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WO2020261464A1 - トランスフェクション方法 - Google Patents

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WO2020261464A1
WO2020261464A1 PCT/JP2019/025506 JP2019025506W WO2020261464A1 WO 2020261464 A1 WO2020261464 A1 WO 2020261464A1 JP 2019025506 W JP2019025506 W JP 2019025506W WO 2020261464 A1 WO2020261464 A1 WO 2020261464A1
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WO
WIPO (PCT)
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cells
ultrafine
ultrafine bubble
aqueous solution
present
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2019/025506
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English (en)
French (fr)
Inventor
直之 村田
薫雄 柳井
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Takeda Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Takeda Pharmaceutical Co Ltd
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Priority to CN201980099629.7A priority patent/CN114269385A/zh
Priority to PCT/JP2019/025506 priority patent/WO2020261464A1/ja
Priority to US17/622,585 priority patent/US20220249665A1/en
Priority to JP2021528766A priority patent/JP7314270B2/ja
Publication of WO2020261464A1 publication Critical patent/WO2020261464A1/ja
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    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Definitions

  • the present invention is an ultrafine bubble delivery system for a target substance into cells (excluding immune cells), which is a combination of ultrafine bubble water or an ultrafine bubble aqueous solution containing ultrafine bubbles and an ultrasonic generator.
  • the present invention relates to a method for delivering a nucleic acid, a protein or a low molecular weight compound into the cell by contacting with and treating with an ultrasonic wave.
  • Ultrasound has been mainly used as an ultrasonic contrast device in the medical field.
  • Microbubbles which are ultrasonic contrast agents, have brought about breakthroughs in ultrasonic diagnosis.
  • ultrasonic waves have become available for purposes other than diagnosis.
  • non-invasive cancer hyperthermia by focusing ultrasonic energy on the affected area and heating only the affected area has been used for uterine fibroids and prostate gland. It is clinically applied.
  • DDS drug delivery system
  • bubble liposomes in which perfluoropropane is encapsulated in polyethylene glycol (PEG) -modified liposomes have been reported as a gene delivery system to skeletal muscle that combines bubble liposomes and ultrasonic technology (Non-Patent Document 1). ..
  • PEG-modified bubble liposome bubble lipopolyplex having an average particle diameter of 50 to 500 nm, in which a specific morpholino oligomer is bound to the surface and perfluorohydrocarbon is encapsulated inside, the muscle tissue or blood vessel is administered.
  • Non-Patent Document 1 A therapeutic agent for Duchenne muscular dystrophy, which introduces the morpholino oligomer into muscle cells with high efficiency by irradiating muscle tissue with ultrasonic waves from outside the body, has also been reported (Patent Document 1). Furthermore, it has been reported that gas-filled microbubbles and ultrasonic waves can be used for drug and gene delivery to the brain (Non-Patent Document 2).
  • Non-Patent Document 3 It has been reported that by using perfluoropropane gas as the encapsulating gas, bubble liposomes having a size smaller than that using perfluorobutane gas or nitrogen gas can be obtained (Non-Patent Document 3).
  • bubble lipopolyplex which is a combination of nanobubbles and plasmid
  • the plasmid was introduced into the vascular endothelium or the external position of the blood vessel, and the efficiency of gas encapsulation was increased. It has been reported that the introduction site is different (Non-Patent Document 4).
  • bubble liposomes may cause problems with lipid antigenicity.
  • an output intensity such as 1.5 to 2.5 W / cm 2 , which has a concern about safety, is used for ultrasonic irradiation, which poses a problem in terms of practicality.
  • nanobubble water containing nanobubbles containing no phospholipid and having 2.0 ⁇ 10 8 cells / mL or more has an excellent antibacterial effect (Patent Document 2).
  • the target substance such as nucleic acid or protein was introduced into cells by combining the nanobubble water and ultrasonic waves.
  • An object of the present invention is to provide a novel means for safely and efficiently introducing a target substance such as nucleic acid or protein into cells (excluding immune cells).
  • the present inventors have previously developed nanobubble water having an excellent antibacterial action (see Patent Document 2 above; ISO is a bubble of less than 1 ⁇ m (1000 nm). Since it is defined as “ultra fine bubble”, it is referred to as “ultra fine bubble” in the present specification instead of “nano bubble”), but it is noted that it does not contain phospholipids.
  • the ultrafine bubbles contained in this ultrafine bubble water have an average diameter of 200 nm or less, which is even smaller than the conventional one. Conventionally, it has been thought that ultrafine bubbles cause more severe damage to cell membranes when crushed than microbubbles, but the present inventors dared to combine this ultrafine bubble water with ultrasonic irradiation to skeletal muscle.
  • the introduction of nucleic acids and proteins into cells was examined. As a result, it was surprisingly shown that the combination of the ultrafine bubble water and ultrasonic waves can dramatically increase the nucleic acid introduction efficiency as compared with any single treatment. The introduction efficiency was superior to that of conventional microbubble liposomes. Further, the ultrasonic treatment can significantly increase the protein introduction efficiency by the ultrafine bubble water alone treatment, and according to the combination of the ultrafine bubble water and ultrasonic waves, the low output intensity of 500 mW / cm 2 or less. It was shown that the protein can be efficiently introduced into cells. As a result of further studies based on these findings, the present inventors have completed the present invention.
  • the present invention [1] Into cells (excluding immune cells) composed of a combination of ultrafine bubble water or an ultrafine bubble aqueous solution containing ultrafine bubbles containing no phospholipid having an average diameter of 200 nm or less and an ultrasonic generator. Delivery system of target substance; [2]
  • the ultrafine bubble aqueous solution is one or more kinds of surfactants selected from anionic surfactants, nonionic surfactants, cationic surfactants and amphoteric surfactants, hydrophilic resins, and the like.
  • the ultrafine bubble aqueous solution is one or more kinds of surfactants selected from anionic surfactants, nonionic surfactants, cationic surfactants and amphoteric surfactants, and hydrophilic.
  • the density of ultrafine bubbles in ultrafine bubble water or an aqueous solution of ultrafine bubbles is 1.0 ⁇ 10 8 to 2.0 ⁇ 10 9 cells / mL, [12] to [12-7].
  • the method described in any of the above; [12-10] The method according to any one of [12] to [12-9], wherein the output intensity of ultrasonic waves in the ultrasonic wave generator is 720 mW / cm 2 or less; [12-11] Described in any one of [12] to [12-9], wherein the output intensity of the ultrasonic wave is 50 to 500 mW / cm 2 and the frequency of the ultrasonic wave is 0.5 to 10 MHz in the ultrasonic wave generator.
  • the ultrafine bubble aqueous solution is one or more kinds of surfactants selected from anionic surfactants, nonionic surfactants, cationic surfactants and amphoteric surfactants, and hydrophilic.
  • the density of ultrafine bubbles in ultrafine bubble water or an aqueous solution of ultrafine bubbles is 1.0 ⁇ 10 8 to 2.0 ⁇ 10 9 cells / mL, [13] to [13-7].
  • the formulation described in any of the above; [13-10] The preparation according to any one of [13] to [13-9], wherein the output intensity of ultrasonic waves in the ultrasonic generator is 720 mW / cm 2 or less; [13-11] Described in any one of [13] to [13-9], wherein the output intensity of the ultrasonic wave is 50 to 500 mW / cm 2 and the frequency of the ultrasonic wave is 0.5 to 10 MHz in the ultrasonic wave generator.
  • nucleic acids, proteins, and low levels are non-invasively irradiated by irradiation with an ultrasonic wave having an output intensity that does not adversely affect the living body. Since the target substance such as a molecular compound can be selectively introduced into cells (excluding immune cells), a highly safe introduction system can be provided. Since it is not necessary to use liposomes in the system, it is not necessary to add a special additive such as phospholipid, it can be produced at low cost, and there is no problem of antigenicity due to phospholipid.
  • ultrafine bubbles are considered to be unsuitable for cell transfection because the cell membrane is severely damaged when crushed as compared with microbubbles.
  • ultrafine bubbles are considered to be unsuitable.
  • the system of the present invention is a cell (immune cell) comprising a combination of ultrafine bubble water or an ultrafine bubble aqueous solution containing ultrafine bubbles containing no phospholipid having an average diameter of 200 nm or less and an ultrasonic generator. (Excluding) provides a delivery system for the target substance (hereinafter, also referred to as “system of the present invention”).
  • delivery of a target substance into cells means a substance that is originally difficult to pass through a cell membrane (for example, a compound that is water-soluble and difficult to passively diffuse, a compound having a large molecular weight, etc. It means that a compound without a selective transporter or receptor) passes through the cell membrane and translocates into the cell. Therefore, the system of the present invention may deliver the target substance into the cell by any mechanism, and includes, but is not limited to, temporarily forming a hole in the cell membrane.
  • non-immune cells include immune cells (eg, T cells, B cells, natural killer (NK) cells, etc.). Lymphocytes such as natural killer T (NKT) cells, granulocytes such as neutrophils, eosinophils, basophils, monospheres, macrophages, dendritic cells, etc., or monopoly capable of final differentiation into them
  • the cells are not particularly limited as long as they are cells other than pluripotent stem cells or progenitor cells (excluding embryos and other pluripotent or pluripotent stem cells), but for example, nerve cells (including brain nerve cells).
  • Skeletal muscle cells endothelial cells, epithelial cells, mesenteric cells, bone cells, cartilage cells, fat cells, tendon cells, eye cells, major glands or organs excluding the immune system (eg, testis, liver, lungs, heart, Cells of the stomach, pancreas, kidneys, skin, etc.), exocrine cells, endocrine cells, fibroblasts, islet cells, cells derived from neurons and other neural tissues, monopoly or capable of differentiating into any of the above cells Pluripotent progenitor and tissue stem cells, embryos and other pluripotent or pluripotent stem cells (eg, iPS cells, ES cells, ES-like cells, and embryonic germ cells, etc.), and other cells [epithelial cells] , Membranous cells, and high-purity mesenchymal stem cells (Rapidly Expanding Cells: REC)] and the like.
  • the target substance delivered into a non-immune cell using the system of the present invention is not particularly limited as long as it is a substance capable of imparting favorable physiological activity to the cell by being delivered into the cell, for example.
  • High molecular weight compounds eg, nucleic acids, such as small RNA / DNA, genes (eg, plasmid DNA, such as siRNA (eg, FAM-siRNA, manufactured by Nippon Gene), ssRNA, shRNA, miRNA, S-modified oligo DNA (phosphorothioate, etc.)).
  • Proteins including peptides (eg, antibodies (eg, IgG (eg, Alexa-IgG, manufactured by Invitrogen)), etc.), polysaccharides (eg, dextran, fluorescein isothiocyanate dextran, etc.), etc.], Low molecular weight compounds (eg, fluorescein, sodium fluorescein, etc.) and the like can be mentioned, but are not limited thereto. Of these, high molecular weight compounds and low molecular weight compounds are preferable. More preferably, a polymer compound is used. More preferably, nucleic acids and proteins are mentioned. Particularly preferred are nucleic acids and antibodies.
  • the term "ultrafine bubble” may include a gas having a normal atmospheric pressure or a higher pressure, or the inside of the ultrafine bubble may be a vacuum.
  • vacuum means a state of a space filled with a gas having a pressure lower than the normal atmospheric pressure.
  • the "phospholipid-free ultrafine bubble” is an ultrafine bubble in which the shell of the bubble does not form a phospholipid bilayer structure.
  • ultra fine bubble water refers to water containing ultra fine bubbles.
  • the “ultra-fine bubble aqueous solution” refers to an aqueous solution containing ultra-fine bubbles.
  • the aqueous solution constituting the ultrafine bubble aqueous solution is, for example, 1) One or more surfactants selected from anionic surfactants, nonionic surfactants, cationic surfactants and amphoteric surfactants, It contains one or more substances selected from 2) hydrophilic resin and 3) buffer solution as components.
  • the "anionic surfactant” in the present invention examples include sodium lauryl sulfate and the like.
  • the "nonionic surfactant” includes, for example, glycerin fatty acid ester (eg, glycerin monostearate, etc.), sucrose fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester (eg, sorbitan monostearate, sorbitan monolaurate, etc.).
  • Polyglycerin fatty acid ester polyoxyethylene (hardened) castor oil, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester (eg, polyoxyethylene sorbitan laurate (eg, polysorbate 20, etc.), polyoxyethylene sorbitan oleic acid ester (eg, polysorbate) 80 etc.), polyethylene glycol fatty acid ester, polyoxyethylene alkyl ether (eg polyoxyethylene lauryl ether etc.), polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether (eg polyoxyethylene polyoxypropylene cetyl ether etc.), poly Examples thereof include oxyethylene alkyl phenyl ether (eg, polyoxyethylene nonyl phenyl ether, etc.), macrogol, polyoxyethylene polyoxypropylene glycol (eg, porox summer 407, porox summer 235, porox summer 188, poroxamine, etc.).
  • polyoxyethylene polyoxypropylene glycol eg, porox summer 407, porox summer 235,
  • polyoxyethylene sorbitan lauric acid ester eg, polysorbate 20 and the like
  • polyoxyethylene sorbitan oleic acid ester eg, polysorbate 80 and the like
  • polysorbate 20 or polysorbate 80 Particularly preferred is polysorbate 80.
  • the "cationic surfactant” in the present invention include benzalkonium chloride, benzethonium chloride, cetylpyridinium chloride, hexadecyltrimethylammonium bromide, decalinium chloride and the like.
  • the "amphoteric surfactant” in the present invention include cocamidopropyl betaine and cocamidopropyl hydroxysultaine. The above-mentioned surfactant may be used alone or in combination of two or more.
  • the "hydrophilic resin” includes, for example, an acrylic resin (eg, polyacrylamide, polyacrylic acid, polymethylmethacrylate), a vinyl resin (eg, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol (PVA), polyvinylethyl ether). ); Polysaccharides (eg, tragant gum, karaya gum, methyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, hyaluronic acid, agarose, curdran, etc.) can be mentioned. Of these, polyvinyl alcohol and hydroxypropyl cellulose are preferable. More preferably, polyvinyl alcohol can be mentioned.
  • the hydrophilic resin may be used alone or in combination of two or more.
  • the "buffer” includes, for example, an acidic buffer (for example, acetate buffer, citrate buffer, diluted Mclivine buffer) or a neutral buffer (for example, 4- (2-hydroxyethyl)).
  • an acidic buffer for example, acetate buffer, citrate buffer, diluted Mclivine buffer
  • a neutral buffer for example, 4- (2-hydroxyethyl)
  • -1-Piperazine ethanesulfonic acid (HEPES) buffer Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) buffer, phosphate buffer, phosphate buffered saline (PBS)
  • Tris hydroxymethyl aminomethane
  • PBS phosphate buffer
  • a diluted Mclivine buffer solution is preferable.
  • the aqueous solution constituting the "ultrafine bubble aqueous solution” in the present invention is preferably 1 or 2 selected from 1) anionic surfactants, nonionic surfactants, cationic surfactants and amphoteric surfactants.
  • examples thereof include an aqueous solution composed of more than one type of surfactant and / or 2) a hydrophilic resin.
  • an aqueous solution composed of a nonionic surfactant and / or a hydrophilic resin is preferable.
  • an aqueous solution composed of a nonionic surfactant is also preferable.
  • an aqueous solution consisting of 1) one or two selected from polysorbate 80 and polysorbate 20 and / or 2) polyvinyl alcohol can be mentioned.
  • an aqueous solution composed of polysorbate 80 and / or polyvinyl alcohol can be mentioned.
  • an aqueous solution composed of polysorbate 80 is preferable.
  • the "gas" constituting the ultra-fine bubbles in the present invention for example, perfluoro hydrocarbons (e.g., perfluoropropane (C 3 F 8), perfluorobutane, etc.), air, nitrogen, ozone, oxygen, argon, Examples thereof include, but are not limited to, one kind or a mixture of two or more kinds selected from carbon dioxide, helium and the like. Of these, perfluorohydrocarbons (eg, perfluoropropane, perfluorobutane, etc.), air, nitrogen, ozone, oxygen, and argon are preferable.
  • perfluoro hydrocarbons e.g., perfluoropropane (C 3 F 8), perfluorobutane, etc.
  • air, nitrogen, ozone, oxygen, and argon are preferable.
  • it is a perfluorohydrocarbon (eg, perfluoropropane, perfluorobutane, etc.), air.
  • perfluorohydrocarbon eg, perfluoropropane, perfluorobutane, etc.
  • air When air is used, ultrafine bubbles can be easily produced at low cost. More preferably, perfluoropropane and air can be mentioned.
  • the "ultrafine bubble aqueous solution” in the present invention is preferably one selected from (A) an aqueous solution composed of a nonionic surfactant and / or a hydrophilic resin, and (B) perfluorohydrocarbon, air and the like.
  • an ultrafine bubble aqueous solution composed of ultrafine bubbles composed of two or more kinds of gases can be mentioned. More preferably, (A) an aqueous solution consisting of 1 or 2 selected from polysorbate 80 and polysorbate 20 and / or 2) polyvinyl alcohol, and (B) one selected from perfluorohydrocarbon and air or An ultrafine bubble aqueous solution composed of an ultrafine bubble composed of two kinds of gases can be mentioned.
  • an ultrafine bubble aqueous solution composed of (A) an aqueous solution composed of polysorbate 80 and / or polyvinyl alcohol and (B) an ultrafine bubble composed of perfluorohydrocarbon and / or air
  • A an aqueous solution composed of polysorbate 80 and / or polyvinyl alcohol
  • B an ultrafine bubble composed of perfluorohydrocarbon and / or air
  • an ultrafine bubble aqueous solution composed of an aqueous solution composed of polysorbate 80 and an ultrafine bubble composed of perfluoropropane or air is preferable.
  • the "ultrafine bubble" in the present invention does not contain amphipathic phospholipids such as liposomes, it is possible to provide a safer preparation without exhibiting antigenicity.
  • the average diameter of the "ultra fine bubble” is about 200 nm or less.
  • the average diameter is preferably, for example, 10 nm to 200 nm, more preferably 50 nm to 200 nm, and more preferably 100 nm to 180 nm.
  • the average diameter of the "ultra fine bubble” in the present invention is, for example, about 175 nm or less, more preferably 25 nm to 175 nm, and more preferably 75 nm to 165 nm.
  • the "mean diameter” means the particle diameter (mode diameter) corresponding to the mode value (maximum value of the number%) of the distribution.
  • the "ultra fine bubble water” or “ultra fine bubble aqueous solution” means water or an aqueous solution in which gas particles (ultra fine bubbles) having a diameter of 1000 nm or less are stably present.
  • the ultrafine bubble water or the ultrafine bubble aqueous solution in the present invention (hereinafter, also referred to as “ultrafine bubble water or the like in the present invention”) is characterized by containing ultrafine bubbles having an average diameter of about 200 nm or less.
  • the size of the ultrafine bubble is uniform.
  • the "d90 / d10 ratio" when the ultrafine bubble diameters corresponding to cumulative 10% and cumulative 90% from the small diameter side of the ultrafine bubble number reference distribution are d10 and d90, respectively, is preferably 5 or less. , More preferably 4.5 or less, and more preferably 4 or less.
  • the number of ultrafine bubbles contained in ultrafine bubble water or the like means the number of ultrafine bubbles present in 1 mL of ultrafine bubble water or an ultrafine bubble aqueous solution, and in the present specification, “ultra fine bubbles”. It is also called “fine bubble density”.
  • the number of ultrafine bubbles contained in the ultrafine bubble water or the like in the present invention is not particularly limited.
  • the lower limit of the “ultra fine bubble density” is, for example, 1.0 ⁇ 10 8 pieces / mL or more, preferably 2.0 ⁇ 10 8 pieces / mL or more, and more preferably 2.5 ⁇ 10 8 pieces / mL or more. ..
  • the upper limit of the "ultra fine bubble density” is, for example, 2.0 ⁇ 10 9 pieces / mL or less, preferably 1.0 ⁇ 10 9 pieces / mL or less.
  • the "ultrafine bubble density" in the present invention is, for example, 1.0 ⁇ 10 8 to 2.0 ⁇ 10 9 pieces / mL, preferably 2.0 ⁇ 10 8 to 1.0 ⁇ 10 9 pieces / mL. more preferably 2.5 ⁇ 10 8 ⁇ 1.0 ⁇ 10 9 cells / mL.
  • Ultrafine bubble diameter (including ultrafine bubble mean diameter; same below), ultrafine bubble number reference distribution (including d90 / d10 ratio; same below), and ultrafine bubble number are scattering of laser light based on Brown motion.
  • Nanosite, LM20, LM10, etc. method based on changes in electrical resistance (eg, Beckman Coulter, Multisizer4, etc.), method based on laser diffraction and scattering method (eg, Shimadzu, SALD-) It can be measured by using a method using Mie scattering (eg, Nippon Denshoku Kogyo, NP-500T, etc.), etc. (7100H, etc.).
  • the ultrafine bubble diameter and the ultrafine bubble number reference distribution in the present invention were measured by using a tracking method (tracking method) using laser light scattering using nanosite (device name LM10) manufactured by Nanosite. Alternatively, the one measured according to it is used.
  • the values of the ultrafine bubble diameter, the number reference distribution of ultrafine bubbles, and the number of ultrafine bubbles are usually measured immediately after the production of ultrafine bubble water or the like, or may be measured after long-term storage.
  • the ultrafine bubble water The value may be a value obtained by measuring the ultrafine bubble diameter, the ultrafine bubble number reference distribution, and the number of ultrafine bubbles immediately before use after sealed storage for a certain period of time after production.
  • the "water” containing ultrapure water (and the “water” used for the “water solution” containing ultrapure water) is not particularly limited, and for example, tap water, deionized water, distilled water, and sterilization. Distilled water, purified water for injection, ultrapure water and the like can be used, but when used as an injection, sterilized distilled water, purified water for injection and the like are preferable.
  • the "aqueous solution" containing ultrafine bubbles is one or more selected from the above-mentioned anionic surfactants, nonionic surfactants, cationic surfactants and amphoteric surfactants.
  • water further containing any additive commonly used in the pharmaceutical formulation field.
  • additive include electrolytes, excipients, lubricants, binders, disintegrants, solubilizers, suspending agents, dispersants, isotonic agents, soothing agents, preservatives, and the like.
  • antioxidants examples thereof include antioxidants, colorants, sweeteners, pH adjusters, stabilizers, acidulants, flavors, fluidizers and the like.
  • Preferred are pharmacologically acceptable additives, and more preferably one or more additives selected from suspending agents, stabilizers, dispersants, isotonic agents and the like are used. Be done.
  • the above-mentioned additives may be used by mixing two or more kinds in an appropriate ratio.
  • additives one or more surfactants, hydrophilic resins, and buffers selected from anionic surfactants, nonionic surfactants, cationic surfactants and amphoteric surfactants
  • Including can be prepared as an aqueous solution of ultrafine bubbles by dissolving it in water in advance as long as it does not affect the formation and stability of ultrafine bubbles, or ultrafine bubbles in water containing no additives. After producing ultrafine bubble water, the additive may be dissolved to prepare an ultrafine bubble aqueous solution.
  • any of uncharged ultrafine bubble aqueous solution, positively charged ultrafine bubble aqueous solution and negatively charged ultrafine bubble aqueous solution can be used, and the type of target cell, surrounding microenvironment, size of target substance, etc. It can be appropriately selected according to the type and the like.
  • the ultrafine bubble aqueous solution is positively charged ultrafine.
  • a bubble aqueous solution is preferable.
  • the pH of the ultrafine bubble aqueous solution is preferably 1 to 4, for example.
  • the target substance is a protein having a large molecular weight (for example, a molecular weight of 25 kDa or more)
  • a positively charged ultrafine bubble aqueous solution in the method of delivering the target substance into non-immune cells using the ultrafine bubble aqueous solution and ultrasonic waves of the present invention, if the molecular weight of the target substance is not large (for example, the molecular weight is less than 25 kDa), the ultrafine bubble aqueous solution may be used. Both positively charged ultrafine bubble aqueous solution and negatively charged ultrafine bubble aqueous solution can be used.
  • the charge of the ultrafine bubble aqueous solution can be appropriately adjusted by, for example, the pH of the buffer solution used.
  • the pH of the ultrafine bubble aqueous solution is preferably 1 to 4, for example.
  • the pH of the ultrafine bubble aqueous solution is preferably 7 to 14, for example.
  • the microbubbles As a method for producing ultrafine bubble water, after microbubbles (gas particles having a diameter of about 1 to 60 ⁇ m) and ultrafine bubbles are simultaneously generated in water, the microbubbles are levitated and separated to produce only ultrafine bubbles. It is roughly divided into a method of leaving it and a method of directly generating ultrafine bubbles, but at present, the former is the mainstream.
  • the former method is a high-speed swirling liquid flow method in which a gas is crushed by high-speed swirling to generate a large number of microbubbles, and the microbubbles are floated and separated to leave ultrafine bubbles in water.
  • the gas is pressurized and dissolved by supersaturation.
  • a pressure dissolution type is preferably used as a method for producing ultrafine bubble water or an ultrafine bubble aqueous solution in the present invention.
  • steps 1) to 3) can be mentioned; 1) in a pressurized container pressurized to about 0.2 to 0.5 MPa by a pressurizing pump, (i) anionic surfactant, non-anionic surfactant.
  • Examples of the ultrafine bubble generator used for producing the ultrafine bubble water or the ultrafine bubble aqueous solution in the present invention include a pressure dissolution type apparatus (eg, nanoGALF TM manufactured by IDEC, OM4-MD5-045 manufactured by Aura Tech). , Nikuni's micro-bubble generator, etc.), high-speed swirling liquid flow type device (eg, B-Clean's YJ, Aqua Air's micro-bubble generator, Royal Electric's micro blade, etc.) and the like.
  • the ultrafine bubble generator is preferably a pressure melting type device (eg, nanoGALF TM manufactured by IDEC Corporation).
  • one or more interfaces selected from anionic surfactants, nonionic surfactants, cationic surfactants and amphoteric surfactants for the production of ultrafine bubble water or ultrafine bubble aqueous solution.
  • an activator a hydrophilic resin and / or a buffer solution, the number of ultrafine bubbles in the ultrafine bubble water or the ultrafine bubble aqueous solution can be increased.
  • One or more surfactants, hydrophilic resins and / or buffers selected from anionic surfactants, nonionic surfactants, cationic surfactants and amphoteric surfactants used in the present invention are used in the present invention.
  • the content of water in water is not particularly limited.
  • the upper limit is preferably 50% (W / V) or less, more preferably 20% (W / V) or less, and further preferably 10% (W / V) or less.
  • the lower limit is preferably 0.01% (W / V) or more, more preferably 0.05% (W / V) or more, and further preferably 0.1% (W / V) or more.
  • (W / V) is assumed to mean g / mL.
  • the ultrafine bubble water, etc. in the present invention produced as described above is sealed and stored in a vial or ampoule. Storage is preferably performed under light-shielded conditions.
  • the storage temperature is preferably room temperature or lower, more preferably 10 ° C. or lower.
  • the ultrafine bubble water or ultrafine bubble aqueous solution in the present invention preferably has one or more interfaces selected from anionic surfactants, nonionic surfactants, cationic surfactants and amphoteric surfactants. Since it is produced in the presence of an activator, a hydrophilic resin and / or a buffer solution, the action and effect of ultrafine bubble water or the like in the present invention (for example, non-immunity when ultrafine bubble water or the like and ultrasonic treatment are used in combination).
  • the period required to maintain the cell membrane perforation effect of cells, the effect of increasing the deliverability of the target substance into non-immune cells by using ultrafine bubble water or the like and ultrasonic waves (for example, the cell membrane) When used as a base for a substance of interest that is desired to pass through and be delivered, its shelf life (eg, 3 months or longer, more preferably 6 months or longer, even more preferably 1 year or longer), ultrafine bubbles.
  • the number of ultrafine bubbles such as water can be maintained at 1.0 ⁇ 10 8 cells / mL or more.
  • Ultra-fine bubble water or the like in the present invention can perform heat sterilization, after heat sterilization even number ultra-fine bubbles can be maintained above 1.0 ⁇ 10 8 cells / mL.
  • the ultrafine bubble water or the like in the present invention When the ultrafine bubble water or the like in the present invention has an ultrafine bubble number of 1.0 ⁇ 10 8 cells / mL or more, it exhibits an excellent antibacterial action and a storage effect due to the excellent antibacterial action.
  • Multiple doses of liquid pharmaceutical preparations such as injections (eg, subcutaneous injections, intravenous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections, infusions, intracerebral injections, intracranial spinal fluid) It is also useful as a base for administered injections, intramuscular injections, etc.).
  • the ultrafine bubble water or the like in the present invention is preferably one or more surfactants (preferably) selected from anionic surfactants, nonionic surfactants, cationic surfactants and amphoteric surfactants.
  • surfactants preferably selected from anionic surfactants, nonionic surfactants, cationic surfactants and amphoteric surfactants.
  • anionic surfactants preferably nonionic surfactants
  • nonionic surfactants cationic surfactants
  • amphoteric surfactants preferably one or more surfactants selected from anionic surfactants, nonionic surfactants, cationic surfactants and amphoteric surfactants.
  • the "ultrasonic generator” used in the system of the present invention is super-conditions sufficient to deliver the target substance into non-immune cells when used in combination with the ultrafine bubble water or the like in the present invention. Anything can be used as long as it can generate ultrasonic waves.
  • any device conventionally used for ultrasonic diagnosis in the medical field a commercially available ultrasonic gene transfer device (eg, Sonicron GTS (manufactured by Neppagene), etc.) can be appropriately used.
  • the output intensity of ultrasonic waves is 10 mW or more, preferably. 30 mW or more, more preferably 50 mW or more (eg, 100 mW or more, 150 mW or more, 200 mW or more, etc.).
  • the upper limit of the output intensity is not particularly limited, but considering that the system of the present invention aims at in vivo delivery of the target substance into target cells in mammals including humans, it adversely affects animals ( For example, it is preferable to set the upper limit to a range that does not affect cytotoxicity).
  • the upper limit of the ultrasonic output intensity in the system of the present invention is preferably 720 mW / cm 2 .
  • the output intensity is 500 mW / cm 2 or less (e.g., 450 mW / cm 2 or less, 400 mW / cm 2 or less, 300 mW / cm 2 or less, etc.) may be.
  • the output intensity of the ultrasonic wave 50 ⁇ 720mW / cm 2, more preferably 50 ⁇ 500mW / cm 2, more preferably from 55 ⁇ 450mW / cm 2.
  • the output intensity of the ultrasound used for conventional gene transfer significantly exceeds the above criteria for ultrasound diagnostic applications (eg, 1.5-2.5 W / cm 2 ) and is a safety risk.
  • the target substance can be efficiently delivered into non-immune cells with a small output intensity (preferably 50 to 500 mW / cm 2 ) regardless of the molecular weight of the target substance, which is extremely high. It is a secure delivery system.
  • the condition of the "ultrasonic wave generator" in the present invention is not particularly limited to the frequency of the ultrasonic wave, and can be appropriately selected within the range of, for example, 0.5 to 10 MHz.
  • the frequency widely adopted at present is about 1 MHz, but since it is considered that the higher frequency has less adverse effect on the living body, it is preferably 1 to 5 MHz, more preferably 1 to 3 MHz, and further preferably 1 to 1. It can be appropriately selected within the range of 2.5 MHz.
  • the irradiation time of ultrasonic waves is not particularly limited as long as it is sufficient to deliver the target substance into non-immune cells, and the output intensity of ultrasonic waves is not particularly limited. However, for example, even if the output intensity is 50 mW / cm 2 , the target substance can be delivered into non-immune cells with an irradiation time of 10 seconds.
  • the ultrasonic irradiation time may be, for example, 1 to 60 seconds, preferably 1 to 30 seconds, more preferably 1 to 20 seconds, and further preferably 1 to 10 seconds.
  • the conditions for using the "ultrasonic wave generator” in the present invention include, for example, (i) ultrasonic wave output intensity of 50 to 720 mW / cm 2 (preferably 50 to 500 mW / cm 2 ), (ii) ultrasonic wave.
  • Examples thereof include a combination of a frequency of 0.5 to 10 MHz and an irradiation time of (iii) ultrasonic waves of 1 to 60 seconds.
  • a combination of (i) an ultrasonic output intensity of 50 to 500 mW / cm 2 , (ii) an ultrasonic frequency of 1 to 5 MHz, and (iii) an ultrasonic irradiation time of 1 to 60 seconds is preferable.
  • the output intensity of the ultrasonic wave is 55 to 450 mW / cm 2
  • the frequency of the ultrasonic wave is 1 to 2.5 MHz
  • the irradiation time of the ultrasonic wave is 1 to 10 seconds. Combinations and the like can be mentioned.
  • the system of the present invention When the system of the present invention is used for transfection of non-immune cells isolated from animals, it may include the step of culturing the non-immune cells after the transfection treatment. Therefore, the system of the present invention may further include means for culturing non-immune cells (eg, culture vessel (eg, dish, flask, etc.), medium, culturing device (eg, CO 2 incubator, etc.)). The above-mentioned culturing step also includes a subculture step. When cells are subcultured by the system of the present invention, the expression intensity of the target substance introduced into the cells can be maintained.
  • culture vessel eg, dish, flask, etc.
  • medium culturing device
  • the present invention also uses ultrafine bubble water or an ultrafine bubble aqueous solution containing ultrafine bubbles containing no phospholipid having an average diameter of 200 nm or less, and ultrasonic waves to produce nucleic acids and proteins.
  • a method for increasing the non-immune intracellular deliverability of a low molecular weight compound (hereinafter, also referred to as “method for increasing the deliverability of the present invention”) is also provided.
  • the method comprises administering the ultrafine bubble water or the like of the present invention to a subject to deliver it in the vicinity of non-immune cells, and irradiating the non-immune cells with ultrasonic waves, whereby nucleic acid, protein or Low molecular weight compounds are delivered into non-immune cells.
  • non-immune cell is synonymous with that defined in the system of the present invention.
  • the ultrafine bubble water or the ultrafine bubble aqueous solution used in the "method for increasing the deliverability of the present invention the above-mentioned ultrafine bubble water or the like in the present invention can be used. Further, the ultrasonic irradiation in the "method for increasing the deliverability of the present invention” can be carried out under the same conditions as the use of the ultrasonic wave generator in the system of the present invention described above.
  • Nucleic acids, proteins or low molecular weight compounds whose deliverability is enhanced by the method for increasing serviceability of the present invention are not particularly limited, but for example, physiology preferable to cells by being delivered into non-immune cells. It can be a substance that can impart activity.
  • nucleic acids include siRNA (eg, FAM-siRNA, manufactured by Nippon Gene), ssRNA, shRNA, miRNA, small RNA / DNA such as S-oligoDNA (phosphorothioate, etc.), genes (eg, plasmid DNA, mRNA, etc.). Can be mentioned.
  • examples of the protein include antibodies (eg, IgG (eg, Alexa-IgG, manufactured by Invitrogen)), peptides and the like.
  • examples of the low molecular weight compound include, but are not limited to, known or novel pharmaceutical compounds, fluorescent substances such as fluorescein and sodium fluorescein.
  • the nucleic acid includes small RNA / DNA such as siRNA and antisense oligonucleic acid
  • the protein includes an antibody and the like
  • the low molecular weight compound includes a pharmaceutical compound and a fluorescent dye.
  • the number of nucleotides in the nucleic acid and the molecular weight of the protein are not particularly limited.
  • nucleic acid small RNA / DNA such as siRNA or antisense oligonucleic acid
  • 10 mer to 30 mer preferably 15 mer to 25 mer
  • protein for example, 25 kDa to 900 kDa, preferably 25 kDa to 320 kDa can be mentioned.
  • the present invention also comprises combining nucleic acids, proteins or low molecular weight compounds with ultrafine bubble water or ultrafine bubble aqueous solutions containing ultrafine bubbles containing no phospholipids having an average diameter of 200 nm or less.
  • a preparation hereinafter, also referred to as “the preparation of the present invention”
  • non-immune cell is synonymous with that defined in the system of the present invention.
  • the nucleic acid, protein or low molecular weight compound can be the nucleic acid, protein or low molecular weight compound exemplified in the above-mentioned "method for increasing deliverability of the present invention".
  • the ultrafine bubble water or the ultrafine bubble aqueous solution in the preparation of the present invention the ultrafine bubble water or the ultrafine bubble aqueous solution described in the above-mentioned "system of the present invention" is used.
  • the nucleic acid, protein or low molecular weight compound may be mixed with the ultrafine bubble water or the like in the present invention and administered to the subject as a single preparation, or both may be simultaneously administered to non-immune cells. As long as they can coexist in the vicinity, each may be formulated separately and administered simultaneously or at different time intervals by the same or different routes.
  • the nucleic acid, protein or low molecular weight compound may be provided with a pharmaceutically acceptable carrier by humans or other mammals. It can be blended in an acceptable amount.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include pH adjusters such as monosodium phosphate, dipotassium phosphate, disodium phosphate, monopotassium phosphate, sodium hydroxide, and hydrochloric acid; canamycin sulfate, erythromycin lactobionate, penicillin G potassium, etc.
  • Antibiotics stabilizers such as lactose, potassium glutamate, D-sorbitol, aminoacetic acid, human serum albumin; colorants such as phenol red; isotonic agents such as sodium chloride and potassium chloride.
  • the content of nucleic acid, protein or low molecular weight compound in the preparation of the present invention is an amount capable of imparting preferable physical properties such as desired physiological activity to non-immune cells when they are delivered into non-immune cells by ultrasonic irradiation. If it is, there is no particular limitation, but it may be, for example, 0.0001 mg to 1000 mg, preferably 0.001 to 10 mg. On the other hand, the amount of ultrafine bubble water or the like is not particularly limited as long as it is sufficient to deliver nucleic acid, protein or low molecular weight compound into non-immune cells by ultrasonic irradiation, but for example, non-immune cells.
  • ultra-fine bubble density 1 ⁇ 10 8 ⁇ 10 ⁇ 10 8 cells / mL in the vicinity, there preferably such that 2 ⁇ 10 8 ⁇ 5 ⁇ 10 8 cells / mL, in an amount capable of delivering ultra-fine bubbles Just do it.
  • the present invention also provides a method of delivering a nucleic acid or protein into the cell, which comprises contacting a non-immune cell with the above-mentioned preparation of the present invention and treating with ultrasonic waves.
  • non-immune cell is synonymous with that defined in the system of the present invention.
  • the "delivery method of the present invention” and the “delivery method of the present invention” can be applied to non-immune cells (eg, nerve cells (including brain nerve cells), skeletal muscle cells, endothelial cells) collected from a living body.
  • non-immune cells eg, nerve cells (including brain nerve cells), skeletal muscle cells, endothelial cells
  • tissue stem cells, embryos and other pluripotent or pluripotent stem cells eg, iPS cells, ES cells,
  • Examples include non-immune cells or tissues containing them.
  • the means for administering the ultrafine bubble water or the like in the present invention to the subject is not particularly limited as long as it is an administration route capable of delivering the ultrafine bubbles in the vicinity of non-immune cells.
  • the ex vivo non-immune cells and the in vivo non-immune cells will be described separately.
  • the nucleic acid, protein or low molecular weight compound is delivered into ex vivo non-immune cells by combining the ultrafine bubble water or the like in the present invention with ultrasonic waves.
  • Ex vivo non-immune cells to which favorable physical properties such as physiological activity are imparted by the action of a low molecular weight compound can be produced.
  • Ex vivo non-immune cells can be collected from tissues / organs containing the cells of humans or non-human mammals.
  • ex vivo non-immune cells eg, ex vivo skeletal muscle cells, ex vivo nerve cells
  • the cell population is the subject to be treated or It is preferred to collect from donors that match the MHC type to be treated.
  • the ex vivo non-immune cells may be undifferentiated cells such as pluripotent stem cells and tissue stem cells other than the immune system.
  • undifferentiated cells such as pluripotent stem cells and tissue stem cells other than the immune system.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • EC cells embryonic tumor cells
  • EG cells embryonic germ stem cells
  • nerve stem cells Examples include skeletal muscle precursor cells.
  • Undifferentiated cells such as pluripotent stem cells can be differentiated into various non-immune cells such as skeletal muscle cells and nerve cells by a method known per se.
  • the method for contacting the preparation of the present invention with ex vivo non-immune cells is not particularly limited, and for example, the preparation of the present invention may be added to a medium of ordinary non-immune cells.
  • Ultrasound irradiation can be performed on ex vivo non-immune cells using the ultrasonic generator and irradiation conditions described in the system of the present invention.
  • the preparation of the present invention can be used in mammals (humans or other mammals (eg, mice, rats, hamsters, rabbits, cats, dogs, cows, sheep, monkeys), preferably humans. ), And by irradiating tissues / organs (eg, skeletal muscle, brain, etc.) containing non-immune cells with ultrasonic waves, inside the non-immune cells (eg, skeletal muscle cells, nerve cells, etc.) in the mammal. Nucleic acids, proteins or low molecular weight compounds are introduced into the cells, and the effects of these target substances are exhibited.
  • mammals humans or other mammals (eg, mice, rats, hamsters, rabbits, cats, dogs, cows, sheep, monkeys), preferably humans. )
  • tissues / organs eg, skeletal muscle, brain, etc.
  • non-immune cells eg, skeletal muscle cells, nerve cells, etc.
  • Nucleic acids, proteins or low molecular weight compounds are introduced into the cells, and
  • an antisense nucleic acid capable of skipping a mutation that causes MDS is delivered into in vivo skeletal muscle cells of a muscular dystrophy (MDS) patient, and by expressing it in the cells, cytotoxicity is reduced and the disease is concerned. Can exert a therapeutic effect on.
  • MDS muscular dystrophy
  • the preparation of the present invention is, for example, in the form of an injection, in vivo non-immune cells by subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, infusion, intracerebral injection, cerebrospinal fluid injection, intraocular injection, etc.
  • Nucleic acid, protein or low molecular weight compound and ultrafine bubble water or the like can be delivered in the vicinity of.
  • the operation conventionally used for ultrasonic diagnosis may be performed by replacing the target site with a tissue / organ containing in vivo non-immune cells.
  • a mixture of ultrafine bubbles having different average diameters is administered to combine multiple ultrasonic waves of different frequencies or output intensities to create a multi-step cell membrane barrier of nucleic acids, proteins or low molecular weight compounds. It can also be passed through and delivered sequentially into the target non-immune cells.
  • the "method for increasing the deliverability of the present invention” and the “method for delivering the present invention” are subjected to a method known per se from exvivo non-immune cells, that is, non-immune cells isolated from animals, or stem cells such as iPS cells.
  • a method known per se from exvivo non-immune cells, that is, non-immune cells isolated from animals, or stem cells such as iPS cells.
  • it may include a step of culturing the non-immune cells after transfection treatment.
  • a culture vessel eg, dish, flask, etc.
  • a culture device eg, CO 2 incubator, etc.
  • the present invention can be carried out in a medium usually used for inducing differentiation of.
  • transfection in the present invention is performed on non-immune cells (including pluripotent stem cells and tissue stems / progenitor cells other than the immune system)
  • the present invention induces differentiation from non-immune cells after transfection. Or it does not preclude the induction of immune cells by direct reprogramming.
  • the above-mentioned culturing step also includes a subculture step. When cells are subcultured according to the "method for increasing deliverability of the present invention" and the "method for increasing deliverability of the present invention", the expression intensity of the target substance introduced into the cells can be maintained.
  • the ex vivo non-immune cells into which the target substance has been introduced using the system of the present invention and by the delivery method of the present invention are the target substance. Since the action produces the desired effect (eg, it acquires new physiological activity), it can be used as is or as known pharmaceutically acceptable carriers (excipients, diluents, bulking agents, binders, slippers). It can be prepared as a pharmaceutical composition by mixing it with a swamp, a fluidizing aid, a disintegrant, a surfactant, etc.) or a conventional additive.
  • Excipients are well known to those of skill in the art, and auxiliary agents such as wetting agents or emulsifiers, and pH buffering agents can also be used. Further, formulation aids such as suspending agents, preservatives, stabilizers and dispersants may be used.
  • the pharmaceutical composition may be in a dry form for reconstitution with a suitable sterile liquid before use.
  • the pharmaceutical composition is prepared in the form of preparation (tablets, pills, capsules, powders, granules, syrups, emulsions, suspensions and other oral administrations; injections, infusions, external preparations, suppositories and the like. Oral administration or parenteral administration can be performed systemically or locally depending on the parenteral administration agent) and the like.
  • intravenous administration In the case of parenteral administration, intravenous administration, intradermal administration, subcutaneous administration, rectal administration, transdermal administration and the like are possible.
  • an acceptable buffer, solubilizing agent, isotonic agent and the like When used in the injection form, an acceptable buffer, solubilizing agent, isotonic agent and the like can be added.
  • the medicine containing ex vivo non-immune cells into which the target substance has been introduced according to the present invention can be a preventive / therapeutic agent for various diseases, and examples of the target diseases include cancer and hereditary diseases.
  • the target substance is an antisense nucleic acid capable of skipping the mutation causing MDS
  • the expression of the highly cytotoxic splicing variant is suppressed in the ex vivo skeletal muscle cells into which the target substance is introduced and expressed. Cytotoxicity can be reduced.
  • the medicament containing ex vivo non-immune cells into which the target substance has been introduced according to the present invention includes humans or other mammals (eg, mice, rats, hamsters, rabbits, cats, dogs, cows, sheep, monkeys), preferably humans. Can be safely administered to.
  • the drug containing ex vivo non-immune cells into which the target substance has been introduced according to the present invention is preferably administered parenterally to a subject for use.
  • Parenteral administration methods include intravenous, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal, and subcutaneous administration.
  • the dose is appropriately selected according to the condition, body weight, age, etc. of the subject, but the number of cells is usually 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 10 per administration for a subject having a body weight of 60 kg.
  • it is preferably administered so as to be 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 9 and more preferably 5 ⁇ 10 7 to 5 ⁇ 10 8 . Further, it may be administered once or may be administered multiple times.
  • Example 1 Introduction of siRNA into skeletal muscle cells C 2 C 12 cells (3 ⁇ 10 4 cells, 0.5 mL) in DMEM medium containing 10% FBS was inoculated into 48 wells. After removing the medium, 0.5 mL of ultrafine bubble / DMEM medium containing 5 ⁇ g of FAM fluorescently labeled siRNA (FAM-siRNA) was added. As the ultrafine bubble / DMEM medium, 1 L of the ultrafine bubble aqueous solution prepared in Reference Example 1 was added to the DMEM medium powder, and 2 g / L NaHCO 3 and 10% FBS were added, which was used as the transfection medium. ..
  • FAM-siRNA FAM fluorescently labeled siRNA
  • Example 2 Comparative introduction with microbubbles C 2 C 12 cells (3 ⁇ 10 4 cells, 0.5 mL) in DMEM medium containing 10% FBS were seeded in 48 wells. After removing the medium, 0.5 mL of ultrafine bubble / DMEM medium or microbubble / DMEM medium containing 5 ⁇ g of FAM fluorescently labeled siRNA (FAM-siRNA) was added. For ultrafine bubble / DMEM medium and microbubble / DMEM medium, add 1 L of the ultrafine bubble aqueous solution prepared in Reference Example 1 or commercially available microbubble water to the powder for DMEM medium, and add 2 g / L NaHCO 3 and 10% FBS. Was used as a medium for transfection.
  • FAM-siRNA FAM fluorescently labeled siRNA
  • phosphatidylserine which is a phospholipid, as a constituent was used.
  • ultrasonic irradiation was performed for 10 sec at a frequency of 1 MHz and an output intensity of 500 mW / cm 2 using an ultrasonic generator (NEPAGENE). After ultrasonic irradiation, the cells were cultured for 2 hours, then the transfection medium was removed, and the cells were cultured in DMEM medium (culture medium) for 48 hours.
  • Example 3 Protein introduction into skeletal muscle cells C 2 C 12 cells (6 ⁇ 10 4 cells, 1 mL) in DMEM medium containing 10% FBS was seeded at 48 wells. After removing the medium, 1 mL of a 100-fold diluted solution of IgG-FITC in ultrafine bubble / DMEM medium was added. As the ultrafine bubble / DMEM medium, 1 L of the ultrafine bubble aqueous solution prepared in Reference Example 1 was added to DMEM medium powder, and 2 g / L NaHCO 3 and 10% FBS were added, which was used as the transfection medium.
  • ultrasonic irradiation was performed for 10 seconds at an output intensity of 500 mW / cm 2 and a frequency of 0.5 MHz or 3 MHz using an ultrasonic generator (NEPAGENE).
  • the cells were cultured for 2 hours, then the transfection medium was removed, and the cells were cultured in DMEM medium (culture medium) for 48 hours.
  • the amount of fluorescence of IgG-FITC was measured with a spectrofluorometer. The number of viable cells was also measured, converted into the amount of fluorescence per viable cell, and compared. The results are shown in FIG.
  • the efficiency of introducing IgG-FITC into cells was significantly increased. In the range examined, the frequency of the ultrasonic waves did not affect the introduction efficiency.
  • Example 4 Introduction of low molecular weight compound into skeletal muscle cells C 2 C 12 cells (3 ⁇ 10 4 cells, 0.5 mL) in DMEM medium containing 10% FBS was inoculated into 48 wells. After removing the medium, 0.5 mL of ultrafine bubble / DMEM medium containing 0.38 ⁇ g of FITC was added. As the ultrafine bubble / DMEM medium, 1 L of the ultrafine bubble aqueous solution prepared in Reference Example 1 was added to DMEM medium powder, and 2 g / L NaHCO 3 and 10% FBS were added, which was used as the transfection medium.
  • ultrasonic irradiation was performed for 10 seconds at a frequency of 1 MHz and an output intensity of 100,250,500 mW / cm 2 using an ultrasonic generator (NEPAGENE).
  • the cells were cultured for 2 hours, then the transfection medium was removed, and the cells were cultured in DMEM medium (culture medium) for 48 hours. After completion of the culture, the cells were collected and completely dissolved in 0.5 mL of the cell lysate, and then the fluorescence amount of FITC was measured with a spectrofluorometer.
  • the FITC uptake amount was evaluated as a relative amount by proportional calculation with the measured value of Control (ultra fine bubble only) as 1.
  • FIG. 4 shows the results of a negatively charged ultrafine bubble (manufactured using water for injection), but in the case of a low molecular weight compound, a positively charged ultrafine bubble (diluted Mclivine buffer solution) is shown. The same effect can be obtained with (manufactured using (pH 3.0)).
  • the system of the present invention can efficiently deliver a target substance such as a nucleic acid, a protein or a low molecular weight compound into a non-immune cell by irradiating ultrasonic waves with a low output intensity, and thus is highly safe non-immune.
  • An intracellular drug delivery system can be provided.
  • the efficiency of introducing the target substance into the cell can be significantly increased by using the ultrafine bubble as compared with the case of using the conventional microbubble.
  • liposomes since it is not necessary to use liposomes, it can be manufactured at low cost and is highly safe. From the above, the system of the present invention is extremely useful as a novel DDS into non-immune cells.

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Abstract

本発明は、核酸やタンパク質等の目的物質を、安全かつ効率的に細胞（免疫細胞を除く）内に導入する新規な手段を提供する。具体的には、平均径が２００ｎｍ以下であるリン脂質を含まないウルトラファインバブルを含むウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液と、超音波発生装置とを組み合わせてなる、細胞（免疫細胞を除く）内への目的物質の送達システム；該ウルトラファインバブル水等と、超音波とを用いて、核酸、タンパク質または低分子化合物の細胞（免疫細胞を除く）内送達性を増大させる方法等が提供される。

Description

トランスフェクション方法
　本発明は、ウルトラファインバブルを含むウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液と、超音波発生装置とを組み合わせてなる、細胞（免疫細胞を除く）内への目的物質の送達システム、該ウルトラファインバブル水もしくは水溶液と、超音波とを用いて、核酸、タンパク質または低分子化合物の細胞（免疫細胞を除く）内送達性を増大させる方法、核酸、タンパク質または低分子化合物と、該ウルトラファインバブル水もしくは水溶液とを組み合わせてなる、超音波照射との併用により該核酸、タンパク質または低分子化合物を細胞（免疫細胞を除く）内に送達させるための製剤、並びに、細胞（免疫細胞を除く）を該製剤と接触させ、超音波で処理することによる該細胞内への核酸、タンパク質または低分子化合物の送達方法等に関する。
（発明の背景）
　超音波は、医療現場において主に超音波造影装置として利用されてきた。超音波造影剤であるマイクロバブルが超音波診断に画期的な進歩をもたらしている。一方、最近では、超音波を診断以外にも利用できるようになり、例えば、超音波エネルギーを患部に集束させて患部のみを加熱することによる非侵襲的がん温熱療法が、子宮筋腫や前立腺がんで臨床応用されている。また、非侵襲性と空間的・時間的制御が容易であることに着目して、超音波照射を、遺伝子や薬物を目的細胞に送達させるドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の手段として利用する研究（ソノポレーション）も進められている。
　これまでに、バブルリポソームと超音波技術を融合した骨格筋への遺伝子デリバリーシステムとして、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リポソームに、パーフルオロプロパンを封入したバブルリポソームが報告されている（非特許文献１）。また、特定のモルフォリノオリゴマーを表面に結合させ、内部にパーフルオロ炭化水素を封入した、平均粒子径５０～５００ｎｍのＰＥＧ修飾バブルリポソーム（バブルリポポリプレックス）を筋組織内または血管内に投与後、体外から筋組織に超音波照射することにより、筋細胞に該モルフォリノオリゴマーを高効率で導入させるデュシェンヌ型筋ジストロフィー治療薬も報告されている（特許文献１）。さらに、脳への薬物や遺伝子送達のために、ガス封入マイクロバブルおよび超音波が利用されうることも報告されている（非特許文献２）。
　封入ガスとしてパーフルオロプロパンガスを用いることで、パーフルオロブタンガスまたは窒素ガスを用いたものよりも小さいサイズのバブルリポソームが得られるとの報告がある（非特許文献３）。また、ｄｄＹマウスに、ナノバブルとプラスミドを組み合わせたバブルリポポリプレックスを投与し、脳組織に対して超音波照射を行ったところ、血管内皮または血管外部位にプラスミドが導入され、ガスの封入効率により導入部位が異なることが報告されている（非特許文献４）。
　しかしながら、バブルリポソームの使用は、脂質による抗原性の問題を引き起こす懸念がある。また、超音波照射に１．５～２．５Ｗ／ｃｍ２といった超音波診断用として安全性に懸念がある出力強度が使用されており、実用性の面で問題がある。
　本発明者らは、２．０×１０８個／ｍＬ以上の、リン脂質を含まないナノバブルを含有するナノバブル水が、優れた抗菌作用を有することを明らかにしている（特許文献２）。しかしながら、該ナノバブル水と超音波とを組み合わせて、細胞に核酸やタンパク質等の目的物質を導入したとの報告は皆無である。
ＷＯ２０１２／１５３６３５ ＷＯ２０１５／１８２６４７
ＹＡＫＵＧＡＫＵ　ＺＡＳＳＨＩ　１３０（１１）　１４８９－１４９６　（２０１０） ＮＡＴＵＲＥ　ＲＥＶＩＥＷＳ　１２　１６１－１７４　（２０１６） Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　２４（１）　３２０－３２７　（２０１７） 「超音波応答性ナノバブルによる脳指向ＤＤＳにおける脳内への薬物動態の評価」、渕上由貴ら、長崎大学、日本薬学会第１３７年会発表要旨（２０１７年３月）
　本発明の目的は、核酸やタンパク質等の目的物質を、安全かつ効率的に細胞（免疫細胞を除く）内に導入する新規な手段を提供することである。
　本発明者らは、上記の目的を達成すべく、本発明者らが以前に開発した抗菌作用に優れたナノバブル水（上記特許文献２を参照；尚、ＩＳＯは１μｍ（１０００ｎｍ）未満のバブルを「ウルトラファインバブル」と定義しているため、本明細書では以下、「ナノバブル」でなく、「ウルトラファインバブル」と表記する。）が、リン脂質を含んでいないことに着目した。このウルトラファインバブル水に含まれるウルトラファインバブルは平均径が２００ｎｍ以下と、従来よりもさらに小さな平均径を有している。従来、ウルトラファインバブルは圧壊した際にマイクロバブルと比較して細胞膜の損傷が激しいと考えられていたが、本発明者らは敢えてこのウルトラファインバブル水と超音波照射とを組み合わせて、骨格筋細胞内への核酸及びタンパク質の導入について検討した。その結果、意外にも、該ウルトラファインバブル水と超音波との組み合わせは、いずれかの単独処理よりも飛躍的に核酸の導入効率を増大させ得ることが示された。該導入効率は、従来のマイクロバブルリポソームよりも優れていた。また、超音波処理は、ウルトラファインバブル水単独処理によるタンパク質の導入効率を顕著に増大させ得ること、該ウルトラファインバブル水と超音波との組み合わせによれば、５００ｍＷ／ｃｍ２以下の低出力強度で、効率よくタンパク質を細胞内に導入できることが示された。
　本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、
［１］平均径が２００ｎｍ以下であるリン脂質を含まないウルトラファインバブルを含むウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液と、超音波発生装置とを組み合わせてなる、細胞（免疫細胞を除く）内への目的物質の送達システム；
［２］ウルトラファインバブル水溶液が、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤および両性界面活性剤から選ばれる１種または２種以上の界面活性剤、親水性樹脂、及び緩衝液から選ばれる１または２以上の成分を含む、［１］に記載のシステム；
［３］ウルトラファインバブル水溶液が、非イオン性界面活性剤および／または親水性樹脂とからなる、［１］または［２］に記載のシステム；
［４］ウルトラファインバブルが、パーフルオロ炭化水素または空気で構成される、［１］～［３］のいずれかに記載のシステム；
［５］ウルトラファインバブルの平均径が、５０ｎｍ～２００ｎｍである、［１］～［４］のいずれかに記載のシステム；
［５－１］ウルトラファインバブルの平均径が、７５ｎｍ～１６５ｎｍである、［１］～［４］のいずれかに記載のシステム；
［６］ウルトラファインバブルのｄ９０／ｄ１０比が５以下である、［１］～［５］のいずれかに記載のシステム；
［６－１］ウルトラファインバブルのｄ９０／ｄ１０比が４以下である、［１］～［５－１］のいずれかに記載のシステム；
［７］ウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液におけるウルトラファインバブルの密度が、１．０×１０８個／ｍＬ以上である、［１］～［６－１］のいずれかに記載のシステム；
［７－１］ウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液におけるウルトラファインバブルの密度が、１．０×１０８～２．０×１０９個／ｍＬである、［１］～［６－１］のいずれかに記載のシステム；
［８］超音波発生装置において超音波の出力強度が、７２０ｍＷ／ｃｍ２以下である、［１］～［７－１］のいずれかに記載のシステム；
［９］超音波発生装置において超音波の出力強度が５０～５００ｍＷ／ｃｍ２および超音波の周波数が０．５～１０ＭＨｚである、［１］～［８］のいずれかに記載のシステム；
［１０］目的物質が核酸、タンパク質または低分子化合物である、［１］～［９］のいずれかに記載のシステム；
［１０Ａ］目的物質の核酸の分子量が１０ｍｅｒ～３０ｍｅｒである、［１］～［９］のいずれかに記載のシステム；
［１０Ｂ］目的物質のタンパク質の分子量が２５ｋＤａ～９００ｋＤａである、［１］～［９］のいずれかに記載のシステム；
［１０Ｃ］目的物質の分子量が２５ｋＤａ以上であり、ウルトラファインバブルがプラスチャージである、［１］～［９］のいずれかに記載のシステム；
［１０Ｄ］目的物質の分子量が２５ｋＤａ未満である、［１］～［９］のいずれかに記載のシステム；
［１１］細胞が骨格筋細胞または神経細胞である、［１］～［１０Ｄ］のいずれかに記載のシステム；
［１２］平均径が２００ｎｍ以下であるリン脂質を含まないウルトラファインバブルを含むウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液と、超音波とを用いて、核酸、タンパク質または低分子化合物の細胞（免疫細胞を除く）内送達性を増大させる方法；
［１２－１］ウルトラファインバブル水溶液が、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤および両性界面活性剤から選ばれる１種または２種以上の界面活性剤、親水性樹脂、及び緩衝液から選ばれる１または２以上の成分を含む、［１２］に記載の方法；
［１２－２］ウルトラファインバブル水溶液が、非イオン性界面活性剤および／または親水性樹脂とからなる、［１２］または［１２－１］に記載の方法；
［１２－３］ウルトラファインバブルが、パーフルオロ炭化水素または空気で構成される、［１２］～［１２－２］のいずれかに記載の方法；
［１２－４］ウルトラファインバブルの平均径が、５０ｎｍ～２００ｎｍである、［１２］～［１２－３］のいずれかに記載の方法；
［１２－５］ウルトラファインバブルの平均径が、７５ｎｍ～１６５ｎｍである、［１２］～［１２－３］のいずれかに記載の方法；
［１２－６］ウルトラファインバブルのｄ９０／ｄ１０比が５以下である、［１２］～［１２－５］のいずれかに記載の方法；
［１２－７］ウルトラファインバブルのｄ９０／ｄ１０比が４以下である、［１２］～［１２－５］のいずれかに記載の方法；
［１２－８］ウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液におけるウルトラファインバブルの密度が、１．０×１０８個／ｍＬ以上である、［１２］～［１２－７］のいずれかに記載の方法；
［１２－９］ウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液におけるウルトラファインバブルの密度が、１．０×１０８～２．０×１０９個／ｍＬである、［１２］～［１２－７］のいずれかに記載の方法；
［１２－１０］超音波発生装置において超音波の出力強度が、７２０ｍＷ／ｃｍ２以下である、［１２］～［１２－９］のいずれかに記載の方法；
［１２－１１］超音波発生装置において超音波の出力強度が５０～５００ｍＷ／ｃｍ２および超音波の周波数が０．５～１０ＭＨｚである、［１２］～［１２－９］のいずれかに記載の方法；
［１２－１２］目的物質が核酸、タンパク質または低分子化合物である、［１２］～［１２－１１］のいずれかに記載の方法；
［１２－１２Ａ］目的物質の核酸の分子量が１０ｍｅｒ～３０ｍｅｒである、［１２］～［１２－１１］のいずれかに記載の方法；
［１２－１２Ｂ］目的物質のタンパク質の分子量が２５ｋＤａ～９００ｋＤａである、［１２］～［１２－１１］のいずれかに記載の方法；
［１２－１２Ｃ］目的物質の分子量が２５ｋＤａ以上であり、ウルトラファインバブルがプラスチャージである、［１］～［９］のいずれかに記載の方法；
［１２－１２Ｄ］目的物質の分子量が２５ｋＤａ未満である、［１］～［９］のいずれかに記載の方法；
［１２－１３］細胞が骨格筋細胞または神経細胞である、［１２］～［１２－１２Ｄ］のいずれかに記載の方法；
［１３］核酸、タンパク質または低分子化合物と、平均径が２００ｎｍ以下であるリン脂質を含まないウルトラファインバブルを含むウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液とを組み合わせてなる、該核酸、タンパク質または低分子化合物を細胞（免疫細胞を除く）内に送達させるための製剤であって、超音波照射との併用により有効量の該核酸、タンパク質または低分子化合物が該細胞（免疫細胞を除く）内に送達されることを特徴とする、製剤；
［１３－１］ウルトラファインバブル水溶液が、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤および両性界面活性剤から選ばれる１種または２種以上の界面活性剤、親水性樹脂、及び緩衝液から選ばれる１または２以上の成分を含む、［１３］に記載の製剤；
［１３－２］ウルトラファインバブル水溶液が、非イオン性界面活性剤および／または親水性樹脂とからなる、［１３］または［１３－１］に記載の製剤；
［１３－３］ウルトラファインバブルが、パーフルオロ炭化水素または空気で構成される、［１３］～［１３－２］のいずれかに記載の製剤；
［１３－４］ウルトラファインバブルの平均径が、５０ｎｍ～２００ｎｍである、［１３］～［１３－３］のいずれかに記載の製剤；
［１３－５］ウルトラファインバブルの平均径が、７５ｎｍ～１６５ｎｍである、［１３］～［１３－３］のいずれかに記載の製剤；
［１３－６］ウルトラファインバブルのｄ９０／ｄ１０比が５以下である、［１３］～［１３－５］のいずれかに記載の製剤；
［１３－７］ウルトラファインバブルのｄ９０／ｄ１０比が４以下である、［１３］～［１３－５］のいずれかに記載の製剤；
［１３－８］ウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液におけるウルトラファインバブルの密度が、１．０×１０８個／ｍＬ以上である、［１３］～［１３－７］のいずれかに記載の製剤；
［１３－９］ウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液におけるウルトラファインバブルの密度が、１．０×１０８～２．０×１０９個／ｍＬである、［１３］～［１３－７］のいずれかに記載の製剤；
［１３－１０］超音波発生装置において超音波の出力強度が、７２０ｍＷ／ｃｍ２以下である、［１３］～［１３－９］のいずれかに記載の製剤；
［１３－１１］超音波発生装置において超音波の出力強度が５０～５００ｍＷ／ｃｍ２および超音波の周波数が０．５～１０ＭＨｚである、［１３］～［１３－９］のいずれかに記載の製剤；
［１３－１２］目的物質が核酸、タンパク質または低分子化合物である、［１３］～［１３－１１］のいずれかに記載の製剤；
［１３－１２Ａ］目的物質の核酸の分子量が１０ｍｅｒ～３０ｍｅｒである、［１３］～［１３－１１］のいずれかに記載の製剤；
［１３－１２Ｂ］目的物質のタンパク質の分子量が２５ｋＤａ～９００ｋＤａである、［１３］～［１３－１１］のいずれかに記載の製剤；
［１３－１２Ｃ］目的物質の分子量が２５ｋＤａ以上であり、ウルトラファインバブルがプラスチャージである、［１］～［９］のいずれかに記載の製剤；
［１３－１２Ｄ］目的物質の分子量が２５ｋＤａ未満である、［１］～［９］のいずれかに記載の製剤；
［１３－１３］細胞が骨格筋細胞または神経細胞である、［１３］～［１３－１２Ｄ］のいずれかに記載の製剤；
［１４］細胞（免疫細胞を除く）を、［１３］～［１３－１３］のいずれかにに記載の製剤と接触さ、超音波で処理することを含む、該細胞（免疫細胞を除く）内への核酸、タンパク質または低分子化合物の送達方法；
［１５］細胞（免疫細胞を除く）培養工程を含む、［１］～［１１］のいずれかに記載のシステム；
［１６］マイナス１０度～５０度の温度で実施される、［１］～［１１］、［１５］のいずれかに記載のシステム、［１２］～［１２－１３］のいずれかに記載の方法、または［１４］に記載の送達方法；
［１７］０－８０歳の患者に投与される、［１３］～［１３－１３］のいずれかに記載の製剤；
［１８］疾患の治療用医薬である、［１３］～［１３－１３］のいずれかに記載の製剤；
等に関する。
　本発明の細胞（免疫細胞を除く）内への目的物質の送達システムによれば、生体に悪影響を及ぼさない程度の出力強度の超音波を照射することで、非侵襲的に核酸、タンパク質、低分子化合物等の目的物質を細胞（免疫細胞を除く）内に選択的に導入することができるので、安全性の高い導入系が提供され得る。該システムでは、リポソームを用いる必要がないため、リン脂質のような特殊な添加剤を配合する必要がなく、安価に製造可能であり、かつ、リン脂質による抗原性の問題が生じない。
　また、従来ウルトラファインバブルは圧壊した際にマイクロバブルと比較して細胞膜の損傷が激しく、細胞のトランスフェクションには不向きと考えられていたが、意外にも、本発明によれば、ウルトラファインバブルを使用することにより、マイクロバブルを使用した場合と比較し、細胞内への目的物質の導入効率を顕著に増大させることができる。
　さらに、該平均径２００ｎｍ以下のウルトラファインバブルはウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液内で長期間安定である。
ウルトラファインバブル水溶液と超音波とを組み合わせることにより、骨格筋細胞へのｓｉＲＮＡの導入効率が改善したことを示す図である。（Ａ）蛍光顕微鏡下でのＦＡＭ蛍光の観察像を示す。核をＤＡＰＩで染色した。（Ｂ）ＦＡＭ蛍光の相対強度を示す。 超音波と組み合わせた場合の、ウルトラファインバブル水溶液と従来のマイクロバブルリポソーム（ソナゾイド）とのｓｉＲＮＡの導入効率を比較した結果を示す図である。 ウルトラファインバブル水溶液と超音波とを組み合わせることにより、骨格筋細胞へのＩｇＧ－ＦＩＴＣの導入効率が改善したことを示す図である。Ａｎ：マイナスチャージのウルトラファインバブルＣａｔ：プラスチャージのウルトラファインバブル ウルトラファインバブル水溶液と種々の出力強度の超音波とを組み合わせることにより、骨格筋細胞へのＦＩＴＣの導入効率を比較した結果を示す図である。グラフ横軸の上段は、超音波の有無および出力強度を示し、下段は、ウルトラファインバブルの有無を示す。
（発明の詳細な説明）
Ｉ．本発明のシステム
　本発明は、平均径が２００ｎｍ以下であるリン脂質を含まないウルトラファインバブルを含むウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液と、超音波発生装置とを組み合わせてなる、細胞（免疫細胞を除く）内への目的物質の送達システム（以下、「本発明のシステム」ともいう）を提供する。
　本明細書において「細胞（免疫細胞を除く）内への目的物質の送達」とは、本来細胞膜を通過することが困難な物質（例えば、水溶性で受動拡散しにくい化合物、分子量が大きい化合物、選択的なトランスポーターや受容体を持たない化合物）が、細胞膜を通過して細胞内に移行することを意味する。従って、本発明のシステムは、いかなるメカニズムによって目的物質を細胞内に送達させるものであってもよく、例えば、細胞膜に一時的に孔を開けること等が挙げられるが、それに限定されない。
　本発明のシステムが適用される「細胞（免疫細胞を除く）（以下、「非免疫細胞」ともいう。）」としては、免疫細胞（例、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞等のリンパ球、好中球、好酸球、好塩基球等の顆粒球、単球、マクロファージ、樹状細胞等、あるいは、それらに最終分化し得る単能性もしくは多分化能を有する幹細胞または前駆細胞（但し、胚および他の全能性または多能性幹細胞を除く。））以外の細胞であれば特に制限はないが、例えば、神経細胞(脳神経細胞を含む）、骨格筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、中皮細胞、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、腱細胞、眼細胞、免疫系を除く主要な腺または器官（例えば、精巣、肝臓、肺、心臓、胃、膵臓、腎臓、および皮膚等）の細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、繊維芽細胞、島細胞、ニューロンおよび他の神経組織由来の細胞、上記いずれかの細胞に分化し得る、単能性もしくは多分化能を有する前駆細胞および組織幹細胞、胚および他の全能性または多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、ＥＳ様細胞、および胚性生殖細胞等）、ならびにその他細胞［上皮系細胞、間葉系細胞、および高純度間葉系幹細胞（Ｒａｐｉｄｌｙ　Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ　Ｃｅｌｌｓ：ＲＥＣ）］等を挙げることができる。好ましくは、骨格筋細胞、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、腎細胞、膵細胞であり、より好ましくは、骨格筋細胞または神経細胞である。
　本発明のシステムを用いて非免疫細胞内に送達される目的物質は、該細胞内に送達されることによって、該細胞に好ましい生理活性を付与し得る物質であれば特に制限はなく、例えば、高分子化合物〔例えば、核酸、例えば、ｓｉＲＮＡ（例、ＦＡＭ－ｓｉＲＮＡ、ニッポンジーン製）、ｓｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、Ｓ化オリゴＤＮＡ（ホスホロチオエート等）などの小ＲＮＡ／ＤＮＡ、遺伝子（例、プラスミドＤＮＡ，ｍＲＮＡ等）など、タンパク質（ペプチドを含む）（例、抗体（例、ＩｇＧ（例、Ａｌｅｘａ－ＩｇＧ、インビトロジェン製））等）、多糖類（例、デキストラン、フルオレセインイソチオシアナートデキストラン等）等〕、低分子化合物（例、フルオレセイン、フルオレセインナトリウム等）等を挙げることができるが、それらに限定されない。中でも好ましくは高分子化合物および低分子化合物が挙げられる。さらに好ましくは高分子化合物が挙げられる。さらに好ましくは核酸およびタンパク質が挙げられる。特に好ましくは核酸および抗体が挙げられる。
　本明細書において「ウルトラファインバブル」とは、通常の大気圧又はより高圧の気体を含んでいてもよいし、ウルトラファインバブル内が真空であってもよい。ここで、「真空」とは通常の大気圧より低い圧力の気体で満たされた空間の状態を意味する。
　本発明において「リン脂質を含まないウルトラファインバブル」とは、バブルの殻（ｓｈｅｌｌ）がリン脂質二重層の構造を形成していないウルトラファインバブルである。
　本発明において「ウルトラファインバブル水」とは、ウルトラファインバブルを含有する水のことをいう。
　本発明において「ウルトラファインバブル水溶液」とは、ウルトラファインバブルを含有する水溶液のことをいう。ウルトラファインバブル水溶液を構成する水溶液は、例えば、
１）アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤および両性界面活性剤から選ばれる１種または２種以上の界面活性剤、
２）親水性樹脂および
３）緩衝液
から選ばれる１種または２種以上の物質を成分として含む。
　本発明において「アニオン性界面活性剤」としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられる。
　本発明において「非イオン性界面活性剤」としては、例えば、グリセリン脂肪酸エステル（例、モノステアリン酸グリセリン等）、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル（例、モノステアリン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン等）、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン（硬化）ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例、ポリオキシエチレンソルビタンラウリン酸エステル（例、ポリソルベート２０等）、ポリオキシエチレンソルビタンオレイン酸エステル（例、ポリソルベート８０等）等）、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（例、ポリオキシエチレンラウリルエーテル等）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル（例、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（例、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等）、マクロゴール類、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（例、ポロクサマー４０７、ポロクサマー２３５、ポロクサマー１８８、ポロキサミン等）等が挙げられる。中でも好ましくは、ポリオキシエチレンソルビタンラウリン酸エステル（例、ポリソルベート２０等）、ポリオキシエチレンソルビタンオレイン酸エステル（例、ポリソルベート８０等）である。さらに好ましくはポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。特に好ましくはポリソルベート８０である。
　本発明において「カチオン性界面活性剤」としては、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化デカリニウム等が挙げられる。
　本発明において「両性界面活性剤」としては、例えば、コカミドプロピルベタイン、コカミドプロピルヒドロキシスルタイン等が挙げられる。
　上記界面活性剤は、単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　本発明において「親水性樹脂」としては、例えば、アクリル系樹脂（例、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸メチル）、ビニル系樹脂（例、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエチルエーテル）；多糖類（例、トラガントガム、カラヤガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒアルロン酸、アガロース、カードラン等）が挙げられる。中でも好ましくはポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロースが挙げられる。より好ましくはポリビニルアルコールが挙げられる。
　上記親水性樹脂は、単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　本発明において「緩衝液」としては、例えば、酸性緩衝液（例えば、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、薄めたＭｃｌｉｖａｉｎｅ緩衝液）や、中性緩衝液（例えば、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)）が挙げられる。緩衝液としては、薄めたＭｃｌｉｖａｉｎｅ緩衝液が好ましい。
　本発明における「ウルトラファインバブル水溶液」を構成する水溶液として、好ましくは、１）アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤および両性界面活性剤から選ばれる１種または２種以上の界面活性剤、および／または２）親水性樹脂とからなる水溶液が挙げられる。中でも好ましくは、非イオン性界面活性剤および／または親水性樹脂とからなる水溶液が挙げられる。または、非イオン性界面活性剤からなる水溶液も好ましい。さらに好ましくは、１）ポリソルベート８０およびポリソルベート２０から選ばれる１種または２種および／または２）ポリビニルアルコールとからなる水溶液が挙げられる。さらに好ましくは、ポリソルベート８０および／またはポリビニルアルコールとからなる水溶液が挙げられる。とりわけ、ポリソルベート８０からなる水溶液が好ましい。
　本発明においてウルトラファインバブルを構成する「気体」としては、例えば、パーフルオロ炭化水素（例、パーフルオロプロパン（Ｃ３Ｆ８）、パーフルオロブタン等）、空気、窒素、オゾン、酸素、アルゴン、二酸化炭素およびヘリウム等から選ばれる１種または２種以上の混合物等が挙げられるが、これらに限定されない。中でも好ましくは、パーフルオロ炭化水素（例、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン等）、空気、窒素、オゾン、酸素、アルゴンが挙げられる。より好ましくは、パーフルオロ炭化水素（例、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン等）、空気である。空気を用いる場合、安価で、かつ、容易にウルトラファインバブルを製造することができる。さらに好ましくはパーフルオロプロパン、空気が挙げられる。
　本発明における「ウルトラファインバブル水溶液」として、好ましくは、（Ａ）非イオン性界面活性剤および／または親水性樹脂とからなる水溶液と、（Ｂ）パーフルオロ炭化水素、空気等から選ばれる１種または２種以上の気体で構成されるウルトラファインバブルとからなるウルトラファインバブル水溶液が挙げられる。さらに好ましくは、（Ａ）１）ポリソルベート８０およびポリソルベート２０から選ばれる１種または２種および／または２）ポリビニルアルコールとからなる水溶液と、（Ｂ）パーフルオロ炭化水素および空気から選ばれる１種または２種の気体で構成されるウルトラファインバブルとからなるウルトラファインバブル水溶液が挙げられる。さらに好ましくは、（Ａ）ポリソルベート８０および／またはポリビニルアルコールとからなる水溶液と、（Ｂ）パーフルオロ炭化水素および／または空気で構成されるウルトラファインバブルとからなるウルトラファインバブル水溶液が挙げられる。とりわけ、ポリソルベート８０からなる水溶液と、パーフルオロプロパンまたは空気で構成されるウルトラファインバブルとからなるウルトラファインバブル水溶液が好ましい。
　本発明における「ウルトラファインバブル」は、リポソーム等の両親媒性リン脂質を含まないため、抗原性を示すことなく、より安全な製剤を提供し得る。
　本発明において「ウルトラファインバブル」の平均径は約２００ｎｍ以下である。好ましい平均径としては、例えば１０ｎｍ～２００ｎｍ、さらに好ましくは５０ｎｍ～２００ｎｍ、より好ましくは１００ｎｍ～１８０ｎｍである。
　また、別の態様として、本発明において「ウルトラファインバブル」の平均径の好ましい平均径としては、例えば約１７５ｎｍ以下であり、さらに好ましくは２５ｎｍ～１７５ｎｍ、より好ましくは７５ｎｍ～１６５ｎｍである。
　本明細書において「平均径」とは、分布の最頻値（個数％の極大値）に対応する粒子径（モード径）を意味する。
　本明細書において「ウルトラファインバブル水」もしくは「ウルトラファインバブル水溶液」とは、１０００ｎｍ以下の直径を有する気体粒子（ウルトラファインバブル）が安定に存在する水もしくは水溶液を意味する。本発明におけるウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液（以下、「本発明におけるウルトラファインバブル水等」ともいう）は、平均径が約２００ｎｍ以下であるウルトラファインバブルを含むことを特徴とする。
　本発明において、ウルトラファインバブルのサイズは均一であることが望ましい。例えば、ウルトラファインバブル個数基準分布の小径側から累積１０％および累積９０％に相当するウルトラファインバブル径をそれぞれｄ１０およびｄ９０としたときの「ｄ９０／ｄ１０比」は、５以下であることが好ましく、さらに好ましくは４．５以下であり、より好ましくは４以下である。
　本発明において、ウルトラファインバブル水等に含有されるウルトラファインバブル数とは、ウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液１ｍＬ中に存在するウルトラファインバブルの数を意味し、本明細書においては「ウルトラファインバブル密度」と称することもある。本発明におけるウルトラファインバブル水等に含まれるウルトラファインバブル数は特に制限されない。「ウルトラファインバブル密度」の下限として例えば、１．０×１０８個／ｍＬ以上、好ましくは２．０×１０８個／ｍＬ以上、より好ましくは２．５×１０８個／ｍＬ以上である。「ウルトラファインバブル密度」の上限として例えば、２．０×１０９個／ｍＬ以下、好ましくは１．０×１０９個／ｍＬ以下である。本発明における「ウルトラファインバブル密度」としては、例えば、１．０×１０８～２．０×１０９個／ｍＬ、好ましくは２．０×１０８～１．０×１０９個／ｍＬ、さらに好ましくは２．５×１０８～１．０×１０９個／ｍＬである。
　ウルトラファインバブル径（ウルトラファインバブル平均径を含む。以下同じ）、ウルトラファインバブル個数基準分布（ｄ９０／ｄ１０比を含む。以下同じ）、およびウルトラファインバブル数は、ブラウン運動に基づくレーザー光の散乱を利用した方法（例、ナノサイト社、ＬＭ２０やＬＭ１０等）、電気抵抗変化に基づく方法（例、ベックマン・コールター社、Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ４等）、レーザー回折散乱法に基づく方法（例、島津製作所、ＳＡＬＤ－７１００Ｈ等）、ミー散乱を利用した方法（例、日本電色工業、ＮＰ－５００Ｔ等）等を用いて測定することができる。本発明におけるウルトラファインバブル径およびウルトラファインバブル個数基準分布は、ナノサイト社製ナノサイト（機器名ＬＭ１０）を用いたレーザー光散乱を利用したトラッキング法（追尾法）を用いて測定されたもの、あるいはそれに準じて測定されたものが使用される。
　ウルトラファインバブル径、ウルトラファインバブル個数基準分布およびウルトラファインバブル数の値は、通常、ウルトラファインバブル水等の製造直後に測定されてもよく、長期保管後に測定されてもよい。本発明におけるウルトラファインバブル水等のウルトラファインバブル径、ウルトラファインバブル個数基準分布およびウルトラファインバブル数は極めて長期間（例えば、６ヶ月～２年程度）安定に維持されるため、ウルトラファインバブル水を製造後に一定期間密閉保管後、使用直前にウルトラファインバブル径、ウルトラファインバブル個数基準分布およびウルトラファインバブル数を測定した値であってもよい。
　本明細書における、ウルトラファインバブルを含む「水」（およびウルトラファインバブルを含む「水溶液」に用いられる「水」）としては、特に制限はなく、例えば水道水、脱イオン水、蒸留水、滅菌蒸留水、注射用精製水、超純水等を用いることができるが、注射剤に使用する場合は、滅菌蒸留水、注射用精製水等が好ましい。
　本明細書における、ウルトラファインバブルを含む「水溶液」としては、前記したアニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤および両性界面活性剤から選ばれる１種または２種以上の界面活性剤、親水性樹脂、及び緩衝剤から選ばれる１または２以上の成分に加え、例えば、医薬製剤分野で通常使用され得る任意の添加剤をさらに含有する水が挙げられる。該「添加剤」としては、例えば、電解質、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、分散剤、等張化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、酸味料、香料、流動化剤等が挙げられる。好ましくは薬理学的に許容し得る添加剤が挙げられ、より好ましくは、懸濁化剤、安定化剤、分散剤、等張化剤等から選ばれる１種または２種以上の添加剤が用いられる。
　上記した添加剤は、２種以上を適宜の割合で混合して用いてもよい。
　これらの添加剤（アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤および両性界面活性剤から選ばれる１種または２種以上の界面活性剤、親水性樹脂、及び緩衝剤を含む）は、ウルトラファインバブルの生成および安定性等に影響を与えない限り、予め水に溶解して直接ウルトラファインバブル水溶液として調製することもでき、あるいは、添加剤を含まない水中にウルトラファインバブルを生成させウルトラファインバブル水とした後、用時添加剤を溶解しウルトラファインバブル水溶液としてもよい。
　水溶液としては、非荷電のウルトラファインバブル水溶液、プラスに帯電したウルトラファインバブル水溶液およびマイナスに帯電したウルトラファインバブル水溶液のいずれも使用でき、標的細胞の種類や周辺の微小環境、目的物質のサイズや種類等に応じて、適宜選択することができる。本発明の、ウルトラファインバブル水溶液と超音波とを用いて目的物質を非免疫細胞内に送達させる方法において、目的物質が高分子化合物の場合、ウルトラファインバブル水溶液としては、プラスに帯電したウルトラファインバブル水溶液が好ましい。また、薬物が高分子化合物の場合、ウルトラファインバブル水溶液のｐＨとしては、例えば１～４が好ましい。
　特に、目的物質が分子量の大きいタンパク質等（例えば、分子量２５ｋＤａ以上）の場合は、プラスに帯電したウルトラファインバブル水溶液を使用することが好ましい。
　本発明のウルトラファインバブル水溶液と超音波とを用いて目的物質を非免疫細胞内に送達させる方法において、目的物質の分子量が大きくない（例えば、分子量２５ｋＤａ未満）場合、ウルトラファインバブル水溶液としては、プラスに帯電したウルトラファインバブル水溶液およびマイナスに帯電したウルトラファインバブル水溶液のどちらでも使用できる。
　ウルトラファインバブル水溶液の電荷は、例えば、用いる緩衝液のｐＨにより適宜調整することができる。例えばプラスに帯電したウルトラファインバブル水溶液とする場合、ウルトラファインバブル水溶液のｐＨとしては、例えば１～４が好ましい。一方、マイナスに帯電したウルトラファインバブル水溶液とする場合、ウルトラファインバブル水溶液のｐＨとしては、例えば７～１４が好ましい。
　ウルトラファインバブル水の製造方法としては、マイクロバブル（１～６０μｍ程度の直径を有する気体粒子）とウルトラファインバブルとを水中に同時発生させた後、マイクロバブルを浮上分離させてウルトラファインバブルのみを残留させる方法と、ウルトラファインバブルを直接生成させる方法とに大別されるが、現状では前者が主流である。前者の方法としては、気体を高速旋回で破砕してマイクロバブルを多数発生させ、マイクロバブルを浮上分離してウルトラファインバブルを水中に残留させる高速旋回液流式、気体を加圧して過飽和で溶解させた液を急速減圧してマイクロバブルとウルトラファインバブルを発生させ、マイクロバブルを浮上分離してウルトラファインバブルを水中に残留させる加圧溶解式等がある。ウルトラファインバブル水溶液の製造方法も上記と同様である。
　本発明におけるウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液の製造方法として好ましくは、加圧溶解式が用いられる。例えば、以下の１）～３）の工程が挙げられる；１）加圧ポンプにより０．２～０．５ＭＰａ程度に加圧された加圧容器内で、（i）アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤および両性界面活性剤から選ばれる１種または２種以上の界面活性剤、（ii）親水性樹脂および／または（iii）緩衝液が溶解している液に強制的に気体を溶解させ；２）ノズルを通して水中にフラッシュ操作し、減圧され過飽和となった気体を排水中にマイクロバブルまたはウルトラファインバブルとして放出させ、マイクロバブル水およびウルトラファインバブル水の混合物を生成する；３）通気を停止して静置し、マイクロバブルを自然浮上離脱させる。これより、ウルトラファインバブルのみが残留した澄明なウルトラファインバブル水が生成される。
　本発明におけるウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液の製造に用いられるウルトラファインバブル発生装置としては、例えば、加圧溶解式装置（例、ＩＤＥＣ社製ｎａｎｏＧＡＬＦＴＭ、オーラテック社製ＯＭ４－ＭＤ５－０４５、ニクニ社製マイクロバブルジェネレータ等）、高速旋回液流式装置（例、バイ・クリーン社製ＹＪ、アクアエアー社製マイクロバブル発生装置、ローヤル電機社製マイクロブレード等）等が挙げられる。ウルトラファインバブル発生装置として好ましくは、加圧溶解式装置（例、ＩＤＥＣ社製ｎａｎｏＧＡＬＦＴＭ）である。
　本発明において、ウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液の製造にアニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤および両性界面活性剤から選ばれる１種または２種以上の界面活性剤、親水性樹脂および／または緩衝液を用いることにより、上記ウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液中のウルトラファインバブル数を増大させることができる。
　本発明で用いられるアニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤および両性界面活性剤から選ばれる１種または２種以上の界面活性剤、親水性樹脂および／または緩衝剤の水への含有量は特に限定されるものではない。上限としては、好ましくは５０％（Ｗ／Ｖ）以下、より好ましくは２０％（Ｗ／Ｖ）以下、さらに好ましくは１０％（Ｗ／Ｖ）以下である。下限としては、好ましくは０．０１％（Ｗ／Ｖ）以上、より好ましくは０．０５％（Ｗ／Ｖ）以上、さらに好ましくは０．１％（Ｗ／Ｖ）以上である。ここで、（Ｗ／Ｖ）は、ｇ／ｍＬを意味するものとする。
　該界面活性剤、親水性樹脂および緩衝剤を２種以上組み合わせて用いる場合は、その合計量を水への含有量とする。
　上記のようにして製造された本発明におけるウルトラファインバブル水等は、バイアルまたはアンプルに密封して保存する。保存は遮光条件下で行うのが好ましい。保存温度は室温以下が好ましく、１０℃以下がより好ましい。
　本発明におけるウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液は、好ましくはアニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤および両性界面活性剤から選ばれる１種または２種以上の界面活性剤、親水性樹脂および／または緩衝液の存在下製造されるため、本発明におけるウルトラファインバブル水等の作用効果（例えば、ウルトラファインバブル水等と超音波処理とを併用した場合の非免疫細胞の細胞膜穿孔効果、ウルトラファインバブル水等と超音波とを用いて目的物質の非免疫細胞内への送達性を増大させる効果等）が維持されることが要求される期間（例えば、細胞膜を通過して送達されることが望まれる目的物質の基剤として使用した場合には、その有効期間（例えば３ヶ月以上、より好ましくは６ヶ月以上、さらに好ましくは１年以上））、ウルトラファインバブル水等のウルトラファインバブル数を１．０×１０８個／ｍＬ以上に維持することができる。
　本発明におけるウルトラファインバブル水等は加熱滅菌を行うことができ、加熱滅菌後もウルトラファインバブル数を１．０×１０８個／ｍＬ以上に維持することができる。
　本発明におけるウルトラファインバブル水等が１．０×１０８個／ｍＬ以上のウルトラファインバブル数を有する場合、優れた抗菌作用とそれによる保存効力を示すので、一定期間、同一容器から繰り返して使用される複数回投与型の液体医薬製剤、例えば、注射剤（例、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、点滴剤、脳内投与注射剤、脳脊髄液内投与注射剤、眼内投与注射剤等）の基剤としても有用である。
　本発明におけるウルトラファインバブル水等は、好ましくはアニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤および両性界面活性剤から選ばれる１種または２種以上の界面活性剤（好ましくはポリソルベート８０および／またはポリソルベート２０、さらに好ましくはポリソルベート８０）の存在下で製造され、製造されたウルトラファインバブル水等では、ウルトラファインバブルの平均径がより小さく、また、そのサイズがより均一である（すなわちｄ９０／ｄ１０比が小さい）ため、本発明のシステムにおいて、より安全な非免疫細胞内への目的物質の送達効果が得られる。
　本発明のシステムに使用される「超音波発生装置」としては、本発明におけるウルトラファインバブル水等と組み合わせて用いた場合に、非免疫細胞内へ目的物質を送達させるのに十分な条件の超音波を発生させ得る限り、いかなるものでも使用することができる。例えば、従来より医療現場で超音波診断用に使用されている任意の装置や、市販の超音波遺伝子導入装置（例、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ　ＧＴＳ（ネッパジーン社製）等）等を適宜用いることができる。
　本発明における「超音波発生装置」の条件としては、例えば、超音波の出力強度（音波の進行方向に垂直な単位面積（ｃｍ２）を単位時間に通過する音響エネルギー）が１０ｍＷ以上、好ましくは３０ｍＷ以上、より好ましくは５０ｍＷ以上（例、１００ｍＷ以上、１５０ｍＷ以上、２００ｍＷ以上等）であることが挙げられる。出力強度の上限に特に制限はないが、本発明のシステムがヒトを含む哺乳動物内の標的細胞内への目的物質のｉｎ　ｖｉｖｏ送達を目的の１つとすることを考慮すれば、動物に悪影響（例、細胞毒性）を及ぼさない範囲を上限とすることが好ましい。例えば、改正薬事法の第３者認証基準（２００５）において「７２０ｍＷ／ｃｍ２を超えない」（米国ＦＤＡのＴｒａｃｋ　３の上限値と同じ）との要求事項が追加され、日本国内の超音波診断装置はこの上限を超えないよう制御されていることから、好ましくは、本発明のシステムにおける超音波の出力強度の上限は７２０ｍＷ／ｃｍ２である。好ましくは、出力強度は５００ｍＷ／ｃｍ２以下（例、４５０ｍＷ／ｃｍ２以下、４００ｍＷ／ｃｍ２以下、３００ｍＷ／ｃｍ２以下等）であり得る。従って、超音波の出力強度として好ましくは、５０～７２０ｍＷ／ｃｍ２、より好ましくは５０～５００ｍＷ／ｃｍ２、さらに好ましくは５５～４５０ｍＷ／ｃｍ２である。従来の遺伝子導入のために使用されている超音波の出力強度は、超音波診断用途での上記基準を大幅に上回っており（例えば、１．５～２．５Ｗ／ｃｍ２）安全性に対するリスクが大きいが、本発明のシステムにおいては、小さな出力強度（好ましくは５０～５００ｍＷ／ｃｍ２）で目的物質の分子量に関係なく、目的物質を効率よく非免疫細胞内へ送達させることができ、極めて安全な送達システムである。
　本発明における「超音波発生装置」の条件としては、超音波の周波数は特に制限されず、例えば、０．５～１０ＭＨｚの範囲内で適宜選択することができる。現在広く採用されている周波数は約１ＭＨｚであるが、高周波数の方が生体への悪影響がより少ないと考えられることから、好ましくは１～５ＭＨｚ、より好ましくは１～３ＭＨｚ、さらに好ましくは１～２．５ＭＨｚの範囲内で適宜選択され得る。
　本発明における「超音波発生装置」を用いる条件としては、超音波の照射時間は、目的物質を非免疫細胞内へ送達させるのに十分な時間であれば特に制限されず、超音波の出力強度に応じても変動し得るが、例えば、出力強度５０ｍＷ／ｃｍ２であっても、１０秒の照射時間で目的物質を非免疫細胞内へ送達させることができる。超音波の照射時間としては、例えば１～６０秒、好ましくは１～３０秒、より好ましくは１～２０秒、さらに好ましくは１～１０秒を挙げることができる。
　本発明における「超音波発生装置」を用いる場合の条件としては、例えば、（ｉ）超音波の出力強度が５０～７２０ｍＷ／ｃｍ２（好ましくは５０～５００ｍＷ／ｃｍ２）、（ｉｉ）超音波の周波数が０．５～１０ＭＨｚおよび（ｉｉｉ）超音波の照射時間が１～６０秒の組み合わせが挙げられる。中でも好ましくは、（ｉ）超音波の出力強度が５０～５００ｍＷ／ｃｍ２、（ｉｉ）超音波の周波数が１～５ＭＨｚおよび（ｉｉｉ）超音波の照射時間が１～６０秒の組み合わせ等が挙げられ、より好ましくは、（ｉ）超音波の出力強度が５５～４５０ｍＷ／ｃｍ２、（ｉｉ）超音波の周波数が１～２．５ＭＨｚおよび（ｉｉｉ）超音波の照射時間が１～１０秒の組み合わせ等が挙げられる。
　本発明のシステムが動物から単離された非免疫細胞のトランスフェクションに使用される場合、トランスフェクション処理後に該非免疫細胞を培養する工程を含んでいてもよい。従って、本発明のシステムは、さらに非免疫細胞の培養手段（例えば、培養容器（例、ディッシュ、フラスコ等）、培地、培養装置（例、ＣＯ２インキュベーター等））をさらに含み得る。上記の培養工程には、継代培養工程も含まれる。本発明のシステムにより細胞が継代培養された場合、細胞内に導入された目的物質の発現強度が維持され得る。
ＩＩ．本発明の送達性増大方法
　本発明はまた、平均径が２００ｎｍ以下であるリン脂質を含まないウルトラファインバブルを含むウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液と、超音波とを用いて、核酸、タンパク質または低分子化合物の非免疫細胞内送達性を増大させる方法（以下、「本発明の送達性増大方法」ともいう）も提供する。当該方法は、本発明におけるウルトラファインバブル水等を対象に投与して非免疫細胞の近傍に送達させること、および非免疫細胞に対して超音波照射を行うことを含み、それにより核酸、タンパク質または低分子化合物が非免疫細胞内に送達される。ここで「非免疫細胞」とは、上記本発明のシステムにおいて定義されたものと同義である。
　「本発明の送達性増大方法」において使用されるウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液としては、上記の本発明におけるウルトラファインバブル水等を用いることができる。また、「本発明の送達性増大方法」における超音波照射は、上記の本発明のシステムにおける超音波発生装置の使用と同様の条件にて実施することができる。
　本発明の送達性増大方法により非免疫細胞内への送達性が増大する核酸、タンパク質または低分子化合物は特に制限されないが、例えば、非免疫細胞内に送達されることによって、該細胞に好ましい生理活性を付与し得る物質であり得る。例えば、核酸として、ｓｉＲＮＡ（例、ＦＡＭ－ｓｉＲＮＡ、ニッポンジーン製）、ｓｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、Ｓ化オリゴＤＮＡ（ホスホロチオエート等）などの小ＲＮＡ／ＤＮＡ、遺伝子（例、プラスミドＤＮＡ，ｍＲＮＡ等）などが挙げられる。また、タンパク質として、例えば、抗体（例、ＩｇＧ（例、Ａｌｅｘａ－ＩｇＧ、インビトロジェン製））等）、ペプチド等を挙げることができる。低分子化合物としては、例えば、既知もしくは新規医薬化合物、フルオレセイン、フルオレセインナトリウム等の蛍光物質を挙げることができるが、それらに限定されない。中でも好ましくは、核酸として、ｓｉＲＮＡやアンチセンスオリゴ核酸のような小ＲＮＡ／ＤＮＡ等、また、タンパク質として抗体等、低分子化合物として医薬化合物や蛍光色素等が挙げられる。
　核酸のヌクレオチド数やタンパク質の分子量は特に制限されないが、例えば、核酸（ｓｉＲＮＡやアンチセンスオリゴ核酸等の小ＲＮＡ／ＤＮＡ）の場合、１０ｍｅｒ～３０ｍｅｒ、好ましくは１５ｍｅｒ～２５ｍｅｒ、また、タンパク質の場合、２５ｋＤａ～９００ｋＤａ、好ましくは２５ｋＤａ～３２０ｋＤａを挙げることができる。
ＩＩＩ．本発明の製剤
　本発明はまた、核酸、タンパク質または低分子化合物と、平均径が２００ｎｍ以下であるリン脂質を含まないウルトラファインバブルを含むウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液とを組み合わせてなる、該核酸、タンパク質または低分子化合物を非免疫細胞内に送達させるための製剤であって、超音波照射との併用により有効量（非免疫細胞が所望の効果を発揮する量）の該核酸、タンパク質または低分子化合物が非免疫細胞内に送達されることを特徴とする、製剤（以下、「本発明の製剤」ともいう。）を提供する。ここで「非免疫細胞」とは、上記本発明のシステムにおいて定義されたものと同義である。
　本発明の製剤において、核酸、タンパク質または低分子化合物は、上記「本発明の送達性増大方法」において例示された核酸、タンパク質または低分子化合物であり得る。また、本発明の製剤におけるウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液としては、上記「本発明のシステム」において記載されたウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液が用いられる。
　本発明の製剤において、核酸、タンパク質または低分子化合物は、本発明におけるウルトラファインバブル水等と混合して単一の製剤として対象に投与してもよいし、あるいは、両者が同時に非免疫細胞の近傍に共存し得る限り、それぞれを別個に製剤化して、同時または時間差をおいて、同一または異なる経路で投与してもよい。
　核酸、タンパク質または低分子化合物と、本発明におけるウルトラファインバブル水等とを別個に製剤化する場合、該核酸、タンパク質または低分子化合物には、医薬上許容できる担体をヒトまたは他の哺乳動物が許容できる量配合することができる。
　医薬上許容できる担体としては、リン酸一ナトリウム、リン酸二カリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、水酸化ナトリウム、塩酸等のｐＨ調節剤；硫酸カナマイシン、ラクトビオン酸エリスロマイシン、ペニシリンＧカリウム等の抗生物質；乳糖、グルタミン酸カリウム、Ｄ－ソルビトール、アミノ酢酸、ヒト血清アルブミン等の安定剤；フェノールレッド等の着色剤；塩化ナトリウム、塩化カリウム等の等張化剤等が挙げられる。
　本発明の製剤における核酸、タンパク質または低分子化合物の含有量としては、超音波照射によりそれらが非免疫細胞内に送達された場合に該細胞に所望の生理活性等の好ましい物性を付与し得る量であれば特に制限はないが、例えば、０．０００１ｍｇ～１０００ｍｇ、好ましくは０．００１～１０ｍｇであり得る。一方、ウルトラファインバブル水等の量としては、超音波照射により核酸、タンパク質または低分子化合物を非免疫細胞内に送達させるのに十分な量であれば特に制限はないが、例えば、非免疫細胞近傍でのウルトラファインバブル密度が１×１０８～１０×１０８個／ｍＬ、好ましくは２×１０８～５×１０８個／ｍＬとなるように、ウルトラファインバブルを送達させ得る量であればよい。
ＩＶ．本発明の送達方法
　本発明はまた、非免疫細胞を、上記本発明の製剤と接触させ、超音波で処理することを含む、該細胞内への核酸又はタンパク質の送達方法を提供する。ここで「非免疫細胞」とは、上記本発明のシステムにおいて定義されたものと同義である。
　「本発明の送達性増大方法」、「本発明の送達方法」を適用し得る対象としては、生体から採取した非免疫細胞（例、神経細胞（脳神経細胞を含む）、骨格筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、中皮細胞、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、腱細胞、眼細胞、免疫系を除く主要な腺または器官（例えば、精巣、肝臓、肺、心臓、胃、膵臓、腎臓、および皮膚等）の細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、繊維芽細胞、島細胞、ニューロンおよび他の神経組織由来の細胞、上記いずれかの細胞に分化し得る、単能性もしくは多分化能を有する前駆細胞および組織幹細胞、胚および他の全能性または多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、ＥＳ様細胞、および胚性生殖細胞等）、ならびにその他細胞［上皮系細胞、間葉系細胞、および高純度間葉系幹細胞（Ｒａｐｉｄｌｙ　Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ　Ｃｅｌｌｓ：ＲＥＣ）］等）（本明細書において「ｅｘ　ｖｉｖｏ非免疫細胞」ともいう）もしくはそれを含む組織、動物体内の非免疫細胞（本明細書において「ｉｎ　ｖｉｖｏ非免疫細胞」ともいう）であれば特に制限はなく、例えば、ヒトおよびその他の哺乳動物（例、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル等）またはそれらに由来する非免疫細胞もしくはそれを含む組織などを挙げることができる。対象に本発明におけるウルトラファインバブル水等を投与する手段としては、ウルトラファインバブルを非免疫細胞の近傍に送達させることができる投与経路であれば特に制限はない。以下、ｅｘ　ｖｉｖｏ非免疫細胞とｉｎ　ｖｉｖｏ非免疫細胞として分けて説明する。
（ａ）ｅｘ　ｖｉｖｏ非免疫細胞への目的物質の送達

　本発明の送達方法によれば、本発明におけるウルトラファインバブル水等と超音波とを組み合わせて、核酸、タンパク質または低分子化合物をｅｘ　ｖｉｖｏ非免疫細胞内に送達させることにより、該核酸、タンパク質または低分子化合物の作用により生理活性等の好ましい物性が付与されたｅｘ　ｖｉｖｏ非免疫細胞を製造することができる。　

　ｅｘ　ｖｉｖｏ非免疫細胞は、ヒト又は非ヒト哺乳動物の該細胞を含む組織・臓器より採取することができる。本発明の製剤が導入されたｅｘ　ｖｉｖｏ非免疫細胞（例、ｅｘ　ｖｉｖｏ骨格筋細胞、ｅｘ　ｖｉｖｏ神経細胞）を、癌などの疾患の治療に用いる場合には、当該細胞集団は治療対象自身、又は治療対象のＭＨＣタイプと一致したドナーから採取することが好ましい。　

　ｅｘ　ｖｉｖｏ非免疫細胞は、多能性幹細胞や、免疫系以外の組織幹細胞等の未分化細胞であってもよい。例えば、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、神経幹細胞、骨格筋前駆細胞などが挙げられる。多能性幹細胞等の未分化細胞は、自体公知の方法により各種非免疫細胞、例えば骨格筋細胞や神経細胞等に分化させることができる。　

　本発明の製剤をｅｘ　ｖｉｖｏ非免疫細胞に接触させる方法に特に限定はないが、例えば、通常の非免疫細胞の培地に本発明の製剤を添加すればよい。超音波照射は、上記本発明のシステムにおいて記載した超音波発生装置と照射条件を用いて、ｅｘ　ｖｉｖｏ非免疫細胞に対して実施することができる。
（ｂ）ｉｎ　ｖｉｖｏ非免疫細胞への目的物質の送達

　本発明の送達方法によれば、本発明の製剤を、哺乳動物（ヒト又は他の哺乳動物（例：マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル）、好ましくは、ヒト）に投与し、非免疫細胞を含む組織・臓器（例、骨格筋、脳等）に超音波照射を行うことにより、該動物体内の非免疫細胞（例、骨格筋細胞、神経細胞等）内に核酸、タンパク質または低分子化合物が導入され、それら目的物質の作用効果が奏せられる。例えば、筋ジストロフィー（ＭＤＳ）患者のｉｎ　ｖｉｖｏ骨格筋細胞内に、ＭＤＳの原因となる変異をスキッピングし得るアンチセンス核酸が送達され、該細胞内で発現することにより、細胞毒性が軽減され、当該疾患に対する治療効果を発揮し得る。
本発明の製剤は、例えば注射剤の形態で、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、点滴、脳内注射、脳脊髄液内注射、眼内注射等によりｉｎ　ｖｉｖｏ非免疫細胞の近傍に核酸、タンパク質または低分子化合物と、ウルトラファインバブル水等とを送達させることができる。また、超音波照射は、従来より超音波診断に用いられている操作を、標的部位をｉｎ　ｖｉｖｏ非免疫細胞を含む組織・臓器に代えて実施すればよい。
　別の態様として、平均径が異なるウルトラファインバブルの混合液を投与して、異なる周波数あるいは出力強度の超音波を複数組み合わせることによって、核酸、タンパク質または低分子化合物を、多段階的に細胞膜障壁を通過させて、標的とする非免疫細胞内へ順次送達させることもできる。
「本発明の送達性増大方法」、「本発明の送達方法」をｅｘ　ｖｉｖｏ非免疫細胞、即ち、動物から単離された非免疫細胞、またはｉＰＳ細胞などの幹細胞から自体公知の方法を用いて分化誘導された非免疫細胞に適用する場合、トランスフェクション処理後に該非免疫細胞を培養する工程を含んでいてもよい。当該培養工程は、自体公知の培養容器（例、ディッシュ、フラスコ等）や培養装置（例、ＣＯ２インキュベーター等）を用い、非免疫細胞の維持培養や未分化な幹細胞から他の非免疫細胞への分化誘導に通常使用される培地中で行うことができる。尚、本発明におけるトランスフェクションが非免疫細胞（多能性幹細胞や免疫系以外の組織幹／前駆細胞も含む）に対して行われる限り、本発明は、トランスフェクション後に、非免疫細胞から分化誘導またはダイレクトリプログラミングにより免疫細胞を誘導することを排除しない。
　また、上記の培養工程には、継代培養工程も含まれる。「本発明の送達性増大方法」、「本発明の送達方法」により細胞が継代培養された場合、細胞内に導入された目的物質の発現強度が維持され得る。
Ｖ．本発明により目的物質が導入されたｅｘ　ｖｉｖｏ非免疫細胞を含む医薬
　本発明システムを用いて、また、本発明の送達方法により、目的物質が導入されたｅｘ　ｖｉｖｏ非免疫細胞は、該目的物質の作用により所望の効果が奏される（例えば、新たな生理活性を獲得する）ので、そのまま、あるいは、公知の薬学的に許容される担体（賦形剤、希釈剤、増量剤、結合剤、滑沢剤、流動助剤、崩壊剤、界面活性剤等などが含まれる）や慣用の添加剤などと混合して医薬組成物として調製することができる。賦形剤は、当業者にはよく知られており、また、湿潤剤又は乳化剤などの補助剤、及びｐＨ緩衝剤も使用することができる。さらに、懸濁化剤、保存剤、安定化剤及び分散剤などの製剤補助剤などを用いてもよい。また、上記医薬組成物は、使用前に適切な無菌の液体により再構成するための乾燥形態であってもよい。該医薬組成物は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、懸濁液などの経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤などの非経口投与剤）等に応じて、全身的に又は局所的に、経口投与又は非経口投与することができる。非経口投与する場合には、静脈投与、皮内投与、皮下投与、直腸投与、経皮投与すること等が可能である。また注射剤型で用いる場合には、許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。
本発明により目的物質が導入されたｅｘ　ｖｉｖｏ非免疫細胞を含む医薬は、種々の疾患の予防・治療薬であり得るが、対象疾患として、例えば、がん、遺伝性疾患が挙げられる。例えば、目的物質がＭＤＳの原因となる変異をスキッピングし得るアンチセンス核酸である場合、該目的物質が導入され、発現したｅｘ　ｖｉｖｏ骨格筋細胞では、細胞毒性の高いスプライシングバリアントの発現が抑制され、細胞毒性が軽減され得る。
　本発明により目的物質が導入されたｅｘ　ｖｉｖｏ非免疫細胞を含む医薬は、ヒト又は他の哺乳動物（例：マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル）、好ましくはヒトに安全に投与することができる。
本発明により目的物質が導入されたｅｘ　ｖｉｖｏ非免疫細胞を含む医薬は、非経口的に対象に投与して用いることが好ましい。非経口的な投与方法としては、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、及び皮下投与などの方法が挙げられる。投与量は、対象の状態、体重、年齢等応じて適宜選択されるが、通常、細胞数として、体重６０ｋｇの対象に対し、１回当り、通常１×１０６～１×１０１０個となるように、好ましくは１×１０７～１×１０９個となるように、より好ましくは５×１０７～５×１０８個となるように投与される。また、１回で投与してもよく、複数回にわたって投与してもよい。
以下、参考例および実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれらに限定されるものではない。
　以下の参考例および実施例において、「％」は特記しない限り、重量／容量％を示す。
参考例１：ウルトラファインバブル水の調製
　注射用水２Ｌまたは薄めたＭｃｌｉｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ３．０）２Ｌにポリソルベート８０を２ｇ溶解させ（０．１％　ポリソルベート８０）、ＩＤＥＣ社製ウルトラファインバブル発生装置（ｎａｎｏＧＡＬＦＴＭＦＺ１Ｎ－０２）を用いて、以下の設定によりウルトラファインバブル水溶液を調製した。酸性緩衝液（薄めたＭｃｌｉｖａｉｎｅ緩衝液：ｐＨ３．０）を用いるとプラスチャージのウルトラファインバブルを、注射用水を用いるとマイナスチャージのウルトラファインバブルを製造できる。
　・調製に用いたガス：空気（実施例３）、Ｃ３Ｆ８（実施例１，２，４）
　・気泡水流量：約４．０Ｌ／分
　・溶解圧力：３００ＫＰａ±５％
　調製されたウルトラファインバブル水は、適宜、オートクレーブを用いて１２１～１２４℃　で３０分間高圧蒸気滅菌した。滅菌後にナノサイト社、ＬＭ１０を用いたレーザー光散乱を利用したトラッキング法（追尾法）を用いてウルトラファインバブル平均径、ウルトラファインバブル密度およびｄ９０／ｄ１０比を測定した。
結果を以下に示す。
　ウルトラファインバブル平均径：１２０ｎｍ±１６ｎｍ
　ウルトラファインバブル密度：４×１０８個／ｍＬ
　ｄ９０／ｄ１０比：３．３
実施例１　骨格筋細胞へのｓｉＲＮＡ導入
　１０％　ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中のＣ２Ｃ１２　ｃｅｌｌ（３×１０４　ｃｅｌｌ，０．５ｍＬ）を４８ｗｅｌｌに播種した。培地を除去した後にＦＡＭで蛍光標識したｓｉＲＮＡ（ＦＡＭ－ｓｉＲＮＡ）を５μｇ含有したウルトラファインバブル／ＤＭＥＭ培地を０．５ｍＬ加えた。ウルトラファインバブル／ＤＭＥＭ培地は、ＤＭＥＭ培地用粉末に、参考例１で調製したウルトラファインバブル水溶液を１Ｌ加え、２ｇ／Ｌ　ＮａＨＣＯ３及び１０％　ＦＢＳを添加したものを、トランスフェクション用培地として用いた。
　ＦＡＭ－ｓｉＲＮＡ含有培地を添加した後、超音波発生装置（ＮＥＰＡＧＥＮＥ）を用いて周波数１ＭＨｚ、出力強度５００ｍＷ／ｃｍ２で１０ｓｅｃ超音波照射を行った。超音波照射した後、細胞を２ｈｒ培養し、その後トランスフェクション用培地を除去し、ＤＭＥＭ培地（培養用培地）中で４８時間培養した。
　培養終了後、細胞をＤＡＰＩで染色し、蛍光顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ社製）下で観察した。結果を図１Ａに示す。ウルトラファインバブルのみでは細胞内へのｓｉＲＮＡの送達は認められなかった。超音波処理によりわずかに細胞内へのｓｉＲＮＡの送達は認められた。ウルトラファインバブルと超音波とを組み合わせることにより、細胞内へのｓｉＲＮＡ導入効率が顕著に上昇した。
　また、培養終了後に細胞を回収し、細胞溶解液０．５ｍＬで完全に溶解させた後に、ＦＡＭ－ｓｉＲＮＡの蛍光量を分光蛍光光度計で測定した。Ｃｏｎｔｒｏｌ（ウルトラファインバブルのみ）の測定値を１として比例計算でＦＡＭ－ｓｉＲＮＡの取り込み量を相対量で評価した。結果を図１Ｂに示す。蛍光顕微鏡観察での結果が定量的に確認された。
　なお、図１にはマイナスに帯電したウルトラファインバブル（注射用水を用いて製造したもの）の結果を示しているが、ｓｉＲＮＡの場合、プラスに帯電したウルトラファインバブル（薄めたＭｃｌｉｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ３．０）を用いて製造したもの）でも同様の効果が得られる。
実施例２　マイクロバブルとの比較導入
　１０％　ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中のＣ２Ｃ１２　ｃｅｌｌ（３×１０４　ｃｅｌｌ，０．５ｍＬ）を４８ｗｅｌｌに播種した。培地を除去した後にＦＡＭで蛍光標識したｓｉＲＮＡ（ＦＡＭ－ｓｉＲＮＡ）５μｇ含有したウルトラファインバブル／ＤＭＥＭ培地またはマイクロバブル／ＤＭＥＭ培地を０．５ｍＬ加えた。ウルトラファインバブル／ＤＭＥＭ培地及びマイクロバブル／ＤＭＥＭ培地はＤＭＥＭ培地用粉末に、参考例１で調製したウルトラファインバブル水溶液または市販のマイクロバブル水を１Ｌ加え、２ｇ／Ｌ　ＮａＨＣＯ３及び１０％　ＦＢＳを添加したものを、トランスフェクション用培地として用いた。マイクロバブル水としては、リン脂質であるホスファチジルセリンを構成成分に含むＳｏｎａｚｏｉｄ（平均径：３μｍ）を使用した。

　各ＦＡＭ－ｓｉＲＮＡ含有培地を添加した後、超音波発生装置（ＮＥＰＡＧＥＮＥ）を用いて周波数１ＭＨｚ、出力強度５００ｍＷ／ｃｍ２で１０ｓｅｃ超音波照射を行った。超音波照射した後、細胞を２ｈｒ培養し、その後トランスフェクション用培地を除去し、ＤＭＥＭ培地（培養用培地）中で４８時間培養した。
　培養終了後に細胞を回収し、細胞溶解液０．５ｍＬで完全に溶解させた後に、ＦＡＭ－ｓｉＲＮＡの蛍光量を分光蛍光光度計で測定した。Ｃｏｎｔｒｏｌ（ウルトラファインバブルのみ）の測定値を１として比例計算でＦＡＭ－ｓｉＲＮＡの取り込み量を相対量で評価した。結果を図２に示す。ウルトラファインバブル水は、マイクロバブル水よりも顕著に細胞内へのｓｉＲＮＡ導入効率を上昇させた。
　なお、図２にはマイナスに帯電したウルトラファインバブル（注射用水を用いて製造したもの）の結果を示しているが、ｓｉＲＮＡの場合、プラスに帯電したウルトラファインバブル（薄めたＭｃｌｉｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ３．０）を用いて製造したもの）でも同様の効果が得られる。
実施例３　骨格筋細胞へのタンパク質導入
　１０％　ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中のＣ２Ｃ１２　ｃｅｌｌ（６×１０４　ｃｅｌｌ，１ｍＬ）を４８ｗｅｌｌに播種した。培地を除去した後にＩｇＧ－ＦＩＴＣをウルトラファインバブル／ＤＭＥＭ培地で１００倍希釈した液を１ｍＬ加えた。ウルトラファインバブル／ＤＭＥＭ培地はＤＭＥＭ培地用粉末に、参考例１で調製したウルトラファインバブル水溶液を１Ｌ加え、２ｇ／Ｌ　ＮａＨＣＯ３及び１０％　ＦＢＳを添加したものを、トランスフェクション用培地として用いた。
　ＩｇＧ－ＦＩＴＣ含有培地を添加した後、超音波発生装置（ＮＥＰＡＧＥＮＥ）を用いて出力強度５００ｍＷ／ｃｍ２、周波数０．５ＭＨｚ又は３ＭＨｚで、１０ｓｅｃ超音波照射を行った。超音波照射した後、細胞を２ｈｒ培養し、その後トランスフェクション用培地を除去し、ＤＭＥＭ培地（培養用培地）中で４８時間培養した。
　培養終了後、ＩｇＧ－ＦＩＴＣの蛍光量を分光蛍光光度計で測定した。生存細胞数も測定し、生存細胞あたりの蛍光量に換算して、比較を行った。結果を図３に示す。ウルトラファインバブルと超音波とを組み合わせることにより、細胞内へのＩｇＧ－ＦＩＴＣ導入効率が顕著に上昇した。調べた範囲では、超音波の周波数は導入効率に影響を及ぼさなかった。
実施例４　骨格筋細胞への低分子化合物の導入
　１０％　ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中のＣ２Ｃ１２　ｃｅｌｌ（３×１０４　ｃｅｌｌ，０．５ｍＬ）を４８ｗｅｌｌに播種した。培地を除去した後にＦＩＴＣ　０．３８μｇ含有したウルトラファインバブル／ＤＭＥＭ培地を０．５ｍＬ加えた。ウルトラファインバブル／ＤＭＥＭ培地はＤＭＥＭ培地用粉末に、参考例１で調製したウルトラファインバブル水溶液を１Ｌ加え、２ｇ／Ｌ　ＮａＨＣＯ３及び１０％　ＦＢＳを添加したものを、トランスフェクション用培地として用いた。
　ＦＩＴＣ含有培地を添加した後、超音波発生装置（ＮＥＰＡＧＥＮＥ）を用いて周波数１ＭＨｚ、出力強度１００，２５０，５００ｍＷ／ｃｍ２で１０ｓｅｃ超音波照射を行った。超音波照射した後、２ｈｒ培養し、その後トランスフェクション用培地を除去し、ＤＭＥＭ培地（培養用培地）で４８時間培養した。
　培養終了後、細胞を回収し、細胞溶解液０．５ｍＬで完全に溶解させた後に、ＦＩＴＣの蛍光量を分光蛍光光度計で測定した。Ｃｏｎｔｒｏｌ（ウルトラファインバブルのみ）の測定値を１として比例計算でＦＩＴＣの取り込み量を相対量で評価した。結果を図４に示す。ウルトラファインバブルと超音波とを組み合わせることにより、細胞内へのＦＩＴＣ導入効率が顕著に上昇した。超音波の出力強度は導入効率に大きく影響し、１００ｍＷ／ｃｍ２でも増加傾向は認められたが、２５０又は５００ｍＷ／ｃｍ２で有意にＦＩＴＣの導入効率は増大し、特に２５０ｍＷ／ｃｍ２で優れた導入効率を示した。
　なお、図４にはマイナスに帯電したウルトラファインバブル（注射用水を用いて製造したもの）の結果を示しているが、低分子化合物の場合、プラスに帯電したウルトラファインバブル（薄めたＭｃｌｉｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ３．０）を用いて製造したもの）でも同様の効果が得られる。
本発明のシステムは、低い出力強度の超音波を照射することで、効率よく非免疫細胞内へ核酸、タンパク質または低分子化合物等の目的物質を送達させることができるので、安全性の高い非免疫細胞内への薬物送達システムを提供することができる。また、従来のマイクロバブルを使用した場合と比較し、ウルトラファインバブルを使用することにより、細胞内への目的物質の導入効率を顕著に増大させることができる。さらに、リポソームを用いる必要がないので、安価に製造可能でかつ安全性も高い。以上より、本発明のシステムは、非免疫細胞内への新規なＤＤＳとして、きわめて有用である。

Claims (14)

  1. 　平均径が２００ｎｍ以下であるリン脂質を含まないウルトラファインバブルを含むウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液と、超音波発生装置とを組み合わせてなる、細胞（免疫細胞を除く）内への目的物質の送達システム。
  2. 　ウルトラファインバブル水溶液が、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤および両性界面活性剤から選ばれる１種または２種以上の界面活性剤、親水性樹脂、及び緩衝液から選ばれる１または２以上の成分を含む、請求項１に記載のシステム。
  3. 　ウルトラファインバブル水溶液が、非イオン性界面活性剤および／または親水性樹脂とからなる、請求項１に記載のシステム。
  4. 　ウルトラファインバブルが、パーフルオロ炭化水素または空気で構成される、請求項１に記載のシステム。
  5. 　ウルトラファインバブルの平均径が、５０ｎｍ～２００ｎｍである、請求項１に記載のシステム。
  6. 　ウルトラファインバブルのｄ９０／ｄ１０比が５以下である、請求項１に記載のシステム。
  7. 　ウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液におけるウルトラファインバブルの密度が、１．０×１０８個／ｍＬ以上である、請求項１に記載のシステム。
  8. 　超音波発生装置において超音波の出力強度が、７２０ｍＷ／ｃｍ２以下である、請求項１に記載のシステム。
  9. 　超音波発生装置において超音波の出力強度が５０～５００ｍＷ／ｃｍ２および超音波の周波数が０．５～１０ＭＨｚである、請求項１に記載のシステム。
  10. 　目的物質が核酸、タンパク質または低分子化合物である、請求項１に記載のシステム。
  11. 　細胞が骨格筋細胞または神経細胞である、請求項１に記載のシステム。
  12. 　平均径が２００ｎｍ以下であるリン脂質を含まないウルトラファインバブルを含むウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液と、超音波とを用いて、核酸、タンパク質または低分子化合物の細胞（免疫細胞を除く）内送達性を増大させる方法。
  13. 　核酸、タンパク質または低分子化合物と、平均径が２００ｎｍ以下であるリン脂質を含まないウルトラファインバブルを含むウルトラファインバブル水もしくはウルトラファインバブル水溶液とを組み合わせてなる、該核酸、該タンパク質または該低分子化合物を細胞（免疫細胞を除く）内に送達させるための製剤であって、超音波照射との併用により有効量の該核酸、該タンパク質または該低分子化合物が該細胞（免疫細胞を除く）内に送達されることを特徴とする、製剤。
  14. 　細胞（免疫細胞を除く）を、請求項１３に記載の製剤と接触させ、超音波で処理することを含む、該細胞（免疫細胞を除く）内への核酸、タンパク質または低分子化合物の送達方法。
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