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WO2021028475A1 - Procede d'isolation de souches de bacterie lactique surproductrices d'exopolysaccharides - Google Patents

Procede d'isolation de souches de bacterie lactique surproductrices d'exopolysaccharides Download PDF

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Publication number
WO2021028475A1
WO2021028475A1 PCT/EP2020/072634 EP2020072634W WO2021028475A1 WO 2021028475 A1 WO2021028475 A1 WO 2021028475A1 EP 2020072634 W EP2020072634 W EP 2020072634W WO 2021028475 A1 WO2021028475 A1 WO 2021028475A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
strain
sequence seq
lactic acid
acid bacteria
equivalent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2020/072634
Other languages
English (en)
Inventor
Saulius KULAKAUSKAS
Marie-Pierre Chapot-Chartier
Pascal Courtin
Pierre Renault
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Original Assignee
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement filed Critical Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Publication of WO2021028475A1 publication Critical patent/WO2021028475A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/123—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt
    • A23C9/1234—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt characterised by using a Lactobacillus sp. other than Lactobacillus Bulgaricus, including Bificlobacterium sp.
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    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/175—Rhamnosus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus

Definitions

  • the present invention relates to new strains of lactic acid bacteria and to their uses.
  • Lactic bacteria are Gram-positive bacteria widely used in food fermentations because of their ability to convert sugars into lactic acid. Lactococci and lactobacilli are thus used in milk fermentations for the production of cheese and yogurts where the production of lactic acid contributes to limiting the deterioration of food. In addition, these lactic acid bacteria contribute to the development of organoleptic properties, in particular the texture and flavor of these dairy products.
  • Lactic acid bacteria are also very present in the human intestinal microbiota where they contribute to the proper functioning of digestion. Moreover, certain natural strains of lactic acid bacteria, in particular lactobacilli, are marketed as probiotics for their beneficial health properties.
  • EPS exopolysaccharides
  • these EPSs which are polymers of carbohydrates, have the particularity of being secreted into the growth medium or loosely bound to the cell surface unlike other polysaccharides in the wall which are covalently bound to the cell wall.
  • bacteria producing EPS has been considered for the production of low-fat cheese.
  • these same EPSs influence bacteria-host interactions, in particular by affecting adhesion to the host cell and to the mucosa or bacterial-mediated immunomodulation. It was thus recently observed that the EPS of Lactobacillus rhamnosus were able to interfere with the spread of Candida and thus act as an anti-candidiasis agent.
  • the inventors have developed a method for isolating a bacterial strain of lactic acid type capable of overproducing exopolysaccharides, which method does not use bacteriophages or antibiotic resistance genes and which comprises at least one step differential sedimentation.
  • a first object of the invention relates to a method for isolating a strain of lactic acid bacteria capable of overproducing exopolysaccharides, which comprises the steps of: i) culturing a bacterial population of lactic acid bacteria in a semi-liquid culture medium, ii) identification and isolation of the clones exhibiting less mobility in said culture medium.
  • a second object relates to a bacterial strain capable of being obtained by the process according to the invention.
  • Another subject of the invention relates to a composition comprising such a strain according to the invention.
  • a complementary object of the invention relates to the use of a strain of lactic acid bacteria according to the invention as a rheological agent.
  • a final subject of the invention relates to a polysaccharide, which can be obtained by culturing the strain CNCM-5413, which polysaccharide has the following structure:
  • FIG. 2 Relative production of exopolysaccharides by Lb. Rhamnosus VES7418 and its overproducing derivatives of EPS.
  • Strain VES7517 strain LGG
  • LACTUS fermented milk product “LACTUS” of the brand CARREFOUR
  • VES764S isolated from the capsules of “TROPHIGYL” of the brand SANOFI
  • Figure 3 Alignment of the EPSD protein sequence of Lb. rhamnosus of strain VES7418 (SEQ ID NO: 1) and of the YVEL homologous sequence of phylogenetically distant Bacillus subtilis strain 168 (accession number P71051; SEQ ID NO: 19). the sites of mutations are indicated in bold.
  • Figure 4 Sequence of the EPSC protein of the Lb rhamnosus strain VES7699 (SEQ ID NO: 19).
  • Figure 5 Graph showing the viscosity of the culture medium of different strains of lactic acid bacteria producing different EPS. The viscosity of the medium is expressed in centipoise (cP).
  • Figure 6 Structures of polysaccharides purified from Lactobacillus rhamnosus strain VES746S and VES7671.
  • a first object of the invention relates to a method for isolating a strain of lactic acid bacteria capable of overproducing exopolysaccharides, which comprises the steps of: i) culturing a bacterial population of lactic acid bacteria in a culture medium semi-liquid, ii) identification and isolation of clones exhibiting less mobility in said culture medium.
  • the principle of the process according to the invention is based on differential sedimentation.
  • the clones of strains overproducing exopolysaccharides have more difficulty in sedimenting in a semi-liquid culture medium than the strains producing less.
  • this sedimentation differential is simply visually accessible since the more a clone has an excess production capacity of exopolysaccharides, the less mobile it will be in the semi-liquid culture medium and the more circular the appearance of the associated colony will be.
  • the less capacity a clone will exhibit for producing exopolysaccharides the more mobile it will be in the semi-liquid culture medium and the more the appearance of the associated colony will be tapering (root).
  • lactic acid bacterium is meant a Gram-positive bacterium, anaerobes which are partially tolerant to oxygen and whose fermentation of sugars is accompanied by the production of acid, mainly lactic acid (otherwise acetic acid and acid propionic).
  • the most widely used lactic acid bacteria in the food industry belong to the order of lactobacilli which includes bacteria belonging to the genus Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pseudoleuconostoc, Pediococcus, Brevibacterium, Enterococcus and Propionibacterium.
  • lactobacilli which includes bacteria belonging to the genus Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pseudoleuconostoc, Pediococcus, Brevibacterium, Enterococcus and Propionibacterium.
  • lactobacilli includes bacteria belonging to the gen
  • lactic acid bacterium means a bacterium belonging to the genus Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bifidocbacterium, Leuconostoc or Pediococcus.
  • such a lactic acid bacterium belongs to one of the following species:
  • Lactobacillus delbrueckii Lactobacillus casei
  • Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus rhamnosus, and - Lactobacillus fermentum.
  • culture medium is meant a culture medium suitable for the growth of the bacterial population screened. Naturally, the culture medium in question allows good synthesis of exopolysaccharides. By way of example, it is possible to use MRS or Todd-Hewitt medium.
  • semi-liquid as regards a culture medium, is meant the viscosity corresponding to a culture medium which comprises agar agar at a content of between 0.03 and 0.2% (by weight relative to the total weight of the composition), preferably between 0.1 and 0.15% and, ideally, of the order of 0.1%.
  • the method according to the invention comprises a preliminary step of mutagenesis.
  • this mutagenesis step is carried out on a strain of bacteria so as to obtain a bacterial population.
  • Mutagenesis techniques are well known to those skilled in the art and a distinction is then made between random mutagenesis and site-directed mutagenesis. These two mutageneses induce one or more mutations in bacterial DNA.
  • Such mutations can consist of substitutions (one or more nucleotides are replaced by the same number of different nucleotides), of insertions (one or more nucleotides are added to a target sequence), and / or of deletions (one or more nucleotides are removed from the sequence).
  • Random mutagenesis makes it possible to obtain a large number of mutants in that it induces mutations in DNA randomly.
  • Such mutagenesis can be obtained by exposing bacteria to a physical agent (UV, temperature, etc.) or to a chemical agent (CaCl2, DMSO, etc.).
  • site-directed mutagenesis allows the induction of one or more mutations in the bacterial genome, but this time in a precise manner.
  • a second subject of the invention relates to a strain of lactic acid bacteria capable of being obtained by the method described above.
  • a strain of lactic acid bacterium exhibits a so-called spinning colony (ropy) phenotype in the process according to the invention and produces large amounts of exopolysaccharides.
  • lactic acid bacteria comprising EPSD or EPSC variants, exhibiting a mutation in the sequence of the epsD or epsC gene, respectively, simultaneously exhibited overexpression in exopolysaccharides.
  • EPSD protein is meant a protein homologous to the tyrosine kinases of gram-negative bacteria which exhibits tyrosine kinase activity localized at its N-terminal end and autophosphorylation sites within a domain located at its C end. -terminal comprising from two to seven tyrosine residues.
  • EPSD exerts its activity of regulating the production of exopolysaccharides (EPS) by autophosphorylation and / or phosphorylation of other bacterial proteins involved in the production of these EPS.
  • EPS exopolysaccharides
  • said strain of lactic acid bacterium exhibits a variant of EPSD exhibiting a tyrosine kinase activity of at least 10% higher, preferably at least 20% higher and, particularly preferably, at least 50%. higher than the reference EPSD.
  • the measurement of the activity of the EPSD protein can be done simply using techniques well known to those skilled in the art. As an example of such methods, mention may be made of the PHOSPHO-TAG TM PHOSPHOPROTEIN GEL STAIN kit (ABP BIOSCIENCES).
  • This dye comprises a “PHOSPHO-TAG TM” group which allows the direct detection within the gel of the phosphate groups attached to the tyrosine residues. Note that this dye can be used with standard SDS-polyacrylamide gels.
  • EpsD is meant the sequence predominantly present in microorganisms of the same species and which corresponds to the reference value for the activity of EpsD. Now, the reference EpsD will be the sequence of the EpsD protein as present in the bacterial strain used in the method according to the invention.
  • variant of EpsD is meant a polypeptide sequence which differs from the sequence SEQ ID NO: 2, preferably by at least one point mutation.
  • said variant corresponds to at least one mutation chosen from the group comprising: a phenylalanine residue (F) at the position corresponding to serine (S) at position 66 of the consensus sequence SEQ ID NO: 2, which is equivalent to Serine (S) at position 63 of the sequence SEQ ID NO: 1;
  • said variant comprises: i) at least one insertion of at least one GY motif, preferably of at least two GY motifs in the tyrosine-rich region of the autophosphorylation site corresponding to the residues between positions 241 to 257 of the consensus sequence SEQ ID NO: 2, which corresponds to the residues between positions 234 and 244 of the sequence SEQ ID NO: 1, and ii) at least one mutation chosen from the group comprising:
  • the strain of lactic acid bacteria capable of being obtained by the process according to the invention is chosen from one of the strains deposited according to the Budapest Treaty with the National Collection for the Culture of Microorganisms (CNCM, Institut Pasteur, FRANCE) under the accession number CNCM 1-5413 or CNCM-5414 or a mutant of one of them.
  • mutant is meant, within the meaning of the present invention, a bacterial strain according to the invention which has undergone one or more mutations, that is to say one or more changes in one or more nucleic acid sequences (such as the sequence of a gene) or in one or more amino acid sequences, compared, for example, to the nucleic acid or amino acid sequence present in the bacterial strain as described in the present invention.
  • Said mutations are, for example, substitutions and / or deletions and / or insertions of one or more nucleotides as well as combinations of these. These mutations can appear spontaneously or else be introduced using in particular molecular biology techniques.
  • the mutants of the bacterial strain of the invention have the same biological activity (s) or similar biological activities as that of the bacterial strain of the invention.
  • mutant can be used interchangeably with the term “variant”.
  • EPSC protein is meant a transmembrane protein having extracellular and cytoplasmic domains, which protein is supposed to be necessary for good localization of the EPS D protein in the bacteria.
  • EPSC is meant the sequence predominantly present in microorganisms of the same species and which corresponds to the reference value for the activity of EPSC. Now, the reference EPSC will be the sequence of the EPSC protein as present in the bacterial strain used in the method according to the invention.
  • said variant corresponds to at least one insertion of an isoleucine (I) residue before the position corresponding to glycine (G) 234 of the sequence SEQ ID NO: 10; which is equivalent to glycine (G) at position 224 of the sequence SEQ ID NO: 13.
  • I isoleucine
  • the strain of lactic acid bacteria capable of being obtained by the process according to the invention is the strain deposited according to the Budapest Treaty with the National Collection for Culture of Microorganisms (CNCM, Institut Pasteur, FRANCE) under the accession number CNCM-5415 or a mutant thereof.
  • the probiotic bacterial strain of the invention can be administered to humans or animals without risk to their health.
  • Another subject of the invention relates to a composition comprising a strain of lactic acid bacteria as described above.
  • the bacteria can be used whole, living or not, or in the form of a bacterial lysate, or else in the form of bacterial fractions.
  • the composition of the invention comprises at least 105, preferably at least 106, and at most 1010 cells of the bacterial strain according to the invention per ml of composition.
  • the strain of the invention can be used in combination with one or more other probiotic species for the preparation of the probiotic compositions.
  • probiotic is intended to mean living or dead microorganisms which, administered in sufficient quantity to a host, especially animal, have a beneficial effect on the health of the host. More particularly, probiotics are known to have a beneficial effect on the intestinal microbiota (formerly intestinal flora) by maintaining its balance.
  • the composition according to the invention comprises one or more acceptable excipients.
  • excipient is meant, within the meaning of the present invention, any substance, other than the active principle of the probiotic composition, intended to give said probiotic composition particular physical, chemical or taste characteristics and not interacting with the active principle.
  • Said excipients can be of natural or synthetic origin. A person skilled in the art will be able, in the light of his knowledge, to identify an acceptable excipient for a probiotic composition.
  • excipients include: sugars such as sucrose, glucose, fructose, palatinose, trehalose, lactose and xylose; polyols such as sorbitol, xylitol, erythritol, and lactitol; emulsifiers such as sucrose esters of fatty acids, glycerol esters of fatty acids and lecithin; thickeners and stabilizers such as carrageenan, xanthan gum, guar gum, pectin and locust bean gum; acidifiers such as citric acid, lactic acid and malic acid; fruit juices such as lemon juice, orange juice and berry juice; vitamins such as vitamin A, vitamin B, vitamin C, vitamin D, and vitamin E; and minerals such as calcium, iron, manganese, and zinc.
  • sugars such as sucrose, glucose, fructose, palatinose, trehalose, lactose and xylose
  • polyols such as sorbi
  • composition of the invention is in a form which can be administered orally.
  • compositions can take the form of capsules, tablets, powders, lozenges, granules, soft capsules, reconstituting powders, suspensions, frozen compositions, oral liquid preparations or even conventional food products.
  • the composition of the invention is in the form of a capsule.
  • Tablets and capsules for oral administration can be single-dose and can contain one or more acceptable excipients such as binders, fillers, lubricants, wetting agents or even disintegrating agents.
  • the tablets can be coated by methods well known in the pharmaceutical field.
  • Liquid oral preparations may for example be in the form of aqueous or oily suspensions, solutions, emulsions, syrups or else elixirs in the form of form of dehydrated products which can be reconstituted with water or any other acceptable vehicle.
  • Such liquid preparations can contain commonly used additives such as suspending agents, emulsifiers, non-aqueous vehicles, preservatives and optionally flavors and / or colorants.
  • the composition of the invention is in the form of a food product.
  • the term “food product” means any substance or product which has been transformed, partially transformed or unprocessed and intended to be ingested by humans or animals.
  • Food products can be of animal, vegetable or mineral origin. Food products provide the body with the energy and nutrients it needs to function.
  • the food product according to the invention can be a liquid, therefore a drink, or a solid.
  • the composition of the invention is in the form of a dairy product.
  • the dairy products according to the invention can be based on raw milk.
  • the milks used can be, for example, cow's, goat's, sheep's, yak's, buffalo's milk or even soy milk.
  • the dairy products according to the invention can be in liquid, solid or powder form.
  • the dairy products according to the invention can be, for example, milk, butter, cheese or even cream.
  • the dairy products according to the invention can also be based on vegetable milks. Plant milks include but are not limited to soy, rice, oat or almond milk.
  • composition of the invention can be in the form of a fermented dairy product.
  • a fermented milk product is, for example, a yogurt.
  • the strain of the invention can be used in combination with yoghurt ferments, namely Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus.
  • Another subject of the invention relates to the use of a strain of lactic acid bacteria as described above as a rheological agent.
  • rheological agent is understood to mean an agent which aims to increase the viscosity of the composition into which it is introduced.
  • a last subject of the invention relates to a polysaccharide, which can be obtained by culturing the strain CNCM-5413, which polysaccharide has the following structure:
  • EXAMPLES The isolation method according to the invention was first tested with a view to selecting mutants of Lactobacillus rhamnosus overproducing exopolysaccharides (EPS).
  • EPS Lactobacillus rhamnosus overproducing exopolysaccharides
  • the INRA strain Lactobacillus rhamnosus VES7418 was first cultured in TODD-HEWYTT medium with a content of 0.1% in agar agar. During growth in this culture medium, this strain formed chains of about 20 to 50 cells settling relatively slowly in this semi-liquid medium.
  • the inventors selected a negative control corresponding to the VES7443 mutant derived from the VES7418 strain, which sediments rapidly and did not form chains. Observation of this bacteria under a transmission electron microscope (TEM) showed that the cells of this strain had a cell wall as thin as that of VES7418. ( Figure 1).
  • TEM transmission electron microscope
  • VES7494 strain exhibited an extremely stringy phenotype (viscous: “ropy”).
  • the TEM observation of this strain VES7494 showed that if it presents a very thin cell wall. It is possible to observe the presence of colored material around it which can be identified as being exopolysaccharides (EPS). The same characteristic can be observed with other mutants overexpressing EPS (VES746S, Figure 1).
  • FIG. 5 shows the results obtained with the different strains tested. It is thus observed that the viscosity of the culture media where the different strains are cultivated varies considerably depending on the EPS production of the latter. In detail, it appears that the identified strains give their culture medium an interesting viscosity and, in particular, the strains VES7752, VES7671, VES7494 and VES 7463. The inventors have also highlighted that the strains having the productions of EPS the most important are those which induce the highest levels of viscosities in their respective culture media.
  • the inventors also carried out a structural analysis of the latter.
  • the EPS produced by the different strains of Lactobacillus rhamnosus were purified by techniques well known to those skilled in the art.
  • one purification technique which can be used consists in the precipitation of the secreted polysaccharides by gradual addition of cold ethanol, then centrifugation and / or gel permeation chromatography.
  • the structure of the EPS thus purified is then characterized by techniques also well known to those skilled in the art.
  • an analysis by NMR spectroscopy or by liquid-gas partition chromatography can be carried out.
  • the structure of the EPS produced by the strains of Lactobacillus rhamnosus VES7463 and VES7671 is thus presented in FIG. 6.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé d'isolation d'une souche de bactérie lactique capable de surproduire des exopolysaccharides, lequel comprend les étapes de i) mise en culture d'une population bactérienne de bactéries lactiques dans un milieu de culture semi-liquide et ii) identification et isolation des clones présentant une moindre mobilité dans ledit milieu de culture; une souche de bactérie lactique susceptible d'être obtenue par ce procédé; une composition comprenant une telle souche et une utilisation d'une telle souche comme agent rhéologique.

Description

PROCEDE D'ISOLATION DE SOUCHES DE BACTERIE LACTIQUE SURPRODUCTRICES
D'EXOPOLYSACCH ARIDES
La présente demande de brevet revendique la priorité de la demande de brevet français FR 1909136 déposée le 12 août 2019, laquelle est incorporée par référence dans la présente demande.
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention est relative à de nouvelles souches de bactéries lactiques et à leurs utilisations.
ART ANTERIEUR Les bactéries lactiques sont des bactéries à Gram positif largement utilisées dans les fermentations alimentaires en raison de leur capacité à convertir les sucres en acide lactique. Les lactocoques et les lactobacilles sont ainsi utilisés dans les fermentations de lait pour la production de fromage et de yogourts où la production d'acide lactique contribue à limiter la détérioration des aliments. En outre, ces bactéries lactiques contribuent au développement de propriétés organoleptiques, notamment de la texture et de la saveur de ces produits laitiers.
Les bactéries lactiques sont également très présentes dans le microbiote intestinal humain où elles contribuent au bon fonctionnement de la digestion. D'ailleurs certaines souches naturelles de bactéries lactiques, notamment des lactobacilles, sont commercialisées en tant que probiotiques pour leurs propriétés bénéfiques pour la santé.
Pour en revenir aux produits laitiers, leurs propriétés rhéologiques et favorables à la santé des produits laitiers seraient largement influencées par les exopolysaccharides (EPS) exprimés par les bactéries lactiques utilisées pour leur fabrication. Ces EPS, qui sont des polymères d'hydrates de carbone, ont la particularité d'être sécrétés dans le milieu de croissance ou liés de manière lâche à la surface de la cellule contrairement aux autres polysaccharides de la paroi qui sont liés de manière covalente à la paroi cellulaire. D'ailleurs, l'utilisation de bactéries productrices d'EPS a été envisagée pour la production de fromage allégé. Outre leurs propriétés texturales, il a également été suggéré que ces mêmes EPS influencent les interactions bactéries-hôte, notamment en affectant l'adhésion à la cellule hôte et à la muqueuse ou l'immunomodulation à médiation bactérienne. Il a ainsi été récemment constaté que les EPS de Lactobacillus rhamnosus étaient capables d'interférer avec la propagation de Candida et d'agir ainsi en tant qu'agent anti-candidose.
Pour ces raisons, la possibilité de disposer de nouvelles souches de bactéries lactiques présentant une surproduction d'EPS constitue une piste d'intérêt pour l'industrie agroalimentaire.
Maintenant, la seule méthode proposée pour la sélection de mutants surproducteurs d'EPS consiste à isoler des mutants de bactériophages ou résistants aux antibiotiques
(W02011092300 Al et W02013160270 Al). Il est bien évident que des méthodes nécessitant des bactériophages, non disponibles d'ailleurs pour toutes les souches B bactériennes d'intérêt, ou conférant une résistance de la bactérie aux antibiotiques, ne sont pas souhaitables en vue d'obtenir des souches adaptées à une utilisation industrielle.
SOMMAIRE DE L'INVENTION Les inventeurs ont développé une méthode d'isolation d'une souche bactérienne de type bactérie lactique capable de surproduction de exopolysaccharides, laquelle méthode n'utilise ni bactériophages, ni gène de résistance aux antibiotiques et qui comprend au moins une étape de sédimentation différentielle.
Aussi, un premier objet de l'invention se rapport à un procédé d'isolation d'une souche de bactérie lactique capable de surproduire des exopolysaccharides, lequel comprend les étapes de : i) mise en culture d'une population bactérienne de bactéries lactiques dans un milieu de culture semi-liquide, ii) identification et isolation des clones présentant une moindre mobilité dans ledit milieu de culture.
Un deuxième objet concerne une souche bactérienne susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention.
Un autre objet de l'invention concerne une composition comprenant une telle souche selon l'invention. Un objet complémentaire de l'invention se rapporte à l'utilisation d'une souche de bactérie lactique selon l'invention en tant qu'agent rhéologique.
Un dernier objet de l'invention porte sur un polysaccharide, qui est susceptible d'être obtenu par la culture de la souche CNCM-5413, lequel polysaccharide présente la structure suivante :
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DESCRPTION DES FIGURES
Figure 1: Vues en microscopie électronique à transmission de paroi de souches bactériennes de référence ou isolées par le procédé selon l'invention (CWPS = polysaccharides de la paroi cellulaire ; EPS = exopolysaccharides)
Figure 2: Production relative d'exopolysaccharides par Lb. Rhamnosus VES7418 et ses dérivés surproduisants des EPS. La souche VES7517 (souche LGG) a été utilisé en tant que contrôle négatif et les souches de Lb. rhamnosus VES7642 (isolée d'un produit laitier fermenté « LACTUS » de la marque CARREFOUR) et VES764S (isolé des capsules de "TROPHIGYL" de la marque SANOFI) en tant que contrôles positifs.
Figure 3: Alignement de la séquence de la protéine EPSD de Lb. rhamnosus de la souche VES7418 (SEQ ID NO :1) et de la séquence homologue YVEL de la souche 168 de Bacillus subtilis phylogénétiquement distante (numéro d'accession P71051 ; SEQ ID NO :19). les sites de mutations sont indiqués en gras. Figure 4: Séquence de la protéine EPSC de la souche Lb rhamnosus VES7699 (SEQ ID NO :19).
Figure 5: Graphique présentant la viscosité du milieu de culture de différentes souches de bactérie lactique produisant différents EPS. La viscosité du milieu est exprimée en centipoise (cP).
Figure 6: Structures de polysaccharides purifiés à partir de Lactobacillus rhamnosus souche VES746S et VES7671.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Un premier objet de l'invention concerne un procédé d'isolation d'une souche de bactérie lactique capable de surproduire des exopolysaccharides, lequel comprend les étapes de : i) mise en culture d'une population bactérienne de bactéries lactiques dans un milieu de culture semi-liquide, ii) identification et isolation des clones présentant une moindre mobilité dans ledit milieu de culture.
Le principe du procédé selon l'invention repose sur la sédimentation différentielle. En effet, les clones de souches surproduisant des exopolysaccharides ont plus de difficultés à sédimenter dans un milieu de culture semi-liquide que les souches en produisant moins. Maintenant, ce différentiel de sédimentation est simplement accessible visuellement puisque plus un clone présentera une surcapacité de production d'exopolysaccharides, moins il sera mobile dans le milieu de culture semi-liquide et plus l'aspect de la colonie associée sera circulaire. A l'inverse, moins un clone présentera de capacité de production d'exopolysaccharides, plus il sera mobile dans le milieu de culture semi- liquide et plus l'aspect de la colonie associée sera effilé (racine).
Par bactérie lactique, on entend une bactérie à Gram positif, anaérobies partiellement tolérantes à l'oxygène et dont la fermentation des sucres s'accompagne d'une production d'acide, d'acide lactique pour l'essentiel (sinon acide acétique et acide propionique). Les bactéries lactiques les plus utilisées dans l'industrie agroalimentaire appartiennent à l'ordre des lactobacilles qui inclue les bactéries appartenant au genre Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pseudoleuconostoc, Pediococcus, Brevibacterium, Enterococcus et Propionibacterium. De surcroît, les bactéries productrices d'acide lactique et strictement anaérobie appartenant au genre Bifidobacterium sont également classées parmi les bactéries lactiques.
Avantageusement, on entend par bactérie lactique, une bactérie appartenant au genre Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bifidocbacterium, Leuconostoc ou Pediococcus.
De manière préférée, une telle bactérie lactique appartient à l'une des espèces suivantes :
Streptococcus thermophilus,
Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus casei,
Lactobacillus reuteri,
Lactobacillus plantarum,
Lactobacillus rhamnosus, et - Lactobacillus fermentum.
Par milieu de culture, on entend un milieu de culture adapté à la croissance de la population bactérienne criblé. Naturellement, le milieu de culture en question permet une bonne synthèse d'exopolysaccharides. A titre d'exemple, il est possible d'utiliser le milieu MRS ou Todd-Hewitt. Par « semi-liquide » pour ce qui concerne un milieu de culture, on entend la viscosité correspondant à un milieu de culture qui comprend de l'agar agarà une teneur comprise entre 0,03 et 0,2% (en poids par rapport au poids total de la composition), de préférence entre 0,1 et 0,15% et, idéalement, de l'ordre de 0,1.%. De préférence, on entend un milieu de culture qui comprend de l'agar agar à une teneur comprise entre 0,03 et 0,2% (en poids par rapport au poids total de la composition), de préférence entre 0,1 et 0,15% et, idéalement, de l'ordre de 0,1.%.
Par population bactérienne, on considère la culture pure d'une seule souche. Maintenant, cette culture peut contenir des mutants spontanés qui apparaissent à une fréquence de 10-8. Il est à noter qu'une telle fréquence peut augmenter considérablement du fait d'une étape de mutagenèse. Aussi et selon un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention comprend une étape préalable de mutagenèse.
Habituellement, cette étape de mutagenèse est réalisée sur une souche de bactérie de sorte à obtenir une population bactérienne. Des techniques de mutagenèse sont bien connues de l'homme du métier et on distingue alors la mutagenèse aléatoire de la mutagenèse dirigée. Ces deux mutagenèses induisent une ou plusieurs mutations dans l'ADN bactérien.
De telles mutations peuvent consister en des substitutions (un ou plusieurs nucléotides sont remplacés par un même nombre de nucléotides différents), en des insertions (un ou plusieurs nucléotides sont ajoutés à une séquence cible), et/ou en des délétions (un ou plusieurs nucléotides sont enlevés de la séquence).
La mutagenèse aléatoire permet d'obtenir un grand nombre de mutants en ce qu'elle induit des mutations dans l'ADN de façon aléatoire. Une telle mutagenèse peut être obtenue en exposant des bactéries à un agent physique (UV, température, etc...) ou à un agent chimique (CaCI2, DMSO, etc...).
Pour ce qui est de la mutagenèse dirigée, elle permet l'induction d'une ou plusieurs mutations dans le génome bactérien, mais cette fois de façon précise.
Un deuxième objet de l'invention concerne une souche de bactérie lactique susceptible d'être obtenue par le procédé décrit précédemment. Une telle souche de bactérie lactique présente un phénotype dit de la colonie filante (ropy) dans le procédé selon l'invention et produit des quantités importantes d'exopolysaccharides.
Les inventeurs ont maintenant mis en évidence que des bactéries lactiques comprenant des variants EPSD ou EPSC, présentant une mutation dans la séquence du gène epsD ou epsC respectivement, présentaient simultanément une surexpression en exopolysaccharides.
Par protéine EPSD, on entend une protéine homologue aux tyrosine kinases des bactéries gram négative qui présente une activité tyrosine kinase localisée au niveau de son extrémité N-terminale et des sites d'autophosphorylation au sein d'un domaine localisé au niveau de son extrémité C-terminale comprenant de deux à sept résidus tyrosine. EPSD exerce son activité de régulation de la production d'exopolysaccharides (EPS) par autophosphorylation et/ou phosphorylation d'autres protéines bactériennes impliquées dans la production de ces EPS. De préférence, ladite souche de bactérie lactique présente un variant de l'EPSD présentant une activité tyrosine kinase d'au moins 10% supérieure, de préférence d'au moins 20% supérieure et, de manière particulièrement préférée, d'au moins 50% supérieure à l'EPSD de référence.
La mesure de l'activité de la protéine EPSD peut être faite simplement à l'aide de techniques bien connues de l'homme du métier. A titre d'exemple de telles méthodes, on peut citer le kit PHOSPHO-TAG™ PHOSPHOPROTEIN GEL STAIN (ABP BIOSCIENCES).
Il s'agit d'un kit utilisant un colorant fluorescent permettant de détecter sélectivement les protéines phosphorylés dans les gels de polyacrylamide. Ce colorant comprend un groupe « PHOSPHO-TAG™ » qui permet la détection directe au sein du gel des groupements phosphate attachés aux résidus tyrosine. A noter que ce colorant peut être utilisé avec des gels standards SDS-polyacrylamide gels. Par EpsD de référence, on entend la séquence majoritairement présente dans les microorganismes d'une même espèce et qui correspond à la valeur de référence pour l'activité de l'EpsD. Maintenant, l'EpsD de référence sera la séquence de la protéine EpsD telle que présente dans la souche bactérienne utilisée dans le procédé selon l'invention. A titre d'exemple, de séquences de référence pour les espèces, on peut citer les séquences des protéines correspondants aux numéros d'accession WP_011544276 (Lactobacillus delbrueckii ATCC 11842, SEQ ID NO :3), WP_015765007 (Lactobacillus rhamnosus LGG, SEQ ID NO :4) et SEQ ID NO :1 (Lactobacillus rhamnosus VES7418), WP_047105729 (Lactobacillus casei, SEQ ID NO :9), YP_004889857 (Lactobacillus plantarum WCFS1 , SEQ ID NO :5), WP_012390713 (Lactobacillus fermentum IFO 3956, SEQ ID NO :6), WP_011161880 (Lactobacillus johnsonii NCC 53, SEQ ID NO :8) et WP_003654424 (Lactobacillus gasseri ATCC 33323, SEQ ID NO :8). Sur la base de ces différentes séquences d'EPSD, une séquence consensus EPSD a été élaborée et correspond à la séquence SEQ ID NO :2.
Par "variant" de l'EpsD, on entend une séquence polypeptidique qui diffère de la séquence SEQ ID NO :2, de préférence par au moins une mutation ponctuelle.
Selon un mode de réalisation préférée, ledit variant correspond à au moins une mutation choisie dans le groupe comprenant : - un résidu phénylalanine (F) à la position correspondant à la sérine (S) en position 66 de la séquence consensus SEQ ID NO :2, laquelle équivaut à la Sérine (S) en position 63 de la séquence SEQ ID NO :1 ;
- un résidu acide glutamique (E) à la position correspondant à la lysine (K) en position 73 de la séquence consensus SEQ ID NO :2, laquelle équivaut à la lysine (K) en position
70 de la séquence SEQ ID NO :1 ;
- un résidu tryptophane (Y) à la position correspondant à la sérine (S) en position 74 de la séquence consensus SEQ ID NO :2, laquelle équivaut à la sérine (S) en position 71 de la séquence SEQ ID NO :1 ; - un résidu valine (V) à la position correspondant à l'acide aspartique (D) en position 97 de la séquence consensus SEQ ID NO :2, laquelle équivaut à l'acide aspartique (D) en position 94 de la séquence SEQ ID NO :1 ;
- un résidu sérine (S) à la position correspondant à la proline (P) en position 181 de la séquence consensus SEQ ID NO :2, laquelle équivaut à la proline (P) en position 175 de la séquence SEQ ID NO :1 ; et une insertion d'au moins un motif GY, de préférence d'au moins deux motifs GY dans la région riche en tyrosine du site d'autophosphorylation correspondant aux résidus compris entre les positions 241 à 257 de la séquence consensus SEQ ID NO :2, ce qui correspond aux résidus compris entre les positions 234 et 244 de la séquence SEQ ID NO :1.
Avantageusement, ledit variant comprend : i) au moins une insertion d'au moins un motif GY, de préférence d'au moins deux motifs GY dans la région riche en tyrosine du site d'autophosphorylation correspondant aux résidus compris entre les positions 241 à 257 de la séquence consensus SEQ ID NO :2, ce qui correspond aux résidus compris entre les positions 234 et 244 de la séquence SEQ ID NO :1, et ii) au moins une mutation choisie dans le groupe comprenant :
- un résidu phénylalanine (F) à la position correspondant à la sérine (S) en position 66 de la séquence consensus SEQ ID NO :2, laquelle équivaut à la Sérine (S) en position 63 de la séquence SEQ ID NO :1 ; - un résidu acide glutamique (E) à la position correspondant à la lysine (K) en position
73 de la séquence consensus SEQ ID NO :2, laquelle équivaut à la lysine (K) en position 70 de la séquence SEQ ID NO :1 ;
- un résidu tryptophane (Y) à la position correspondant à la sérine (S) en position 74 de la séquence consensus SEQ ID NO :2, laquelle équivaut à la sérine (S) en position 71 de la séquence SEQ ID NO :1 ;
- un résidu valine (V) à la position correspondant à l'acide aspartique (D) en position 97 de la séquence consensus SEQ ID NO :2, laquelle équivaut à l'acide aspartique (D) en position 94 de la séquence SEQ ID NO :1 ;
- un résidu sérine (S) à la position correspondant à la proline (P) en position 181 de la séquence consensus SEQ ID NO :2, laquelle équivaut à la proline (P) en position 175 de la séquence SEQ ID NO :1. 1S
Avantageusement, la souche de bactérie lactique susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention est choisie parmi l'une des souches déposées selon le traité de Budapest auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, FRANCE) sous le numéro d'accession CNCM 1-5413 ou CNCM-5414 ou un mutant de l'une d'elle.
Par « mutant », on entend, au sens de la présente invention, une souche bactérienne selon l'invention ayant subi une ou plusieurs mutations, c'est-à-dire un ou plusieurs changements dans une ou plusieurs séquences d'acides nucléiques (telle que la séquence d'un gène) ou dans une ou plusieurs séquences d'acides aminés, comparé, par exemple, à la séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés présente dans la souche bactérienne telle que décrite dans la présente invention. Lesdites mutations sont par exemple des substitutions et/ou délétions et/ou insertions d'un ou plusieurs nucléotides ainsi que des combinaisons de celles-ci. Ces mutations peuvent apparaître spontanément ou bien être introduites en utilisant notamment des techniques de biologie moléculaire. Dans certains modes de réalisation, les mutants de la souche bactérienne de l'invention ont la ou les mêmes activités biologiques ou des activités biologiques similaires à celle de la souche bactérienne de l'invention. Le terme « mutant » peut être utilisé de manière interchangeable avec le terme « variant ».
Par protéine EPSC, on entend une protéine transmembranaire présentant des domaines extracellulaire et cytoplasmique, laquelle protéine est supposée être nécessaire à une bonne localisation de la protéine EPS D dans la bactérie. Par EPSC de référence, on entend la séquence majoritairement présente dans les microorganismes d'une même espèce et qui correspond à la valeur de référence pour l'activité de l'EPSC. Maintenant, l'EPSC de référence sera la séquence de la protéine EPSC telle que présente dans la souche bactérienne utilisée dans le procédé selon l'invention. A titre d'exemple, de séquences de référence pour les espèces, on peut citer les séquences des protéines correspondants aux numéros d'accession WP_011544277 (Lactobacillus delbrueckii ATCC 11842 ; SEQ ID NO :11), WP_014569866 (Lactobacillus rhamnosus LGG ; SEQ ID NO :12) et WP_070788833.1 (Lactobacillus rhamnosus VES 7699 ; SEQ ID NO :13), WP_025013752 (Lactobacillus casei ATCC 393 ; SEQ ID NO :14), YP_004889858 (Lactobacillus plantarum WCFS1 ; SEQ ID NO :15), WP_012390712
(Lactobacillus fermentum IFO 3956 ; SEQ ID NO :16), WP_011161879 (Lactobacillus johnsonii NCC 53 ; SEQ ID NO :17) et WP_003647150 (Lactobacillus gasseri ATCC 33323 ; SEQ ID NO :18).Sur la base de ces différentes séquences d'EPSC, une séquence consensus EPSC a été élaborée et correspond à la séquence SEQ ID NO :10 Par "variant" de l'EpsC, on entend une séquence polypeptidique qui diffère de la séquence de référence par au moins une mutation ponctuelle.
Selon un mode de réalisation préférée, ledit variant correspond à au moins une insertion d'un résidu isoleucine (I) avant la position correspondant à la glycine (G) 234 de la séquence SEQ ID NO :10 ; laquelle équivaut à la glycine (G) en position 224 de la séquence SEQ ID NO :13.
Avantageusement, la souche de bactérie lactique susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention est la souche déposée selon le traité de Budapest auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, FRANCE) sous le numéro d'accession CNCM-5415 ou un mutant de celle-ci.
De manière préférée, la souche bactérienne probiotique de l'invention, peut être administrée à l'homme ou à l'animal sans risque pour sa santé. Un autre objet de l'invention concerne une composition comprenant une souche de bactérie lactique telle que décrite précédemment.
Dans cette composition, les bactéries peuvent être utilisées entières, vivantes ou non, ou sous forme de lysat bactérien, ou encore sous forme de fractions bactériennes.
Selon un mode de réalisation préféré, la composition de l'invention comprend au moins 105, de préférence au moins 106, et au plus 1010 cellules de la souche bactérienne selon l'invention par mL de composition.
De manière préférée, la souche de l'invention peut être utilisée en association avec une ou plusieurs autres espèces probiotiques pour la préparation des compositions probiotiques. Par "probiotique", on entend, au sens de la présente invention, des microorganismes vivants ou morts qui, administrés en quantité suffisante à un hôte, animal notamment, ont un effet bénéfique sur la santé de l'hôte. Plus particulièrement, les probiotiques sont connus pour avoir un effet bénéfique sur le microbiote intestinal (anciennement flore intestinale) en maintenant son équilibre. Le microbiote intestinal a quatre fonctions reconnues : une fonction physiologique, à la fois sur l'anatomie et l'histologie du tube digestif et sur le transit intestinal ; une fonction digestive, par la digestion de certains types de molécules telles que les lipides et les protéines ; une fonction de protection anti-infectieuse, en empêchant le développement de germes potentiellement pathogènes dans les intestins et enfin une fonction immunitaire, par l'activation du système immunitaire. Par « composition probiotique » on entend, au sens de la présente invention un complément alimentaire qui a des effets bénéfiques pour la santé de l'hôte auquel il est administré. Une composition probiotique contient des microorganismes probiotiques qui doivent être ingérés pour induire des effets bénéfiques chez l'Homme selon la définition de l'OMS (2001) ; lesquels microorganismes peuvent être vivants ou morts. Les probiotiques vivants peuvent sécréter une gamme complète d'antigènes, se multiplient pour promouvoir les interactions avec la muqueuse intestinale et adhèrent aux tissus intestinaux pour stimuler la réponse immunitaire.
De manière préférée, la composition selon l'invention comprend un ou plusieurs excipients acceptables. Par « excipient » on entend, au sens de la présente invention toute substance, autre que le principe actif de la composition probiotique, destinée à conférer à ladite composition probiotique des caractéristiques physiques, chimiques ou gustatives particulières et n'interagissant pas avec le principe actif. Lesdits excipients peuvent être d'origine naturelle ou d'origine synthétique. Un homme du métier sera à même, au regard de ses connaissances, d'identifier un excipient acceptable pour une composition probiotique. Des exemples d'excipients acceptables incluent : des sucres tels que le saccharose, le glucose, le fructose, le palatinose, le tréhalose, le lactose et le xylose ; des polyols tels que le sorbitol, le xylitol, l'érythritol, et le lactitol ; des émulsifiants tels que les esters de saccharose d'acides gras, les esters de glycérol d'acides gras et la lécithine ; des épaississants et stabilisants tels que le carraghénane, la gomme de xanthane, la gomme de guar, la pectine et la gomme de caroube ; des acidifiants tels que l'acide citrique, l'acide lactique et l'acide malique ; des jus de fruits tels que le jus de citron, le jus d'orange et des jus de baies ; des vitamines telles que la vitamine A, la vitamine B, la vitamine C, la vitamine D et la vitamine E ; et des minéraux tels que le calcium, le fer le manganèse et le zinc.
Selon un autre mode de réalisation préféré, la composition de l'invention se présente sous une forme administrable par voie orale.
De telles compositions peuvent prendre la forme de gélules, de comprimés, de poudres, de pastilles, de granules, de capsules molles, de poudres reconstituables, de suspensions, de compositions surgelées, de préparations liquides orales ou encore de produits alimentaires conventionnels. De préférence, la composition de l'invention se présente sous la forme d'une gélule.
Les comprimés et les gélules à administration orale peuvent être unidoses et peuvent contenir un ou plusieurs excipients acceptables tels que des liants, des agents de remplissage, des lubrifiants, des agents mouillant ou encore des agents désintégrant. Les comprimés peuvent être enrobés par des méthodes bien connues dans le domaine pharmaceutique.
Les préparations orales liquides peuvent par exemple être sous la forme de suspensions aqueuses ou huileuses, de solutions, d'émulsions, de sirops ou encore d'élixirs sous la forme de produits déshydratés reconstituables avec de l'eau ou tout autre véhicule acceptable. De telles préparations liquides peuvent contenir des additifs communément utilisés tels que des agents de suspension, des émulsifiants, des véhicules non aqueux, des conservateurs et éventuellement des arômes et/ou des colorants. Selon un mode de réalisation préférée, la composition de l'invention se présente sous la forme d'un produit alimentaire.
Par « produit alimentaire », on entend, au sens de la présente invention, toute substance ou produit, ayant été transformé, partiellement transformé ou non transformé et destiné à être ingéré par l'homme ou l'animal. Les produits alimentaires peuvent être d'origine animale, végétale ou minérale. Les produits alimentaires apportent à l'organisme l'énergie et les nutriments nécessaires à son fonctionnement. Le produit alimentaire selon l'invention peut être un liquide, donc une boisson, ou solide.
De préférence, la composition de l'invention se présente sous la forme d'un produit laitier.
Les produits laitiers selon l'invention peuvent être à base de lait cru. Les laits utilisés peuvent être par exemple des laits de vache, de chèvre, de brebis, de yack, de bufflonne ou encore du lait de soja. Les produits laitiers selon l'invention peuvent être sous forme liquide, solide ou de poudre. Les produits laitiers selon l'invention peuvent être par exemple du lait, du beurre, du fromage ou encore de la crème. Les produits laitiers selon l'invention peuvent également être à base de laits végétaux. Les laits végétaux comprennent mais ne sont pas limités au lait de soja, de riz, d'avoine ou encore d'amande.
La composition de l'invention peut se présenter sous la forme d'un produit laitier fermenté.
Un produit laitier fermenté est par exemple un yaourt.
La souche de l'invention peut être utilisée en association avec des ferments du yaourt, à savoir Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus et Streptococcus thermophilus.
Un autre objet de l'invention porte sur l'utilisation d'une souche de bactérie lactique telle que décrite précédemment en tant qu'agent rhéologique.
On entend par « agent rhéologique », un agent qui vise à augmenter la viscosité de la composition dans laquelle il est introduite.
Enfin, un dernier objet de l'invention porte sur un polysaccharide, qui est susceptible d'être obtenu par la culture de la souche CNCM-5413, lequel polysaccharide présente la structure suivante :
Les exemples qui suivent sont fournis à titre d'illustration et ne sauraient limiter la portée de la présente invention.
EXEMPLES Le procédé d'isolation selon l'invention a été testé en premier lieu en vue de sélectionner des mutants de Lactobacillus rhamnosus surproduisant des exopolysaccharides (EPS).
La souche INRA Lactobacillus rhamnosus VES7418 a d'abord été cultivée dans un milieu de TODD-HEWYTT avec une teneur de 0,1 % en agar agar. Durant sa croissance dans ce milieu de culture, cette souche a formé des chaînes d'environs 20 à S0 cellules sédimentant relativement lentement dans ce milieu semi-liquide.
En vue d'optimiser le procédé d'identification de souches surproduisant des exopolysaccharides, les inventeurs ont sélectionné un témoin négatif correspondant au mutant VES7443 issu de la souche VES7418, lequel sédimente rapidement et ne formait pas de chaînes. Une observation de cette bactérie au microscope électronique à transmission (TEM) a montré que les cellules de cette souche avaient une paroi cellulaire aussi fine que celle de VES7418. (Figure 1).
En partant d'une large population bactérienne de Lactobacillus rhamnosus issu de la souche VES7443, il a ensuite été possible d'isoler de nombreux clones ne présentant qu'une très faible sédimentation dans ce milieu semi-liquide et correspondant à des souches de bactéries lactiques surproduisant les exopolysaccharides.
Parmi ces souches, la souche VES7494 a présenté un phénotype extrêmement filant (visqueux : « ropy »). L'observation au TEM de cette souche VES7494 a montré que si elle présente une paroi cellulaire très fine. Il est possible d'observer la présence de matériel coloré autour de celle-ci qui peut être identifié comme étant des exopolysaccharides (EPS). La même caractéristique peut être observée avec d'autres mutants surexprimant des EPS (VES746S, Figure 1).
Pour affiner cette analyse au TEM, la quantification des sucres neutres totaux pour 50 DO de culture de différentes souches bactériennes isolées a été réalisée par des méthodes bien connues de l'homme du métier (figure 2). En lien avec cette quantification, ont été utilisées en tant que contrôles positifs les souches « ropy » de Lactobacillus rhamnosus que sont VES7642 (isolée de produits laitiers fermentés "LACTUS"(CARREFOUR)) et VES7643 (isolée des capsules "Trophigylla souche " (SANOFI)) et en en tant que contrôle négatif, la souche VES7517 (Lb. rhamnosus souche LGG). Les résultats sont présentés dans les figures 2A et 2B et montrent que les souches VES7463, VES7494, VES7752 et VES7671 produisent significativement plus d'EPS que le témoin négatif VES 7517 (LGG). Dans le détail, il faut noter que les souches VES7752 et VES7671 produisent respectivement deux et trois fois plus d'EPS que la souche utilisée dans l'industrie pharmaceutique (VES7643). Par la suite des mutants complémentaires ont pu être identifiés.
En vue de déterminer la ou les mutations impliquées dans cette surexpression d'EPS, le génome des différents mutants identifiés a été séquencé. Le détail des mutations identifiées est présenté dans le tableau 1 qui suit.
Tableau 1 : Mutations impliquées dans la surexpression d'exopolysaccharides
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Il ressort de ces séquençages que la très grande majorité des mutants présentent des mutations au sein du gène Eps D. L'alignement des séquences en acides aminés de la protéine EPSD de VES7418 et de la protéine apparentée YVE L d'une souche phylogénétiquement éloignée (Bacillus subtilis 168) permet de mettre en évidence les domaines conservés au sein de la séquence de la protéine EPSD. Il est ainsi intéressant de noter que tous les changements d'acides aminés (sauf le site d'autophosphorylation de GYGYGYGYGY) chez les mutants surexprimant les EPS sont tous situés dans des domaines conservés de la protéine EPSD, ce qui indique l'importance de ces domaines dans la fonction EPSD (Figure B).
Il est à noter également que les mutations entraînant des décalages de phases de lecture, qui devraient complètement supprimer l'activité d'EPSD, sont associés à des mutants EPS négatifs VES7709 et VES7713. Le profil de ces mutants conforte donc l'idée que l'activité d'EPSD semble requise pour permettre l'expression d'EPS. Enfin, les résultats ont également permis d'identifier un mutant présentant une mutation au sein du gène Eps C. La protéine EPS C dont la séquence est donnée en figure 4 est à priori essentielle en vue de permettre la bonne localisation et activité de la protéine EPSD.
La viscosité d'échantillons de milieu de culture contenant les différentes souches a été mesurée à l'aide d'un viscosimètre BROOKFIELD DIGITAL DVE.
La figure 5 présente les résultats obtenus avec les différentes souches testées. On observe ainsi que la viscosité des milieux de culture où les différentes souches sont cultivées varie considérablement en fonction de la production d'EPS de ces dernières. Dans le détail, il apparaît que les souches identifiées confèrent à leur milieu de culture une viscosité intéressante et, particulièrement, les souches VES7752, VES7671, VES7494 et VES 7463. Les inventeurs ont également mis en exergue que les souches ayant les productions d'EPS les plus importantes sont celles qui induisent les plus hauts niveaux de viscosités dans leurs milieux de culture respectifs.
En vue de parfaire l'analyse de la production de polysaccharides dans ces souches, les inventeurs ont également effectué une analyse structurale de ces derniers. Au préalable, les EPS produits par les différentes souches de Lactobacillus rhamnosus ont été purifiés par des techniques bien connues de l'Homme du métier. A titre d'exemple, une technique de purification pouvant être utilisée consiste en la précipitation des polysaccharides sécrétés par ajout graduel d'éthanol froid, puis centrifugation et/ou chromatographie par perméation sur gel. La structure des EPS ainsi purifiés est ensuite caractérisée par des techniques également bien connue de l'Homme du métier. A titre d'exemple, une analyse par spectroscopie RMN ou par chromatographie de partage liquide-gazeuse peut être réalisée. La structure des EPS produits par les souches de Lactobacillus rhamnosus VES7463 et VES7671 est ainsi présentée dans la figure 6.
Les résultats montrent que l'on trouve, pour chaque souche, un polysaccharide neutre et un polysaccharide chargé. En outre, il est à noter que l'EPS PS2 produit par la souche VES7463 n'a jamais été identifié. Il est probable que cet EPS PS2 résulte de la substitution EPSD D94>L, également présente dans la souche CNCM-I 5413 et qu'il est certainement impliqué dans la viscosité augmentée du milieu de culture pour cette souche. PCT
(original sous forme électronique)
(Cette feuille ne fait pas partie de la demande internationale ni ne compte comme une feuille de celle-ci)
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Claims

REVENDICATIONS
1. Un procédé d'isolation d'une souche de bactérie lactique capable de surproduire des exopolysaccharides et qui appartient de préférence au genre Lactobacillus , Lactococcus, Streptococcus, Bifidocbacterium, Leuconostoc ou Pediococcus, lequel procédé comprend les étapes de : i) mise en culture d'une population bactérienne de bactéries lactiques dans un milieu de culture semi-liquide précédée éventuellement d'une étape préalable de mutagenèse, ii) identification et isolation des clones présentant une moindre mobilité dans ledit milieu de culture.
2. Une souche de bactérie lactique susceptible d'être obtenue par le procédé selon la revendication 1.
B. La souche de bactérie lactique selon la revendication 2, caractérisée en ce que ladite souche de bactérie lactique présente un variant de l'EpsD présentant une activité tyrosine kinase d'au moins 10% supérieure, de préférence d'au moins 20% supérieure et, de manière particulièrement préférée, d'au moins 50% supérieure à l'EpsD de référence défini par la séquence SEQ ID NO :2, ledit variant de l'EpsD étant défini par une séquence polypeptidique qui diffère de la SEQ ID NO :2 par au moins une mutation ponctuelle.
4. La souche de bactérie lactique selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit variant correspond à au moins une mutation choisie dans le groupe comprenant :
- un résidu phénylalanine (F) à la position correspondant à la sérine (S) en position 66 de la séquence consensus SEQ ID NO :2, laquelle équivaut à la Sérine (S) en position 63 de la séquence SEQ ID NO :1 ;
- un résidu acide glutamique (E) à la position correspondant à la lysine (K) en position 73 de la séquence consensus SEQ ID NO :2, laquelle équivaut à la lysine (K) en position 70 de la séquence SEQ ID NO :1 ;
- un résidu tryptophane (Y) à la position correspondant à la sérine (S) en position 74 de la séquence consensus SEQ ID NO :2, laquelle équivaut à la sérine (S) en position 71 de la séquence SEQ ID NO :1 ;
- un résidu valine (V) à la position correspondant à l'acide aspartique (D) en position 97 de la séquence consensus SEQ ID NO :2, laquelle équivaut à l'acide aspartique (D) en position 94 de la séquence SEQ ID NO :1 ;
- un résidu sérine (S) à la position correspondant à la proline (P) en position 181 de la séquence consensus SEQ ID NO :2, laquelle équivaut à la proline (P) en position 175 de la séquence SEQ ID NO :1 ; et - une insertion d'au moins un motif GY, de préférence d'au moins deux motifs GY dans la région riche en tyrosine du site d'autophosphorylation correspondant aux résidus compris entre les positions 241 à 257 de la séquence consensus SEQ ID NO :2, ce qui correspond aux résidus compris entre les positions 234 et 244 de la séquence SEQ ID NO :1.
5. La souche de bactérie lactique selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi l'une des souches déposées selon le traité de Budapest auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur,
FRANCE) sous le numéro d'accession CNCM 1-5413, CNCM-5414.
6. La souche de bactérie lactique selon la revendication 2, caractérisée en ce que ladite souche de bactérie lactique présente un variant de l'EpsC correspondant à au moins une insertion d'un résidu isoleucine (I) avant la position correspondant à la glycine (G) 234 de la séquence SEQ ID NO :10 ; laquelle équivaut à la glycine (G) en position 224 de la séquence SEQ ID NO :13.
7. La souche de bactérie lactique selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche déposée selon le traité de Budapest auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, FRANCE) sous le numéro d'accession CNCM 1-5415.
8. Une composition comprenant une souche de bactérie lactique telle que définie à l'une quelconque des revendications 2 à 7.
9. La composition selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme d'un produit laitier.
10. Une utilisation d'une souche de bactérie lactique telle que définie à l'une quelconque des revendications 2 à 7 en tant qu'agent rhéologique.
11. Un polysaccharide présentant la structure suivante :
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116590184A (zh) * 2023-04-28 2023-08-15 山东康祐生物科技有限公司 一种提升免疫力的后生元制品及其制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2075332A1 (fr) * 2006-10-27 2009-07-01 Kabushiki Kaisha Yakult Honsha Gène régulateur de la production de cytokines et utilisation de celui-ci
WO2011092300A1 (fr) 2010-01-28 2011-08-04 Chr. Hansen A/S Bactéries lactiques utilisées à des fins de texturation de produits alimentaires et choisies sur la base de leur résistance aux phages
WO2013160270A1 (fr) 2012-04-23 2013-10-31 Chr. Hansen A/S Souches de bactéries d'acide lactique texturantes résistant à l'ampicilline

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2075332A1 (fr) * 2006-10-27 2009-07-01 Kabushiki Kaisha Yakult Honsha Gène régulateur de la production de cytokines et utilisation de celui-ci
WO2011092300A1 (fr) 2010-01-28 2011-08-04 Chr. Hansen A/S Bactéries lactiques utilisées à des fins de texturation de produits alimentaires et choisies sur la base de leur résistance aux phages
WO2013160270A1 (fr) 2012-04-23 2013-10-31 Chr. Hansen A/S Souches de bactéries d'acide lactique texturantes résistant à l'ampicilline

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A.D. WELMAN ET AL: "Screening and selection of exopolysaccharide-producing strains of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus", JOURNAL OF APPLIED MICROBIOLOGY., vol. 95, no. 6, 1 December 2003 (2003-12-01), GB, pages 1200 - 1206, XP055701971, ISSN: 1364-5072, DOI: 10.1046/j.1365-2672.2003.02122.x *
MAGDALENA OLEKSY ET AL: "Exopolysaccharides produced by Lactobacillus sp.: Biosynthesis and applications", CRITICAL REVIEWS IN FOOD SCIENCE AND NUTRITION, 31 May 2016 (2016-05-31), USA, pages 1 - 13, XP055471777, ISSN: 1040-8398, DOI: 10.1080/10408398.2016.1187112 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116590184A (zh) * 2023-04-28 2023-08-15 山东康祐生物科技有限公司 一种提升免疫力的后生元制品及其制备方法和应用
CN116590184B (zh) * 2023-04-28 2024-03-08 山东康祐生物科技有限公司 一种提升免疫力的后生元制品及其制备方法和应用

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