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WO2021043719A1 - Composition pharmaceutique antivirale contenant du thionicotinamide - Google Patents

Composition pharmaceutique antivirale contenant du thionicotinamide Download PDF

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Publication number
WO2021043719A1
WO2021043719A1 PCT/EP2020/074232 EP2020074232W WO2021043719A1 WO 2021043719 A1 WO2021043719 A1 WO 2021043719A1 EP 2020074232 W EP2020074232 W EP 2020074232W WO 2021043719 A1 WO2021043719 A1 WO 2021043719A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
virus
pharmaceutical composition
composition according
cells
infection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2020/074232
Other languages
English (en)
Inventor
Gilles Duverlie
Lynda HANDALA
Etienne BROCHOT
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite de Picardie Jules Verne
Centre Hospitalier Universitaire Amiens-Picardie
Original Assignee
Universite de Picardie Jules Verne
Centre Hospitalier Universitaire Amiens-Picardie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite de Picardie Jules Verne, Centre Hospitalier Universitaire Amiens-Picardie filed Critical Universite de Picardie Jules Verne
Publication of WO2021043719A1 publication Critical patent/WO2021043719A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition which contains as a pharmaceutically active compound, thionicotinamide, for its use as an antiviral agent, in the treatment of a viral infection, in particular of a polyomavirus infection.
  • This composition can be used during the complications of polyomavirus infections requiring medical management of patients (nephropathies, hemorrhagic cystitis, etc.).
  • JC virus which remains latent in the urinary tract, can cause, upon reactivation in an immunocompromised subject, progressive multifocal leukoencephalitis (PML).
  • the MCPyV virus is associated with cancer, Merkel cell carcinoma.
  • the SV 40 virus which is a simian virus, was able to contaminate humans as a result of the first polio vaccination campaigns with the oral Sabin-type vaccine prepared from cell culture on monkey kidneys. In immunocompromised monkeys, it can also cause kidney disease and sometimes demyelinating disease similar to PML.
  • Cidofovir® a nucleoside which inhibits the replication of the herpes virus makes it possible to reduce the replication of the BK virus in human kidney cells. This nucleoside is nevertheless nephrotoxic which decreases its interest.
  • a lipid derivative of Cidofovir®, Brincidofovir® is found to be less nephrotoxic, but these compounds are not currently used because their clinical benefit remains insufficient.
  • An aim of the present invention is therefore to provide a pharmaceutical composition which makes it possible to limit or prevent viral replication / propagation, in particular of a polyomavirus, and in particular of the BK virus and / or of the SV 40 virus.
  • Another aim of the present invention is to provide a pharmaceutical composition which makes it possible to limit or prevent the dissemination of a virus in the body, in particular a polyomavirus, in particular in the blood, in the kidneys or in the brain.
  • Another aim of the present invention is to provide a pharmaceutical composition which limits or prevents the spread of a virus, in particular a polyomavirus, in an immunosuppressed subject, in particular a patient who has undergone a kidney transplant.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition in which the pharmaceutically active compound exhibits a good selectivity index as an antiviral.
  • the interest of the present invention is also to provide an antiviral treatment, in particular against polyomaviruses, the side effects of which can be corrected by the administration of nicotinamide which is the endogenous natural molecule targeted by thionicotinamide, which is potentially a competitive inhibitor.
  • Nicotinamide can therefore be used as an antidote for the pharmaceutical composition of the invention, in the event of proven toxicity, in particular in the context of multiple or complex treatments such as during transplants.
  • Another aim of the present invention is to provide a combination product which makes it possible to prevent infection and / or reactivation of polyomaviruses, in particular the BK virus and / or the SV 40 virus, in immunocompromised patients.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition containing as a pharmaceutically active compound thionicotinamide for its use in as an antiviral agent in the treatment of viral infection, especially polyomavirus infection, in a subject in such need.
  • composition of the invention makes it possible either to avoid infection, when it is administered as a preventive measure, for example, before a kidney transplant, or to avoid or limit the reactivation of the virus, in particular of the polyomavirus, when 'it is administered, for example on a preemptive basis, before too great a drop in the control of this infection by the subject's immune system, this infection being able to be induced by an immunosuppressive or immunomodulatory treatment, or even as a curative in order to limit the spread of virus when administered after primary infection or after virus reactivation.
  • said virus is a polyomavirus, in particular the BK virus or the SV 40 virus.
  • the pharmaceutical composition of the invention is contained in a formulation suitable for oral administration or in a formulation suitable for administration. parenterally, in particular intravenously or in a formulation suitable for administration by the bladder route.
  • parenterally in particular intravenously or in a formulation suitable for administration by the bladder route.
  • polyomaviruses which can remain latent in renal or urothelial cells, such as the BK virus, for example, local administration in the bladder, by a catheter, can make it possible to treat the viral focus located in the urinary tract.
  • the pharmaceutical composition of the invention which is found in the bladder, moves the ureters up due to the efflux or reflux movements of the urine and makes it possible to treat the viral focus in the kidneys.
  • the pharmaceutical composition of the invention is in a form suitable for administration at a pharmaceutical active dosage equal to or greater than 0, 1 g / kg / day, in particular equal to 0.2 g / kg / day, in particular for a period equal to or greater than 5 days or equal to or less than 10 days.
  • the pharmaceutical composition of the invention is in a form suitable for administration by parenteral or bladder route and suitable for being administered at a daily pharmaceutical active dosage equal to or greater than 0.1 mg / kg, in particular equal to 0.2 mg / kg for 2, 3 or 4 weeks or at a dosage equal to or greater than 0.3 mg / kg and in particular equal to 0.4 mg / kg for 1 or 2 weeks.
  • the subject is not limited according to the invention. It may be an uninfected subject or an already infected subject in whom the virus, in particular the polyomavirus and in particular the BK virus, is reactivated or latent.
  • the subject is an immunosuppressive subject and in particular a human subject immunosuppressed following an immunosuppressive or immunomodulatory treatment, in particular an immunosuppressive treatment. or immunomodulator which makes it possible to avoid the rejection of a transplant, in particular of a kidney transplant.
  • composition of the invention can also comprise any excipient.
  • excipient in particular an excipient as defined in the 21st edition of Remington, “the Science and practice of Pharmacy”.
  • the pharmaceutical composition of the invention may contain, whatever its embodiment, at least one excipient chosen from water, lactose, corn or potato starch, dextrose , sorbitol, microcrystalline cellulose, dibasic calcium phosphate hydrate, acacia gum, gelatin, polyvinyl pyrrolidone, glucose, carboxy-methyl cellulose, povidone iodine, talc, stearic acid , calcium stearate, magnesium stearate, polyethylene glycol, surfactants, oils, hydrogenated oils, possibly hydrogenated vegetable oils, waxes, in particular vegetable, colloidal silica, clays, cellulose, starch modified, copolymers, silica gel, activated carbon, hydroxypropylmethyl cellulose, zein, poly
  • composition of the invention can comprise DMSO as excipient and be provided in liquid form.
  • DMSO as excipient
  • the solubility of THN in this excipient is such that the required doses allow dissolution at low non-toxic concentrations of DMSO ( ⁇ 1% o).
  • the pharmaceutical composition of the invention is in the form of a capsule or a tablet with a delayed effect and in particular in that it contains as excipient at least one hydrogenated oil and polyethylene glycol. It may also, in this embodiment, contain DMSO in a mixture of excipients or DMSO alone as an excipient.
  • the pharmaceutical composition of the invention contains a therapeutically active amount of thionicotinamide and in particular a therapeutic amount substantially equal to or greater than 2 g, in particular substantially equal to 3 g or 4 g and substantially equal to or less than 6 grams.
  • the pharmaceutical composition of the invention is suitable for being administered as a preventive measure before the primary infection or before the reactivation of said polyomavirus. This, in both cases, in particular, in the case of a patient who is going to undergo a kidney transplant.
  • the pharmaceutical composition of the invention is capable of being administered preemptively during the reactivation of said polyomavirus before the appearance of clinical signs. .
  • composition of the invention is administered curatively after the primary infection or after the reactivation of said polyomavirus.
  • the present invention also relates to a combination product comprising a pharmaceutical composition according to any one of the aforementioned embodiments and at least one immunosuppressive agent chosen from steroidal anti-inflammatory drugs, calcineurin inhibitors, in particular cyclosporine or tacrolimus, cell multiplication inhibitors, including Azathioprine, mycophenolate mofetil, inhibitors of the mTOR protein, such as Vererolimus® in particular and agents blocking the second signal, in particular LEA29Y®, for their simultaneous use delayed or sequenced over time.
  • the composition of the invention can be separated from the immunosuppressive agent (s) or be mixed with the latter (s).
  • the present invention also relates to a method of therapeutic treatment according to which a patient infected with a polyomavirus, in particular the BK virus and / or the SV40 virus, is administered a quantity / therapeutic dose of a pharmaceutical composition containing as active agent of thionicotinamide.
  • composition can be administered via the bladder, parenterally or orally.
  • the patient / subject can be a patient as defined above.
  • the aforementioned information relating to the composition of the invention or its mode of administration applies to the aforementioned therapeutic method.
  • the method can be curative or preventive.
  • polyomavirus denotes a polyomavirus capable of infecting a mammal. It can be chosen from polyomaviruses that are human or likely to be pathogenic in humans, such as, for example, the BK virus, the SV40 virus or the JC virus (JCPyV).
  • immunocompromised subject designates a subject exhibiting at least one of the criteria defined below:
  • the subject can be a mammal, especially a human. It may be a patient who is immunocompromised due to the taking of an immunosuppressive or immunomodulatory drug (for example, due to the taking of an anti-rejection drug, in particular in the case of transplants, in particular of kidney).
  • treatment encompasses both prophylactic (or preventive) treatment which aims to avoid a primary infection or reactivation and preemptive or therapeutic treatment which aims to limit the spread of the virus during a primary infection or reactivation of the virus. virus in an already infected person.
  • pre-emptive treatment is to treat early any patient suspected of developing a symptomatic clinical infection from biological markers or additional examinations (imaging, etc.) in a population particularly at risk of developing or reactivating a disease.
  • initially asymptomatic infection which will progress beyond a certain threshold to a serious symptomatic clinical pathology.
  • One example may be an elevation of a marker of an infectious agent in an asymptomatic patient beyond a threshold which indicates a high probability of developing a clinical pathology and its complications. In this case, it is an increase in the urinary or blood level of genomic copies of BK virus beyond the threshold where the infection becomes symptomatic such as nephropathies or hemorrhagic cystitis.
  • limiting the propagation of a virus mean that at least in vitro the replication of the virus is slowed down or reduced for a given period of time, or even stopped. In the patient, this can (but not necessarily) result in the fact that the concentration of the virus concerned in the urine of the patient after treatment with the composition of the invention remains below the threshold viruria for which symptoms due to appear.
  • the viremia concentration of viral particles in the blood
  • threshold viraemia for which symptoms appear, in particular in an immunocompromised patient, in particular in the case of the treatment of the initial pathology, which causes immunosuppression.
  • the cut-off values may already be defined by clinical consensus which has made it possible to define decision-making algorithms for the treatment of patients. For example, for the BK virus, clinical problems during renal transplantation only arise when viruria exceeds 10 7 / ml_ or viremia 10 4 / ml_ expressed as the number of genomic copies per milliliter.
  • CC50 50% Cytotoxic Concentration designates the so-called cytotoxic concentration of the tested pharmaceutical active compound for which 50% inhibition of cell viability is obtained after a given period;
  • IC50 Inhibitory Concentration 50% designates the concentration of the tested pharmaceutical active compound for which a decrease in the viral population of 50% is obtained under given experimental conditions.
  • the ISso selectivity index denotes the CC50 / IC50 ratio; the higher the selectivity index, the greater the therapeutic margin, that is, the therapeutically effective concentrations are lower the higher the cytotoxic concentrations.
  • MOI multiplicity of infection, defines the ratio of the number of infectious viral particles to the total number of cells in the same volume used for the test.
  • the infectious titer defines the number of infectious viruses in a given volume. It is measured here in FFU / mL (Focus Forming Unit / mL), ie in Focus Forming Units therefore initially corresponding to one infectious viral particle per milliliter.
  • pharmaceutically active and “therapeutic amount” indicate that the compound induces a measurable improvement, immediate or delayed, transient or definitive, in the state of health or the well-being of a subject, in particular when it is found. administered in an appropriate therapeutic amount.
  • THN thionicotinamide
  • Thionicotinamide is also referred to as pyridine-3-carbothioamide.
  • tacrolimus denotes 3S- [3R * [E (1 S * , 3S * , 4S * )], 4S * , 5R * , 8S * , 9E, 12R * , 14R * , 15S * , 16R * , 18S * , 19S * , 26aR * ]] -5,6,8, 11, 12,13,14,15,16, 17,18,19,24,25,26,26 a-hexadecahydro-5, 19- dihydroxy-3- [2- (4-hydroxy-3- methoxycyclohexyl) -1 -methylethenyl] -14,16-dimethoxy-4,10,12,18-tetramethyl-8- (2-propenyl) -15,19- epoxy-3H-pyrido [2,1 -c] [1, 4] oxaazacyclotricosine-
  • azathioprine refers to 6 - [(1 -methyl-4-nitro-4,5-dihydro-1 H-imidazol-5-yl) sulfanyl] -7H-purine.
  • mycophenolate mofetil designates the molecule of the crude formula C23H31 N07 marketed under the name Cellcept®.
  • Everolimus® denotes 2-0- (2-hydroxyethyl) rapamycin; the term “LEA29Y” corresponds to the molecule marketed under the name Belatacept®.
  • progeny corresponds to the quantity of infectious virus released into the supernatant after 72 hours of culture.
  • Figures 1A and B show the cytotoxicity of thionicotinamide on human primary epithelial renal cells (RPTEC) at 72 h;
  • Fig. 1 A represents the above cytoxicity by measurement of intracellular ATR (Cell Titer Glo 2.0 Promega). (On the ordinate, the cytotoxic effect is normalized as a percentage relative to the control. On the abscissa, the concentrations tested are 1,250, 2,500, 5,000, 10,000 and 20,000 nM placed on a logarithmic scale.)
  • Fig. 1 B represents the aforementioned toxicity by measuring the reduction of resazurin (Cell Titer Blue Promega). On the ordinate, the cytotoxic effect is normalized as a percentage compared to the control without THN. On the x-axis, the concentrations tested are 1,250, 2,500, 5,000, 10,000 and 20,000 nM placed on a logarithmic scale.
  • Figs. 2A and 2B represent the cytotoxicity of thionicotinamide on Vero cells at 72 h
  • Fig. 2A represents the aforementioned toxicity by measurement of intracellular ATR. On the ordinate, the effect is normalized as a percentage compared to the control without THN. On the x-axis, the concentrations tested are 8, 80, 8,000, and 80,000 nM placed on a logarithmic scale.
  • Fig. 2B represents the aforementioned toxicity by measuring the reduction in resazurin. On the ordinate, the effect is normalized as a percentage relative to the control without THN. On the x-axis, the concentrations tested are 8, 80, 8,000, and 80,000 nM placed on a logarithmic scale.
  • Figs. 3A and 3B represent the cytotoxicity of thionicotinamide on CV1 cells at 72 h:
  • Fig. 3A represents the aforementioned cytotoxicity by measurement of intracellular ATR.
  • the effect is normalized as a percentage compared to the control without TFIN.
  • the concentrations tested are 8, 80, 8,000, and 80,000 nM placed on a logarithmic scale.
  • Fig. 3B represents the aforementioned cytotoxicity by measuring the reduction of resazurin.
  • the effect is normalized as a percentage compared to the control without THN.
  • the concentrations tested are 8, 80, 8,000, and 80,000 nM placed on a logarithmic scale.
  • Figs. 4A, 4B and 4C represent the inhibitory effect of thionicotinamide after 72 h of infection of RPTEC cells:
  • Fig. 4A represents the inhibitory effect on the expression of BK virus T antigen messenger RNA as measured by qRT-PCR. The measurement is normalized against the expression of a cellular gene (GAPDH). On the ordinate, the effect is normalized as a percentage compared to the control without THN. On the x-axis, the concentrations tested are 1,250, 2,500, 5,000, 10,000 and 20,000 nM placed on a logarithmic scale.
  • Fig. 4B represents the inhibitory effect on the amount of extracellular DNA of BK virus measured by qPCR. On the ordinate, the effect is normalized as a percentage compared to the control without THN. On the x-axis, the concentrations tested are 1,250, 2,500, 5,000, 10,000 and 20,000 nM placed on a logarithmic scale.
  • Fig. 4C represents the inhibitory effect on the percentage of RPTEC cells infected with BK virus measured by immunofluorescence of Viral T Antigen (T Ag) at 72 h. On the ordinate, the effect is normalized as a percentage compared to the control without THN. On the x-axis, the concentrations tested are 1,250, 2,500, 5,000, 10,000 and 20,000 nM placed on a logarithmic scale.
  • Fig. 5 represents the inhibitory effect of thionicotinamide on the percentage of Vero cells infected with the BK virus measured by immunofluorescence of the viral T antigen (T Ag) at 72 h.
  • T Ag viral T antigen
  • the concentrations tested are 8, 80, 8,000, and 80,000 nM placed on a logarithmic scale.
  • Fig. 6 shows the inhibitory effect of thionicotinamide on the percentage of CV1 cells infected with SV40 virus measured by immunofluorescence of Viral T Antigen (T Ag) at 72 h. On the ordinate, the effect is normalized as a percentage compared to the control without THN. On the x-axis, the concentrations tested are 8, 80, 8,000, and 80,000 nM placed on a logarithmic scale.
  • Fig. 7 shows the antiviral effect of thionicotinamide on the extracellular progeny of BK virus after 72 h of infection of RPTEC cells.
  • the effect is normalized as a percentage compared to the control without THN.
  • the concentrations tested are 8, 80, 8,000, and 80,000 nM placed on a logarithmic scale.
  • Fig. 8 represents the antiviral effect of thionicotinamide on the extracellular progeny of BK virus after 72 hours of infection of Vero cells. On the ordinate, the effect is normalized as a percentage compared to the control without THN. On the x-axis, the concentrations tested are 8, 80, 8,000, and 80,000 nM placed on a logarithmic scale.
  • Fig. 9 shows the antiviral effect of thionicotinamide on the extracellular progeny of SV40 virus after 72 h of infection of CV1 cells.
  • the effect is normalized as a percentage compared to the control without THN.
  • the concentrations tested are 8, 80, 8,000, and 80,000 nM placed on a logarithmic scale.
  • Vero cells and CV1 cells are simian epithelial renal cells cultured according to the recommendations of the ATCC in DMEM medium (Gibco, Thermofisher Scientific, France) supplemented with 10% fetal calf serum.
  • RPTECs Sciencell, Clinisciences, France Primary human renal epithelial proximal tubular cells (RPTECs Sciencell, Clinisciences, France) were cultured in growth medium for renal epithelial cells (REGM Bulletkit at Lonza, France) supplemented with 0.1% of recombinant EGF (epithelial growth factor ), 0.1% hydrocortisone, 0.1% epinephrine, 0.1% insulin, 0.1% triodothyronine, 0.1% transferrin, 0.1% GA-100 (amphotericin B and gentamycin) and 0.5% fetal calf serum. The cells are cultured at 37 ° C. in a 5% CO2 incubator according to the supplier's recommendations.
  • Viruses Polyomavirus BK and SV40
  • polyomaviruses Two polyomaviruses were used, the human BK virus which causes kidney disease in humans and the simian virus SV40 as a prototype of the polyomaviruses.
  • the Dunlop strain of the BK virus was produced from the plasmid pUC19pBKv (34-2) under the reference 45025 at the ATCC.
  • the plasmid is amplified after transformation of competent Escherichia Coli HB101 bacteria (Invitrogen) cultured at 37 ° C. in LB medium with 50 ⁇ g / ml of ampicillin.
  • the plasmids produced are purified and linearized by enzymatic digestion with the restriction enzyme BamHI before being used to transfect the Vero cells permissive to BK virus.
  • the infected Vero cells are stored and passed until a cytopathic effect appears.
  • the cells are then frozen and thawed 3 times to obtain cell lysis and release the virus which can be purified by ultracentrifugation.
  • the viral stock is titrated by serial dilution of a ratio of 10 (10 1 to 10 8 ) on the Vero cells distributed 24 h before in 96-well plates and then incubated at 37 ° C.
  • the infected cells are revealed by immunofluorescence of the T antigen of the virus after three days of culture.
  • the titer is expressed in focus units or FFU / mL.
  • SV40 virus strain 777 supplied by Prof. Andréas Sauerbrei was cultured on CV1 cells. The stocks were produced after the onset of the cytopathic effect and the titrations carried out in the same way as the BK virus as described above.
  • the thionicotinamide or pyridine-3-carbothioamide used is as follows: Ref EN300-17569 from Enamine, ordered through Sigma-Aldrich. Thionicotinamide has already been described as an antimetabolite inhibitor of vitamin B3 derivatives.
  • cytotoxicity tests were carried out in triplicate (triplicate) on cell culture microplates incubated for 3 days in a CO 2 incubator under the same conditions as the tests used to evaluate the antiviral effects.
  • the first test (CelITiter-GIo 2.0 Assay Ref. G9241) measures the amount of ATP by bioluminescence to test metabolically active cells. Briefly, the CelITiter Glo reagent is added to each well tested keeping the medium and the plate shaken for 2 minutes on an orbital shaker to induce cell lysis. The plate is then incubated at room temperature for 10 minutes to stabilize the signal which is finally read on a 96-well microplate luminometer (Berthold).
  • the second test (CelITiter-Blue cell Viability Assay) uses a redox dye, ie the staining of a compound induced by the reducing capacity of cells. This is resazurin which is therefore reduced to resofurin and which can be measured by fluorimetry (Promega Fluorimeter).
  • CelITiter-Blue reagent is added to each well.
  • the microplate is shaken for 10 seconds on an orbital shaker and then incubated for 3 hours in a 5% CO2 incubator at 37 ° C.
  • the reduction of the dye is then measured on the Microplate fluorimeter with excitation wavelength at 560 nm and emission at 590 nm.
  • FIGS 1 to 3 show the results obtained on the different cell lines.
  • 6-aminonicotinamide has already been reported in the literature as less toxic than other nicotinamide derivatives such as 6-aminonicotinamide, for example. This lower toxicity is very clear, especially for cell lines. Indeed, the toxicity of 6-aminonicotinamide is of the order of 18.7 mM on RPTEC cells (with the two measurement methods), of the order of 31 mM on Vero cells (with the two measurement methods ) and of the order of 50 mM on the CV1 cells (with the two measurement methods).
  • Control wells of cells cultured respectively without THN, without virus, and without THN or virus are carried out for each experiment.
  • the level of infection and its inhibition are evaluated by markers specific to the virus concerned: T antigen, viral DNA and viral messenger RNA, viral progeny.
  • the most used markers were the number of cells infected by immunofluorescence of the T antigen of the virus and the viral progeny in the supernatant after 3 days corresponding to a complete cell cycle of the virus.
  • For the BK virus we also evaluated the extracellular viral DNA in the supernatants, the messenger RNA of the T antigen. The evaluation of these markers is described below.
  • Amplification is carried out in an ABI prism 7900 HT device (Applied Biosystems) according to the program: 2 minutes at 50 ° C followed by a cycle at 95 ° C for 10 minutes, and 45 cycles at two times 15 seconds at 95 ° C and one minute at 60 ° C.
  • Quantification is done using a 4-point calibration range containing known concentrations of plasmid pUC19pBKv (34-2) containing the BK virus genome (9,000,000 to 9,000 copies / mL in 10-fold dilutions) .
  • the quantifications are carried out in triplicate and a negative control is added to each series.
  • RNAs were extracted using the RNeasy® Mini Kit (Qiagen TM) on the QIAcube extractor (Qiagen TM) from the manufacturer's protocol in the presence of DNAse. The concentration of the extracted RNAs was evaluated on the Nanodrop ND 1000 spectrophotometer. The cDNAs were synthesized from the RNAs extracted by reverse transcription with the High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems TM) according to the manufacturer's recommendations.
  • the qPCR of the cDNA corresponding to the T Antigen was carried out in a total volume of 25 ⁇ l containing the Applied Universal Master Mix 2x, 10 mM of each primer and of the probe labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) and finally 2 ⁇ L of cDNA.
  • PCR amplification was performed on ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection System (Applied Biosystems TM) according to the manufacturer's recommendations.
  • the quantification was carried out by the AACt method. This is a relative quantification by comparison of the Ct (Cycle threshold) obtained with respect to the expression of the cellular gene for household b-Actin. This formula allows gene expression to be normalized from one series to another.
  • the cells are washed three times with isotonic phosphate buffer at pH 7.4 (PBS) in the wells of the microplates after three days of culture.
  • PBS isotonic phosphate buffer at pH 7.4
  • the fixed cells are then washed with PBS and then incubated with the primary monoclonal antibody for 1 h at RT, washed again, then incubated with the secondary antibody for 30 minutes in the dark.
  • the two antibodies are diluted in 0.1% PBS Tween 20.
  • the primary antibody is a mouse monoclonal anti-SV40 TAg diluted 1/500 [PAb416] (Abcam, France). Note that this antibody reveals both the T antigen of the SV40 virus and the T antigen of the BK virus.
  • the secondary antibody is a polyclonal goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor Plus 488 diluted to 1 / 1000th (ThermoFisher Scientific, France).
  • the nuclei are stained with 1/1000 th DAPI for five minutes in the wells which are then washed three times with PBS. The number of infected cells and the number of total cells are counted by immunofluorescence on an inverted microscope at low magnification x10 (Axio Vert.AI Zeiss with a Colibri 7 LED source, France).
  • the progeny here corresponds to the quantity of infectious virus released into the supernatant after 72 hours of culture with or without THN.
  • the supernatants are clarified by centrifugation for 15 minutes at 1500 rpm and then stored at 4 ° C.
  • a volume of 100 microliters is taken to infect Vero (for the BK virus) or CV1 (for the SV40) cell culture wells.
  • the supernatant is removed after 2 hours of contact at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator with the cells and replaced with culture medium. After 3 days under these conditions, the infectious foci are counted in each well by indirect immunofluorescence according to the technique described above (5.1). The results are shown in Figures 7-9.
  • the concentrations are converted to a logarithm of base 10 and the test results are normalized to 100% for the control wells without the test compound (here, the THN) (100% control). The results of the wells with THN are therefore expressed as a percentage relative to the 100% control.
  • the program makes it possible to produce the curve (curve fitting) and to calculate the 50% inhibitory effects, either the cytotoxic effects on the cells (CC50), or the inhibitory concentrations of the viruses (IC50).
  • the results for the BK virus on the primary lines show that the antiviral effects increase as they progress through the viral cycle of cell infection (messenger RNA, genomic DNA, number of infected cells and viral progeny)
  • the most significant results in relation to the pathophysiology of BK virus infection relate to those obtained for viral progeny on primary lines (RPTECs).
  • the IS selectivity index is close to 30 for thionicotinamide measured on BKV virus progeny on RPTEC cells.
  • the selectivity indices are higher for the lines than for the cells of the primary lines.
  • thionicotinamide is an effective antiviral for polyomaviruses, and more particularly the BK virus (BKV) and the SV40 virus and that it can be used both as a preventive treatment but also as a curative treatment for treat infections.
  • BKV BK virus
  • the Applicant is not bound by the following explanation of the mechanism of action of 6-aminonicotinamide.
  • the Applicant believes that the antiviral action of thionicotinamide can be explained by the inhibition of the NAD + and NADP + enzymes in the cell. The main mechanism probably involves the inhibition of the pentose-phosphate pathway used by many viruses for the rapid synthesis of their nucleic acids.

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Abstract

Composition pharmaceutique contenant en tant que composé pharmaceuticalement actif du thionicotinamide pour son utilisation en tant qu'agent antiviral- produit de combinaison associé. La présente invention concerne une composition pharmaceutique contenant en tant que composé pharmaceuticalement actif du thionicotinamide pour son utilisation en tant qu'agent antiviral dans le traitement d'une infection virale, notamment d'une infection à polyomavirus, chez un sujet ayant un tel besoin.

Description

COMPOSITION PHARMACEUTIQUE ANTIVIRALE CONTENANT DU
THIONICOTINAMIDE
Domaine technique
La présente invention concerne une composition pharmaceutique qui contient en tant que composé pharmaceuticalement actif, le thionicotinamide, pour son utilisation en tant qu’agent antiviral, dans le traitement d’une infection virale, notamment d’une infection à polyomavirus. Cette composition peut être utilisée au cours des complications des infections à polyomavirus nécessitant une prise en charge médicale des patients (néphropathies, cystites hémorragiques, etc...).
Art antérieur
La plupart des individus sont infectés par les polyomavirus de manière asymptomatique dès l’enfance. Les polyomavirus restent à l’état latent ou persistant chez les sujets en bonne santé dont le système immunitaire peut contrôler l’infection. En revanche, leur réactivation chez les personnes immunodéprimées (âgées, ayant subi une transplantation, infectées par le VIH, par exemple) peut causer des maladies très graves. Ainsi, dans le cas d’une greffe rénale, le virus BK peut entraîner un rejet de la greffe, s’il se réactive chez le patient transplanté ou s’il infecte le patient transplanté via l’organe du donneur. Le BK virus peut également causer, surtout chez des patients immunodéprimés, des néphrites, une sténose urétrale ou des cystites hémorragiques. Chez les patients ayant reçu une greffe de moelle osseuse, il n’est pas rare que le virus BK provoque une cystite hémorragique.
D’autres polyomavirus engendrent des cancers ou des pathologies neurologiques. Ainsi, le virus JC qui reste latent dans le tractus urinaire, peut provoquer, lors de sa réactivation chez un sujet immunodéprimé, la leucoencéphalite multifocale progressive (LEMP). Le virus MCPyV est associé à un cancer, le carcinome à cellules de Merkel. Le virus SV 40 qui est un virus simien, a pu contaminer l’homme du fait des premières campagnes de vaccination antipoliomyélitique par le vaccin oral de type Sabin préparé à partir de culture cellulaire sur des reins de singe. Chez le singe immunodéprimé, il peut d’ailleurs causer des maladies rénales et parfois des maladies démyélinisantes semblables à la LEMP. La publication « Human polyomavirus réactivation : disease pathogenesis and treatment approaches » de De Gascun et Carr, publiée en 2013 la revue « Clinical and Developmental Immunology » éditée par Hindawi Publishing Corporation (ID 373579) passe en revue la plupart des polyomavirus connus, les pathologies qu’ils sont susceptibles d’engendrer, les sujets à risques et les antiviraux connus. Cette publication indique qu’aucun antiviral testé lors des essais cliniques n’offre un bénéfice thérapeutique suffisamment significatif. La publication précitée décrit les candidats médicaments utilisés contre les polyomavirus : certains nucléosides ou autres composés chimiques tels que la myrtazapine, la chlorpromazine, la méfloquine ou le léflunomide ont été testés comme antiviraux. Des fluoroquinolones peuvent également être utilisés comme antiviral dans le cas du virus BK. Dans le cas d’un rejet de greffe de rein causé par le BK virus, des inhibiteurs de l’enzyme mTOR ont également été testés ; leur efficacité antivirale n’est pas avérée.
La publication intitulée « 45 years after the discovery of human polyomaviruses BK and JC: Time to speed up the understanding of associated diseases and treatment approaches » de H. Barth et al. et publiée dans la revue Crit Rev Microbiol., en Mars 2017 volume 43(2), pages 178-195, indique que le Cidofovir®, un nucléoside qui inhibe la réplication du virus de l’herpès permet de réduire le réplication du virus BK dans des cellules rénales humaines. Ce nucléoside est néanmoins néphrotoxique ce qui diminue son intérêt. Un dérivé lipidique du Cidofovir®, le Brincidofovir® s’avère être moins néphrotoxique, mais ces composés ne sont pas utilisés actuellement car leur bénéfice clinique reste insuffisant.
En pratique, chez les patients greffés, sous traitement immunosuppresseur, on effectue un suivi virologique direct (détection du virus ou d’un constituant du virus) ou indirect (détection d’un anticorps ou d’un biomarqueur). Au-delà d’un certain seuil de virus détecté, la conduite à tenir est généralement une diminution ou un arrêt des traitements en cours pour la pathologie initiale traitée (greffe, sclérose en plaques, infection à VIH, etc...). Seule la diminution, la modulation ou la suspension des traitements immunosuppresseurs permet de restaurer une immunité suffisante pour contrôler les infections à polyomavirus. Cela demande au moins une semaine et se fait souvent aux dépens du traitement de la pathologie initiale (perte du greffon, etc..). Dans le cas de patients infectés par le VIH, la réactivation des polyomavirus peut-être un réel problème s’il n’est pas possible de restaurer une immunité suffisante pour stopper la propagation virale.
Problème technique à résoudre
Un but de la présente invention est donc de proposer une composition pharmaceutique qui permet de limiter ou d’empêcher la réplication/ propagation virale, notamment d’un polyomavirus, et en particulier du virus BK et/ou du virus SV 40.
Un autre but de la présente invention est de proposer une composition pharmaceutique qui permet de limiter ou d’empêcher la dissémination d’un virus dans l’organisme, notamment un polyomavirus, notamment dans le sang, dans les reins ou dans le cerveau.
Un autre but de la présente invention est de proposer une composition pharmaceutique qui limite ou empêche la propagation d’un virus, notamment d’un polyomavirus, chez un sujet immunodéprimé, notamment un patient ayant subi une greffe de rein.
Un autre objet de la présente invention est de proposer une composition pharmaceutique dont le composé pharmaceuticalement actif présente un bon index de sélectivité en tant qu’antiviral.
L'intérêt de la présente invention est aussi de proposer un traitement antiviral, notamment contre les polyomavirus, dont les effets secondaires peuvent être corrigés par l'administration de nicotinamide qui est la molécule naturelle endogène ciblée par le thionicotinamide, lequel est potentiellement un inhibiteur compétitif. Le nicotinamide peut donc être utilisé comme antidote de la composition pharmaceutique de l’invention, en cas de toxicité avérée en particulier dans le cadre de traitements multiples ou complexes comme lors de transplantations.
Un autre but de la présente invention est de proposer un produit de combinaison qui permet d’éviter l’infection et/ou la réactivation des polyomavirus, en particulier le virus BK et/ou le virus SV 40, chez les patients immunodéprimés.
Brève description de l’invention
La présente invention concerne une composition pharmaceutique contenant en tant que composé pharmaceuticalement actif le thionicotinamide pour son utilisation en tant qu’agent antiviral dans le traitement d’une infection virale, notamment d’une infection à polyomavirus, chez un sujet ayant un tel besoin.
Les Inventeurs ont en effet montré qu’une telle composition pharmaceutique s’avérait efficace pour réduire ou supprimer la réplication d’un virus dans le cas d’une primo infection et dans le cas d’une réactivation de virus. La composition de l’invention permet, soit d’éviter l’infection, lorsqu’elle est administrée à titre préventif, par exemple, avant une greffe de rein, soit d’éviter ou limiter la réactivation du virus, notamment du polyomavirus, lorsqu’elle est administrée, par exemple à titre préemptif, avant une baisse trop importante du contrôle de cette infection par le système immunitaire du sujet, celle-ci pouvant être induite par un traitement immunosuppresseur ou immunomodulateur, soit encore à titre curatif afin de limiter la propagation du virus lorsqu’elle est administrée après la primo-infection ou après la réactivation du virus.
Description détaillée
Selon un mode de réalisation de la présente invention, ledit virus est un polyomavirus, en particulier le virus BK ou le virus SV 40.
Selon un mode de réalisation particulier qui peut être combiné à n’importe quel mode de réalisation de la présente invention, la composition pharmaceutique de l’invention est contenue dans une formulation adaptée à une administration par voie orale ou dans une formulation adaptée à une administration par voie parentérale, notamment intraveineuse ou dans une formulation adaptée à une administration par voie vésicale. Dans le cas des polyomavirus qui peuvent rester latents dans les cellules rénales ou urothéliales, comme le virus BK, par exemple, une administration locale dans la vessie, par une sonde, peut permettre de traiter le foyer viral situé dans le tractus urinaire. La composition pharmaceutique de l’invention qui se trouve dans la vessie remonte les uretères du fait des mouvements d’efflux ou de reflux de l’urine et permet de traiter le foyer viral dans les reins. Selon un mode de réalisation qui peut être combiné à l’un quelconque des modes de réalisation de l’invention, la composition pharmaceutique de l’invention se présente sous une forme adaptée pour être administrée à un dosage pharmaceuticalement actif égal ou supérieur à 0,1 g/kg/jour, notamment égal à 0,2 g/kg/jour, notamment pendant une durée égale ou supérieure à 5 jours ou égale ou inférieure à 10 jours. Selon une variante, la composition pharmaceutique de l’invention se présente sous une forme adaptée à une administration par voie parentérale ou vésicale et adaptée pour être administrée à un dosage journalier pharmaceuticalement actif égal ou supérieur à 0,1 mg/kg, notamment égal à 0,2 mg/kg pendant 2, 3 ou 4 semaines ou à un dosage égal ou supérieur 0,3 mg/kg et notamment égale à 0,4 mg/kg pendant 1 ou 2 semaines.
Le sujet n’est pas limité selon l’invention. Il peut s’agir d’un sujet non infecté ou d’un sujet déjà infecté chez qui le virus, notamment le polyomavirus et notamment le virus BK est réactivé ou latent. Selon un mode de réalisation qui peut être combiné à l’un quelconque des modes de réalisation de l’invention, le sujet est un sujet immunodéprimé et notamment un sujet humain immunodéprimé à la suite d’un traitement immunosuppresseur ou immunomodulateur, notamment un traitement immunosuppresseur ou immunomodulateur qui permet d’éviter le rejet d’une greffe, notamment d’une greffe de rein.
La composition de l’invention peut comprendre en outre un excipient quelconque. L’Homme du Métier est à même de choisir un excipient, notamment un excipient tel que défini dans la 21ème édition du Remington, « the Science and practice of Pharmacy ». A titre d’exemple, la composition pharmaceutique de l’invention peut contenir, quel que soit son mode de réalisation, au moins un excipient choisi parmi l’eau, le lactose, l’amidon de maïs ou de pomme de terre, le dextrose, le sorbitol, la cellulose microcristalline, l’hydrate de phosphate de calcium dibasique, la gomme d’acacia, la gélatine, la pyrrolidone polyvinylique, le glucose, la carboxy-méthyl cellulose, la povidone iodée, le talc, l’acide stéarique, le stéarate de calcium, le stéarate de magnésium, le polyéthylène glycol, les surfactants, les huiles, les huiles hydrogénées, les huiles végétales éventuellement hydrogénées, les cires, notamment végétales, la silice colloïdale, les argiles, la cellulose, l’amidon modifié, les copolymères, le gel de silice, le charbon actif, l’hydroxypropylméthyl cellulose, la zéine, les polysaccharides, le propylène glycol, les solvants aqueux, notamment l’eau, les alcools, l’acide acétique, l’acétone, les acétates d’éthyle, l’éthanol, l’acide citrique, le DMSO, l’alcool benzylique, le butyl-parabène, le phénol, l’acide ascorbique, le bisulfate de sodium, les tocophérols, la lécithine de soja, l’EDTA, l’acide tartrique, les alginates de sodium. En particulier, la composition de l’invention peut comprendre du DMSO en tant qu’excipient et se présenter sous forme liquide. La solubilité du THN dans cet excipient est telle que les doses requises permettent une dissolution à de faibles concentrations non toxiques de DMSO (<1%o).
Selon un autre mode de réalisation, la composition pharmaceutique de l’invention se présente sous la forme d’une gélule ou d’un comprimé à effet retard et notamment en ce qu’elle contient en tant qu’excipient au moins une huile hydrogénée et du polyéthylène glycol. Elle peut également, dans ce mode de réalisation, contenir du DMSO dans un mélange d’excipients ou du DMSO seul en tant qu’excipient.
Selon un mode de réalisation qui peut être combiné à l’un quelconque des modes de réalisation de l’invention, la composition pharmaceutique de l’invention contient une quantité thérapeutiquement active de thionicotinamide et notamment une quantité thérapeutique sensiblement égale ou supérieure à 2 g, notamment sensiblement égale à 3 g ou 4 g et sensiblement égale ou inférieure à 6 grammes.
Selon un mode particulier de réalisation qui peut être combiné à l’une quelconque des modes de réalisation précités, la composition pharmaceutique de l’invention est apte à être administrée à titre préventif avant la primo infection ou avant la réactivation dudit polyomavirus. Ceci, dans les deux cas, en particulier, dans le cas d’un patient qui va subir une greffe de rein.
Selon un mode particulier de réalisation qui peut être combiné à l’une quelconque des modes de réalisation précités, la composition pharmaceutique de l’invention est apte à être administrée à titre préemptif au cours de la réactivation dudit polyomavirus avant l’apparition des signes cliniques.
Selon un autre mode de réalisation, apte à être combiné avec l’un quelconque des modes de réalisation précités, la composition de l’invention est administrée à titre curatif après la primo-infection ou après la réactivation dudit polyomavirus.
La présente invention concerne également un produit de combinaison comprenant une composition pharmaceutique selon l’un quelconque des modes de réalisation précités et au moins un agent immunosuppresseur choisi parmi les anti inflammatoires stéroïdiens, les inhibiteurs de la calcineurine, notamment la cyclosporine ou le tacrolimus, les inhibiteurs de la multiplication cellulaire, notamment 1’azathioprine, le mycophénolate mofétil, les inhibiteurs de la protéine mTOR, tel que l’Evérolimus® notamment et les agents bloquant le deuxième signal, notamment le LEA29Y®, pour leur utilisation simultanée différée ou séquencée dans le temps. Selon l’invention, la composition de l’invention peut être séparée de l’agent ou des agents immunosuppresseurs ou être mélangée avec ce/ces dernier(s).
La présente invention concerne également une méthode de traitement thérapeutique selon laquelle on administre à un patient infecté par un polyomavirus, notamment le virus BK et/ou le virus SV40 une quantité/dose thérapeutique d’une composition pharmaceutique contenant en tant qu’agent actif du thionicotinamide.
La composition peut être administrée par voie vésicale, par voie parentérale ou par voie orale.
Le patient/sujet peut être un patient tel que défini précédemment.
Les informations précitées relatives à la composition de l’invention ou à son mode d’administration, s’appliquent à la méthode thérapeutique précitée. La méthode peut être à but curatif ou préventif.
Définitions
Le terme « polyomavirus » désigne un polyomavirus pouvant infecter un mammifère. Il peut être choisi parmi les polyomavirus humains ou susceptibles d’être pathogènes chez l’Humain, tels que par exemple, le virus BK, le virus SV40 ou le virus JC (JCPyV).
Le terme « sujet immunodéprimé » désigne un sujet présentant au moins un des critères définis ci-dessous :
- une insuffisance en immunoglobulines, notamment en immunoglobulines G, A, D, M et E ;
- une insuffisance en lymphocytes T et/ou en lymphocytes B ;
- une insuffisance des cellules intervenant dans l'élimination des particules antigèniques étrangères insuffisante, notamment une quantité insuffisante de macrophages et/ou polynucléaires et/ou neutrophiles et/ou cellules dendritiques ;
- un déficit de la phagocytose ; et
- une déficience du système du complément. Le sujet peut être un mammifère, notamment un humain. Il peut s’agir d’un patient immunodéprimé du fait de la prise de médicament immunodépresseur ou immunomodulateur (par exemple, du fait de la prise d’un médicament antirejet, notamment dans le cas des greffes, notamment de rein).
Le terme “traitement” englobe à la fois le traitement prophylactique (ou préventif) qui vise à éviter une primo infection ou une réactivation et le traitement préemptif ou thérapeutique qui vise à limiter la propagation du virus lors d’une primo infection ou la réactivation du virus chez un sujet déjà infecté.
Le « traitement préemptif » a pour but de traiter précocement tout patient suspect de développer une infection clinique symptomatique à partir de marqueurs biologiques ou d’examens complémentaires (imagerie, etc...) dans une population particulièrement à risque de développer ou de réactiver une infection asymptomatique au départ qui évoluera au-delà d'un certain seuil vers une pathologie clinique symptomatique grave. On peut citer comme exemple une élévation d’un marqueur d’un agent infectieux chez un patient asymptomatique au-delà d’un seuil qui indique une forte probabilité de développer une pathologie clinique et ses complications. Dans le cas présent, il s’agit de l’élévation du taux urinaire ou sanguin de copies génomiques de BK virus au-delà du seuil où l’infection devient symptomatique à type de néphropathies ou de cystites hémorragiques.
Les termes « limiter la propagation d’un virus » signifient qu’au moins in vitro la réplication du virus est ralentie ou réduite durant une durée donnée, voire stoppée. Chez le patient cela peut (mais pas nécessairement) se traduire par le fait que la concentration du virus concerné dans l’urine du patient après traitement avec la composition de l’invention reste inférieure à la virurie seuil pour laquelle on voit apparaître des symptômes dus directement ou non à l’infection, notamment chez un patient immunodéprimé, et notamment dans le cadre du traitement de la pathologie initiale, laquelle engendre l’immunodépression, et/ou que la virémie (concentration de particules virales dans le sang) est inférieure à la virémie seuil pour laquelle on voit apparaître des symptômes, notamment chez un patient immunodéprimé, notamment dans le cas du traitement de la pathologie initiale, laquelle engendre l’immunodépression. Les valeurs seuil peuvent être déjà définies par des consensus cliniques ayant permis de définir des algorithmes décisionnels pour le traitement des patients. A titre d’exemple, pour le BK virus, les problèmes cliniques au cours de la transplantation rénale ne surviennent que lorsque la virurie dépasse 107/ml_ ou la virémie 104/ml_ exprimées en nombre de copies génomiques par millilitre.
Le terme CC50 (Concentration Cytotoxique 50%) désigne la concentration dite cytotoxique du composé testé pharmaceuticalement actif pour laquelle on obtient 50% d’inhibition de la viabilité cellulaire au bout d’une durée donnée ;
Le terme IC50 (Concentration Inhibitrice 50%), désigne la concentration du composé pharmaceuticalement actif testé pour laquelle on obtient une baisse de la population virale de 50% dans des conditions expérimentales données
L’index de sélectivité ISso désigne le rapport CC50/IC50 ; plus l’indice de sélectivité est élevé, plus la marge thérapeutique est grande, c’est-à-dire que les concentrations thérapeutiquement efficaces sont d’autant plus faibles que les concentrations cytotoxiques sont élevés.
Le terme « MOI »= multiplicité d'infection, définit le ratio du nombre de particules virales infectieuses sur le nombre total de cellules dans le même volume utilisé pour le test.
Le titre infectieux définit le nombre de virus infectieux dans un volume donné. Il est mesuré ici en FFU/mL (Focus Forming Unit/mL), c'est à dire en Unités Formant Foyers correspondant donc initialement à une particule virale infectieuse par millilitre.
Les termes « pharmaceuticalement actif » et « quantité thérapeutique » indiquent que le composé induit une amélioration mesurable, immédiate ou retardée, transitoire ou définitive, de l’état de santé ou du bien-être d’un sujet, notamment lorsqu’il se trouve administré en quantité thérapeutique adapté.
L’abréviation THN » désigne dans la présente demande le thionicotinamide. Le thionicotinamide est également dénommé pyridine-3-carbothioamide.
Le terme « tacrolimus » désigne le 3S-[3R*[E(1 S*,3S*,4S*)], 4S*,5R*,8S*,9E,12R*,14R*, 15S*,16R*,18S*,19S*,26aR*]] -5,6,8, 11 ,12,13,14,15,16, 17,18,19,24,25,26,26 a-hexadecahydro-5, 19-dihydroxy-3-[2-(4-hydroxy-3- methoxycyclohexyl)-1 -methylethenyl]-14,16-dimethoxy-4,10,12,18-tetramethyl-8-(2- propenyl)-15,19-epoxy-3H-pyrido[2,1 -c] [1 ,4] oxaazacyclotricosine-
1 ,7,20,21 (4H,23H)-tetrone, monohydrate. Le terme « azathioprine » désigne le 6-[(1 -méthyl-4-nitro-4,5-dihydro-1 H-imidazol-5- yl)sulfanyl]-7H-purine.
Le terme « mycophenolate mofétil » désigne la molécule de formule brute C23H31 N07 commercialisée sous le nom de Cellcept®.
Le terme «Evérolimus®» désigne le 2-0-(2-hydroxyethyl)rapamycin le terme « LEA29Y » correspond à la molécule commercialisée sous le nom de Belatacept®.
Le terme « progénie » correspond à la quantité de virus infectieux libérés dans le surnageant après 72h de culture.
FIGURES
Les Fig 1 A et B représentent la cytotoxicité.du thionicotinamide sur les cellules rénales épithéliales primaires humaines (RPTEC) à 72 h ;
La Fig. 1 A représente la cytoxicité précitée par la mesure de ATR intracellulaire (Cell Titer Glo 2.0 Promega). (En ordonnée, l’effet cytotoxique est normalisé en pourcentage par rapport au contrôle. En abscisse, les concentrations testées sont de 1 250, 2 500, 5 000, 10 000 et 20 000 nM placées sur une échelle logarithmique.)
La Fig. 1 B représente la toxicité précitée par la mesure de la réduction de la résazurine (Cell Titer Blue Promega). En ordonnée, l’effet cytotoxique est normalisé en pourcentage par rapport au contrôle sans THN. En abscisse, les concentrations testées sont de 1 250, 2 500, 5 000, 10 000 et 20 000 nM placées sur une échelle logarithmique.
Les Fig. 2A et 2B représentent la cytotoxicité du thionicotinamide sur les cellules Vero à 72 h
La Fig. 2A représente la toxicité précitée par la mesure de ATR intracellulaire. En ordonnée, l’effet est normalisé en pourcentage par rapport au contrôle sans THN. En abscisse, les concentrations testées sont de 8, 80, 8 000, et 80 000 nM placées sur une échelle logarithmique.
La Fig. 2B représente la toxicité précitée par la mesure de la réduction de la résazurine. En ordonnée, l’effet est normalisé en pourcentage par rapport au contrôle sans THN. En abscisse, les concentrations testées sont de 8, 80, 8 000, et 80 000 nM placées sur une échelle logarithmique. Les Fig. 3A et 3B représentent la cytotoxicité du thionicotinamide sur les cellules CV1 à 72 h:
La Fig. 3A représente la cytotoxicité précitée par la mesure de ATR intracellulaire. En ordonnée, l’effet est normalisé en pourcentage par rapport au contrôle sans TFIN. En abscisse, les concentrations testées sont de 8, 80, 8 000, et 80 000 nM placées sur une échelle logarithmique.
La Fig. 3B représente la cytotoxicité précitée par la mesure de la réduction de la résazurine. En ordonnée, l’effet est normalisé en pourcentage par rapport au contrôle sans THN. En abscisse, les concentrations testées sont de 8, 80, 8 000, et 80 000 nM placées sur une échelle logarithmique.
Les Fig. 4A, 4B et 4C représentent l’effet inhibiteur du thionicotinamide après 72 h d’infection des cellules RPTEC:
La Fig. 4A représente l’effet inhibiteur sur l’expression de l’ARN messager de l’antigène T du BK virus mesuré par qRT-PCR. La mesure est normalisée par rapport à l’expression d’un gène cellulaire (GAPDH). En ordonnée, l’effet est normalisé en pourcentage par rapport au contrôle sans THN. En abscisse, les concentrations testées sont de 1 250, 2 500, 5 000, 10 000 et 20 000 nM placées sur une échelle logarithmique.
La Fig. 4B représente l’effet inhibiteur sur la quantité d’ADN extracellulaire du BK virus mesuré par qPCR. En ordonnée, l’effet est normalisé en pourcentage par rapport au contrôle sans THN. En abscisse, les concentrations testées sont de 1 250, 2 500, 5 000, 10 000 et 20 000 nM placées sur une échelle logarithmique.
La Fig. 4C représente l’effet inhibiteur sur le pourcentage de cellules RPTEC infectées par le BK virus mesuré par immunofluorescence de l’Antigène viral T (T Ag) à 72 h. En ordonnée, l’effet est normalisé en pourcentage par rapport au contrôle sans THN. En abscisse, les concentrations testées sont de 1 250, 2 500, 5 000, 10 000 et 20 000 nM placées sur une échelle logarithmique.
La Fig. 5 représente l’effet inhibiteur du thionicotinamide sur le pourcentage de cellules Vero infectées par le BK virus mesuré par immunofluorescence de l’Antigène viral T (T Ag) à 72 h. En ordonnée, l’effet est normalisé en pourcentage par rapport au contrôle sans THN. En abscisse, les concentrations testées sont de 8, 80, 8 000, et 80 000 nM placées sur une échelle logarithmique.
La Fig. 6 représente l’effet inhibiteur du thionicotinamide sur le pourcentage de cellules CV1 infectées par le virus SV40 mesuré par immunofluorescence de l’Antigène viral T (T Ag) à 72 h. En ordonnée, l’effet est normalisé en pourcentage par rapport au contrôle sans THN. En abscisse, les concentrations testées sont de 8, 80, 8 000, et 80 000 nM placées sur une échelle logarithmique.
La Fig. 7 représente l’effet antiviral du thionicotinamide sur la progénie extracellulaire du BK virus après 72 h d’infection des cellules RPTEC. En ordonnée, l’effet est normalisé en pourcentage par rapport au contrôle sans THN. En abscisse, les concentrations testées sont de 8, 80, 8 000, et 80 000 nM placées sur une échelle logarithmique.
La Fig. 8 représente l’effet antiviral du thionicotinamide sur la progénie extracellulaire du BK virus après 72h d’infection des cellules Vero . En ordonnée, l’effet est normalisé en pourcentage par rapport au contrôle sans THN. En abscisse, les concentrations testées sont de 8, 80, 8 000, et 80 000 nM placées sur une échelle logarithmique.
La Fig. 9 représente l’effet antiviral du thionicotinamide sur la progénie extracellulaire du virus SV40 après 72 h d’infection des cellules CV1. En ordonnée, l’effet est normalisé en pourcentage par rapport au contrôle sans THN. En abscisse, les concentrations testées sont de 8, 80, 8 000, et 80 000 nM placées sur une échelle logarithmique.
EXEMPLES
Etude de la cytotoxicité du thionicotinamide sur les cellules hRPTECs, les cellules VERO et sur les cellules CV1 -Clone 1 (cellules de reins de Cercopithecus aethiops ou singe vert africain).
1.1. Cultures cellulaires
Cellules : lignées Vero et CV1 , et cellules primaires (RPTEC)
Les cellules primaires et les lignées cellulaires utilisées ont été cultivées selon les recommandations des fournisseurs et correspondent à celles utilisées dans la littérature scientifique. Les cellules Vero et les cellules CV1 sont des cellules rénales épithéliales simiennes cultivées selon les recommandations de l'ATCC en milieu DMEM (Gibco, Thermofisher Scientific, France) additionné de 10% de sérum de veau foetal.
Les cellules tubulaires proximales épithéliales rénales humaines primaires (RPTECs Sciencell, Clinisciences, France) ont été cultivées en milieu de croissance pour les cellules épithéliales rénales (REGM Bulletkit chez Lonza, France) supplémenté par 0,1% d'EGF recombinant (épithélial growth factor), 0,1% d'hydrocortisone, 0,1% d'épinéphrine, 0,1% d'insuline, 0,1% de triodothyronine, 0,1% de transferrine, 0,1% de GA-100 (amphotéricine B et gentamycine) et 0,5% de sérum de veau foetal. Les cellules sont cultivées à 37°C dans un incubateur à 5% de CO2 selon les recommandations du fournisseur.
Virus : Polyomavirus BK et SV40
Deux polyomavirus ont été utilisés , le virus humain BK qui cause des pathologies rénales chez l'homme et le virus simien SV40 comme prototype des polyomavirus.
La souche Dunlop du virus BK a été produite à partir du plasmide pUC19pBKv(34-2) sous la référence 45025 à l'ATCC. Le plasmide est amplifié après transformation de bactéries Escherichia Coli HB101 compétentes (Invitrogen) cultivées à 37°C en milieu LB avec 50 pg/mL d'ampicilline. Les plasmides produits sont purifiés et linéarisés par digestion enzymatique avec l'enzyme de restriction BamHI avant d'être utilisé pour transfecter les cellules Vero permissives au BK virus. Les cellules Vero infectées sont conservées et passées jusqu'à apparition d'un effet cytopathique. Les cellules sont alors congelées et décongelées 3 fois pour obtenir la lyse cellulaire et libérer le virus qui peut être purifié par ultracentrifugation.
Le stock viral est titré par dilution sérielle de raison 10 (10 1 à 108) sur les cellules Vero réparties 24 h avant dans des plaques à 96 puits puis incubées à 37°C. Les cellules infectées sont révélées par immunofluorescence de l'Antigène T du virus après trois jours de culture. Le titre est exprimé en unités formant foyers ou FFU/mL.
La souche 777 du virus SV40 fournie par le Pr Andréas Sauerbrei a été cultivée sur les cellules CV1. Les stocks ont été produits après apparition de l'effet cytopathique et les titrages effectués de la même façon que le virus BK comme décrit ci-dessus.
Pour les essais, les infections ont été faites à une multiplicité d'infection de 1 (MOI=1 ). Chaque expérimentation a été réalisée au moins en triple pour calculer la moyenne et les écarts-type qui sont reportés dans les courbes réalisées à l'aide du logiciel GraphPad Prism 8.0 (San Diego, Californie).
Le thionicotinamide ou pyridine-3-carbothioamide utilisé est le suivant : Ref EN300- 17569 chez Enamine, commandé par l'intermédiaire de Sigma-Aldrich. Le thionicotinamide a déjà été décrit comme un antimétabolite inhibiteur des dérivés de la Vitamine B3.
Il a été solubilisé à 100 mM dans du diméthylsulfoxide (DMSO Ref D2650 Sigma- Aldrich) et dilués pour faire des gammes de concentration dans les milieux de culture utilisés respectivement pour chaque type cellulaire. Les gammes sont préparées extemporanément avant chaque expérimentation.
1 .2. Essais de Cytotoxicité du thionicotinamide
Les essais de cytotoxicité ont été réalisé en triple (triplicate) sur des microplaques de culture cellulaire incubées pendant 3 jours en incubateur à CO2 dans les mêmes conditions que les tests utilisés pour évaluer les effets antiviraux.
Deux essais classiques de la société Promega (France) ont été utilisés selon leurs recommandations :
Le premier test (CelITiter-GIo 2.0 Assay Ref. G9241 ) mesure la quantité d'ATP par bioluminescence pour tester les cellules métaboliquement actives. Brièvement, le réactif CelITiter Glo est ajouté à chaque puits testé en conservant le milieu et la plaque agitée 2 minutes sur un agitateur orbital pour induire la lyse cellulaire. La plaque est ensuite incubée à température ambiante pendant 10 minutes pour stabiliser le signal qui est finalement lu sur un luminomètre pour microplaque 96 puits (Berthold).
Le deuxième test (CelITiter-Blue cell Viability Assay) utilise un colorant redox, c'est à dire la coloration d'un composé induite par la capacité réductrice des cellules. Il s'agit de la résazurine qui est donc réduite en résofurine et qui peut être mesurée en fluorimétrie (Fluorimètre Promega).
Brièvement, le réactif CelITiter-Blue est ajouté à chaque puits. La microplaque est agitée pendant 10 secondes sur un agitateur orbital puis incubée 3h dans un incubateur à 5% CO2 à 37°C. La réduction du colorant est alors mesurée sur le fluorimètre pour microplaque avec un longueur d'onde d'excitation à 560 nm et d'émission à 590 nm.
Les figures 1 à 3 présentent les résultats obtenus sur les différentes lignées cellulaires.
Pour les essais de cytotoxicité, on constate que les lignées cellulaires sont plus robustes que les cellules primaires. Les résultats diffèrent mais sont comparables avec les deux tests utilisés. Le thionicotinamide a été déjà rapporté dans la littérature comme moins toxique que d'autres dérivés du nicotinamide tel que le 6- aminonicotinamide, par exemple. Cette toxicité plus faible est très nette surtout pour les lignées cellulaires. En effet, la toxicité du 6-aminonicotinamide est de l’ordre de 18,7 mM sur les cellules RPTEC (avec les deux méthodes de mesure), de l’ordre de 31 mM sur les cellules Vero (avec les deux méthodes de mesure) et de l’ordre de 50 mM sur les cellules CV1 (avec les deux méthodes de mesure).
2. Essais des effets antiviraux du thionicotinamide
Les cellules sont réparties ("platées") dans des microplaques de culture cellulaire à 96 puits à des densités entre 10 000 et 20 000 cellules par puits permettant d'obtenir une confluence au cinquième jour de culture à 37°C en incubateur à 5% de CO2. Après 24 h de plating, les surnageants de culture sont retirés, et les infections virales sont réalisées pendant 2 h à une MOI=1 après le plating. Après ces 2 h, les inoculums sont éliminés par pipetage, et les cellules sont cultivées avec leurs milieux respectifs avec ou sans THN pendant 3 jours.
Des puits de contrôle des cellules cultivées respectivement sans THN, sans virus, et sans THN ni virus sont effectués pour chaque expérimentation. Le niveau d'infection et son inhibition sont évalués par des marqueurs spécifiques du virus concerné : Antigène T, ADN viral et ARN messager viral, progénie virale.
Les marqueurs les plus utilisés ont été le nombre de cellules infectées par immunofluorescence de l'antigène T du virus et la progénie virale dans le surnageant après 3 jours correspondant à un cycle cellulaire complet du virus. Pour le BK virus nous avons également évalué l'ADN viral extracellulaire dans les surnageants, l'ARN messager de l'antigène T. L'évaluation de ces marqueurs est décrite ci-après.
Les résultats sont présentés sur les figures 4 à 6.
2.1 . Quantification de l'ADN extracellulaire du BK virus Les surnageant des cellules infectées sont récupérés après les trois jours de culture et clarifiés par centrifugation pendant 15 minutes à 1500 tours/minutes, puis stockés à 4°C avant de réaliser la PCR quantitative en temps réel (qPCR Taqman, Applied Biossystems, France). Nous avons utilisé des amorces et une sonde ciblant une région conservée des gènes VP1 et VP2 dans le génome du BK virus. Les réactions sont effectuées sous un volume total de 25 pL contenant le Master Mix universel Applied 2x, 10mM de chaque amorce et de la sonde marquée à la 6- carboxyfluorescéine (FAM) et enfin 5 pL de surnageant des cellules.
L'amplification est réalisée dans un appareil ABI prism 7900 HT (Applied Biosystems) suivant le programme : 2 minutes à 50°C suivi par un cycle à 95°C pendant 10 minutes, et 45 cycles à deux temps 15 secondes à 95°C et une minute à 60°C.
La quantification est faite à l'aide d'une gamme de calibration à 4 points contenant des concentrations connues de plasmide pUC19pBKv(34-2) contenant le génome du BK virus (9 000000 à 9 000 copies/mL en dilutions de raison 10 ). Les quantifications sont réalisées en triplicate et un contrôle négatif est ajouté à chaque série.
2.2. Quantification par qRT-PCR de l'ARN messager intracellulaire de l'Antigène T du BK virus
Les ARN totaux intracellulaires ont été extraits à l’aide du kit RNeasy® Mini Kit (Qiagen™) sur l’extracteur QIAcube (Qiagen™) à partir du protocole du fabricant en présence de DNAse. La concentration des ARN extraits a été évaluée sur le spectrophotomètre Nanodrop ND 1000. Les cDNA ont été synthétisés à partir des ARN extraits par transcription inverse avec le High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems™) selon les recommandations du fabricant.
La qPCR du cDNA correspondant à l'Antigène T a été réalisée sous un volume total de 25 pL contenant le Master Mix universel Applied 2x,10 mM de chaque amorce et de la sonde marquée à la 6-carboxyfluorescéine (FAM) et enfin 2 pL de cDNA. L’amplification par PCR a été effectuée sur ABI PRISM 7900 HT Sequence Détection System (Applied Biosystems™) selon les recommandations du fabricant. La quantification a été réalisée par la méthode des AACt II s’agit d’une quantification relative par comparaison des Ct (Cycle threshold) obtenus par rapport à l'expression du gène cellulaire de ménage de la b-Actine. Cette formule permet de normaliser l’expression génique d’une série à l’autre. 2.3. Immunofluorescence indirecte de l'Antigène T des polyomavirus
Les cellules sont lavées trois fois avec du tampon phosphate isotonique à PH 7,4 (PBS) dans les puits des microplaques après trois jours de culture.
Elles sont ensuite fixées par du paraformaldéhyde à 3,7% dans du PBS et perméabilisées à température ambiante (TA) pendant 15 minutes avec du Triton X100 à 0,5% dans du tampon CSK filtré (cytoskeletal buffer; 10 mM PIPES pH 6,8, 100 mM NaCI, 300 mM sucrose , 3 mM MgCl2, 1 mM EDTA) à part égale avec de l'eau (H2O 1 :1 ).
Les cellules fixées sont ensuite lavées avec du PBS puis incubées avec l'anticorps monoclonal primaire pendant 1 h à TA, lavées à nouveau, puis incubées avec l'anticorps secondaire 30 minutes à l'abri de la lumière. Les deux anticorps sont dilués dans du PBS Tween 20 à 0,1%.
L'anticorps primaire est un monoclonal de souris anti-SV40 TAg dilué au 1/500ème [PAb416] (Abcam, France). Noter que cet anticorps révèle aussi bien l'antgène T du virus SV40 que l'antigène T du virus BK. L'anticorps secondaire est un anticorps polyclonal de chèvre anti-IgG de souris conjugué avec de l'Alexa Fluor Plus 488 dilué au 1/1000ème (ThermoFisher Scientific, France).
Pour faciliter le comptage des cellules, les noyaux sont colorés par du DAPI au 1/1000ème pendant cinq minutes dans les puits qui sont ensuite lavés trois fois par du PBS. Le nombre de cellules infectées et le nombre de cellules totales sont comptés en immunofluorescence sur un microscope inversé à faible grossissement x10 (Axio Vert.AI Zeiss avec une source LED Colibri 7, France).
3. Evaluation de la progénie infectieuse extracellulaire des virus BK et SV40
La progénie correspond ici à la quantité de virus infectieux libérés dans le surnageant après 72h de culture avec ou sans THN. Les surnageants sont clarifiés par centrifugation 15 minutes à 1500 t/mn puis stockés à 4°C. Un volume de 100 microlitres est prélevé pour infecter des puits de culture de cellules Vero (pour le BK virus) ou CV1 (pour le SV40). Le surnageant est éliminé après 2h de contact à 37°C en incubateur à 5% C02 avec les cellules et remplacé par du milieu de culture. Après 3 jours dans ces conditions, les foyers infectieux sont dénombrés dans chaque puits par immunofluorescence indirecte selon la technique décrite ci-dessus (5.1 ) Les résultats sont présentés sur les figures 7 à 9.
4. Calculs statistiques, concentrations 50% et index de sélectivité.
Les moyennes des résultats et leurs écarts-type sont calculés à l'aide du logiciel GraphPad Prism 8 selon les recommandations d'analyse données pour l'étude pharmacologique in vitro de l'effet inhibiteur du composé testé sur la croissance cellulaire ou le titre des marqueurs viraux.
Les concentrations sont transformées en logarithme de base 10 et les résultats des essais sont normalisés à 100% pour les puits contrôle sans composé testé (ici, le THN) (témoin 100%). Les résultats des puits avec THN sont donc exprimés en pourcentage par rapport au témoin 100%.
Le programme permet de réaliser la courbe (curve fitting) et de calculer les effets inhibiteurs 50%, soit les effets cytotoxiques sur les cellules (CC50), soit les concentrations inhibitrices des virus (IC50).
L'index de sélectivité est ensuite estimé par le rapport CC50/IC50 . Il augmente (»1) quand le composé testé a un effet antiviral 50% à une dose d'autant plus faible que l'effet cytotoxique 50% se manifeste à une dose d'autant plus forte.
Les résultats pour le BK virus sur les lignées primaires montrent que les effets antiviraux augmentent en progressant dans le cycle viral de l'infection cellulaire (ARN messager, ADN génomique, Nombre de cellules infectées et progénie virale) Les résultats les plus significatifs en rapport avec la physiopathologie de l'infection à BK virus concernent ceux obtenus pour la progénie virale sur les lignées primaires (RPTECs).
L’index de sélectivité IS est proche de 30 pour le thionicotinamide mesuré sur la progénie du virus BKV sur les cellules RPTEC. Les index de sélectivité sont plus élevés pour les lignées que pour les cellules des lignées primaires.
Le Tableau I ci-dessous-reprend l’ensemble des résultats obtenus. Tableau 1
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000020_0002
Figure imgf000020_0003
Dans le tableau ci-dessus cc ATP et cc résazurine font référence à la cytotoxicité du THN sur le type de cellule indiqué dans le tableau à gauche. L’ensemble des résultats suggère donc que le thionicotinamide est un antiviral efficace pour les polyomavirus, et plus particulièrement le BK virus (BKV) et le virus SV40 et qu’il peut être utilisé à la fois comme traitement préventif mais également comme traitement curatif pour traiter les infections. La Demanderesse n’est pas liée à l’explication qui suit du mécanisme d’action du 6- aminonicotinamide. Cependant, la Demanderesse estime que l’action antivirale du thionicotinamide peut être expliquée par l’inhibition des enzymes à NAD+ et à NADP+ dans la cellule. Le mécanisme principal passe vraisemblablement par l’inhibition de la voie des pentoses-phosphates utilisée par de nombreux virus pour la synthèse rapide de leurs acides nucléiques.

Claims

Revendications
1 . Composition pharmaceutique contenant en tant que composé pharmaceuticalement actif du thionicotinamide pour son utilisation en tant qu’agent antiviral dans le traitement d’une infection virale, notamment d’une infection à polyomavirus, chez un sujet ayant un tel besoin.
2. Composition pharmaceutique selon la revendication 1 , caractérisé en ce que ledit virus est un polyomavirus choisi parmi le virus BK le virus SV 40 et le virus JC.
3. Composition pharmaceutique selon l’une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu’elle est contenue dans une formulation adaptée à une administration par voie orale ou dans une formulation adaptée à une administration par voie parentérale, notamment intraveineuse ou dans une formulation adaptée à une administration par voie vésicale
4. Composition pharmaceutique selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu’elle est adaptée pour une administration à un dosage pharmaceuticalement actif égal ou supérieur à 0,1 g/kg/jour, notamment égal à 0,2 g/kg/jour, notamment pendant une durée égale ou supérieure à 5 jours ou égale ou inférieure à 10 jours.
5. Composition pharmaceutique selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu’elle comprend, en outre, au moins un excipient choisi parmi l’eau, le lactose, l’amidon de maïs ou de pomme de terre, le dextrose, le sorbitol, la cellulose microcristalline, l’hydrate de phosphate de calcium dibasique, la gomme d’acacia, la gélatine, la pyrrolidone polyvinylique, le glucose, la carboxy-méthyl cellulose, la povidone iodée, le talc, l’acide stéarique, le stéarate de calcium, le stéarate de magnésium, le polyéthylène glycol, les surfactants, les huiles, les huiles hydrogénées, les huiles végétales, les huiles végétales hydrogénées, les cires, notamment végétales, la silice colloïdale, les argiles, la cellulose, l’amidon modifié, les copolymères, le gel de silice, le charbon actif, l’hydroxypropylméthyl cellulose, la zéine, les polysaccharides, le propylène glycol, les solvants aqueux, notamment l’eau, les alcools, l’acide acétique, le DMSO, l’acétone, les acétates d’éthyle, l’éthanol, l’acide citrique, l’alcool benzylique, le butyl-parabène, le phénol, l’acide ascorbique, le bisulfate de sodium, les tocophérols, la lécithine de soja, l’EDTA, l’acide tartrique, les alginates de sodium.
6. Composition pharmaceutique selon la revendication 5, caractérisée en ce qu’elle se présente sous la forme d’une gélule ou d’un comprimé à effet retard et notamment en ce qu’elle contient en tant qu’excipient une huile hydrogénée et du polyéthylène glycol.
7. Composition pharmaceutique selon l’une des revendications 6 et 7, caractérisée en ce qu’elle contient une quantité thérapeutiquement active de thionicotinamide et notamment une quantité thérapeutiquement active sensiblement égale ou supérieure à 2 g, notamment sensiblement égale à 3 g ou 4 g et sensiblement égale ou inférieure à 6 grammes.
8. Composition pharmaceutique selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu’elle est administrée à titre préventif avant la primo infection ou avant la réactivation dudit polyomavirus.
9. Composition pharmaceutique selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu’elle est administrée à titre curatif après primo infection ou après la réactivation dudit polyomavirus.
10. Produit de combinaison comprenant une composition selon l’une quelconque des revendications précédentes et au moins un agent immunosuppresseur choisi parmi les anti-inflammatoires stéroïdiens, les inhibiteurs de la calcineurine, notamment la cyclosporine ou le tacrolimus®, les inhibiteurs de la multiplication cellulaire, notamment l’azathioprine, le mycophénolate mofétil, les inhibiteurs de la protéine mTOR, notamment l’Evérolimus® et les agents bloquant le deuxième signal, notamment le LEA29Y®.
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