WO2020209280A1

WO2020209280A1 - 再生毛包原基の製造に使用するための上皮由来細胞

Info

Publication number: WO2020209280A1
Application number: PCT/JP2020/015788
Authority: WO
Inventors: 孝辻; 真武尾; 尚一岡本; 美帆小川; 悠森; 恭介岸本
Original assignee: Kyocera Corp; Organ Technologies Inc; RIKEN
Current assignee: Kyocera Corp; Organ Technologies Inc; RIKEN
Priority date: 2019-04-12
Filing date: 2020-04-08
Publication date: 2020-10-15
Anticipated expiration: 2021-10-12
Also published as: JP2025175203A; JPWO2020209280A1

Abstract

【課題】　再生毛包原基の製造に使用することができる新規の上皮由来細胞を提供すること。【解決手段】　検出可能なレベルのインテグリンβ５（Ｉｔｇｂ５）を発現する上皮由来細胞、前記細胞を含む細胞集団、および前記細胞集団を用いた再生毛包原基の製造方法が提供される。

Description

再生毛包原基の製造に使用するための上皮由来細胞

　本発明は、再生毛包原基の製造に使用することが可能な上皮由来細胞に関する。

　毛髪再生医療の実現のためには、毛包原基を再構成するために必要となる毛包誘導能を有する上皮由来幹細胞および間葉系幹細胞の取得、ならびにその生体外増殖が必要である。間葉系幹細胞については、毛乳頭より取得可能である毛乳頭細胞が、毛包誘導能を有していることが知られており、生体外での培養により取得可能であることが示されている（非特許文献１）。

　一方、上皮由来幹細胞については、腸管上皮組織からのＬｇｒ５（Ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ　ｒｅａｐｅａｔ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５）陽性幹細胞の培養技術が確立されており、培養後のＬｇｒ５陽性幹細胞から腸管絨毛を再生可能であることが示されている（非特許文献２）。

　毛包においては、バルジ領域に毛包誘導能を有する幹細胞の存在が示唆されており（非特許文献３）、生体外増殖については、マウス毛包由来細胞の三次元培養による細胞表面マーカーＣＤ３４（ＣＤ３４　ａｎｔｉｇｅｎ）陽性、ＣＤ４９ｆ（インテグリンα６）陽性幹細胞の増殖方法の報告（非特許文献４）があるが、その器官再生能は十分に立証されていない。

Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇ．１３，９７５－８２，２００７Ｎａｔｕｒｅ　４５９，　２６２－５，　２００９Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．３１６，１４２２－８，２０１０ＥＭＢＯ　Ｊ．　３６，　１５１－６４，　２０１７

　本発明は、再生毛包原基の製造に使用することができる新規の上皮由来細胞を提供することを目的とする。

　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、検出可能なレベルのインテグリンβ５（Ｉｔｇｂ５）を発現する上皮由来細胞の集団が、持続的な発毛を可能にする再生毛包原基を誘導できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

　すなわち、本発明は、以下の特徴を包含する：
　［１］　上皮由来細胞であって、
　検出可能なレベルのインテグリンβ５（Ｉｔｇｂ５）を発現する、
ことを特徴とする、
上皮由来細胞。

　［２］　［１］に記載の上皮由来細胞であって、
　検出可能なレベルの細胞表面マーカーＣＤ３４および／またはＣＤ４９ｆをさらに発現する、
ことを特徴とする、
上皮由来細胞。

　［３］　［１］または［２］に記載の上皮由来細胞であって、
　検出可能なレベルの細胞表面マーカーＣＤ３４およびＣＤ４９ｆをさらに発現する、
ことを特徴とする、
上皮由来細胞。

　［４］　［１］から［３］のいずれかに記載の上皮由来細胞であって、
　ＰＤＧＦＲα（Ｐｌａｔｅｌｅｔ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－α）および細胞表面マーカーＣＤ８６の発現がフローサイトメトリーで検出可能なレベルではない
ことを特徴とする、
上皮由来細胞。

　［５］　［１］から［４］のいずれかに記載の上皮由来細胞を含む上皮由来細胞集団。

　［６］　［５］に記載の上皮由来細胞集団であって、
　生体外培養物である、
上皮由来細胞集団。

　［７］　［５］または［６］に記載の上皮由来細胞集団であって、
　少なくとも２％の割合でＩｔｇｂ５を発現する細胞を含む、
ことを特徴とする、
上皮由来細胞集団。

　［８］　［５］または［６］に記載の上皮由来細胞集団であって、
　少なくとも１０％の割合でＩｔｇｂ５を発現する細胞を含む、
ことを特徴とする、
上皮由来細胞集団。

　［９］　［５］から［８］のいずれかに記載の上皮由来細胞集団であって、
　再生毛包原基の製造のために使用されることを特徴とする、
細胞集団。

　［１０］　再生毛包原基の製造方法であって、
　［５］から［８］のいずれかに記載の上皮由来細胞集団と、間葉系細胞由来の細胞集団とを接触させながら培養することにより、再生毛包原基を得る工程を含む、
製造方法。

　上記に挙げた本発明の一または複数の特徴を任意に組み合わせた発明も、本発明の範囲に含まれる。

　本発明によれば、再生毛包原基の製造に使用することができる新規な上皮由来細胞を提供される。

図１は、培養したマウス皮膚上皮由来細胞（左枠）から分離後（右枠）のマウスＩｔｇｂ５陽性細胞のフローサイトメトリーによる解析図を示す。図２は、毛包におけるマウスＩｔｇｂ５陽性細胞の分化能を検討するために用いた器官原基法（Ａ）およびマウスＩｔｇｂ５陽性細胞の分化能を示した組織学的解析（Ｂ）を示す。図３は、培養マウス皮膚上皮由来細胞のＣＤ３４およびＣＤ４９ｆ発現の細胞集団（Ａ）および分離前後におけるＣＤ３４およびＩｔｇｂ５発現の細胞集団（Ｂ）（左枠：分離前、中央枠：Ｉｔｇｂ５陰性／陽性細胞、右枠：Ｉｔｇｂ５陰性細胞）のフローサイトメトリーによる解析図を示す。図４は、発毛の持続性に対するＩｔｇｂ５陽性細胞の機能解析を検討するために用いた器官原基法、移植後の代表的発毛例（白矢頭：発毛）およびマウスＩｔｇｂ５陰性細胞とマウスＩｔｇｂ５陰性／陽性細胞の発毛率及び毛周期が３回以上となる割合（毛周期３回以上）を示す。図５は、培養マウス皮膚上皮由来細胞のＣＤ３４およびＣＤ４９ｆ発現の細胞集団（Ａ）、ＣＤ３４およびＩｔｇｂ５発現の細胞集団（Ａの黒枠（１）をゲーティング、Ｂ）、ＣＤ８６およびＩｔｇｂ５発現の細胞集団（Ｂの黒枠（２）をゲーティング、Ｃ）を示す。

　以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
　本発明は、新規な上皮由来細胞に関する。本発明の上皮由来細胞は、動物（典型的にはヒト）の上皮細胞から調製される上皮由来細胞であって、検出可能なレベルのＩｔｇｂ５を発現することを特徴とする。

　本明細書中で用いる「検出可能なレベル」とは、当業者にとって公知の手法で細胞表面マーカーを検出する場合に、各手法における陰性対照に対してその発現が検出可能な量であることを指す。したがって、その発現の程度は問題とせず、本発明においては、わずかな発現量であっても、陰性対照に対してその発現が検出される量である限り「検出可能なレベル」に該当し得る。

　本発明において、細胞表面マーカーのｍＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ　ＲＮＡ）、ｃＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ＤＮＡ）またはタンパク質を検出するために使用される手法は発色、発光、蛍光、ＵＶ（Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ）またはＲＩ（Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅ）などが挙げられる。具体的にはフローサイトメトリー、ノーザンブロッティング、ウェスタンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＲＴ－qＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫吸着スポット分析（ＥＬＩＳＰＯＴ分析）、競合的酵素免疫分析法（Ｅｎｚｙｍｅ　ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｄ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）、放射性アレルゲン吸着（ＲＡＳＴ）試験、ラジオイムノアッセイ、ラジオバインディングアッセイ、ゲルろ過クロマトグラフィー、アガロース電気泳動、アクリルアミド電気泳動などが挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明の一実施形態において、細胞表面マーカーの検出に使用される手法は、フローサイトメトリーである。

　一実施形態において、本発明の上皮由来細胞は、検出可能なレベルの他の上皮細胞マーカーをさらに発現する。そのような他の上皮細胞マーカーとして、これに限定されるものではないが、ＣＤ３４、ＣＤ４９ｆ、インテグリンα５、インテグリンβ１、インテグリンβ６、インテグリンβ８、ＴＧＦβ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｂｅｔａ）ｒｅｃｅｐｔｏｒ１、ＴＧＦβ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ２、ＴＧＦβ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ３、Ｒｅｔｉｎｏｉｃ　ａｃｉｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒα、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｂｉｎｄｉｎｇ　１、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｂｉｎｄｉｎｇ　２、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｂｉｎｄｉｎｇ　３、Ｈｉｓｔｏｎ　ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ９、Ｋｒｕｐｐｅｌ―ｌｉｋｅ　ｆａｃｔｏｒ４、Ｋｒｕｐｐｅｌ―ｌｉｋｅ　ｆａｃｔｏｒ５、Ｋｒｕｐｐｅｌ―ｌｉｋｅ　ｆａｃｔｏｒ７、Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ３、Ｎｕｃｌｅａｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｓｕｂｆａｍｉｌｙ４　ｇｒｏｕｐＡ　ｍｅｍｂｅｒ１、Ｎｕｃｌｅａｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｓｕｂｆａｍｉｌｙ４　ｇｒｏｕｐＡ　ｍｅｍｂｅｒ２、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１５、ＬＩＭ　ｈｏｍｅｏｂｏｘ　ｐｒｏｔｅｉｎ２、Ｓｅｘ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｓｉｏｎＹ－ｂｏｘ９、Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｔｙｐｅＸＶＩＩ　α1、Ｃａｄｈｅｒｉｎ３などを挙げることができる。本発明の一実施形態において、本発明の上皮由来細胞は、検出可能なレベルのＣＤ３４およびＣＤ４９ｆをさらに発現する。

　一実施形態において、本発明の上皮由来細胞は、検出可能なレベルの特定の細胞表面マーカーを発現しない。そのような細胞表面マーカーとして、ＰＤＧＦＲα、ＣＤ８６などを挙げることができる。一実施形態において、本発明の上皮由来細胞は、検出可能なレベルのＰＤＧＦＲα、およびＣＤ８６を発現しない。

　以下、本発明の上皮由来細胞または前記細胞を含む細胞集団の製造方法を説明する。

　本発明の上皮由来細胞は、動物の上皮組織由来の細胞を、例えば特定の発現誘導物質を含む基本培地中で常法にしたがって培養することによって取得することができる。

　基本培地は、細胞、特に哺乳動物細胞（例えばヒト）の培養に必須の炭素源、窒素源および無機塩等を含有する培地を指す。本発明の上皮由来細胞の製造に使用することができる基本培地として、一般的に、動物細胞の培養に用いられる培地を用いることができ、これに限定されるものではないが、イーグル培地などの最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地α（ＭＥＭ－α）、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２およびＦ－１０培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｗｉｌｌｉａｍｓ培地Ｅ、ＲＰＭＩ－１６４０培地、ＭＣＤＢ培地、１９９培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＭｃＣｏｙ改変培地、ＤＥＦ－ＣＳ培地、ＣｎＴ－ＰＲ培地、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ培地、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＭＥＭ培地、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、またはこれらの混合培地等を挙げることができる。

　一実施形態において、本発明の上皮由来細胞の製造には、前記発現誘導物質として、少なくとも以下を使用する：
少なくとも１種の骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＭＰ）阻害剤、
少なくとも１種の線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ，ＦＧＦ）；および
ソニックヘッジホッグ（Ｓｏｎｉｃ　ｈｅｄｇｅｈｏｇ，ＳＨＨ）またはＳＨＨアゴニスト、の少なくとも１種。

　本発明の上皮由来細胞の製造に使用されるＢＭＰ阻害剤は、ＢＭＰ受容体へのＢＭＰ分子の結合を阻止または阻害できるものであれば特に限定されない。ある分子または化合物がＢＭＰ阻害活性を有するか否かは、当業者に公知の方法（Ｚｉｌｂｅｒｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ.,　ＢＭＣ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ,　８：４１,　２００７.）を用いて、ＢＭＰの転写活性を測定することによって決定することができる。

　本発明の上皮由来細胞の製造に使用されるＢＭＰ阻害剤としては、これに限定されるものではないが、例えばノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、ドルソモルフィン（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）、コーディン（Ｃｈｏｒｄｉｎ）、フォリスタチン（Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）、およびエクトディン（Ｅｃｔｏｄｉｎ）等を挙げることができる。本発明において、ＢＭＰ阻害剤は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。

　本発明の上皮由来細胞の製造に使用されるＢＭＰ阻害剤の濃度は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは０．３ｎｇ／ｍＬ～３００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの範囲とすることができる。

　本発明の上皮由来細胞の製造に使用される線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）としては、これに限定されるものではないが、例えばＦＧＦ－１、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ－３、ＦＧＦ－４、ＦＧＦ－５、ＦＧＦ－６、ＦＧＦ－７、ＦＧＦ－８、ＦＧＦ－９、およびＦＧＦ－１０等を挙げることができる。本発明の上皮由来細胞の製造において、線維芽細胞増殖因子は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。本発明の別の実施形態では、線維芽細胞増殖因子として、少なくとも２種の線維芽細胞増殖因子が組み合わせて使用される。

　本発明の一実施形態では、線維芽細胞増殖因子として、少なくともがＦＧＦ－７が使用される。

　本発明の上皮由来細胞の製造に使用される線維芽細胞増殖因子の濃度は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは０．３ｎｇ／ｍＬ～３００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの範囲とすることができる。

　本発明の上皮由来細胞の製造に使用されるＳＨＨアゴニストは、ＳＨＨにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものであれば特に制限されない。ある分子または化合物がＳＨＨアゴニスト活性を有するか否かは、例えば特開２００９－２１３４４２号中に示唆されるような方法を用いて決定することができる。
　本発明の上皮由来細胞の製造に使用されるＳＨＨアゴニストとしては、これに限定されるものではないが、例えば、ＳＡＧ（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ　ａｇｏｎｉｓｔ）またはプルモルファミン（Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎ）等を挙げることができる。

　本発明の上皮由来細胞の製造に使用されるＳＨＨまたはＳＨＨアゴニストの濃度は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは０．３ｎｇ／ｍＬ～３００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの範囲とすることができる。

　一実施形態において、本発明の上皮由来細胞の製造には、少なくとも１種の受容体型チロシンキナーゼリガンドがさらに使用される。本発明の上皮由来細胞の製造に受容体型チロシンキナーゼリガンドをさらに使用することは、製造される再生毛包原基を生体へ移植した際の生着率を顕著に改善できる点で好ましい。
　本発明の上皮由来細胞の製造に使用される受容体型チロシンキナーゼリガンドとしては、これに限定されるものではないが、例えば、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ＴＧＦα（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　α）、アンフィレギュリン、およびヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ－ＥＧＦ）を挙げることができる。

　本発明の上皮由来細胞の製造に使用される受容体型チロシンキナーゼリガンドの濃度は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは０．３ｎｇ／ｍＬ～３００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの範囲とすることができる。

　必要に応じて本発明の上皮由来細胞の製造には、少なくとも１種のＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５（Ａｎａｐｌａｓｔｉｃ　ｌｙｍｐｈｏｍａ　ｋｉｎａｓｅ　５）阻害剤がさらに使用される。本発明の上皮由来細胞の製造に使用されるＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤は、ＴＧＦβ受容体とＡＬＫ５との相互作用を阻害できるものであれば特に制限されず、ＴＧＦβ受容体阻害剤またはＡＬＫ５阻害剤などを含み得る。
　本発明の上皮由来細胞の製造に使用されるＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤としては、これに限定されるものではないが、例えば、ＳＢ４３１５４２、Ａ８３－０１、ＡＬＫ５　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、Ｄ４４７６、ＬＹ３６４９４７、ＳＢ５２５３３４、ＳＤ２０８を挙げることができる。

　本発明の上皮由来細胞の製造に使用されるＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤の濃度は、０．００１ｎｇ／ｍＬ～１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは０．０１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬの範囲とすることができる。

　本発明の上皮由来細胞の製造において、細胞培養培地、例えば上皮由来細胞用の細胞培養培地を最適化するための他の成分を使用してもよい。そのような細胞培養培地を最適化するための他の成分としては、これに限定されるものではないが、Ｇｌｕｔａｍａｘ^ＴＭ、Ｂ２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｎ２　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などの血清代替物や、Ｙ－２７６３２などのＲｏｃｋ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ等を挙げることができる。

　本発明の例示的な実施形態において、本発明の上皮由来細胞の製造において、基礎培地、以下の添加剤の組み合わせ、および細胞培養培地を最適化するための他の成分が使用される：ノギン、ＥＧＦ、ＦＧＦ－７、ＦＧＦ－１０、ＳＡＧ。

　本発明の別の例示的な実施形態において、本発明の上皮由来細胞の製造において、基礎培地、以下の添加剤の組み合わせ、および細胞培養培地を最適化するための他の成分が使用される：ノギン、ＦＧＦ－７、ＦＧＦ－１０、ＳＡＧ。

　本発明の上皮由来細胞の製造において、培養の対象である上皮組織由来の細胞は、典型的には、毛包から調製することができ、例えば、バルジ領域（例えばバルジ領域の外毛根鞘最外層細胞）、毛母基部、またはｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ）もしくはＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ）から誘導した毛包上皮などを用いることができる。

　本発明に使用することができる上皮組織は、哺乳動物の霊長類（例えばヒト、サルなど）、有蹄類（例えばブタ、ウシ、ウマなど）、小型哺乳類のげっ歯類（例えばマウス、ラット、ウサギなど）のほか、イヌ、ネコなど種々の動物などから採取することができる。上皮組織の採取は、通常、組織の採取で用いられる条件をそのまま適用すればよく、無菌状態で取り出し、適当な保存液に保存すればよい。

　毛包からの上皮組織由来の細胞の調製は、例えば、まず周囲の組織から単離された毛包を、形状に従って、上皮組織および間葉組織に分離することによって行われる。その際、分離を容易に行うため酵素を用いてもよい。酵素としては、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、トリプシン等、公知のものを挙げることができ、当業者は適宜好ましい酵素を使用することができる。

　また、上皮組織由来の細胞として、毛包以外に由来する細胞を使用してもよい。毛包以外に由来する細胞としては、これに限定されるものではないが、皮膚もしくは口腔内の粘膜または歯肉の上皮由来細胞、好ましくは、皮膚または粘膜などの、分化した、例えば角化した、または錯角化した上皮由来細胞に分化しうる未熟な上皮由来前駆細胞、例えば非角化上皮由来細胞またはその幹細胞等が挙げられる。具体的に、口腔内上皮由来細胞またはその初代培養細胞を上皮由来細胞として用いる例が特開２００８－２９７５６号公報に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照として組み込まれる。

　本発明において用いることのできるＥＳ細胞の由来は特に限定されず、動物の内部細胞塊由来のＥＳ細胞を用いることができる。例えば、ＥＳ細胞の由来として、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、またはサルの内部細胞塊由来のＥＳ細胞を用いることができる。

　「ｉＰＳ細胞」とは、一般的に、体細胞へ、例えば数種類の遺伝子および／または薬剤を導入することにより、ＥＳ細胞のように非常に多くの細胞に分化できる分化万能性と、分裂増殖を経ても分化万能性を維持できる自己複製能を持たせた細胞をいう。ただし、本発明においては、上記の説明に限定されず、当業者が「ｉＰＳ細胞」であると認識する細胞を広く含む。

　本発明において用いることのできるｉＰＳ細胞の由来は特に限定されず、動物由来のｉＰＳ細胞を用いることができる。例えば、ｉＰＳ細胞の由来として、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、またはサル由来のｉＰＳ細胞を用いることができる。また、本発明において用いることのできるｉＰＳ細胞の由来となる体細胞も特に限定されず、あらゆる組織由来の細胞から誘導されたｉＰＳ細胞を用いることができる。さらに、本発明において用いることのできるｉＰＳ細胞の誘導方法も特に限定されず、体細胞からｉＰＳ細胞を誘導することができる方法であれば、どのような方法を用いて誘導されたｉＰＳ細胞でも用いることができる。

　上皮組織由来の細胞として、生体から採取した上皮組織由来の細胞を用いる場合には、培養に供する前に、単一細胞化処理を行うことが好ましい。本発明において、「単一細胞化」は、互いに結合または接着した状態にある複数の細胞（典型的には組織または器官）を、個々の細胞に分離する処理を指す。このような単一細胞化の処理は、当業者に公知の方法を用いてよく、これに限定されるものではないが、例えば酵素処理によって行うことができる。当該酵素処理に使用できる酵素およびその使用条件も当業者に公知であり、例えばディスパーゼ、コラゲナーゼ、トリプシンなどの酵素を使用することができる。単一細胞化は、所望の上皮由来細胞の効率的な増殖を促す観点から好ましい。

　一実施形態において、上皮組織由来の細胞は、バルジ領域の上皮組織由来の細胞である。このような細胞は、バルジ領域上皮（例えば外毛根鞘最外層）から組織を採取し、単一細胞化処理に供することによって調製することができる。

　上皮組織由来の細胞の培養は、動物細胞の培養に一般的に用いられる条件を採用することができ、例えば約３７℃の温度、５％ＣＯ_２濃度のインキュベーター内で、５から８日間の培養を適用することができる。また、適宜、ストレプトマイシン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。

　培養には、適宜、当業者に公知の細胞外マトリクスを用いてよく、例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、Ｔｙｐｅ　ＩＶ　ｃｏｌｌａｇｅｎ、アテロコラーゲン、Ｔｙｐｅ　Ｉ　ｃｏｌｌａｇｅｎ、Ｔｙｐｅ　ＩＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎなどを使用することができる。

　上記にしたがって増殖された細胞集団は、一定の割合でＩｔｇｂ５を発現する細胞を含む生体外培養物であり、必要に応じて、Ｉｔｇｂ５に基づくポジティブ選択を行い、Ｉｔｇｂ５を発現する細胞を分離、単離または富化してもよい。表面マーカーに基づくネガティブおよびポジティブ選択技術も、当業者に公知であり、例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）および磁気ビーズ分離を含む、任意の抗体に基づく技術を用いることができる。

　本発明の上皮由来細胞は、典型的には、毛包再生医療に使用される再生毛包原基の製造に使用することが可能である。
　毛包原基は、毛包の由来となる組織であり、上皮由来細胞および間葉系細胞から構成される。毛包原基は胎生期に表皮の一部が肥厚し、対面の間葉系細胞が凝集することにより形成される。
　本発明において、「再生毛包原基」とは、上皮由来細胞および間葉系細胞から人工的に誘導または再生された毛包原基を指す。

　本発明の上皮由来細胞は、典型的には、毛包再生医療に使用される再生毛包原基の製造に使用することが可能である。本発明の上皮由来細胞を再生毛包原基の製造に使用する場合、前記上皮由来細胞を含む細胞集団と、間葉系細胞由来の細胞集団とを接触させながら培養することにより、再生毛包原基を製造することができる。

　「上皮由来細胞を含む細胞集団」は、再生毛包原基の製造、好ましくは持続的な発毛能を有する（すなわち、毛周期１回以上、好ましくは２回、３回、４回もしくは５回以上にわたって発毛能を有する）再生毛包原基の製造を可能にするために、少なくとも２％、例えば少なくとも１０％の割合で、検出可能なレベルのＩｔｇｂ５を発現する細胞を含む細胞集団であることが好ましい。

　上皮由来細胞を含む細胞集団と間葉系細胞由来の細胞集団とを接触させて培養する際の培養条件は、一般的な動物細胞の培養に用いられる条件とすることができ、例えば少なくとも１２時間、好ましくは少なくとも１６時間、さらに好ましくは少なくとも２４時間、さらに好ましくは少なくとも４０時間にわたって行い、培養の途中で、培地や培養条件を変更してもよい。

　本明細書において用いられる用語は、特に定義されたものを除き、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。

　また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。

　異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語および科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書および関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、または、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。

　以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明は様々な態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。

［実施例１］細胞系譜追跡によるＩｔｇｂ５陽性細胞の分化能の解析
１）試薬の調製
１－１）解剖用培地の調製
　ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、終濃度：１０％）、ＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、終濃度：１０ｍＭ）およびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、終濃度：１％）を混合した。

１－２）ＨＥＰＥＳの調製
　ＨＥＰＥＳ（同仁化学研究所）をミリＱ水に溶解後、ＮａＯＨ（富士フイルム和光純薬）でｐＨを７．４に調整することにより、１Ｍ　ＨＥＰＥＳを調製した。

１－３）ＮａＨＣＯ_３の調製
　ＮａＨＣＯ_３（富士フイルム和光純薬）をミリＱ水に溶解することにより、１Ｍ　ＮａＨＣＯ_３を調製した。

１－４）ＤＭＥＭの調製
　１Ｌ用のＤＭＥＭパウダー（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をミリＱ水１００ｍＬで溶解させることにより、１０ｘＤＭＥＭを調製した。

１－５）再構成緩衝液の調製
　０．０５Ｎ　ＮａＯＨ溶液（ＮａＯＨ（富士フイルム和光純薬）をミリＱ水に溶解させることにより調製）１００ｍＬに対し、ＮａＨＣＯ_３（富士フイルム和光純薬）２．２ｇ、ＨＥＰＥＳ（富士フイルム和光純薬）４．７７ｇを溶解することにより、再構成緩衝液を調製した。

１－６）１０ｘαＭＥＭの調製
　１Ｌ用のαＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）をミリＱ水１００ｍＬで溶解させることにより、１０ｘαＭＥＭを調製した。

１－７）再構成用ゲルの調製
　Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ　Ｔｙｐｅ　Ｉ－Ａ（新田ゼラチン）と１０ｘαＭＥＭ（前掲）を混合比８：１で混合したあと、１０ｘαＭＥＭと同容量の再構成緩衝液（前掲）を添加し混合した。

１－８）１ｘＰＢＳ
　ミリＱ水にＫＣｌ（富士フイルム和光純薬、終濃度２７ｍＭ）、ＫＨ_２ＰＯ_４（富士フイルム和光純薬、終濃度１５ｍＭ）、Ｎａ_２ＨＰＯ_４（富士フイルム和光純薬、終濃度８０ｍＭ）およびＮａＣｌ（富士フイルム和光純薬、終濃度１．３７Ｍ）を溶解させることにより、１０ｘＰＢＳを調製した。１０ｘＰＢＳをミリＱ水で１０倍希釈することにより、１ｘＰＢＳを調製した。

２）マウス皮膚上皮由来細胞の播種、培養回収
　７－８週齢のＣＡＧ－ＥＧＦＰマウス（ＳＬＣ）の背部から皮膚を採取し、ＰＢＳ（－）（ナカライテスク）で１０倍希釈した０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３７℃、５０分間反応させた。反応後、解剖用培地に組織を移し、表皮（上皮層）を分離し、分離した表皮をピペッティングすることにより細胞を剥離した。剥離した細胞を含む細胞液を７０μｍセルストレーナー（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に通し、微量高速遠心機（日立工業）で２５０ｘｇ、４℃、５分間遠心した。遠心後、上清を除去し、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加および混合することにより、マウス皮膚上皮由来細胞を回収した。マウス皮膚上皮由来細胞の細胞濃度を測定後、細胞懸濁液をチューブに分取した。チューブを３１０ｘｇ、４℃で３分間遠心して上清を除去し、１Ｍ　ＨＥＰＥＳ（同仁化学研究所、終濃度：１０ｍＭ）、ＮａＨＣＯ_３（前掲、終濃度：１０ｍＭ）およびＤＭＥＭ（前掲、終濃度：１ｘ）を含有する１％アテロコラーゲン溶液（高研）を添加および混合することにより、１ｘ１０^５個／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。遠心により気泡を除去後、細胞懸濁液を６ウェルプレート（ベクトン・ディッキンソン）に９０μＬ／ウェルずつ播種した。３７℃設定およびＣＯ_２濃度５％設定のＣＯ_２インキュベーター（パナソニック）内で３０分程度ゲルを固化させた後、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ－１２を基礎培地とし、添加剤として、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１ｘＧｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１ｘＢ２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１ｘＮ２　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０μＭ　Ｒｏｃｋ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｙ－２７６３２、富士フイルム和光純薬）、５０ｎｇ／ｍＬ　ＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、５０ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ－７（Ｒ＆Ｄ）、５０ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ－１０（Ｒ＆Ｄ）、５０ｎｇ／ｍＬ　ＳＨＨ　ａｇｏｎｉｓｔ（ＳＡＧ、ｃａｙｍａｎ）、および５０ｎｇ／ｍＬ　ＢＭＰ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｎｏｇｇｉｎ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ならびに１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む培地（ＮＦＦＳＥ培地）を３ｍＬ／ウェルで添加し、３７℃設定およびＣＯ_２濃度５％設定のＣＯ_２インキュベーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で６日間、３次元培養を行った。

　培養６日後、細胞がコロニー形成しているゲルについて、セルスクレーパーでゲルを培養皿から剥離した。剥離したゲルを１．５ｍＬチューブに回収し（最大ゲル３個／チューブ）、培養上清を１ｍＬ添加した。Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　Ｉ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を終濃度が１００Ｕ／ｍＬになるように添加し、３７℃で６０～９０分間反応させることにより、ゲルを溶解させた。５９０ｘｇ、４℃で３分間遠心後、上清を除去し、ＰＢＳ（－）（ナカライテスク）を１ｍＬで１回洗浄した。洗浄後、ＰＢＳ（－）で希釈した０．１２５％　Ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を５００μＬ添加し、３７℃で２０分間反応させた。３５Ｕ／ｍＬ　ＤＮａｓｅ　ＴｙｐｅＩ（Ｓｉｇｍａ）含有解剖用培地を１ｍＬ添加および混合することにより、細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を３５μｍセルストレーナー（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に通し、５９０ｘｇ、４℃で３分間遠心した。遠心後、上清を除去し、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地で懸濁することにより、培養マウス皮膚上皮由来細胞を回収し、細胞濃度を計測した。

３）マウスＩｔｇｂ５陽性細胞の分離
　フローサイトメーターであるＢＤ　ＦＡＣＳＡｒｉａ^ＴＭＩＩＩ（ベクトン・ディッキンソン）を用いてＣＤ３４およびＣＤ４９ｆ陽性である培養マウス皮膚上皮由来細胞のＩｔｇｂ５陽性画分（図１左枠内の黒四角）を分離（セルソーティング）することにより、マウスＩｔｇｂ５陽性細胞を調製し、解析した。なお、分離したマウスＩｔｇｂ５陽性細胞において、ＣＤ８６の発現がフローサイトメトリーで検出可能なレベルではなかった（図５Ｃ黒枠（３））。
　回収した培養マウス皮膚上皮由来細胞（細胞数：１ｘ１０^５個または２ｘ１０^７個）を０．２ｍＭ　ＥＤＴＡ（富士フイルム和光純薬）および０．０５％ＢＳＡ（ＢＭ　ｂｉｏ　ｊａｐａｎ）含有ＰＢＳ（－）で１回洗浄後、ｅＦｌｕｏｒ６６０標識ＣＤ３４モノクローナル抗体（インビトロジェン、５０倍希釈）、ＰＥ標識ヒト／マウスＣＤ４９ｆモノクローナル抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、５０倍希釈）およびＩｔｇｂ５抗体（Ｒ＆Ｄ、５０倍希釈）を含む０．２ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．０５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（－）に再懸濁し、４℃で１５分間反応させた。なお、ＣＤ８６の発現解析にはＦＩＴＣ標識ラット抗マウスＣＤ８６モノクローナル抗体（ベクトン・ディッキンソン、５０倍希釈）を用いた。反応後、２回洗浄し、ＢＶ４２１標識ロバ抗ヒツジポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１００倍希釈）を含む０．２ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．０５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（－）に再懸濁し、４℃で１５分間反応させた。反応後、２回洗浄し、０．２ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．０５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（－）で１ｘ１０^７個／５００μLに再懸濁した。ＢＤ　ＦＡＣＳＡｒｉａ^ＴＭＩＩＩで解析し、ＣＤ３４およびＣＤ４９ｆ陽性細胞からマウスＩｔｇｂ５陽性細胞を分離した。
　結果を図１に示す。培養したマウス皮膚上皮由来細胞からマウスＩｔｇｂ５陽性細胞が分離されたことを確認した（図１）。

４）再生毛包原基の作製
　毛包におけるマウスＩｔｇｂ５陽性細胞の分化能を検討するため、マウスＩｔｇｂ５陽性細胞を用いて器官原基法（特許第５９３２６７１号）に従い、再生毛包原基を作製した。
　まず、従来法に従いマウス胎児から皮膚間葉系細胞を調製した。すなわち、胎齢１８．０から１８．５日齢のＣ５７ＢＬ／６マウス胎児（ＳＬＣ）より体毛原基を含む皮膚を３５ｍｍディッシュ（ベクトン・ディッキンソン）に採取し、中尾等が報告した方法（Ｎａｋａｏ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　４（３），　２２７－３０，　２００７）を一部改変し、ＰＢＳ（－）で希釈した１０ｃａｓｅｉｎｏｌｙｔｉｃ　Ｕ／ｍＬ　Ｄｉｓｐａｓｅ（ベクトン・ディッキンソン）２ｍＬで４℃、１時間反応させた。反応後、解剖用培地で２回洗浄し、７０Ｕ／ｍＬ　ＤＮａｓｅ　ＴｙｐｅＩ含有解剖用培地を２ｍＬ添加した。２５Ｇ注射針（テルモ）を用いて上皮層と真皮層を分離し、それぞれを３５ｍｍディッシュに静置した。上皮層をＰＢＳ（－）で２回洗浄し、Ａｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１ｍＬで室温、４５分間反応させた。反応後、７０Ｕ／ｍＬ　ＤＮａｓｅ　ＴｙｐｅＩ含有解剖用培地を２ｍＬ添加し、混合した。混合後、３５μｍセルストレーナーに通し、５９０ｘｇ、４℃で３分間遠心した。遠心後、上清を除去し、解剖用培地を添加および混合することにより、マウス胎児皮膚上皮由来細胞を採取した。一方、真皮層を５０ｍＬチューブ（ベクトン・ディッキンソン）に移し、解剖用培地で希釈した９１０Ｕ／ｍＬ　ＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅＩで３７℃、１時間、５５ｒｐｍで振盪しながら反応させた。反応後、解剖用培地を１０ｍＬ添加し、１０μｍセルストレーナー（Ｓｙｓｍｅｘ）に通し、５９０ｘｇ、４℃で３分間遠心した。遠心後、上清を除去し、７０Ｕ／ｍＬ　ＤＮａｓｅ　ＴｙｐｅＩ含有解剖用培地を添加および混合することにより、マウス胎児皮膚間葉系細胞を採取した。採取した両細胞の細胞数を測定後、マウスＩｔｇｂ５陽性細胞と採取したマウス胎児皮膚上皮由来細胞とを１：９の割合で混合することにより、マウス混合上皮由来細胞を調製した。マウス混合上皮由来細胞とマウス胎児皮膚間葉系細胞とを、シリコーングリース（東レ・ダウコーニング）を塗布した１．５ｍＬマイクロチューブ（エッペンドルフ）にそれぞれ別々に移し、遠心分離（６００ｘｇ、４℃、３分間）により沈殿として回収し、遠心後の培養液の上清をＧＥＬｏａｄｅｒ　Ｔｉｐ　０．５－２０μＬ（エッペンドルフ）を用いて除去した。なお、遠心分離と上清除去の操作は上清が可能な限り除去されるまで繰り返した。次に、シリコーングリースを塗布したペトリディッシュ（ベクトン・ディッキンソン）上に再構成用ゲルを３０μＬ滴下してコラーゲンゲルドロップを作製し、上記にて調製したマウス胎児皮膚間葉系細胞を０．１－１０μＬのピペットチップ（Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｌａｓｔｉｃｓ）を用いて、０．２μＬ程度注入し細胞凝集塊を作製した（細胞数：１ｘ１０^４個／原基）。続いて、同ゲルドロップ内へ、上記にて調製したマウス混合上皮由来細胞を０．１－１０μＬのピペットチップ（Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｌａｓｔｉｃｓ）を用いて、マウス胎児皮膚間葉系細胞の凝集塊に密着させるように０．２μＬ程度注入し細胞凝集塊を作製した（細胞数：１ｘ１０^４個／原基）。さらにマウス胎児皮膚間葉系細胞とマウス混合上皮由来細胞との細胞凝集塊のマウス混合上皮由来細胞側より、全長５ｍｍのナイロン糸（松田医科工業）を、細胞凝集塊の構造（特にマウス混合上皮由来細胞とマウス胎児皮膚間葉系細胞との接触面）を壊さずマウス胎児皮膚間葉系細胞の細胞画分とマウス混合上皮由来細胞画分との接触面を垂直に貫くように実体顕微鏡（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ）下で確認のうえで挿入し、１０％ＦＢＳおよび１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含有したＤＭＥＭを１ｍＬ加えた６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にセットした０．４μｍ　ｐｏｒｅ　ｓｉｚｅのＣｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｉｎｓｅｒｔ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に再構成用ゲルごと移し、３７℃設定およびＣＯ_２濃度５％設定のＣＯ_２インキュベーター内にて１６から４０時間器官培養を行い、再生毛包原基を作製した。

５）再生毛包原基のヌードマウス皮内移植
　再生毛包原基を、従来法に従いマウスの皮内に移植した。すなわち、５から８週齢のＢａｌｂ／ｃ　ｎｕ／ｎｕマウス（ＳＬＣ）を定法に従って麻酔を行い、背部をイソジン消毒した後に自然横臥位をとらせた。Ｖランスマイクロメス（日本アルコン）を用いて穿刺し、皮膚表皮層から真皮層下層部に至る移植創を形成した。移植創は体表面より垂直方向に約４００μｍの深度までとし、水平方向は約１ｍｍ程度とした。ナイロン糸製ガイドを挿入した再生毛包原基を、移植創の体表側に上皮由来細胞成分が向くように、先鋭ピンセットＮｏ．５（夏目製作所）を用いて挿入した。移植創上端部に再生毛包原基の上皮由来細胞成分の上端部が露出するよう移植深度を調節し、ナイロン糸製ガイドが体表面に露出するように位置させた。ナイロン糸製ガイドを移植創に近接した皮膚表面にステリストリップ（スリーエム）で固定し、その後、ナースバン（サンプラネット）およびサージカルテープ（スリーエム）で移植創を保護した。移植後５から７日で保護テープを除去した。

６）組織学的解析
　移植３週間から３カ月後に移植物を含んだ皮膚組織を採取し、４％ＰＦＡ（富士フイルム和光純薬）に４℃、一晩固定し、１ｘＰＢＳに溶解した１２．５％スクロース（富士フイルム和光純薬）に４℃、一晩浸し、１ｘＰＢＳで洗浄後、１ｘＰＢＳに溶解した２５％スクロースに４℃、一晩浸し、ＯＣＴコンパウンド（サクラファイテックジャパン）に皮膚組織を包埋した。包埋した組織をクラリオスタット（ライカ）で厚さ５０μｍの組織切片を作製した。作製した組織切片を２４ウェルプレート（ベクトン・ディッキンソン）に移し、５００μＬの洗浄用緩衝液（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ａｌｆａ　Ａｅｓａｒ）を１ｘＰＢＳで希釈することにより調製した０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）に室温、１０分間浸透することにより洗浄した（洗浄回数２回）。洗浄後、Ｉｔｇｂ５抗体（Ｒ＆Ｄ、５０倍希釈）を含む洗浄用緩衝液に再懸濁し、４℃、一晩振盪させた。上清を除去し、５００μＬの洗浄用緩衝液に室温、１時間浸透することにより洗浄した（洗浄回数３回）。洗浄後、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５９４標識ロバ抗ヒツジポリクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１００倍希釈）を含む洗浄用緩衝液に再懸濁し、４℃、一晩振盪させた。上清を除去し、５００μＬの洗浄用緩衝液に室温、１時間浸透することにより洗浄した（洗浄回数３回）。スライドガラスに組織を移し、退色防止剤入り封入材を用いて、カバーガラスで封入した。共焦点レーザスキャン顕微鏡ＬＳＭ－７８０（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ）を用いてマウスＩｔｇｂ５細胞のＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）による蛍光染色の局在を指標に毛包におけるマウスＩｔｇｂ５細胞の分化能について解析した。
　結果を図２に示す。マウスＩｔｇｂ５陽性細胞（ＥＧＦＰ陽性細胞）は毛包を構成する皮脂腺（白矢頭）、幹細胞ニッチ（白矢頭）、毛包可変部（白矢頭）および毛球部（白矢頭）に局在していたことから（図２）、Ｉｔｇｂ５陽性細胞は多様な組織、領域への分化能を有していることが予想される。

［実施例２］発毛の持続性に対するＩｔｇｂ５陽性細胞の機能解析
１）試薬の調製、２）実験動物および３）マウス皮膚上皮由来細胞の播種、培養および回収は前掲した方法で実施した。

４）マウスＩｔｇｂ５陰性／陽性細胞およびマウスＩｔｇｂ５陰性細胞の分離
フローサイトメーターを用いてＣＤ３４およびＣＤ４９ｆ陽性である培養マウス皮膚上皮由来細胞のＩｔｇｂ５陰性およびＩｔｇｂ５陽性画分（図３Ｂの左枠内大きい黒四角）を分離することにより、マウスＩｔｇｂ５陰性／陽性細胞を調製した（図３Ｂ中央枠）。また、Ｉｔｇｂ５陰性画分（図３Ｂの左枠内小さい黒四角）を分離（セルソーティング）することにより、マウスＩｔｇｂ５陰性細胞を調製した（図３Ｂ右枠）。回収した培養マウス皮膚上皮由来細胞（細胞数：５ｘ１０^７個）に前掲した方法で３種類の抗体を反応させた。再懸濁した細胞懸濁液をＢＤ　ＦＡＣＳＡｒｉａ^ＴＭＩＩＩで解析し、ＣＤ３４およびＣＤ４９ｆ陽性細胞からＩｔｇｂ５陰性細胞（細胞数：１ｘ１０^６個）およびマウスＩｔｇｂ５陰性／陽性細胞（細胞数：１ｘ１０^６個）を分離した。
　結果を図３に示す。培養したマウス皮膚上皮由来細胞がＣＤ３４およびＣＤ４９ｆ陽性であることを確認した（図３Ａ）。また、Ｉｔｇｂ５陰性細胞およびマウスＩｔｇｂ５陰性／陽性細胞をそれぞれ分離したことを確認した（図３Ｂ）。

５）マウスＩｔｇｂ５陰性／陽性細胞の器官誘導能評価
　マウスＩｔｇｂ５陰性／陽性細胞の器官誘導能を評価するために器官原基法を用いて再生毛包原基を作製し、動物移植による発毛能を指標に発毛の持続性に対するＩｔｇｂ５陽性細胞の機能解析を行った。なお、対照群としてマウスＩｔｇｂ５陰性細胞を用いた。再生毛包原基は器官原基法（特許第５９３２６７１号）に従い、作製した。
　前掲した方法でマウス胎児皮膚間葉系細胞を採取し、採取した細胞数を測定した。マウスＩｔｇｂ５陰性／陽性細胞とマウスＩｔｇｂ５陰性細胞とマウス胎児皮膚間葉系細胞を、シリコーングリースを塗布した１．５ｍＬマイクロチューブ（エッペンドルフ）にそれぞれ別々に移し、遠心分離（６００ｘｇ、４℃、３分間）により沈殿として回収し、遠心後の培養液の上清をＧＥＬｏａｄｅｒ　Ｔｉｐ　０．５－２０μＬ（エッペンドルフ）を用いて除去した。なお、遠心分離と上清除去の操作は上清が可能な限り除去されるまで繰り返した。次に、シリコーングリースを塗布したペトリディッシュ上に再構成用ゲルを３０μＬ滴下してコラーゲンゲルドロップを作製し、上記にて調製したマウス胎児皮膚間葉系細胞を０．１－１０μＬのピペットチップ（Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｌａｓｔｉｃｓ）を用いて、０．２μＬ程度注入し細胞凝集塊を作製した（細胞数：１ｘ１０^４個／原基）。続いて、同ゲルドロップ内へ、上記にて調製したマウスＩｔｇｂ５陰性／陽性細胞またはマウスＩｔｇｂ５陰性細胞を０．１－１０μＬのピペットチップ（Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｌａｓｔｉｃｓ）を用いて、マウス胎児皮膚間葉系細胞の凝集塊に密着させるように０．２μＬ程度注入し細胞凝集塊を作製した（各細胞数：１ｘ１０^４個／原基）。さらにマウス胎児皮膚間葉系細胞とマウスＩｔｇｂ５陰性／陽性細胞またはマウスＩｔｇｂ５陰性細胞との細胞凝集塊のマウスＩｔｇｂ５陰性／陽性細胞またはマウスＩｔｇｂ５陰性細胞側より、全長５ｍｍのナイロン糸（松田医科工業）を、細胞凝集塊の構造（特にマウスＩｔｇｂ５陰性／陽性細胞またはマウスＩｔｇｂ５陰性細胞とマウス胎児皮膚間葉系細胞との接触面）を壊さずマウス胎児皮膚間葉系細胞の細胞画分とマウスＩｔｇｂ５陰性／陽性細胞またはマウスＩｔｇｂ５陰性細胞画分との接触面を貫くように実体顕微鏡下で確認のうえで挿入し、ＤＭＥＭ１０％ＦＢＳを１ｍＬ加えた６ウェルプレート（ベクトン・ディッキンソン）にセットした０．４μｍ　ｐｏｒｅ　ｓｉｚｅのＣｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｉｎｓｅｒｔｓ（ベクトン・ディッキンソン）上にコラーゲンゲルごと移し、３７℃設定およびＣＯ_２濃度５％設定のＣＯ_２インキュベーター内にて１６から４０時間器官培養を行い、再生毛包原基を作製した。
　再生毛包原基を、前掲した方法で移植した。移植物の生着を蛍光実体顕微鏡ＳｔｅＲＥＯ　Ｌｕｍａｒ．Ｖ１２（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ）で判定した後に経過観察（３または４日に１回）を行った。経過観察は、麻酔下のマウスの移植部位を蛍光実体顕微鏡ＳｔｅＲＥＯ　Ｌｕｍａｒ．Ｖ１２（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ）による観察・撮影を行い、再生毛包の発毛能を指標に発毛の持続性を評価した。
結果を図４に示す。Ｉｔｇｂ５陰性／陽性細胞を包含する再生毛包原基はＩｔｇｂ５陰性細胞を包含する再生毛包原基と比較して、高い発毛率を示し、さらに、毛周期が３回以上となる割合がＩｔｇｂ５陰性／陽性細胞を包含する再生毛包原基で高かったことから（図４）、上皮由来細胞にＩｔｇｂ５陽性細胞を包含することにより、高い発毛能を持続的に維持していることが予想される。

Claims

　上皮由来細胞であって、
　検出可能なレベルのインテグリンβ５（Ｉｔｇｂ５）を発現する、
ことを特徴とする、
上皮由来細胞。
　請求項１に記載の上皮由来細胞であって、
　検出可能なレベルのＣＤ３４および／またはＣＤ４９ｆをさらに発現する、
ことを特徴とする、
上皮由来細胞。
　請求項１または２に記載の上皮由来細胞であって、
　検出可能なレベルのＣＤ３４およびＣＤ４９ｆをさらに発現する、
ことを特徴とする、
上皮由来細胞。
　請求項１から３のいずれか１項に記載の上皮由来細胞であって、
　ＰＤＧＦＲα（Ｐｌａｔｅｌｅｔ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－α）およびＣＤ８６の発現がフローサイトメトリーで検出可能なレベルではない
ことを特徴とする、
上皮由来細胞。
　請求項１から４のいずれか１項に記載の上皮由来細胞を含む上皮由来細胞集団。
　請求項５に記載の上皮由来細胞集団であって、
　生体外培養物である、
上皮由来細胞集団。
　請求項５または６に記載の上皮由来細胞集団であって、
　少なくとも２％の割合でＩｔｇｂ５を発現する細胞を含む、
ことを特徴とする、
上皮由来細胞集団。
　請求項５または６に記載の上皮由来細胞集団であって、
　少なくとも１０％の割合でＩｔｇｂ５を発現する細胞を含む、
ことを特徴とする、
上皮由来細胞集団。
　請求項５から８のいずれか１項に記載の上皮由来細胞集団であって、
　再生毛包原基の製造のために使用されることを特徴とする、
上皮由来細胞集団。
　再生毛包原基の製造方法であって、
　請求項５から８のいずれか１項に記載の上皮由来細胞集団と、間葉系細胞由来の細胞集団とを接触させながら培養することにより、再生毛包原基を得る工程を含む、
製造方法。