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WO2021000997A1 - Arylalkylamin-, pyrrol-, indol- und opiatderivatkonzentrationsbestimmungsverfahren sowie testkit unter verwendung dieses verfahrens - Google Patents

Arylalkylamin-, pyrrol-, indol- und opiatderivatkonzentrationsbestimmungsverfahren sowie testkit unter verwendung dieses verfahrens Download PDF

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WO2021000997A1
WO2021000997A1 PCT/DE2020/100566 DE2020100566W WO2021000997A1 WO 2021000997 A1 WO2021000997 A1 WO 2021000997A1 DE 2020100566 W DE2020100566 W DE 2020100566W WO 2021000997 A1 WO2021000997 A1 WO 2021000997A1
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WO
WIPO (PCT)
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reagent
color
indole
concentration
substances
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/DE2020/100566
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English (en)
French (fr)
Inventor
Felix BLEI
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Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to EP20743581.9A priority Critical patent/EP3994458A1/de
Priority to CA3145995A priority patent/CA3145995A1/en
Priority to US17/624,476 priority patent/US20230067029A1/en
Publication of WO2021000997A1 publication Critical patent/WO2021000997A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/946—CNS-stimulants, e.g. cocaine, amphetamines
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N31/00—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods
    • G01N31/22—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods using chemical indicators

Definitions

  • Arylalkylamine, pyrrole, indole and opiate derivative concentration determination method and test kit using this method The invention relates to an arylalkylamine, pyrrole, indole and opiate derivative concentration determination method and a test kit using this method for the exact determination of the presence and exact concentration of these substances (to which E.g. which belongs to psilocybin), which have an indole as a structural element and similarly structured substances with primary or secondary amines or pyrrole compounds.
  • Mushrooms containing psilocybin are a group of psychoactive mushrooms that are also known as magic mushrooms or hallucinogenic mushrooms.
  • WO 2019/073379 A1 discloses the large-scale production of psilocybin for use in medicine.
  • it is a process for the production of highly pure crystalline psilocybin, in particular in the form of polymorph A. It also relates to a process for the production of psilocybin and intermediates in its production and psilocybin-containing formulations.
  • WO 2018/135943 A1 discloses the use of one or more cannabinoids and / or terpenes in combination with psilocybin and / or psilocin for use in the prevention or treatment of mental or brain disorders.
  • the one or more cannabinoids from the group cannabidiol (CBD); Cannabidioic acid (CBDA); Tetrahydrocannbidivarin (THCV); Tetrahydrocannbidivaric acid (THCVA); Cannabichromene (CBC); Cannabichromic acid (CBCA); Taken from cannabigerol (CBG) and cannabigerolic acid (CBGA).
  • compositions and methods which comprise a psilocybin derivative.
  • the compositions disclosed herein are used for a method of regulating a neurotransmitter receptor, e.g., a serotonin receptor.
  • the compositions disclosed herein comprise purified compounds, e.g., a purified psilocybin derivative, a purified cannabinoid, or purified terpene.
  • WO 2019/079742 A1 discloses methods and systems for increasing the safety of psychedelic drug therapies (e.g. 5-HT2A agonists such as LSD and psilocybin), e.g. as part of a complex therapy.
  • psychedelic drug therapies e.g. 5-HT2A agonists such as LSD and psilocybin
  • methods and systems for reducing the risk of psychosis, hypomania or mania in connection with psychedelic therapy are disclosed.
  • Ehrlich's reagent is used to detect pyrrole and indole derivatives, such as parent comalkaloids.
  • This reaction is also called the Van Urk reaction [S. Ebel and H. J. Roth (editors): Lexikon der Pharmazie, Georg Thieme Verlag, 1987, p. 213 and Ehrlich, P .: About the dimethylamido-benzaldehyde reaction.
  • the medical week and balneological central newspaper (1901) 151-153 and Urk, H. W. A new sensitive reaction for the ergot alkaloids, ergotamine, ergotoxine and ergotinine and its adaptation to the examination and colorimetric determination of ergot preparations. Pharm. Weekbl. 66 (1929) 473-481.]
  • dimethylaminobenzaldehyde is used as a Kovacs reagent for the detection of indole.
  • This indole test is also suitable for the detection of lysergic acid diethylamide (LSD).
  • the drug is mixed with a reagent solution made from Ehrlich's reagent, sulfuric acid and iron (III) chloride [Dibbem, HW, Rochelmeyer, H., Studies on the Van Urk's color reaction of beta-substituted indoles. Pharmaceutical Research 13 (1963) 7-16.]
  • DE 29 35 881 C2 describes a device for detecting traces of marijuana.
  • a color reaction to the marijuana ingredient (cannabis) is used as a detection reaction.
  • the device consists of a cotton swab that is stored in a transparent plastic tube.
  • the reagents required for the detection of cannabis are contained in separate reagent chambers of the plastic tube.
  • the object to be examined or the person to be examined is wiped off with the cotton swab, traces of marijuana possibly accumulating in the cotton ball.
  • This cotton ball is then dipped into the reagent solutions provided in the storage tube in the specified order.
  • the detection reaction is based on a purely chemical reaction of the cannabis molecules with the reagents made available in the device at a defined pH value. If cannabis is present, a color reaction will appear in the last solution.
  • EP 0 229 517 A1 describes an absorbent test paper impregnated with reagent for the detection of illegal drugs or their metabolites in biological fluid samples.
  • the sample liquid must be pretreated to detect the drugs. For this purpose, it is chromatographically purified and concentrated using a specially prepared syringe. After the pretreatment, the sample is applied to the sample application zone of the test paper. From there, the sample liquid migrates into a reagent-impregnated zone, where the detection reaction for the target analyte takes place and can be observed using a color reaction. This is also a purely chemical detection reaction. It is known that the sensitivity and specificity Such reactions are not sufficient to detect drugs in body fluids.
  • EP 0 229 517 A1 a step for concentrating and cleaning the sample is connected upstream.
  • the complex nature of the sample preparation and the conduct of the reaction in the detection reaction on the test paper make the detection method described in EP 0 229 517 A1 appear unsuitable for use "on site” and in particular for use by "laypersons".
  • DE 101 11 224 A1 discloses a system for the improved detection of compounds of the ecstasy class in biological samples, new analogs of the ecstasy class being made available for the detection of such drugs.
  • analogs are compounds, or salts thereof, of a 2-aminomethylenedioxyphenyl (MDP) derivative attached to Z, where Z is a component capable of being, either directly or indirectly, attached to an immunogenic carrier, detectable label, or to tie a solid capture vehicle.
  • MDP 2-aminomethylenedioxyphenyl
  • Such analogs can be used to construct immunogens, enzyme or enzyme donor conjugates, and other conjugates.
  • the immunogens produce reproducible antibodies with an excellent ability to distinguish various ecstasy-class drugs from potentially interfering substances in biological samples.
  • the specific antibodies and conjugates can be used to distinguish and measure various ecstasy-class compounds in biological samples such as those obtained from an individual suspected of substance abuse.
  • DE 43 05 593 CI discloses a test system for the colorimetric detection of drugs, in particular of opium derivatives, cocaine and amphetamines.
  • An easy-to-use test kit is provided, which reduces the disadvantages of known solutions with regard to possible hazards to the personnel charged with the test due to cuts, chemical burns and deflagrations as well as with regard to possible environmental pollution.
  • the test system consists of an ampoule, a carrier material and a solution of a color reagent, the carrier material being non-porous and the weight ratio of carrier material to color reagent being within the limits of 100: 5 to 20. This results in a significant reduction in the proportions of reagents and solvents required.
  • a simplified test system for this concentration determination is desirable in order to improve the previous knowledge, and it would be very good if this test system were also used to screen for other fungi that contain the active ingredient psilocybin that were not previously tested because they were considered poisonous or inedible.
  • the active ingredient psilocybin has been discovered in over a hundred species of mushrooms around the world and new species are constantly being added.
  • the extraction begins with the drying of the fruit bodies by means of freeze-drying, whereby larger fruit bodies can take several days to dry.
  • the fruit bodies are ground to a fine powder with a mortar, and the active ingredient psilocybin is extracted by adding methanol while stirring continuously for several hours.
  • the biomass of the fungus is then separated off using vacuum filtration. This step must be repeated at least three times so that all of the psilocybin is extracted with the methanol.
  • the resulting methanol extract is combined in a large glass flask and concentrated using a rotary evaporator.
  • the following steps include cleaning using different solvents, such as cyclohexane, in a separating funnel, with which the fats are removed from the extract.
  • the amount of psilocybin present can be compared using high-performance liquid chromatography (HPLC) with a previous exact measurement of a laboratory standard.
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • the difficulty here is that psilocybin, as a very polar molecule, is difficult to separate with the standard C18 column material commonly used.
  • Some optimization of the standard methods is required in order to achieve a meaningful separation of the different indole derivatives. This is necessary because individual peaks separated by baselines are always required for the calculation of the amount of active ingredient.
  • a wide variety of calculations, including the measured laboratory standard must therefore be carried out in the evaluation in order to be able to deduce the amount of the substances present.
  • the second possibility to obtain the content of derivatives from biological samples is the specific extraction and purification of these substances.
  • the purified psilocybin obtained can be weighed from the defined amount from which the extraction was carried out.
  • the analysis can be carried out not only by means of HPLC, but also using the
  • Drug discovery is used. There is practically no possibility of determining the concentration of, for example, psilocybin in wild mushrooms outside of these structures. Another disadvantage is that there is currently no mobile rapid test for determining the concentration of pyrrole, phenylethylamine and indole derivatives.
  • the concentration of pyrrole, phenylethylamine and indole derivatives varies greatly.
  • different amounts of psilocybin can be formed in mushrooms depending on the season and each of the over one hundred species concentrations between 0.1% to 3% achieved. This means that if the specific species of the same genus is confused, there is a high risk of accidental overdosing.
  • Another major disadvantage of the methods used so far is the lack of rapid tests for acute medical use. These would be very desirable, for example, for patients who are admitted for treatment with high levels of confusion and who are suspected of fungal poisoning or overdose.
  • N, N-dimethyltryptamine (DMT) -containing extracts from plants of the genus Psychotria, the indole derivatives of which are obtained from the leaves of the plant with unknown active ingredient content by cooking for several hours.
  • DMT N, N-dimethyltryptamine
  • DMT can be consumed as a pure substance or mixed with MAO inhibitors such as the Harman alkaloids (also a measurable derivative) to make a strong ritual brew called Ayahuasca.
  • MAO inhibitors such as the Harman alkaloids (also a measurable derivative) to make a strong ritual brew called Ayahuasca.
  • This drink is of great cultural importance in many indigenous cultures of the Amazon region and the ceremonial use of the mixture has enjoyed increasing global popularity, especially in the last decade.
  • so-called Ayahuasca retreats by companies such as "Ayahuasca International" offer ceremonies worldwide, which, however, neither meet the standards of care and care for the people who go through the ceremony, nor can guarantee an estimate of the active ingredient content of the mixture.
  • the object of the invention is to avoid the disadvantages of the prior art and to provide an arylalkylamine, pyrrole, indole and opiate derivative concentration determination method as well as a test kit for determining the concentration of these substances, which provide rapid, low-cost, quantitative detection of indole derivatives, in particular of psilocybin, as well as pyrrole or arylalkylamine derivatives or opiate derivatives and thereby an exact determination of the presence and precise concentrations of various natural substances, such as psilocybin, which have an indole as a structural fragment, as well as similarly structured substances with primary or secondary amines or pyrrole compounds or Enable opiates in the quantitative rapid test.
  • This two-stage concentration determination method begins with a defined extraction of the respective derivatives from the sample, which can be very diverse and is already known from the prior art.
  • the extract obtained in this way is then subjected to a quantitative determination of the concentration of the respective active ingredient using colorimetric methods, which enables precise information on the active ingredient content present.
  • test kit enables the concentration of psilocybin, psilocin, LSD, DMT and other indole derivatives, primary aromatic amines, especially tryptamines, such as
  • Sumatriptan and phenylethylamines such as, for example, amphetamine, methamphetamine, ephedrine, pseudoephedrine, norephedrine, norpseudoephedrine, oxilofrin, N-methylephedrine, N-ethylamphetamine, PMA, PMMA, methyl-MA, 2C-B, 2C-C, 2C-D, 2C-D, 2C-D -E, 2C-P, 2C-I, 2C-F, 2C-N, 2C-T-2, 2C-T-4, 2C-T-7, 2C-T-8, 2C-T-9, 2C -T-21, 2C-TFM, MDA, MDMA, MDEA, MDE, MMDA-3a, MMDA, mescaline (M), IM or TMPEA, pyrroles and similar substances by means of a single test method, which is fast, cost
  • test kit can be produced in large numbers for a low price, which makes it possible to use it on a large scale in the "Safer Drug Use" scene within existing projects to minimize the risk of drug consumption, for later use in psychotherapy against depression by psychologists or alternative practitioners or ultimately also for private use by mushroom pickers or breeders.
  • Fig. 1 a diagram of the absorption measurement (optical density / wavelength) for determining the absorption maximum of
  • Determining the concentration of LSD and 5 a diagram of the optical densities of the dilution series of an amphetamine standard after staining by means of an embodiment of the method according to the invention for determining the concentration of amphetamine.
  • the test procedure which is the basis for the test kit, comprises two steps to determine the concentration of arylalkylamine, pyrrole, indole and opiate derivatives, especially in the form of psilocybin, DMT, harmane alkaloids and their related derivatives, carbazoles and other substances with primary
  • arylalkylamine, pyrrole, indole and opiate derivatives especially in the form of psilocybin, DMT, harmane alkaloids and their related derivatives, carbazoles and other substances with primary
  • parent alkaloids or ergotamine as well as synthetically produced lysergic acid derivatives such as lysergic acid diethylamide (LSD), drugs or substances with a similar structure.
  • LSD lysergic acid diethylamide
  • the test procedure can also be used for the detection of substances in which primary aromatic amines or similar substances are only formed as a result of a reaction such as in the preceding hydrolysis.
  • the various substances listed can also be found in dried fruiting bodies, mycelia, sclerotia or other plant or animal materials, in body fluids such as urine or blood, in food, waste water or synthetic products of any origin.
  • the test method also serves to be able to measure the concentration of bacterial cultures or other organisms which, for example, contain the enzyme tryptophanase and enables conclusions to be drawn about the concentration and growth of these bacteria.
  • the two-stage test procedure for determining the concentration is individually adapted for each derivative, with the respective test kit containing the materials and instructions required for the extraction and the subsequent concentration determination.
  • an extraction adapted to the respective active substance or the absorption of the active substance in a defined amount of water and / or organic solvent takes place, which, depending on the substance, requires an aqueous acidic solution or the use of an alcoholic solvent or other similar solvents. This is done according to the known prior art.
  • the noise solution for this process includes, for example, the electrophilic 4- (N, N-dimethylamino) benzaldehyde (abbreviated: DMABA).
  • DMABA electrophilic 4- (N, N-dimethylamino) benzaldehyde
  • the larch solution contains, for example, the electrophilic 4- (N, N-dimethylamino) benzaldehyde (DMABA) in an aqueous hydrochloric acid solution for coloring psilocybin.
  • DMABA electrophilic 4- (N, N-dimethylamino) benzaldehyde
  • the DMABA can also be dissolved in other solvents or in powder form, or contain other additives such as other acids or solvents or metal ions such as Le 3+ .
  • the selection is made according to the known prior art.
  • the staining solution for this procedure comprises 4- (N, N-dimethylamino) benzaldehyde or, alternatively, the following reagents:
  • -Marquis reagent which is classically used for the detection of various alkaloids, such as morphines or various phenylethylamine derivatives, and is based on the use of sulfuric acid and formaldehyde
  • -Zwikker reagent which is used for the quantitative detection of mainly barbiturates and other active substances
  • -Simon's reagent which is also mainly used for the detection of alkaloids with secondary amines and others and also has a linear color gradient and in combination with Mecke and Marquis are used to identify alkaloids
  • -Folins reagent which is used to differentiate between MDMA and related compounds
  • -Dille-Koppanyi reagent which is mainly used for the detection of barbiturates
  • the reagents listed above showed different colorations with the substances to be examined quantitatively, which enables a good way of distinguishing the various substances to be tested, whereby substance mixtures can also be examined quantitatively in order to determine the different concentrations, since all of the reagents listed have a linear one
  • the course of the concentration curves in the absorption measurements of the color reactions (shown by way of example in Figures 2 to 5), so that these reagents, which have been known for a long time, are also used for determining the active ingredient concentration by means of the method for indole alkaloids, phenylethylamines and other compounds and for colorimetric determination of active ingredient concentrations for use in the test kits can be used.
  • the color change observed in psilocybin / psilocin can be described, for example, as violet to bluish in higher concentrations, whereas the discoloration of DMT can be observed, for example, from yellow to green in higher concentrations.
  • the color of LSD together with the coloring solution can be described as brownish.
  • the specific optimal incubation temperatures of the individual reagents are contained in the user instructions enclosed with the respective test kits.
  • the use of latent heat storage or the simple use of batteries or rechargeable batteries for generating the required heat and other possible heat sources are advisable.
  • the coloration in the second reaction step has a linear range within which an exact determination of the concentration of the active ingredient (pyrrole, phenylethylamine and indole derivatives, opiates, cannabinoids) is possible.
  • the exact active ingredient content is compared and determined in the method based on a comparison of the color intensities with a determined color spectrum of an exact dilution series and the associated active ingredient contents.
  • This optical comparison during the second process step allows a quick and direct determination of the concentration of the examined sample.
  • the necessary evaluation of the test result can be compared with the color reaction of a pH test strip and the reading of the pH value on a color scale.
  • This evaluation of the test procedure for measuring the concentration of a wide variety of substances can, however, also be measured using technical auxiliary equipment or other methods such as a spectrophotometer analysis, and thus allows an even more precise determination of the concentration for values that lie exactly between 2 colors in the color scale.
  • the pure optical evaluation which is possible with the human eye using a color scale, is improved with the aid of a modern camera cell phone (smartphone) by means of an exact color determination by the cell phone's camera.
  • APP application software
  • the entire test kit includes the “single-use kits” as a single-use system or the “multiple-use kits” as a reusable system, as well as user instructions, whereby the handling of the test kit and the indication of the active ingredient-specific optimal incubation temperatures are included in the enclosed user instructions.
  • Dried fruit bodies of mushrooms of the genus Psilocybe are crushed to a fine powder using a mortar, mixer or other means and a defined amount of 1 g is provided using a balance or other suitable measuring device.
  • the biomass is placed in a suitable vessel such as a 100 ml sample beaker and the 5% citric acid supplied is sprinkled over it and incubated for a short time at room temperature
  • the sample cup is filled with 50 ml of distilled water and the extraction is carried out with vigorous shaking.
  • a filtration is recommended, which can be achieved, for example, by an attached syringe filter, but is not absolutely necessary.
  • incubation takes place with 3 ml detection solution in which a defined amount of 40 mg / ml p-dimethylaminobenzaldehyde (4- (CH 3 ) 2 NC 6 H 4 CHO) is in an aqueous hydrochloric acid solution.
  • p-dimethylaminobenzaldehyde 4- (CH 3 ) 2 NC 6 H 4 CHO
  • This leads to a reaction with the p-dimethylaminobenzaldehyde and an intense blue-violet discoloration, depending on the additives used in the coloring solution and the existing concentration of the ingredients.
  • the concentration is too high, the result is an opaque, violet-blackish color, which determines the detection limit of the reaction, since no optical differences can be recognized.
  • the respective instructions must be followed exactly, which already includes the amount of extraction solution in relation to the amount of ingredients to be expected.
  • the absorption measurement is shown in FIG. 1 and shows a maximum absorption of 550 nm, which corresponds to the observed color.
  • a dilution series is made from an authentic psilocybin standard, which is also incubated with the staining solution already described and measured at a wavelength of 550 nm.
  • the result of the very linear color reaction is shown in Fig. 2 and forms the basis for a quantitative determination of the concentration.
  • Different dilution levels and their observed color gradients serve as the basis for a colorimetric determination of unknown psilocybin concentrations, as in the above example described.
  • a comparison of the color gradients can be used to determine the exact concentration of psilocybin and thus the active ingredient content in the mushrooms.
  • DMT is usually acquired by consumers as a light-colored crystalline or powdery substance. This is mostly the product of a simple extraction of DMT-containing plants such as Psychotria viridis.
  • 10 mg of the substance are weighed and dissolved using 1 ml of acidic water (4% HCl solution in double-distilled water).
  • acidic water 4% HCl solution in double-distilled water.
  • staining solution with p-dimethylaminobenzaldehyde in an aqueous hydrochloric acid solution, the color reaction takes place with an incubation at 50 degrees for 15 minutes. The maximum absorption of the resulting color reaction at 472 nm was determined by subsequent measurements.
  • the absorptions obtained can now be compared or the resulting color can be compared colorimetrically with the colorations of an authentic standard series. This comes from a standard from which a dilution series was created and examined with regard to a linear color gradient. The results can be seen in FIG. 3 and also show a linear color gradient for DMT, which forms the basis for a colorimetric determination of the concentration.
  • the measured absorption or the observed color gradient of the sample can also be assigned to the concentration already known by means of the best-fit straight line.
  • Amphetamine is commonly purchased by consumers as a light-colored crystalline or powdered substance. To test how much active ingredient is present in this powder, 10 mg of the substance are removed and dissolved using 1 ml of ethanol. By adding 3 ml of staining solution with p-dimethylaminobenzaldehyde in an aqueous hydrochloric acid solution, the color reaction takes place with an incubation at 50 degrees for 15 minutes. The maximum absorption at 510 nm was determined by a subsequent measurement. The absorption value obtained at 510 nm or the resulting color can now be compared colorimetrically with the colorations of an authentic standard series. A dilution series was prepared from the standard in advance and examined with regard to its linear color gradient.
  • results can be seen in FIG. 5 and also show a linear color gradient for amphetamine, which forms the basis for a colorimetric determination of the concentration.
  • the measured absorption or the observed color gradient of the sample can also be assigned to the concentration already known by means of the best-fit straight line. It can be seen that the concentration of Phenylethylamine derivatives such as amphetamine and many other examples, not shown, can be carried out with high sensitivity and simple methods using colorimetric methods.
  • the procedure and the test kit enable the measurement of the
  • pyrrole and indole derivatives such as psilocybin, N, N-dimethyltryptamine (DMT), other active ingredients such as 5-methoxy-N, N-dimethyltryptamine (5-MeO-DMT) and similar indole alkaloids, 5-MeO- DIPT, 5-MeO-MIPT, 5-MeO-AMT, 4-AcO-DMT, 2C-D, 2C-E, 2C-I, 2C-P and DXM, the Harman alkaloids and other derivatives, carbazoles, cannabinoids, opiates and other substances with primary or secondary amines, parent alkaloids and ergotamine, as well as synthetically produced lysergic acid derivatives, such as. Lysergic acid diethylamide (LSD), medicinal substances, other semi or fully synthetic products or
  • Substances with a similar structure are widespread and can occur in dried fruit bodies, mycelia, sclerotia or other plant or animal materials, in body fluids such as urine or others, in food or other products of synthetic origin.
  • the detection reaction can also be used in order to be able to measure the concentration of bacterial cultures or the like which contain tryptophanase, for example.
  • Dilution series with Marquis reagent also showed a linear color gradient. The Marquis reagent colors DMT linear brownish / yellow. To do this, 250 ml of 37% formaldehyde were added to 5 ml of concentrated sulfuric acid.
  • DMT and psilocybin are in an aqueous 3.5% HCL solution and have been mixed with the same amount of Marquis reagent. In the last row 3 times the amount of reagent was used, which showed a stronger color.
  • the Marquis Test also shows linear color gradients measured at 450 nm and can therefore be used for colorimetric determination. As a result, other color tests such as Mecke, Simon, Liebermann, Folin, Zwikker Mandelin, Fröde and many more were examined and confirmed for their linearity.
  • the method and the test kit are used for the detection of substances in which primary aromatic amines or similar substances arise only through a preceding hydrolysis, which can be detected with this test method.
  • the concentration is determined by a simple color reaction, which can be evaluated purely optically by means of colorimetry or with the aid of measuring devices.
  • test kit for the above-mentioned derivatives can, if necessary, take place with the supply of heat, which enables the concentration to be determined independently of outside temperatures or an additional power source by means of an external heat source.
  • test kit is designed instead of the closed vessel, bag or other cavities in the form of test strips with an applied color reagent, which advantageously contains 4- (N, N-dimethylamino) benzaldehyde, Marquis reagent, Mecke reagent, Zwikker reagent, Simon's reagent, Mandelin reagent, Liebermann reagent, Fröhde reagent, Folins reagent, Dille-Koppanyi reagent, Scott reagent or Duquenois-Levine reagent, (whereby the test strip can be obtained according to the prior art for the production of test strips ), which can be immersed directly in liquids, whereupon a simple and uncomplicated concentration determination according to the
  • Valuation is handled.
  • the provision of a rapid test kit for single use, in which the required solvent is already contained in a bag or similar storage item, and in which the respective sample must subsequently be added, enables easy handling by the user, who can even be a layperson.
  • the detection solution is added manually or, as an alternative, is already in a breakable ampoule or a similar vessel in which the color reagent, preferably 4- (N, N-dimethylaminojbenzaldehyde, Marquis reagent, Mecke reagent,
  • Zwikker reagent Simon's reagent, Mandelin reagent, Liebermann reagent, Fröhde reagent, Folins reagent, Dille-Koppanyi reagent, Scott reagent or Duquenois-Levine reagent is located, and releases the color reaction by simply adding or breaking or similar of the storage vessel.
  • the method and the test kit for the precise determination of the concentration of the substances mentioned above can be used in a micro-dosing area, e.g. in the form of a psilocybin microdosing kit, by means of which the required dose of 2-3 mg exactly to the e.g.
  • the amount of fungus used can be extrapolated, whereby the extraction solution produced, consisting of water and citric acid, can be used safely in order to achieve a targeted dosage.
  • the procedure and kit allow:
  • the provision of the single-use test kit which already contains the required solutions in different cavities for the method and to which only the substance to be tested has to be added, also enables very simple, low-effort handling, even by non-specialists such as patients and end users.
  • Possible areas of application of the method and the test kit include doping tests, tests of incapacity to drive, poisonous mushroom selections as well as substance and environmental monitoring.
  • the method and the test kit can also be used for the quantitative analysis of unknown street drugs in tablet form, such as ecstasy, which are often filled or stretched. Due to various stretching or filling substances, neither illegal drugs available on the black market nor legal, industrially manufactured drugs in tablet form can be detected using common colorimetric methods, since, for example, the sugar or starch (common fillers) contained react with the detection reagents or components of these excessively colored compounds and thus cover the color of the actual active ingredient.
  • the mentioned fillers sugar and starch react, for example, with the sulfuric acid of the detection reagent to a brown color and the actual purple color of MDMA is covered by the brown color. This can be easily demonstrated experimentally, as shown below:
  • 0.05 mg MDMA in 100 ⁇ l aqueous solution turns into a strong purple color when 200 ⁇ l of a mixture of 20: 1 concentrated 97% sulfuric acid and 40% formaldehyde is added. If only the 0.10 mg strength is added, the mixture turns a brown shade when treated with the mentioned detection reagent and thus hides the actually intended color reaction and makes evaluation impossible.
  • the possible case of a fatal admixture is, for example, the substance PMMA (para-methoxy-N-methylamphetamine) in MDMA (3,4-methylenedioxy-N-methylamphetamine), also known as ecstasy.
  • PMMA para-methoxy-N-methylamphetamine
  • MDMA 3,4-methylenedioxy-N-methylamphetamine
  • the method enables the removal of unwanted fillers and the determination of the concentration of different active ingredients for a wide range of active ingredients with a set of color reagents without the use of, for example, expensive and only very specific antibodies.
  • active ingredient contents of mixtures can also be analyzed quantitatively very easily and without specialist knowledge without using thin-layer chromatography.
  • Phenylethylamines in the following example show the detection of common extenders such as amphetamine or 2C-B by means of a second color especially for these substances.
  • a combination of several color reagents is also used and enables the detection of, for example, fentanyl in heroin.
  • these active ingredients however, the necessary removal of fillers before the actual coloring of the expected active ingredient remains the same, and this is made possible by removing these before the actual coloring by means of the mixture of the color reagent 1: 1 with chloroform. The actual coloring is not affected by this treatment.
  • Embodiment 6 Embodiment 6
  • Two detection solutions are prepared for the determination of the active substances present.
  • the weighed substance is added to 5 ml of 5% citric acid in a sealable vessel and dissolved by shaking briefly.
  • the color in the lower colored phase is compared using the comparison colors available.
  • the color can be evaluated using a spectrophotometer or APP and a direct conclusion can be drawn about the concentration present using a calibration line.
  • Unwanted fillers which could influence the color, are in the clear, uncolored phase and thus do not hinder the detection of MDMA, so that a clear purple color is shown in the test and the concentration of the active ingredient can be determined by this color.
  • a further 100 ml drop of the already weighed and dissolved substance is added to a "negative color" in the second detection solution, which contains 1 g of sodium nitroprusside and 2 ml of acetone in 50 ml.
  • a glass vial which contains 300 ml of chloroform and 200 ml of a 2% sodium carbonate solution.
  • the strength of this color can also be used to determine how much Extender is present in this sample, which for the first time provides the user with "vital" information on the content of his sample.
  • Extenders can now be identified by means of the color and the concentration of these extenders can also be determined on the basis of the intensity of the resulting color. With the information available, dangerous overdoses with undesired mixed samples can be prevented, which for example can be significantly more potent than MDMA and which are usually added to illegal black market drugs without the knowledge of the subsequent users.
  • This application example illustrates the first-time possibility of not only detecting substances that are stretched or mixed in any form by means of colorimetry, but even determining their concentration.
  • the method can remove unwanted fillers, such as sugar and starch, and at the same time test for different active ingredients and their concentration.
  • DMT is usually smoked in powder form by consumers and is extracted from leaves of the plant Psychotria viridis, for example.
  • the batch is shaken several times and you can see two phases, one of which is clear and the other is colored depending on the active ingredient contained.
  • Psilocybin appears as a brown color and DMT as a yellowish color. It is also possible to identify completely different active ingredients, such as, for example, synthetic variants, which are immediately noticeable due to a changed color.
  • Possible stretchers and fillers such as in this case the indole alkaloids, which are extracted from natural substances, are mostly still cleaning residues that collect in the clear, uncolored chloroform layer and do not affect the color in the aqueous acidic phase.
  • tropane alkaloids such as cocaine
  • 20 mg of the present powdery substance are weighed out and dissolved in a vessel with 5 ml of distilled water by shaking. 100 ml are removed from this solution and added to the improved detection solution in a second vessel. 50 ml of this detection solution contains 1: 1 5 g potassium nitrite in concentrated 97% sulfuric acid and 99% chloroform. From the detection solution lie 500 m ⁇ in a vessel in front of which the 100 m ⁇ of cocaine solution is added. There are again two phases, one of which contains colored cocaine and a phase in which there are possible fillers. The active ingredient content of cocaine can be read off from the intensity of the yellow color in the colored lower phase (using the evaluation options already described).
  • a second detection solution is the use of cobalt (II) thiocyanate.
  • the weighed substance is dissolved in dist.
  • Dissolved water which, due to the cobalt (II) thiocyanate it contains, turns blue in the presence of cocaine.
  • 100 ml of the solution are now added to a second vessel with 1: 1 10% hydrochloric acid aqueous solution and chloroform, a pink coloration with a blue phase in the upper area results. Since cocaine is almost always in stretched form, it is necessary to purify the unwanted fillers in order to quantify the cocaine concentration. If extenders such as levamisole are added to the cocaine, they are immediately noticeable in the first dyeing method through an orange coloration of the colored phase and can also be quantified by the intensity of the coloration using the evaluation methods described.
  • opiates such as heroin, morphine or fentanyl
  • 20 mg of the present substance are weighed out and dissolved in a vessel with 5 ml of distilled water by shaking.
  • 50 ml of this detection solution contains 4: 1: 5 (62% HN0 3 : H 2 0: CHC1 3 ).
  • 500 ml of the detection solution are in a vessel to which 100 ml of the opiate solution taken up is added.
  • Two phases are created again, one of which contains the colored active ingredient and a clear phase in which there are possible fillers.
  • the active ingredient content of heroin for example, can be determined by the intensity of the The resulting yellow color in the colored lower phase can be read (using the evaluation options already described).
  • test will turn reddish in color.
  • extender fentanyl a synthetic opiate which is lethal at a dose of just a few milligrams.
  • the already prepared heroin solution can be added to a second detection solution.
  • 400 ml of chloroform is given in a 1.5 ml glass vessel with a screw cap. Added to this are 10 m ⁇ formaldehyde and 390 m ⁇ concentrated 96% sulfuric acid.
  • Fentanyl can immediately be distinguished by its orange color from the light yellow of heroin or the red color from morphine. Since heroin is almost always available in stretched form, it is necessary to purify the unwanted fillers in order to quantify the heroin. If additives, such as fentanyl, are added to the heroin, they are noticeable in a second color and can also be quantified by the intensity of the color using the evaluation methods described.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Arylalkylamine-, Pyrrol-, Indol- und Opiatderivatkonzentrationsbestimmungsverfahren sowie Testkit unter Verwendung dieses Verfahrens zur exakten Bestimmung von Anwesenheit und genauer Konzentration dieser Stoffe, welche ein Indol als Strukturelement besitzen sowie ähnlich aufgebaute Stoffe mit primären Aminen oder Pyrrolverbindungen, Phenylethylamine und weitere Substanzen. Die Aufgabe der Erfindung, ein Arylalkylamine-, Pyrrol-, Indol- und Opiatderivatkonzentrationsbestimmungsverfahren sowie einen Testkit zur Konzentrationsbestimmung anzugeben, welche einen schnellen, kosten- und aufwandgeringen quantitativen Nachweis von Indolderivaten, insbesondere von Psilocybin, sowie von Arylalkylamine-, Pyrrol- oder Opiatderivaten bereitstellen und dabei eine exakte Bestimmung von Anwesenheit und genauer Konzentrationen verschiedener Naturstoffe, wie bspw. dem Psilocybin, welche ein Indol als Strukturfragment besitzen, sowie ähnlich aufgebaute Stoffe mit primären oder sekundäre Aminen oder Pyrrolverbindungen im Schnelltest ermöglichen, wird dadurch gelöst, dass das Verfahren zwei Verfahrensschritte in Form eines Extraktionsschrittes und eines nachfolgenden Analyseschrittes unter Verwendung einer Farbreagenz umfasst, wobei bei dem Analyseschritt mindestens eine Farbreagenz mit mindestens einem Arylalkyl-, Pyrrol-, Indol- oder Opiatderivat eine mittels kolorimetrischer Methoden messbare quantitative und lineare Farbreaktion hervorruft, welche erfasst und ausgewertet wird.

Description

Arylalkylamin-, Pyrrol-, Indol- und Opiatderivatkonzentrationsbestimmungsverfahren sowie Testkit unter Verwendung dieses Verfahrens Die Erfindung betrifft ein Arylalkylamin-, Pyrrol-, Indol- und Opiatderivatkonzentrationsbestimmungsverfahren sowie einen Testkit unter Verwendung dieses Verfahrens zur exakten Bestimmung von Anwesenheit und genauer Konzentration dieser Stoffe (zu denen bspw. das Psilocybin gehört), welche ein Indol als Strukturelement besitzen sowie ähnlich aufgebaute Stoffe mit primären oder sekundären Aminen oder Pyrrolverbindungen.
Psilocybinhaltige Pilze (sogenannte Zauberpilze) sind eine Gruppe psychoaktiver Pilze, die auch als Zauberpilze, magic mushrooms oder halluzinogene Pilze bezeichnet wird. Zu dieser Gruppe gehörende Pilze, wie bspw. Psilocybe cyanescens, auch Blauender Kahlkopf genannt, enthalten die psychedelisch (bewusstseinserweitemden, halluzinogen) wirkenden Substanzen Psilocybin und Psilocin, welche als Wirkstoff erforscht werden.
WO 2019/073379 Al offenbart die großtechnische Herstellung von Psilocybin zur Verwendung in der Medizin. Insbesondere handelt es sich um ein Verfahren zur Gewinnung von hochreinem kristallinem Psilocybin, insbesondere in Form von Polymorph A. Es bezieht sich ferner auf ein Verfahren zur Herstellung von Psilocybin und Zwischenprodukten bei dessen Herstellung und psilocybinhaltigen Formulierungen.
WO 2018/135943 Al offenbart die Verwendung eines oder mehrerer Cannabinoide und/oder Terpene in Kombination mit Psilocybin und/oder Psilocin zur Verwendung bei der Prävention oder Behandlung von psychischen oder Himstörungen. Vorzugsweise werden das eine oder die mehreren Cannabinoide aus der Gruppe Cannabidiol (CBD); Cannabidiosäure (CBDA); Tetrahydrocannbidivarin (THCV); Tetrahydrocannbidivarinsäure (THCVA); Cannabichromen (CBC); Cannabichromensäure (CBCA); Cannabigerol (CBG) und Cannabigerolsäure (CBGA) entnommen.
WO 2018/148605 Al offenbart neue Zusammensetzungen und Verfahren, die ein Psilocybinderivat umfassen. In einer Ausführungsform werden die hierin offenbarten Zusammensetzungen für ein Verfahren zur Regulierung eines Neurotransmitter-Rezeptors, z.B. eines Serotonin-Rezeptors, verwendet. In einer Ausführungsform umfassen die hierin offenbarten Zusammensetzungen gereinigte Verbindungen, z.B. ein gereinigtes Psilocybinderivat, ein gereinigtes Cannabinoid oder gereinigtes Terpen.
WO 2019/079742 Al offenbart Methoden und Systeme zur Erhöhung der Sicherheit von psychedelischen Arzneimitteltherapien (z.B. 5-HT2A- Agonisten, wie LSD und Psilocybin), z.B. im Rahmen einer Komplextherapie. Insbesondere werden Verfahren und Systeme zur Reduzierung des Risikos einer Psychose, Hypomanie oder Manie im Zusammenhang mit der psychedelischen Therapie offenbart.
Seit langem ist bekannt, dass eine Lösung aus 2 % Dimethylaminobenzaldehyd in 20%iger Salzsäure, welche als Ehrlich- Reagenz oder Ehrlich-Pröscher-Reagenz bezeichnet wird, zum Nachweis von primären Aminogruppen, Pyrrol- und Indol-Derivaten dient.
In der Pharmazie wird das Ehrlich-Reagenz zum Nachweis von Pyrrol-, und Indol-Derivaten, wie bspw. von Mutterkomalkaloiden, verwendet. Diese Reaktion wird auch als Van-Urk-Reaktion bezeichnet [S. Ebel und H. J. Roth (Herausgeber): Lexikon der Pharmazie, Georg Thieme Verlag, 1987, S. 213 sowie Ehrlich, P.: Über die Dimethylamido- benzaldehydreaction. Die medizinische Woche und balneologische Zentralzeitung (1901) 151-153 und Urk, H. W., A new sensitive reaction for the ergot alkaloids, ergotamine, ergotoxine and ergotinine and its adaptation to the examination and colorimetric determination of ergot preparations. Pharm. Weekbl. 66 (1929) 473-481.]
In der Mikrobiologie wird Dimethylaminobenzaldehyd als Kovacs- Reagenz zum Nachweis von Indol verwendet. Dieser Indol-Test ist auch zum Nachweis von Lysergsäurediethylamid (LSD) geeignet. Hierzu wird der Arzneistoff mit einer Reagenzlösung aus Ehrlichs-Reagenz, Schwefelsäure und Eisen (Ill)chlorid versetzt [Dibbem, H. W., Rochelmeyer, H., Studies on the Van Urk’s color reaction of beta- substituted indoles. Arzneimittelforschung 13 (1963) 7-16.]
In DE 29 35 881 C2 wird eine Vorrichtung zur Detektion von Spuren von Marihuana beschrieben. Als Nachweisreaktion wird eine Farbreaktion auf den Marihuana-Inhaltsstoff (Cannabis) verwendet. Die Vorrichtung besteht aus einem Wattestäbchen, das in einem durchsichtigen Kunststoffröhrchen aufbewahrt wird. In getrennten Reagenzienkammem des Kunststoffröhrchens sind die für den Cannabis- Nachweis erforderlichen Reagenzien enthalten. Mit dem Wattestäbchen wird der zu untersuchende Gegenstand bzw. die zu untersuchende Person abgewischt, wobei sich gegebenenfalls Marihuanaspuren im Wattebausch ansammeln. Dieser Wattebausch wird anschließend in vorgegebener Reihenfolge in die Reagenzienlösungen, die im Aufbewahrungsröhrchen zur Verfügung gestellt werden, getaucht. Die Nachweisreaktion beruht auf einer rein chemischen Reaktion der Cannabismoleküle mit den in der Vorrichtung zur Verfügung gestellten Reagenzien bei einem definierten pH-Wert. Bei Anwesenheit von Cannabis zeigt sich eine Farbreaktion in der letzten Lösung.
EP 0 229 517 Al beschreibt ein saugfähiges, mit Reagenz imprägniertes Testpapier zum Nachweis von illegalen Drogen oder deren Metaboliten in biologischen Flüssigkeitsproben. Gemäß der technischen Lösung der EP 0 229 517 Al muss die Probenflüssigkeit zum Nachweis der Drogen vorbehandelt werden. Dazu wird sie mittels einer speziell präparierten Spritze chromatographisch gereinigt und aufkonzentriert. Nach der Vorbehandlung wird die Probe auf die Probenaufgabezone des Testpapiers aufgegeben. Von dort wandert die Probenflüssigkeit in eine reagenzimprägnierte Zone, wo die Nachweisreaktion für den Zielanalyten stattfindet und anhand einer Farbreaktion beobachtbar ist. Auch hierbei handelt es sich um eine rein chemische Nachweisreaktion. Es ist bekannt, dass die Nachweisempflindlichkeit und die Spezifität derartiger Reaktionen nicht ausreichen, um Drogen in Körperflüssigkeiten nachzuweisen.
Deshalb ist gemäß der technischen Lösung von EP 0 229 517 Al ein Schritt zur Aufkonzentrierung und Reinigung der Probe vorgeschaltet. Die aufwendige Art der Probenvorbereitung und der Reaktionsführung bei der Nachweisreaktion auf dem Testpapier lässt die in EP 0 229 517 Al beschriebene Detektionsmethode ungeeignet für den Einsatz "vor Ort" und insbesondere die Anwendung durch "Laien" erscheinen. DE 101 11 224 Al offenbart ein System zum verbesserten Nachweis von Verbindungen der Ecstasy-Klasse in biologischen Proben zur Verfügung, wobei neue Analoge der Ecstasy-Klasse zum Nachweis solcher Drogen zur Verfügung gestellt werden. Diese Analoge sind Verbindungen oder deren Salze, eines 2-Aminomethylendioxyphenyl- (MDP)-Derivats, das an Z befestigt ist, wobei Z eine Komponente ist, die in der Lage ist, entweder direkt oder indirekt an einen immunogenen Träger, eine nachweisbare Markierung oder ein festes Einfangvehikel zu binden. Solche Analogen können verwendet werden, um Immunogene, Enzym- oder Enzymdonor-Konjugate und andere Konjugate zu konstruieren. Die Immunogene erzeugen reproduzierbare Antikörper mit einer ausgezeichneten Fähigkeit, verschiedene Drogen der Ecstasy- Klasse in biologischen Proben von potentiell störenden Substanzen zu unterscheiden. Die spezifischen Antikörper und die Konjugate können verwendet werden, um verschiedene Verbindungen der Ecstasy-Klasse in biologischen Proben wie beispielsweise jenen, die von einer Einzelperson erhalten wurden, welche des Substanzmissbrauchs verdächtigt wird, zu unterscheiden und zu messen.
DE 43 05 593 CI offenbart ein Testsystem zum kolorimetrischen Nachweis von Drogen, insbesondere von Opiumderivaten, Cocain und Amphetaminen. Dabei wird ein einfach zu handhabenden Testsatz bereitgestellt, der die Nachteile bekannter Lösungen in Bezug auf mögliche Gefährdungen des mit der Prüfung beauftragten Personals durch Schnittverletzungen, Verätzungen und Verpuffungen sowie in Bezug auf mögliche Umweltbelastungen auf ein Minimum reduziert. Gemäß der DE 43 05 593 CI besteht das Testsystem aus einer Ampulle, einem Trägermaterial und einer Lösung eines Farbreagenz, wobei das Trägermaterial unporös ist und das Gewichtsverhältnis von Trägermaterial zu Farbreagenz in den Grenzen von 100 zu 5 bis 20 liegt. Damit wird eine signifikante Reduzierung der benötigten Reagenzien- und Lösungsmittelanteile erreicht.
Seit der Entdeckung des Moleküls Psilocybin von 1959 bis in die heutige Zeit hat sich die Konzentrationsbestimmung von Psilocybin und ähnlichen anderen Stoffen nicht wesentlich weiterentwickelt und stellt ein kostenintensives und langwieriges Verfahren dar. Es bedarf einer wesentlichen Vereinfachung der Testmethoden, welche einen weitreichenden Einsatz ermöglicht. Viele Angaben zu vorkommenden Inhaltsstoffen in Pilzen, Pflanzen oder Tiere sind bereits seit vielen Jahrzehnten auch in der Fachliteratur ungenau und beruhen auf einzelnen Messungen, auch werden lokale und saisonale Schwankungen nicht berücksichtigt. Als Beispiel zu nennen: den Pilz Pluteus salicinus dessen Psilocybingehalt in der Fachliteratur mit 0,1 bis 0,8 % angegeben ist, es gibt hingegen widersprüchliche Analysen von Gartz die auf einen Gehalt von über 2% schließen lassen. Diese Verwirrung und auch Fehlinformationen herrschen bei vielen Naturstoffen vor, welche aus Pilzen oder Pflanzen konsumiert werden, und beruhen auf der eingeschränkten Möglichkeit, die Konzentration dieser zu bestimmen.
Ein vereinfachtes Testsystem für diese Konzentrationsbestimmung ist wünschenswert, um die bisherigen Erkenntnisse noch zu verbessern, und dabei wäre es sehr gut, wenn dieses Testsystem auch dem Screening nach weiteren Pilzen dienen würde, welche den Wirkstoff Psilocybin enthalten, die vorher nicht getestet wurden, weil sie als giftig oder ungenießbar galten. Der Wirkstoff Psilocybin wurde bisher schon in über hundert Arten von Pilzen auf der ganzen Welt entdeckt und es kommen ständig neue Arten hinzu.
Aktuell benötigt die Konzentrationsbestimmung von Indolderivaten wie dem Psilocybin, welche unter anderem von den Pilzen der Gattung Psilocybe produziert wird, immer noch eine komplizierte und umfangreiche Analyse in speziellen Laboratorien. Die Fruchtkörper der Pilze müssen zu einem Spezial-Labor versendet werden, in welchem der Wirkstoff Psilocybin mittels mehrstufiger und aufwändiger Protokolle unter Zuhilfenahme unterschiedlichster Lösungsmittel extrahiert wird. Um den bisher nötigen Zeit- und Kostenaufwand für derartige Wirkstoffmengenbestimmungen zu verdeutlichen, werden nach folgend die aktuell verwendeten Schritte für eine solche Nachweisreaktion von Psilocybin aus den Fruchtkörpem der Pilze der Gattung Psilocybe aufgezeigt.
Die Extraktion beginnt mit der Trocknung der Fruchtkörper mittels Gefriertrocknung, dabei können größere Fruchtkörper mehrere Tage zur Trocknung benötigen.
Im nächsten Schritt werden die Fruchtkörper mit einem Mörser zu einem feinen Pulver zermahlen, und mittels Methanol Zugabe wird unter ständigen Rühren über mehrere Stunden der Wirkstoff Psilocybin extrahiert.
Die Biomasse des Pilzes wird nachfolgend mittels Vakuumfiltration abgetrennt. Damit auch wirklich alles Psilocybin mit dem Methanol extrahiert wird, muss dieser Schritt mindestens drei Mal wiederholt werden.
Das entstandene Methanolextrakt wird in einem großen Glaskolben vereinigt und mittels Rotationsverdampfer eingeengt. Die folgenden Schritte beinhalten die Reinigung mittels unterschiedlicher Lösungsmittel, wie bspw. dem Cyclohexan, in einem Scheidetrichter, mit welchem die Fette aus dem Extrakt entfernt werden.
Mittels Zentrifugation und Filtration werden letzte kleine Partikel entfernt, welche nachfolgende Maschinen verstopfen könnten.
Nachdem ein sauberes Extrakt gewonnen wurde, kann die vorliegende Menge Psilocybin mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit einer vorherigen exakten Messung eines Laborstandards verglichen werden. Hierbei besteht die Schwierigkeit, dass Psilocybin als sehr polares Molekül sich nur schwer mit dem üblicherweise verwendeten Standard- C18-Säulenmaterial auftrennen lässt. Es bedarf einiger Optimierungen der Standardmethoden, um eine sinnvolle Auftrennung der unterschiedlichen Indolderivate zu erreichen. Dies ist notwendig, da für die Wirkstoffmengenberechnung stets durch Basislinien getrennte Einzelpeaks von Nöten sind. Momentan ist selbst die Verfügbarkeit von reinem Psilocybin stark eingeschränkt und nur sehr wenige Labore weltweit besitzen überhaupt einen internen Standard für die Ausführung solcher Messungen. In der Auswertung müssen daher verschiedenste Berechnungen inklusive des vermessenen Laborstandards ausgeführt werden, um auf die Menge der vorliegenden Inhalts Stoffe schließen zu können. Die zweite Möglichkeit, den Gehalt an Derivaten aus biologischen Proben zu erhalten, ist die gezielte Extraktion und Aufreinigung dieser Stoffe.
Dafür werden diverse Extraktions- und Aufreinigungs schritte miteinander kombiniert und die extrahierten Stoffe zu Analyse mittels mehrfacher Aufreinigung über unterschiedliche Säulen mittels HPLC und Umkristallisation zur finalen Aufreinigung und Bestätigung der Stoffreinheit über Kemspinresonanzspektroskopie vorbereitet.
Danach kann aus der definierten Menge, aus welcher extrahiert wurde, das erhaltene aufgereinigte Psilocybin abgewogen werden.
Bei dieser Methode kommt es jedoch zu sehr ungenauen Ergebnissen, da bei der Aufreinigung ein großer Teil des Psilocybins verloren geht. Dies ist der Eigenschaft der Psilocybin- Moleküle geschuldet, welche bei der Verwendung von hohem Druck und Temperaturen zerstört werden, oder in den einzelnen Aufreinigungsschritten Zurückbleiben.
Die nun folgenden Ausführungen zur möglichen Konzentrations bestimmung des Psilocybins sollen exemplarisch auch die momentan möglichen Methoden zur Bestimmung vieler ähnlicher Substanzen näher erläutern, welche alle ähnlich komplizierte Aufreinigungs- und Analysemethoden benötigen. Die Bestimmung der Konzentration anderer Indol- oder Pyrrolderivate oder Substanzen mit primären Aminen und ähnlichen Substanzen aus biologischen Proben setzen ebenso immer eine mehrstufige Extraktion voraus, die je nach Art der Probe angepasst wird. Es muss dabei immer ein sehr sauberes Extrakt erzeugt werden, um in der nachfolgenden Analyse keine Verunreinigungen an den verwendeten hochsensiblen Messgeräten zu erzeugen.
Die Analyse kann, wie beim Beispiel des Psilocybins, nicht nur mittels HPLC erfolgen, sondern auch unter dem Einsatz der
Gaschromatographie oder ähnlicher Verfahren. Alle diese Verfahren haben jedoch gemeinsam, dass Proben im Vorfeld zunächst an ein kompetentes Speziallabor mit den jeweiligen Genehmigungen verschickt werden, dort aufwändig extrahiert, analysiert und ausgewertet werden müssen, bevor eine Aussage zur Konzentration der enthaltenen Naturstoffe getroffen werden kann.
Das gesamte Aufbereitungs- und Analyseverfahren ist sehr zeitaufwändig und vor allem auch sehr kostenintensiv, weswegen es bisher zum Beispiel nur von Behörden bei der Analyse von
Drogenfunden angewendet wird. Es gibt praktisch keine Möglichkeit, außerhalb dieser Strukturen eine Konzentrationsbestimmung von bspw. Psilocybin in wild gefundenen Pilzen durchzuführen. Ein weiterer Nachteil besteht derzeit darin, dass es bisher keinen mobilen Schnelltest für die Konzentrationsbestimmung von Pyrrol-, Phenylethylamine- und Indolderivaten gibt.
Bisherige Tests lassen lediglich auf die Anwesenheit der Stoffe schließen, jedoch treffen sie keine Aussage zu den Konzentrationen jener Proben.
In biologischen Materialien zum Beispiel, schwankt die Konzentration von Pyrrol-, Phenylethylamine- und Indolderivaten stark. So kann zum Beispiel saisonal unterschiedlich viel Psilocybin in Pilzen gebildet werden und jede der über hundert Arten Konzentrationen zwischen 0,1 % bis 3 % erreicht. Somit besteht bei Verwechslung der spezifischen Spezies ein- und desselben Genus schnell die Gefahr der versehentlichen Überdosierung. Ein weiterer großer Nachteil der bisher verwendeten Verfahren stellt das Fehlen von Schnelltests zur akuten medizinischen Anwendung dar. Diese wären bspw. für Patienten, welche mit stark präsenten Verwirrtheitszuständen zur Behandlung eingeliefert werden, im Verdacht einer Pilzvergiftung oder Überdosierung zu stehen, sehr wünschenswert. Die rasche Analyse von Körperflüssigkeiten mittels eines Schnelltestes durch den behandelten Arzt könnte in diesem Fall sehr schnell eine Ursache für die beobachteten Symptome liefern, welche die Voraussetzung für eine notwendige gezielte und effektive Behandlung ermöglichtn. Denn gerade bei Patienten mit Überdosierungen von Naturstoffen dieser Art ist eine korrekte Behandlung für den späteren mentalen Gesundheitszustand immens wichtig, da eine fälschliche Versorgung durch Verkennen einer wirkstoffinduzierten psychotischen Episode die Symptome dieses Zustandes immens verschlimmern und dauerhafte psychotische Erkrankungen ermöglichen kann.
Ein Monitoring dieser Art mittels eines Schnelltestes würde auch bei Verkehrs- oder anderweitigen Kontrollen seitens des Staates rasch den Verdacht auf einen Konsum bewusstseins veränderter Substanzen bestätigen, und gestattet dank der Konzentrationsbestimmung ebenfalls Rückschlüsse auf aktuelle Einflüsse bei hohen Blutkonzentrationen oder über Dosierung und Zeitpunkt des Konsums unter Verwendung von Urinproben. Die aufgeführten Probleme treten ebenfalls im Bereich anderer Naturstoffe auf. So muss bei einem Kauf von LSD, welches üblicherweise auf ein kleines Stück Papier geträufelt wird, auf die Wirkstoffmengenangabe des Händlers vertraut werden, was ebenso schnell zu unerwünschten Überdosierungen und Nebenwirkungen führen kann. In vielen Fällen handelt sich nicht einmal um das eigentlich gewünschte und dementsprechend beworbene Molekül. Die gleiche Problematik tritt auch bei der Herstellung von N,N- Dimethyltryptamin (DMT)-haltigen Extrakten aus Pflanzen der Gattung Psychotria auf, deren Indolderivat mittels mehrstündigem Kochen aus den Blättern der Pflanze mit unbekannten Wirkstoffgehalt gewonnen werden.
DMT kann als Reinsubstanz konsumiert werden oder zusammen mit MAO-Inhibitoren wie den Harman-Alkaloiden (ebenso ein messbares Derivat) vermischt zu einem starken rituellen Gebräu namens Ayahuasca verarbeitet werden. Diesem Trunk haftet eine große kulturelle Bedeutung in vielen indigenen Kulturen des Amazonas-Gebietes an und die zeremonielle Anwendung des Gemischs erfreut sich besonders im letzten Jahrzehnt zunehmend an globaler Popularität. Hierbei bieten sogenannte Ayahuasca-Retreats durch Unternehmen wie etwa „Ayahuasca International“ weltweit Zeremonien an, welche jedoch weder die Standards der Betreuung und Umsorge der Personen erfüllen, welche die Zeremonie durchlaufen, noch eine Abschätzung des Wirkstoffgehalts der Mischung gewährleisten können. Daher wäre die Risikominderung durch eine exakte Mengenbestimmung des Wirkstoffs DMT durch einen Schnelltestkit essenziell, um das Risiko traumatisierender Erlebnisse durch ungenaue Dosierung von vornherein so weit wie möglich einzudämmen. Aktuelle Studien zeigen des Weiteren extrem vielversprechende Ergebnisse bei Anwendungen von Psilocybin durch Patienten mit existenziellen Krisen im Krebsendstadium, behandlungsresistenten Depressionen oder Suchtverhalten (Johnson und Griffiths 2017). Phase- 2-Studien, durchgeführt vom Johns-Hopkins-Universität und der New- York-Universität, zeigten Behandlungserfolge von 60-80% bei bislang behandlungsresistenten Depressionen und Angstzuständen bei Patienten (Sherwood und Prisinzano 2018). Diese Ergebnisse sind insofern nur exemplarisch, dass auch für andere bereits angesprochene Derivate bereits klinische Studien existieren, und diese Stoffe für den Einsatz innerhalb verschiedenster Therapiedomänen erprobt werden. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass es bisher noch keine Möglichkeit zur einfachen Bestimmung der Konzentrationen von Arylalkylamine-, Pyrrol-, Indol- und Opiatderivaten gibt, um extrem zeit- und kostenintensive Methoden, wie die exakte Laboranalyse, zu umgehen.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, die Nachteile des Standes der Technik zu vermeiden und ein Arylalkylamin-, Pyrrol-, Indol- und Opiatderivatkonzentrationsbestimmungsverfahren sowie einen Testkit zur Konzentrationsbestimmung dieser Substanzen anzugeben, welche einen schnellen, kosten- und aufwandgeringen quantitativen Nachweis von Indolderivaten, insbesondere von Psilocybin, sowie von Pyrrol- oder Arylalkylaminederivaten oder Opiatderivaten bereitstellen und dabei eine exakte Bestimmung von Anwesenheit und genauer Konzentrationen verschiedener Naturstoffe, wie bspw. dem Psilocybin, welche ein Indol als Strukturfragment besitzen, sowie ähnlich aufgebaute Stoffe mit primären oder sekundären Aminen oder Pyrrolverbindungen oder Opiaten im quantitativen Schnelltest ermöglichen. Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Verfahren gemäß dem ersten Patentanspruch sowie durch einen Kit gemäß dem siebenden Patentanspruch. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den nachgeordneten Ansprüchen angegeben. Das Wesen der Erfindung besteht darin, dass die mittlerweile mehr als hundert Jahre bekannte Farbreaktion gezielt für eine messbare quantitative und lineare Farbreaktion von Arylalklyamin-, Pyrrol-, Indolund Opiatderivaten in einem zweistufigen Verfahren zu deren Konzentrationsbestimmung eingesetzt wird.
Dieses zweistufige Konzentrationsbestimmungsverfahren beginnt mit einer definierten Extraktion der jeweiligen Derivate aus der Probe, welche sehr vielgestaltig sein kann und aus dem Stand der Technik vorbekannt ist. Anschließend wird das so gewonnene Extrakt in der zweiten Stufe des Verfahrens mittels kolorimetrischer Methoden einer quantitativen Konzentrationsbestimmung des jeweiligen Wirkstoffes unterzogen, wodurch exakte Angaben zum vorliegenden Wirkstoffgehalt ermöglicht werden.
Durch dieses einfache Verfahren wird eine schnellen Bestimmung des Gehaltes von relevanten Pyrrol-, Phenylethylamine- und Indolderivaten aus biologischen Materialien, wie bspw. Pilzen und Pflanzen, oder von synthetischen Produkten ermöglicht, was die Basis für einen Testkit für schnelle quantitative Tests ist.
Der bereitgestellte Testkit ermöglicht eine Konzentrationsbestimmung von Psilocybin, Psilocin, LSD, DMT und weitern Indolderivaten, primären aromatischen Aminen, insbesondere Tryptaminen, wie bspw.
NMT, 5-MeO-NMT, Dimethyltryptamin, 5-MeO-DMT, 5-Brom-DMT, Bufotenin, N-Methylserotonin, Serotonin, Psilocin, Psilocybin, Baeocystin, Norbaeocystin, Melatonin, Tryptophan, AMT, 5-MeO- AMT, AET, NET, DET, DiPT, DPT, DBT, 4-HO-MET, 4-HO-DET, 4- PO-DET, 4-HO-DIPT, 4-HO-MiPT, 5-MeO-DALT, 5-MeO-DiPT oder
Sumatriptan sowie Phenylethylaminen, wie bspw. Amphetamin, Methamphetamin, Ephedrin, Pseudoephedrin, Norephedrin, Norpseudoephedrin, Oxilofrin, N-Methylephedrin, N-Ethylamphetamin, PMA, PMMA, Methyl-MA, 2C-B, 2C-C, 2C-D, 2C-E, 2C-P, 2C-I, 2C- F, 2C-N, 2C-T-2, 2C-T-4, 2C-T-7, 2C-T-8, 2C-T-9, 2C-T-21, 2C-TFM, MDA, MDMA, MDEA, MDE, MMDA-3a, MMDA, Meskalin(M), IM oder TMPEA, Pyrrole und ähnlichen Substanzen mittels eines einzigen Testverfahrens, welches schnell, kosten- und aufwandgering ist. Aufgrund des simplen Ablaufs des Verfahrens und des einfachen Aufbaus des Testkits sowie der relativen Ungefährlichkeit der dabei verwendeten Chemikalien können selbst ungeübte Laien mittels einer exakten Anleitung den Wirkstoffgehalt von beispielsweise wild gefunden Pilzen oder aus einer unbekannten Quelle käuflich erworbenen Substanz bestimmen. So können medizinische Anwendbarkeit dieser Substanzen sowie der sichere Konsum dieser pharmazeutisch durchaus interessanten Substanzen gewährleistet, wichtige Erkenntnisse in der Akutbehandlung von Vergiftungen und Überdosierungen gewonnen oder aber strafrechtlich relevante Wirkstoffmengen seitens des Staates ermittelt werden.
Durch das simple Testverfahren kann der Testkit in großer Stückzahl für einen geringen Preis hergestellt werden, was den großflächigen Einsatz in der Szene des „Safer Drug Use“ innerhalb bereits bestehender Projekte zur Risikominimierung bei Drogenkonsum, für den späteren Einsatz in der Psychotherapie gegen Depressionen durch Psychologen oder Heilpraktiker oder letztendlich ebenso für privaten Gebrauch von Pilzsammlern oder Züchtern ermöglicht.
Die Erfindung wird nachfolgend an Hand der Ausführungbeispiele und der Figur näher erläutert, ohne auf diese beschränkt zu sein. Dabei zeigt:
Fig. 1: ein Diagramm der Absorptionsmessung (optische Dichte/ Wellenlänge) zur Bestimmung des Absorptionsmaximums von
Psilocybin,
Fig. 2: ein Diagramm der optischen Dichten einer Verdünnungsreihe eines Psilocybinstandards nach erfolgter Färbung mittels einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur
Konzentrationsbestimmung von Psilocybin,
Fig. 3: ein Diagramm der optischen Dichten der Verdünnungsreihe eines DMT-Standards nach erfolgter Färbung mittels einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur
Konzentrationsbestimmung von DMT,
Fig. 4: ein Diagramm der optischen Dichten der Verdünnungsreihe eines LSD-Standards nach erfolgter Färbung mittels einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur
Konzentrationsbestimmung von LSD und Fig. 5: ein Diagramm der optischen Dichten der Verdünnungsreihe eines Amphetamin-Standards nach erfolgter Färbung mittels einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Konzentrationsbestimmung von Amphetamin.
Das Testverfahren, welches die Grundlage für den Testkit darstellt, umfasst zwei Verfahrensschritte, um die Konzentration von Arylalkylamin-, Pyrrol-, Indol- und Opiatderivaten, insbesondere in Form von Psilocybin, DMT, Harmanalkaloiden und deren verwandten Derivaten, Carbazolen sowie weiteren Substanzen mit primären Aminen, Mutterkomalkaloiden oder Ergotamin als auch synthetisch hergestellten Lysergsäure-Derivaten wie Lysergsäurediethylamid (LSD), Arzneistoffen oder Substanzen mit ähnlicher Struktur messen zu können.
Das Testverfahren kann auch zum Nachweis von Substanzen herangezogen werden, bei welchen erst durch eine Reaktion wie bei der vorgelagerten Hydrolyse primäre aromatische Amine oder ähnliche Substanzen entstehen. Jene vielfältig aufgezählten Stoffe können ebenso divers in getrockneten Fruchtkörpem, Mycelien, Sklerotien oder sonstigen pflanzlichen oder tierischem Materialien, in Körperflüssigkeiten wie Urin oder Blut, in Nahrungsmitteln, Abwässern oder synthetischen Produkten jeglichen Ursprungs gefunden werden. Weiterhin dient das Testverfahren auch dazu, Konzentration von Bakterienkulturen oder anderen Organismen messen zu können, welche beispielsweise das Enzym Tryptophanase enthalten und einen Rückschluss auf die Konzentration und das Wachstum dieser Bakterien ermöglicht.
Für jedes Derivat wird das zweistufige Testverfahren zur Konzentrationsbestimmung individuell angepasst, wobei der jeweilige Testkit die benötigten Materialien und Anleitungen für die Extraktion und die anschließende Konzentrationsbestimmung enthält. Im ersten Verfahrens schritt erfolgt eine, dem jeweiligen Wirkstoff angepasste Extraktion oder die Aufnahme des Wirkstoffes in einer definierten Menge Wasser und/oder organischem Lösungsmittel, welches je nach Substanz eine wässrige saure Lösung oder die Verwendung eines alkoholischen Lösungsmittels oder anderen ähnlichen Lösungsmitteln erfordert. Dies geschieht gemäß dem vorbekannten Stand der Technik.
Im zweiten, nachfolgenden Verfahrens schritt wird eine definierte Menge Lösungsmittel mit dem enthaltenen Wirkstoff abgenommen und die Lärblösung hinzugegeben. Das jeweilig passende Lösungsmittel ist gemäß dem vorbekannten Stand der Technik auszuwählen.
Die Lärbelösung für dieses Verfahren umfasst u.a. bspw. das elektrophile 4-(N,N-Dimethylamino)benzaldehyd (abgekürzt: DMABA).
Lür die Konzentrationsbestimmung von Psilocybin enthält die Lärblösung bspw. das elektrophile 4-(N,N-Dimethylamino)benzaldehyd (DMABA) in einer salzsauren wässrigen Lösung für die Lärbung von Psilocybin.
Je nach Wirkstoff kann das DMABA auch in anderen Lösungsmitteln gelöst werden oder als Pulverform vorliegen, beziehungsweise noch weitere Zusätze, wie bspw. andere Säuren oder Lösungsmittel oder Metallione, wie bspw. Le3+, enthalten. Die Auswahl erfolgt dabei gemäß dem vorbekannten Stand der Technik.
In einer Reaktion des DMABA mit Indolverbindungen und den zuvor stehend aufgeführten Substanzen kommt es zu stark gefärbten Verbindungen, welche optisch erfasst und ausgewertet werden. Dabei erfolgt ein Vergleich der Messwerte gegenüber einer durch Kalibrierung erhaltenen Kurve von Messwerten, so dass durch diesen Vergleich eine quantitative Konzentrationsbestimmung anhand der Larbintensität der vorliegenden Testsubstanz erfolgt. Aufgrund der hohen Reaktivität des DMABA kann auch eine Färbung von Substanzen erreicht werden, welche keine Stickstoffverbindung besitzen. Wird der zweite Verfahrens schritt bei einer gegenüber der Umgebungstemperatur erhöhten Temperatur durchgeführt, was bspw. beim Psilocybins sinnvoll ist, verkürzt sich die erforderliche Reaktionszeit deutlich. Die benötigte Wärmezufuhr ist je nach Substanz unterschiedlich groß und kann in einem Ofen realisiert werden.
Die Färbelösung für dieses Verfahren umfasst 4-(N,N- Dimethylamino)benzaldehyd oder alternativ dazu die folgenden Reagenzien:
-Marquis Reagenz, (welche klassischerweise für den Nachweis von verschiedenen Alkaloiden, wie bspw. den Morphinen oder verschiedensten Phenylethylaminderivaten genutzt wird, und auf der Verwendung von Schwefelsäure sowie Formaldehyd basiert),
-Mecke Reagenz (welche ebenso Alkaloide wie LSD, Morphine und viele weitere Wirkstoffe färben),
-Zwikker Reagenz (welche für den quantitavien Nachweis von hauptsächlich Barbituraten und anderen Wirkstoffen verwendet wird), -Simon 's Reagenz (welche ebenso hauptsächlich für den Nachweis von Alkaloiden mit sekundären Aminen und weiteren genutzt wird und ebenso einen linearen Farbverlauf aufweist und in Kombination mit Mecke und Marquis zur Identifizierung von Alkaloiden dient)
-Mandelin Reagenz (welche hauptsächlich für den Nachweis von Ketamin und anderer Wirkstoffe dient),
- Liebermann Reagenz (welche ebenso klassische Alkaloide und andere Wirkstoffe nachweist. Wird üblicherweise für den Nachweis von Kokain und Morphin verwendet.),
- Fröhde Reagenz (welche üblicherweise für den Nachweis von Opiaten sowie anderen Wirkstoffen verwendet wird),
-Folins Reagenz (welche für die Unterscheidung von MDMA und verwandten Verbindungen verwendet wird), -Dille-Koppanyi Reagenz (welche hauptsächlich für den Nachweis von Barbituraten verwendet wird),
-Scott Reagenz (welche für den Nachweis von Kokain und anderen Wirkstoffen verwendet wird) und
-Duquenois-Levine Reagenz (welche zum Nachweis von Cannabinoiden verwendet wird).
Die zuvor stehend aufgeführten Reagenzien zeigten unterschiedliche Färbungen mit den quantitativ zu untersuchenden Substanzen, was eine gute Möglichkeit zum Unterscheiden der verschiedenen zu prüfenden Substanzen ermöglicht, wodurch auch Substanzgemische quantitativ untersucht werden können, um die verschiedenen Konzentrationen zu ermitteln, da sämtliche der aufgeführten Reagenzien einen linearen Verlauf der Konzentrationskurven bei der Absorptionsmessungen der Farbreaktionen aufweisen (beispielhaft in den Figuren 2 bis 5 gezeigt), so dass diese bereits seit langen bekannten Reagenzien auch für eine Bestimmung der Wirkstoffkonzentration mittels des Verfahrens für Indolalkaloide, Phenylethylamine und weiteren Verbindungen eingesetzt und für die kolorimetrische Bestimmung von Wirkstoffkonzentrationen für einen Einsatz in dem Testkits genutzt werden können.
Der beobachtete Farbumschlag beim Psilocybin/Psilocin lässt sich bspw. mit violett bis bläulich in höheren Konzentrationen beschreiben, wohingegen die Verfärbung von DMT sich bspw. von gelb bis grün in höheren Konzentrationen beobachten lässt. Die Farbe von LSD zusammen mit der Färbelösung lässt sich als bräunlich beschreiben. Je nach verwendeten Lösungsmitteln wie der Zugabe von Methanol kann die beobachtete Farbe variieren. Dargestellt ist das in den Figuren 6 und 7 (= den Fotos).
Die spezifischen optimalen Inkubationstemperaturen der einzelnen Reagenzien sind in den beiliegenden Anwenderinstruktionen der jeweiligen Testkits enthalten. Für einen mobilen Einsatz ist die Verwendung von Latentwärmespeichem oder die einfache Verwendung von Batterien bzw. Akkus für die Erzeugung der benötigten Wärme sowie weiteren möglichen Wärmequellen ratsam.
Möglich ist auch eine Kopplung der Nachweisreaktion an eine exotherme Reaktion, welche die benötigte Wärmezufuhr liefert oder die Verwendung von Metallionen, wie bspw. Fe3+- Ionen, zur Umgehung dessen.
Es zeigt sich überraschend, dass die Färbung im zweiten Reaktionsschritt einen linearen Bereich aufweist, innerhalb welchem eine exakte Bestimmung der Konzentration des Wirkstoffes (Pyrrol-, Phenylethylamine- und Indolderivate, Opiate, Cannabinoide) möglich ist.
Durch eine für jeden Wirkstoff spezifische Kalibrierung wird bei dem Verfahren der genaue Wirkstoffgehalt anhand eines Vergleichs der Farbintensitäten mit einem ermittelten Farbspektrum einer exakten Verdünnungsreihe und den dazugehörigen Wirkstoffgehalten verglichen und bestimmt.
Dieser optische Vergleich während des zweiten Verfahrens Schrittes erlaubt eine schnelle und direkte Konzentrationsbestimmung der untersuchten Probe. Die nötige Auswertung des Testresultats lässt sich dabei mit der Farbreaktion eines pH-Teststreifens und dem Ablesen des pH-Wertes an einer Farbskala vergleichen. Diese Auswertung des Testverfahrens zur Messung der Konzentration unterschiedlichster Stoffe kann allerdings auch mittels technischer Hilfsgeräte oder anderen Verfahren wie bspw. einer Spektralphotometer analyse vermessen werden, und erlaubt so eine noch exaktere Konzentrationsbestimmung bei Werten, welche genau zwischen 2 Farben in der Farbskala hegen.
Eine Verbesserung der reinen optischen Auswertung, die mit dem menschlichen Auge an Hand einer Farbskala möglich ist, erfolgt durch die Zuhilfenahme eines modernen Fotohandys (Smartphones) vermittels einer exakten Farbbestimmung durch die Kamera des Handys. Mittels einer APP (Anwendungssoftware) und Referenzwerten kann auf diese Weise sehr einfach eine exaktere Bestimmung der Konzentration, als mit dem menschlichen Auge, erfolgen.
Im Rahmen der Erfindung liegt auch ein kombiniertes Testsystem in einem geschlossenen Gefäß, Beutel oder anderen Kavitäten, welche bereits die benötigte Extraktionslösung sowie das benötigte Farbreagenz, wie bspw. DMABA) und ggf. weitere Stoffe oder Lösungen in einer separaten Ampulle oder andersartigen Kavitäten enthält. Durch die Hinzugabe der Testsubstanz und die Freigabe der Färbelösung kann nach erfolgter Inkubation ebenso eine Konzentrationsbestimmung erfolgen. Diese „Ein- oder Mehrmalkits“ sind vor allem für eine schnelle, unkomplizierte und mobile Konzentrationsbestimmung bei Behörden, in Krankenhäusern und vielen weiteren Anwendungsgebieten sehr interessant.
Der gesamte Testkit umfasst dabei die„Einmalkits“ als Einwegsystem oder die „Mehrmalkits“ als Mehrwegsystem sowie Anwender- Instruktionen, wobei die Handhabung des Testkits und die Angabe der wirkstoffspezifischen optimalen Inkubationstemperaturen in den beiliegenden Anwenderinstruktionen enthalten sind.
Dieser Testkit zur Konzentrationsbestimmung ermöglicht einen schnellen, kosten- und aufwandgeringen quantitativen Nachweis von Indolderivaten, insbesondere von Psilocybin, sowie von Pyrrol- oder Phenylethylaminederivaten, wobei eine exakte Bestimmung von Anwesenheit und genauer Konzentrationen verschiedener Naturstoffe, wie bspw. dem Psilocybin, welche ein Indol als Strukturfragment besitzen, sowie ähnlich aufgebaute Stoffe mit primären oder sekundären Aminen, Pyrrolverbindungen, Cannabinoiden, Opiaten oder Barbituraten im Schnelltest möglich ist. Ausführungsbeispiel 1
Es werden getrocknete Fruchtkörper von Pilzen der Gattung Psilocybe mittels Mörser, Mixer oder anderem zu einem feinem Pulver zerkleinert und eine definierte Menge von 1 g mittels einer Waage oder anderen geeigneten Messgeräten bereitgestellt.
Die Biomasse wird in einem geeigneten Gefäß wie einem 100 ml Probenbecher gegeben und mit der dazugelieferten 5 % Zitronensäure beträufelt und für kurze Zeit bei Raumtemperatur inkubiert
Im nachfolgenden Schritt wird der Probenbecher mit 50 ml destilliertem Wasser aufgefüllt und unter kräftigem Schütteln die Extraktion vollzogen.
Mittels der im Testkit ebenso beigelegten Spritze kann nun exakt ein Milliliter der Extraktionslösung, möglichst ohne Pilzliche Biomasse abgenommen werden.
Für eine noch exaktere Messung empfiehlt sich eine Filtration, welche zum Beispiel durch einen aufgesteckten Spritzenfilter erreicht werden kann, ist jedoch nicht zwingend erforderlich.
Im nachfolgen Schritt erfolgt die Inkubation mit 3 ml Nachweislösung in der eine definierte Menge von 40 mg/ml p-Dimethylaminobenzaldehyd (4-(CH3)2NC6H4CHO) in einer wässrigen salzsauren Lösung befindet. Dabei kommt es zu einer Reaktion mit dem p-Dimethylamino benzaldehyd und zu einer intensiv blau- violetten Verfärbung je nach verwendeten Zusätzen in der Färbelösung und der vorhandenen Konzentration der Inhaltsstoffe.
Wenn die Konzentration zu hoch gewählt wurde, kommt es zu einer blickdichten violett-schwärzlichen Farbe, die die Nachweisgrenze der Reaktion bestimmt, da keine optischen Unterschiede mehr zu erkennen sind. Hier muss den jeweiligen Anleitungen genau gefolgt werden, was die Menge an Extraktionslösung bereits an die zu erwartete Menge an Inhaltsstoffen einbezieht.
Sollte die Konzentration der nachzuweisenden Stoffe zu hoch sein, empfiehlt sich eine vorherige Verdünnung oder Verringerung der gewählten Extraktionslösung, mit einer Anpassung an die Verwendung der Menge der Nachweislösung. Dies geschieht Im Hinblick auf die nachfolgende Messung, welche nur in einem gewissen Bereich ihren linearen Bereich aufweist und in dem ein Farbumschlag optisch sichtbar ist. Die Farbumschlag verläuft bspw. bei der Reaktion von Psilocybin mit DMABA zu einem Triarylmethanfarbstoff gemäß dem folgenden Reaktionsschema:
Figure imgf000023_0001
Die Absorptionsmessung ist in der Fig. 1 dargestellt und zeigt eine maximale Absorption von 550 nm was mit der beobachteten Farbe übereinstimmt.
Ausführungsbeispiel 2
Von einem authentischen Psilocybin- Standard wird eine Verdünnungsreihe erstellt, welcher ebenso mit der bereits beschriebenen Färbelösung inkubiert, und bei der Wellenlänge von 550 nm gemessen wurde. Das Ergebnis der sehr linearen Farbreaktion ist in Fig. 2 gezeigt und stellt die Grundlage für eine quantitative Konzentrationsbestimmung dar. Verschiedene Verdünnungs stufen und deren beobachtete Farbverläufe dienen als Grundlage für eine kolorimetrische Bestimmung unbekannter Psilocybin Konzentrationen, wie im obigen Beispiel beschrieben. Mittels genauer Kalibrierung kann ein Vergleich der Farbverläufe die exakte Konzentration von Psilocybin und somit der Wirkstoffgehalt in den Pilzen bestimmt werden.
Ausführungsbeispiel 3
DMT wird von Konsumenten üblicherweise als helle kristalline oder pulverförmige Substanz erworben. Bei diesem handelt es sich meist um das Produkt einer einfachen Extraktion von DMT-haltigen Pflanzen wie Psychotria viridis. Um den tatsächlichen Wirkstoffgehalt des DMT in diesem Pulver zu bestimmen, werden 10 mg der Substanz abgewogen und mittels 1 ml saurem Wasser gelöst (4% HCl- Lösung in Aqua bidest). Durch Hinzugabe von 3 ml Färbelösung mit p- Dimethylaminobenzaldehyd in einer salzsauren wässrigen Lösung erfolgt die Farbreaktion bei einer Inkubation bei 50 Grad für 15 Minuten. Durch nachfolgende Messungen wurde die maximale Absorption der entstandenen Farbreaktion bei 472 nm ermittelt. Die erhaltenen Absorptionen können nun verglichen werden oder die entstandene Farbe kolorimetrisch mit den Färbungen einer authentischen Standardreihe verglichen werden. Diese stammt von einem Standard, von welchem eine Verdünnungsreihe erstellt und hinsichtlich eines linearen Farbverlaufs untersucht wurde. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 ersichtlich und zeigen ebenso einen linearen Farbverlauf für DMT, welcher die Grundlage für eine kolorimetrische Bestimmung der Konzentration bildet. Die gemessene Absorption oder der beobachtete Farbverlauf der Probe kann ebenso mittels der Ausgleichsgeraden und den bereits bekannten Konzentration zugeordnet werden.
Ausführungsbeispiel 4
Aufgrund der geringen Menge von LSD, welche für den Konsum verwendet wird, findet man die Substanz häufig auf saugfähiger Pappe (Blotter). Dieses kleine Pappstück wird in ein 1,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäß gegeben und es wird 0,5 ml reiner Ethanol hinzugegeben. Unter Schütteln wird die Extraktion des LSD vollzogen. Der Ethanol kann abgenommen werden und mit 1,5 ml Färbelösung, welche p-Dimethylaminobenzaldehyd in einer salzsauren wässrigen Lösung enthält, bei 50 Grad für 15 Minuten inkubiert werden. Die entstandene Färbung kann nun kolorimetrisch mit den Färbungen von bereits bekannten Wirkstoffmengen verglichen werden. Eine Verdünnungsreihe eines authentischen Standards und die anschließende Färbung der einzelnen Proben zeigen ebenso wieder einen linearen Farbverlauf bei ansteigenden Konzentrationen (siehe Fig. 4). Gemessen werden die Proben beim Maximum der Absorption bei 530 nm. Beachtlich ist die unglaublich hohe Sensitivität des Tests schon bei wenigen Microgramm LSD und beweist damit auch die Funktion der Konzentrationsbestimmung in der Gruppe der Mutterkornalkaloide.
Ausführungsbeispiel 5
Amphetamin wird von Verbrauchern üblicherweise als helle kristalline oder pulverförmige Substanz erworben. Um zu testen wieviel Wirkstoff in diesem Pulver vorhanden ist, werden 10 mg der Substanz abgenommen und mittels 1 ml Ethanol gelöst. Durch Hinzugabe von 3 ml Färbelösung mit p-Dimethylaminobenzaldehyd in einer salzsauren wässrigen Lösung erfolgt die Farbreaktion bei einer Inkubation bei 50 Grad für 15 Minuten. Durch eine nachfolgende Messung wurde die maximale Absorption bei 510 nm ermittelt. Der erhaltene Absorptionswert bei 510 nm oder die entstandene Farbe kann nun kolorimetrisch mit den Färbungen einer authentischen Standardreihe verglichen werden. Von dem Standard wurde im Voraus eine Verdünnungsreihe erstellt und hinsichtlich ihres linearen Farbverlaufs untersucht.
Die Ergebnisse sind in Fig. 5 ersichtlich und zeigen ebenso einen linearen Farbverlauf für Amphetamin, welches die Grundlage für eine kolorimetrische Bestimmung der Konzentration bildet. Die gemessene Absorption oder der beobachtete Farbverlauf der Probe kann ebenso mittels der Ausgleichsgeraden und den bereits bekannten Konzentration zugeordnet werden. Es ist ersichtlich, dass ebenso die Konzentration von Phenylethylaminderivaten wie Amphetamin und vielen weiteren nicht gezeigten Beispielen mit hoher Sensitivität und einfachen Methoden mittels kolorimetrischen Methodiken erfolgen kann. Das Verfahren und der Testkit ermöglichen die Messung der
Konzentration von Pyrrol und Indolderivaten, wie bspw. Psilocybin, N,N-Dimethyltryptamin (DMT), weiteren Wirkstoffen, wie bspw. 5- Methoxy-N,N-Dimethyltryptamin (5-MeO-DMT) und ähnlichen Indolalkaloiden, 5-MeO-DIPT, 5-MeO-MIPT , 5-MeO-AMT , 4-AcO- DMT, 2C-D, 2C-E, 2C-I, 2C-P und DXM, den Harman Alkaloiden und weitere Derivaten, Carbazole, Cannabinoide, Opiate und weiteren Substanzen mit primären oder sekundären Aminen, Mutterkomalkaloiden und Ergotamin sowie synthetisch hergestellten Lysergsäure-Derivate, wiebspw. Lysergsäurediethylamid (LSD), Arzneistoffe, sonstige halb oder vollsynthethische Produke oder
Substanzen mit ähnlicher Struktur. Jene Substanzen haben eine große Verbreitung und können in getrockneten Fruchtkörpern, Mycelien, Sklerotien oder sonstigen pflanzlichen oder tierischem Materialien, in Körperflüssigkeiten wie Urin oder anderen, in Nahrungsmitteln oder sonstigen Produkten synthetischen Ursprungs auftreten. Weiterhin kann die Nachweisreaktion ebenso verwendet werden, um die Konzentration von Bakterienkulturen oder ähnlichen messen zu können, welche zum Beispiel Tryptophanase enthalten. Verdünnungsreihen mit Marquis Reagenz haben ebenso einen linearen Farbverlauf gezeigt. Die Marquis Reagenz färbt DMT linear bräunlich/gelb. Dafür wurde 5ml konzentrierte Schwefelsäure mit 250m1 37% Formaldehyd versetzt. DMT und Psilocybin liegen in einer wässrigen 3,5 % HCL Lösung vor und wurden mit derselben Menge Marquis Reagenz versetzt. In der letzten Reihe wurde die 3fache Menge Reagenz verwendet welche dadurch eine stärkere Färbung zeigte. Generell kann zusammengefasst werden das viele Stoffe deren Konzentration mittels DMABA nachgewiesen werden kann ebenso mittels Marquis Reagenz bestimmt werden kann, in geringeren Konzentrationen der Nachweislösung können die Stoffe auch gut voneinander durch ihre Farbunterschiede charakterisiert werden. Der Marquis Test zeigt dabei ebenso lineare Farbverläufe gemessen bei 450 nm und kann somit zur kolorimetrischen Bestimmung herangezogen werden. Aufgrunddessen wurden ebenso weitere Farbtests wie Mecke, Simon, Liebermann, Folin, Zwikker Mandelin, Fröde und viele mehr auf ihre Linearität hin untersucht und bestätigt. Diese zusätzlichen Farbtests eignen sich ebenso zur Konzentrationsbestimmung von den angesprochenen Indolalkaloiden, Pyyrol und Phenylethylaminen sowie durch die Erweiterung des Farbtests auf andere Nachweis verfahren nun auch für den Nachweis von Opiaten sowie Cannabinoiden.
Das Verfahren und der Testkit dienen zum Nachweis von Substanzen, bei welchen erst durch eine vorgelagerte Hydrolyse primäre aromatische Amine oder ähnliche Substanzen entstehen, welche mit diesem Testverfahren nachgewiesen werden können. Die Bestimmung der Konzentration erfolgt durch eine einfache Farbreaktion, welche mittels kolorimetrischen rein optisch oder unter Zuhilfenahme von Messgeräten ausgewertet werden kann.
Die Anwendung eines mobilen Testkits für die zuvor stehend genannten Derivate kann erforderlichen Falles unter Wärmezufuhr erfolgen, welche mittels externer Wärmequelle eine Konzentrationsbestimmung unabhängig von Außentemperaturen oder zusätzlicher Stromquelle ermöglichen. Im Rahmen der Erfindung liegt auch, dass der Testkit an Stelle des geschlossenen Gefäßes, Beutels oder anderer Kavitäten in Form von Teststreifen mit einer aufgebrachten Farbreagenz ausgeführt ist, welche vorteilhaft 4-(N,N-Dimethylamino)benzaldehyd, Marquis Reagenz, Mecke Reagenz, Zwikker Reagenz, Simon 's Reagenz, Mandelin Reagenz, Liebermann Reagenz, Fröhde Reagenz, Folins Reagenz, Dille- Koppanyi Reagenz, Scott Reagenz oder Duquenois- Levine Reagenz ist, (wobei der Teststreifen gemäß dem Stand der Technik zur Fertigung von Teststreifen erhalten werden kann), die direkt in Flüssigkeiten getaucht werden können, woraufhin mittels der optisch auswertbaren Farbreaktion eine einfache und unkomplizierte Konzentrationsbestimmung gemäß dem Verfahren, insbesondere dem zweiten Schritt des Verfahrens erfolgt, verfügt der Anwender über ein sehr einfach handhabbares System, welches ähnlich dem Teststreifensystem zur pH-
Wertbestimmung gehandhabt wird. Die Bereitstellung eines Schnelltestkits zur einmaligen Anwendung, bei welchem das erforderliche Lösungsmittel bereits in einem Beutel oder ähnlichem Aufbewahrungsgegenstand enthalten ist, und in welches nachfolgend die jeweilige Probe hinzugegeben werden muss, ermöglicht die einfache Handhabung durch den Anwender, welcher sogar ein Laie sein kann.
Die Nachweislösung wird dabei manuell hinzugegeben oder befindet sich alternativ dazu bereits in einer zerbrechlichen Ampulle, oder einem ähnlichen Gefäß, in welche sich die Farbreagenz, vorzugsweise 4-(N,N- Dimethylaminojbenzaldehyd, Marquis Reagenz, Mecke Reagenz,
Zwikker Reagenz, Simon 's Reagenz, Mandelin Reagenz, Liebermann Reagenz, Fröhde Reagenz, Folins Reagenz, Dille- Koppanyi Reagenz, Scott Reagenz oder Duquenois- Levine Reagenz befindet, und setzt die Farbreaktion durch einfaches Hinzufügen oder Zerbrechen oder ähnlichem des Aufbewahrungsgefäßes frei.
Nach erfolgter Inkubation wird mittels optischer Auswertung durch kolorimetrische Methoden, welche an sich bekannt sind, die Anwesenheit und Konzentration der zuvor stehend genannten Stoffe bestimmt.
Das Verfahren und der Testkit zur genauen Konzentrationsbestimmung der zuvor stehend genannten Stoffe kann in einem Micro-Dosing Bereich zur Anwendung erfolgen, bspw. in Form eines Psilocybin- Microdosing- Kits, vermittels dessen die benötigte Dosis von 2-3 mg exakt auf die bspw. eingesetzte Pilzmenge hochrechnet werden kann, wobei die hergestellte Extraktionslösung bestehend aus Wasser und Zitronensäure unbedenklich eingesetzt werden kann, um eine gezielte Dosierung zu erreichen. Im erforderlichen Fall liegt es auch im Rahmen der Erfindung, eine externe Wärmequelle für eine Inkubation während des Verfahrens und bei der bestimmungsgemäßen Verwendung des Testkits einzusetzen. Das Verfahren und der Kit ermöglichen:
• die exakte Dosierung psycholytisch eingesetzter Indolalkaloide und weiterer Stoffe zur präzisen Anwendung in Therapie und Medizin,
• die Bestimmung von Anwesenheit und Menge psychoaktiver Indolalkaloide oder anderer Stoffe in wild gesammelten Pilzen und Pflanzen oder jeglichen anderen Materialien, um so gefährlichen Verwechslungen vorzubeugen,
• die exakte Bestimmung von Wirkstoffmengen im Körperflüssigkeiten und Geweben und anderen Materialien zur Einschätzung der Notwendigkeit medizinischer Intervention bei Überdosierungserscheinungen oder aber der Straffälligkeit von
Menschen und weiteren Anwendungen,
• die Messung von Wirkstoffmengen in Organismenkulturen, wie bspw. wie Kulturen von Bakterien, welche Tryptophanase enthalten,
• den Test von (illegal erworbenen) Substanzen auf Inhaltsstoffe und deren Konzentration in Kombination verschiedener Tests zur
Vermeidung von Vergiftungen, Überdosierungen oder unerwünschter Effekte, um bspw. auf PMP/PMMA-Konzentrationen in Ectasy- Pillen oder -Pulver zu testen,
• sowie die mobile Messung bei Feldversuchen o.Ä..
Die Bereitstellung des Einmaltestkits, welcher bereits die benötigten Lösungen in unterschiedlichen Kavitäten für das Verfahren bereits beinhaltet und bei dem lediglich die zu testende Substanz hinzugefügt werden muss, ermöglicht darüber hinaus eine sehr einfache, aufwandgeringe Handhabung, auch durch Nichtfachleute, wie Patienten und Endverbraucher.
Mögliche Einsatzgebiete des Verfahrens und des Testkits sind u.a. Dopinguntersuchungen, Fahruntüchtigkeitsuntersuchungen, Giftpilz- Selektionen sowie Stoff- und Umweltmonitoring. Das Verfahren und der Testkit kann auch zur quantitativen Analyse von unbekannten Straßendrogen in Tablettenform, wie bspw. Ecstasy, welche oft gefüllt oder gestreckt sind, eingesetzt werden. Aufgrund diverser Streck oder -Füllsubstanzen können weder illegale im Schwarzmarkt erhältliche noch legale industriell hergestellte Drogen in Tablettenform mittels gängiger kolorimetrischer Methoden nachgewiesen werden, da bspw. enthaltene Zucker oder Stärke (gängige Füllstoffe) mit den Nachweisreagenzien oder Bestandteilen dieser zu stark gefärbten Verbindungen reagieren und somit die Färbung des eigentlichen Wirkstoffes überdecken.
Die angesprochenen Füllstoffe Zucker und Stärke reagieren beispielsweise mit der Schwefelsäure der Nachweisreagenz zu einer braunen Farbe und die eigentliche lila Färbung von MDMA wird dabei durch die braune Farbe überdeckt. Dies lässt sich experimentell, wie folgt dargestellt, leicht zeigen:
0.05 mg MDMA in 100 pl wässriger Lösung färbt sich durch die Zugabe von 200 pl einer Mischung aus 20: 1 konzentrierter 97 % Schwefelsäure und 40 % Formaldehyd zu einer kräftigen Lila Farbe. Alleine bei einer Zugabe von bereits der 0.10 mg Stärke färbt sich die Mischung bei Behandlung mit der angesprochenen Nachweisreagenz zu einem Braunton und verdeckt so die eigentlich gewollte Farbreaktion und macht ein Auswerten unmöglich.
Zur Umgehung dieser Problematik wird das quantitative Nachweisverfahren für Stoffe wie bspw. MDMA, aus der Gruppe der Phenylethylamine, (Tropanalkaloide oder Opiate sind in den seltensten Fällen bei illegalen Rauschmitteln als Reinstoff vorliegend), welche oftmals gefüllt oder gestreckt, eingesetzt. Dabei erfolgt, zusätzlich zum quantitativen Nachweis des gewünschten Wirkstoffes, das Entfernen unerwünschter Streck oder Füllstoffe, welche ein Auswerten der
Farbreaktion unmöglich machen.
Zusätzlich zu den Füllstoffen liegt oftmals noch eine Mischung mit anderen Wirkstoffen vor, welche mitunter tödliche Auswirkungen auf den Konsumenten bei einer Falsch Dosierung haben kann. Auch dahingehend schafft das Nachweis verfahren Abhilfe durch die Verwendung von unterschiedlichen Nachweisreagenzien abgestimmt auf die zu erwartenden Streckstoffe, wie folgt beispielhaft gezeigt wird.
Der mögliche Fall einer tödlichen Beimischung liegt bspw. bei der Substanz PMMA (para-Methoxy-N-methylamphetamine) in MDMA (3,4-Methylendioxy-N-methylamphetamin), auch bekannt als Ecstasy, vor.
Das Verfahren ermöglicht in kürzester Zeit die Entfernung unerwünschte Füllstoffe und die Konzentrationsbestimmung unterschiedlicher Wirkstoffe für eine große Bandbreite an Wirkstoffen mit einem Set an Farbreagenzien ohne eine Verwendung bspw. von teuren und nur sehr spezifischen Antikörpern. Erstmalig können damit auch ohne die Verwendung einer Dünnschichtchromatografie sehr einfach und ohne Fachwissen Wirkstoffgehalte auch von Mischungen quantitativ analysiert werden.
Je nach erwartetem Wirkstoff werden unterschiedliche Farbreagenzien für diese Anwendung kombiniert welche ebenso sämtliche bisher verwendete Streckstoffe abdecken. Beispielhaft für zb. die
Phenylethylamine im folgenden Beispiel die Detektion von gängigen Streckstoffen wie Amphetamin oder 2C-B mittels einer zweiten Färbung speziell für diese Stoffe gezeigt. Für die Detektion von Opiaten und Tropanalkaloiden und deren enthaltene Streckstoffe wird ebenso eine Kombination aus mehreren Farbreagenzien verwendet und ermöglicht das Detektieren von bspw. Fentanyl in Heroin. Gleich bleibt bei diesen Wirkstoffen aber ebenso die notwendige Entfernung von Füllstoffen vor der eigentlichen Färbung des erwartenden Wirkstoffes, und die Ermöglichung dieses durch eine Entfernung dieser vor der eigentlichen Färbung mittels der Mischung der Farbreagenz 1 : 1 mit Chloroform. Die eigentliche Färbung wird von dieser Behandlung nicht beeinflusst. Ausführungsbeispiel 6
Quantitativer Nachweis von möglicherweise gestrecktem Phenylethylanin, wie bspw. MDMA (auch Ecstasy genannt) in Tablettenform Für den Test werden 10 mg Pulver einer unbekannten Tablette, welche mit Füllstoffen gestreckt ist, mit einem Messer abgekratzt und mit einer Feinwaage exakt abgewogen.
Für die Bestimmung der vorliegenden Wirkstoffe werden zwei Nachweislösungen hergestellt.
Für die erste Nachweislösung wird in einem 1,5 ml Glasgefäß mit Schraubdeckel 400 mΐ Chloroform gegeben. Hinzu kommen 10 mΐ Formaldehyd sowie 390 mΐ konzentrierte 97 % Schwefelsäure.
Die abgewogene Substanz wird zu 5 ml 5%iger Zitronensäure in einem verschließbaren Gefäß gegeben und durch kurzes Schütteln gelöst.
Von dieser Lösung werden 20 mΐ (ca, 1 Tropfen) in die erste Nachweislösung gegeben und die entstandene Farbe in der unteren gefärbten Phase mittels vorliegendem Vergleichsfarben verglichen. Alternativ kann, wie bei den anderen Ausführungsbeispielen, mittels Spektralphotometer oder APP die Farbe ausgewertet werden und mittels einer Eichgerade ein direkter Rückschluss auf die vorliegende Konzentration geschlossen werden.
Unerwünschte Füllstoffe, welche die Färbung beeinflussen könnten, befinden sich in der klaren ungefärbten Phase und behindern dadurch nicht den Nachweis von MDMA, so dass sich eine klare lila Färbung bei dem Test zeigt und die Konzentration des Wirkstoffes durch diese Färbung bestimmt werden kann.
Um unerwünschte Streckstoffe in der MDMA-Tablette zu detektieren, wird von der bereits abgewogenen und gelösten Substanz ein weiterer Tropfen zu 100 mΐ zu einer "Negativfärbung" in die zweite Nachweislösung gegeben, welche 1 g Natriumnitroprussid und 2 ml Acetone in 50 ml dest. Wasser enthält, wobei nach erfolgter Mischung diese gesamte Flüssigkeit in ein Glasvial gegeben, welches 300 mΐ Chloroform sowie 200 mΐ einer 2 %igen Natriumcarbonatlösung enthält. Bei dieser Färbung ist MDMA nur ganz schwach leicht rosa gefärbt wo hingegen Streckstoffe, wie bpsw. Amphetamin, eine intensive Färbung aufweisen. Es zeigt sich dadurch eine kräftige orange Färbung, welche die Anwesenheit von Amphetamin (umgangssprachlich Speed) anzeigt. Durch die Stärke dieser Färbung kann ebenso ermittelt werden, wieviel Streckstoff in dieser Probe vorliegt, was dem Anwender erstmalig „überlebenswichtige“ Informationen zum Inhalt seiner Probe liefert. Mittels der Farbe können nun Streckstoffe identifiziert und anhand der Intensität der entstandenen Färbung kann ebenso die Konzentration dieser Streckstoffe bestimmt werden. Mit den vorliegenden Informationen können gefährliche Überdosierungen mit unerwünschten Mischproben verhindert werden, welche beispielsweise bedeutend potenter als MDMA sein können und standardmäßig in illegalen Schwarzmarkt Drogen ohne das Wissen der späteren Konsumenten beigesetzt werden.
Dieses Anwendungsbeispiel verdeutlicht die erstmalige Möglichkeit Substanzen, welche in irgendeiner Form gestreckt oder vermischt sind, nicht nur erstmalig mittels Kolorimetrie zu detektieren sondern sogar deren Konzentration zu bestimmen.
Das Verfahren kann unerwünschte Füllstoffe, wie bspw. Zucker und Stärke, entfernen und gleichzeitig auf unterschiedliche Wirkstoffe und deren Konzentration testen.
Anwendungsbeispiel 7
Quantitativer Nachweis von möglicherweise gestreckten Indolalkaloiden wie DMT, Psilocybin, oder weiteren in Pulverform vorliegenden Substanzen (DMT wird von Konsumenten gängigerweise in Pulverform geraucht und dafür aus bspw. Blättern der Pflanze Psychotria viridis extrahiert).
Für den Nachweis von diversen Indolalkaloiden werden 20 mg der vorliegenden pulverförmigen Substanz abgewogen, und in einem Gefäß mit 5 ml einer 5 %igen wässrigen Zitronensäurelösung durch Schütteln gelöst. Es können sogar Fruchtkörper der Psilocybe Pilze verwendet werden, allerdings muss im nachfolgenden Schritt die Biomasse wieder mittels bspw, eines Sterilfilters entfernt werden, bevor die Lösung in die Nachweislösung gegeben werden kann.
Von der sauren Extraktionslösung werden 100 mΐ abgenommen und zu der Nachweislösung in einem zweiten Gefäß gegeben. 50 ml dieser Nachweis Lösung enthält 96 % konzentrierte Schwefelsäure mit 0.1 g para-Dimethylaminobenzaldehyde und 0.1 g Eisen(III)-chlorid Hexahydrat.
Für den Nachweis werden in einem Gefäß 200 mΐ dieser Lösung ähnlichen Nachweislösung mit 300 mΐ Chloroform vermischt und hinzu kommen 100 mΐ der sauren Lösung mit dem gelösten Indolalkaloid.
Der Ansatz wird mehrfach geschüttelt und man sieht zwei Phasen, wovon eine klar ist und die andere je nach enthaltenem Wirkstoff gefärbt ist.
Psilocybin erscheint als braune Färbung und DMT als gelbliche Färbung. Möglich ist auch die Identifizierung von völlig anderen Wirkstoffen wie bspw.. synthetischen Varianten, welche sofort durch eine veränderte Farbgebung auffallen.
Mögliche Streck und Füllstoffe, wie in diesem Fall der Indolalkaloide, welche aus Naturstoffen extrahiert werden, sind meist noch Aufreinigungsrückstände vorhanden, welche sich in der klaren ungefärbten Chloroform Schicht sammeln und die Färbung in der wässrigen sauren Phase so nicht beeinflussen.
Auch werden gängige Streckstoffe, welche den Extrakten aus Profitgründen beigemischt werden, wie unterschiedlichste Zucker, ebenso entfernt und können so nicht die Färbung des eigentlichen Wirkstoffes beeinflussen oder überdecken und ermöglichen die tatsächliche Analyse der vorliegenden Wirkstoffkonzentration
Anwendungsbeispiel 8
Quantitativer Nachweis von Tropanalkaloiden, wie bspw. Kokain in Pulverform.
Für den Nachweis von Tropanalkaloiden, wie bspw. Kokain, werden 20 mg der vorliegenden pulverförmigen Substanz abgewogen und in einem Gefäß mit 5 ml destilliertem Wasser durch Schütteln gelöst. Von dieser Lösung werden 100 mΐ abgenommen und zu der verbesserten Nachweislösung in einem zweiten Gefäß gegeben. 50 ml dieser Nachweislösung enthält 1: 1 5 g Kaliumnitrit in konzentrierter 97% Schwefelsäure und 99 % Chloroform. Von der Nachweislösung liegen 500 mΐ in einem Gefäß vor zu welchem die 100 mΐ auf genommene Kokainlösung hinzugegeben wird. Es entstehen wieder zwei Phasen, von denen eine angefärbtes Kokain enthält und eine Phase in der sich mögliche Füllstoffe befinden. Der Wirkstoffgehalt von Kokain kann durch die Intensität der entstandenen gelben Färbung in der gefärbten unteren Phase abgelesen werden (Durch die bereits beschriebenen Möglichkeiten zur Auswertung). Eine zweite Nachweislösung ist die Verwendung von Cobalt(II)-thiocyanat. Die abgewogene Substanz wird in dest. Wasser gelöst welche durch das enthaltene Cobalt(II)-thiocyanat sich bei Anwesenheit von Kokain blau färbt. Werden IOOmI der Lösung nun zu einem zweiten Gefäß mit 1: 1 10% salzsaurer wässriger Lösung und Chloroform gegeben, dann entsteht eine rosa Färbung mit einer blauen Phase im oberen Bereich dieser. Da Kokain eigentlich fast immer in gestreckter Form vorliegt, ist eine Aufreinigung der unerwünschten Füllstoffe zur Quantifizierung der Kokain Konzentration notwendig. Sollten dem Kokain Streckstoffe wie Levamisol zugesetzt sein, fallen diese sofort in der ersten Färbemethode durch eine entstandene Orange Färbung der gefärbten Phase auf und lassen sich ebenso durch die Intensität der Färbung mittels der beschriebenen Auswertemethoden quantifizieren.
Anwendungsbeispiel 9
Quantitativer Nachweis von Opiaten, wie bspw. Heroin, Morphin und tödlichen Streckmitteln wie Fentanyl
Für den Nachweis von Opiaten wie Heroin, Morphin oder Fentanyl werden 20 mg der vorliegenden Substanz abgewogen, und in einem Gefäß mit 5 ml destilliertem Wasser durch Schütteln gelöst.
Von dieser Lösung werden 100 mΐ abgenommen und zu der Nachweislösung in einem zweiten Gefäß gegeben.
50 ml dieser Nachweislösung enthält 4: 1:5 (62% HN03: H20 : CHC13).
Von der Nachweislösung liegen 500 mΐ in einen Gefäß vor zu welchem 100 mΐ der aufgenommenen Opiatlösung hinzugegeben wird. Es entstehen wieder zwei Phasen, von denen eine den angefärbten Wirkstoff enthält und eine klare Phase, in der sich mögliche Füllstoffe befinden. Der Wirkstoffgehalt bspw. von Heroin kann durch die Intensität der entstandenen gelben Färbung in der gefärbten unteren Phase abgelesen werden (Mithilfe der bereits beschriebenen Möglichkeiten zur Auswertung).
Enthält die Probe Morphin, färbt sich der Test rötlich.
Da in Heroin jedoch noch weitere Streckstoffe vorliegen, können die der gelblichen Färbung von Heroin ähneln kann noch ein zweiter Nachweis durchgeführt werden. Ein aktuelles Beispiel ist das Streckmittel Fentanyl, ein synthetischen Opiat, welches schon bei einer Dosis von wenigen Milligramm tödlich wirkt.
Dafür kann die bereits angefertigte Heroinlösung zu einer zweiten Nachweislösung gegeben werden. Für diese wird in einem 1,5 ml Glasgefäß mit Schraubdeckel 400 mΐ Chloroform gegeben. Hinzu kommen 10 mΐ Formaldehyd sowie 390 mΐ konzentrierte 96 % Schwefelsäure.
Von dieser Opiatlösung Lösung werden 100 mΐ in die zweite Nachweislösung gegeben und die entstandene Farbe in der unteren gefärbten Phase mittels vorliegendem Vergleichsfarben verglichen. Fentanyl kann sofort durch eine orange Färbung vom hellem Gelb des Heroins oder der roten Färbung durch Morphine unterschieden werden. Da Heroin eigentlich fast immer in gestreckter Form vorliegt, ist eine Aufreinigung der unerwünschten Füllstoffe zur Quantifizierung des Heroins notwendig. Sollten dem Heroin Streckstoffe, wie Fentanyl, zugesetzt sein, fallen diese in einer zweiten Färbung auf, und lassen sich ebenso durch die Intensität der Färbung mittels der beschriebenen Auswertemethoden quantifizieren.
Durch eine Verwendung dieser Nachweismethode könnten viele Tote durch den ungewollten Konsum von Fentanyl in Heroin vermieden werden. Alle in der Beschreibung, den Ausführungsbeispielen und den nachfolgenden Ansprüchen dargestellten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination miteinander erfindungswesentlich sein. Abkürzungen
Tryptamin 2-(Indol-3-yl)-ethylamin
NMT N -Methyltryptamin
5-MeO-NMT 5 -Methoxy-N-methyltryptamin
Dimethyltryptamin N,N-Dimethyltryptamin
5-MeO-DMT 5-Methoxy-N,N-dimethyltryptamin
5-Brom-DMT 5-Brom-N,N-dimethyltryptamin
Bufotenin 5-Hydroxy-N,N-dimethyltryptamin
N-Methylserotonin 5 -Hydroxy-N -methyltryptamin
Serotonin 5 -Hydroxy tryptamin
Psilocin 4-Hydroxy-N,N-dimethyltryptamin
Psilocybin 4-Phosphoryloxy-N,N-dimethyltryptamin
Baeocystin 4-Phosphoryloxy-N-methyltryptamin
Norbaeocystin 4-Phosphoryloxytryptamin
Melatonin 5 -Methoxy-N - acetyltryptamin
Tryptophan a-Carboxy-tryptamin
5-MeO-AMT 5 -Methoxy- a-methyltryp tamin
AET a-Ethyltryptamin
NET N -Ethyltryp tamin
DET N,N-Diethyltryptamin
DiPT N,N-Diisopropyltryptamin
DPT N,N-Dipropyltryptamin
DBT N,N-Dibutyltryptamin
4-HO-MET 4-Hydroxy-N-methyl-N-ethyltryptamin
4-HO-DET 4-Hydroxy-N,N-diethyltryptamin
4-PO-DET 4-Phosphoryloxy-N,N- diethyltryptamin
4-HO-DIPT 4-Hydroxy-N,N-diisopropyltryptamin
4-HO-MiPT 4-Hydroxy-N-isopropyl-N-methyltryptamin
5-MeO-DALT 5-Methoxy-N,N-diallyltryp tamin
5-MeO-DiPT 5-Methoxy-N,N-diisopropyltryptamin
Sumatriptan 5-Methylaminosulfonyl-N,N-dimethyltryptamin Methamphetamin N-Methylamphetamin
Oxilofrin 4-Hydroxyephedrin
PMA 4-Methoxyamphetamin
PMMA, Methyl-MA 4-Methoxy-N-methylamphetamin
2C-B 2.5-Dimethoxy-4-bromphenethylamin
2C-C 2.5-Dimethoxy-4-chlorphenethylamin
2C-D 2.5-Dimethoxy-4-methylphenylethylamin
2C-E 2.5-Dimethoxy-4-ethylphenylethylamin
2C-P 2.5-Dimethoxy-4-propylphenethylamin
2C-I 2.5-Dimethoxy-4-iodphenethylamin
2C-F 2.5-Dimethoxy-4-fluorphenethylamin
2C-N 2.5-Dimethoxy-4-nitrophenethylamin
2C-T-2 2.5-Dimethoxy-4-ethylthiophenylethylamin 2C-T-4 2.5-Dimethoxy-4-(iso)-propylthiophenylethylamin 2C-T-7 2.5-Dimethoxy-4-(n)-propylthiophenylethylamin
2C-T-8 2.5-Dimethoxy-4-cyclopropylmethyl- thiophenylethylamin
2C-T-9 2.5-Dimethoxy-4-butylthiophenylethylamin 2C-T-21 2.5-Dimethoxy-4-(2-fluorethylthio)phenylethylamin 2C-TFM 2.5-Dimethoxy-4-trifluormethylphenethylamin
MDA 3.4-Methylendioxyamphetamin
MDMA 3.4-Methylendioxy-N-methylamphetamin
MDEA, MDE 3.4-Methylendioxy-N-ethylamphetamin
MMDA-3a 2-Methoxy-3,4-methylendioxyamphetamin
MMDA 3-Methoxy-4,5-methylendioxyamphetamin
Meskalin (M) 3.4.5-Trimethoxyphenylethylamin
IM 2.3.4-Trimethoxyphenylethylamin
TMPEA 2.4.5-Trimethoxyphenylethylamin

Claims

Patentansprüche
1. Arylalkylamin-, Pyrrol-, Indol- und Opiatderivatkonzentrations- bestimmungsverfahren umfassend zwei Verfahrensschritte in Form eines Extraktionsschrittes und eines nachfolgenden Analyseschrittes unter Verwendung mindestens einer Farbreagenz, dadurch gekennzeichnet, dass beim Analyseschritt die mindestens eine Farbreagenz mit mindestens einem Arylalkylamin-, Pyrrol-, Indol- oder Opiatderivat eine mittels kolorimetrischer Methoden messbare quantitative und lineare Farbreaktion hervorruft, welche erfasst und ausgewertet wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Farbreagenz 4-(N,N-Dimethylamino)benzaldehyd, Marquis Reagenz,
Mecke Reagenz, Zwikker Reagenz, Simon' s Reagenz, Mandelin Reagenz, Liebermann Reagenz, Fröhde Reagenz, Folins Reagenz, Dille- Koppanyi Reagenz, Scott Reagenz oder Duquenois- Levine Reagenz ist.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Farbreaktion über eine Inkubationszeit verläuft, die Farbreaktion optisch erfasst wird und die Farbwerte zur Auswertung mit Referenzwerten verglichen werden.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenzwerte eine kalibrierte Eichlösung, einer Farbskala oder eine Sammlung von Einzelmesswerten sind.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass während der verlaufenden Inkubationszeit die Temperatur gegenüber der Umgebungstemperatur erhöht ist.
6. Verwendung des Verfahrens gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 1 bis 5 zur schnellen Bestimmung des Gehaltes von als Wirkstoff relevanten Pyrrol-, Phenylethylamin- oder Indolderivaten aus biologischen Materialien oder in synthetischen Produkten.
7. Testkit für eine schnelle Konzentrationsbestimmung von Psilocybin, Psilocin, LSD, DMT und weitem Indolderivaten, primären und sekundären aromatischen Aminen, Opiaten und mit diesen Wirkstoffen ähnlichen Substanzen mittels des Verfahrens gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 1 bis 5 umfassend:
• ein geschlossenes Gefäß, Beutel oder anderen Kavitäten in Form eines Ein- oder Mehrmalkits, welcher die benötigte Extraktionslösung sowie das benötigte Farbreagenz und weitere
Stoffe oder Lösungen in einer separaten Ampulle oder andersartigen Kavitäten enthält, wobei in dem Testkit durch die Hinzugabe der Testsubstanz, die Freigabe der Farbreagenz und der anschließenden Inkubation eine Konzentrationsbestimmung erfolgt, und
• eine Anleitung für die Extraktion und die anschließende
Konzentrationsbestimmung.
8. Testkit für eine schnelle Konzentrationsbestimmung von Psilocybin, Psilocin, LSD, DMT und weitern Indolderivaten, primären und sekundären aromatischen Aminen, Opiaten und mit diesen Wirkstoffen ähnlichen Substanzen mittels des Verfahrens gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 1 bis 5 umfassend:
• eine Vielzahl von Farbreagenz enthaltender Testtreifen, wobei auf den Teststreifen durch die Hinzugabe der Testsubstanz, die
Reaktion mit der Farbreagenz und der anschließenden Inkubation eine Konzentrationsbestimmung erfolgt, und
• eine Anleitung für die Extraktion und die anschließende
Konzentrationsbestimmung.
9. Verwendung eines Verfahrens gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 1 bis 5 und / oder eines Testkits gemäß Anspruch 7 oder 8 zur schnellen Bestimmung des Gehaltes von als Wirkstoff relevanten Phenylethylaminen, Indolalkaloiden, Tropanalkaloide, Opiaten, bei dem für den Analyseschritt einer Extraktionslösung eine Analyselösung hinzugefügt wird, diese Lösungen vermischt werden und anschließend zwei Phasen entstehen, wobei für die Analyselösung mindestens eine Farbreagenz eingesetzt wird und der Wirkstoff in der gefärbten Phase einer Konzentrationsbestimmung unterzogen wird.
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