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WO2021049486A1 - 酵素種判別方法及び検査装置、並びにプログラム - Google Patents

酵素種判別方法及び検査装置、並びにプログラム Download PDF

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Publication number
WO2021049486A1
WO2021049486A1 PCT/JP2020/033948 JP2020033948W WO2021049486A1 WO 2021049486 A1 WO2021049486 A1 WO 2021049486A1 JP 2020033948 W JP2020033948 W JP 2020033948W WO 2021049486 A1 WO2021049486 A1 WO 2021049486A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
classification
judgment information
information
judgment
image
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2020/033948
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
直樹 松永
征和 霞
文章 渡邉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fukoku Co Ltd
Original Assignee
Fukoku Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fukoku Co Ltd filed Critical Fukoku Co Ltd
Publication of WO2021049486A1 publication Critical patent/WO2021049486A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor

Definitions

  • the present invention relates to an enzyme species discriminating method for discriminating an enzyme species produced by a cell, a test device used for discriminating an enzyme species produced by a cell, and a program used for discriminating the enzyme species.
  • the minimum inhibitory concentration (MIC) which is the minimum concentration at which an antimicrobial drug inhibits the growth or growth of bacteria
  • MIC minimum inhibitory concentration
  • a breakpoint (BP) is set by a public institution or the like as a reference value used clinically to predict the therapeutic effect of an antimicrobial drug from the MIC value which is the result of a drug susceptibility test. ..
  • BP has a risk that its value is set only by whether or not an antimicrobial drug can be used against the bacterium without considering the drug resistance mechanism of the bacterium.
  • Many bacteria having a MIC of BP or less despite having a gene that produces an enzyme that decomposes an antimicrobial drug have also been reported in Non-Patent Document 1.
  • the function of degradation of antimicrobial agents by enzyme production is generally very easy to propagate between bacteria.
  • antimicrobial agents such as substrate-specific extended ⁇ -lactamase (ESBL), which is an enzyme evolved in the propagation pathway, are decomposed. Bacteria that have genes that produce enzymes are regarded as important, and have become a problem in clinical practice.
  • ESBL substrate-specific extended ⁇ -lactamase
  • a device has been proposed that tests the susceptibility or resistance of bacteria or cells to antimicrobial agents in a short time and with a simple procedure.
  • bacteria are cultured in the presence of an antimicrobial agent on a culture plate, and the state of bacterial division is monitored by observing the shape and number of bacteria in each well of the culture plate under a microscope. Disclosure that MIC, which is a drug susceptibility result, can be obtained by analyzing the shape, number, and area of bacteria obtained from the images obtained by observation and their changes over time, and comparing the information in the database with the analysis results. doing.
  • Patent Document 2 a liquid containing bacteria and an antimicrobial agent is introduced into the microchannel of the microchannel cartridge to cultivate the bacteria, and then the bacteria in the microchannel are photographed to obtain an image. It is disclosed that as a result of showing drug susceptibility, particularly MIC is obtained from the information obtained from.
  • the information obtained from the image is the number of bacteria, the circumference length, and the like, and the MIC can be obtained by statistically analyzing them and determining them by an algorithm.
  • Patent Documents 1 and 2 use an image of cells when cells are cultured in the presence of an antimicrobial drug as input, and perform drug susceptibility results by image processing, collation with a database, execution of a determination algorithm, and the like. It is intended to output the MIC.
  • An object of the present invention is to provide an enzyme species discriminating method and an inspection device capable of easily discriminating an enzyme species produced by cells such as bacteria, and a program for implementing such an enzyme species discriminating method.
  • the enzyme species determination method of the present invention It is an enzyme species discrimination method for discriminating the enzyme species produced by cells.
  • a judgment information creation step of creating judgment information indicating the characteristics of cell morphology for each flow path from a photographed image which is an image of a plurality of flow paths taken at the same time.
  • a judgment information standardization step of selecting standard judgment information to be a judgment standard from the judgment information and standardizing the judgment information using the reference judgment information.
  • the photographed image is an image showing a state in which cultured cells are present inside each of the plurality of channels.
  • judgment information is obtained for each flow path by image processing from captured images obtained by photographing a plurality of flow paths in which cultured cells exist, and standardized judgment is performed. Classification is performed based on the information to determine the enzyme type.
  • this method for example, it is possible to obtain changes in cell morphology due to the presence or absence of an antimicrobial agent and the difference in the combination of the antimicrobial agent and the inhibitor, regardless of the difference in imaging conditions for each flow path. It is possible to classify cells based on changes in cell morphology for each channel. As a result, according to this method, the enzyme species produced by cells such as bacteria can be easily identified.
  • a pre-classification step of executing subject classification by a reference judgment information group consisting of judgment information for each subject classification to obtain subject classification is further provided, and in the classification step, the pre-classification step is obtained. It is possible to select a classification parameter corresponding to the subject classification and classify the determination information using the selected classification parameter. For the classification of the subject by the reference determination information group, for example, a discriminator by multiple regression analysis can be used. By associating the subject classification with the difference in cell type, it is possible to discriminate the produced enzyme type with higher accuracy.
  • the photographed image is, for example, an image obtained by photographing a microchannel chip having an observation unit composed of a plurality of channels, and the plurality of channels are contained in one field of view. It may be an image of the state of cells existing in each flow path.
  • the photographed image is an image obtained by photographing the morphological change of the cell due to the influence of either the influence of the antimicrobial agent or the influence of the reagent combining the antimicrobial agent and the inhibitor. May be.
  • the drug resistance of the antimicrobial drug can be appropriately evaluated.
  • the reference determination information since the reference determination information is used as a reference at the time of standardization, it is preferable that the reference determination information corresponds to the flow path in which neither the antimicrobial agent nor the inhibitor is present.
  • the determination information preferably includes at least the number of particles in the photographed image.
  • the number of particles in the photographed image is judgment information that directly corresponds to the number of cells, and is considered to be one of the indexes that accurately indicate the growth state of the cells.
  • the judgment information creation step a plurality of types of judgment information are acquired for each flow path to form a judgment information group, and in the classification step, discrimination is performed by multiple regression analysis based on the plurality of types of judgment information. It is preferable to use a device to classify the judgment information group.
  • the inspection device of the present invention A test device that determines the type of enzyme produced by cells.
  • Judgment information creating means for creating judgment information indicating the characteristics of cell morphology for each flow path from captured images, each of which is an image of a plurality of flow paths taken at the same time.
  • Criteria judgment information selection means for selecting the reference judgment information to be the judgment reference from the judgment information, and
  • Judgment information standardizing means for standardizing the judgment information using the reference judgment information
  • a classification means for classifying the judgment information based on the standardized judgment information
  • a determination means for determining the enzyme species from the classification information obtained by the classification means, and Have,
  • the photographed image is an image showing a state in which cultured cells are present inside each of the plurality of channels.
  • judgment information is obtained and standardized for each flow path by image processing from captured images obtained by photographing a plurality of flow paths in which cultured cells exist, and the standardized judgment information is obtained.
  • Classification is performed based on the enzyme type.
  • this inspection device for example, changes in cell morphology due to the presence or absence of antimicrobial agents and differences in the combination of antimicrobial agents and inhibitors are not affected by differences in imaging conditions for each flow path. It can be obtained, and classification can be performed based on changes in cell morphology for each channel.
  • the enzyme species produced by cells such as bacteria can be easily identified.
  • a pre-classification means for executing subject classification by a reference judgment information group consisting of judgment information for each subject classification and obtaining the subject classification is provided, and the classification means is a subject obtained by the pre-classification means.
  • the classification parameter corresponding to the classification can be selected, and the determination information can be classified using the selected classification parameter.
  • the preclassification means for example, a discriminator based on multiple regression analysis can be used.
  • the photographed image is, for example, an image obtained by photographing a microchannel chip having an observation unit composed of a plurality of channels, and the plurality of channels are contained in one field of view. It may be an image of the state of cells existing in each case. Further, the photographed image may be an image obtained by photographing the morphological change of the cell due to the influence of either the influence of the antimicrobial agent or the influence of the reagent combining the antimicrobial agent and the inhibitor.
  • the reference determination information is preferably determination information corresponding to the flow path in which neither the antimicrobial agent nor the inhibitor is present.
  • the determination information includes at least the number of particles in the captured image.
  • the judgment information creating means acquires a plurality of types of judgment information for each flow path to form a judgment information group, and the classification means uses a discriminator by multiple regression analysis based on the plurality of types of judgment information to obtain the judgment information group. It is desirable to carry out the classification.
  • the program of the present invention A computer that inputs captured images, which are images captured of multiple channels at the same time, Judgment information creation processing for creating determination information indicating the characteristics of cell morphology for each channel from the photographed image, which is an image showing the presence of cultured cells inside each of the plurality of channels. , Judgment information standardization processing that selects the standard judgment information to be the standard of judgment from the judgment information and standardizes the judgment information using the standard judgment information. Based on the standardized judgment information, the classification process for classifying the judgment information and From the classification information obtained by the classification process, a process for determining the enzyme species produced by the cells and To execute.
  • the program of the present invention is to input a photographed image of a plurality of flow paths in which cultured cells are present into a computer and cause the computer to execute image processing based on the program.
  • judgment information is obtained and standardized for each flow path, and classification is performed based on the standardized judgment information to determine the enzyme type. Therefore, for example, the presence or absence of an antimicrobial drug and the presence or absence of an antimicrobial drug are determined. It is possible to obtain changes in cell morphology due to differences in the combination of antimicrobial agents and inhibitors without being affected by differences in imaging conditions for each channel, and classify based on changes in cell morphology for each channel. Will be able to do. As a result, the enzyme species produced by cells such as bacteria can be easily identified.
  • the program of the present invention causes a computer to further classify a subject by a reference judgment information group consisting of judgment information for each subject classification, execute a pre-classification process for obtaining the subject classification, and in the classification process, the pre-classification process is performed.
  • the classification parameter corresponding to the obtained subject classification may be selected, and the determination information may be classified using the selected classification parameter.
  • the enzyme species produced by cells such as bacteria can be easily identified.
  • FIG. 1 It is a block diagram which shows the structure of the inspection apparatus of 1st Embodiment of this invention. It is a figure which shows the inspection apparatus realized by the computer. It is a top view which shows the appearance of the micro flow path chip. It is a top view which shows the internal space of each unit in a microchannel chip. It is an enlarged plan view of the observation part in the internal space of each unit in a microchannel chip. It is a flowchart which shows the method of discriminating the enzyme type in 1st Embodiment. It is a figure explaining the pre-processing by the discrimination method shown in FIG. It is a schematic diagram which shows an example of the image which image
  • the enzyme species discrimination method is a method for discriminating the enzyme species produced by cells such as bacteria.
  • cells are cultured in each of the plurality of channels of the microchannel device 1, and the state of the cells in these plurality of channels is simultaneously photographed so that the plurality of channels fit in one field of view.
  • the captured image is obtained by applying image processing or arithmetic processing to the captured image by an inspection device to determine the type of enzyme produced by the cell.
  • a microscope optical system 2 having an imaging unit such as a digital camera is provided, and an image captured by the microscope optical system 2, that is, a captured image is sent to the inspection device 30. Since the microscope optical system 2 observes cells cultured in the flow path of the microchannel device 1, it is desirable to use a phase-contrast microscope in order to accurately capture the contour of the cell to be observed. .. Further, in order to avoid excessive overlap of cells in the obtained observation image, it is desirable that the depth of field of the microscope optical system 2 is 10 ⁇ m to 20 ⁇ m.
  • the inspection device 30 shown in FIG. 1 includes an image storage unit 31 for storing a captured image, a determination information creating unit 32 for creating determination information indicating the characteristics of cell morphology for each flow path from the captured image, and a determination information.
  • the standard judgment information selection unit 33 that selects the standard judgment information that serves as the standard for judgment
  • the judgment information standardization unit 34 that standardizes the judgment information using the standard judgment information
  • the standardized judgment information It includes a classification unit 35 that classifies the determination information, and an enzyme type determination unit 36 that determines the enzyme type from the classification information obtained by the classification unit 35 and outputs the determination result. Since the photographed image shows the cells existing in the flow path, the particulate object in the photographed image corresponds to each cell.
  • the determination information is information obtained from a photographed image by a known image processing technique, and is, for example, information such as the number of particles, roundness, and peripheral length.
  • the determination information that can be used in this embodiment will be described later, but the number of particles corresponds to the number of cells, the roundness is the roundness in the shape of the cell, and the peripheral length is also the peripheral length of the cell.
  • one type of determination information may be used, but it is desirable to combine a plurality of types of determination information in order to more accurately determine the production enzyme type. When a plurality of types of judgment information are used, they are collectively called a judgment information group.
  • the inspection device 30 of the present embodiment can be realized by using a computer, for example, and a software program executed on the computer.
  • This program is a program that causes a computer that inputs captured images, which are images captured at a plurality of channels at the same time, to execute each process described later.
  • the program is stored in a recording medium such as a CD-ROM, distributed, and read into a computer via the recording medium. Alternatively, the program is loaded into the computer over the network.
  • a recording medium such as a CD-ROM that stores such a program non-temporarily and can be read by a computer, and a signal medium such as a cable used for transmitting the program to the computer via a network are also used in the present invention. Included in the category.
  • FIG. 2 shows the configuration of the device when the inspection device 30 shown in FIG. 1 is realized by the computer 3.
  • the display of the computer 3 can display, for example, a captured image 4 which is an observation image of the microscope optical system 2.
  • FIG. 3 is a plan view showing the appearance of the microchannel chip 1.
  • the microchannel chip 1 used here, for example, those disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2017-67620 and Japanese Patent Application Laid-Open No. 2017-67621 can be used.
  • the microchannel chip 1 is a transparent silicone rubber having a length of about 24 mm, a width of about 45 mm, and a thickness of about 1 mm in which a concave groove and a through hole are formed on a glass substrate 1c having a length of about 26 mm, a width of about 76 mm, and a thickness of about 1 mm.
  • the plate 1a has a bonded structure.
  • the through holes are shown as a test solution introduction port 131 and a drug fixing port 132 in FIG. 4A described later.
  • the internal space 11 constituting the flow path or the like is formed.
  • the internal space 11 communicates with the outside through a through hole, whereby the test solution described later can be introduced into the internal space 11 and the reactant described later can be introduced.
  • the width and depth of the groove can be arbitrarily selected depending on the size of the observation target, but when the target is a cell or the like, the width is preferably about 100 ⁇ m and the depth is preferably about 50 ⁇ m.
  • a plurality of internal spaces may be arranged depending on the application, and when a plurality of internal spaces are provided in one microchannel chip 1, the internal space is referred to as a unit.
  • a microchannel chip 1 having four internal spaces is used.
  • reference numerals are given to these internal spaces such as internal spaces 11, 12, 13, and 14.
  • the internal spaces 11 to 14 are also referred to as a first unit, a second unit, a third unit, and a fourth unit, respectively. Since the internal spaces 11 to 14 have the same configuration, the details of the microchannel chip 1 will be described below by the internal space 11 which is the first unit.
  • FIG. 4A is a diagram showing the internal space 11 in the microchannel chip 1, and FIG. 4B is an enlarged plan view of the observation unit 102 in the internal space 11.
  • the internal space 11 includes a test liquid introduction port 131, a plurality of drug fixing ports 132, and a flow path 100 that communicates them.
  • the flow path 100 is composed of a branch portion 101 that communicates with the test liquid introduction port 131 and branches toward the drug fixing port 132, and an observation unit 102 that is arranged on the drug fixing port 132 side. Since the four drug fixing ports 132 are provided here, the test solution introduced from the test solution introduction port 131 branches into four flow paths 100a, 100b, 100c, and 100d in the flow path 100.
  • the flow path widths of the flow paths 100a to 100d are narrowed so that the four flow paths 100a to 100d fit in the same field of view in the microscope optical system 2, and these flow paths 100a to 100d are mutually connected. They are placed close together.
  • the flow paths 100a to 100d will be referred to as a first flow path, a second flow path, a third flow path, and a fourth flow path, respectively.
  • the drug fixing port 132 is for arranging a solid drug 103 at the bottom thereof depending on the intended use.
  • the test solution which is a liquid medium containing cells
  • the drug 103 is introduced into the drug fixing port 132.
  • Antimicrobial agents are placed as.
  • an antimicrobial drug and an inhibitor which is a chemical substance that inactivates or inhibits an enzyme that decomposes the antimicrobial drug may be combined and arranged at the drug fixing port 132.
  • the drug fixing port 132 in which the drug 103 is not arranged is also set.
  • the type of enzyme produced as a drug resistance mechanism in a cell having a cell membrane is, for example, ⁇ such as penicillin, cephalosporin, cephamycin, oxacephem, penem, carbapenem, carbacephem, and monobactam.
  • ⁇ such as penicillin, cephalosporin, cephamycin, oxacephem, penem, carbapenem, carbacephem, and monobactam.
  • antimicrobial agents include cefotaxime (CTX; Cefotaxime), ceftazim (CAZ; Ceftazime), cefmethazol (CMZ; Cefmetazole), meropenem (MEPM; Meropenem), ceftriaxone (CTRex), ceftriaxone (CTRX).
  • CCTX cefotaxime
  • CAZ ceftazim
  • CMR cefmethazol
  • CTRX ceftriaxone
  • CTRX ceftriaxone
  • AAT Aztreonam
  • Cefpodoxime Cefpodoxime
  • Latamoxef LMOX; Latamoxef or Moxalactam
  • Penicillin PC
  • Penicillin Benzylpenicillin
  • PCG Benzylpenicillin
  • PCG Benzylpenicillin
  • PCG Benzylpenicillin
  • Inhibitors need to be appropriately selected for each enzyme that degrades antimicrobial agents.
  • Typical enzymes that inhibit anti-microbial agents having a ⁇ -lactam ring include metallo ⁇ -lactamase (MBL; Metallo ⁇ -lactamase), in addition to the substrate specificity extended ⁇ -lactamase (ESBL) described above.
  • MBL metallo ⁇ -lactamase
  • ESBL substrate specificity extended ⁇ -lactamase
  • AmpC type ⁇ -lactamase AmpC
  • KPC KPC type ⁇ -lactamase
  • OXA type ⁇ -lactamase and the like.
  • Examples of the inhibitor against ESBL include clavulanic acid (CVA; Clavulanic Acid), sulbactam (SBT: Sulbactam), tazobactam (TAZ; Tazobactam), and the like, and class A ⁇ -lactamase in the Amber classification. Drugs that inhibit sulbactam.
  • Examples of the inhibitor against MBL include chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and its metal salt, dipicolinic acid (DPA), and phenanthroline (Phen), which inhibit class B ⁇ -lactamase. Be done.
  • inhibitor against AmpC examples include 3-aminophenylboronic acid (APB), cloxacillin (MCICP; Cloxacillin), and the like, which inhibit class C ⁇ -lactamase.
  • Inhibitors for KPC include agents that inhibit class A ⁇ -lactamase, such as 3-aminophenylboronic acid (APB).
  • the drug 103 is arranged as shown in Table 1 with respect to the drug fixing port 132 of each channel of the first to fourth units of the microchannel chip 1.
  • Table 1 the description such as "first" for the drug inlet indicates which of the first to fourth channels is the drug inlet. In all units, no drug is placed in the drug fixing port 103 of the first flow path, and the first flow path is used as a reference flow path for standardizing the determination standard.
  • an appropriate antimicrobial agent and inhibitor By selecting an appropriate antimicrobial agent and inhibitor, it becomes possible to discriminate the production of enzymes other than the above-mentioned ESBL, MBL, AmpC and KPC enzyme species.
  • the enzyme species produced is OXA due to the difference in bacterial morphology depending on the presence or absence of the inhibitor. It can be determined whether or not.
  • FIG. 5 shows a specific procedure of the enzyme type discrimination method.
  • This enzyme type discrimination method can be roughly divided into a pretreatment step in which a test solution is adjusted and photographed by the microscope optical system 2 to obtain a photographed image, and a photographed image which is an observation image is processed by the above-mentioned inspection device 30. It is divided into two stages, which are the determination processing stages for determining the enzyme species produced.
  • the pretreatment stage is basically composed of work that may be performed manually. Of course, the preprocessing stage itself can be automated.
  • the pretreatment step first, in step S101, the bacterium for which the production enzyme species is to be discriminated is seeded on the agar medium, and in step S102, the bacterium is cultured on the agar medium. After completion of culturing on the agar medium, in step S103, the bacteria are fished from the agar medium and diffused into the liquid medium to prepare a test solution.
  • step S104 the test liquid is introduced into each flow path of the micro flow path chip 1 from each test liquid introduction port 131 of the micro flow path chip 1.
  • the solid drug 103 has already been fixed to each drug fixing port 132 of the microchannel chip 1 based on Table 1 described above.
  • the test solution flows to the drug fixing port 132 in the microchannel chip 1, the drug 103 dissolves in the test solution, and the antimicrobial drug or inhibitor in the drug flows to the position of the observation unit 102. It diffuses through the paths 100a-100d.
  • the bacteria are cultured at a predetermined temperature for a predetermined time.
  • the microchannel chip 1 is set in the microscope optical system 2, the observation unit 102 is photographed by the microscope optical system 2 for each unit, and the captured image 4 which is an observation image is acquired in step S106. To do. Four flow paths are collectively imaged in one observation image. Further, since the number of units is 4, a total of 4 captured images 4 are acquired.
  • FIG. 6 schematically shows the processing in the pretreatment stage.
  • Bacteria 5 to be inspected are cultured on an agar medium and then dispersed in a liquid medium 6 to prepare a test solution. Then, this test solution is introduced into the microchannel chip 1 from the test solution introduction port 131 using a microsyringe 7 or the like.
  • FIG. 7 shows an example of the photographed image 4 acquired as an observation image.
  • This photographed image 4 is an image of the observation unit 102 of the first unit, and from this image, it can be seen that the flow paths 100a to 100d, that is, the first to fourth flow paths are contained in one field of view.
  • an observation image direction indicating guide 41 and an imaging position guide 42 both of which are triangular around the observation unit 102, are used for alignment for each unit. It is provided as a mark of.
  • these guides 41 and 42 it is easy to acquire the captured image 4.
  • These guides 41 and 42 are also reflected in the photographed image 4 shown in FIG. 7.
  • the number of triangular marks constituting the observation image direction instruction guide 41 is different for each unit. Therefore, if you look at the captured image 4, you can see which unit the observation unit 102 was captured.
  • the photographed image 4 also shows cells. In the example shown here, the morphological change is not observed in the cells 51 of the paths 100a and 100b, whereas the morphological change is observed in the cells 52 of the flow paths 100c and 100d. Since the antimicrobial agent having a ⁇ -lactam ring is used for the cell having a cell wall, it can be said that the cell 52 whose morphology has changed is a cell affected by the antimicrobial agent.
  • Cells affected by an antimicrobial drug are antibacterial because they do not produce an enzyme that degrades the antimicrobial agent and an enzyme that produces an enzyme that degrades the antimicrobial agent but the enzyme is blocked by the inhibitor. There are two possible types of cells that have been affected by microbial agents.
  • the determination information generation unit 32 determines that each of the photographed images 4 in the image storage unit 31 is subjected to image processing from each flow path in the photographed image 4 to indicate the characteristics of the cell morphology. To get.
  • the data that can be used as judgment information include the number of particles, particle shape, average area (or particle size), peripheral length of particles, number of edges of particles, number of corners of particles, average number of corners, roundness of particles, and particles.
  • the average area refers to the area occupied by the analysis target (cells in this case) within the specified range (in this case, in the flow path).
  • the number of corners is a numerical value detected by the Harris operator, and the average number of corners is the number of corners divided by the area of the specified range.
  • the feature score is the feature score within the specified range detected by the AKAZE algorithm, which is an algorithm for extracting the feature quantity within the target range without rotation, and the average feature score is the feature score divided by the area of the designated range. It refers to the thing.
  • the average box area is the average value of the rectangular area surrounding the analysis target within the specified range.
  • the area ratio is the ratio of the area occupied by the analysis target to the rectangular area surrounding the analysis target within the specified range.
  • a plurality of types of judgment information are obtained for each flow path. Specifically, a total of 10 types of judgment information such as the number of particles, roundness, peripheral length, number of corners, average number of corners, number of feature points, average number of feature points, average box area, area ratio, and average area are provided for each flow path. get. These judgment information is grouped for each flow path and is referred to as a judgment information group.
  • the determination information acquired for the flow path 100a is represented as 101a, 102a, 103a, ..., And these are collectively referred to as the determination information group 110a for the flow path 100a.
  • the determination information 102b, 102c, ... Are obtained for the flow path 100b, and these form the determination information group 110b. The same applies to the flow paths 100c and 100d.
  • the reference determination information selection unit 33 for each captured image 4 serves as a determination reference from the determination information groups 110a to 110d.
  • a reference determination information group is selected, and the determination information standardization unit 34 standardizes the values of other determination information groups by the reference determination information group in step S202.
  • the first flow path that is, the flow path 100a
  • the determination information group of this first flow path is used as the reference determination information group.
  • the value of the judgment information is set for each judgment information included in the judgment information group. Normalize using the value of the same judgment information in the standard judgment information group.
  • the classification unit 35 shown in FIG. 1 classifies the standardized judgment information group for each flow path into several stages in step S203. To acquire classification information. Since there are three channels that are not reference channels, three classification information is acquired. In the classification here, classification information for each flow path is generated from the judgment information group according to the change in the morphology of the bacterium. As an example, classification information of any of classification A, classification B, and classification C is generated from the judgment information group. Classification A classifies those in which there is almost no change in bacterial morphology in the channel with respect to the reference channel, that is, the first channel that does not use antimicrobial agents and inhibitors.
  • Category C those in which the morphological change of bacteria in the channel is remarkable as compared with the reference channel are classified.
  • Classification C corresponds to the case where the morphology is significantly changed as compared with the cell 51 in the flow path 100a, which is the reference flow path, as in the case of the cell 52 in the flow path 100d, in the example shown in FIG. .
  • Category B is an intermediate state between Category A and Category C, and a mixture of bacteria whose morphology has not changed and bacteria whose morphology has changed is classified into Category B.
  • each judgment information group is classified into one of the classification A, the classification B, and the classification C.
  • [X] be the standardized judgment information group.
  • n the number of judgment information constituting the judgment information group.
  • Determination information group [X] classification A, classification B and each probability classification C F A ([X]) , F B ([X]), if the F C ([X]), F A ([X ]) + F B ([X ]) + F C ([X]) 1 is holds, these probabilities using logistic function is expressed as follows.
  • Factor C A, C B is a classification parameter, C Ak, be determined to C Bk, it can be seen that the flow path can be uniquely classified based on standardized determination information set for each flow path. For example, it is possible that the human multiple photographed images as target classifies each flow path in the captured image by visually determining the coefficient C A so as to correspond to the classification result, C B, C Ak, a C Bk advance ..
  • the judgment information group is classified by multiple regression analysis using logistic functions, but judgment information such as support vector machine (SVM), neural network, random forest, decision tree, k-nearest neighbor method, etc. is classified based on supervised learning.
  • the judgment information group may be classified using a general classifier such as a linear classifier or a non-linear classifier that can acquire classification information as an input.
  • the composition of the classification parameters used for the classification also differs.
  • the classification unit 35 shown in FIG. 1 converts the classification information into the corresponding ranks, acquires the rank value, and outputs the rank value to the enzyme type determination unit 36 in the subsequent stage.
  • the conversion from the classification information to the rank is performed by digitizing the classification A as 0, the classification B as 1, and the classification C as 2, and ordering them.
  • FIG. 8 illustrates in detail the processes from step S201 to step S204 from the viewpoint of information flow and conversion.
  • the captured images obtained from the four units of one microchannel chip 1 are captured images 4a, 4b, 4c, and 4d, respectively.
  • four determination information groups 110a to 110d corresponding to the flow paths 100a to 100d are obtained by executing step S201, and by executing step S202, respectively.
  • the standardized determination information groups 111b to 111d corresponding to the flow paths 100b to 100d can be obtained. Since the flow path 100a is a reference flow path, a standardized determination information group is not created for this flow path.
  • three classification information 112b to 112d corresponding to the flow paths 100b to 100d are obtained, and from these classification information, rank values 113b to 113d are obtained by executing step S204.
  • Classification information 312b to 312d can be obtained from the captured image 4c corresponding to the third unit, and rank values 313b to 313d can be obtained from these.
  • Classification information 412b to 412d can also be obtained from the captured image 4d corresponding to the fourth unit, and rank values 413b to 413d can be obtained from these.
  • the enzyme species determination unit 36 shown in FIG. 1 acquires the production information of each enzyme by comparing the rank values based on the discrimination algorithm in step S205, and in step S206, the production enzyme. Get the seed.
  • FIG. 9 shows the details of the process of step S205 for acquiring the production information of each enzyme.
  • the drug is arranged on the microchannel chip 1 as shown in Table 1 above.
  • the rank value of the Nth flow path of the Mth unit is expressed as Rank MN.
  • the enzyme type determination unit 36 first executes the ESBL determination process in step S205E to determine whether or not ESBL is produced.
  • step S501 the rank value Rank 1-2 of the second flow path of the first unit and the rank value Rank 1-3 of the first unit are compared, and Rank 1-2 ⁇ Rank If it is 1-3, that is, if it branches to the direction displayed as TRUE (true) in the figure, it is determined in step S502 that "ESBL is being produced", that is, ESBL (+). If Rank 1-2 is not ⁇ Rank 1-3 in step S501, that is, if the branch is to the direction displayed as FALSE (false) in the figure, then in step S503, Rank 2-2 and Rank 2-3.
  • step S502 If Rank 2-2 ⁇ Rank 2-3 , the process proceeds to step S502 and it is determined that "ESBL is being produced”. On the other hand, if Rank 2-2 ⁇ Rank 2-3 in step S503, it is determined in step S504 that "ESBL is not produced", that is, ESBL ( ⁇ ).
  • ESBL ESBL ( ⁇ ).
  • the symbols “(+)” and “( ⁇ )” correspond to “produce the corresponding enzyme” and “do not produce the corresponding enzyme”, respectively.
  • step S205M the MBL determination process is then executed in step S205M to determine the presence or absence of MBL production.
  • the MBL determination process first, Rank 2-2 and Rank 2-4 are compared in step S511, and if Rank 2-2 ⁇ Rank 2-4 , “MBL is produced” in step 512. Is determined. If Rank 2-2 ⁇ Rank 2-4 is not found in step S511, then Rank 4-2 and Rank 4-4 are compared in step S513. Here, if Rank 4-2 ⁇ Rank 4-4, the process proceeds to step S512 is determined as "are producing MBL", unless Rank 4-2 ⁇ Rank 4-4, in step S514, It is determined that "MBL is not produced”.
  • step S205A the AmpC determination process is then executed in step S205A to determine the presence or absence of AmpC production.
  • the AmpC determination process first, Rank 3-2 and Rank 3-3 are compared in step S521, and if Rank 3-2 ⁇ Rank 3-3 , “AmpC is produced” in step S522. Is determined. Unless Rank 3-2 ⁇ Rank 3-3 in step S521, in step S523, the Rank 3-2 and Rank 3-4 are compared. Here, if Rank 3-2 ⁇ Rank 3-4, the process proceeds to step S522 is determined as "are producing AmpC", unless Rank 3-2 ⁇ Rank 3-4, in step S524, It is determined that "AmpC is not produced”.
  • step S205K the KPC determination process is then executed in step S205K to determine the presence or absence of KPC production.
  • the KPC determination process first, Rank 4-2 and Rank 4-3 are compared in step S531, and if Rank 4-2 ⁇ Rank 4-3 , “KPC is produced” in step S532. If it is not Rank 4-2 ⁇ Rank 4-3 , it is determined in step S533 that "KPC is not produced”.
  • the enzyme species produced by the bacterium is determined without using the information on the type of the bacterium, so that the enzyme species produced can be used for all the bacterial species. It makes a judgment.
  • classification parameters a is the coefficient of above C A to be used for classifying determination information groups, C B, the C Ak, C Bk, the type of each cell, the optimal value for each example bacterial species present. If the higher determination system is required, the optimal coefficients C A according to the species, C B, it is necessary to perform the classification of the determination information group with C Ak, C Bk. Therefore, in the second embodiment, based on the reference determination information group identifies the species, the coefficient corresponding to the species C A, C B, C Ak , by using a C Bk, thereby improving the inspection accuracy ing.
  • FIG. 10 shows an inspection device 30 that can be used to carry out the enzyme type determination method in the second embodiment.
  • the inspection device 30 further includes a pre-classification unit 37 that classifies the bacterial species of the subject using the reference determination information group and obtains the subject classification, and a classification parameter corresponding to the subject classification, with respect to the inspection device shown in FIG.
  • Subject classification corresponds to differences in captured images due to differences in bacterial species.
  • the inspection device 30 can be realized by a software program executed on the computer, for example, using a computer.
  • step S301 and step S302 are executed instead of step S203 in the first embodiment. Therefore, step S301 and step S302 will be described.
  • step S301 the pre-classification unit 37 shown in FIG. 10 performs multiple regression analysis using a logistic function or the like to perform a first flow, which is a reference flow path. From the judgment information group obtained from the road, that is, the standard judgment information group, the subject classification corresponding to the bacterial species such as Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae is acquired.
  • step S302 the classification unit 35 searches the database 38 based on the acquired subject classification , reads the classification parameters corresponding to the subject classification, that is, the coefficients C A , C B , C Ak , and C Bk, and reads the read coefficients C.
  • the classification parameters corresponding to the subject classification that is, the coefficients C A , C B , C Ak , and C Bk
  • the standardized judgment information group for each flow path is classified in the same manner as described above, and the classification information is generated.
  • the processing after the classification information is generated is the same as that shown in FIG.
  • FIG. 12A, 12B and 12C are diagrams for explaining subject classification by showing examples of captured images corresponding to subject classification.
  • three types of subject classifications subject classification x, subject classification y, and subject classification z, are shown.
  • FIG. 12A schematically shows a captured image 4x corresponding to the subject classification x.
  • the morphology of the cells 51x is in the first channel in the captured image shown in FIG. 7 even in the state not affected by the antimicrobial agent, that is, in the state shown in the first flow path (flow path 100a).
  • It is different from the cell 51 of. 12B and 12C schematically show the captured images 4y and 4z corresponding to the subject classifications y and z, respectively.
  • the cells 51y and 51z observed in the first flow path of the photographed images 4y and 4x, respectively, have the same morphology as the cells 51 in the first flow path in the photographed image shown in FIG. 7, but are in a developing state.
  • the number of bacteria (number of particles) indicating is different.
  • Cells 52x, 52y, 52z whose morphology has changed due to the influence of antimicrobial agents are drawn in the fourth flow path (that is, flow path 100d) in the captured images 4x, 4y, 4z, respectively, and the third flow path (flow).
  • the passage 100c an example of a cell having a slight morphological change as compared with the cells 52x, 52y, 52z in the fourth flow path is shown.
  • the shapes of the cells in the third flow path of the captured images 4x, 4y, and 4z are compared, they look similar to each other, but it is a production whether these should be classified into classification A, classification B, or classification C according to the bacterial species. It affects the correct answer rate for determining the enzyme type.
  • the accuracy of discrimination of the produced enzyme species is improved.
  • the enzyme species produced by the cells were discriminated by the procedure described in the first embodiment.
  • Klebsiella pneumoniae strain ATCC760603 strain
  • the cultured bacteria are then fished and diffused into a cation-adjusted Mueller Hinton liquid medium, where McF (McFarland turbidity unit) 0 is used as an index of turbidity, which is the number of bacteria per unit volume in the liquid.
  • McF McFarland turbidity unit
  • FIG. 13 shows the obtained photographed image.
  • the first flow path 100a which is a reference flow path
  • the second to fourth flow paths 100b, 100c, 100d which are not reference flow paths
  • reference numeral 150 indicates a second flow path that is not a reference flow path.
  • the fourth flow paths 100b, 100c, and 100d are collectively shown.
  • a photographed image 4a was obtained from the first unit
  • a photographed image 4b was obtained from the second unit
  • a photographed image 4c was obtained from the third unit
  • a photographed image 4d was obtained from the fourth unit.
  • step S521 the process branches from step S521 through step S522 to step S524, and "AmpC is performed. It is determined that it does not produce. " Further, since Rank 4-2 and Rank 4-3 are equal, the process branches from step S531 to step S532 in the flowchart shown in FIG. 9, and it is determined that "KPC is not produced".
  • the enzyme species produced by cells such as bacteria can be easily identified.
  • drug-resistant bacteria having resistance to antimicrobial drugs more appropriate antibacterial activity against drug-resistant bacteria is performed by inferring enzyme production as a bacterial resistance mechanism rather than the result of MIC, which is a drug-sensitivity result.
  • Drugs can be selected, and future resistance of drug-resistant bacteria can be suppressed. As a result, it becomes possible to prevent the aggravation of nosocomial infections.
  • Microchannel chip 2 Microscope optical system 3 Computer 4,4a-4c Captured image 11-14 Internal space 30 Inspection device 31 Image storage unit 32 Judgment information generation unit 33 Criteria judgment information selection unit 34 Judgment information standardization unit 35 Classification unit 36 Enzyme type determination unit 37 Pre-classification unit 38 Database 100, 100a-100d Channel

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Abstract

細菌などの細胞が産生する酵素種を判別する判別方法は、複数の流路を同時に撮影した画像である撮影画像から、流路ごとに細胞の形態の特徴を示す判定情報を作成する処理（Ｓ２０１）と、判定情報の中から判定の基準となる基準判定情報を選択し、基準判定情報を用いて判定情報を規格化する処理（Ｓ２０２）と、規格化された判定情報に基づいて、判定情報を分類する処理と（Ｓ２０３）、分類によって得られた分類情報から酵素種を判定する処理（Ｓ２０５，Ｓ２０６）とを有する。撮影画像は、複数の流路の各々の内部に培養された細胞が存在する状態を示す画像である。

Description

酵素種判別方法及び検査装置、並びにプログラム
　本発明は、細胞が産生する酵素種を判別する酵素種判別方法と、細胞が産生する酵素種の判別に用いられる検査装置と、酵素種の判別に用いられるプログラムとに関する。
　近年、抗微生物薬の濫用により、抗微生物薬に対する耐性を有する菌すなわち薬剤耐性菌の出現割合が増加しており、それに伴い院内感染の発生件数も増加傾向にある。例えば特許文献１に記載されるように、抗微生物薬を適切に使用することによる薬剤耐性菌の出現を抑制することが、極めて重要となっている。薬剤耐性菌には、抗微生物薬を分解する酵素を産生する機能を獲得したものがある。
　抗微生物薬が細菌に対してどの程度有効であるかを判断する指標の１つとして、抗微生物薬が細菌の増殖または発育を阻止させる最小濃度である最少発育阻止濃度（ＭＩＣ：Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）がある。抗微生物薬に対するＭＩＣが高ければ細菌の発育を阻止するために抗微生物薬が多く必要ということになるので、ＭＩＣは、その細菌の薬剤耐性度合いを示す指標になる。さらに、薬剤感受性試験の結果であるＭＩＣの値から、臨床上で抗微生物薬による治療効果を予測するために使用される基準値として、ブレイクポイント（ＢＰ）が公的機関などにより設定されている。しかしＢＰは、細菌が有する薬剤耐性機構を考慮することなく、抗微生物薬がその細菌に対して使用できるか否かのみによってその値が設定されてしまうという危険性を有する。抗微生物薬を分解する酵素を産生する遺伝子を有するにも関わらずＢＰ以下のＭＩＣを有する細菌も、非特許文献１において多数報告されている。細菌の抗微生物薬に対する耐性機構のうち酵素産生による抗微生物薬の分解に関しては、一般的にその機能が細菌間で非常に伝搬しやすい。非特許文献２に記載されるように、近年では、伝搬経路中で進化した酵素である基質特異性拡張β－ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ；Ｅｘｔｅｎｄｅｄ　Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　β－Ｌａｃｔａｍａｓｅ）等の、多くの抗微生物薬を分解する酵素を産生する遺伝子を持つ細菌が重要視され、臨床現場では問題になっている。
　抗微生物薬に対する細菌あるいは細胞の感受性あるいは耐性を短時間かつ簡単な手順で検査する装置が提案されている。例えば特許文献１は、培養プレートにより抗微生物薬の存在下で細菌を培養し、培養プレートの各々のウェル中の細菌の形状や数を顕微鏡観察することによって細菌の分裂の様子をモニタし、顕微鏡観察で得た画像から得られる細菌の形状や数、面積とそれらの経時変化とを解析し、データベース中の情報と解析結果とを比較することよって、薬剤感受性結果であるＭＩＣを得ることを開示している。特許文献２は、マイクロ流路カートリッジのマイクロ流路に細菌と抗微生物薬とを含む液体を導入して細菌を培養し、そののちマイクロ流路内の細菌を撮影して画像を取得し、画像から得られた情報から、薬剤感受性を示す結果、特にＭＩＣを得ることを開示している。特許文献２に記載された技術では、画像から得られる情報は、細菌の数や周囲長などであり、それらを統計的に解析しアルゴリズムによって判定することによって、ＭＩＣを得ることができる。
特開２０１６－１３６８７６号公報 米国特許出願公開第２０１７／０２１８４２６号明細書
村谷　哲郎他、"基質特異性拡張型β－ｌａｃｔａｍａｓｅ産生Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉに対する各種抗菌薬の抗菌力"、日本化学療法学会雑誌、第５２巻、第１０号、第５５６－５６７頁、２００４年 上地　幸平他、"ＥＳＢＬｓ迅速検出法ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＥＳＢＬ　ＮＤＰ　ｔｅｓｔの有用性に関する検討"、日本臨床微生物学雑誌、第２８巻、第３号、第１－１０頁、２０１８年
　特許文献１，２に記載された技術は、抗微生物薬の存在下で細胞を培養したときの細胞の画像を入力として、画像処理やデータベースとの照合、判定アルゴリズムの実行などによって、薬剤感受性結果であるＭＩＣを出力しようとするものである。しかしながら、薬剤感受性であるＭＩＣの結果だけでは、細菌の薬剤耐性機構としての酵素の産生状況を推察することは難しい。したがって、１つの抗微生物薬に対して細菌のＭＩＣを測定し、その結果、ＢＰと比較して相対的に感受性を示したからと言って、その細菌がその抗微生物薬に対して非耐性である、という絶対的な証拠にはならない。公衆衛生上、薬剤耐性菌の蔓延を防止するためには、細菌のＭＩＣを求めるだけではなく、その細菌の薬剤耐性機構としての酵素の産生状況を推察し、産生される酵素種にも基づいてより適切な抗微生物薬の処方が必要とされる。
　本発明の目的は、細菌などの細胞が産生する酵素種を容易に判別できる酵素種判別方法及び検査装置と、そのような酵素種判別方法を実施するプログラムとを提供することにある。
　本発明の酵素種判別方法は、
　細胞が産生する酵素種を判別する酵素種判別方法であって、
　複数の流路を同時に撮影した画像である撮影画像から、流路ごとに細胞の形態の特徴を示す判定情報を作成する判定情報作成工程と、
　前記判定情報の中から判定の基準となる基準判定情報を選択し、基準判定情報を用いて前記判定情報を規格化する判定情報規格化工程と、
　前記規格化された判定情報に基づいて、前記判定情報を分類する分類工程と、
　前記分類工程によって得られた分類情報から酵素種を判定する判定工程と、
　を有し、
　前記撮影画像は、前記複数の流路の各々の内部に培養された細胞が存在する状態を示す画像である。
　本発明の酵素種判別方法では、培養された細胞が内部に存在する複数の流路を撮影した撮影画像から、画像処理により、流路ごとに判定情報を求めて規格化し、規格化された判定情報に基づいて分類を行って酵素種を判別する。この方法では、例えば、抗微生物薬の存在の有無や抗微生物薬と阻害剤との組み合わせの違いによる細胞の形態変化を流路ごとの撮影条件の違いなどに左右されることなく取得することができ、流路ごとの細胞の形態変化に基づいて分類を行うことが可能になる。その結果、この方法によれば、細菌などの細胞が産生する酵素種を容易に判別することができる。
　本発明の酵素種判別方法では、さらに、被写体分類ごとの判定情報からなる基準判定情報群により被写体の分類を実行して被写体分類を得る事前分類工程を設け、分類工程において、事前分類工程で得た被写体分類に対応する分類パラメータを選択し、選択された分類パラメータを用いて判定情報を分類することができる。基準判定情報群による被写体の分類には、例えば、多重回帰分析による識別器を用いることができる。細胞の種類の違いなどに被写体分類を対応付けることにより、さらに高精度に産生酵素種の判別を行うことができる。
　本発明の酵素種判別方法では、撮影画像は、例えば、複数の流路から構成される観察部を有するマイクロ流路チップを撮影した画像であって、複数の流路を一つの視野に収めて流路ごとに存在する細胞の状態を撮影した画像であってよい。複数の流路を一つの視野に収めることにより、基準流路とその他の流路とが常に同一条件かつ同一環境下で撮影されることとなって、検査の精度や信頼性の向上につながる。
　本発明の酵素種判別方法では、撮影画像は、例えば、抗微生物薬の影響、および、抗微生物薬と阻害剤を組み合わせた試薬の影響のいずれか一方の影響による細胞の形態変化を撮影した画像であってよい。このような撮影画像を使用することにより、抗微生物薬の薬剤耐性の評価を適切に行うことができる。この場合、基準判定情報は、規格化の際の基準として用いられるものであるので、抗微生物薬及び阻害剤のいずれもが存在しない流路に対応する判定情報であることが好ましい。
　本発明の酵素種判別方法では、判定情報は、撮影画像における粒子数を少なくとも含むことが好ましい。撮影画像における粒子数は細胞の数に直接対応する判定情報であり、細胞の生育状態を的確に示す指標の１つであると考えられる。
　本発明の酵素種判別方法では、判定情報作成工程において、複数種類の判定情報を流路ごとに取得して判定情報群とし、分類工程において、複数種類の判定情報に基づき、多重回帰分析による識別器を用いて判定情報群の分類を実行することが好ましい。複数種類の判定情報を用いるとともに多重解析分析による識別器を用いることによって、産生酵素種の判別の精度が向上する。
　本発明の検査装置は、
　細胞が産生する酵素種を判別する検査装置であって、
　各々が複数の流路を同時に撮影した画像である撮影画像から、流路ごとに細胞の形態の特徴を示す判定情報を作成する判定情報作成手段と、
　前記判定情報の中から判定の基準となる基準判定情報を選択する基準判定情報選択手段と、
　前記基準判定情報を用いて前記判定情報を規格化する判定情報規格化手段と、
　前記規格化された判定情報に基づいて、前記判定情報を分類する分類手段と、
　前記分類手段によって得られた分類情報から酵素種を判定する判定手段と、
　を有し、
　前記撮影画像は、前記複数の流路の各々の内部に培養された細胞が存在する状態を示す画像である。
　本発明の検査装置では、培養された細胞が内部に存在する複数の流路を撮影した撮影画像から、画像処理により、流路ごとに判定情報を求めて規格化し、規格化された判定情報に基づいて分類を行って酵素種を判別する。この検査装置によれば、例えば、抗微生物薬の存在の有無や抗微生物薬と阻害剤との組み合わせの違いによる細胞の形態変化を、流路ごとの撮影条件の違いなどに左右されることなく取得することができ、流路ごとの細胞の形態変化に基づいて分類を行うことが可能になる。その結果、この検査装置によれば、細菌などの細胞が産生する酵素種を容易に判別することができる。
　本発明の検査装置では、さらに、被写体分類ごとの判定情報からなる基準判定情報群により被写体の分類を実行し、被写体分類を得る事前分類手段を設け、分類手段が、事前分類手段で得た被写体分類に対応する分類パラメータを選択し、選択された分類パラメータを用いて判定情報を分類するようにすることができる。事前分類手段には、例えば、多重回帰分析による識別器を用いることができる。
　本発明の検査装置では、撮影画像は、例えば、複数の流路から構成される観察部を有するマイクロ流路チップを撮影した画像であって、複数の流路を一つの視野に収めて流路ごとに存在する細胞の状態を撮影した画像であってよい。また撮影画像は、例えば、抗微生物薬の影響、および、抗微生物薬と阻害剤を組み合わせた試薬の影響のいずれか一方の影響による細胞の形態変化を撮影した画像であってもよい。この場合、基準判定情報は、抗微生物薬及び阻害剤のいずれもが存在しない流路に対応する判定情報であることが好ましい。
　本発明の検査装置では、判定情報は、撮影画像における粒子数を少なくとも含むことが望ましい。また、判定情報作成手段が複数種類の判定情報を流路ごとに取得して判定情報群とし、分類手段が、複数種類の判定情報に基づき多重回帰分析による識別器を用いて、判定情報群の分類を実行することが望ましい。
　本発明のプログラムは、
　複数の流路を同時に撮影した画像である撮影画像が入力するコンピューターに、
　前記複数の流路の各々の内部に培養された細胞が存在する状態を示す画像である前記撮影画像から、前記流路ごとに細胞の形態の特徴を示す判定情報を作成する判定情報作成処理と、
　前記判定情報の中から判定の基準となる基準判定情報を選択し、基準判定情報を用いて前記判定情報を規格化する判定情報規格化処理と、
　前記規格化された判定情報に基づいて、前記判定情報を分類する分類処理と、
　前記分類処理によって得られた分類情報から、前記細胞が産生する酵素種を判定する処理と、
　を実行させる。
　本発明のプログラムは、培養された細胞が内部に存在する複数の流路を撮影した撮影画像をコンピューターに入力してコンピューターにそのプログラムに基づく画像処理を実行させるものである。このようなプログラムによれば、流路ごとに判定情報を求めて規格化し、規格化された判定情報に基づいて分類を行って酵素種を判別するので、例えば、抗微生物薬の存在の有無や抗微生物薬と阻害剤との組み合わせの違いによる細胞の形態変化を流路ごとの撮影条件の違いなどに左右されることなく取得することができ、流路ごとの細胞の形態変化に基づいて分類を行うことが可能になる。その結果、細菌などの細胞が産生する酵素種を容易に判別できるようになる。
　本発明のプログラムは、コンピューターに、さらに、被写体分類ごとの判定情報からなる基準判定情報群により被写体の分類を実行し、被写体分類を得る事前分類処理を実行させ、分類処理において、事前分類処理で得た被写体分類に対応する分類パラメータを選択し、選択された分類パラメータを用いて判定情報が分類されるようにしてもよい。
　本発明によれば、細菌などの細胞が産生する酵素種を容易に判別できる。
本発明の第１の実施形態の検査装置の構成を示すブロック図である。 コンピューターにより実現した検査装置を示す図である。 マイクロ流路チップの外観を示す平面図である。 マイクロ流路チップにおけるユニットごとの内部空間を示す平面図である。 マイクロ流路チップにおけるユニットごとの内部空間における観察部の拡大平面図である。 第１の実施形態での酵素種の判別方法を示すフローチャートである。 図５に示す判別方法での前処理を説明する図である。 観察部を撮影した画像の一例を示す模式図である。 図５に示す判別方法での決定処理の詳細を説明する図である。 産生酵素種を決定する処理の詳細を示すフローチャートである。 第２の実施形態の検査装置の構成を示すブロック図である。 第２の実施形態での酵素種の判別方法を示すフローチャートである。 被写体分類を説明する図である。 被写体分類を説明する図である。 被写体分類を説明する図である。 実施例における撮影画像を示す図である。
　［第１の実施形態］
　図１および図２は、本発明の第１の実施形態において酵素種判別方法の実施に用いることができる検査装置を示している。本実施形態において酵素種判別方法は、細菌などの細胞が産生する酵素種を判別する方法である。この方法では、マイクロ流路デバイス１の複数の流路の各々において細胞を培養し、複数の流路が一つの視野に収まるようにしてこれら複数の流路での細胞の状態を示す同時に撮影して撮影画像とし、撮影画像に対して検査装置によって画像処理や演算処理を適用して、細胞が産生する酵素種を判別する。
　マイクロ流路デバイス１を撮影するために、デジタルカメラなどの撮影部を有する顕微鏡光学系２が設けられており、顕微鏡光学系２で撮影された画像すなわち撮影画像は検査装置３０に送られる。顕微鏡光学系２は、マイクロ流路デバイス１の流路内で培養された細胞を観察するものであるので、観察対象である細胞の輪郭を正確に捉えるために、位相差顕微鏡であることが望ましい。また、得られた観察像における細胞の過度の重なりを避けるために、顕微鏡光学系２の被写界深度は、１０μｍ～２０μｍであることが望ましい。
　図１に示す検査装置３０は、撮影画像を格納する画像格納部３１と、撮影画像から流路ごとに細胞の形態の特徴を示す判定情報を作成する判定情報作成部３２と、判定情報の中から判定の基準となる基準判定情報を選択する基準判定情報選択部３３と、基準判定情報を用いて判定情報を規格化する判定情報規格化部３４と、規格化された判定情報に基づいて、判定情報を分類する分類部３５と、分類部３５によって得られた分類情報から酵素種を判定して判定結果を出力する酵素種判定部３６と、を備えている。撮影画像は、流路内に存在する細胞を示すものであるから、撮影画像における粒子状の物体は個々の細胞に該当する。判定情報は、公知の画像処理技術によって撮影画像から得られる情報であり、例えば、粒子数、真円度、周囲長などの情報である。本実施形態で使用可能な判定情報については後述するが、粒子数は細胞数に対応し、真円度は細胞の形状における真円度であり、周囲長も細胞の周囲長である。本実施形態では１種類の判定情報を用いてもよいが、より的確な産生酵素種の判定のためには、複数種類の判定情報を組み合わせることが望ましい。複数種類の判定情報を用いるときは、それらをまとめて判定情報群と呼ぶ。
　本実施形態の検査装置３０は、例えばコンピューターを使用し、コンピューター上で実行されるソフトウェアプログラムによって実現することができる。このプログラムは、複数の流路を同時に撮影した画像である撮影画像が入力するコンピューターに、後述する各処理を実行させるプログラムである。プログラムは、例えば、ＣＤ－ＲＯＭなどの記録媒体に格納されて流通し、記録媒体を介してコンピューターに読み込まれる。あるいは、プログラムは、ネットワークを介してコンピューターに読み込まれる。このようなプログラムを非一時的に格納してコンピューターによって読み出し可能なＣＤ－ＲＯＭなどの記録媒体や、ネットワークを介してプログラムをコンピューターに送信するために用いられるケーブルなどの信号媒体も、本発明の範疇に含まれる。図２は、図１に示す検査装置３０をコンピューター３によって実現した場合の装置の構成を示している。コンピューター３によって検査装置を実現した場合、コンピューター３のディスプレイには、例えば顕微鏡光学系２での観察像である撮影画像４を表示させることができる。
　次に、本実施形態で使用するマイクロ流路デバイス１について説明する。図３は、マイクロ流路チップ１の外観を示す平面図である。ここで用いるマイクロ流路チップ１として、例えば特開２０１７－６７６２０号公報や特開２０１７－６７６２１号公報に開示されたものを使用することができる。マイクロ流路チップ１は、縦２６ｍｍ程度、横７６ｍｍ程度、厚み１ｍｍ程度のガラス基板１ｃ上に、凹溝と貫通孔とを形成した縦２４ｍｍ程度、横４５ｍｍ程度、厚み１ｍｍ程度の透明なシリコーンゴム板１ａが接着された構造をしている。貫通孔は、後述の図４Ａにおいては試験液導入口１３１及び薬剤固定口１３２として示されている。シリコーンゴム板１ａの凹溝を形成した面とガラス基板１ｃを接着することにより、流路等を構成する内部空間１１が形成される。内部空間１１は、貫通孔により外部と連通し、これにより内部空間１１に対する後述の試験液の導入や、後述の反応物の導入を行うことができる。凹溝の幅や深さは、観察対象の大きさにより任意に選択できるが、対象が細胞等の場合、幅１００μｍ、深さ５０μｍ程度が望ましい。また、用途に応じて内部空間を複数配置する場合もあり、複数の内部空間を１つのマイクロ流路チップ１に設ける場合には、内部空間をユニットと呼ぶこととする。本実施形態では、４個の内部空間を有するマイクロ流路チップ１が使用される。以下の説明では、４個の内部空間を区別するために、これらの内部空間に対して、内部空間１１，１２，１３，１４のように参照符号を付与する。内部空間１１～１４を、それぞれ、第１ユニット、第２ユニット、第３ユニット及び第４ユニットとも呼ぶ。内部空間１１～１４は同一構成であるので、以下では、第１ユニットである内部空間１１により、マイクロ流路チップ１の詳細を説明する。
　図４Ａは、マイクロ流路チップ１における内部空間１１を示す図であり、図４Ｂは、内部空間１１における観察部１０２の拡大平面図である。内部空間１１は、試験液導入口１３１と複数の薬剤固定口１３２と、それらを連通する流路１００とからなる。流路１００は、試験液導入口１３１に連通するとともに薬剤固定口１３２に向けて分岐する分岐部１０１と、薬剤固定口１３２側に配置する観察部１０２とから構成されている。ここでは４個の薬剤固定口１３２が設けられているので、試験液導入口１３１から導入された試験液は、流路１００において、４本の流路１００ａ，１００ｂ，１００ｃ，１００ｄに分岐する。観察部１０２では、この４本の流路１００ａ～１００ｄが顕微鏡光学系２における同一視野に収まるように、流路１００ａ～１００ｄの流路幅を狭くするとともにこれらの流路１００ａ～１００ｄを相互に接近して配置している。以下の説明において、流路１００ａ～１００ｄをそれぞれ第１流路、第２流路、第３流路、第４流路と呼ぶ。薬剤固定口１３２は、用途に応じてその底部に固形の薬剤１０３を配置するためのものである。
　本実施形態では、マイクロ流路チップ１の各ユニット１１，１２，１３，１４において、細胞を含む液体培地である試験液が試験液導入口１３１から導入され、薬剤固定口１３２には、薬剤１０３として抗微生物薬が配置される。さらに、薬剤１０３として、抗微生物薬と、抗微生物薬を分解する酵素を不活性化するすなわち阻害する化学物質である阻害剤とを組み合わせて薬剤固定口１３２に配置してもよい。基準となる判定情報を得るために、薬剤１０３が配置されない薬剤固定口１３２も設定される。
　本実施形態では、例えば、細胞膜を有する細胞における薬剤耐性機構としての産生酵素種の判定を行うことができる。この場合の産生酵素種の判定において用いられる抗微生物薬は、例えば、ペニシリン系、セファロスポリン系、セファマイシン系、オキサセフェム系、ペネム系、カルバペネム系、カルバセフェム系、モノバクタム系などの、β－ラクタム環を有し、抗菌活性を示す化合物である。そのような抗微生物薬の具体例としては、セフォタキシム（ＣＴＸ；Ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ）、セフタジジム（ＣＡＺ；Ｃｅｆｔａｚｉｄｉｍｅ）、セフメタゾール（ＣＭＺ；Ｃｅｆｍｅｔａｚｏｌｅ）、メロペネム（ＭＥＰＭ；Ｍｅｒｏｐｅｎｅｍ）、セフトリアキソン（ＣＴＲＸ；Ｃｅｆｔｒｉａｘｏｎｅ）、アズトレオナム（ＡＺＴ；Ａｚｔｒｅｏｎａｍ）、セフポドキシム（ＣＰＤＸ；Ｃｅｆｐｏｄｏｘｉｍｅ）、ラタモキセフ（ＬＭＯＸ；ＬａｔａｍｏｘｅｆまたはＭｏｘａｌａｃｔａｍ）、ペニシリン（ＰＣ；Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、ベンジルペニシリン（ＰＣＧ；Ｂｅｎｚｙｌｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、ファロペネム（ＦＲＰＭ；Ｆａｒｏｐｅｎｅｍ）、ロラカルベフ（ＬＣＢＦ；Ｌｏｒａｃａｒｂｅｆ）などが挙げられる。
　阻害剤は、抗微生物薬を分解する酵素ごとに適切に選択される必要がある。β－ラクタム環を有する抗微生物薬を阻害する酵素として代表的なものには、上述した基質特異性拡張β－ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）のほかに、メタロβ－ラクタマーゼ（ＭＢＬ；Ｍｅｔａｌｌｏ　β－Ｌａｃｔａｍａｓｅ）、ＡｍｐＣ型β－ラクタマーゼ（ＡｍｐＣ）、ＫＰＣ型β－ラクタマーゼ、（ＫＰＣ）、ＯＸＡ型β－ラクタマーゼなどがある。ＥＳＢＬに対する阻害剤としては、例えば、クラブラン酸（ＣＶＡ；Ｃｌａｖｕｌａｎｉｃ　Ａｃｉｄ）、スルバクタム（ＳＢＴ：Ｓｕｌｂａｃｔａｍ）、タゾバクタム（ＴＡＺ；Ｔａｚｏｂａｃｔａｍ）などであって、Ａｍｂｅｒ（アンバー）分類でのクラスＡのβ－ラクタマーゼを阻害する薬剤が挙げられる。ＭＢＬに対する阻害剤としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びその金属塩、ジピコリン酸（ＤＰＡ）、フェナントロリン（Ｐｈｅｎ）などのキレート剤であって、クラスＢのβ－ラクタマーゼを阻害する薬剤が挙げられる。ＡｍｐＣに対する阻害剤としては、例えば、３－アミノフェニルボロン酸（ＡＰＢ）、クロキサシリン（ＭＣＩＣＰ；Ｃｌｏｘａｃｉｌｌｉｎ）などであって、クラスＣのβ－ラクタマーゼを阻害する薬剤が挙げられる。ＫＰＣに対する阻害剤としては、３－アミノフェニルボロン酸（ＡＰＢ）などのクラスＡのβ－ラクタマーゼを阻害する薬剤が挙げられる。
　ここでは、細菌がＥＳＢＬ、ＭＢＬ，ＡｍｐＣ及びＫＰＣの各酵素を産生するか否かを判定するものとする。その場合、マイクロ流路チップ１の第１乃至第４ユニットの各流路の薬剤固定口１３２に対し、表１に示すように薬剤１０３を配置する。表１において、薬剤投入口に対する「第１」などの記載は、第１乃至第４流路のうちのどの流路の薬剤投入口であるかを示している。なお、全てのユニットにおいて、第１流路の薬剤固定口１０３には薬剤を配置せず、第１流路を判定基準の規格化のための基準流路としている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　適切な抗微生物薬と阻害剤とを選択することにより、上記のＥＳＢＬ、ＭＢＬ，ＡｍｐＣ及びＫＰＣの各酵素種以外の酵素の産生も判別可能になる。例えばＯＸＡ阻害剤として塩化ナトリウムやクラブラン酸（ＣＶＡ）を選択し、抗微生物薬としてＬＭＯＸを選択することにより、阻害剤の有無により細菌の形態変化の差から、産生する酵素種がＯＸＡであるかどうか判別できる。
　次に、本実施形態における酵素種判別方法の具体的手順について説明する。図５は、酵素種判別方法の具体的な手順を示している。この酵素種判別方法は、大別すると、試験液を調整して顕微鏡光学系２で撮影して撮影画像を得るまでの前処理段階と、観察像である撮影画像を上述の検査装置３０で処理して産生酵素種を決定する決定処理段階の２つの段階に分けられる。
　前処理段階は、基本的には人の手によって行われてもよい作業によって構成される。もちろん、前処理段階自体を自動化することもできる。前処理段階では、まずステップＳ１０１において、産生酵素種の判別を行おうとする細菌を寒天培地に播種し、ステップＳ１０２において、寒天培地においてその細菌を培養する。寒天培地での培養の終了後、ステップＳ１０３において、寒天培地から釣菌し、液体培地に拡散させて試験液とする。次にステップＳ１０４において、試験液をマイクロ流路チップ１の各試験液導入口１３１からマイクロ流路チップ１の各流路に導入する。試験液の導入の時点で、マイクロ流路チップ１の各薬剤固定口１３２には上述の表１に基づいて固形の薬剤１０３が既に固定されているものとする。試験液を導入することにより、マイクロ流路チップ１では試験液が薬剤固定口１３２まで流れ、薬剤１０３が試験液に溶解し、薬剤中の抗微生物薬や阻害剤が観察部１０２の位置まで流路１００ａ～１００ｄを介して拡散する。その後、ステップＳ１０５において、所定の温度で所定の時間にわたって細菌の培養を行う。細菌の培養の終了後、マイクロ流路チップ１を顕微鏡光学系２にセットし、ユニットごとにその観察部１０２を顕微鏡光学系２で撮影し、ステップＳ１０６において、観察像である撮像画像４を取得する。１つの観察像には４本の流路がまとめて撮像されている。またユニットの数が４個であるので、合計で４枚の撮像画像４が取得される。
　図６は、前処理段階での処理を概略的に示したものである。検査対象の細菌５を寒天培地で培養後、液体培地６に分散させて試験液とする。その後、この試験液をマイクロシリンジ７などを用いて試験液導入口１３１からマイクロ流路チップ１に導入する。
　図７は、観察像として取得された撮影画像４の一例を示している。この撮影画像４は、第１ユニットの観察部１０２を撮影したものであり、この画像から、流路１００ａ～１００ｄすなわち第１乃至第４流路が一視野に収まっていることがわかる。顕微鏡光学系２による撮影を容易にするために、マイクロ流路チップ１では、ユニットごとにその観察部１０２の周囲にいずれも三角形である観察像方向指示ガイド４１と撮影位置ガイド４２が位置合わせ用のマークとして設けられている。これらのガイド４１，４２を参照することで、撮影画像４の取得が容易になっている。図７に示す撮影画像４には、これらのガイド４１，４２も映り込んでいる。なお、観察像方向指示ガイド４１は、それを構成する三角形のマークの数がユニットごとに異なっている。したがって、撮影画像４を見ればそれがどのユニットの観察部１０２を撮影したものであるかが分かる。撮影画像４には細胞も映っている。ここに示す例では、路１００ａ，１００ｂの細胞５１には形態の変化が見られないのに対し、流路１００ｃ，１００ｄの細胞５２では形態の変化が認められる。細胞壁を有する細胞に対してβ－ラクタム環を有する抗微生物薬を使用しているので、形態が変化した細胞５２は、抗微生物薬の影響を受けた細胞であると言える。抗微生物薬の影響を受けた細胞には、その抗微生物薬を分解する酵素を産生しない細胞と、抗微生物薬を分解する酵素を産生するがその酵素が阻害剤によって阻害されているために抗微生物薬の影響を受けてしまった細胞との２通りが考えられる。
　図５に戻って、決定処理段階での処理を説明する。なお、顕微鏡光学系４で取得された４枚の撮影画像４は、図１に示す検査装置３０に送られて画像格納部３１に格納されている。まず、ステップＳ２０１において、判定情報生成部３２は、画像格納部３１内の撮影画像４の各々について、その撮影画像４内の各流路から、画像処理により、細胞の形態の特徴を示す判定情報を取得する。判定情報として使用可能なものには、粒子数、粒子形状、平均面積（あるいは粒子サイズ）、粒子の周囲長、粒子のエッジ数、粒子のコーナー数、平均コーナー数、粒子の真円度、粒子の特徴点数、平均特徴点数、粒子のボックス面積、平均ボックス面積、粒子の面積比率、画像のホワイトバランス、粒子間の距離などが挙げられる。これらの値や、それらの標準偏差や分布情報、さらには画像のピクセルデータそのものも、判定情報として使用可能なものの中に含まれる。ここで平均面積は、指定範囲内（この場合、流路内）において、解析対象（この場合、細胞）が占める面積のことをいう。コーナー数は、ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）オペレーターにより検出された数値のことをいい、平均コーナー数は、コーナー数を指定範囲の面積で割ったもののことをいう。特徴点数は、対象範囲内の特徴量を回転不変で抽出するアルゴリズムであるＡＫＡＺＥアルゴリズムにより検出された指定範囲内の特徴点数のことをいい、平均特徴点数は、特徴点数を指定範囲の面積で割ったもののことをいう。平均ボックス面積は、指定範囲内において解析対象を囲む矩形の面積の平均値のことをいう。面積比率は、指定範囲内において、解析対象を囲む矩形の面積に対する解析対象が占める面積の比のことをいう。
　本実施形態では、一例として、流路ごとに複数種類の判定情報を求める。具体的には、粒子数、真円度、周囲長、コーナー数、平均コーナー数、特徴点数、平均特徴点数、平均ボックス面積、面積比率、平均面積の計１０種の判定情報を流路ごとに取得する。これらの判定情報を流路ごとに群として、判定情報群とする。以下の説明において、流路１００ａに対して取得される判定情報を１０１ａ，１０２ａ，１０３ａ，…のように表し、これらをまとめて流路１００ａに対する判定情報群１１０ａとする。流路１００ｂに対しても同様に判定情報１０２ｂ，１０２ｃ，…が求められてこれらは判定情報群１１０ｂを構成する。流路１００ｃ，１００ｄについても同様である。
　流路１００ａ～１００ｄに対してそれぞれ判定情報群１１０ａ～１１０ｄが求められたら、次に、撮像画像４ごとに基準判定情報選択部３３が、判定情報群１１０ａ～１１０ｄの中から判定の基準となる基準判定情報群を選択し、判定情報規格化部３４が、ステップＳ２０２において、基準判定情報群によって他の判定情報群の値を規格化する。ここでは、薬剤投入口１３２に薬剤１０３を配置していない第１流路（すなわち流路１００ａ）を基準流路として選択し、この第１流路の判定情報群を基準判定情報群とする。そして、基準判定情報群として選択されなかった判定情報群、ここでは第２乃至第４流路に対応する判定情報群について、その判定情報群に含まれる判定情報ごとにその判定情報の値を、基準判定情報群での同じ判定情報の値を用いて規格化する。
　基準流路を除く各流路の判定情報群の規格化が終了したら、図１に示す分類部３５が、ステップＳ２０３において、流路ごとの規格化された判定情報群を何段階かに分類して分類情報を取得する。基準流路でない流路が３つあるので、３つの分類情報が取得される。ここでの分類では、細菌の形態の変化に応じ、判定情報群から流路ごとの分類情報を生成する。一例として、判定情報群から分類Ａ、分類Ｂ及び分類Ｃのいずれかの分類情報を生成する。分類Ａには、流路内での細菌の形態変化が基準流路、すなわち抗微生物薬及び阻害剤を用いない第１流路に対してほとんどないものが分類される。分類Ｃには、流路内での細菌の形態変化が基準流路に比べて顕著なものが分類される。分類Ｃは、図７に示す例で言えば、流路１００ｄにおける細胞５２の場合のような、基準流路である流路１００ａの細胞５１に比べて大きく形態が変化している場合に該当する。分類Ｂは分類Ａと分類Ｃの中間の状態であり、形態が変化していない細菌と形態が変化している細菌とが混在しているものが分類Ｂに分類される。
　以下、分類情報の求め方の詳細について、各判定情報群を分類Ａ、分類Ｂ及び分類Ｃのいずれかに分類する場合を例に挙げて説明する。
　規格化された判定情報群を[Ｘ]とする。判定情報群を構成する判定情報の数をｎとする。１０種類の判定情報を用いる場合であればｎ＝１０である。規格化された判定情報群[Ｘ]を構成する規格化された各判定情報の値をｘ1，ｘ2，ｘ3，…，ｘnとすれば、[Ｘ]＝（ｘ1，ｘ2，ｘ3，…，ｘn）である。流路ごとの判定情報群をロジスティック関数に代入し、分類Ａ乃至Ｃの各々に分類される確率を算出し、最も高い確率である分類を選択し、流路の分類をその選択された分類とする。
　判定情報群[Ｘ]が分類Ａ、分類Ｂ及び分類Ｃにそれぞれ確率をＦA([Ｘ])，ＦB([Ｘ])，ＦC([Ｘ])とすると、ＦA([Ｘ])＋ＦB([Ｘ])＋ＦC([Ｘ])＝１が成り立ち、これらの確率は、ロジスティック関数を用いて以下のように表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　ここで、実際に分類を行うために用いる分類パラメータとして係数ＣA，ＣB，ＣAk，ＣBkを導入する。すると上記式におけるｆA([Ｘ])及びｆB([Ｘ])は、以下のように表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　分類パラメータである係数ＣA，ＣB，ＣAk，ＣBkを定めれば、流路ごとの規格化された判定情報群に基づいてその流路を一意に分類できることが分かる。例えば、多数の撮影画像を対象として人が目視によって撮影画像中の各流路を分類し、その分類結果に対応するように係数ＣA，ＣB，ＣAk，ＣBkを予め定めることができる。
　ここではロジスティック関数を用いる多重回帰分析によって判定情報群の分類を行っているが、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）やニューラルネットワーク、ランダムフォレスト、決定木、ｋ近傍法など、教師あり学習に基づき判定情報を入力とし分類情報を取得することのできる線形識別器や非線形識別器などの一般的な識別器を用いて判定情報群の分類を行ってもよい。どのようにして分類を行うかに応じ、分類に用いる分類パラメータの構成なども異なってくる。
　以上の処理により、撮影画像すなわちユニットごとに３つの流路の分類が行われて３つの分類情報が得られたことになる。本実施形態では４つのユニットを有するマイクロ流路チップ１を用いているので、合計で１２（＝３×４）個の分類情報が得られる。
　分類情報は、分類Ａ、分類Ｂ及び分類Ｃのうちのどれであるかという情報であり数値情報ではないので、この形態のままでは、産生酵素種を判別するための判別アルゴリズムの適用が不便である。そこで、図１に示す分類部３５は、ステップＳ２０４において、分類情報を対応するランクに変換し、ランク値を取得して後段の酵素種判定部３６に出力する。分類情報からランクへの変換は、分類Ａを０、分類Ｂを１、分類Ｃを２と数値化し、順序化することによって行われる。
　ここで、図８は、ステップＳ２０１からステップＳ２０４までの処理を、情報の流れと変換の観点で詳しく説明したものである。この図では、１つのマイクロ流路チップ１の４つのユニットから得られる撮影画像を、それぞれ、撮影画像４ａ，４ｂ，４ｃ，４ｄとしている。第１ユニットに対応する撮影画像４ａからは、ステップＳ２０１を実行することにより、それぞれ流路１００ａ～１００ｄに対応する４つの判定情報群１１０ａ～１１０ｄが得られ、ステップＳ２０２を実行することにより、それぞれ流路１００ｂ～１００ｄに対応する規格化された判定情報群１１１ｂ～１１１ｄが得られる。流路１００ａは基準流路であるので、この流路に対しては規格化された判定情報群は作成されない。そして、ステップＳ２０３を実行することにより、それぞれ流路１００ｂ～１００ｄに対応する３つの分類情報１１２ｂ～１１２ｄが得られ、これらの分類情報からステップＳ２０４の実行によってランク値１１３ｂ～１１３ｄが得られる。
　同様に、第２ユニットに対応する撮影画像４ｂからは、３つの分類情報２１２ｂ～２１２ｄが得られ、これらからランク値２１３ｂ～２１３ｄが得られる。第３ユニットに対応する撮影画像４ｃからは、分類情報３１２ｂ～３１２ｄが得られ、これらからランク値３１３ｂ～３１３ｄが得られる。第４ユニットに対応する撮影画像４ｄからも、分類情報４１２ｂ～４１２ｄが得られ、これらからランク値４１３ｂ～４１３ｄが得られる。
　ランク値の取得が終了すると、図１に示す酵素種判定部３６が、ステップＳ２０５において、判別アルゴリズムに基づいてランク値を比較することにより各酵素の産生情報を取得し、ステップＳ２０６において、産生酵素種を取得する。図９は、各酵素の産生情報を取得するステップＳ２０５の処理の詳細を示している。ここでは上記の表１に示すようにマイクロ流路チップ１に薬剤が配置されるものとする。また、第Ｍユニットの第Ｎ流路のランク値のことをＲａｎｋM-Nと表すこととする。ステップＳ２０５に示す処理では、酵素種判定部３６は、まずステップＳ２０５Ｅにおいて、ＥＳＢＬ判定処理を実行し、ＥＳＢＬの産生の有無を判定する。具体的にはＥＳＢＬ判定処理では、ステップＳ５０１において、第１ユニットの第２流路のランク値Ｒａｎｋ1-2と第１ユニットのランク値Ｒａｎｋ1-3とが比較され、Ｒａｎｋ1-2＜Ｒａｎｋ1-3であれば、すなわち図においてＴＲＵＥ（真）と表示される方に分岐する場合であれば、ステップＳ５０２において、「ＥＳＢＬを産生している」、すなわちＥＳＢＬ（＋）と判定される。ステップＳ５０１においてＲａｎｋ1-2＜Ｒａｎｋ1-3でなければ、すなわち図においてＦＡＬＳＥ（偽）と表示されている方に分岐する場合であれば、ステップＳ５０３において、Ｒａｎｋ2-2とＲａｎｋ2-3とが比較され、Ｒａｎｋ2-2＜Ｒａｎｋ2-3であれば、ステップＳ５０２に移行して「ＥＳＢＬを産生している」と判定される。一方、ステップＳ５０３においてＲａｎｋ2-2＜Ｒａｎｋ2-3でなければ、ステップＳ５０４において、「ＥＳＢＬを産生しない」、すなわちＥＳＢＬ（－）と判定される。図９において「（＋）」及び「（－）」の記号は、それぞれ、「対応する酵素を産生する」及び「対応する酵素を産生しない」に対応する。
　ステップＳ２０５ＥにおけるＥＳＢＬの産生の有無の判定が終われば、次にステップＳ２０５Ｍにおいて、ＭＢＬ判定処理が実行され、ＭＢＬの産生の有無が判定される。ＭＢＬ判定処理では、まず、ステップＳ５１１において、Ｒａｎｋ2-2とＲａｎｋ2-4とが比較され、Ｒａｎｋ2-2＜Ｒａｎｋ2-4であれば、ステップ５１２において、「ＭＢＬを産生している」と判定される。ステップＳ５１１においてＲａｎｋ2-2＜Ｒａｎｋ2-4でなければ、ステップＳ５１３において、Ｒａｎｋ4-2とＲａｎｋ4-4とが比較される。ここでＲａｎｋ4-2＜Ｒａｎｋ4-4であれば、ステップＳ５１２に移行して「ＭＢＬを産生している」と判定され、Ｒａｎｋ4-2＜Ｒａｎｋ4-4でなければ、ステップＳ５１４において、「ＭＢＬを産生しない」と判定される。
　ステップＳ２０５ＭにおけるＭＢＬの産生の有無の判定が終われば、次に、ステップＳ２０５Ａにおいて、ＡｍｐＣ判定処理が実行され、ＡｍｐＣの産生の有無が判定される。ＡｍｐＣ判定処理では、まず、ステップＳ５２１において、Ｒａｎｋ3-2とＲａｎｋ3-3とが比較され、Ｒａｎｋ3-2＜Ｒａｎｋ3-3であれば、ステップＳ５２２において、「ＡｍｐＣを産生している」と判定される。ステップＳ５２１においてＲａｎｋ3-2＜Ｒａｎｋ3-3でなければ、ステップＳ５２３において、Ｒａｎｋ3-2とＲａｎｋ3-4とが比較される。ここでＲａｎｋ3-2＜Ｒａｎｋ3-4であれば、ステップＳ５２２に移行して「ＡｍｐＣを産生している」と判定され、Ｒａｎｋ3-2＜Ｒａｎｋ3-4でなければ、ステップＳ５２４において、「ＡｍｐＣを産生しない」と判定される。
　ステップＳ２０５ＡにおけるＡｍｐＣの産生の有無の判定が終われば、次に、ステップＳ２０５Ｋにおいて、ＫＰＣ判定処理が実行され、ＫＰＣの産生の有無が判定される。ＫＰＣ判定処理では、まず、ステップＳ５３１において、Ｒａｎｋ4-2とＲａｎｋ4-3とが比較され、Ｒａｎｋ4-2＜Ｒａｎｋ4-3であれば、ステップＳ５３２において、「ＫＰＣを産生している」と判定され、Ｒａｎｋ4-2＜Ｒａｎｋ4-3でなければ、ステップＳ５３３において、「ＫＰＣを産生しない」と判定される。
　以上の処理を実行することにより、検査対象の細菌が、ＥＳＢＬ、ＭＢＬ、ＡｍｐＣ及びＫＰＣの各酵素を産生するか産生しないかの判別を行うことができる。
　［第２の実施形態］
　図１乃至図９を用いて説明した上述の第１の実施形態は、細菌の種類に関する情報を利用しないで細菌が産生する酵素種を判別することにより、あらゆる菌種に対して産生酵素種の判別を行うものである。しかしながら、判定情報群を分類する際に用いる分類パラメータである既述の係数ＣA，ＣB，ＣAk，ＣBkには、それぞれ細胞の種類、例えば菌種ごとに最適な値が存在する。より高い判定制度が要求される場合には、菌種に応じた最適な係数ＣA，ＣB，ＣAk，ＣBkを用いて判定情報群の分類を行う必要がある。そこで、第２の実施形態では、基準判定情報群に基づいて菌種を識別し、菌種に応じた係数ＣA，ＣB，ＣAk，ＣBkを用いることによって、検査精度の向上を図っている。
　図１０は、第２の実施形態において酵素種判別方法の実施に用いることができる検査装置３０を示している。この検査装置３０は、図１に示す検査装置に対し、さらに、基準判定情報群を用いて被写体の菌種を分類し、被写体分類を得る事前分類部３７と、被写体分類に対応した分類パラメータが複数組格納されたデータベース３８と、を付け加えたものである。被写体分類は、菌種の違いによる撮影画像の相違に対応する。データベース３８より被写体分類に対応する分類パラメータを選択し、選択された分類パラメータを用いて分類部３５で判定情報群の分類を行うことにより、より高い精度で産生酵素種の判定を行うことができるようになる。したがって図１０に示す検査装置３０の分類部３５は、事前分類部３７が求めた被写体分類に対応する分類パラメータをデータベース３８から読み出し、読み出した分類パラメータを用いて、撮影画像から得られて規格化された判定情報群に対する分類を実行し、分類情報を生成する。この第２の実施形態においても、第１の実施形態と同様に、検査装置３０は、例えばコンピューターを使用し、コンピューター上で実行されるソフトウェアプログラムによって実現することができる。
　図１１を用いて、第２の実施形態の酵素種判別方法の具体的手順について説明する。図１１に示す手順は、基本的には図５に示す第１の実施形態と同じであるが、第１の実施形態でのステップＳ２０３の代わりに、ステップＳ３０１及びステップＳ３０２を実行するようにしたものであるので、ステップＳ３０１及びステップＳ３０２について説明する。
　ステップＳ２０２において判定情報群の規格化が行なわれたのち、ステップＳ３０１では、図１０に示す事前分類部３７が、ロジスティック関数などを用いる多重回帰分析を行うことにより、基準流路である第１流路から得られた判定情報群すなわち基準判定情報群から、例えば大腸菌や肺炎桿菌などの菌種に対応する被写体分類を取得する。
　ステップＳ３０２では、分類部３５は、取得された被写体分類に基づいてデータベース３８を検索して被写体分類に対応した分類パラメータすなわち係数ＣA，ＣB，ＣAk，ＣBkを読み出し、読み出した係数ＣA，ＣB，ＣAk，ＣBkを使用して、流路ごとの規格化された判定情報群を上述と同様に分類し、分類情報を生成する。分類情報が生成したのちの処理は、図５に示すものと同じである。
　図１２Ａ、図１２Ｂ及び図１２Ｃは、被写体分類に対応する撮影画像の例を示すことによって被写体分類を説明する図である。ここでは、被写体分類として被写体分類ｘ、被写体分類ｙ及び被写体分類ｚの３種類が示されている。図１２Ａは、被写体分類ｘに対応する撮影画像４ｘを模式的に示している。この撮影画像４ｘでは、抗微生物薬の影響を受けていない状態すなわち第１流路（流路１００ａ）に示される状態においても、細胞５１ｘの形態が図７に示す撮影画像における第１流路での細胞５１とは異なっている。図１２Ｂ及び図１２Ｃは、それぞれ被写体分類ｙ，ｚに対応する撮影画像４ｙ，４ｚを模式的に示している。撮影画像４ｙ，４ｘの第１流路でそれぞれ観察される細胞５１ｙ，５１ｚは、それらの形態自体は図７に示す撮影画像における第１流路の細胞５１と同等のものであるが、発育状態を示す菌数（粒子数）が異なっている。
　撮影画像４ｘ，４ｙ，４ｚでの第４流路（すなわち流路１００ｄ）には、それぞれ、抗微生物薬の影響により形態が変化した細胞５２ｘ，５２ｙ，５２ｚが描かれ、第３流路（流路１００ｃ）には、第４流路内の細胞５２ｘ，５２ｙ，５２ｚに比べて軽微な形態変化を有する細胞の例が示されている。撮影画像４ｘ，４ｙ，４ｚの第３流路内の細胞の形状を比較すると相互に同じように見えるが、菌種によってこれらを分類Ａ、分類Ｂ及び分類Ｃのいずれに分類すべきかは、産生酵素種の判別の正答率に影響を及ぼす。被写体分類を求め、求めた被写体分類に対応する分類パラメータを用いることによって、産生酵素種の判別の精度が向上する。
　次に、実施例により本発明をさらに詳しく説明する。図１に示す検査装置を用い、第１の実施形態において説明した手順によって、細胞が産生する酵素種の判別を行った。細胞として、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌（ＡＴＣＣ７００６０３株）が使用され、これをハートインフュージョン寒天培地に播種して３５℃で１８時間培養した。培養された細菌をその後、釣菌し、カチオン調整されたミューラーヒントン液体培地に拡散させ、液中の単位体積当たりの菌数である濁度の指標として、ＭｃＦ（マクファーランド濁度単位）０．２５相当になるように懸濁液を調整し、これを試験液とした。そして、この試験液をマイクロ流路チップ１の各流路に導入し、湿潤環境（相対湿度９０％以上）にマイクロ流路チップ１を配置して３５℃で３時間培養した。このように培養を行ったマイクロ流路チップ１の各ユニットの観察部１０２を顕微鏡光学系２により撮影し、ユニットごとに撮影画像を得た。図１３は得られた撮影画像を示している。ユニットごとに、基準流路である第１流路１００ａと、基準流路ではない第２乃至第４流路１００ｂ，１００ｃ，１００ｄが写っているが、符号１５０は、基準流路ではない第２乃至第４流路１００ｂ，１００ｃ，１００ｄをまとめて示している。第１ユニットからは撮影画像４ａが得られ、第２ユニットからは撮影画像４ｂが得られ、第３ユニットからは撮影画像４ｃが得られ、第４ユニットからは撮影画像４ｄが得られた。
　このように得られた撮影画像４ａ～４ｄに対し、判定情報群を求め、分類情報を求めてランク値を取得した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表２に示す結果では、Ｒａｎｋ1-2＝０でＲａｎｋ1-3＝２であるので、Ｒａｎｋ1-2＜Ｒａｎｋ1-3となり、図９に示すフローチャートにおいて処理がステップＳ５０１からステップＳ５０２へと分岐し、ＥＳＢＬ（＋）すなわち「ＥＳＢＬを産生する」と判定された。同様に、Ｒａｎｋ2-2とＲａｎｋ2-4が等しく、Ｒａｎｋ4-2とＲａｎｋ4-4も等しいので、図９に示すフローチャートにおいて処理がステップＳ５１１からステップＳ５１２を経てステップＳ５１４へと分岐し、「ＭＢＬを産生しない」と判定された。Ｒａｎｋ3-2とＲａｎｋ3-3が等しく、Ｒａｎｋ3-2とＲａｎｋ3-4も等しいので、図９に示すフローチャートにおいて処理がステップＳ５２１からステップＳ５２２を経てステップＳ５２４へと分岐し、「ＡｍｐＣを産生しない」と判定された。さらにＲａｎｋ4-2とＲａｎｋ4-3が等しいので、図９に示すフローチャートにおいて処理がステップＳ５３１からステップＳ５３２へと分岐し、「ＫＰＣを産生しない」と判定された。
　本発明によれば、細菌などの細胞が産生する酵素種を容易に判別できる。その結果、抗微生物薬に対する耐性を有する薬剤耐性菌に関し、薬剤感受性結果であるＭＩＣの結果ではなく、細菌の耐性機構としての酵素産生推察を行うことで、薬剤耐性菌に対してより適切な抗菌薬を選択することができ、薬剤耐性菌の将来的な耐性化を抑制することができるようになる。ひいては院内感染の重篤化を防ぐことができるようになる。
　　１　　マイクロ流路チップ
　　２　　顕微鏡光学系
　　３　　コンピューター
　　４，４ａ～４ｃ　　撮影画像
　１１～１４　　内部空間
　３０　　検査装置
　３１　　画像格納部
　３２　　判定情報生成部
　３３　　基準判定情報選択部
　３４　　判定情報規格化部
　３５　　分類部
　３６　　酵素種判定部
　３７　　事前分類部
　３８　　データベース
１００，１００ａ～１００ｄ　　流路

Claims (17)

  1. 　細胞が産生する酵素種を判別する酵素種判別方法であって、
    　複数の流路を同時に撮影した画像である撮影画像から、前記流路ごとに細胞の形態の特徴を示す判定情報を作成する判定情報作成工程と、
    　前記判定情報の中から判定の基準となる基準判定情報を選択し、基準判定情報を用いて前記判定情報を規格化する判定情報規格化工程と、
    　前記規格化された判定情報に基づいて、前記判定情報を分類する分類工程と、
    　前記分類工程によって得られた分類情報から酵素種を判定する判定工程と、
    　を有し、
    　前記撮影画像は、前記複数の流路の各々の内部に培養された細胞が存在する状態を示す画像である、酵素種判別方法。
  2. 　被写体分類ごとの判定情報からなる基準判定情報群により被写体の分類を実行し、被写体分類を得る事前分類工程をさらに備え、
    　前記分類工程において、前記事前分類工程で得た前記被写体分類に対応する分類パラメータを選択し、選択された前記分類パラメータを用いて前記判定情報を分類する、請求項１に記載の酵素種判別方法。
  3. 　前記撮影画像は、複数の流路から構成される観察部を有するマイクロ流路チップを撮影した画像であって、前記複数の流路を一つの視野に収めて前記流路ごとに存在する細胞の状態を撮影した画像である、請求項１または２に記載の酵素種判別方法。
  4. 　前記マイクロ流路チップは、複数の前記観察部を有し、前記観察部ごとに前記撮影画像が取得される、請求項３に記載の酵素種判別方法。
  5. 　前記撮影画像は、抗微生物薬の影響、および、抗微生物薬と阻害剤とを組み合わせた試薬の影響のいずれか一方の影響による細胞の形態変化を撮影した画像である、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の酵素種判別方法。
  6. 　前記基準判定情報は、抗微生物薬及び阻害剤のいずれもが存在しない流路に対応する前記判定情報である、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の酵素種判別方法。
  7. 　前記判定情報は、前記撮影画像における粒子数を少なくとも含む、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の酵素種判別方法。
  8. 　前記判定情報作成工程において、複数種類の前記判定情報を前記流路ごとに取得して判定情報群とし、
    　前記分類工程において、前記複数種類の判定情報に基づき、多重回帰分析による識別器を用いて前記判定情報群の分類を実行する、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の酵素種判別方法。
  9. 　細胞が産生する酵素種を判別する検査装置であって、
    　各々が複数の流路を同時に撮影した画像である撮影画像から、前記流路ごとに細胞の形態の特徴を示す判定情報を作成する判定情報作成手段と、
    　前記判定情報の中から判定の基準となる基準判定情報を選択する基準判定情報選択手段と、
    　前記基準判定情報を用いて前記判定情報を規格化する判定情報規格化手段と、
    　前記規格化された判定情報に基づいて、前記判定情報を分類する分類手段と、
    　前記分類手段によって得られた分類情報から酵素種を判定する判定手段と、
    　を有し、
    　前記撮影画像は、前記複数の流路の各々の内部に培養された細胞が存在する状態を示す画像である、検査装置。
  10. 　被写体分類ごとの判定情報からなる基準判定情報群により被写体の分類を実行し、被写体分類を得る事前分類手段をさらに備え、
    　前記分類手段は、前記事前分類手段で得た前記被写体分類に対応する分類パラメータを選択し、選択された前記分類パラメータを用いて前記判定情報を分類する、請求項９に記載の検査装置。
  11. 　前記撮影画像は、複数の流路から構成される観察部を有するマイクロ流路チップを撮影した画像であって、前記複数の流路を一つの視野に収めて前記流路ごとに存在する細胞の状態を撮影した画像である、請求項９または１０に記載の検査装置。
  12. 　前記撮影画像は、抗微生物薬の影響、および、抗微生物薬と阻害剤を組み合わせた試薬の影響のいずれか一方の影響による細胞の形態変化を撮影した画像である、請求項９乃至１１のいずれか１項に記載の検査装置。
  13. 　前記基準判定情報は、抗微生物薬及び阻害剤のいずれもが存在しない流路に対応する前記判定情報である、請求項９乃至１２のいずれか１項に記載の検査装置。
  14. 　前記判定情報は、前記撮影画像における粒子数を少なくとも含む、請求項９乃至１３のいずれか１項に記載の検査装置。
  15. 　前記判定情報作成手段は、複数種類の前記判定情報を前記流路ごとに取得して判定情報群とし、
    　前記分類手段は、前記複数種類の判定情報に基づき、多重回帰分析による識別器を用いて、前記判定情報群の分類を実行する、請求項９乃至１４のいずれか１項に記載の検査装置。
  16. 　複数の流路を同時に撮影した画像である撮影画像が入力するコンピューターに、
    　前記複数の流路の各々の内部に培養された細胞が存在する状態を示す画像である前記撮影画像から、前記流路ごとに細胞の形態の特徴を示す判定情報を作成する判定情報作成処理と、
    　前記判定情報の中から判定の基準となる基準判定情報を選択し、基準判定情報を用いて前記判定情報を規格化する判定情報規格化処理と、
    　前記規格化された判定情報に基づいて、前記判定情報を分類する分類処理と、
    　前記分類処理によって得られた分類情報から、前記細胞が産生する酵素種を判定する処理と、
    　を実行させるプログラム。
  17. 　前記コンピューターに、さらに、
    　被写体分類ごとの判定情報からなる基準判定情報群により被写体の分類を実行し、被写体分類を得る事前分類処理を実行させ、
    　前記分類処理において、前記事前分類処理で得た前記被写体分類に対応する分類パラメータを選択し、選択された前記分類パラメータを用いて前記判定情報が分類される、請求項１６に記載のプログラム。
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