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WO2021084760A1 - 皮膚での活性型ｐａｒ－２を指標とした皮膚状態評価方法、ｐａｒ－２活性化促進剤又は抑制剤のスクリーニング方法及びｐａｒ－２活性化抑制剤 - Google Patents

皮膚での活性型ｐａｒ－２を指標とした皮膚状態評価方法、ｐａｒ－２活性化促進剤又は抑制剤のスクリーニング方法及びｐａｒ－２活性化抑制剤 Download PDF

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WO2021084760A1
WO2021084760A1 PCT/JP2019/043162 JP2019043162W WO2021084760A1 WO 2021084760 A1 WO2021084760 A1 WO 2021084760A1 JP 2019043162 W JP2019043162 W JP 2019043162W WO 2021084760 A1 WO2021084760 A1 WO 2021084760A1
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WO
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par
active
antibody
activation
skin
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PCT/JP2019/043162
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French (fr)
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澄美子 傳田
傳田　光洋
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Shiseido Co Ltd
Original Assignee
Shiseido Co Ltd
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Publication date
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Priority to PCT/JP2019/043162 priority patent/WO2021084760A1/ja
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    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/164—Amides, e.g. hydroxamic acids of a carboxylic acid with an aminoalcohol, e.g. ceramides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G—PHYSICS
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the present invention relates to a skin condition evaluation method using active PAR-2 on the skin as an index, and a method for screening a PAR-2 activator or inhibitor using PAR-2 activity as an index. Furthermore, it also relates to a PAR-2 activation inhibitor selected by the screening method according to the present invention.
  • Protease-activated receptor is a type of G protein-conjugated 7-transmembrane receptor that is activated by a specific protease.
  • PAR-1, 3 and 4 are thrombin receptors, while PAR-2 is not activated on thrombin.
  • PAR-2 is known to be activated by trypsin, tryptase, factor VIIa, factor Xa and the like.
  • PAR-2 is activated by cleaving the N-terminal partial peptide of PAR-2 with these proteases to generate a new N-terminal, and the peptide containing this new N-terminal acts as a ligand.
  • PAR-2 is widely distributed in endothelial tissues, and is known to be highly expressed in digestive organs, circulatory organs, respiratory organs, nerves, skin and the like.
  • PAR-2 Protease Activated Receptor-22 of epidermal keratinocytes is involved in the pathophysiology of atopy and psoriasis, and the homeostasis, itchiness, and inflammation of the skin barrier.
  • IP3 inositol trisphosphate
  • NF- ⁇ B Nuclear Factor-kappa B
  • TSLP Thymic Stromal Lymphopoietin
  • Elevated extracellular calcium in the stratum granulosum of the epidermis suppresses the release of lamellar granules and delays barrier recovery.
  • Inflammatory cytokines such as TSLP are thought to stimulate sensory nerves in the skin and cause itching.
  • Patent Document 1 Patent No. 4728248, Patent Document.
  • Patent Document 2 Special Table 2012-591735
  • Patent Document 3 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-170323.
  • Conventional screening methods for PAR-2 inhibitors use cultured cells expressing PAR-2 to measure intracellular reactions that occur after PAR-2 activation, such as changes in calcium concentration and the amount of cytokines released. However, it was used as an index.
  • PAR-2 activation can be evaluated based on the cleavage state of PAR-2 by using an antibody that detects cleavage of the N-terminal of PAR-2 protein. I found it possible. By using an antibody, it is possible to clarify the site where PAR-2 activation occurs in the epidermis, and by focusing on such a site, a PAR-2 activation inhibitor or a PAR-2 activation promoter is screened. He came to invent the method. Furthermore, by using the screening method, a new PAR-2 activation inhibitor was found. Therefore, the present invention relates to the following:
  • a method for evaluating an epidermal state which comprises detecting active PAR-2 in the epidermis in a skin sample using an anti-active PAR-2 antibody that binds to the N-terminal antigen peptide of active PAR-2.
  • the anti-active PAR-2 antibody binds to active PAR-2 cleaved at a protease cleavage site present in the extracellular N-terminal region, the protease-cleaving site present in the extracellular N-terminal region.
  • the evaluation method according to item 2 wherein the inactive PAR-2 contains an N-terminal amino acid at positions 26 to 36 of SEQ ID NO: 1.
  • the evaluation method according to any one of items 1 to 4 wherein when the detected amount of the active PAR-2 is high, the epidermis is evaluated to be in a rough state.
  • the evaluation of a rough epidermis is to determine at least one epidermis condition selected from the group consisting of an inflammatory condition, rough skin, decreased barrier function, itching, redness, and dryness, according to item 5. Evaluation method.
  • the detection of activated PAR-2 is as follows: The step of contacting the skin sample with the anti-active PAR-2 antibody, The evaluation method according to any one of items 1 to 6, which comprises a step of bringing a labeled secondary antibody into contact with a skin sample and a step of determining the detection intensity of the label in the skin sample. [8] A step of applying a candidate substance in a skin sample, A step of detecting active PAR-2 with an anti-active PAR-2 antibody that binds to the N-terminal antigen peptide of active PAR-2 in a skin sample to which a candidate substance has been applied, and detection of active PAR-2.
  • a method for screening a PAR-2 activation inhibitor which comprises a step of determining a candidate substance for reducing the intensity as a PAR-2 activation inhibitor.
  • the screening method according to item 8 further comprising a step of performing a scratch treatment on the skin sample, and applying the candidate substance to the scratched skin sample.
  • the PAR-2 activation inhibitor is an epidermis condition improving agent.
  • a step of applying a candidate substance in a skin sample A step of detecting active PAR-2 with an anti-active PAR-2 antibody that binds to the N-terminal antigen peptide of active PAR-2 in a skin sample to which a candidate substance has been applied, and detection of active PAR-2.
  • a method for screening a PAR-2 activation promoter which comprises a step of determining a candidate substance for increasing strength as a PAR-2 activation promoter.
  • the screening method according to item 11 wherein the PAR-2 activation promoter is a substance that deteriorates the epidermis condition.
  • the step of detecting the active PAR-2 is A step of contacting a skin sample with the anti-active PAR-2 antibody, and a step of contacting a labeled secondary antibody to detect a label.
  • the screening method according to any one of items 8 to 12, wherein the screening method comprises.
  • the anti-active PAR-2 antibody binds to the active PAR-2 in which the protease cleavage site existing in the extracellular N-terminal region is cleaved, the protease cleavage site existing in the extracellular N-terminal region is bound.
  • the screening method according to item 14, wherein the inactive PAR-2 has an N-terminal amino acid at positions 26 to 36 of SEQ ID NO: 1.
  • the screening method according to any one of items 8 to 15, wherein the activated PAR-2 lacks the N-terminal amino acid up to at least position 36 of SEQ ID NO: 1.
  • a PAR-2 activation inhibitor containing the compound represented by, or a salt thereof.
  • a method for treating or cosmetologically treating inflammatory skin diseases, inflammatory conditions of the skin, rough skin, decreased barrier function, itchiness, redness, and dryness which comprises administering the compound represented by the above, or a salt thereof.
  • PAR-2 activation can be detected in line with PAR-2 activation that occurs in actual skin, and PAR-2 activation can be detected more accurately. It is possible to evaluate the epidermal condition, and in the screening method, it is possible to select a PAR-2 activation inhibitor and / or a PAR-2 activation promoter that acts on the skin.
  • FIG. 1 shows a photograph of a skin sample fluorescently stained with an anti-PAR-2 antibody and an anti-active PAR-2 antibody and taken with a fluorescence microscope.
  • FIG. 2 shows a photograph of a skin sample fluorescently stained with an anti-active PAR-2 antibody and an anti-filaggrin antibody and taken with a fluorescence microscope.
  • FIG. 3 shows a photograph of a skin sample fluorescently stained with an anti-active PAR-2 antibody and an anti-ZO-1 antibody and taken with a fluorescence microscope.
  • FIG. 4 shows the change in fluorescence when the antigen peptide of the anti-active PAR-2 antibody was added when the skin sample was fluorescently stained using the anti-PAR-2 antibody and the anti-active PAR-2 antibody. The photograph taken by the fluorescence microscope is shown. In FIG.
  • FIG. 6B shows a graph in which the fluorescence intensity is quantified in the photograph of FIG. 6A.
  • FIG. 7A shows the full-length amino acid sequence of human PAR-2
  • FIG. 7B shows the full-length amino acid sequence of mouse PAR-2.
  • One aspect of the present invention relates to a method for evaluating an epidermal state using an anti-active PAR-2 antibody that binds to an N-terminal antigen peptide of active PAR-2.
  • the state of rough epidermis which is the epidermis state caused by the activation of PAR-2, can be evaluated. More specifically, the rough epidermis includes an inflammatory condition, rough skin, decreased barrier function, itching, redness, and dryness.
  • the evaluation method according to the present invention includes detecting the active PAR-2 of the epidermis in a skin sample using an anti-active PAR-2 antibody that binds to the N-terminal antigen peptide of the active PAR-2.
  • PAR-2 refers to protease receptor 2 (Protease activated receptor-2).
  • the amino acid sequence of PAR-2 is represented by, for example, SEQ ID NO: 1 in humans (FIG. 7A) and by SEQ ID NO: 2 in mice (FIG. 7B).
  • peptides human: SLIGKV, mouse: SLIGRL
  • the organism from which PAR-2 is derived may be any organism, but mammals such as humans are preferred.
  • PAR-2 is not limited to those having the above amino acid sequences, but also homologues (homologs and splicing variants), variants, derivatives, matures and amino acids thereof, as long as their biological functions are equivalent to these. Modified products and the like can be included.
  • Active PAR-2 refers to PAR-2 cleaved at a protease cleavage site present in the extracellular N-terminal region of PAR-2.
  • PAR-2 in which the protease cleavage site existing in the extracellular N-terminal region of PAR-2 is not cleaved is called inactive PAR-2.
  • the protease cleavage site existing in the extracellular N-terminal region of PAR-2 is between the 36th and 37th positions of SEQ ID NO: 1, and the N-terminal amino acid up to at least the 36th position is cleaved.
  • S (serine) at position 37 of SEQ ID NO: 1 is exposed as a new N-terminal.
  • Intracellular signals are induced by binding of a peptide containing a new N-terminal (FIGS. 7A and B, underlined) to the extracellular second loop.
  • protease cleavage site existing in the N-terminal region of PAR-2 is cleaved by an enzyme such as trypsin or tryptase, but it is not intended to be limited thereto.
  • active PAR-2 and inactive PAR-2 are the same except that they are cleaved at a protease cleavage site existing in the extracellular N-terminal region, active PAR-2 can be detected with an antibody. When doing so, it is necessary to use an antibody that can identify the N-terminus of active PAR-2.
  • an antibody capable of identifying the N-terminal of active PAR-2 can bind to the N-terminal antigenic peptide of active PAR-2.
  • an antigenic peptide means a peptide containing SLIGKV (SEQ ID NO: 3) in the case of humans, and is preferably a peptide having an N-terminal portion of SLIGKV.
  • SLIGKV SEQ ID NO: 3
  • SLIGRL SEQ ID NO: 4
  • the anti-active PAR-2 antibody used in the present invention binds to active PAR-2 cleaved at a protease cleavage site present in the extracellular N-terminal region, while cleaving protease present in the extracellular N-terminal region.
  • a protease cleavage site present in the extracellular N-terminal region
  • cleaving protease present in the extracellular N-terminal region Refers to an antibody that does not bind to inactive PAR-2 whose site has not been cleaved.
  • Such an antibody can be produced according to a conventional method using an antigen peptide containing SLIGKV.
  • an antigen peptide containing SLIGKV as an example, a peptide having 10 to 20 residues starting with SLIGKV from the sequence of SEQ ID NO: 1 can be used.
  • an anti-active PAR-2 antibody there is a goat anti-PAR-2N19 antibody (sc-8206) sold by Santa Cruz.
  • an anti-inactive PAR-2 antibody can be used for the purpose of detecting the inactive PAR-2.
  • the anti-inactive PAR-2 antibody can generate an N-terminal region of inactive PAR-2, for example, a peptide at positions 26 to 36 of SEQ ID NO: 1 as an antigen.
  • an anti-PAR-2 antibody can be used for the purpose of detecting active PAR-2 and inactive PAR-2 without distinguishing them.
  • the anti-PAR-2 antibody can be produced by using a region other than the extracellular N-terminal region as an antigen peptide.
  • Antibodies are used in the broadest sense in the present invention, and monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, and modified antibodies thereof are also included as long as the desired specific binding property is shown.
  • the antibody in the present invention may be any animal-derived antibody such as a mouse antibody, a human antibody, a rat antibody, a rabbit antibody, a goat antibody, and a camel antibody.
  • the modified antibody include a protein containing a part of the antibody and an antibody fragment capable of binding to an antigen.
  • antibody fragments include Fab fragment, Fv fragment, F (ab') 2 fragment, Fab'fragment, or scFv.
  • a direct method for directly labeling an antibody for detection for example, a direct method for directly labeling an antibody for detection, an indirect method for detecting a secondary antibody that recognizes an antibody with a label, and a complex-forming substance such as biotin-avidin are used.
  • the amplified amplification method can be used.
  • an antibody is biotinylated and detection is possible by using labeled avidin or streptavidin.
  • the detection of active PAR-2 can be performed on a skin sample.
  • the skin sample may be a skin sample collected from the skin or a skin sample obtained by a three-dimensional skin model.
  • Epidermal cells proliferate in the basal layer, differentiate into the stratum spinosum, the stratum granulosum, and finally shed from the skin surface. Enucleated in the process of differentiation into the stratum corneum, resulting in dead cells.
  • Active PAR-2 is expressed in the outermost layer of the epidermis where living epidermal cells are present, that is, from the stratum granulosum to the stratum granulosum, more preferably in the outer layer of the stratum granulosum.
  • the granular layer can be classified into three layers, SG1 to SG3, from the outside to the inside. It is said that tight junctions are formed in the SG2 layer of the stratum granulosum.
  • the expression pattern of active PAR-2 is also consistent with the expression pattern of ZO-1, which constitutes a tight junction. Therefore, in immunohistochemical staining, when detecting active PAR-2 in the skin, from the viewpoint of specifying the location, co-staining with a protein such as ZO-1 that can determine the location, or nuclear staining for discriminating enucleation. Co-staining is preferred.
  • the method for evaluating the epidermis state of the present invention can evaluate the epidermis state according to the abundance of active PAR-2. More specifically, it can be evaluated that the higher the abundance of active PAR-2, the worse the epidermal condition. More preferably, when the abundance of active PAR-2 is large in the region from the granular layer to the stratum granulosum of the epidermis, it can be evaluated that the epidermis state is poor.
  • the amount of active PAR-2 stained in the stratum granulosum to stratum granulosum region is measured by image processing software (for example, manufactured by Nikon Corporation).
  • the epidermis state can be determined by comparing with an appropriately set threshold value.
  • the epidermal state may be evaluated by the abundance ratio of active PAR-2 and inactive PAR-2 or the abundance ratio of active PAR-2.
  • the abundance ratio of active PAR-2 to inactive PAR-2 is, for example, to an antibody that binds to active PAR-2 but not to inactive PAR-2, and to active PAR-2.
  • the abundance ratio may be determined by using an antibody that does not bind but binds to the inactive PAR-2.
  • the abundance ratio of active PAR-2 is, for example, for antibodies that bind to active PAR-2 but not to inactive PAR-2, and to both active PAR-2 and inactive PAR-2. It can be determined using an antibody that can bind.
  • a further aspect of the present invention relates to a method for screening a PAR-2 activation inhibitor or a PAR-2 activation promoter.
  • This screening method is specifically described in the following steps: The process of applying a candidate substance in a skin sample, A step of detecting active PAR-2 with an anti-active PAR-2 antibody that binds to the N-terminal antigen peptide of active PAR-2 in a skin sample to which a candidate substance has been applied, and detection of active PAR-2.
  • Candidate substances include arbitrary substances, and for example, a compound library for searching for pharmaceuticals or cosmetics, or a library of animal and plant extracts can be used. Furthermore, a cosmetic material library and the like can be selected. Active PAR-2 in skin samples that differ only in that no candidate substance has been applied can be detected and used as a control. The controls may be tested in parallel or in advance.
  • the screening method of the present invention may include a step of scratching a skin sample.
  • the scratch treatment is a treatment that imitates scratching the skin with a fingernail, and can be performed by bringing a spatula or the like into contact with a skin sample and reciprocating it one to a plurality of times, for example, 50 times.
  • the scratch treatment can cause invisible damage to the epidermis of the skin sample. It has been found that PAR-2 activation occurs when scratch treatment is performed. Therefore, in the method for screening a PAR-2 activation inhibitor, scratch treatment can activate PAR-2 in a skin sample, which is useful for screening a PAR-2 activation inhibitor.
  • the candidate substance screened as a PAR-2 activation inhibitor after the scratch treatment is a substance capable of suppressing the PAR-2 activation immediately after the scratch treatment, and has an immediate effect at the time of scratching. It can be used as a PAR-2 activation inhibitor.
  • a PAR-2 activation inhibitor can be used as a barrier recovery function promoter, an inflammation inhibitor, and an itch inhibitor applied at the time of scratching.
  • the detection of active PAR-2 is more specifically described in the following step: A step of contacting a skin sample with the anti-active PAR-2 antibody, This can be done by contacting the labeled secondary antibody with the skin sample and by performing a step of determining the detection intensity of the label on the skin sample.
  • the skin sample can be contacted with the anti-active PAR-2 antibody, for example, for 1 to 20 hours at room temperature or under cooling.
  • a step of fixing the skin sample in advance may be performed prior to this contact step.
  • Immobilization of the skin sample may be performed by any method, but can be performed, for example, by incubating the skin sample in an ethanol or paraformaldehyde-containing solution for 16 to 24 hours at room temperature or under cooling.
  • the secondary antibody is an antibody that binds to the anti-active PAR-2 antibody, and can be selected depending on the organism from which the anti-active PAR-2 antibody, which is the primary antibody, is derived.
  • the label may be any label, but a fluorescent label may be used as an example. When a fluorescent label is used, the contact step with the secondary antibody is performed in the dark and can be contacted at room temperature for 1 hour, for example. Contact is carried out, for example, by incubating in a solution containing each antibody.
  • the detection intensity can be determined by appropriately selecting an apparatus according to the label.
  • a fluorescence microscope can be used, and fluorescence can be detected by using an excitation light and a filter that match the fluorescent label.
  • a washing step may be further included before and after the contact step with the primary antibody or the secondary antibody.
  • the present invention relates to a PAR-2 activation inhibitor, which comprises a compound represented by, or a salt thereof.
  • the PAR-2 activation inhibitor comprises N-methyl-trans-4- (aminomethyl) cyclohexanecarboxamide or a salt thereof.
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 9-227367.
  • the PAR-2 activation inhibitor screened in the screening method of the present invention can be used as a rough skin inhibitor, for example, an inflammation inhibitor, a rough skin inhibitor, a barrier function enhancer, and an itch inhibitor. Since the PAR-2 activation inhibitor of the present invention has an effect of suppressing inflammation against scratches, it is a drug for treating or preventing inflammatory skin diseases such as atopic dermatitis, psoriasis, and contact dermatitis. Alternatively, it can be used as a cosmetic composition and can be administered to a subject in need of suppression of PAR-2 activation. A subject requiring suppression of PAR-2 activation is, for example, a subject in which itching is induced by inflammation or scratching.
  • the PAR-2 activation inhibitor can be incorporated into cosmetics, quasi-drugs, and pharmaceuticals.
  • cosmetics containing the PAR-2 activation inhibitor of the present invention include, but are not limited to, lotions, milky lotions, beauty essences, creams, foundations, etc., but the direct purpose is to improve the skin. It is intended to include everything that is not applied to the skin, but includes, for example, sunscreens, insect repellents, hair removers, hair restorers, shaving lotions, after-shaving lotions and the like.
  • Example 1 Immunohistochemical staining of PAR-2 and active PAR-2 on skin Human abdominal skin obtained from KAC was incubated in PBS containing 4% paraformaldehyde for 24 hours at 4 ° C. to fix samples. After washing with PBS, it was replaced with PBS containing 30% sucrose, and a frozen block was prepared together with OCT compound. This was sliced with a microtome to prepare a skin section having a thickness of 6 ⁇ m, which was used for staining.
  • the primary antibody was diluted 300-fold goat anti-PAR-2N19 antibody (Santa Cruz, sc-8206) and Incubated for 16 hours in blocking solution containing 300-fold diluted rabbit anti-PAR-2H99 antibody (Santa Cruz, sc-5597).
  • Active PAR-2 (N19) was localized in the outermost layer of the epidermis, whereas PAR-2 was widely distributed in the stratum spinosum to the stratum granulosum of the epidermis, and was particularly abundant in the stratum granulosum.
  • Example 2 Identification of the localized region of active PAR-2 As in Example 1, active PAR-2 was detected using a goat anti-PAR-2N19 antibody (Santa Cruz, sc-8206) as the primary antibody. At the same time, a rabbit anti-filaggrin antibody (Santa Cruz, sc-30229) was used instead of the rabbit anti-PAR-2H99 antibody, and the same secondary antibody was used to examine the localization with filaggrin (Fig. 2). .. Filaggrin is present in the outermost layer to the stratum corneum of unenucleated cells, while active PAR-2 is localized only in the outermost layer of unenucleated cells, completely with the localization of filaggrin. Did not match.
  • Example 1 As in Example 1, a goat anti-PAR-2N19 antibody (Santa Cruz, sc-8206) was used as the primary antibody to detect active PAR-2, and a 500-fold diluted mouse was used instead of the rabbit anti-PAR-2H99 antibody.
  • An anti-ZO1-1 antibody (Thermo Fisher Scientific, 339100) was used, and an Alexa488-labeled anti-mouse IgG antibody (Thermo Fisher Scientific) was used as the secondary antibody to examine localization with tight junctions. Activated PAR-2 was shown to be localized outside the tight junction layer.
  • Example 3 Examination of specificity of anti-active PAR-2 antibody Similar to Example 1, goat anti-PAR-2N19 antibody (Santa Cruz, sc-8206) and rabbit anti-PAR-2H99 antibody (Santa) were used as primary antibodies. Using Cruz, sc-5597) and the same secondary antibody, skin sections were stained. The goat anti-PAR-2N19 antibody was mixed with 5 times the weight of the antigen peptide (sequence: N-terminal portion containing SLIGKV (SEQ ID NO: 3)) (Santa Cruz, sc-8206P), treated at room temperature for 30 minutes, and then centrifuged. The supernatant was added to the skin section together with the rabbit anti-PAR-2H99 antibody and incubated. The shooting results are shown in FIG. Incubation with the antigenic peptide eliminated the fluorescence from the goat anti-PAR-2N19 antibody, but did not change the fluorescence from the rabbit anti-PAR-2H99 antibody (FIG. 4).
  • Example 4 Activation of PAR-2 antibody in epidermis by trypsin treatment
  • the abdominal skin of a 51-year-old woman obtained from KAC (7th day after storage at 4 ° C after surgery) was used as a medium for maintaining human skin tissue (Biopredic, Inc., The dermis was immersed in MIL218) and organ culture was performed at 37 ° C. for 1 day.
  • a ring of silicone adhesive was formed on the skin and the following solution was applied into the ring: Water, 0.05% soy trypsin inhibitor (SBTI), 50 ⁇ M trypsin + 0.05% soy trypsin inhibitor Agent (Try 50 ⁇ M + SBTI), 10 ⁇ M trypsin (Try 10 ⁇ M), 100 ⁇ M trypsin (Try 100 ⁇ M). Sigma (T-0303) was used as the trypsin, and Sigma (T6522) was used as the soybean trypsin inhibitor. Incubation was carried out for 30 minutes in a 37 ° C. 5% CO 2 atmosphere so that the upper surface of the skin was not covered with the medium.
  • the surface was washed with water, fixed with 4% paraformaldehyde (PFA) in the same manner as in Example 1, replaced with 30% sucrose, an OCT block was prepared, and a section having a thickness of 6 ⁇ m was prepared with a microtom. Sections were used as primary antibodies in blocking solutions of 300-fold diluted goat anti-PAR-2N19 antibody (Santa Cruz, sc-8206) and 300-fold diluted rabbit anti-PAR-2H99 antibody (Santa Cruz, sc-5597) for 16 hours. Incubated.
  • PFA paraformaldehyde
  • Example 5 Suppression of active PAR-2 in skin sample after scratch treatment
  • the abdominal skin (7 days after surgery) of a 40-year-old woman obtained from KAC was put into a medium for maintaining human skin tissue (Biopredic).
  • the cells were cultured at 37 ° C. for 1 day.
  • the skin was scratched 50 times by applying a metal spatula to the skin.
  • Silicone adhesive was formed into a ring on the scratched area and the following solution was applied into the ring: Water, 1% Tranexamic acid (LKT Laboratories), 0.7. % N-methyl-trans-4-aminomethylcyclohexanecarboxamide hydrochloride (CAS No. 38697-94-8).
  • a sample was obtained by incubating for 1 hour in a 37 ° C.
  • the fluorescence intensity of the active PAR-2 was measured using NIS-elements software (manufactured by Nikon Corporation) and shown as a graph (FIG. 6B). No change was observed in the fluorescence intensity of the inactive PAR-2 (H99). Immediately after the scratch treatment, the fluorescence intensity of the active PAR-2 was low, but the fluorescence intensity increased significantly 1 hour after the scratch treatment.

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Abstract

従来のＰＡＲ－２抑制作用の評価方法やスクリーニング方法は、ＰＡＲ－２を発現する培養細胞においてＰＡＲ－２活性化以降に起こる細胞内の反応を指標とすることで間接的にＰＡＲ－２活性化を評価するものであり、実際の組織、例えば皮膚などにおけるＰＡＲ－２活性化を正確に評価することができないという問題がある。ＰＡＲ－２タンパク質のＮ末端の切断を検知する抗体を用いることで、ＰＡＲ－２の切断状態に基づいてＰＡＲ－２活性化の評価が可能なことを見出した。この抗体を用いて、皮膚におけるＰＡＲ－２活性化を評価したところ、トリプシン処理や外部刺激によりＰＡＲ－２活性化が生じる部位が明らかになった。ＰＡＲ－２タンパク質のＮ末端の切断を検知する抗体を用いて、皮膚におけるかかる部位に着目することで、ＰＡＲ－２活性化抑制剤又はＰＡＲ－２活性化促進剤をスクリーニングする新規方法を提供する。

Description

皮膚での活性型ＰＡＲ－２を指標とした皮膚状態評価方法、ＰＡＲ－２活性化促進剤又は抑制剤のスクリーニング方法及びＰＡＲ－２活性化抑制剤
　本発明は、皮膚での活性型ＰＡＲ－２を指標とした皮膚状態評価方法、並びにＰＡＲ－２活性を指標としたＰＡＲ－２活性化剤又は抑制剤のスクリーニング方法に関する。さらに、本発明に係るスクリーニング方法により選択されたＰＡＲ－２活性化抑制剤にも関する。
　プロテアーゼ受容体（ＰＡＲ：Protease Activated Receptor）は、特定のプロテアーゼにより活性化されるＧタンパク共役７回膜貫通型受容体の一種である。現在までに４つのＰＡＲファミリー（ＰＡＲ－１～４）が同定されている。ＰＡＲ－１、３及び４は、トロンビン受容体である一方で、ＰＡＲ－２はトロンビンでは活性化されない。ＰＡＲ－２は、トリプシン、トリプターゼ、第ＶＩＩａ因子、第Ｘａ因子などにより活性化されることが知られている。ＰＡＲ－２は、ＰＡＲ－２のＮ末端の部分ペプチドがこれらのプロテアーゼにより切断され、新たなＮ末端が生成し、この新たなＮ末端を含むペプチドがリガンドとして作用することにより活性化される。また、切断により生じる新たなＮ末端のペプチドの配列に基づく合成ペプチドが、ＰＡＲ－２を活性化できることが報告されている。ＰＡＲ－２は、内皮性の組織に広く分布し、特に消化器、循環器、呼吸器、神経、皮膚などで高度に発現していることが知られている。
　表皮ケラチノサイトのＰＡＲ－２（Protease Activated Receptor-2）は、アトピーや乾癬の病態、皮膚バリアの恒常性・痒み・炎症に関与している。ＰＡＲ－２はプロテアーゼにより切断され活性化すると、Ｇタンパク質を介してイノシトール三リン酸（ＩＰ３）を産生し、細胞内カルシウムを上昇させ、ＮＦ－κＢ（Nuclear Factor-kappa B）などの転写因子を動員させ、ＴＳＬＰ（Thymic Stromal Lymphopoietin）など炎症性サイトカインの産生を増加させる。表皮の顆粒層における細胞外カルシウムの上昇は、ラメラ顆粒の放出を抑制し、バリア回復を遅らせる。ＴＳＬＰなどの炎症性サイトカインは皮膚内の感覚神経を刺激し、痒みを起こすと考えられている。
　このように生理的に重要な役割を担うＰＡＲ－２に関し、特定の化合物についてＰＡＲ－２抑制作用を評価する方法や、スクリーニング方法が開発されている（特許文献１：特許第４７２８２４８号、特許文献２：特表２０１２－５１９７３５号、特許文献３：特開２００４－１７０３２３号）。これまでのＰＡＲ－２抑制剤のスクリーニング法は、ＰＡＲ－２を発現する培養細胞を用いて、ＰＡＲ－２活性化以降に起こる細胞内の反応、例えばカルシウム濃度変化やサイトカインの放出量などを測定し、指標とするものであった。
特許第４７２８２４８号公報 特表２０１２－５１９７３５号公報 特開２００４－１７０３２３号公報 特開平９－２２７３６７号公報
　従来行われているＰＡＲ－２活性化以降に起こる細胞内の反応を指標としたＰＡＲ－２抑制作用の評価方法やスクリーニング方法は、ＰＡＲ－２活性化を間接的に評価することに基づいている。これらの評価方法は、ＰＡＲ－２活性化を直接測定しているわけではないことから、試験物質の他の生理作用に基づく反応をＰＡＲ－２への作用と誤認する可能性がある。また、従来の方法では培養細胞においてスクリーニングがされることから、実際の組織、例えば皮膚で生じているＰＡＲ－２活性化を反映した結果が得られないという問題がある。
　そこで、本発明者らが、鋭意研究を行ったところ、ＰＡＲ－２タンパク質のＮ末端の切断を検知する抗体を用いることで、ＰＡＲ－２の切断状態に基づいてＰＡＲ－２活性化の評価が可能になることを見出した。抗体を用いることにより、表皮においてＰＡＲ－２活性化が生じる部位を明らかにすることができ、かかる部位に着目することで、ＰＡＲ－２活性化抑制剤又はＰＡＲ－２活性化促進剤をスクリーニングする方法を発明するに至った。さらに当該スクリーニング方法を用いることで、新たなＰＡＲ－２活性化抑制剤を見出した。そこで本発明は、以下のものに関する：
［１］　活性型ＰＡＲ－２のＮ末端抗原ペプチドに結合する抗活性型ＰＡＲ－２抗体を用いて、皮膚試料における表皮の活性型ＰＡＲ－２を検出することを含む、表皮状態の評価方法。
［２］　前記抗活性型ＰＡＲ－２抗体が、細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位で切断された活性型ＰＡＲ－２に結合する一方で、細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位が切断されていない非活性型ＰＡＲ－２には結合しない、項目１に記載の評価方法。
［３］　前記非活性型ＰＡＲ－２が、配列番号１の第２６位～第３６位のＮ末端アミノ酸を含む、項目２に記載の評価方法。
［４］　前記活性型ＰＡＲ－２が、配列番号１の少なくとも第３６位までのＮ末端のアミノ酸を欠如する、項目１～３のいずれか一項に記載の評価方法。
［５］　前記活性型ＰＡＲ－２の検出量が高い場合に、表皮が荒れ状態であると評価する、項目１～４のいずれか一項に記載の評価方法。
［６］　表皮の荒れ状態であると評価するとは、炎症状態、肌荒れ、バリア機能低下、かゆみ、赤み、乾燥からなる群から選ばれる少なくとも１の表皮状態を決定することである、項目５に記載の評価方法。
［７］　活性型ＰＡＲ－２の検出が、以下の：
　前記皮膚試料を前記抗活性型ＰＡＲ－２抗体と接触させる工程、
　標識付きの二次抗体を皮膚試料と接触させる工程、及び
　皮膚試料において標識の検出強度を決定する工程
を含む、項目１～６のいずれか一項に記載の評価方法。
［８］　皮膚試料において候補物質を適用する工程、
　候補物質が適用された皮膚試料において、活性型ＰＡＲ－２のＮ末端抗原ペプチドに結合する抗活性型ＰＡＲ－２抗体により、活性型ＰＡＲ－２を検出する工程、及び
　活性型ＰＡＲ－２の検出強度を低下させる候補物質をＰＡＲ－２活性化抑制剤と決定する工程
を含む、ＰＡＲ－２活性化抑制剤のスクリーニング方法。
［９］　皮膚試料において、スクラッチ処理を行う工程をさらに含み、スクラッチ処理がされた皮膚試料に候補物質が適用される、項目８に記載のスクリーニング方法。
［１０］　前記ＰＡＲ－２活性化抑制剤が、表皮状態改善剤である、項目８又は９に記載のスクリーニング方法。
［１１］　皮膚試料において候補物質を適用する工程、
　候補物質が適用された皮膚試料において、活性型ＰＡＲ－２のＮ末端抗原ペプチドに結合する抗活性型ＰＡＲ－２抗体により、活性型ＰＡＲ－２を検出する工程、及び
　活性型ＰＡＲ－２の検出強度を増加させる候補物質をＰＡＲ－２活性化促進剤と決定する工程
を含む、ＰＡＲ－２活性化促進剤のスクリーニング方法。
［１２］　前記ＰＡＲ－２活性化促進剤が、表皮状態悪化物質である、項目１１に記載のスクリーニング方法。
［１３］　活性型ＰＡＲ－２を検出する工程が、
　皮膚試料を前記抗活性型ＰＡＲ－２抗体と接触させる工程、及び
　標識付き二次抗体を接触させ、標識を検出する工程、
　を含む、項目８～１２のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
［１４］　前記抗活性型ＰＡＲ－２抗体が、細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位が切断された活性型ＰＡＲ－２に結合する一方で、細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位が切断されていない非活性型ＰＡＲ－２には結合しない、項目８～１３のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
［１５］　前記非活性型ＰＡＲ－２が、配列番号１の２６～３６位のＮ末端アミノ酸を有する、項目１４に記載のスクリーニング方法。
［１６］　前記活性型されたＰＡＲ－２が、配列番号１の少なくとも３６位までのＮ末端のアミノ酸を欠如している、項目８～１５のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
［１７］　以下の：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 ｛式中、Ｒ1およびＲ2は同一または異なり、水素原子、炭素数１～１８の直鎖状または分岐状アルキル基、炭素数５～８のシクロアルキル基、ベンジル基または下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 （但し、Ｘは低級アルキル基、低級アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、ハロゲン原子を示し、ｎ＝０～３である）をそれぞれ示す｝
　で表される化合物、又はその塩を含む、ＰＡＲ－２活性化抑制剤。
［１８］　ＰＡＲ－２活性化の抑制を必要とする対象に、以下の：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 ｛式中、Ｒ1およびＲ2は同一または異なり、水素原子、炭素数１～１８の直鎖状または分岐状アルキル基、炭素数５～８のシクロアルキル基、ベンジル基または下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （但し、Ｘは低級アルキル基、低級アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、ハロゲン原子を示し、ｎ＝０～３である）をそれぞれ示す｝
　で表される化合物、又はその塩を投与することを含む、炎症性皮膚疾患、皮膚の炎症状態、肌荒れ、バリア機能低下、かゆみ、赤み、乾燥の治療方法又は美容方法。
［１９］　ＰＡＲ－２活性化抑制を介して、炎症性皮膚疾患、皮膚の炎症状態、肌荒れ、バリア機能低下、かゆみ、赤み、乾燥の治療において使用するための、以下の：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 ｛式中、Ｒ1およびＲ2は同一または異なり、水素原子、炭素数１～１８の直鎖状または分岐状アルキル基、炭素数５～８のシクロアルキル基、ベンジル基または下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （但し、Ｘは低級アルキル基、低級アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、ハロゲン原子を示し、ｎ＝０～３である）をそれぞれ示す｝
　で表される化合物、又はその塩。
［２０］　ＰＡＲ－２活性化抑制剤の製造のための、以下の：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 ｛式中、Ｒ1およびＲ2は同一または異なり、水素原子、炭素数１～１８の直鎖状または分岐状アルキル基、炭素数５～８のシクロアルキル基、ベンジル基または下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （但し、Ｘは低級アルキル基、低級アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、ハロゲン原子を示し、ｎ＝０～３である）をそれぞれ示す｝
　で表される化合物、又はその塩の使用。
［２１］　Ｎ－メチル－トランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボキサミド又はその塩を含む、項目１７に記載のＰＡＲ－２活性化抑制剤、項目１８に記載の方法、項目１９に記載の化合物又はその塩、又は項目２０に記載の使用。
　本発明によれば、活性型ＰＡＲ－２の検出強度を指標とすることで、実際の皮膚において生じるＰＡＲ－２活性化に即してＰＡＲ－２活性化を検出することができ、より正確に表皮状態の評価が可能となり、またスクリーニング方法において、皮膚において作用するＰＡＲ－２活性化抑制剤及び／又はＰＡＲ－２活性化促進剤の選択が可能になる。
図１は、抗ＰＡＲ－２抗体と抗活性型ＰＡＲ－２抗体とを用いて、皮膚試料を蛍光染色して蛍光顕微鏡で撮影された写真を示す。 図２は、抗活性型ＰＡＲ－２抗体と抗フィラグリン抗体とを用いて、皮膚試料を蛍光染色して蛍光顕微鏡で撮影された写真を示す。 図３は、抗活性型ＰＡＲ－２抗体と抗ＺＯ－１抗体とを用いて、皮膚試料を蛍光染色して蛍光顕微鏡で撮影された写真を示す。 図４は、抗ＰＡＲ－２抗体と抗活性型ＰＡＲ－２抗体を用いて、皮膚試料を蛍光染色する際に、抗活性型ＰＡＲ－２抗体の抗原ペプチドを添加した場合の、蛍光の変化を蛍光顕微鏡で撮影した写真を示す。 図５は、皮膚試料を、水（Water)、ダイズトリプシン阻害剤（SBTI）、５０μＭトリプシン及びダイズトリプシン阻害剤(Try 50μM+SBTI)、１０μＭトリプシン(Try 10μM)、１００μＭトリプシン(Try 100μM)で処理した後に、抗活性型ＰＡＲ－２抗体を用いて蛍光染色を行い、蛍光顕微鏡で撮影された写真から蛍光強度を数値化したグラフ示す。 図６Ａは、皮膚試料に対してスクラッチ処理を行い、スクラッチ直後の皮膚試料（After scratch before incubation)、スクラッチ処理後水を１時間適用した皮膚試料（Water）、スクラッチ処理後トラネキサム酸を１時間適用した皮膚試料（Tranexamic Acid）、スクラッチ処理後Ｎ－メチル－トランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボキサミドを１時間適用した皮膚試料について、抗活性型ＰＡＲ－２抗体を用いて蛍光染色して蛍光顕微鏡で撮影された写真を示す。図６Ｂは、図６Ａの写真において、蛍光強度を数値化したグラフ示す。 図７Ａは、ヒトＰＡＲ－２の全長アミノ酸配列を示し、図７Ｂは、マウスＰＡＲ－２の全長アミノ酸配列を示す。
　本発明の１の態様は、活性型ＰＡＲ－２のＮ末端抗原ペプチドに結合する、抗活性型ＰＡＲ－２抗体を用いた表皮状態の評価方法に関する。本発明により評価される表皮状態として、ＰＡＲ－２の活性化により引き起こされる表皮状態である表皮の荒れの状態を評価することができる。表皮の荒れ状態としては、さらに具体的に炎症状態、肌荒れ、バリア機能低下、かゆみ、赤み、乾燥などが挙げられる。本発明に係る評価方法は、活性型ＰＡＲ－２のＮ末端抗原ペプチドに結合する、抗活性型ＰＡＲ－２抗体を用いて、皮膚試料における表皮の活性型ＰＡＲ－２を検出することを含む。
　ＰＡＲ－２とは、プロテアーゼ受容体２（Protease activated receptor-2）を指す。ＰＡＲ－２のアミノ酸配列は、ヒトでは例えば配列番号１により表され（図７Ａ）、マウスについては配列番号２で表される（図７Ｂ）。図中、活性化ＰＡＲ－２において切断して生じる新たなＮ末端を含むペプチド（ヒト：SLIGKV、マウス：SLIGRL）に下線を付して示す。ＰＡＲ－２の由来生物は任意の生物であってよいが、哺乳動物、例えばヒトが好ましい。ＰＡＲ－２は、上記のアミノ酸配列を有するものだけでなく、これらと生物学的機能が同等であることを限度として、その同族体（ホモログやスプライスバリアント）、変異体、誘導体、成熟体及びアミノ酸修飾体などが包含されうる。
　活性型ＰＡＲ－２とは、ＰＡＲ－２の細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位で切断されたＰＡＲ－２を指す。一方、ＰＡＲ－２の細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位が切断されていないＰＡＲ－２を非活性型ＰＡＲ－２と呼ぶ。ヒトの場合、ＰＡＲ－２の細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位は、配列番号１の第３６位と第３７位との間であり、少なくとも３６位までのＮ末端のアミノ酸が切断されることで配列番号１の３７位のＳ（セリン）が新たなＮ末端として露出する。新たなＮ末端を含むペプチド（図７Ａ及びＢ、下線部）が細胞外第２ループに結合することで、細胞内シグナルが誘起される。ＰＡＲ－２のＮ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位は、トリプシン、トリプターゼなどの酵素により切断されることが知られているが、これらに限定されることを意図しない。活性型ＰＡＲ－２と、非活性型ＰＡＲ－２は、細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位で切断されている点を除き同一であることから、活性型ＰＡＲ－２を抗体で検出を行う場合、活性型ＰＡＲ－２のＮ末端を識別できる抗体を使用する必要がある。活性型ＰＡＲ－２のＮ末端を識別できる抗体は、活性型ＰＡＲ－２のＮ末端の抗原ペプチドに結合することができる。このような抗原ペプチドは、ヒトの場合ＳＬＩＧＫＶ（配列番号３）を含むペプチドを意味し、好ましくはＮ末端部分がＳＬＩＧＫＶであるペプチドである。マウスの場合、ＳＬＩＧＲＬ（配列番号４）を含むペプチドを意味し、好ましくはＮ末端部分がＳＬＩＧＲＬであるペプチドである。
　本発明において用いられる抗活性型ＰＡＲ－２抗体は、細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位で切断された活性型ＰＡＲ－２に結合する一方で、細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位が切断されていない非活性型ＰＡＲ－２には結合しない抗体を指す。このような抗体は、ＳＬＩＧＫＶを含む抗原ペプチドを用いて、定法に従い製造することができる。ＳＬＩＧＫＶを含む抗原ペプチドとしては、一例として配列番号１の配列のうち、ＳＬＩＧＫＶから始まる１０～２０残基のペプチドを使用することができる。抗活性型ＰＡＲ－２抗体の一例として、Santa Cruz社から販売される、ヤギ抗ＰＡＲ－２Ｎ１９抗体（sc-8206)が挙げられる。また、非活性型ＰＡＲ－２を検出する目的で、抗非活性型ＰＡＲ－２抗体を使用することができる。抗非活性型ＰＡＲ－２抗体は、非活性型ＰＡＲ－２のＮ末領域、例えば配列番号１の第２６位～第３６位のペプチドを抗原として生成することができる。また、活性型ＰＡＲ－２と非活性型ＰＡＲ－２とを識別せずに検出する目的で、抗ＰＡＲ－２抗体を使用することができる。抗ＰＡＲ－２抗体としては、細胞外Ｎ末領域以外の領域を抗原ペプチドとして用いることで生成することができる。抗ＰＡＲ－２抗体の一例として、Santa Cruz社から販売される、ウサギ抗ＰＡＲ－２Ｈ９９抗体（sc-5597)が挙げられる。
　本発明において抗体は、最も広い意味で使用するものとし、所望の特異的結合性が示される限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及びその改変抗体も含まれるものとする。本発明における抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ラクダ抗体など、任意の動物由来の抗体であってもよい。改変抗体としては、例えば抗体の一部分を含む蛋白質であり、抗原に結合できる抗体のフラグメントが挙げられる。抗体のフラグメントの例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、またはｓｃＦｖが挙げられる。
　皮膚試料における表皮の活性型ＰＡＲ－２の検出は、抗活性型ＰＡＲ－２抗体を用いて検出されうる。より具体的には、抗活性型ＰＡＲ－２抗体を用いて、免疫学的検出を行うことにより、皮膚試料中で活性型ＰＡＲ－２の存在場所を検出することができる。免疫学的検出は、定法に基づいて行うことができる。免疫学的検出として、免疫組織染色や免疫ブロッティングなどが挙げられるが、組織上での活性型ＰＡＲ－２の存在部位を検出する観点から、免疫組織化学染色が好ましい。免疫組織染色としては、蛍光標識又は色素標識を用いた手法を用いることができる。免疫組織染色を行うにあたり、例えば抗体に直接標識を付して検出する直接法、抗体を認識する二次抗体に標識を付して検出する間接法、複合体形成物質、例えばビオチン－アビジンを利用した増幅法を利用することができる。増幅法では、一例として抗体をビオチン化し、標識化されたアビジンやストレプトアビジンを用いることで検出が可能になる。
　本発明において活性型ＰＡＲ－２の検出は、皮膚試料に対して行われうる。皮膚試料としては、皮膚から採取した皮膚試料又は３次元皮膚モデルにより取得された皮膚試料であってもよい。表皮細胞は基底層で増殖し、有棘層、顆粒層を経て角層へと分化し、最終的に皮膚表面から脱落する。角層への分化過程で脱核し、死んだ細胞となる。活性型ＰＡＲ－２は、表皮のうち生きている表皮細胞が存在している最外層、すなわち顆粒層～角層にかけて、より好ましくは顆粒層の外層において発現している。顆粒層は、外部から内部に向けてＳＧ１～ＳＧ３という三層に分類することができる。顆粒層のＳＧ２層においてタイトジャンクションが形成しているとされている。活性型ＰＡＲ－２の発現パターンは、タイトジャンクションを構成するＺＯ－１の発現パターンとも一致する。したがって、免疫組織染色において、皮膚で活性型ＰＡＲ－２の検出にあたり、場所を特定する観点から、ＺＯ－１などの場所を確定できるタンパク質などとの共染色や、脱核を判別する核染色と共染色を行うことが好ましい。これにより皮膚試料における部位、例えば表皮、さらにより具体的に表皮の顆粒層～角層、特に顆粒層の外層を特定して、活性型ＰＡＲ－２の検出が可能になる。
　本発明の表皮状態の評価方法は、活性型ＰＡＲ－２の存在量に応じて、表皮状態を評価することができる。より具体的に、活性型ＰＡＲ－２の存在量が高いほど、表皮状態が悪いと評価することができる。より好ましくは、表皮の顆粒層～角層の領域において、活性型ＰＡＲ－２の存在量が多い場合に、表皮状態が悪いと評価することができる。表皮の顆粒層～角層の領域における活性型ＰＡＲ－２の存在量を測定するために、顆粒層～角層の領域の活性型ＰＡＲ－２の染色量を、画像処理ソフト（例えばニコン社製 NIS-elements、フリーソフトImageJ）などにより決定することができる。評価には、適宜設定された閾値と比較することで、表皮状態を決定することができる。さらに別の態様では、活性型ＰＡＲ－２と非活性型ＰＡＲ－２との存在比又は活性型ＰＡＲ－２の存在割合により表皮状態を評価してもよい。活性型ＰＡＲ－２と非活性型ＰＡＲ－２との存在比は、例えば、活性型ＰＡＲ－２に結合する一方で、非活性型ＰＡＲ－２には結合しない抗体と、活性型ＰＡＲ－２に結合しない一方で、非活性型ＰＡＲ－２には結合する抗体とを用いて、存在比を決定してもよい。活性型ＰＡＲ－２の存在割合は、例えば活性型ＰＡＲ－２に結合する一方で、非活性型ＰＡＲ－２には結合しない抗体と、活性型ＰＡＲ－２と非活性型ＰＡＲ－２の両方に結合可能な抗体とを用いて、決定することができる。
　本発明のさらなる態様は、ＰＡＲ－２活性化抑制剤又はＰＡＲ－２活性化促進剤のスクリーニング方法に関する。このスクリーニング方法は、具体的に以下の工程：
　皮膚試料において候補物質を適用する工程、
　候補物質が適用された皮膚試料において、活性型ＰＡＲ－２のＮ末端抗原ペプチドに結合する抗活性型ＰＡＲ－２抗体により、活性型ＰＡＲ－２を検出する工程、及び
　活性型ＰＡＲ－２の検出強度を低下させる候補物質をＰＡＲ－２活性化抑制剤と決定し、又は活性型ＰＡＲ－２の検出強度を増加させる候補物質をＰＡＲ－２活性化促進剤と決定する工程
を含む。候補物質は、任意のものが挙げられるが、例えば医薬品又は化粧料探索用の化合物ライブラリーや、動植物の抽出物ライブラリーを使用することができる。さらには、化粧品素材ライブラリーなどを選択することができる。候補物質を適用されていない点でのみ異なる皮膚試料における活性型ＰＡＲ－２を検出し、対照として用いることができる。対照については、同時並行で実験されていてもよいし、予め実験されていてもよい。
　本発明のスクリーニング方法において、皮膚試料にスクラッチ処理を行う工程を含んでもよい。スクラッチ処理とは、指の爪で皮膚をひっかくことを模す処理であり、スパチュラなどを皮膚試料に接触させて、１～複数回、例えば５０回往復させることにより行われうる。スクラッチ処理を行うことにより、皮膚試料の表皮に目に見えない損傷を与えることができる。スクラッチ処理を行うと、ＰＡＲ－２活性化が起こることが見いだされている。したがって、ＰＡＲ－２活性化抑制剤のスクリーニング方法において、スクラッチ処理を行うことで、皮膚試料におけるＰＡＲ－２を活性化することができ、ＰＡＲ－２活性化抑制剤のスクリーニングに有用である。また、スクラッチ処理を行った後にＰＡＲ－２活性化抑制剤としてスクリーニングされた候補物質は、スクラッチ処理直後のＰＡＲ－２活性化を抑制することができる物質であり、掻傷時において即効性のあるＰＡＲ－２活性化抑制剤として使用することができる。このようなＰＡＲ－２活性化抑制剤は、掻傷時において適用するバリア回復機能促進剤、炎症抑制剤、痒み抑制剤として使用しうる。
　本発明の評価方法及びスクリーニング方法の両方において、活性型ＰＡＲ－２の検出は、より具体的に、下記の工程：
　皮膚試料を前記抗活性型ＰＡＲ－２抗体と接触させる工程、
　標識付きの二次抗体を皮膚試料と接触させる工程、及び
　皮膚試料において標識の検出強度を決定する工程
　を行うことにより行われうる。皮膚試料を前記抗活性型ＰＡＲ－２抗体と接触させる工程において、皮膚試料は、抗活性型ＰＡＲ－２抗体と一例として１～２０時間、室温又は冷却下で接触されうる。この接触工程の前に、予め皮膚試料を固定する工程が行われてもよい。皮膚試料の固定は、任意の手法で行われてよいが、一例としてエタノール又はパラホルムアルデヒド含有溶液中で皮膚試料を１６～２４時間、室温又は冷却下でインキュベートすることにより実施できる固定されうる。二次抗体は、抗活性型ＰＡＲ－２抗体に結合する抗体であり、一次抗体である抗活性型ＰＡＲ－２抗体の由来生物に応じて選択することができる。標識は任意の標識であってよいが、一例として蛍光標識が用いられうる。蛍光標識を用いる場合、二次抗体との接触工程は暗所で行われ、一例として１時間、室温で接触されうる。接触は一例として各抗体を含む溶液中でインキュベートすることで行われる。皮膚試料において標識の検出強度を決定する工程は、標識に応じて適宜機器を選択して検出強度を決定することができる。蛍光標識を用いた場合には、蛍光顕微鏡を利用することができ、蛍光標識に合わせた励起光及びフィルターを用いて蛍光を検出することができる。一次抗体又は二次抗体との接触工程の前後には、さらに洗浄工程がふくまれてもよい。
　本発明のスクリーニング方法により、Ｎ－メチル－トランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボキサミドが、ＰＡＲ－２活性化抑制剤としてスクリーニングされた。したがって、本発明のさらに別の態様は、下記の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 ｛式中、Ｒ1およびＲ2は同一または異なり、水素原子、炭素数１～１８の直鎖状または分岐状アルキル基、炭素数５～８のシクロアルキル基、ベンジル基または下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 （但し、Ｘは低級アルキル基、低級アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、ハロゲン原子を示し、ｎ＝０～３である）をそれぞれ示す｝
　で表される化合物、又はその塩を含む、ＰＡＲ－２活性化抑制剤に関する。特に好ましくは、ＰＡＲ－２活性化抑制剤は、Ｎ－メチル－トランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボキサミド又はその塩を含む。上述の化合物については、特許文献４（特開平９－２２７３６７号）を参照することで製造することができる。
　本発明のスクリーニング方法においてスクリーニングされたＰＡＲ－２活性化抑制剤は、肌荒れ抑制剤、例えば炎症抑制剤、肌荒れ抑制剤、バリア機能亢進剤、かゆみ抑制剤として使用することができる。本発明のＰＡＲ－２活性化抑制剤は、掻傷に対し、炎症を抑制する作用を有することから、炎症性皮膚疾患、例えばアトピー性皮膚炎、乾癬、接触皮膚炎などの治療又は予防用医薬又は美容組成物として使用することができ、PAR-2活性化の抑制を必要とする対象に投与されうる。ＰＡＲ－２活性化の抑制を必要とする対象とは、一例として炎症や掻傷によりかゆみが誘発された対象である。皮膚外用剤として製剤化することが好ましいが、他の任意の剤形に製剤化することもできる。ＰＡＲ－２活性化抑制剤は、化粧料、医薬部外品、医薬品に配合されうる。本発明のＰＡＲ－２活性化抑制剤が配合される化粧料として、例えば化粧水、乳液、美容液、クリーム、ファンデーションなどが挙げられるが、これらに限定されず、皮膚の改善を直接の目的とするものではないが、皮膚に塗布されるもの全てを含むことを意図し、例えば、日焼け止め剤、虫除け剤、脱毛剤、育毛剤、シェービングローション、アフターシェービングローションなども包含するものとする。
　以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、種々の態様をとることができる。本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
実施例１：皮膚におけるＰＡＲ－２及び活性型ＰＡＲ－２の免疫組織染色
　ＫＡＣ社から入手したヒト腹部皮膚を４％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳ中で、４℃で２４時間インキュベートし、試料を固定した。ＰＢＳで洗浄後、３０％スクロース含有ＰＢＳに置換し、ＯＣＴコンパウンドとともに凍結ブロックを作製した。これをミクロトームで薄切し、６μｍ厚さの皮膚切片を作製し、染色に使用した。切片をブロッキング溶液（１０％ロバ血清及び０．４％ＴｒｉｔｏｎＸ―１００を含むＰＢＳ）で１時間インキュベートした後、一次抗体として、３００倍希釈ヤギ抗ＰＡＲ－２Ｎ１９抗体（Santa Cruz, sc-8206)及び３００倍希釈ウサギ抗ＰＡＲ－２Ｈ９９抗体（Santa Cruz, sc-5597)を含むブロッキング溶液で、１６時間インキュベートした。ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で洗浄後、二次抗体として、１０００倍希釈のＡｌｅｘａ４８８標識抗ヤギＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック, A11055）及び１０００倍希釈のＡｌｅｘａ５９４標識抗ウサギＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック, A21207）を含むブロッキング溶液で、暗室下で１時間インキュベートを行った。ＰＢＳＴ溶液で洗浄後、蛍光顕微鏡（カールツァイス社）で撮影を行った（図１）。活性型ＰＡＲ－２（Ｎ１９）は、表皮の最外層に局在しているのに対し、ＰＡＲ－２は、表皮の有棘層～顆粒層に広く分布し、特に顆粒層に多く存在した。
実施例２：活性型ＰＡＲ－２の局在領域の特定
　実施例１と同様に、一次抗体としてヤギ抗ＰＡＲ－２Ｎ１９抗体（Santa Cruz, sc-8206)を用いて、活性型ＰＡＲ－２を検出するとともに、ウサギ抗ＰＡＲ－２Ｈ９９抗体に代えてウサギ抗フィラグリン抗体（Santa Cruz, sc-30229）を用い、二次抗体は同じものを使用して、フィラグリンとの局在を調べた（図２）。フィラグリンは、未脱核細胞の最外層から角層において存在している一方で、活性型ＰＡＲ－２は、未脱核細胞の最外層にのみ局在しており、フィラグリンの局在と完全には一致しなかった。
　実施例１と同様に一次抗体としてヤギ抗ＰＡＲ－２Ｎ１９抗体（Santa Cruz, sc-8206)を用いて、活性型ＰＡＲ－２を検出するとともに、ウサギ抗ＰＡＲ－２Ｈ９９抗体に代えて５００倍希釈マウス抗ＺＯ１－１抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック, 339100）を用い、二次抗体はＡｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を使用して、タイトジャンクションとの局在を調べた。活性型ＰＡＲ－２は、タイトジャンクションの層を含めてその外側に局在することが示された。
実施例３：抗活性型ＰＡＲ－２抗体の特異性の検討
　実施例１と同様に、一次抗体として、ヤギ抗ＰＡＲ－２Ｎ１９抗体（Santa Cruz, sc-8206)及びウサギ抗ＰＡＲ－２Ｈ９９抗体（Santa Cruz, sc-5597)を用い、二次抗体は同じものを使用して、皮膚切片を染色した。ヤギ抗ＰＡＲ－２Ｎ１９抗体をその５倍重量の抗原ペプチド（配列：SLIGKV（配列番号３）を含むN末端部分）（Santa Cruz, sc-8206P）と混合し室温で３０分間処理し、その後遠心した上清をウサギ抗ＰＡＲ－２Ｈ９９抗体と一緒に皮膚切片に添加してインキュベートを行った。撮影結果を図３に示す。抗原ペプチドとインキュベートすることにより、ヤギ抗ＰＡＲ－２Ｎ１９抗体由来の蛍光は消失する一方で、ウサギ抗ＰＡＲ－２Ｈ９９抗体由来の蛍光に変化はなかった（図４）。
実施例４：トリプシン処理による表皮のＰＡＲ－２抗体の活性化
　ＫＡＣ社から入手した５１歳女性の腹部皮膚（手術後４℃保存で７日目）を、ヒト皮膚組織維持用培地（Biopredic社, MIL218）に真皮部分を浸して３７℃で１日器官培養を行った。皮膚上にシリコン接着剤をリング状に形成して、リング内に下記の溶液を適用した：水（Water）、０．０５％ダイズトリプシン阻害剤（SBTI）、５０μＭトリプシン＋０．０５％ダイズトリプシン阻害剤（Try 50μM＋SBTI）、１０μＭトリプシン（Try10μM）、１００μMトリプシン（Try 100μM）。トリプシンはＳｉｇｍａ社製（T-0303)を用い、ダイズトリプシン阻害剤はＳｉｇｍａ社製(T6522)を用いた。皮膚上面に培地がかからないようにして、３７℃５％ＣＯ2雰囲気下で、３０分インキュベートした。水で表面を洗浄し、実施例１と同様に４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定、３０％スクロースに置換後、ＯＣＴブロックを作成し、マイクロトームで６μｍ厚さの切片を作成した。切片を、一次抗体として、３００倍希釈ヤギ抗ＰＡＲ－２Ｎ１９抗体（Santa Cruz, sc-8206)及び３００倍希釈ウサギ抗PAR-2H99抗体（Santa Cruz, sc-5597)のブロッキング溶液中で、１６時間インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄後、二次抗体として、１０００倍希釈のＡｌｅｘａ６４７標識抗ヤギＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック, A21447）及び１０００倍希釈のＡｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック, A21206）のブロッキング溶液で、暗室下で１時間インキュベートを行った。ＰＢＳＴ溶液で洗浄後、共焦点レーザー顕微鏡（ニコン社）で撮影を行った。活性型ＰＡＲ－２（Ｎ１９）の染色強度をNIS-elementsソフトウェアを用いて測定し、グラフ化して示した（図５）。非活性型ＰＡＲ－２（Ｈ９９）について蛍光強度に変化は見られなかった一方で、活性型ＰＡＲ－２（Ｎ１９）はトリプシン処理（１０μＭ、１００μＭ）で用量依存的に蛍光強度が増加する一方、ダイズトリプシン阻害剤の添加により、トリプシンにより増加した蛍光強度が低下した。
実施例５：スクラッチ処理後の皮膚試料における活性型ＰＡＲ－２の抑制
　ＫＡＣ社から入手した４０歳女性の腹部皮膚（手術後７日目）を、ヒト皮膚組織維持用培地（Ｂｉｏｐｒｅｄｉｃ社）培地中で３７℃で１日間培養を行った。皮膚に対し、金属スパチュラを皮膚に当てて、５０往復のスクラッチ処理を行った。スクラッチ処理を行った領域上にシリコン接着剤をリング状に形成して、リング内に下記の溶液を適用した：水（Water）、１％トラネキサム酸（Tranexamic acid： LKT Laboratories社）、０．７％Ｎ－メチル－トランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボキサミド（N-methyl-trans-4-aminomethylcyclohexanecarboxamide hydrochloride；CAS No. 38697-94-8)。皮膚上面に培地がかからないようにして、３７℃５％ＣＯ2雰囲気下で１時間インキュベートし、水で表面を洗浄して試料を得た。スクラッチ処理直後の試料及び溶液を適用した試料を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定、３０％スクロースに置換後、ＯＣＴブロックを作成し、マイクロトームで６μｍ厚さの切片を作成した。切片を、一次抗体として、３００倍希釈ヤギ抗ＰＡＲ－２Ｎ１９抗体（Santa Cruz, sc-8206)及び３００倍希釈ウサギ抗ＰＡＲ－２Ｈ９９抗体（Santa Cruz, sc-5597)のブロッキング溶液中で、１６時間インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄後、二次抗体として、１０００倍希釈のＡｌｅｘａ６４７標識抗ヤギＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック, A21447）及び１０００倍希釈のＡｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック, A21447）のブロッキング溶液で、暗室下で１時間インキュベートを行った。ＰＢＳＴ溶液で洗浄後、共焦点レーザー顕微鏡（ニコン社）で撮影を行った。活性型ＰＡＲ－２（Ｎ１９）の蛍光画像を撮影した（図６Ａ）。染色画像について、活性型ＰＡＲ－２（Ｎ１９）の蛍光強度をNIS-elementsソフトウェア（ニコン社製）を用いて測定し、グラフ化して示した（図６Ｂ）。非活性型ＰＡＲ－２（Ｈ９９）について蛍光強度に変化は見られなかった。スクラッチ処理の直後は、活性型ＰＡＲ－２の蛍光強度は低いものの、スクラッチ処理後１時間で蛍光強度が大幅に増加した。一方で、トラネキサム酸及びＮ－メチル－トランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボキサミドを適用した場合、スクラッチ処理により増加する活性型ＰＡＲ－２を抑えることができ、特にＮ－メチル－トランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボキサミドでは、スクラッチ処理直後のレベルまで抑制することができ、これらの成分をＰＡＲ－２活性化抑制剤としてスクリーニングできた。

Claims (18)

  1. 　活性型ＰＡＲ－２のＮ末端抗原ペプチドに結合する抗活性型ＰＡＲ－２抗体を用いて、皮膚試料における表皮の活性型ＰＡＲ－２を検出することを含む、表皮状態の評価方法。
  2. 　前記抗活性型ＰＡＲ－２抗体が、細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位が切断された活性型ＰＡＲ－２に結合する一方で、細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位が切断されていない非活性型ＰＡＲ－２には結合しない、請求項１に記載の評価方法。
  3. 　前記非活性型ＰＡＲ－２が、配列番号１の２６～３６位のＮ末端アミノ酸を含む、請求項２に記載の評価方法。
  4. 　前記活性型ＰＡＲ－２が、配列番号１の少なくとも３６位までのＮ末端のアミノ酸を欠如する、請求項１～３のいずれか一項に記載の評価方法。
  5. 　前記活性型ＰＡＲ－２の検出量が高い場合に、表皮が荒れ状態であると評価する、請求項１～４のいずれか一項に記載の評価方法。
  6. 　表皮の荒れ状態とは、炎症状態、肌荒れ、バリア機能低下、かゆみ、赤み、乾燥からなる群から選ばれる少なくとも１の表皮状態を決定する、請求項５に記載の評価方法。
  7. 　活性型ＰＡＲ－２の検出が、以下の：
    　前記皮膚試料を前記抗活性型ＰＡＲ－２抗体と接触させる工程、
    　標識付きの二次抗体を皮膚試料と接触させる工程、及び
    　皮膚試料において標識の検出強度を決定する工程
    を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の評価方法。
  8. 　皮膚試料において候補物質を適用する工程、
    　候補物質が適用された皮膚試料において、活性型ＰＡＲ－２のＮ末端抗原ペプチドに結合する抗活性型ＰＡＲ－２抗体により、活性型ＰＡＲ－２を検出する工程、及び
    　活性型ＰＡＲ－２の検出強度を低下させる候補物質をＰＡＲ－２活性化抑制剤と決定する工程
    を含む、ＰＡＲ－２活性化抑制剤のスクリーニング方法。
  9. 　皮膚試料において、スクラッチ処理を行う工程をさらに含み、スクラッチ処理がされた皮膚試料に候補物質が適用される、請求項８に記載のスクリーニング方法。
  10. 　前記ＰＡＲ－２活性化抑制剤が、表皮状態改善剤である、請求項８又は９に記載のスクリーニング方法。
  11. 　皮膚試料において候補物質を適用する工程、
    　候補物質が適用された皮膚試料において、活性型ＰＡＲ－２のＮ末端抗原ペプチドに結合する抗活性型ＰＡＲ－２抗体により、活性型ＰＡＲ－２を検出する工程、及び
    　活性型ＰＡＲ－２の検出強度を増加させる候補物質をＰＡＲ－２活性化促進剤と決定する工程
    を含む、ＰＡＲ－２活性化促進剤のスクリーニング方法。
  12. 　前記ＰＡＲ－２活性化促進剤が、表皮状態悪化物質である、請求項１１に記載のスクリーニング方法。
  13. 　活性型ＰＡＲ－２を検出する工程が、
    　皮膚試料を前記抗活性型ＰＡＲ－２抗体と接触させる工程、及び
    　標識付き二次抗体を接触させ、標識を検出する工程、
    　を含む、請求項８～１２のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
  14. 　前記抗活性型ＰＡＲ－２抗体が、細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位が切断された活性型ＰＡＲ－２に結合する一方で、細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位が切断されていない非活性型ＰＡＲ－２には結合しない、請求項８～１３のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
  15. 　前記非活性型ＰＡＲ－２が、配列番号１の２６～３６位のＮ末端アミノ酸を有する、請求項１４に記載のスクリーニング方法。
  16. 　前記活性型されたＰＡＲ－２が、配列番号１の少なくとも３６位までのＮ末端のアミノ酸を欠如している、請求項８～１５のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
  17. 　以下の：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ｛式中、Ｒ1およびＲ2は同一または異なり、水素原子、炭素数１～18の直鎖状または分岐状アルキル基、炭素数５～８のシクロアルキル基、ベンジル基または下記式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （但し、Ｘは低級アルキル基、低級アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、ハロゲン原子を示し、ｎ＝０～３である）をそれぞれ示す｝
    　で表される化合物、又はその塩を含む、ＰＡＲ－２活性化抑制剤。
  18. 　Ｎ－メチル－トランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボキサミド又はその塩を含む、請求項１７に記載のＰＡＲ－２活性化抑制剤。
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