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WO2021060127A1 - リポポリサッカライドの製造方法 - Google Patents

リポポリサッカライドの製造方法 Download PDF

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WO2021060127A1
WO2021060127A1 PCT/JP2020/035204 JP2020035204W WO2021060127A1 WO 2021060127 A1 WO2021060127 A1 WO 2021060127A1 JP 2020035204 W JP2020035204 W JP 2020035204W WO 2021060127 A1 WO2021060127 A1 WO 2021060127A1
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WO
WIPO (PCT)
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lps
lipopolysaccharide
molecular weight
genus
producing
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2020/035204
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English (en)
French (fr)
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源一郎 杣
裕之 稲川
千恵 河内
恭平 松下
亮 橋野
文▲セイ▼ 李
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nitto Denko Corp
Biomedical Research Group Inc
Macrophi Inc
Original Assignee
Nitto Denko Corp
Biomedical Research Group Inc
Macrophi Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to JP2021548854A priority patent/JP7678419B2/ja
Priority to EP20867839.1A priority patent/EP4036245B1/en
Priority to US17/761,373 priority patent/US20220372536A1/en
Priority to EP25181745.8A priority patent/EP4628527A3/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/32—Bonded phase chromatography
    • B01D15/325—Reversed phase
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • B01J20/287—Non-polar phases; Reversed phases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing lipopolysaccharide.
  • Lipopolysaccharide (hereinafter, also referred to as LPS) is a complex compound consisting of lipids and sugars present on the outer membrane surrounding peptidoglycan on the cell wall of Gram-negative bacteria such as Escherichia coli, Salmonella, and Bordetella pertussis, and is an endotoxin (endotoxin). ) Is known as an active ingredient (Non-Patent Document 1).
  • the basic structure of the LPS is composed of three components: lipid A having a specific lipid, an oligosaccharide covalently bound to the lipid A, and an O-specific polysaccharide (Non-Patent Document 2). It is known that the structure of LPS differs depending on the type of bacteria from which it is derived.
  • LPS is known as endotoxin and is known to activate immune system cells and raise inflammatory cytokines. Recently, the function of LPS to activate immune system cells has attracted attention. Therefore, innate immunity research using LPS and research on biological defense function have been actively conducted. Among them, LPS derived from Pantoea has abundant eating experience in humans, and it has been reported that it can be used for health foods, vaccine adjuvants, pharmaceuticals, etc., and can be said to be a particularly useful LPS.
  • This method includes precipitation of LPS by addition of acetone and water, and recovery of LPS by centrifugation or filtration (Non-Patent Document 3). Further, in the SAN method, after extraction with an aqueous solution of trichloroacetic acid, extraction with an aqueous solution of phenol is performed to obtain LPS (Non-Patent Document 4). The Chen method also includes a series of methanol sedimentation steps following LPS extraction with a mixture of chloroform and methanol (CM) (Non-Patent Document 5).
  • CM chloroform and methanol
  • solvent mixtures phenol, chloroform, petroleum ether, trichloroacetic acid, etc.
  • Chloroform is also used in the extraction process in the Chen method, which poses environmental, health and safety concerns, and the Chen method produces a CM phase rich in LPS-phospholipids, which is sufficient. Multiple settling steps are required to obtain pure LPS, which requires manufacturing time and cost.
  • Patent Document 1 alcohol, an organic solvent and water are used in place of the solvent mixture (PCP) of phenol, chloroform and petroleum ether used in the Galanos method in the step of extracting LPS from Gram-negative bacteria.
  • PCP solvent mixture
  • an organic solvent that can be selected from the group of chloroform, alkane, toluene and petroleum ether is used as the organic solvent, and there are environmental, health and safety concerns in this production method as well. Yes, it is not suitable for large-scale production.
  • the conventional LPS manufacturing method includes a manufacturing process having a large burden on the environment and occupational health.
  • the conventional LPS manufacturing method has a risk of environmental conservation in addition to the risk of occupational health management of work environment management, work management and health management.
  • the LPS manufacturing facility requires the above-mentioned risk countermeasure equipment, and the manufacturing cost has also increased.
  • Pantoea (hereinafter, also referred to as Pantoea) -derived LPS, which is useful for health foods, vaccine adjuvants, and pharmaceuticals, has been reported to have various usefulness as described above, and demand is expected to increase. Is done. Therefore, there has been a particular demand for the development of a production method suitable for large-scale production without using an organic solvent in the extraction process.
  • a method for producing LPS derived from Pantoea there is only a report of a method combining extraction with hot phenol and purification of an anion exchange column (Non-Patent Document 6), and since this method also uses phenol, it is a large scale. There were health and safety concerns in producing.
  • Patent Document 2 As an example in which a harmful organic solvent is not used, in Patent Document 2, hot water extraction is performed for acetobacter, gluconic acid, xanthomonas, zymomonas, or Enterobacter. Is disclosed. However, the lipopolysaccharide (LPS) obtained by the production method contains a large amount of impurities other than LPS and is merely an extraction operation for obtaining an extract having low LPS purity, and cannot be said to be a practical production method of LPS. Further, Patent Document 2 separately discloses a method for producing LPS, which is a method combining hot phenol extraction and nucleolytic enzyme treatment. That is, Patent Document 2 does not disclose or suggest a method for producing LPS without using a harmful organic solvent.
  • LPS lipopolysaccharide
  • the extracted and purified product of LPS is usually a mixture of a low molecular weight component and a high molecular weight component, and when the proportion of the low molecular weight LPS is increased, the safety is enhanced and the physiological activity (cytokine inducing ability) is also improved. It has been reported (Patent Document 3, Non-Patent Document 7). Therefore, there has been a demand for LPS containing a larger amount of low molecular weight LPS than LPS produced by the conventional method and a method for producing the same.
  • the present invention is a method for producing lipopolysaccharide by extracting and purifying lipopolysaccharide from a gram-negative bacterium, and by extracting the gram-negative bacterium with hot water, an extract containing the lipopolysaccharide can be obtained.
  • the reverse phase liquid chromatography comprises a first step of obtaining and a second step of obtaining lipopolysaccharide by purifying the extract or a solution containing LPS in the extract using reverse phase liquid chromatography.
  • the reversed-phase column in the imaging is a method for producing lipopolysaccharide, which comprises a filler composed of a material having a functional group having 1 to 8 carbon atoms.
  • the filler is preferably composed of a material having a functional group having 2 to 6 carbon atoms.
  • the filler is preferably composed of a material having a functional group having 2 to 4 carbon atoms.
  • the filler is preferably composed of a material having a functional group having 4 carbon atoms.
  • the functional group is preferably an alkyl group.
  • the temperature of the hot water in the first step is preferably 50 to 150 ° C.
  • the temperature of the hot water in the first step is preferably 50 to 99 ° C.
  • the temperature of the hot water in the first step is preferably 70 to 99 ° C.
  • the temperature of the hot water in the first step is preferably 85 to 95 ° C.
  • the Gram-negative bacterium is preferably selected from the group consisting of the genus Escherichia, the genus Salmonella, the genus Pantoea, the genus Acetobacter, the genus Zymomonas, the genus Xanthomonas and the genus Enterobacter, and the genus Roseomonas and the genus Rhodobactor.
  • the Gram-negative bacteria preferably belong to the genus Pantoea.
  • the present invention is also a lipopolysaccharide produced by the production method of the present invention. Further, the lipopolysaccharide of the present invention is preferably obtained from the above-mentioned Gram-negative bacteria.
  • the lipopolysaccharides of the present invention are low molecular weight lipopolysaccharide having a molecular weight of 2000 to 20000 measured by the SDS-PAGE method and high molecular weight lipo having a molecular weight of more than 20000 and 100,000 or less measured by the SDS-PAGE method.
  • the content of the low molecular weight lipopolysaccharide is 80% or more with respect to the total amount of the low molecular weight lipopolysaccharide and the high molecular weight lipopolysaccharide including polysaccharide.
  • the lipopolysaccharide of the present invention is obtained by dividing the lipopolysaccharide quantitative value (E) by the ELISA method by the lipopolysaccharide quantitative value (L) by the Limulus test (endpoint-colorimetric method) (E / L ratio). ) Is preferably 1.0 or less.
  • E lipopolysaccharide quantitative value
  • L lipopolysaccharide quantitative value
  • the method for producing lipopolysaccharide of the present invention it is possible to provide a method for producing lipopolysaccharide that contributes to occupational health and environmental protection and is suitable for large-scale production.
  • Contribution to the above-mentioned occupational health and environmental conservation means that lipopolysaccharide can be extracted without using an organic solvent having a high environmental load, which poses environmental, health and safety risks. Can be improved.
  • the risk of occupational health management of work environment management, work management and health management in addition to the risk of occupational health management of work environment management, work management and health management, the risk of environmental conservation can be reduced, so the above risk countermeasure equipment in the LPS manufacturing facility can be reduced, and the whole Manufacturing cost can be suppressed.
  • lipopolysaccharide having high purity and high molecular weight lipopolysaccharide can be obtained, so that it is possible to provide lipopolysaccharide having high safety and physiological activity.
  • FIG. 1 is an SDS-PAGE (silver staining method) electrophoresis chart.
  • the above-mentioned solvent having a high environmental load is an organic solvent in the first step of obtaining an extract containing LPS, and further, in the entire manufacturing process excluding the first step, chemical substance emission grasp control is performed. It is a substance designated as a Class 1 designated chemical substance in the Acceleration Law and can be used as an organic solvent.
  • the high-purity LPS is an LPS in which LPS can be a main component as compared with proteins and nucleic acids, that is, the content of LPS (the content (weight) of proteins and nucleic acids from the weight of the obtained LPS). It means LPS in which (the remaining ratio obtained by subtracting) is 60% by weight or more. Further, in the present specification, "purity” means the purity of LPS and is expressed in% by weight. The purity of LPS is preferably 70% by weight or more, more preferably 80% by weight or more, still more preferably 90% by weight or more.
  • low molecular weight lipopolysaccharide (hereinafter, also referred to as low molecular weight LPS) is developed into a constituent component by SDS-PAGE (silver staining method), and the molecular weight obtained by using the protein size marker mobility as an index is obtained.
  • high molecular weight lipopolysaccharide (hereinafter, also referred to as high molecular weight LPS) is an LPS having a molecular weight of more than 20000 and 100,000 or less obtained by the above measurement.
  • LPS containing a high content of low molecular weight lipopolysaccharide is from one that does not substantially contain high molecular weight lipopolysaccharide (high molecular weight LPS) to a high content even if it contains high molecular weight LPS. It means that the content of the low molecular weight LPS with respect to the total of the molecular weight LPS and the low molecular weight LPS is 80% or more. LPS having a low molecular weight LPS content of 80% or more of the total of the high molecular weight LPS and the low molecular weight LPS has a higher content of the low molecular weight LPS as compared with the LPS purified by the conventional method.
  • LPS is developed into components by SDS-PAGE (silver staining method), the molecular weight is determined using the protein size marker mobility as an index, and the total image brightness of SDS-PAGE images (after silver staining) is used.
  • SDS-PAGE silver staining method
  • the content of the constituents was determined, LPS containing low molecular weight lipopolysaccharide having a molecular weight of 2000 to 20000 and high molecular weight lipopolysaccharide having a molecular weight of more than 20000 and 100,000 or less was subjected to silver staining by SDS-PAGE.
  • the content of the low molecular weight lipopolysaccharide is 80% or more with respect to the total amount of the low molecular weight lipopolysaccharide and the high molecular weight lipopolysaccharide.
  • LPS having a low molecular weight LPS content of 80% or more is referred to as LPS having a high molecular weight LPS content.
  • the yield of lipopolysaccharide applicable to large-scale production means lipopolysaccharide having a yield of 4 g or more of lipopolysaccharide produced from 1 kg of bacterial cell pellets.
  • the yield of lipopolysaccharide produced from 1 kg of bacterial cell pellets can be measured by using an HPLC method.
  • ABS means "A or more and B or less”.
  • the method for producing lipopolysaccharide is a method for producing lipopolysaccharide that extracts and purifies lipopolysaccharide from a gram-negative bacterium, and by extracting the gram-negative bacterium with hot water.
  • the reverse phase column in the reverse phase liquid chromatography including the steps is characterized by having a filler composed of a material having a functional group having 1 to 8 carbon atoms.
  • LPS may be an extract from the Gram-negative bacterial cell wall or a variant thereof, or may be a synthetic product.
  • the LPS obtained by the method for producing LPS of the present invention is an extract and purified product from the cell wall of Gram-negative bacteria.
  • Examples of the gram-negative bacteria include Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Haemophilus, Pseudomonas, Legionella, Borderella, Brucella , Plesiomonas genus, Prophyromonas spp., Pantoea sp., Agrobacterium sp., Stenortophomonas spp., Serratia spp., Leclercia genus, Rahnella genus, Acidicaldus genus, Acidiphilium genus, Acidisphaera genus, Acidocella genus, Acidomonas genus, Asaia genus, Belnapia genus, Craurococcus genus, Gluconacetobacter genus, Gluconobacter genus, Kozakia genus, Leahibacter genus, Muricoccus genus, Neoasaia genus, Ole
  • Gram-negative bacteria are selected from the genus Escherichia, the genus Salmonella, the genus Pantoea (Pantoea), the genus Acetobacter, the genus Zymomonas, the genus Xanthomonas, the genus Enterobacter, the genus Roseomonas, and the genus Rhodobac. It is preferable to have. This is because they have been contained in many foods and Chinese herbs since ancient times, and their safety to the living body is guaranteed. In particular, Pantoea is currently used as a health food, and LPS extracted and purified from the genus Pantoea can be said to be safer and more effective for its use.
  • Gram-negative bacteria are more preferably of the genus Pantoea.
  • the production method of the present invention provides a production method that contributes to occupational health and environmental conservation in the production of Pantoea-derived LPS, for which demand is expected to increase, and Pantoea-derived LPS having high purity and high content of low molecular weight LPS. it can.
  • the cell wall of Gram-negative bacteria is denatured and removed, and LPS in the cell wall and intracellular proteins and nucleic acids of Gram-negative bacteria are extracted. Then, an extract containing LPS is obtained.
  • the temperature of the hot water in the first step is preferably 50 to 150 ° C. If the temperature of the hot water is higher than 150 ° C, thermal denaturation of the LPS extracted due to the high temperature may occur, and if it is lower than 50 ° C, the cell wall of the Gram-negative bacteria is denatured. This is because LPS may not be sufficiently extracted.
  • the temperature of the hot water is more preferably 50 to 130 ° C., further preferably 50 to 99 ° C., even more preferably 70 to 99 ° C., and most preferably 85 to 95 ° C. This is because LPS can be extracted efficiently. This is also because extraction at normal pressure is possible.
  • the time for extracting with the hot water is preferably 10 to 120 minutes. This is because if the extraction time exceeds 120 minutes, thermal decomposition of LPS may occur, and if it is less than 10 minutes, LPS may not be sufficiently extracted.
  • the optimum conditions for the temperature and time of hot water extraction in the first step can be appropriately selected from the above-mentioned hot water temperature and extraction time depending on the type of Gram-negative bacteria used.
  • the hot water temperature and the extraction time in the extraction of LPS can be appropriately selected within the above ranges, but the conditions of 70 to 99 ° C. for 10 to 120 minutes are more preferable. Extracts hot water at 85 to 95 ° C. for 20 to 30 minutes.
  • the hot water extraction in the first step may be carried out only once, or may be carried out a plurality of times at the same temperature or different temperatures.
  • the water used in the hot water extraction is not particularly limited, and water normally used in this field can be used.
  • hot water extraction can be carried out using methods and devices generally used in the present technology, and can be carried out under normal pressure, reduced pressure or pressurization.
  • a surfactant, a chelating agent, an organic acid salt, an inorganic salt or the like may be added to the water used for hot water extraction.
  • the first step and the second step may be continuously performed, and another step may be performed between the first step and the second step. It may be included.
  • the extract obtained in the first step is purified in the second step.
  • the solution containing LPS in the extract obtained in the first step is purified in the second step.
  • steps performed between the first step and the second step include, for example, ultrafiltration, enzyme treatment, ethanol precipitation, dialysis, solid phase extraction and the like, and among them, obtained in the first step. It is preferable to perform ultrafiltration on the obtained extract. Reverse-phase liquid chromatography in the second step by concentrating the LPS in the extract by performing ultrafiltration and at the same time removing impurities of low molecular weight (those that pass through the ultrafiltration membrane 200,000 daltons). This is because purification using the above can be performed efficiently.
  • the extract obtained in the first step is preferably ultrafiltered once or multiple times. Since LPS forms micelles and has a large apparent molecular weight, the molecular weight does not directly correspond to the molecular weight of the cutoff value of the ultrafiltration membrane described above.
  • the ultrafiltration membrane used in the above ultrafiltration has a cut-off molecular weight. It is 5,000 to 200,000 daltons, preferably 8,000 to 100,000 daltons. More preferably, it is 10,000 to 50,000 daltons.
  • the molecular weight cut-off is a term representing the membrane properties defined in JIS K 3802 (membrane term).
  • the reverse phase column of the reverse phase liquid chromatography used in the second step has a filler composed of a material having a functional group having 1 to 8 carbon atoms.
  • a reverse phase column having a filler composed of a material having a functional group having a specific carbon number other than LPS remaining in the extract obtained in the first step or the solution containing LPS in the extract. This is because impurities can be removed and LPS with higher purity can be purified. Further, it is possible to purify LPS having a low molecular weight and a high content of LPS.
  • the filler is preferably composed of a material having a functional group having 2 to 6 carbon atoms, more preferably composed of a material having a functional group having 2 to 4 carbon atoms, and having 4 carbon atoms. It is more preferably composed of a material having a functional group.
  • the functional group is preferably an alkyl group. This is because impurities other than LPS remaining in the extract obtained in the first step can be removed to purify LPS with higher purity. Further, it is possible to sufficiently purify LPS while suppressing the cost of the equipment used in the production method of the present invention.
  • the filler is preferably composed of a material having an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, more preferably composed of a material having an alkyl group having 2 to 6 carbon atoms, and having 2 to 6 carbon atoms. It is more preferably composed of a material having an alkyl group of 4, and most preferably composed of a material having an alkyl group having 4 carbon atoms. That is, the filler is most preferably composed of a material having a butyl group.
  • the material (base material) constituting the filler is preferably silica gel. This is because impurities other than LPS remaining in the extract obtained in the first step can be removed to purify LPS with higher purity. Further, it is possible to sufficiently purify LPS while suppressing the cost of the equipment used in the production method of the present invention.
  • the filler is preferably silica gel having a functional group having 1 to 8 carbon atoms, more preferably silica gel having a functional group having 2 to 6 carbon atoms, and having a functional group having 2 to 4 carbon atoms. Silica gel is more preferable, and silica gel having a functional group having 4 carbon atoms is most preferable.
  • the material (base material) constituting the filler is preferably silica gel having an alkyl group. This is because impurities other than LPS remaining in the extract obtained in the first step can be removed to purify LPS with higher purity. Further, it is possible to sufficiently purify LPS while suppressing the cost of the equipment used in the production method of the present invention.
  • the filler is preferably silica gel having an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, more preferably silica gel having an alkyl group having 2 to 6 carbon atoms, and having an alkyl group having 2 to 4 carbon atoms. Silica gel is more preferable, and silica gel having an alkyl group having 4 carbon atoms is most preferable. That is, the filler is most preferably silica gel having a butyl group.
  • the filler preferably has an alkyl group as a functional group and silica gel as a material, and a configuration in which the above configurations are appropriately combined can be adopted.
  • the second step may include a pretreatment for the extract obtained in the first step or a solution containing LPS in the extract, which is treated by reverse phase liquid chromatography.
  • a pretreatment an operation suitable for separation by reverse phase liquid chromatography, which is usually used in this field, can be performed. Specifically, a surfactant is added to the extract obtained in the first step or the solution containing LPS in the extract, solubilization treatment of LPS is performed, and this is purified by reverse phase liquid chromatography. You may do it. This is because the efficiency of separation by reverse phase liquid chromatography can be improved.
  • the second step preferably includes the solubilization treatment described above as a pretreatment for reverse phase liquid chromatography.
  • the above-mentioned surfactant is preferably an ionic surfactant. This is because the solubilization effect of LPS is high.
  • the ionic surfactant is not particularly limited, and for example, an alkylammonium salt, a bile acid, a fusidic acid, an amino acid, an oligopeptide or a fatty acid conjugate of a polypeptide, an amino acid, a glyceride ester of an oligopeptide, a glyceride ester of a polypeptide, etc.
  • Acyllactilate monoglyceride monoacetylated tartrate ester, monoglyceride diacetylated tartrate ester, diglyceride monoacetylated tartrate ester, diglyceride diacetylated tartrate ester, succinylated monoglyceride, monoglyceride citrate ester, diglyceride citrate ester, Examples thereof include alginic acid, propylene glycol alginate, lecithin, hydride lecithin, lysolecithin, hydride lysolecithin, lysophospholipids, phospholipids, alkylsulfate salts, fatty acids, and pharmacologically acceptable salts thereof. Bile acids and / or pharmaceutically acceptable salts thereof are preferred. This is because the solubilizing effect of LPS is particularly high.
  • Examples of the bile acid and its pharmacologically acceptable salt include chenodeoxycholic acid (CDCA), ursodeoxycholic acid deoxycholic acid (UDCA), cholic acid, dehydrocholic acid, deoxycholic acid, glucolic acid, and glycolic acid. , Glycodeoxycholic acid, taurocholic acid, taurodeoxycholic acid, tauro-24,25-sodium dihydro-fushidic acid, glycodihydrofushidic acid, and pharmacologically acceptable salts thereof (eg, sodium salt), etc. Can be mentioned.
  • the surfactant is preferably deoxycholic acid and / or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • the surfactant is preferably deoxycholic acid and / or a salt thereof. This is because the solubilizing effect of LPS is particularly high.
  • the concentration of the extract after the first step or the solution containing LPS in the extract is adjusted and the pH is adjusted.
  • Various pretreatments such as adjustment, ion intensity adjustment, addition of organic solvent, filtration, dialysis, etc., which are generally performed on a sample solution of reverse phase liquid chromatography, may be appropriately performed. This is because the efficiency of separation by reverse phase liquid chromatography can be improved.
  • the second step may include post-treatment of the separation liquid containing LPS obtained by using reverse phase liquid chromatography.
  • an operation suitable for the separation liquid of reverse phase liquid chromatography can be performed, and as the operation suitable for the separation liquid, a separation liquid treatment usually used in the technical field to which the present invention belongs is appropriately combined.
  • distillation and / or ultrafiltration it is preferable to perform distillation and / or ultrafiltration, and it is more preferable to perform distillation and ultrafiltration. This is because impurities contained in the mobile phase of the reverse phase liquid chromatography in the second step can be removed.
  • the method for producing LPS in one embodiment of the present invention may include a step of concentrating LPS purified in the second step and a step of washing.
  • the concentration step and the washing step can be carried out by appropriately combining treatments usually used in the technical field to which the present invention belongs.
  • the method for producing LPS in one embodiment of the present invention may include a step (drying step) of drying the LPS purified in the second step.
  • the LPS purified in the second step often contains a volatile organic solvent contained in the mobile phase of the reverse phase liquid chromatography in the second step and a solvent such as water. Therefore, in the drying step, a step of removing the volatile organic solvent contained in the mobile phase of the reverse phase liquid chromatography in the second step by a dry distillation method (evaporation) (organic solvent removing step) and / or freeze-drying. It is desirable to include a step of completely removing a solvent such as water (solvent removal step). By having such a drying step, the handleability of LPS can be improved.
  • the above-mentioned method for producing LPS of the present invention can be suitably used for large-scale production.
  • the yield of LPS obtained from the method for producing LPS of the present invention is preferably 4 g or more of lipopolysaccharide produced from 1 kg of cell pellets of Gram-negative bacteria.
  • the LPS obtained from the method for producing LPS of the present invention can be quantified by using an HPLC method.
  • the present invention is a lipopolysaccharide produced by the production method of the present invention described above.
  • the lipopolysaccharide produced by the production method of the present invention is a high-purity LPS having a purity of 60% by weight or more, preferably a purity of 70% by weight or more, and a purity of 80% by weight or more. Is more preferable, and the purity is further preferably 90% by weight or more.
  • lipopolysaccharide is preferably made from the Gram-negative bacteria described above.
  • the Gram-negative bacterium is selected from the group consisting of Escherichia, Salmonella, Pantoea, Acetobacter, Zymomonas, Xanthomonas and Enterobacter, Roseomonas and Rhodobactor, preferably from the Pantoea group. It is more preferably a genus. This is because they have been contained in many foods and Chinese herbs since ancient times, and their safety to the living body is guaranteed.
  • Pantoea is currently used as a health food, and LPS extracted and purified from the genus Pantoea can be said to be safer and more effective for its use.
  • Lipopolysaccharides which are another embodiment of the present invention, are low molecular weight lipopolysaccharide having a molecular weight of 2000 to 20000 measured by the SDS-PAGE method, and lipopolysaccharide having a molecular weight of more than 20000 and 100,000 or less measured by the SDS-PAGE method. It is preferable that the content of the low molecular weight lipopolysaccharide is 80% or more with respect to the total amount of the low molecular weight lipopolysaccharide and the high molecular weight lipopolysaccharide including a certain high molecular weight lipopolysaccharide. LPS having a low molecular weight LPS content of 80% or more is extremely safe and has excellent biological activity, and is particularly useful.
  • the molecular weight of LPS is a value obtained by developing the constituent components by SDS-PAGE (silver staining method) and determining the molecular weight using the mobility of the protein size marker as an index.
  • the content ratio of low molecular weight LPS to high molecular weight LPS is a value obtained by determining the content of constituent components based on the total image brightness of SDS-PAGE images (after silver staining).
  • the lipopolysaccharide which is another embodiment of the present invention, is obtained by dividing the lipopolysaccharide quantitative value (E) by the ELISA method by the lipopolysaccharide quantitative value (L) by the Limulus test (endpoint-colorimetric method) (L).
  • the E / L ratio is preferably 1.0 or less.
  • the E / L ratio is a value larger than 0.
  • the lipopolysaccharide quantified value (E) by the ELISA method and the lipopolysaccharide quantified value (L) by the Limulus test (endpoint-colorimetric method) are measured by, for example, the following methods.
  • the quantification of LPS by the ELISA method is performed in the sample by the ELISA method using, for example, a sugar chain-specific antibody of the LPS to be measured (for example, IP-PA1 sugar chain-specific antibody, manufactured by Natural Immunology Applied Giken Co., Ltd.). It is determined by measuring the LPS content (E) ( ⁇ g / mg). Specifically, the ELISA measurement can be performed by the following procedure.
  • 34-G2 immobilized antibody: antibody against O antigen polysaccharide of Lot.201107-7, IP-PA1 manufactured by Natural Immunology Applied Giken Co., Ltd.
  • PBS PBS
  • LPS concentration ( ⁇ g / mL) in the sample solution from the absorbance of the sample solution.
  • LPS content in sample (E) ( ⁇ g / mg) by dividing the LPS concentration in the sample solution by the sample concentration in the sample solution (mg / mL) (calculated from the sample weighing value and solution volume at the time of preparation).
  • Ask for. The detection limit of the ELISA method by this measurement method is 1.6 ng / mL.
  • the quantification of LPS by the Limulus test is determined by measuring the LPS content (L) ( ⁇ g / mg) in the sample using, for example, an LPS-specifically measurable Limulus measurement kit. Specifically, the Limulus test can be performed by the following procedure.
  • LPS quantification method by Limulus test endpoint-colorimetric method
  • endpoint-colorimetric method A sample to be measured by the endpoint-colorimetric method using a microplate using an LPS-specific measurable Limulus measurement kit (for example, Endospecy ES-50M set, manufactured by Seikagaku Corporation) according to the attached instructions.
  • the LPS content (L) ( ⁇ g / mg) in the LPS is measured.
  • CSE (10 ng / vial) (manufactured by Seikagaku Corporation) is used as an endotoxin standard product.
  • the ratio (E / L ratio) can be determined based on the LPS content (E and L) determined by the above two methods.
  • the LPS is structurally composed of an O-antigen polysaccharide, a core polysaccharide, and a lipid A moiety.
  • the molecular weight of the lipid A portion in one molecule of LPS does not differ significantly between the LPS types.
  • the molecular weight of the core polysaccharide portion in one molecule of LPS is also not significantly different between LPS types.
  • the O-antigen polysaccharide moiety in the LPS molecule has a repeating structure, and the degree of repetition varies greatly depending on the LPS type.
  • the molecular weight of the O-antigen polysaccharide portion differs depending on the type of LPS, and the molecular weight of the LPS differs.
  • the molecular weight of LPS is large, and when the number of repetitions of the O-antigen polysaccharide moiety is small, the molecular weight of LPS is small.
  • LPS extracted from Gram-negative bacteria is usually a mixture of LPS having different molecular weights.
  • the amount of LPS (E) measured by the ELISA method is the amount of LPS determined based on the amount of the antibody that recognizes and binds to the O antigen polysaccharide in the LPS structure. If the number of repetitions of the O-antigen polysaccharide in the LPS structure is small, or if there is no O-antigen polysaccharide (that is, if the molecular weight of LPS is small), an antibody binding site of sufficient size cannot be secured in the LPS molecule. The antibody cannot bind to LPS, and the measured value of the amount of LPS by the ELISA method becomes a small value.
  • the amount of LPS (L) measured in the Limulus test is the amount of LPS determined based on the reaction activity of the lipid A structure in the LPS structure, and therefore, regardless of the proportion or presence of O antigen polysaccharide in the LPS structure. , The measured value corresponding to the number of moles of LPS in the measurement sample is obtained. Therefore, when a constant mass LPS sample (mixture of LPS having different molecular weights) is measured by the ELISA method and the endotoxin method to determine the LPS content (E and L), if the E / L ratio is large, it is included in the measurement sample. LPS means that a large amount of LPS having a large molecular weight is contained, and if the E / L ratio is small, it means that LPS contained in the measurement sample contains a large amount of one having a small molecular weight.
  • the LPS obtained by the production method of the present invention preferably has the above (E / L ratio) of more than 0 and 1.0 or less. As a result, such LPS has a higher content ratio of low molecular weight LPS as compared with LPS (IP-PA1) produced by the conventional method.
  • LPS LPS having high lipophilicity (LPS having a small amount of hydrophilic sugar chains and a high proportion of lipid A moiety) is produced. , It is highly probable that it was selectively recovered. That is, LPS containing a low molecular weight LPS and a high content can be produced by including a purification step by reverse phase chromatography. Therefore, since the low molecular weight LPS has a high content, LPS having high safety and physiological activity (cytokine inducing ability) can be obtained.
  • Preculture 100 mL each of preculture culture medium (LB medium: 1% trypton (Nacalai Tesque, special reagent for microbial culture), 0.5% yeast extract (Nacalai Tesque, microbial culture) in 250 mL baffle flasks (10) ), 1% sodium chloride (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., special grade)) was dispensed and sterilized in an autoclave (HV-50 manufactured by HIRAYAMA) at 121 ° C. for 15 minutes.
  • HV-50 manufactured by HIRAYAMA autoclave
  • 10% magnesium sulfate heptahydrate (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., special grade) was aseptically added to the above main culture medium so as to be 0.04%. Further, 500 mL of the above preculture solution was aseptically poured and inoculated to carry out the main culture.
  • the conditions for the main culture were a culture temperature of 30 ° C., a stirring speed of 300 rpm, an aeration rate of 18 to 20 L / min, and a pH of 6.8 to 7.2.
  • the culture solution was collected 16 hours after the start of the culture. Two sets of the above-mentioned main culture operations of the 10 L medium scale were carried out in parallel, and they were homogenized (mixed) and then subjected to the next cell recovery operation.
  • the above homogenized main culture solution is transferred to a 1 L centrifuge tube (20 tubes), centrifuged at 4 ° C., 8000 rpm, and 20 minutes (high-speed cooling centrifuge: 7780 manufactured by KUBOTA), and then the supernatant is prepared. It was removed and the bacterial cell pellets were collected as a precipitate (total amount of bacterial cell pellets 260 g). The obtained bacterial cell pellet was cryopreserved at ⁇ 30 ° C.
  • LPS was extracted and purified by the method of Example or Comparative Example for the cell pellet (cryopreserved product) of Pantoea agglomerance obtained by the above method.
  • Hot water extraction 78 g of Pantair agglomerans cell pellets obtained by the above-mentioned preparation operation for Gram-negative bacteria (Pantoea) is added to 400 mL of water for injection (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory) and suspended. It became cloudy.
  • a pH meter LAQUA manufactured by HORIBA, Ltd.
  • the pH of the suspension was 6.0, so sodium hydroxide (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (10N) was added to neutralize the suspension. did. Then, it was heated at 90 ° C.
  • Ultrafiltration treatment 15 mL of the above hot water extract is added to an ultrafiltration tube (Amicon Ultracentrifugal filter units) having a molecular weight cut-off of 30 kda, and centrifuged (7000 rpm ⁇ 30 minutes) to form an ultrafiltration membrane. A concentrated solution containing LPS on the non-permeated side was obtained. Further, 15 mL of water for injection was added to the concentrated solution, and centrifugation was performed in the same manner to wash the concentrated solution. The same washing was repeated 5 more times, and the concentrated solution after washing was collected, water for injection was added and scalpel-up was performed to obtain a 15 mL ultrafiltered suspension.
  • an ultrafiltration tube Anagonal filter units having a molecular weight cut-off of 30 kda
  • Example 2 Hot water extraction + C4 reverse phase HPLC
  • the hot water extract obtained through the step [1] of Example 1 was used.
  • Step [2] Ultrafiltration treatment performed in Example 1 was not performed.
  • Step [3] of Example 1 Except that 1 mL of the suspension after extraction with hot water was used instead of 1 mL of the ultrafiltered suspension used in the pretreatment (solubilization treatment) for chromatographic purification. The same operation as in Step [3] of Example 1 was carried out to obtain about 3.5 mL of the solubilized solution.
  • the obtained solubilized solution is subjected to the same steps as in Step [4] Chromatographic Purification, [5] Chromatographic Purification Post-treatment (Organic Solvent Removal and Concentration), and [6] Freeze-Drying of Example 1.
  • the operation was carried out to obtain the LPS according to Example 2 which is the final product.
  • TCA trichloroacetic acid
  • the upper layer (1st extract) of the centrifuge tube after centrifugation was recovered, and the lower layer was returned to the beaker used for phenol extraction.
  • 40 mL of distilled water was added to the beaker, and the mixture was stirred at 68 ° C. for 20 minutes.
  • the obtained suspension was transferred to a centrifuge tube and centrifuged at room temperature (7,000 G ⁇ 30 minutes).
  • the upper layer (2nd extract) of the centrifuge tube after centrifugation was recovered and combined with the 1st extract to prepare a phenol-extracted aqueous layer solution.
  • Comparative Example 2 Hot water extraction + ultrafiltration
  • the same operation as in the step [2] of Example 1 was performed to perform an ultrafiltration treatment.
  • the suspension obtained by ultrafiltration was 15 mL.
  • the obtained critically filtered suspension was subjected to the same operation as in step [6] freeze-drying of Example 1 to obtain LPS according to Comparative Example 2 as a final product.
  • ⁇ Maximum treatment concentration of Class 1 designated chemical substances> (Calculation method of maximum treatment concentration of Class 1 designated chemical substances)
  • the solvent component A is a (mL)
  • the component B is b (mL)
  • the component C is c (mL) in each step
  • B is a Class 1 designated chemical substance
  • the processing concentration is ⁇ b / (a + b + c) ⁇ ⁇ 100 (%).
  • the first-class designated chemical substance treatment concentration was calculated in each step adopted in the examples or comparative examples, and the highest one was shown in Table 1 as the first-class designated chemical substance maximum treatment concentration.
  • the substances designated as Class I Designated Chemical Substances (Chemical Substance Emission Control Promotion Law) used for the preparation of the sample according to Comparative Example 1 are trichloroacetic acid and phenol, and the maximum treatment of these substances in the manufacturing process.
  • the concentrations are shown in Table 1 below.
  • the substance designated as the Class 1 Designated Chemical Substance used for the preparation of the samples according to Examples 1 and 2 is triethylamine, and the maximum treatment concentration in the manufacturing process is as follows. It is shown in Table 1.
  • LPS purity 94.4%) prepared by the production method of Example 2 was evaluated by SDS-PAGE gel electrophoresis for the purpose of clarifying the structural characteristics as LPS. Further, the LPS quantitative value (E) by the ELISA method and the LPS quantitative value (L) by the Limulus test (endpoint-colorimetric method) were obtained, and the ratio (E / L ratio) was evaluated. The measurement method and measurement results are described below.
  • IP-PA1 standard product is LPS derived from pantoair agglomerans, but the manufacturing method thereof is different from that of the present invention. IP-PA1 was obtained by extracting with hot phenol water and purifying by anion exchange chromatography.
  • the size marker (Bio-Rad Laboratories, Precision Plus Protein Dual Extra Standard, molecular weight size: 250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 20, 15, 10, 5, 2 kDa) buffers 1 ⁇ L of the sample.
  • the solution manufactured by Nacalai Tesque, sample buffer (for SDS-PAGE, 2-fold concentration, containing 2-ME)
  • 2-ME 2-fold concentration, containing 2-ME
  • 20 ⁇ L was applied to the gel.
  • the electrophoresis was started at a constant 20 mA, and the electrophoresis was completed when the BPB (marker dye) was migrated to a position 1 cm from the lower end of the separation gel (about 60 minutes).
  • the gel plate was removed from the apparatus, and the gel was immersed in a fixative for silver staining.
  • the obtained electrophoresis chart is shown in the SDS-PAGE (silver staining method) electrophoresis chart of FIG.
  • the vertical axis of FIG. 1 indicates the molecular weight.
  • the molecular weight determined based on the protein size marker standard is shown in Table 3 below.
  • the molecular weight determined based on the protein size marker standard was 5000 to 20000 for both the IP-PA1 standard product and the LPS of Example 2 in the low molecular weight region band.
  • the polymer region band had a narrow distribution of 25,000 to 60,000 for the LPS of Example 2 while the IP-PA1 standard product had a narrow distribution of 20,000 to 70,000.
  • the proportion of low molecular weight LPS in the luminance value was 74.9%, whereas the LPS Lot. In 2, 82.3%, Lot. In No. 3, it was 84.6%, indicating that the LPS of Example 2 had a higher ratio of low molecular weight LPS than the IP-PA1 standard product in both lots.
  • 34-G2 immobilized antibody: antibody against O antigen polysaccharide of Lot.201107-7, IP-PA1 manufactured by Natural Immunology Applied Giken Co., Ltd.
  • PBS PBS
  • LPS content in sample (E) ( ⁇ g / mg) by dividing the LPS concentration in the sample solution by the sample concentration in the sample solution (mg / mL) (calculated from the sample weighing value and solution volume at the time of preparation). Asked.
  • the detection limit of this ELISA method is 1.6 ng / mL.
  • IP-PA1 standard product Lit.4
  • LPS of Example 2 Lit.2 and Lot.3
  • the measurement results are shown in Table 5 below.
  • LPS quantification method by Limulus test (endpoint-colorimetric method)) Using an LPS-specific measurable Limulus measurement kit (End Specy ES-50M set, manufactured by Seikagaku Corporation), sample by the endpoint-colorimetric method using a microplate according to the attached instructions (Example 2).
  • CSE (10 ng / vial) (manufactured by Seikagaku Corporation) was used as an endotoxin standard product.
  • the measurement results are shown in Table 5 below.
  • the ratio (E / L ratio) was determined based on the LPS content (E and L) determined by the above two methods. The results are shown in Table 5 below.
  • LPS is a substance of biological origin, it is considered to be a mixture of molecules of different structures and molecular weights. Therefore, it is difficult to clearly define the product of the present invention by the structural formula. Therefore, the characteristics of the manufactured product were clarified by evaluating the characteristic values due to the structure. That is, from the measurement results of SDS-PAGE gel electrophoresis, an LPS mixture in which the ratio of low molecular weight LPS to the whole LPS is higher than that of the conventional LPS (IP-PA1) can be obtained by producing by the method of the example. It was confirmed that it was done.
  • LPS having high lipophilicity LPS having a small amount of hydrophilic sugar chains and a high proportion of lipid A moiety
  • LPS low molecular weight LPS in the entire LPS
  • cytokine inducing ability a product having a large proportion of low molecular weight LPS in the entire LPS. And because of its molecular weight distribution, it is an LPS with high safety and physiological activity (cytokine inducing ability).

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Abstract

本発明は、労働衛生及び環境保全に寄与し、大規模生産に適したリポポリサッカライドの製造方法、及び、これによって製造されるリポポリサッカライドを提供することを目的とする。 本発明は、グラム陰性菌からリポポリサッカライドを抽出、精製するリポポリサッカライドの製造方法であって、上記グラム陰性菌を熱水で抽出することにより、上記リポポリサッカライドを含む抽出液を得る第一工程と、逆相液体クロマトグラフィーを用いて前記抽出液又は前記抽出液中のＬＰＳを含む溶液を精製することにより、リポポリサッカライドを得る第二工程とを含み、上記逆相液体クロマトグラフィーにおける逆相カラムは、炭素数が１～８の官能基を有する材料で構成された充填剤を有するリポポリサッカライドの製造方法等に関する。

Description

リポポリサッカライドの製造方法
本発明は、リポポリサッカライドの製造方法に関する。
リポポリサッカライド（以下、ＬＰＳともいう。）は、大腸菌、サルモネラ菌、百日咳菌等のグラム陰性細菌細胞壁のペプチドグリカンを囲む外膜に存在している脂質及び糖からなる複合化合物であり、内毒素（エンドトキシン）の活性成分として知られている（非特許文献１）。
上記ＬＰＳの基本構造は、特異な脂質を有するリピドＡ、それに共有結合したＲコアと呼ばれるオリゴ糖、更にＯ特異多糖の３成分よりなっている（非特許文献２）。そして、ＬＰＳの構造は、由来する菌の種類によって異なることが知られている。
ＬＰＳは、エンドトキシンとして知られており、免疫系細胞を活性化し、炎症性サイトカインを上昇させることが知られているが、最近では、ＬＰＳの免疫系細胞を活性化させる機能が注目されている。そのため、ＬＰＳを用いた自然免疫研究、生体防御機能の研究が盛んに行われるようになってきた。その中で、パントエア菌由来のＬＰＳは、ヒトでの食経験が豊富で、また健康食品、ワクチン用アジュバント、医薬品などに利用できる可能性も報告されており、特に有用なＬＰＳといえる。
このように、ＬＰＳの需要は増加しているものの、ＬＰＳの製造については、その抽出工程でトリクロロ酢酸、フェノール、クロロホルム、トルエン、アルカン、石油エーテル等の有機溶剤が抽出溶媒として多量に用いられることから、製造作業者の健康を害し、また、排出による自然環境への影響が問題となっている。また、前記の有機溶剤に対応した特殊な設備の導入が必要となり、製造コスト等がかかる点が問題となっている。
例えば、公知のＬＰＳの製造法として、ガラノス（Ｇａｌａｎｏｓ）法が知られているが、これは、フェノール、クロロホルム及び石油エーテルの混合物（ＰＣＰ）によるＬＰＳ抽出に続いて、クロロホルム及び石油エーテルの蒸発、アセトン及び水の添加によるＬＰＳの沈殿、並びに遠心又はろ過によるＬＰＳの回収を含む方法である（非特許文献３）。
また、サン（ＴＳＡＮＧ）法では、トリクロロ酢酸水溶液による抽出の後に、フェノール水溶液による抽出を行って、ＬＰＳを得ている（非特許文献４）。
また、チェン（Ｃｈｅｎ）法はクロロホルム及びメタノールの混合物（ＣＭ）によるＬＰＳ抽出に続いて、一連のメタノール沈降ステップを含むものである（非特許文献５）。
上記ガラノス法およびサン法では、環境上、健康上及び安全上の懸念がある溶媒混合物（フェノール、クロロホルム、石油エーテル、トリクロロ酢酸等）が抽出工程で使用されており、大規模な生産には不向きであり、商業的生産には適していない。また、チェン法においてもクロロホルムが抽出工程で用いられており、環境上、健康上及び安全上の懸念があり、また、チェン法では、ＬＰＳ－リン脂質の豊富なＣＭ相が生じるため、充分な純度のＬＰＳを得るために複数の沈降ステップが必要とされ、製造時間及びコストを必要とする。
また、例えば、特許文献１には、グラム陰性菌からＬＰＳを抽出する工程において、ガラノス法で用いられるフェノール、クロロホルム及び石油エーテルの溶媒混合物（ＰＣＰ）の代わりに、アルコール、有機溶媒及び水を用いることが開示されている。
しかしながら、上記有機溶媒としては、クロロホルム、アルカン、トルエン及び石油エーテルのグループから選択できる有機溶媒が用いられることが開示されており、本製造方法においても、環境上、健康上及び安全上の懸念があり、大規模な生産には不向きである。
このように従来のＬＰＳの製造方法は、環境及び労働衛生に対する負荷が大きい製造プロセスを含むものであった。言い換えると、従来のＬＰＳの製造方法は、作業環境管理、作業管理及び健康管理の労働衛生管理のリスクに加え、環境保全のリスクを有するものである。また、ＬＰＳの製造施設は上記リスク対策設備が必要とされ、製造コストも上がっていた。
また、ＬＰＳの中では、健康食品、ワクチン用アジュバント、医薬品の用途として有用な、Ｐａｎｔｏｅａ（以下、パントエア菌ともいう。）由来ＬＰＳは、上述の通り有用性が種々報告されており需要増加が見込まれる。そのため、抽出工程に有機溶媒を用いない、大規模生産に適した製造方法の開発が特に求められていた。しかしながら、パントエア菌由来ＬＰＳの製造方法としては、熱フェノールによる抽出とアニオン交換カラム精製を組み合わせた方法の報告があるくらいであり（非特許文献６）、その方法もフェノールを用いることから、大規模生産を行うには、健康上及び安全上の懸念があった。
以上のように、大規模生産に適したＬＰＳの製造方法、すなわち、労働衛生及び環境保全の負荷の小さい製造方法が求められていた。特にパントエア菌由来ＬＰＳの製造において、上記のような製造方法が求められていた。
なお、ＬＰＳの抽出方法に関しては、有害な有機溶媒を用いない例として、特許文献２には、酢酸菌、グルコン酸菌、キサントモナス菌、ザイモモナス菌又はエンテロバクター菌に対して熱水抽出を行うことが開示されている。しかしながら、当該製造方法で得られるリポ多糖（ＬＰＳ）は、ＬＰＳ以外の不純物を多く含み、ＬＰＳ純度の低いエキスを得る抽出操作に過ぎず、ＬＰＳの実用的な製造方法といえるものではない。また、特許文献２には、ＬＰＳの製造方法が別途開示されているが、それは熱フェノール抽出と核酸分解酵素処理を組み合わせた方法である。すなわち特許文献２には、有害な有機溶媒を用いずにＬＰＳを製造する方法は、開示も示唆もされていない。
また、通常、ＬＰＳの抽出精製物は低分子量成分と高分子量成分の混合物であり、低分子量ＬＰＳの割合が増えると、安全性が高まり、また、生理活性（サイトカイン誘導能）も向上することが報告されている（特許文献３、非特許文献７）。そこで従来製法によるＬＰＳよりも低分子量ＬＰＳを多く含むＬＰＳ及びその製法が求められていた。
特開２０１６－１７４６０１号公報 国際公開第２００７／０６１１０２号 特許第４０４３５３３号公報
ジェー・エム・ギューセン及びアール・ハッケンベック（Ｊ．Ｍ．Ｇｈｕｙｓｅｎ　ａｎｄ　Ｒ．Ｈａｋｅｎｂｅｃｋ）編、「ニュー・コンプリヘンシブ・バイオケミストリー（Ｎｅｗ　Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、第２７巻、バクテリアル・セル・ウオール（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｗａｌｌ）、第１８ページ、エルセヴィア（Ｅｌｓｅｖｅａ）、１９９４年 「日経バイオテクノロジー最新用語辞典」、第４３１ページ、日経マグロウヒル社、１９８５年 Ｇａｌａｎｏｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９：２４５（１９６９） Ｊ．Ｃ．ＴＳＡＮＧ　ｅｔ　ａｌ．，ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ，Ｆｅｂ．１９７４，ｐ．７８６－７９５ Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｅｓｉｅｓｅｓ．１２８ｓ，４３，１９７３ ＡＮＴＩＣＡＮＣＥＲ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ２７：３７０１－３７０６（２００７） Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ　１０（３）：５１９－５２１，Ｍａｒｃｈ，１９９６
本発明は、上記現状に鑑み、労働衛生及び環境保全に寄与し、大規模生産に適したリポポリサッカライドの製造方法、及び、これによって製造されるリポポリサッカライドを提供することを課題とする。
上述した目的を達成するため、環境負荷の高い有機溶媒を用いることなく、大規模生産に適用可能な収量が得られるＬＰＳを抽出精製する方法を鋭意検討した。その結果、グラム陰性菌を熱水で抽出する第一工程と、特定の充填剤を有する逆相カラムを備えた逆相液体クロマトグラフィーを用いて第一工程で得られた抽出液又は上記抽出液中のＬＰＳを含む溶液を精製する第二工程とを組み合わせることにより、環境負荷の高い有機溶媒を用いることなく、大規模生産に適用可能な収量のＬＰＳが得られることを見出した。さらに、本製造方法で得られたＬＰＳは、高純度であり、かつ、低分子量リポポリサッカライドを高含有量で含むことを見出した。
すなわち、本発明は、グラム陰性菌からリポポリサッカライドを抽出、精製するリポポリサッカライドの製造方法であって、上記グラム陰性菌を熱水で抽出することにより、上記リポポリサッカライドを含む抽出液を得る第一工程と、逆相液体クロマトグラフィーを用いて前記抽出液又は前記抽出液中のＬＰＳを含む溶液を精製することにより、リポポリサッカライドを得る第二工程とを含み、上記逆相液体クロマトグラフィーにおける逆相カラムは、炭素数が１～８の官能基を有する材料で構成された充填剤を有することを特徴とするリポポリサッカライドの製造方法である。
上記充填剤は、炭素数が２～６の官能基を有する材料で構成されていることが好ましい。
上記充填剤は、炭素数が２～４の官能基を有する材料で構成されていることが好ましい。
上記充填剤は、炭素数が４の官能基を有する材料で構成されていることが好ましい。
また、上記官能基はアルキル基であることが好ましい。
上記第一工程の熱水の温度が５０～１５０℃であることが好ましい。
上記第一工程の熱水の温度が５０～９９℃であることが好ましい。
上記第一工程の熱水の温度が７０～９９℃であることが好ましい。
上記第一工程の熱水の温度が８５～９５℃であることが好ましい。
上記グラム陰性菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｐａｎｔｏｅａ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｏｓｅｏｍｏｎａｓ属とＲｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ属からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。
上記グラム陰性菌は、Ｐａｎｔｏｅａ属であることが好ましい。
また、本発明は、本発明の製造方法で製造されたことを特徴とするリポポリサッカライドでもある。
また、本発明のリポポリサッカライドは、上記グラム陰性菌から得られることが好ましい。
また、本発明のリポポリサッカライドは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法で測定した分子量が２０００～２００００である低分子量リポポリサッカライドと、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法で測定した分子量が２００００より大きく１０００００以下である高分子量リポポリサッカライドとを含み、上記低分子量リポポリサッカライドと上記高分子量リポポリサッカライドとの合計量に対する、上記低分子量リポポリサッカライドの含有量が８０％以上であることが好ましい。
また、本発明のリポポリサッカライドは、ＥＬＩＳＡ法によるリポポリサッカライド定量値（Ｅ）をリムルス試験（エンドポイント－比色法）によるリポポリサッカライド定量値（Ｌ）で除した値（Ｅ／Ｌ比）が１．０以下であることが好ましい。
以下本発明を詳述する。なお、以下の説明において、百分率の表示は特に断りのない限り、重量による値である。
本発明のリポポリサッカライドの製造方法によれば労働衛生及び環境保全に寄与し、かつ、大規模生産に適したリポポリサッカライドの製造方法を提供できる。
上記労働衛生及び環境保全に寄与するとは、具体的に、環境負荷の高い有機溶媒を用いることなくリポポリサッカライドを抽出することができることであり、これにより、環境上、健康上及び安全上のリスクを改善することができる。また、リポポリサッカライドの製造において、作業環境管理、作業管理及び健康管理の労働衛生管理のリスクに加え、環境保全のリスクを低減できるため、ＬＰＳの製造施設における上記リスク対策設備を削減でき、全体的な製造コストを抑制することができる。
さらに、本発明の製造方法によれば、高純度かつ低分子量リポポリサッカライド高含有量のリポポリサッカライドが得られるので、安全性と生理活性の高いリポポリサッカライドを提供することが可能になる。
図１は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（銀染色法）泳動図である。
本明細書において、上述の環境負荷の高い溶媒とは、ＬＰＳを含む抽出液を得る第１工程においては有機溶媒であり、さらに上記第１工程を除く製造工程全体においては、化学物質排出把握管理促進法において第１種指定化学物質に指定される物質で有機溶媒として使用可能なものである。
本明細書において、高純度のＬＰＳとは、タンパク質、核酸と比較してＬＰＳが主成分たりえるＬＰＳ、すなわち、ＬＰＳの含有量（得られたＬＰＳの重量からタンパク質と核酸の含有量（重量）を減じた残りの割合）が６０重量％以上であるＬＰＳを意味する。また、本明細書において、「純度」は、ＬＰＳの純度を意味し、重量％で表記する。ＬＰＳの純度は好ましくは７０重量％以上、より好ましくは８０重量％以上、さらに好ましくは９０重量％以上である。
また、本明細書において低分子量リポポリサッカライド（以下、低分子量ＬＰＳともいう。）は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（銀染色法）によって構成成分に展開し、プロテインサイズマーカー移動度を指標として求められる分子量が、２０００以上２００００以下のＬＰＳであり、高分子量リポポリサッカライド（以下、高分子量ＬＰＳともいう。）は、上記測定により求められる分子量が２００００より大きく１０００００以下のＬＰＳである。
また低分子量リポポリサッカライド（低分子量ＬＰＳ）を高含有量で含むＬＰＳとは、実質的に高分子量リポポリサッカライド（高分子量ＬＰＳ）を含まないものから、高分子量ＬＰＳを含んでいても、高分子量ＬＰＳと低分子量ＬＰＳとの合計に対する低分子量ＬＰＳの含有量が８０％以上のものを意味する。低分子量ＬＰＳの含有量が高分子量ＬＰＳと低分子ＬＰＳとの合計に対し８０％以上のＬＰＳは、従来法で精製したＬＰＳと比較して低分子量ＬＰＳの含有量が多い。より具体的に説明すると、ＬＰＳをＳＤＳ－ＰＡＧＥ（銀染色法）によって構成成分に展開し、プロテインサイズマーカー移動度を指標として分子量を求め、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像（銀染色後）の画像輝度総量によって構成成分の含有量を求めた場合、分子量が２０００～２００００の低分子量リポポリサッカライドと、分子量が２００００より大きく１０００００以下の高分子量リポポリサッカライドとを含むＬＰＳについて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの銀染色法により上記低分子量リポポリサッカライドの量と上記高分子量リポポリサッカライドとの量の合計に対する、上記低分子量リポポリサッカライドの含有量が８０％以上であることを意味する。
以下の説明において、低分子量ＬＰＳの含有量が８０％以上のＬＰＳを低分子量ＬＰＳ高含有のＬＰＳと表現する。
なお、本明細書において、大規模生産に適用可能な収量のリポポリサッカライドとは、菌体ペレット１ｋｇから製造されるリポポリサッカライドが４ｇ以上の収量であるリポポリサッカライドをいう。なお、菌体ペレット１ｋｇから製造されるリポポリサッカライドの収量は、ＨＰＬＣ法を用いて測定することができる。
本願明細書において、「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上Ｂ以下」を意味する。
本発明の一実施形態であるリポポリサッカライドの製造方法は、グラム陰性菌からリポポリサッカライドを抽出、精製するリポポリサッカライドの製造方法であって、上記グラム陰性菌を熱水で抽出することにより、上記リポポリサッカライドを含む抽出液を得る第一工程と、逆相液体クロマトグラフィーを用いて前記抽出液又は前記抽出液中のＬＰＳを含む溶液を精製することにより、リポポリサッカライドを得る第二工程とを含み、上記逆相液体クロマトグラフィーにおける逆相カラムは、炭素数が１～８の官能基を有する材料で構成された充填剤を有することを特徴とする。
一般に、ＬＰＳは、グラム陰性菌細胞壁からの抽出物又はその改変体であってよく、合成品であってもよい。しかし、本発明のＬＰＳの製造方法で得られるＬＰＳは、グラム陰性菌細胞壁からの抽出精製物である。
上記グラム陰性菌としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属、Ｖｉｂｌｉｏ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ属、Ｐｒｏｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属、Ｐａｎｔｏｅａ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｔｅｎｏｒｔｏｐｈｏｍｏｎａｓ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ属、Ｒａｈｎｅｌｌａ属、Ａｃｉｄｉｃａｌｄｕｓ属、Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ属、Ａｃｉｄｉｓｐｈａｅｒａ属、Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ属、Ａｃｉｄｏｍｏｎａｓ属、Ａｓａｉａ属、Ｂｅｌｎａｐｉａ属、Ｃｒａｕｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属、Ｋｏｚａｋｉａ属、Ｌｅａｈｉｂａｃｔｅｒ属、Ｍｕｒｉｃｏｃｃｕｓ属、Ｎｅｏａｓａｉａ属、Ｏｌｅｏｍｏｎａｓ属、Ｐａｒａｃｒａｕｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｒｈｏｄｏｐｉｌａ属、Ｒｏｓｅｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｒｕｂｒｉｔｅｐｉｄａ属、Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒ属、Ｓｔｅｌｌａ属、Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎｉａ属、Ｔｅｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｚａｖａｒｚｉｎｉａ属、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属及びＺｙｍｏｍｏｎａｓ属、Ｒｏｓｅｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属等が挙げられる。
なかでも、グラム陰性菌としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｐａｎｔｏｅａ属（パントエア菌）、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｏｓｅｏｍｏｎａｓ属及びＲｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ属からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。これらは、古来より多くの食品、漢方薬に含まれ、生体への安全性が担保されているためである。特にＰａｎｔｏｅａは、現在健康食品として用いられており、Ｐａｎｔｏｅａ属から抽出、精製されるＬＰＳは、その使用に対し、より安全性及び有効性が高いといえる。グラム陰性菌は、Ｐａｎｔｏｅａ属であることがより好ましい。本発明の製造方法は、需要増加が見込まれるＰａｎｔｏｅａ（パントエア菌）由来ＬＰＳの製造において、労働衛生及び環境保全に寄与する製造方法と、高純度かつ低分子量ＬＰＳ高含有のパントエア菌由来ＬＰＳを提供できる。
上記第一工程では、グラム陰性菌を熱水で抽出することにより、上記グラム陰性菌の細胞壁が変性し除去され、上記細胞壁中のＬＰＳ、及び、グラム陰性菌の細胞内のタンパク質及び核酸が抽出され、ＬＰＳを含む抽出液が得られる。
上記第一工程の熱水の温度は、５０～１５０℃であることが好ましい。熱水の温度が、１５０℃より高い場合は、高温に起因して抽出されるＬＰＳの熱変性が発生する可能性があり、５０℃未満の場合は、上記グラム陰性菌の細胞壁の変性が生じず、ＬＰＳが充分に抽出されない可能性があるためである。
また、熱水の温度は、５０～１３０℃がより好ましく、５０～９９℃がさらに好ましく、７０～９９℃がよりさらに好ましく、８５～９５℃が最も好ましい。ＬＰＳを効率よく抽出できるためである。また、常圧での抽出も可能なためである。
上記熱水で抽出を行う時間は、１０～１２０分であることが好ましい。抽出時間が１２０分を超える場合は、ＬＰＳの熱分解等を生じる場合があり、１０分未満の場合は、ＬＰＳが充分に抽出されない場合があるためである。
第一工程における熱水抽出の温度及び時間は、用いられるグラム陰性菌の種類によって上述の熱水温度及び抽出時間から最適な条件を適宜選択することができる。
グラム陰性菌がＰａｎｔｏｅａ属の場合も、ＬＰＳの抽出における熱水温度及び抽出時間を上述の範囲内で適宜選択することができるが、好ましくは７０～９９℃で１０～１２０分の条件、さらに好ましくは８５～９５℃で２０～３０分の条件で熱水抽出を行う。
また、第一工程での熱水抽出は、１回のみの実施でもよく、同じ温度又は異なる温度で複数回実施してもよい。なお、上記熱水抽出で用いられる水は、特に限定されず、本分野で通常使用される水を用いることができる。
また、熱水抽出は、本技術分野において一般的に用いられている方法及び装置を用いて実施することができ、常圧、減圧又は加圧下において行うことができる。
また、熱水抽出で用いられる水に対し、界面活性剤、キレート剤、有機酸塩、無機塩類などを加えてもよい。
本発明の一実施形態におけるＬＰＳの製造方法において、上記第一工程と上記第二工程とは連続して行われてもよく、また、第一工程と第二工程との間に他の工程を含んでもよい。
上記第一工程と上記第二工程とが連続で行われる場合、第一工程で得られた抽出液が第二工程で精製される。また、上記第一工程と上記第二工程との間に他の工程を含む場合、第一工程で得られた抽出液中のＬＰＳを含む溶液が、第二工程で精製される。
上記第一工程と上記第二工程との間に行われる他の工程としては、例えば、限外ろ過、酵素処理、エタノール沈殿、透析、固相抽出等が挙げられ、なかでも第一工程で得られた抽出液に対し、限外ろ過を行うことが好ましい。限外ろ過を行うことで、上記抽出液中のＬＰＳを濃縮し、同時に低分子量（限外ろ過膜２０万ダルトンを通り抜けるもの）の不純物を除去することにより、第二工程における逆相液体クロマトグラフィーを用いた精製を効率よく行うことができるためである。第一工程で得られた抽出液は、１回又は複数回限外ろ過されることが好ましい。なお、ＬＰＳはミセルを形成して見かけ上の分子量が大きくなるため、その分子量は、上記の限外ろ過膜のカットオフ値の分子量とは直接的には対応しない。
本発明の製造方法において、第一工程と第二工程との間で限外ろ過が行われる場合、上記限外ろ過で用いられる限外ろ過膜は、分画分子量（Ｃｕｔ－ｏｆｆ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ）が５０００～２０万ダルトン、好ましくは８０００～１０万ダルトンである。より好ましくは１万～５万ダルトンである。
なお、分画分子量は、ＪＩＳ　Ｋ　３８０２（膜用語）に定義された膜特性を表す用語である。
上記第二工程で用いられる逆相液体クロマトグラフィーの逆相カラムは、炭素数１～８の官能基を有する材料で構成された充填剤を有する。特定の炭素数の官能基を有する材料で構成された充填剤を有する逆相カラムを用いることで、第一工程で得られた抽出液又は抽出液中のＬＰＳを含む溶液に残存するＬＰＳ以外の不純物を取り除き、より純度の高いＬＰＳを精製できるためである。また、低分子量ＬＰＳ高含有のＬＰＳを精製できるためである。
上記充填剤は、炭素数２～６の官能基を有する材料で構成されていることが好ましく、炭素数２～４の官能基を有する材料で構成されていることがより好ましく、炭素数４の官能基を有する材料で構成されていることがさらに好ましい。
上記官能基は、アルキル基であることが好ましい。第一工程で得られた抽出液に残存するＬＰＳ以外の不純物を取り除き、より純度の高いＬＰＳを精製できるためである。また、本発明の製造方法に用いられる設備のコストを抑制しながら、ＬＰＳを充分に精製できるためである。上記充填剤は、炭素数１～８のアルキル基を有する材料で構成されていることが好ましく、炭素数２～６のアルキル基を有する材料で構成されていることがより好ましく、炭素数２～４のアルキル基を有する材料で構成されていることがさらに好ましく、炭素数４のアルキル基を有する材料で構成されていることが最も好ましい。すなわち上記充填剤は、ブチル基を有する材料で構成されていることが最も好ましい。
上記充填剤を構成する材料（ベース材料）はシリカゲルであることが好ましい。第一工程で得られた抽出液に残存するＬＰＳ以外の不純物を取り除き、より純度の高いＬＰＳを精製できるためである。また、本発明の製造方法に用いられる設備のコストを抑制しながら、ＬＰＳを充分に精製できるためである。上記充填剤は、炭素数１～８の官能基を有するシリカゲルであることが好ましく、炭素数２～６の官能基を有するシリカゲルであることがより好ましく、炭素数２～４の官能基を有するシリカゲルであることがさらに好ましく、炭素数４の官能基を有するシリカゲルであることが最も好ましい。
上記充填剤を構成する材料（ベース材料）はアルキル基を有するシリカゲルであることが好ましい。第一工程で得られた抽出液に残存するＬＰＳ以外の不純物を取り除き、より純度の高いＬＰＳを精製できるためである。また、本発明の製造方法に用いられる設備のコストを抑制しながら、ＬＰＳを充分に精製できるためである。上記充填剤は、炭素数１～８のアルキル基を有するシリカゲルであることが好ましく、炭素数２～６のアルキル基を有するシリカゲルであることがより好ましく、炭素数２～４のアルキル基を有するシリカゲルであることがさらに好ましく、炭素数４のアルキル基を有するシリカゲルであることが最も好ましい。すなわち、上記充填剤は、ブチル基を有するシリカゲルであることが最も好ましい。
上記充填剤は、官能基がアルキル基であり、材料がシリカゲルであることが好ましく、上述の構成を適宜組み合わせた構成を採用することができる。
また、上記第二工程は、逆相液体クロマトグラフィーで処理される上記第一工程で得られた抽出液又は抽出液中のＬＰＳを含む溶液に対する前処理を含んでもよい。前処理としては、本分野で通常使用され、逆相液体クロマトグラフィーによる分離に適した操作を行うことができる。具体的に、上記第一工程で得られた抽出液又は抽出液中のＬＰＳを含む溶液に対し、界面活性剤を添加し、ＬＰＳの可溶化処理を行い、これを逆相液体クロマトグラフィーで精製することとしてもよい。逆相液体クロマトグラフィーによる分離の効率化を図ることができるためである。上記第二工程は、逆相液体クロマトグラフィーの前処理として、上述の可溶化処理を含むことが好ましい。
上記界面活性剤は、イオン性界面活性剤が好ましい。ＬＰＳの可溶化効果が高いためである。イオン性界面活性剤としては特に限定されないが、例えば、アルキルアンモニウム塩、胆汁酸、フシジン酸、アミノ酸、オリゴペプチド又はポリペプチドの脂肪酸結合物、アミノ酸、オリゴペプチドのグリセリドエステル、ポリペプチドのグリセリドエステル、アシルラクチレート、モノグリセリドのモノアセチル化酒石酸エステル、モノグリセリドのジアセチル化酒石酸エステル、ジグリセリドのモノアセチル化酒石酸エステル、ジグリセリドのジアセチル化酒石酸エステル、スクシニル化モノグリセリド、モノグリセリドのクエン酸エステル、ジグリセリドのクエン酸エステル、アルギン酸、プロピレングリコールアルギン酸エステル、レシチン、水素化レシチン、リゾレシチン、水素化リゾレシチン、リゾリン脂質、リン脂質、アルキルサルフェートの塩、脂肪酸、及び、薬理学的に許容可能なそれらの塩等が挙げられるが、胆汁酸及び／又はその薬理学的に許容可能な塩であることが好ましい。ＬＰＳの可溶化効果が特に高いためである。
また、上記胆汁酸及びその薬理学的に許容可能な塩としては、例えば、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、ウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウム、グリコジヒドロフシジン酸、及び、薬理学的に許容可能なそれらの塩（例えば、ナトリウム塩）等が挙げられる。
なかでも、上記界面活性剤は、デオキシコール酸及び／又はその薬理学的に許容可能な塩であることが好ましい。また、上記界面活性剤は、デオキシコール酸及び／又はその塩であることが好ましい。ＬＰＳの可溶化効果が特に高いためである。
また、本発明のＬＰＳの製造方法における上記第二工程は、上記第一工程後の抽出液又は上記抽出液中のＬＰＳを含む溶液に対し、上述の可溶化処理の他に、濃度調整、ｐＨ調整、イオン強度調整、有機溶媒添加、ろ過、透析など、一般的に逆相液体クロマトグラフィーの試料液に対して行われる、様々な前処理を適宜行ってもよい。逆相液体クロマトグラフィーによる分離の効率化を図ることができるためである。
また、上記第二工程は、逆相液体クロマトグラフィーを用いて得られたＬＰＳを含む分離液に対する後処理を含んでもよい。後処理としては、逆相液体クロマトグラフィーの分離液に適した操作を行うことができ、分離液に適した操作としては、本発明の属する技術分野において通常使用されている分離液処理を適宜組み合わせて行うことができる。具体的には、例えば、蒸留、塩析、溶媒沈殿法等の溶解度の差を利用する方法；透析、限外ろ過、ゲル濾過、ＰＡＧＥ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ等の分子量の差を利用する方法；等電点電気泳動等の等電点の差を利用する方法等が挙げられる。なかでも、後処理として、蒸留及び／又は限外ろ過を行うことが好ましく、蒸留及び限外ろ過を行うことがより好ましい。上記第二工程における逆相液体クロマトグラフィーの移動相中に含まれる不純物を除去できる為である。
また、本発明の一実施形態におけるＬＰＳの製造方法は、上記第二工程で精製されたＬＰＳを濃縮する工程や、洗浄する工程を有していてもよい。濃縮工程や洗浄工程は、本発明の属する技術分野において通常使用されている処理を適宜組み合わせて行うことができる。
また、本発明の一実施形態におけるＬＰＳの製造方法は、上記第二工程で精製したＬＰＳを乾燥させる工程（乾燥工程）を有してもよい。上記第二工程で精製したＬＰＳには、第二工程における逆相液体クロマトグラフィーの移動相に含まれる揮発性有機溶媒や、水等の溶媒が含まれている場合が多い。そのため、乾燥工程では、乾燥蒸留法（エバポレーション）により第二工程における逆相液体クロマトグラフィーの移動相に含まれる揮発性有機溶媒を除去する工程（有機溶媒除去工程）、及び／又は、凍結乾燥によって水などの溶媒を完全に除去する工程（溶媒除去工程）を含むことが望ましい。このような乾燥工程を有することで、ＬＰＳの取扱い性を向上させることができる。
なお、上述の本発明のＬＰＳの製造方法は、大規模生産に好適に使用することができる。本発明のＬＰＳの製造方法から得られるＬＰＳの収量は、グラム陰性菌の菌体ペレット１ｋｇから製造されるリポポリサッカライドが４ｇ以上であることが好ましい。本発明のＬＰＳの製造方法から得られるＬＰＳは、ＨＰＬＣ法を用いて定量することができる。
別の実施形態として、本発明は、上述の本発明の製造方法で製造されたリポポリサッカライドである。本発明の製造方法で製造されたリポポリサッカライドは、純度が６０重量％以上の高純度のＬＰＳであるが、純度が７０重量％以上であることが好ましく、純度が８０重量％以上であることがより好ましく、純度が９０重量％以上であることがさらに好ましい。
本発明の別の実施形態であるリポポリサッカライドは、上述のグラム陰性菌から製造されることが好ましい。上記グラム陰性菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｐａｎｔｏｅａ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｏｓｅｏｍｏｎａｓ属とＲｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ属からなる群より選択される少なくとも１種であることがより好ましく、パントエア属であることがさらに好ましい。これらは、古来より多くの食品、漢方薬に含まれ、生体への安全性が担保されているためである。特にＰａｎｔｏｅａは、現在健康食品として用いられており、Ｐａｎｔｏｅａ属から抽出、精製されるＬＰＳは、その使用に対し、より安全性及び有効性が高いといえる。
本発明の別の実施形態であるリポポリサッカライドは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法で測定した分子量が２０００～２００００である低分子量リポポリサッカライドと、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法で測定した分子量が２００００より大きく１０００００以下である高分子量リポポリサッカライドとを含み、上記低分子量リポポリサッカライドと上記高分子量リポポリサッカライドとの合計量に対する、上記低分子量リポポリサッカライドの含有量が８０％以上であることが好ましい。低分子量ＬＰＳの含有量が８０％以上でのＬＰＳは、極めて安全性が高く、かつ生物活性にも優れており特に有用である。
本発明において、ＬＰＳの分子量は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（銀染色法）によって構成成分に展開し、プロテインサイズマーカー移動度を指標として分子量を求めた値である。低分子量ＬＰＳと高分子量ＬＰＳとの含有量比は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像（銀染色後）の画像輝度総量によって、構成成分の含有量を求めることにより得られる値である。
本発明の別の実施形態であるリポポリサッカライドは、ＥＬＩＳＡ法によるリポポリサッカライド定量値（Ｅ）をリムルス試験（エンドポイント－比色法）によるリポポリサッカライド定量値（Ｌ）で除した値（Ｅ／Ｌ比）が１．０以下であることが好ましい。なお、上記Ｅ／Ｌ比は０より大きい値である。
ＥＬＩＳＡ法によるリポポリサッカライド定量値（Ｅ）、及び、リムルス試験（エンドポイント－比色法）によるリポポリサッカライド定量値（Ｌ）は、例えば、下記方法により測定される。
（ＥＬＩＳＡ法によるＬＰＳの定量方法）
ＥＬＩＳＡ法によるＬＰＳの定量は、例えば、測定対象ＬＰＳの糖鎖特異的抗体（例えば、ＩＰ－ＰＡ１糖鎖特異的抗体、自然免疫応用技研（株）製）を用いたＥＬＩＳＡ法によって、サンプル中のＬＰＳ含有量（Ｅ）（μｇ／ｍｇ）を測定することにより求められる。具体的には、以下の手順でＥＬＩＳＡ測定を行うことができる。
１）３４－Ｇ２（固相化抗体：自然免疫応用技研（株）製、Ｌｏｔ．２０１１０７－７、ＩＰ－ＰＡ１のＯ抗原多糖に対する抗体）を、使用時にフィルター濾過滅菌したＰＢＳ（－）にて、８００倍希釈する。９６穴イムノプレートに５０μＬずつ分注し、液が蒸発しないようにパラフィルムで密閉して４℃にて保存する。
２）３４－Ｇ２を加えた９６穴イムノプレートを４℃から出し、液を捨てた後、ブロッキング溶液（ＰＢＳ（－）に終濃度３％（ｗ／ｖ）になるようにＢＳＡを加えた溶液）を２００μＬ／ウエルの割合で入れ、２５℃で３０分以上放置し、抗体その他のタンパクの非特異的吸着を防止する。
３）洗浄液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ７．５、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）　Ｔｗｅｅｎ２０相当品）２００μＬで３回洗浄後、ウエルに段階希釈したＬＰＳ標準溶液（ＬＰＳ標準物質（例えば、自然免疫応用技研（株）製のパントエアアグロメランス由来ＬＰＳ標準品、純度９５％以上））５０μＬを入れる。同じ９６穴イムノプレートの別のウエルに、測定対象のサンプル溶液を５０μＬ入れる。２５℃の恒温槽で１時間放置する。
４）洗浄液　２００μＬでウエルを３回洗浄し、１０００倍希釈した４Ｅ－１１（１次抗体：自然免疫応用技研（株）製、Ｌｏｔ．２０１７０７０２、ＩＰ－ＰＡ１のＯ抗原多糖に対する抗体）を５０μＬ／ウエルで入れ、２５℃の恒温槽で１時間放置する。
５）洗浄液　２００μＬでウエルを３回洗浄し、１０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ免疫グロブリン抗体（Ｓｉｇｍａ社製、Ｃａｔ．１４１８）を５０μＬ／ウエルで入れ、２５℃の恒温槽で１時間放置する。
６）洗浄液　２００μＬでウエルを５回洗浄し、発色液（ｐ－ニトロフェニルリン酸二ナトリウム六水和物（ｐ－ＮＰＰ）：ナカライテスク社製、Ｃａｔ．２５０１９－５２、Ｌｏｔ．ＭＯＰ２２５９）を１００μＬ／ウエルで入れ、室温で１時間放置する。
７）その後、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ、Ｐｌｕｓ３８４）にて４１５ｎｍの吸光度を測定する。検量線は２次曲線で作成する。
８）検量線を用いて、サンプル溶液の吸光度から、サンプル溶液中ＬＰＳ濃度（μｇ／ｍＬ）を算出する。サンプル溶液中ＬＰＳ濃度を、サンプル溶液中サンプル濃度（ｍｇ／ｍＬ）（調製時のサンプル秤量値と溶液量から算出）で除すことで、サンプル中のＬＰＳ含有量（Ｅ）（μｇ／ｍｇ）を求める。
なお、本測定方法によるＥＬＩＳＡ法の検出限界は１．６ｎｇ／ｍＬである。
（リムルス試験によるＬＰＳの定量方法）
リムルス試験によるＬＰＳの定量は、例えばＬＰＳ特異的に測定可能なリムルス測定キットを用いて、サンプル中のＬＰＳ含有量（Ｌ）（μｇ／ｍｇ）を測定することにより求められる。具体的には、以下の手順でリムルス試験を行うことができる。
（リムルス試験（エンドポイント－比色法）によるＬＰＳ定量方法）
ＬＰＳ特異的に測定可能なリムルス測定キット（例えば、エンドスペシー　ＥＳ－５０Ｍセット、生化学工業社製）を用い、添付の説明書に従って、マイクロプレートを用いたエンドポイント－比色法により測定対象のサンプルＬＰＳ中のＬＰＳ含有量（Ｌ）（μｇ／ｍｇ）を測定する。
測定には、エンドトキシン標準品としてＣＳＥ（１０ｎｇ／ｖｉａｌ）（生化学工業社製）を用いる。
上記の２つの方法で求めたＬＰＳ含有量（ＥおよびＬ）に基づき、その比（Ｅ／Ｌ比）を求めることができる。ここで、まず、ＬＰＳの構造と分子量の関係について説明する。ＬＰＳは、構造として、Ｏ抗原多糖、コア多糖、リピドＡ部分とからなる。このうち、ＬＰＳの１分子中におけるリピドＡ部分の分子量はＬＰＳ種類間で大きな違いはない。ＬＰＳの１分子中におけるコア多糖部分の分子量もＬＰＳ種類間で大きな違いはない。一方、ＬＰＳ分子中のＯ抗原多糖部分は繰り返し構造であり、その繰り返しの程度はＬＰＳ種類によって大きく異なる。その結果、ＬＰＳの種類によって、Ｏ抗原多糖部分の分子量の違いが生じ、ＬＰＳの分子量の違いが生じるのである。Ｏ抗原多糖部分の繰り返し数が多いと、ＬＰＳの分子量は大きく、Ｏ抗原多糖部分の繰り返し数が少ないと、ＬＰＳの分子量は小さくなるのである。また、グラム陰性菌から抽出されるＬＰＳは、通常、分子量の異なるＬＰＳの混合物である。次にＬＰＳの構造とＬＰＳ含有量（ＥおよびＬ）の関係について説明する。ＥＬＩＳＡ法で測定されるＬＰＳ量（Ｅ）は、ＬＰＳ構造中のＯ抗原多糖を認識して結合した抗体の量に基づいて求めたＬＰＳ量である。ＬＰＳ構造中のＯ抗原多糖の繰り返し数が少ないか、あるいは、Ｏ抗原多糖がない場合（すなわち、ＬＰＳの分子量が小さい場合）、ＬＰＳ分子中に十分なサイズの抗体結合部位が確保されないこととなり、ＬＰＳに抗体が結合できず、ＥＬＩＳＡ法によるＬＰＳ量の測定値は小さい値となる。一方、リムルス試験で測定されるＬＰＳ量（Ｌ）は、ＬＰＳ構造中のリピドＡ構造の反応活性に基づいて求めたＬＰＳ量であるので、ＬＰＳ構造中のＯ抗原多糖の割合または有無に関係なく、測定サンプル中のＬＰＳのモル数に対応した測定値が求められる。よって、一定質量のＬＰＳサンプル（分子量の異なるＬＰＳの混合物）をＥＬＩＳＡ法およびエンドトキシン法で測定してＬＰＳ含量（ＥおよびＬ）を求めたとき、Ｅ／Ｌ比が大きければ、測定試料に含まれるＬＰＳは分子量の大きいものが多く含まれることを意味し、Ｅ／Ｌ比が小さければ、測定試料に含まれるＬＰＳは分子量の小さいものが多く含まれることを意味する。
本発明の製造方法により得られたＬＰＳは、上記（Ｅ／Ｌ比）が０より大きく１．０以下であることが好ましい。このようなＬＰＳは、低分子量ＬＰＳの含有割合が、従来製法のＬＰＳ（ＩＰ－ＰＡ１）と比べて、結果として高くなる。本発明の製造方法においては、第二工程の精製で逆相クロマトグラフィーを用いているので、脂溶性が高いＬＰＳ（親水性の糖鎖が少なく脂溶性のＬｉｐｉｄ　Ａ部分の割合が高いＬＰＳ）が、選択的に回収された可能性が高いと考えられる。
すなわち、逆相クロマトグラフィーによる精製工程を含むことで、低分子量ＬＰＳ高含有のＬＰＳを製造することができる。そのため、低分子量ＬＰＳが高含有量であるために、安全性および生理活性（サイトカイン誘導能）の高いＬＰＳが得られる。
以下、本発明の内容を実施例及び比較例によりさらに具体的に説明するが、本発明の権利範囲は実施例に限定されるものではない。
＜実施例及び比較例で用いるグラム陰性菌（パントエア菌）の調製＞
（前培養）
２５０ｍＬバッフルフラスコ（１０本）に各１００ｍＬの前培養用培養液（ＬＢ培地：１％トリプトン（ナカライテスク社製、微生物培養用特製試薬）、０．５％酵母エキス（ナカライテスク社製、微生物培養用）、１％塩化ナトリウム（富士フイルム和光純薬（株）製、特級））を分注し、１２１℃で１５分間、オートクレーブ（ＨＩＲＡＹＡＭＡ社製ＨＶ－５０）で滅菌処理をした。クリーンベンチ内で、無菌的にパントエアアグロメランス（自然免疫応用技研（株）製）を寒天培地から前記フラスコに植菌し、振蕩培養機（サンキ精機社製、ＲＭＳ－２０Ｒ）にセットし、振蕩培養した。振蕩培養条件は３５℃、１５０ｒｐｍとし、２２時間培養した。
（本培養）
１０Ｌの本培養培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム、０．２％グリセリン（富士フイルム和光純薬（株）製）、０．０４％クエン酸一水和物（富士フイルム和光純薬（株）製、特級）、０．２％リン酸水素二カリウム（富士フイルム和光純薬（株）製、特級）、０．０７％リン酸水素アンモニウム四水和物（富士フイルム和光純薬（株）製、一級）、０．０１％Ａｎｔｉｆｏａｍ　２０４（Ｓｉｇｍａ社製））を２０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジン社製）に入れ、１２１℃で３０分間オートクレーブ滅菌した。
上記の本培養培地に、１０％　硫酸マグネシウム七水和物（富士フイルム和光純薬（株）製、特級）を０．０４％になるように無菌的に加えた。さらに、上記の前培養液を５００ｍＬ、無菌的に流し込み植菌し、本培養を行った。本培養の条件は、培養温度：３０℃、撹拌速度：３００ｒｐｍ、通気量：１８～２０Ｌ／ｍｉｎ、ｐＨ：６．８～７．２とした。培養開始１６時間経過後に培養液を回収した。
上記の１０Ｌ培地スケールの本培養操作を並行して２セット実施し、それらを合わせて均質化（混合）した上で、次の菌体回収操作に供した。
（菌体回収）
上記の均質化した本培養液を１Ｌ遠心管（２０本）に移し、４℃、８０００ｒｐｍ、２０分間の条件で遠心分離（高速冷却遠心機：ＫＵＢＯＴＡ社製７７８０）を行った後、上清を取り除き、沈殿物として菌体ペレットを回収した（菌体ペレットの合計量２６０ｇ）。得られた菌体ペレットは－３０℃で凍結保存した。
以上の方法で得られたパントエアアグロメランスの菌体ペレット（凍結保存品）について、実施例あるいは比較例の方法でＬＰＳの抽出、精製を行った。
（実施例１）（熱水抽出（第一工程）＋限外ろ過＋Ｃ４逆相ＨＰＬＣ（第二工程））
［１］熱水抽出
上述のグラム陰性菌（パントエア菌）の調製の操作で得たパントエアアグロメランスの菌体ペレット７８ｇを、４００ｍＬの注射用水（大塚製薬工場社製）に添加して懸濁した。ｐＨメーター（堀場製作所社製　ＬＡＱＵＡ）で測定したところ、懸濁液のｐＨが６．０であったので、水酸化ナトリウム（富士フイルム和光純薬（株）製）（１０Ｎ）を加えて中和した。その後、オートクレーブ（ＨＩＲＡＹＡＭＡ社製ＨＶ－５０）を用いて、９０℃にて２０分間加熱した。冷却した後、１Ｌ遠心管に移し８０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離し、上清（熱水抽出液）を回収した。
［２］限外ろ過処理
上記熱水抽出液１５ｍＬを、分画分子量３０ｋｄａの限外ろ過チューブ（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　ｆｉｌｔｅｒ　ｕｎｉｔｓ）に加えて、遠心分離（７０００ｒｐｍ×３０分）し、限外ろ過膜の未透過側にＬＰＳを含む濃縮液を得た。さらに濃縮液に注射用水を１５ｍＬ追加し、同様に遠心分離を行って、濃縮液の洗浄を行った。同様の洗浄をさらに５回繰り返して、洗浄後の濃縮液を回収し、注射用水を加えてメスアップし、１５ｍＬの限外ろ過済み懸濁液を得た。
［３］クロマトグラフィー精製の前処理（可溶化処理）
上記の限外ろ過済み懸濁液の１ｍＬに、可溶化緩衝液（０．２５％デオキシコール酸ナトリウム、２００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭトリス－ＨＣｌ（ｐＨ約９．５））３ｍＬを加え、よく混和し４倍に希釈した。可溶化されない沈殿物を、孔径０．４５μｍのシリンジフィルターで除去し、約３．５ｍＬの可溶化処理済み溶液（上記抽出液中のＬＰＳを含む溶液）を得た。
［４］クロマトグラフィー精製
上記の可溶化処理済み溶液の一部（１５００μＬ）を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置にインジェクションし、ＬＰＳ該当成分（サンプルフラクション）を分取した。カラムとしては、ブチル基（炭素数４のアルキル基）を有する逆相シリカゲルカラム（Ｃ４逆相カラム）を用いた。すなわち、Ｃ４逆相カラムを備えたＨＰＬＣ（Ｃ４逆相ＨＰＬＣ）を用いた。移動相は環境負荷の小さい、水溶液／メタノール系のグラジエント分離を採用した。水溶液にはギ酸およびトリエチルアミンを添加した。グラジエントは、Ａ液リッチ条件で流した後に、Ｂ液の濃度を上げるグラジエント条件とした。
具体的な分離条件は以下の通りである。
＜ＨＰＬＣ分離条件＞
・装置：ＨＰＬＣ（島津製作所社製「Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ」）
・Ｃ４逆相カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＢＥＨ　Ｃ４　Ｃｏｌｕｍｎ，　３００Å，　３．５μｍ，４．６ｍｍＸ１００ｍｍ　Ｗａｔｅｒｓ社製
・溶離液：Ａ液（５０ｍＭギ酸・５０ｍＭトリエチルアミン）の水溶液
Ｂ液　メタノール
・グラジエント条件（体積％）：
０～１０ｍｉｎ：濃度一定条件（Ａ液９５％／Ｂ液５％）、
１０～３５ｍｉｎ：直線的グラジエント条件
（Ａ液９５％／Ｂ液５％（１０ｍｉｎ）→（Ａ液５％／Ｂ液９５％（３５ｍｉｎ））、
３５～５０ｍｉｎ：濃度一定（Ａ液５％／Ｂ液９５％）
・流量：４．５ｍＬ／ｍｉｎ
・カラム温度：４０℃
・試料注入量：１５００μＬ
・検出器（ＤＡＤ）：２１０ｎｍ
［５］クロマトグラフィー精製の後処理（有機溶媒除去および濃縮）
上記［４］のクロマトグラフィー精製により分取したサンプルフラクションについて、メタノール除去のために３５℃でエバポレートし（ロータリーエバポレーター）、揮発しなかった水溶液を回収し、注射用水を加えて１５ｍＬとした。
その液を、分画分子量１０ｋｄａの限外ろ過チューブ（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　ｆｉｌｔｅｒ　ｕｎｉｔｓ）に加えて、遠心分離（７０００ｒｐｍ×３０分）し、限外ろ過膜の未透過側にＬＰＳを含む濃縮液を得た。さらに濃縮液に注射用水を１５ｍＬ追加し、同様に遠心分離を行って、濃縮液の洗浄を行った。同様の洗浄をさらに５回繰り返して、洗浄後の濃縮液を回収し、注射用水を加えてメスアップし、４ｍＬの水溶液を得た。
［６］凍結乾燥
得られた水溶液を真空凍結乾燥機（日本テクノサービス社製ＦＤ－２ＢＵ－ＳＱ）にて凍結乾燥し（条件：－２０℃、５Ｐａ、１５ｈ）、最終産物である実施例１にかかるＬＰＳを得た。
（実施例２）（熱水抽出＋Ｃ４逆相ＨＰＬＣ）
実施例１の工程［１］を経て得られた熱水抽出液を用いた。実施例１で行った工程［２］限外ろ過処理は行わなかった。
実施例１の工程［３］クロマトグラフィー精製の前処理（可溶化処理）で用いた、限外ろ過済みの懸濁液１ｍＬに変えて、熱水抽出後の懸濁液１ｍＬを用いた以外は、実施例１の工程［３］と同様の操作を行い、約３．５ｍＬの可溶化処理済み溶液を得た。
得られた可溶化処理済み溶液に対し、実施例１の工程［４］クロマトグラフィー精製、［５］クロマトグラフィー精製の後処理（有機溶媒除去および濃縮）、及び、［６］凍結乾燥と同様の操作を行い、最終生産物である実施例２にかかるＬＰＳを得た。
（比較例１）（ＴＣＡ抽出＋ＰｈＯＨ抽出＋限外ろ過）
［１１］ＴＣＡ抽出
上述のグラム陰性菌（パントエア菌）の調製の操作で得たパントエアアグロメランスの菌体ペレット１３０ｇと、蒸留水とを３Ｌビーカーに添加して、攪拌混合し３００ｍｇ／ｍＬの懸濁液（４３３ｍＬ）を調製した。
上記懸濁液と等量の０．５Ｍトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）水溶液を添加し、１５～２０℃で３時間攪拌混合した（１００ｒｐｍ）。その後、遠心管に移し、遠心分離（８，０００Ｇ×１５分）して上清を得た。これを３Ｌビーカーに加え、１０Ｎ　ＮａＯＨ（２０μＬ／ｍＬ）を添加し、ｐＨを７．０に調整しＴＣＡ抽出液とした。
得られたＴＣＡ抽出液３００ｍＬに、－２０℃のエタノール６００ｍＬを添加し、攪拌混合した後、上記ＴＣＡ抽出液を－２０℃で一晩静置し、翌日遠心分離（７，０００Ｇ×１５分）して沈殿を得た。得られた沈殿に蒸留水４０ｍＬを添加し懸濁液を調製し、凍結乾燥を行い、乾燥ＴＣＡ抽出物１．７ｇを得た。
［１２］フェノール抽出
ビーカーに、得られた乾燥ＴＣＡ抽出物１．６ｇと蒸留水４０ｍＬとを添加し、攪拌混合し、４０ｍｇ／ｍＬの懸濁液を調製した。次に、上記懸濁液に６８℃に加温した９０％フェノール水溶液を４０ｍＬ添加し、６８℃で２０分間攪拌した。続いて、上記懸濁液が２０℃以下まで冷めた後に、遠心管に懸濁液を移し、室温にて遠心分離した（７，０００Ｇ×３０分）。遠心分離後の遠心管の上層（１ｓｔ抽出液）を回収し、下層をフェノール抽出に使用したビーカーに戻した。
上記ビーカーに４０ｍＬの蒸留水を加え、６８℃で２０分間攪拌した。続いて、上記懸濁液が２０℃以下まで冷めた後に、得られた懸濁液を遠心管に移し、室温にて遠心分離した（７，０００Ｇ×３０分）。遠心分離後の遠心管の上層（２ｎｄ抽出液）を回収し、１ｓｔ抽出液と合わせて、フェノール抽出水層液とした。
［１３］限外ろ過処理
上記［１２］フェノール抽出水層液全量（約８０ｍＬ）を分画分子量１０ｋｄａの限外ろ過チューブ（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　ｆｉｌｔｅｒ　ｕｎｉｔｓ）に加えて、遠心分離（７０００ｒｐｍ×３０分）し、限外ろ過膜の未透過側にＬＰＳを含む濃縮液を得た。さらに濃縮液に注射用水を１５ｍＬ追加し、同様に遠心分離を行って、濃縮液の洗浄を行った。同様の洗浄をさらに１１回繰り返して、洗浄後の濃縮液を回収し、注射用水を加えてメスアップし、１５ｍＬの限外ろ過済み懸濁液を得た。
［１４］凍結乾燥
得られた限外ろ過済みの懸濁液を真空凍結乾燥機（日本テクノサービス社製ＦＤ－２ＢＵ－ＳＱ）にて凍結乾燥し（条件：－２０℃、５Ｐａ、１５ｈ）、最終産物である比較例１にかかるＬＰＳを得た。
（比較例２）（熱水抽出＋限外ろ過）
実施例１の工程［１］を経て得られた熱水抽出液１５ｍＬを用いて、実施例１の工程［２］と同様の操作を行い、限外ろ過処理を行った。限外ろ過処理で得られた懸濁液は１５ｍＬであった。
得られた限界ろ過済み懸濁液について、実施例１の工程［６］凍結乾燥と同様の操作を行い、最終産物である比較例２にかかるＬＰＳを得た。
（比較例３）（熱水抽出のみ）
実施例１の工程［１］を経て得られた熱水抽出液について、実施例１の工程［６］凍結乾燥と同様の操作を行い、最終産物である比較例３にかかるＬＰＳを得た。
＜ＬＰＳの定量＞
上記工程により得られた各実施例及び比較例に係るＬＰＳ（以下、サンプルという。）を下記の溶離液に溶かし、下記のＨＰＬＣ法にてＬＰＳの定量を行った。また、定量結果から、菌体ペレット１ｋｇに対するＬＰＳ収量を算出し、下記表１に記載した。
＜ＨＰＬＣ法＞
各サンプルを溶離液で適宜希釈し、ＨＰＬＣにインジェクションした。定量は絶対検量線法により行った。
＜ＨＰＬＣ分離条件＞
・装置：ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製「ＨＰＬＣ　１２６０　Ｉｎｆｉｎｉｔｙ」）
・カラム：ＰＬ－ａｑｕａｇｅｌ－ＯＨ　３０　Ａｇｉｌｅｎｔ社製（粒径８ｕｍ、長さ３００ｍｍ×内径７．５ｍｍ）×３本連結
・溶離液：０．２５％デオキシコール酸ナトリウム、２００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭトリス－ＨＣｌ水溶液（ｐＨ９．５）
・流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
・カラム温度：４０℃
・試料注入量：５０μＬ
・検出器：示差屈折率検出器
・標準物質：パントエアアグロメランス由来ＬＰＳ標準品（純度９５％以上）
＜タンパク質及び核酸の各サンプル中濃度の測定＞
下記方法により、各サンプル中に残存するタンパク質及び核酸の濃度を測定した。その結果を下記表１に記載した。
（タンパク質含有率の測定）
重量を測定した各サンプルを水に溶解し、ＢＣＡ法（Ｔｈｅｒｍｏ社製「Ｐｉｅｒｃｅ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ」）にてタンパク質含有量を測定した。
さらに水溶液の液量を乗じてタンパク質含有量を求めた。
その上で次の式１により各サンプル中のタンパク質含有率を求め、表１に示した。
（式１）タンパク質含有率（％）＝（タンパク質含有量（ｍｇ）／サンプル（ｍｇ））×１００
（核酸含有率の測定）
重量を測定した各サンプルを水に溶解した水溶液について、分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＰｌｕｓ３８４）にて、水を対照として、各サンプル水溶液の２６０ｎｍおよび３２０ｎｍの吸光度を求め、次の式２により水溶液中の核酸濃度Ａｃを求めた。
（式２）Ａｃ（μｇ／ｍＬ）＝Ｏ．Ｄ．２６０ｎｍ－Ｏ．Ｄ．３２０ｎｍ）×５０
さらに水溶液の液量を乗じて核酸含有量を求めた。
その上で次の式３により各サンプル中の核酸含有率を求め、表１に示した。
（式３）核酸含有率（％）＝（核酸含有量（ｍｇ）／サンプル（ｍｇ））×１００
（ＬＰＳ純度の計算）
次の式４により得られた各サンプルのＬＰＳの純度を求め、表１に示した。
（式４）ＬＰＳ純度（％）＝１００－タンパク質含有率（％）－核酸含有率（％）
（菌体ペレット１ｋｇあたりＬＰＳ収量の算出方法）
菌体ペレットＷ（ｇ）から得た抽出液（熱水またはＴＣＡ）Ｖ（ｍＬ）のうちｖ（ｍＬ）を精製してＷＬＰＳ（ｇ）のＬＰＳを得た場合、菌体ペレット１ｋｇあたりＬＰＳ収量はＷＬＰＳ×（Ｖ／ｖ）×（１０００／Ｗ）（ｇ）である。これに基づき、実施例及び比較例にかかるＬＰＳの収量を算出し、表１に示した。
＜第一種指定化学物質最大処理濃度＞
（第一種指定化学物質最大処理濃度の算出方法）
各工程において溶媒成分Ａがａ（ｍＬ）、成分Ｂがｂ（ｍＬ）、成分Ｃがｃ（ｍＬ）混合されており、Ｂが第一種指定化学物質である場合、第一種指定化学物質処理濃度は｛ｂ／（ａ＋ｂ＋ｃ）｝×１００（％）である。実施例または比較例に採用される各工程において第一種指定化学物質処理濃度を算出し、最も高いものを第一種指定化学物質最大処理濃度として、表１に示した。
なお、比較例１に係るサンプルの調製に用いられた第一種指定化学物質（化学物質排出把握管理促進法）に指定される物質は、トリクロロ酢酸及びフェノールであり、製造過程におけるこれらの最大処理濃度を下記表１に示す。
また、実施例１および２に係るサンプルの調製に用いられた第一種指定化学物質（化学物質排出把握管理促進法）に指定される物質は、トリエチルアミンであり、製造過程における最大処理濃度を下記表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
上記表１の結果から、実施例１および２では、熱水抽出とＣ４逆相カラムＨＰＬＣの組合せによって、限外ろ過の有無にかかわらず、抽出溶媒として環境負荷の高い有機溶媒を用いることなく、また、製法全行程での第１種指定化学物質の使用量も少なく抑えて、十分な純度のＬＰＳを製造することができた。環境負荷の高いＴＣＡおよびフェノールで抽出した従来のＬＰＳ製造方法である比較例１と同程度の高純度であり、収量も遜色ないことがわかる。そして、熱水抽出のみ、あるいは熱水抽出と限外ろ過だけでは、ＬＰＳ収量、ＬＰＳ純度ともに十分ではないことがわかる。この結果より、熱水抽出と特定の逆相カラムを用いたＨＰＬＣを組み合わせたことにより、抽出工程で環境負荷の高い有機溶媒を用いず、また、製法全体で第一種指定化学物質の使用量も少なく抑えて、ＬＰＳ収量、ＬＰＳ純度ともに満足できるレベルでＬＰＳを製造できることは明らかである。
次に実施例２の製法で調製したＬＰＳ（ＬＰＳ純度９４．４％）について、ＬＰＳとしての構造的特徴を明確化する目的で、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動法により分子量分布を評価した。また、ＥＬＩＳＡ法によるＬＰＳ定量値（Ｅ）と、リムルス試験（エンドポイント－比色法）によるＬＰＳ定量値（Ｌ）を求め、その比（Ｅ／Ｌ比）を評価した。
その測定方法および測定結果を以下に記す。
（測定サンプル）
実施例２の製法で調製したサンプル（ＬＰＳ純度９４．４％）（Ｌｏｔ．２、Ｌｏｔ．３）
ＩＰ－ＰＡ１標準品（パントエアアグロメランス由来ＬＰＳ、ＬＰＳ純度９７．３％、自然免疫応用技研（株）製、Ｌｏｔ．４）（比較対象として測定）
なお、ＩＰ－ＰＡ１標準品は、パントエアアグロメランス由来ＬＰＳであるが、その製法は本発明とは異なる。ＩＰ－ＰＡ１は、ホットフェノール水によって抽出し、陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製して得たものである。
＜ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動法による分子量分布の測定＞
（測定方法）
Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥによりＬＰＳを分画し、銀染色法により可視化した。Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、Ｓｃｈａｅｇｇｅｒ　Ｈ．らの論文（１）を参考にした。１５％ポリアクリルアミドゲルはアトー社製のプレキャストゲルを用い、Ｔｒｉｃｉｎｅは泳動Ｂｕｆｆｅｒにのみ加えた。銀染色法は、Ｔｓａｉらの論文（２）を参考にして、富士フイルム和光純薬（株）製の電気泳動用銀染色ＩＩキット　ワコーを用いて染色した。
参考論文：
（１）Ｔｒｉｃｉｎｅ－ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｆｒｏｍ　１　ｔｏ　１００　ｋＤａ．　Ｓｃｈａｅｇｇｅｒ　Ｈ，　ｖｏｎ　Ｊａｇｏｗ　Ｇ．　Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１９８７　Ｎｏｖ　１；１６６（２）：３６８－７９
（２）Ａ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｓｉｌｖｅｒ　ｓｔａｉｎ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｉｎ　ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌｓ．　Ｔｓａｉ　ＣＭ，　Ｆｒａｓｃｈ　ＣＥ．　Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１９８２　Ｊａｎ　１；１１９（１）：１１５－９．
（泳動用試料溶液の調製および電気泳動）
ＩＰ－ＰＡ１標準品、実施例２のＬＰＳ（Ｌｏｔ．２、Ｌｏｔ．３）を電気泳動した。
ＩＰ－ＰＡ１標準品、実施例２のＬＰＳ（Ｌｏｔ．２、Ｌｏｔ．３）については、蒸留水を加えて５００μｇ／ｍＬとした。それぞれ、１２μＬを各３本ずつ１．５ｍＬチューブに分注し、同量（１２μＬ）の試料緩衝液（ナカライテスク社製、試料緩衝液（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用、２倍濃縮、２－ＭＥ含有））を加えよく混ぜ、１００℃のヒーティングブロック中（アルミブロックヒーター、サイニクス社製）で５分間加熱処理した。処理後に氷水中で急冷し、遠心分離により試料をチューブの底に集めた後、ゲルに２０μＬアプライした。
なお、泳動用緩衝液は下記表２の組成で調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
サイズマーカー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、プレシジョンＰｌｕｓプロテインデュアルエクストラスタンダード、分子量サイズ：２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、２０、１５、１０、５、２ｋＤａ）は、１μＬを試料緩衝液（ナカライテスク社製、試料緩衝液（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用、２倍濃縮、２－ＭＥ含有））を蒸留水で２倍希釈したもの（３９μＬ）に加え、ゲルに２０μＬアプライした。サイズマーカーと検体をアプライした後、直ちに、２０ｍＡコンスタントで泳動を開始し、ＢＰＢ（マーカー色素）が分離ゲルの下端から１ｃｍの位置まで泳動された時点（約６０分）で泳動を終了した。泳動終了後、ゲル板を装置よりはずし、ゲルを銀染色用の固定液につけた。
（銀染色法）
富士フイルム和光純薬（株）製の電気泳動用銀染色ＩＩキット　ワコーを用いて染色した。染色操作は、添付の説明書に従った。
得られた電気泳動図を、図１のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（銀染色法）泳動図に示す。図１のＳＤＳ－ＰＡＧＥは、左からＩＰ－ＰＡ１標準品（Ｌｏｔ．４）（Ｎ＝３）、実施例２のＬＰＳ（Ｌｏｔ．２）（Ｎ＝３）、実施例２のＬＰＳ（Ｌｏｔ．３）（Ｎ＝３）、プロテインサイズマーカーの順に並んでいる。図１の縦軸は、分子量を示す。また、プロテインサイズマーカー基準で求めた分子量を下記表３に示す。
（各バンドの総輝度値の解析）
次に、イメージＪソフトウェア（フリー画像処理ソフトウェア、ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／、ＩｍａｇｅＪ　１．５２ａ）を用いて、画像データを読み込み、各レーンの高分子量領域のバンドと低分子領域のバンドの総輝度値（輝度値×面積）を求めた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる低分子量成分と高分子量成分の総輝度値の測定結果を下記表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（測定結果）
電気泳動の結果、プロテインサイズマーカー基準で求めた分子量は、低分子領域バンドは、ＩＰ－ＰＡ１標準品、実施例２のＬＰＳともに５０００～２００００であった。高分子領域バンドは、ＩＰ－ＰＡ１標準品が２００００～７００００であるのに対して、実施例２のＬＰＳは２５０００～６００００と狭い分布であった。
次に各バンドの総輝度値については、ＩＰ－ＰＡ１標準品では、輝度値で低分子ＬＰＳの割合が７４．９％に対して、実施例２のＬＰＳ　Ｌｏｔ．２では、８２．３％、Ｌｏｔ．３では８４．６％と、実施例２のＬＰＳは両ロット共、低分子ＬＰＳの比率がＩＰ－ＰＡ１標準品より高いことが示された。
＜Ｅ／Ｌ比の測定＞
（ＥＬＩＳＡ法によるＬＰＳの定量方法）
ＩＰ－ＰＡ１糖鎖特異的抗体（自然免疫応用技研（株）製）を用いたＥＬＩＳＡ法によって、サンプル中のＬＰＳ含有量（Ｅ）（μｇ／ｍｇ）を測定した。具体的には、以下の手順でＥＬＩＳＡ測定を行った。
１）３４－Ｇ２（固相化抗体：自然免疫応用技研（株）製、Ｌｏｔ．２０１１０７－７、ＩＰ－ＰＡ１のＯ抗原多糖に対する抗体）を、使用時にフィルター濾過滅菌したＰＢＳ（－）にて、８００倍希釈した。９６穴イムノプレートに５０μＬずつ分注し、液が蒸発しないようにパラフィルムで密閉して４℃にて保存した。
２）３４－Ｇ２を加えた９６穴イムノプレートを４℃から出し、液を捨てた後、ブロッキング溶液（ＰＢＳ（－）に終濃度３％（ｗ／ｖ）になるようにＢＳＡを加えた溶液）を２００μＬ／ウエルの割合で入れ、２５℃で３０分以上放置し、抗体その他のタンパクの非特異的吸着を防止した。
３）洗浄液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ７．５、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）　Ｔｗｅｅｎ２０相当品）２００μＬで３回洗浄後、ウエルに段階希釈したＩＰ－ＰＡ１標準品（ＩＰ－ＰＡ１純度９７．２％以上：自然免疫応用技研（株）製、Ｌｏｔ．４）５０μＬを入れた。同じ９６穴イムノプレートの別のウエルに、測定対象のサンプル溶液を５０μＬ入れた。２５℃の恒温槽で１時間放置した。
４）洗浄液　２００μＬでウエルを３回洗浄し、１０００倍希釈した４Ｅ－１１（１次抗体：自然免疫応用技研（株）製、Ｌｏｔ．２０１７０７０２、ＩＰ－ＰＡ１のＯ抗原多糖に対する抗体）を５０μＬ／ウエルで入れ、２５℃の恒温槽で１時間放置した。
５）洗浄液　２００μＬでウエルを３回洗浄し、１０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ免疫グロブリン抗体（Ｓｉｇｍａ社製、Ｃａｔ．１４１８）を５０μＬ／ウエルで入れ、２５℃の恒温槽で１時間放置した。
６）洗浄液　２００μＬでウエルを５回洗浄し、発色液（ｐ－ニトロフェニルリン酸二ナトリウム六水和物（ｐ－ＮＰＰ）：ナカライテスク社製、Ｃａｔ．２５０１９－５２、Ｌｏｔ．ＭＯＰ２２５９）を１００μＬ／ウエルで入れ、室温で１時間放置した。
７）その後、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ、Ｐｌｕｓ３８４）にて４１５ｎｍの吸光度を測定した。検量線は２次曲線で作成した。
８）検量線を用いて、サンプル溶液の吸光度から、サンプル溶液中ＬＰＳ濃度（μｇ／ｍＬ）を算出した。サンプル溶液中ＬＰＳ濃度を、サンプル溶液中サンプル濃度（ｍｇ／ｍＬ）（調製時のサンプル秤量値と溶液量から算出）で除すことで、サンプル中のＬＰＳ含有量（Ｅ）（μｇ／ｍｇ）を求めた。
なお、本ＥＬＩＳＡ法の検出限界は１．６ｎｇ／ｍＬである。
ＩＰ－ＰＡ１標準品（Ｌｏｔ．４）、実施例２のＬＰＳ（Ｌｏｔ．２及びＬｏｔ．３）について、ＥＬＩＳＡ法によるＬＰＳ定量を行った。各測定結果を下記表５に示す。
（リムルス試験（エンドポイント－比色法）によるＬＰＳ定量方法）
ＬＰＳ特異的に測定可能なリムルス測定キット（エンドスペシー　ＥＳ－５０Ｍセット、生化学工業社製）を用い、添付の説明書に従って、マイクロプレートを用いたエンドポイント－比色法によりサンプル（実施例２のＬＰＳ（Ｌｏｔ．２及びＬｏｔ．３）及びＩＰ－ＰＡ１標準品（Ｌｏｔ．４））中のＬＰＳ含有量（Ｌ）（μｇ／ｍｇ）を測定した。
測定には、エンドトキシン標準品としてＣＳＥ（１０ｎｇ／ｖｉａｌ）（生化学工業社製）を用いた。各測定結果を下記表５に示す。
上記の２つの方法で求めたＬＰＳ含有量（ＥおよびＬ）に基づき、その比（Ｅ／Ｌ比）を求めた。結果を下記表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（測定結果）
従来製法で製造されたＩＰ－ＰＡ１のＥ／Ｌ比が１．６４であるのに対し、実施例２のＬＰＳは０．７１～０．７２、と低い値となった。
ＬＰＳは、生物由来の物質であるため、異なる構造および分子量の分子の混合物と考えられる。よって、本発明の産物も構造式によって明確に規定することは困難である。そこで、構造に起因する特性値を評価することによって、製造産物の特性を明確化した。すなわち、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動法の測定結果より、実施例の方法で製造することで、ＬＰＳ全体に対する低分子量ＬＰＳの比率が、従来製法のＬＰＳ（ＩＰ－ＰＡ１）よりも高いＬＰＳ混合物が得られたことが確認できた。また、実施例の方法で製造したＬＰＳのＥ／Ｌ比の値が従来製法のＬＰＳ（ＩＰ－ＰＡ１）よりも小さいことは、分子量への寄与が大きい糖鎖部分が短くなっていることを示しており、この結果からも、実施例の方法で製造することによって、ＬＰＳ全体に対する低分子量ＬＰＳの比率が、従来製法のＬＰＳ（ＩＰ－ＰＡ１）よりも高いＬＰＳ混合物が得られたことを示していることを確認した。
すなわち、本発明の製造方法においては、精製工程で逆相クロマトグラフィーを用いているので、脂溶性が高いＬＰＳ（親水性の糖鎖が少なく脂溶性のＬｉｐｉｄ　Ａ部分の割合が高いＬＰＳ）が、選択的に回収された可能性が考えられた。
以上のように本発明のＬＰＳは、特定の製造方法で製造することにより、ＬＰＳ全体における低分子量ＬＰＳの割合の多い産物（ＬＰＳ）が得られる。そして、その分子量分布ゆえに、安全性および生理活性（サイトカイン誘導能）の高いＬＰＳである。

 

Claims (15)

  1. グラム陰性菌からリポポリサッカライドを抽出、精製するリポポリサッカライドの製造方法であって、
    前記グラム陰性菌を熱水で抽出することにより、前記リポポリサッカライドを含む抽出液を得る第一工程と、
    逆相液体クロマトグラフィーを用いて前記抽出液又は前記抽出液中のＬＰＳを含む溶液を精製することにより、リポポリサッカライドを得る第二工程とを含み、
    前記逆相液体クロマトグラフィーにおける逆相カラムは、炭素数が１～８の官能基を有する材料で構成された充填剤を有する
    ことを特徴とするリポポリサッカライドの製造方法。
  2. 充填剤は、炭素数が２～６の官能基を有する材料で構成されていることを特徴とする、請求項１に記載のリポポリサッカライドの製造方法。
  3. 充填剤は、炭素数が２～４の官能基を有する材料で構成されていることを特徴とする、請求項１又は２に記載のリポポリサッカライドの製造方法。
  4. 充填剤は、炭素数が４の官能基を有する材料で構成されていることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載のリポポリサッカライドの製造方法。
  5. 官能基はアルキル基であることを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載のリポポリサッカライドの製造方法。
  6. 第一工程の熱水の温度が５０～１５０℃であることを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載のリポポリサッカライドの製造方法。
  7. 第一工程の熱水の温度が５０～９９℃であることを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載のリポポリサッカライドの製造方法。
  8. 第一工程の熱水の温度が７０～９９℃であることを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載のリポポリサッカライドの製造方法。
  9. 第一工程の熱水の温度が８５～９５℃であることを特徴とする、請求項１～８のいずれか一項に記載のリポポリサッカライドの製造方法。
  10. グラム陰性菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｐａｎｔｏｅａ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｏｓｅｏｍｏｎａｓ属とＲｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ属からなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする、請求項１～９のいずれか一項に記載のリポポリサッカライドの製造方法。
  11. グラム陰性菌は、Ｐａｎｔｏｅａ属であることを特徴とする、請求項１～１０のいずれか一項に記載のリポポリサッカライドの製造方法。
  12. 請求項１～９のいずれか一項に記載の製造方法で製造されたことを特徴とする、リポポリサッカライド。
  13. 請求項１０又は１１記載のグラム陰性菌から得られることを特徴とする、請求項１２に記載のリポポリサッカライド。
  14. ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法で測定した分子量が２０００～２００００である低分子量リポポリサッカライドと、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法で測定した分子量が２００００より大きく１０００００以下である高分子量リポポリサッカライドとを含み、前記低分子量リポポリサッカライドと前記高分子量リポポリサッカライドとの合計量に対する、前記低分子量リポポリサッカライドの含有量が８０％以上であることを特徴とする、請求項１２又は１３に記載のリポポリサッカライド。
  15. ＥＬＩＳＡ法によるリポポリサッカライド定量値（Ｅ）をリムルス試験（エンドポイント－比色法）によるリポポリサッカライド定量値（Ｌ）で除した値（Ｅ／Ｌ比）が１．０以下であることを特徴とする、請求項１２～１４のいずれか一項に記載のリポポリサッカライド。
     

     
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