～３ｋＷである。
　マイクロ波の照射時におけるマイクロ波の出力は１００Ｗ以上であればよく、好ましくは１００Ｗ～３００Ｗである。また、マイクロ波照射時、その対象物（再生医療用材料等）に対して、別途、遠赤外線の照射がされていてもよい。
　本発明で不活化されるウイルスは、特に限定されないが、単純ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルスなどのエンベロールを有するウイルス；ノロウイルス・ロタウイルス・アデノウイルスなどのエンベローブを有さないウイルスが挙げられる。
　本発明の方法を実施するための装置としては、例えば、概略図を図６に示す構成の装置が挙げられる。以下、この装置について説明する。
　装置では、処理槽１０内に回転テーブル１２が配設されており、回転テーブル１２は処理槽１０外に載置されたモータ１６によって回転する。
　かかる処理槽１０の減圧手段として、真空ポンプ１８が処理槽１０外に配設されており、処理槽１０と真空ポンプ１８とを接続する減圧配管２２の途中に電磁弁２０が設けられている。
　更に、処理槽１０の復圧手段として、減圧状態の処理槽１０内に外気を吸引して復圧すべく、吸込む外気を濾過するフィルター２４と電磁弁２６とが設けられた復圧配管２８が処理槽１０に接続されている。
　また、処理槽１０の回転テーブル１２上に載置された羊膜の加温手段として、処理槽１０内に遠赤外線ヒータ１４が配設されていると共に、回転テーブル１２上に載置された対象物にマイクロ波を照射できるように、処理槽１０の外側にマイクロ波照射装置３０が設けられている。かかる加温手段の設置温度は対象物を構成する細胞組織を破壊することのない温度、好ましくは５０℃以下とする。
　図６に示す装置を用いてウイルスを不活化する際には、回転テーブル１２上にウイルスを不活化したい対象物を載置する。対象物を載置した回転テーブル１２をモータ１６によって連続回転しつつ、加温手段としての遠赤外線ヒータ１４によって対象物を連続的に加温する。
　遠赤外線ヒータ１４によって処理槽１０内の対象物を連続的に加温しつつ、減圧手段としての真空ポンプ１８を駆動し且つ電磁弁２０を開放にして、処理槽１０内を減圧状態とする。この際に、復圧手段としての電磁弁２６は閉じている。
　図６の装置を使用したウイルスの不活化について、一例を説明する。
マイクロ波照射装置３０としては、出力１．５ＫＷのマグネトロンを用いる。また、遠赤外線ヒータ１４の温度設定を５０℃とし、遠赤外線を対象物に対して開始から終了まで連続照射する。更に、処理槽１０内に対象物を載置していないとき、真空ポンプ１８による最高減圧到達圧力を０．４ｋＰａとなるように設定する。対象物をトレイ上に載置する。更に、このトレイを処理槽１０内の回転テーブル１２上に載置した後、回転テーブル１２を回転する。この回転テーブル１２は、開始から終了まで連続回転する。
　次いで、遠赤外線ヒータ１４をＯＮとして、真空ポンプ１８を駆動すると共に電磁弁２０を開けて処理槽１０内を減圧する減圧操作を開始する。減圧開始から暫くすると減圧速度が低下するので、最高減圧到達圧力が０.９０ｋＰａに到達したとき、真空ポンプ１８を停止すると共に電磁弁２０を閉じ、電磁弁２６を開いて、フィルター２４によってゴミや細菌が濾過された空気を処理槽１０内に導入する復圧操作を開始し、処理槽１０内の圧力を４.５３ｋＰａに復圧する。
　かかる復圧操作の開始と同時に、マイクロ波照射装置３０としてのマグネトロンをＯＮとしてマイクロ波を回転テーブル１２上の対象物に照射する。
　かかる遠赤外線ヒータ１４よる加温およびマイクロ波照射を３分間施した後、マグネトロンをＯＦＦにして、遠赤外線ヒータ１４をＯＮとしつつ減圧操作を再開する。再開した減圧操作によって処理槽１０内を０.６２ｋＰａまで減圧状態とした後、処理槽１０内を４.６３ｋＰａに復圧する復圧操作と、遠赤外線ヒータ１４よる加温およびマイクロ波照射を３分間行う。かかる減圧操作、加温操作及び復圧操作を合計で６回施してウイルス不活化を終了する。
　この終了は、第５回目の減圧操作による処理槽１０内の最高減圧到達圧力と、処理槽１０内に対象物を載置していないときの最高減圧到達圧力とによって判断する。すなわち、第６回目の減圧操作の最高減圧到達圧力が０.４０ｋＰａに到達し、処理槽１０内に対象物を載置していないときの最高減圧到達圧力と等しくなった時点で終了と判断する。
　なお、上述したウイルスの不活化方法においては、処理槽１０内を所定の圧力まで減圧した後、復圧工程中にマイクロ波照射を実行した例について説明したが、マイクロ波照射は減圧行程中に実行してもよく又は減圧工程中と復圧工程中の双方で実行してもよい。
＜ウイルス液の調製とプラークアッセイによるウイルス量測定の方法＞
　１）単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）の定量
ＨＳＶ－１のＫＯＳ株を、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎由来細胞）に感染させて、２％ウシ胎児血清を添加したＭＥＭ培地を加え、ＣＯ２インキュベータに入れて培養する。２０～２４時間後にＣＰＥ（ウイルスが増殖することによって生じる細胞の病的変化）が充分に出現していることを確認の上で、培養物を－８０℃の冷凍庫に移し、３回の凍結・融解処理後に液をチューブに移し、遠心（３,０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）して上清を得る。この上清をマイクロチューブに分注して、－８０℃で保存する。ウイルス量の測定は、プラークアッセイ法で実施した。即ち、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で１００～１０７倍希釈したウイルス液を、前もって３５ｍｍディッシュに層状に培養したＶｅｒｏ細胞に感染させた後、プラークアッセイ用培地（０.８％メチルセルロース及び２％ウシ胎児血清を添加したＭＥＭ培地）を加えて、ＣＯ２インキュベータに入れて２日間培養し、細胞をクリスタルバイオレット液で固定・染色処理して、検出されたプラークを顕微鏡下でカウントすることによって行なった。
　２）ポリオウイルス１型（Ｐｏｌ－１）の定量
Ｐｏｌ－１のワクチン株であるＳａｂｉｎ株を、Ｖｅｒｏ細胞に感染させて、２％ウシ胎児血清を添加したＭＥＭ培地を加え、ＣＯ２インキュベータに入れて培養する。２０～２４時間後にＣＰＥが充分に出現していることを確認の上で、培地をチューブに移し、遠心（３,０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）して上清を得る。この上清をマイクロチューブに分注して、－８０℃で保存する。ウイルス量の測定は、プラークアッセイ法で実施した。即ち、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で１００～１０７倍希釈したウイルス液を、前もって３５ｍｍディッシュに層状に培養したＶｅｒｏ細胞に感染させた後、プラークアッセイ用培地（０.８％メチルセルロース及び２％ウシ胎児血清を添加したＭＥＭ培地）を加えて、ＣＯ２インキュベータに入れて２日間培養し、細胞をクリスタルバイオレット液で固定・染色処理して、検出されたプラークを顕微鏡下でカウントすることによって行なった。
　３）Ａ型インフルエンザウイルス（ＩＦＶ）の定量
ＩＦＶのＡ／ＮＷＳ／３３株　（Ｈ１Ｎ１亜型）を、ＭＤＣＫ細胞（イヌ腎由来細胞）に感染させて、２％ウシ胎児血清を添加したＭＥＭ培地を加え、ＣＯ２インキュベータに入れて培養する。２０～２４時間後にＣＰＥが充分に出現していることを確認の上で、培地をチューブに移し、遠心（３,０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）して上清を得る。この上清をマイクロチューブに分注して、－８０℃で保存する。ウイルス量の測定は、プラークアッセイ法で実施した。即ち、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で１００～１０７倍希釈したウイルス液を、前もって３５－ｍｍディッシュに層状に培養したＭＤＣＫ細胞に感染させた後、プラークアッセイ用培地（２％アガロース及び２％ウシ胎児血清を添加したＭＥＭ培地）を加えて、ＣＯ２インキュベータに入れて２日間培養し、細胞をクリスタルバイオレット液で固定・染色処理して、検出されたプラークを顕微鏡下でカウントすることによって行なった。
＜ウイルス不活化＞
　図６に示す装置を用い、下記の真空・遠赤外線・マイクロ波の条件において、ウイルス溶液のウイルスを不活化した。
・槽加温：５０℃、Ｆ．Ｉ．Ｒ：５０℃、ストップ弁：３７％、最高到達圧力０．３４ｋＰａ　空運転最高到達圧力０．３３ｋＰａ
・不活化の方法
　（１）減圧　１８０ｓｅｃ  
　（２）復圧　３０ｓｅｃ（ストップ弁開度３７％）
　　マイクロ波投入　０．１ｋｗ－１８０ｓｅｃ（復圧は継続）
　（３）減圧　１８０ｓｅｃ　
　（４）以降、（２）・（３）の繰返し
　（５）不活化終了は、（３）の１８０ｓｅｃ減圧後到達圧力を確認し（０．３０～０．３５　ｋＰａ）、手動にて行う。
　大気圧まで復圧し終了。
　図１にポリオウイルスの不活化の状態を示す。
　このグラフにおいて、1:何もしない状態、2:マイクロ波0W+遠赤外線、3: マイクロ波100W＋遠赤外線、4: マイクロ波200W＋遠赤外線、5:マイクロ波300W＋遠赤外線である。
　このようにポリオウイルスの場合、マイクロ波200W＋遠赤外線の場合にウイルス不活性化の効果が高いことがわかる。
　図２にインフルエンザウイルスの不活化の状態を示す。
　このグラフにおいて、1:何もしない状態、2:マイクロ波0W+遠赤外線、3: マイクロ波100W＋遠赤外線、4: マイクロ波200W＋遠赤外線、5:マイクロ波300W＋遠赤外線である。
　このようにインフルエンザウイルスの場合、マイクロ波の出力にかかわらず、マイクロ波と遠赤外線の組み合わせによりウイルス不活性化の効果が高いことがわかる。
　図３にヘルペス1型ウイルスの不活化の状態を示す。
　このグラフにおいて、1:何もしない状態、2:マイクロ波0W+遠赤外線、3: マイクロ波100W＋遠赤外線、4: マイクロ波200W＋遠赤外線、5:マイクロ波300W＋遠赤外線である。
　このようにヘルペス1型ウイルスの場合、遠赤外線だけでもある程度の効果があるが、さらにマイクロ波の出力にかかわらず、マイクロ波と遠赤外線の組み合わせによりウイルス不活性化の効果が高いことがわかる。
　ウイルスの感染力は、減圧と遠赤外線により数％まで低下するが、さらにマイクロ波照射でさらに低下し、両者の併用により最終的にウイルスは０.５％以下にまで不活性する。
　すなわち、真空、遠赤外線、マイクロ波の3要素の制御によりウイルスの感染力を１／２００～１／１０００まで減少させる事ができる。
　図４に、遠赤外線を照射しない場合のヘルペス1型ウイルスの不活化の状態を示す。
　このグラフにおいて1:何もしない状態、2:マイクロ波100W、3: マイクロ波100W＋遠赤外線である。
　このようにヘルペス1型ウイルスに対して、減圧下においてマイクロ波を照射すれば、遠赤外線を照射しなくてもウイルスの不活化がある程度達成できることがわかる。
　図５に、遠赤外線を照射しない場合のポリオウイルスの不活化の状態を示す。
　このグラフにおいて1:何もしない状態、2:マイクロ波100W、3: マイクロ波100W＋遠赤外線である。
　このようにポリオウイルスに対して、減圧下においてマイクロ波を照射すれば、遠赤外線を照射しなくてもウイルスの不活化がある程度達成できることがわかる。
　次に、図６に示した装置を用いて、ウイルスが不活化された再生医療材料としての乾燥羊膜を製造する方法について説明する。
　回転テーブル１２上に、人を含む動物の胎児を包む生羊膜を載置する。この生羊膜としては、人由来の生羊膜、特に帝王切開分娩した胎盤等から無菌状態で分離した生羊膜を好適に用いることができる。
　かかる生羊膜は、処理槽１０内の回転テーブル１２上にシート状に広げて載置する。特に、生羊膜を、処理槽１０内の回転テーブル１２上に広げた吸水紙上にシート状に広げて載置することが好ましい。生羊膜の脱水を容易に行なうことができるためである。
　この様に、生羊膜を載置した回転テーブル１２をモータ１６によって連続回転しつつ、加温手段としての遠赤外線ヒータ１４によって生羊膜を連続的に加温する。
　遠赤外線ヒータ１４によって処理槽１０内の羊膜を連続的に加温しつつ、減圧手段としての真空ポンプ１８を駆動し且つ電磁弁２０を開放にして、処理槽１０内を減圧状態とする。この際に、復圧手段としての電磁弁２６は閉じている。
　処理槽１０内が所定圧力（例えば０.６２ｋＰａ）に到達後、減圧手段としての真空ポンプ１８の駆動を停止すると共に、電磁弁２０を閉じて減圧工程を終了する。
　そして復圧手段としての電磁弁２６を開放し、処理槽１０内に外気を吸引して処理槽１０内を復圧する復圧工程を開始する。復圧工程は、処理槽１０内が所定圧力（例えば４.６３ｋＰａ）になるように実行される。
　そして、復圧工程の開始と同時にマイクロ波照射装置３０としてのマグネトロンをＯＮとしてマイクロ波を回転テーブル１２上の羊膜に照射する。なお、遠赤外線ヒータ１４による遠赤外線照射は、減圧工程及び復圧工程の間常時行っている。
　復圧工程時において、遠赤外線ヒータ１４よる加温及びマイクロ波照射を所定時間（例えば３分間）施した後、マグネトロンをＯＦＦにし、復圧工程を終了する。
　復圧工程終了後、遠赤外線ヒータ１４をＯＮとしつつ減圧工程を再開する。
　再開した減圧工程によって処理槽１０内を所定圧力（例えば０.６２ｋＰａ）まで減圧状態とした後、処理槽１０内を所定圧力（例えば４.６３ｋＰａ）に復圧する復圧工程中に遠赤外線ヒータ１４よる加温およびマイクロ波照射を３分間行う。
　かかる減圧工程、加温及び復圧工程の操作を繰り返し合計６回施してウイルス不活化を終了する。
　上述してきたような方法により、生羊膜をその構成する上皮細胞、基底膜及び結合組織を破壊することなく脱水・乾燥し、且つ同時にウイルスが不活化されて、水又は緩衝液に浸漬して再水和した際、生羊膜と同様の、上皮細胞、基底膜及び結合組織が保持されているウイルス不活化乾燥羊膜を製造することができる。
　なお、上述したウイルス不活化乾燥羊膜の製造方法においては、処理槽１０内を所定の圧力まで減圧した後、復圧工程中にマイクロ波照射を実行した例について説明したが、マイクロ波照射は減圧行程中に実行してもよく又は減圧工程中と復圧工程中の双方で実行してもよい。
　本発明のウイルス不活化方法は羊膜などの生物由来材料を乾燥させて製造する際のウイルス不活化方法として有用である。また、再生医療用材料そのもの不活化、再生医療用材料を乾燥する際の不活化、さらに食品加工の際にも応用することができる。

 

Claims (11)

  1. 　マイクロ波照射を行うことによってウイルスを不活化させることを特徴とするウイルスの不活化方法。
  2. 　減圧下においてマイクロ波照射を行うことを特徴とする請求項１記載のウイルスの不活化方法。
  3. 　減圧下が低真空である請求項２記載のウイルスの不活化方法。
  4. マイクロ波がＩＳＭ周波数である請求項１～請求項３のうちのいずれか１項記載のウイルスの不活化方法。
  5. 　再生医療用材料を対象物とする請求項１～請求項４のうちのいずれか１項記載のウイルスの不活化方法。
  6. 　人を含む動物の胎児を包む生羊膜に対して、マイクロ波を照射することによる乾燥処理とウイルスの不活化とを同時に実行する乾燥羊膜の製造方法。
  7. 　減圧下において、マイクロ波を照射することを特徴とする請求項６記載の乾燥羊膜の製造方法。
  8. 　対象となる羊膜を載置する処理槽と、前記処理槽内を減圧状態とする減圧手段と、減圧状態の前記処理槽内に載置した羊膜を加温するとともにウイルスの不活化を行うマイクロ波照射装置と、前記処理槽内の減圧状態を大気圧方向に復圧する復圧手段と、を具備する乾燥装置を用い、
    　前記減圧手段によって前記処理槽内を減圧する減圧工程と、前記復圧手段によって前記処理槽内を復圧する復圧工程を交互に複数回繰り返し実行するとともに、
    　前記マイクロ波照射装置により前記処理槽内に載置された羊膜にマイクロ波を照射することにより乾燥処理とウイルスの不活化とを同時に実行する乾燥羊膜の製造方法。
  9. 　前記復圧手段による復圧工程を実行中に前記マイクロ波照射装置により前記処理槽内に載置された羊膜にマイクロ波を照射することを特徴とする請求項８記載の乾燥羊膜の製造方法。
  10. 　前記乾燥装置は、遠赤外線ヒータを具備し、
    　前記遠赤外線ヒータは、前記繰り返し実行される減圧工程と復圧工程の間は常に前記処理槽内の羊膜を加温することを特徴とする請求項７又は請求項８記載の乾燥羊膜の製造方法。
  11. 　人を含む動物の胎児を包む生羊膜を、生羊膜の細胞組織を破壊することなく乾燥処理して得た乾燥羊膜であって、
    前記乾燥処理時においてウイルス不活化処理がなされており、
    無菌状態の乾燥大気中で保存できるように脱水乾燥されていると共に、
    水又は緩衝液に浸漬して再水和した際、生羊膜と同様の、上皮細胞、基底膜及び結合組織が保持されていることを特徴とする乾燥羊膜。

     
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