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WO2020120910A1 - Production de vaccins viraux sur une lignee cellulaire aviaire - Google Patents

Production de vaccins viraux sur une lignee cellulaire aviaire Download PDF

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Publication number
WO2020120910A1
WO2020120910A1 PCT/FR2019/053036 FR2019053036W WO2020120910A1 WO 2020120910 A1 WO2020120910 A1 WO 2020120910A1 FR 2019053036 W FR2019053036 W FR 2019053036W WO 2020120910 A1 WO2020120910 A1 WO 2020120910A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
viral
strain
attenuated
vaccine
virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2019/053036
Other languages
English (en)
Inventor
Manuel Rosa-Calatrava
Guy Boivin
Julia DUBOIS
Mario Andres PIZZORNO
Olivier Terrier
Aurélien TRAVERSIER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite Laval
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Transgene SA
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Ecole Normale Superieure de Lyon
Universite Claude Bernard Lyon 1
Original Assignee
Universite Laval
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Transgene SA
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Ecole Normale Superieure de Lyon
Universite Claude Bernard Lyon 1
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite Laval, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Transgene SA, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Ecole Normale Superieure de Lyon, Universite Claude Bernard Lyon 1 filed Critical Universite Laval
Priority to US17/413,228 priority Critical patent/US20220054618A1/en
Priority to EP19842600.9A priority patent/EP3893928A1/fr
Priority to CA3123105A priority patent/CA3123105A1/fr
Priority to JP2021534236A priority patent/JP2022514261A/ja
Priority to BR112021011362-2A priority patent/BR112021011362A2/pt
Priority to CN201980091860.1A priority patent/CN113490507A/zh
Publication of WO2020120910A1 publication Critical patent/WO2020120910A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18311—Metapneumovirus, e.g. avian pneumovirus
    • C12N2760/18334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18311—Metapneumovirus, e.g. avian pneumovirus
    • C12N2760/18351—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • the present invention relates to the use of an immortalized avian cell line for the production of a pneumovirus type virus, and of viral vaccines consisting of live attenuated viral strains.
  • Pneumoviruses are viruses responsible for acute respiratory tract infections such as bronchiolitis, bronchitis or pneumonia, mainly in the at-risk populations of young children under 5, the elderly and the immunocompromised.
  • the family Pneumoviridae whose members were previously included in the family Paramyxoviridae, includes enveloped viruses with negative-polarity single-stranded RNA, including:
  • hVRS human respiratory syncytial virus
  • hMPV human metapneumovirus
  • ICTV International Committee on Virus Taxonomy
  • the hVRS virus is the most common cause of respiratory infections in young children. Very contagious, this virus mainly infects infants under two years of age.
  • the hMPV virus is also one of the major causes of pediatric bronchiolitis, responsible for 5 to 15% of hospitalizations attributable to acute lower respiratory tract infections in young children.
  • the average age of children hospitalized as a result of hMPV infection is 6 to 12 months, later than that caused by hVRS, which mainly occurs between 0 and 3 months.
  • ribavirin which is not free from adverse effects, or very expensive intravenous immunoglobulins, can be used occasionally for the treatment of severe cases of hMPV infections, as well as hVRS.
  • the usual clinical approach consists mainly of treating the symptoms of the infection, by putting patients on respiratory assistance (administration of oxygen or mechanized ventilation) and by administering bronchodilators, corticosteroids and / or antibiotics for them. prevent and / or treat secondary bacterial infections.
  • the company Novavax has developed a “non-living nanoparticle” vaccine candidate.
  • This vaccine is made up of nanoparticles with an F protein from the hVRS virus, genetically modified to increase its immunogenicity.
  • This vaccine candidate is intended for pregnant women, it would be used to generate transient immunization of the unborn child in utero.
  • GSK is also developing a vaccine for pregnant women to immunize the fetus in utero, based on recombinant antigens derived from the F protein of the hVRS virus.
  • Another approach is to use non-pathogenic viral vectors, such as adenoviruses, by making them express pneumovirus antigens.
  • adenoviruses A candidate vaccine for newborns, composed of an adenovirus encoding 3 major pneumovirus antigens (proteins F, N and M2.1) is currently being developed by the company GSK.
  • live attenuated vaccines made up of attenuated viral strains. Indeed, live attenuated vaccines have many advantages:
  • this vaccination strategy does not require the addition of adjuvants, the live attenuated vaccine being by nature sufficiently immunogenic to generate a satisfactory immune reaction.
  • viral vaccines are produced by a step of viral replication on virus host cells, cultured in vitro.
  • the choice of these cells is essential: they must be both:
  • Laboratory cell lines in their “adherent” form in culture, such as:
  • the MDCK cell line a canine cell line
  • Vero cell line an African green monkey kidney cell line, commonly used in cell culture to test various viruses
  • the PERC6 cell line a cell line of human origin
  • LLC-MK2 cell line a cell line derived from rhesus monkey kidney cells, available from ATCC under the number CCL-7, and commonly used for tests of infection by various viruses,
  • “industrialized” cell lines that is to say stable (“robust”), nonadherent, which can be cultured in the absence of serum (for example), and conform regulatory requirements for the production of viral vaccines for use in humans or animals have been established.
  • the EB66® cell line developed by VALNEVA is a line derived from duck embryonic cells; it has already enabled the development of several viral vaccines.
  • the AGE1.CR® cell lines distributed by ProBioGen come from several cell types, from gallinaceae or humans.
  • the AGE1.CR.plX® line is derived from musk duck cells (Jordan et al., 2009). This very stable line allows the production, on an industrial scale, of vectors from alphavirus and paramyxovirus genomes, as well as for the growth of poxviruses.
  • the present invention relates to the identification of an industrialized immortalized duck cell line allowing the replication of viral vectors derived from hMPV and / or hVRS viruses, in particular the replication of live attenuated viral vaccines derived from a specific viral strain of hMPV .
  • the present invention relates to the identification of an "industrializable" cell line which allows the replication of live attenuated viral vaccines intended to prevent infections by hMPV and / or hVRS.
  • the present invention relates to the use of the immortalized cell line ECACC 09070703, deposited with the European Collection of Cell Cultures (ECACC, Salisbury, United Kingdom) under the number 09070703 on July 7, 2009, for the production of a viral vaccine consisting of an attenuated strain derived from a human metapneumovirus.
  • Said viral vaccine may in particular be an attenuated strain derived from a human metapneumovirus comprising the genomic sequence represented by the sequence SEQ ID NO. 1.
  • said viral vaccine is an attenuated viral strain which has been genetically modified by the introduction of at least one exogenous gene, in particular a gene coding for an antigen derived from the hVRS virus, such as the fusion protein F by example.
  • the present invention also relates to a process for the production of a viral vaccine constituted by an attenuated strain derived from a human metapneumovirus, comprising the following steps:
  • step (a) Culture of said infected cells in step (a) for a period of between 2 and 14 days, in a suitable medium;
  • the present invention also relates to a viral vaccine as obtained by the method described above, as well as a pharmaceutical composition comprising said viral vaccine, and at least one pharmaceutically acceptable vehicle. According to another aspect, the present invention relates to said viral vaccine or to said pharmaceutical composition, for their use as a medicament.
  • the present invention relates to said viral vaccine or to said pharmaceutical composition, for their use in the prevention or treatment of viral infections, in particular infections by pneumovirus, and more particularly by human metapneumovirus and / or human respiratory syncytial virus.
  • the present invention also relates to a kit for implementing the process for producing a viral vaccine, comprising at least:
  • the immortalized cell line ECACC 09070703;
  • Figure 1 Replicative capacity of wild viral strain C-85473 in DuckCelt®-T17 cells, in comparison with the replicative capacities of wild strains CAN98-75, CAN97-82 and CAN99-81. The kinetics are stopped ( * ) when more than 50% of the cells are dead.
  • FIG. 1 a Monitoring of the quantity of cells according to the days post-viral infection
  • FIG. 1b Monitoring of the viral titer (TCID50 / ml) according to the days post-viral infection
  • FIG. 2a Cell growth after infection. Mock cells were not infected.
  • FIG. 2b Infectivity of the recombinant viruses C-85473 WT (GFP), ASH-C-85473 (GFP) and AG- C-85473 (GFP). The percentage of infected cells is evaluated by flow cytometry (detection of the expression of GFP expressed by these recombinant viruses) during the 14 days of viral kinetics.
  • FIG. 2c Viral replication of the recombinant viruses C-85473 WT (GFP), ASH- C-
  • FIG. 3a A cell mat of LLC-MK2 cells (left) and healthy reconstituted human respiratory epithelia MucilAir TM (right) were infected with the recombinant hMPV virus ASH-C-85473 at MOI (multiplicity of infection) 0.01 and 0.1, respectively. The photos were taken after 3, 5, 7, 12 and 17 days post-infection for the respiratory epithelium.
  • FIG. 3b A cell mat of LLC-MK2 cells (left) and healthy reconstituted human respiratory epithelia MucilAir TM (right) were infected with the recombinant hMPV virus AG-C-85473 at MOI (multiplicity of infection). 0.1 and 0.65, respectively. The photos were taken after 3, 5, 7, 12 and 17 days post-infection for the respiratory epithelium.
  • FIG. 3c The viral secretion at the apical pole of the infected epithelia was evaluated by RT-qPCR (number of copies of the viral gene N) from washings on the apical surface carried out on days 5, 7, 12 and 17 post-infection.
  • the viral replication of the attenuated recombinant viruses ASH-C-85473 and AG-C-85473 was compared with that of a wild-type recombinant virus C-85473 produced in DuckCelt®-T17 cells.
  • the detection threshold by RT-qPCR is 10 copies of viral N gene.
  • FIG. 3d Viral replication within infected epithelia was evaluated by RT-qPCR (number of copies of viral gene N) from lysates of epithelium to 17 th day post-infection.
  • the viral replication of the attenuated recombinant viruses ASH-C-85473 and AG-C-85473 was compared with that of a wild recombinant virus WT C-85473 produced in DuckCelt®-T17 cells.
  • the detection threshold by
  • RT-qPCR is 10 1 copies of viral N gene.
  • FIG. 4 BALB / c mice from 4 to 6 weeks of age were infected intranasally with 5 ⁇ 10 5 TCID 50 of the vaccine candidates ASH-C-85473 or AG-C-
  • the present invention relates to the use of the immortalized cell line ECACC 09070703, deposited on July 7, 2009 with the European Collection of Cell Cultures (ECACC, Salisbury, United Kingdom) under the number 09070703, for the production of a viral vaccine consisting of an attenuated viral strain derived from a human metapneumovirus.
  • the present invention relates to a new use of the DuckCelt®-T17 cell line, deposited with the European Collection of Cell Cultures (ECACC) under the access number 09070703, and previously described in the literature, in particular in applications WO 2007/077256, WO 2009/004016 and WO 2012/001075.
  • ECACC European Collection of Cell Cultures
  • the term “immortalized cell line” designates cells capable of growing in culture in vitro during at least 35 subcultures (dilution of the cells in a new culture medium), without losing their functional characteristics.
  • the cell lines described in WO 2012/001075, deposited with the ECACC under the numbers 09070701, 09070702 and 09070703 originate from duck embryonic cells (cairina moschata), and have been immortalized by introduction of the following nucleotide sequences:
  • dTERT duck telomerase reverse transcriptase
  • viruses such as poxviruses, adenoviruses, retroviruses, herpes viruses and influenza viruses.
  • Attenuated viral strains of human metapneumovirus Significant research is underway to produce a viral vaccine to prevent and / or treat infections with human metapneumorvirus and / or respiratory syncytial virus.
  • Attenuated viral strains derived from human metapneumovirus virus have been prepared and offered as vaccines.
  • the strain NL 00-1 belonging to the genotype A1
  • CAN 97-83 strain belonging to genotype A2
  • CAN 98-75 strain belonging to genotype B2.
  • a virus and "a viral strain” are used interchangeably to designate a particular viral strain, as identified previously.
  • derived strain means a recombinant viral strain obtained by the introduction of genetic modifications into the genome of a viral strain called "original strain".
  • the original strain is advantageously a wild strain, for example a clinical isolate.
  • the virulence of a viral strain corresponds to the degree of rapidity of multiplication of a virus in a given organism, therefore its speed of invasion.
  • attenuating virulence we mean reducing the speed at which a virus invades an organism.
  • This attenuation may take the form of a reduction in the replication capacities of the viral strain, a reduction in its capacity for infecting target cells, or even a reduction in the pathology induced by viral infection of the virus. 'organization.
  • Viral strains are considered to be attenuated in vitro when they have a reduced replicative capacity compared to the wild virus (WT), and / or when these viral strains cause the formation of infectious foci, in particular of syncytia (adjacent cells fusing more to viral infection), more restricted.
  • WT wild virus
  • attenuated viral strains replicate at a lower maximum titer and / or induce a less severe pathology (in terms of weight loss or inflammatory profile or histopathological damage) than the wild viral strain.
  • Attenuated viral strain is meant, within the meaning of the invention, a recombinant virus whose virulence is reduced compared to that of the original viral strain, that is to say less than that of the original viral strain.
  • tests in vitro, ex vivo or in vivo can be carried out, such as for example tests of replicative capacity in vitro (measured by viral titration TCID50 / ml or quantification of viral genome by quantitative PCR ), monitoring by microscopic observation of the evolution of cytopathic effects in vitro and ex vivo (in 3D model of human respiratory epithelium reconstituted and cultured at the air-liquid interface for example), or monitoring clinical signs of pathology and measurement of pulmonary viral titers in an in vivo infection model.
  • Tables 1, 2 and 3 below list the different approaches under development to obtain live attenuated vaccines from wild-type hMPV strains.
  • Table 1 List of candidate live attenuated vaccines based on a strain of hMPV virus presenting one or more mutations, developed or under development
  • V indicates that the cells used are susceptible / permissive to viral infection by said viral strain.
  • M Mouse
  • H hamster
  • CR Cotton Rat
  • CM Cynomolgus Macaque
  • AGM African Green Monkey
  • Ch Chimpanzee
  • Rh Rh for Rhesus Monkey
  • SCID Severe Combinée! ImmunoDeficiency.
  • aa denote amino acids
  • aa172 denotes the amino acid at position 172 in the protein sequence.
  • Table 2 List of live attenuated vaccine candidates developed or in development, comprising a strain of hMPV virus having a complete deletion of at least one gene
  • TM transmembrane domain
  • PIV Parainfluenza virus
  • SeV Sendai virus.
  • the international application WO 2005/014626 relates to several strains of hMPV virus, designated by the following names: CAN 97-83, CAN 98-75 and HMPV 00-1.
  • This application describes a recombinant hMPV virus strain, designated CAN 97-83, genetically modified to reduce its virulence.
  • the proposed modifications relate in particular to the total deletion of the genes coding for the G and / or SH proteins.
  • US Patent 8,841,433 further describes other isolated hMPV strains and their use for the preparation of vaccines.
  • attenuated strains derived from the clinical strain C-85473 of human metapneumovirus, comprising the genomic sequence represented by the sequence SEQ ID NO. 1 have been described and proposed as vaccine candidates.
  • These attenuated strains comprise one or more genetic modifications of said sequence SEQ ID NO.1, in particular the inactivation of the gene coding for the SH protein and / or of the gene coding for the G protein of said strain of metapneumovirus.
  • Attenuated viral strains derived from human metapneumovirus are candidate vaccines which are capable of being developed industrially to produce, on a large scale, vaccines intended to be administered to numerous patients, for a preventive and / or therapeutic aim.
  • EB66® and AGE1.CR.plX® did not allow sufficient replication of different viral strains derived from human metapneumovirus.
  • the present invention aims to meet this need, by having identified an immortalized cell line, having functional characteristics suitable for production of viruses on an industrial scale, for the replication of such attenuated strains derived from human metapneumovirus.
  • said attenuated strain has been genetically modified by inactivation of the gene coding for the SH protein and / or of the gene coding for the G protein of metapneumovirus.
  • Genetic modifications designate, within the meaning of the invention, all modifications of an original nucleotide sequence such as the deletion of one or more nucleotides, the addition of one or more nucleotides, and the replacement of one or more nucleotides. These modifications include in particular all the modifications making it possible to shift the genetic reading frame, or to introduce a stop codon in the middle of a coding sequence.
  • the inactivation of a gene designates the fact that this gene is modified so that the gene product is no longer expressed, or expressed in a non-active form, or expressed in an amount low that the activity of this protein is nonexistent.
  • This inactivation of a gene can be carried out by any technique well known to those skilled in the art.
  • the inactivation of a gene can be obtained by the introduction of a point mutation in the gene, by the partial or total deletion of the coding sequences of the gene, or by modification of the promoter of the gene.
  • Attenuated viral strains of human metapneumoviruses have been obtained by deletion of the genes coding for the accessory proteins SH, G and / or M2-2 (see Table 2).
  • SH protein is a type II membrane protein, whose functions are not yet fully characterized.
  • the deletion of the gene coding for the SH protein generates a recombinant virus capable of reproducing in vitro, and the virulence of which is attenuated in the upper respiratory tract of mice, but not in the lower part of said tract ( Bukreyev et al., 1997).
  • the functions of the SH protein are still being evaluated.
  • Protein G is also a type II membrane protein, its C-terminal end being outside the cell. This protein is not essential for the assembly of viral constituents, and for replication in vitro.
  • the deletion of the gene encoding this protein has been shown to attenuate the virulence of the strain during infection of the respiratory tract of mice (Teng et al., 2001).
  • the functions of the G protein are still being evaluated.
  • the attenuated viral strain is characterized in that the genetic modifications include the inactivation of the two genes coding for the G protein and the SH protein.
  • the inactivation of the two genes corresponds to the complete deletion of one or the other or of the two genes coding for the G and SH proteins.
  • said attenuated strain has been genetically modified by the introduction of at least one exogenous gene.
  • This exogenous gene could in particular be a gene coding for a viral antigen.
  • viral antigen means a protein element or of another nature, expressed by a virus, than the immunological system of an individual. recognizes as foreign and which provokes an immune response in said individual, in particular the production of specific antibodies.
  • the viral antigens may in particular be selected from the antigens expressed by at least one influenza virus, or by at least one virus of the pneumovirus family, such as the hVRS virus, or by at least one virus of the Paramyxoviridae family, such than the parainfluenza virus.
  • said viral antigen can be chosen from all or part of the F protein of the hVRS virus, and all or part of the hemagglutinin of the influenza or parainfluenza viruses.
  • said viral antigen is the F protein of the hVRS virus, in its stabilized pre-fusion conformation as described in the article (Krarup A et al. 2015).
  • Such an attenuated viral strain further comprising an exogenous viral antigen will, when administered to a patient, generate a multiple immune response, both against the expressed exogenous viral antigen and against the hMPV virus.
  • Such a strain making it possible to obtain a combined immune response against several viruses, following a single administration, is very advantageous.
  • said attenuated strain is derived from a human metapneumovirus comprising the genomic sequence represented by the sequence SEQ ID NO. 1.
  • said attenuated strain is derived from a human metapneumovirus viral strain, named C-85473, which was isolated from a patient sample in Canada. This strain belongs to the A1 subgroup of metapneumoviruses.
  • the C-85473 strain is characterized by large fusogenic capacities, allowing it to penetrate into target cells at a high frequency and / or a high degree of infection (Dubois et al., 2017).
  • the large fusogenic capacity of this strain makes it possible to generate syncytia, i.e. giant multinucleated cells, particularly large, made up of a very large number of cell nuclei.
  • the attenuated viral strain is derived from this strain C-85473 comprising the genomic sequence represented by the sequence SEQ ID NO. 1.
  • the genetic modifications introduced into this strain C-85473 to obtain a so-called “derivative of” strain are intended to attenuate the virulence of said original strain, and not to modify the identity of its genome.
  • the peptide sequence of the F protein of the original rC-85473 strain is not modified, and therefore has the same peptide sequence as the original strain.
  • the attenuated viral strain is chosen from:
  • a viral strain illustrating the implementation (i) is in particular the strain used in the examples of the present application, comprising the nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO. 2.
  • a viral strain illustrating implementation (ii) is in particular the strain used in the examples of the present application, comprising the nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO. 3.
  • the nucleotide sequence of the attenuated viral strain C-85473 can be, moreover, genetically modified by the introduction of at least one exogenous gene.
  • the attenuated viral strain C-85473 has a genomic sequence which comprises at least one exogenous gene.
  • This exogenous gene could in particular be a gene coding for a viral antigen.
  • Said viral antigen may in particular be selected from the antigens expressed by at least one influenza virus, or by at least one virus of the family of Pneumoviridae, such as the hRSV virus, or by at least one virus of the Paramyxoviridae family, such as the parainfluenza virus.
  • said viral antigen may be chosen from all or part of the protein F of the hRSV virus, and all or part of the hemagglutinin of the influenza or parainfluenza viruses.
  • said viral antigen is the F protein of the hVRS virus, preferably in its stabilized pre-fusion conformation as described in the article (Krarup A et al., 2015).
  • the attenuated viral strains used in the implementation of the present invention can come from various origins.
  • the attenuated viral strain may have been isolated from a patient suffering from a viral infection by pneumovirus, in particular by an hMPV or an hVRS.
  • certain infectious viral strains can exhibit a spontaneously attenuated character.
  • the attenuated viral strain may also have been genetically modified, from an unattenuated viral strain.
  • the attenuated viral strain can be obtained by reproduction of said virus on cells in culture. Frozen samples of the infectious viral particles thus produced may in particular be supplied by academic laboratories or hospitals.
  • the attenuated viral strain can be obtained from DNA sequences using reverse genetic technology, described in particular in the articles (Biacchesi et al., 2004) and (Aerts et al., 2015 ).
  • the principle of this technology which allows the production of recombinant hMPV viruses, is based for example on the use of a hamster kidney cell line (BHK-21) modified to constitutively express the RNA polymerase of bacteriophage T7 (BHK cells -T7 or BSR-T7 / 5).
  • the genomic elements are divided into five plasmid elements: a plasmid coding for the antigenome of the hMPV virus and 4 “satellite” plasmids, coding for the viral proteins of the transcription machinery (L, P, N and M2-1).
  • RNA strand corresponding to the viral genomic strand is transcribed by T7polymerase from its promoter.
  • RNA-dependent RNA polymerase RdRP
  • This functional viral polymerase thus transcribes genomic RNA into viral mRNA and then replicates it into new viral genomic RNA molecules, via transcription of template strands.
  • the translation and assembly of viral proteins with genomic RNA thus allows budding of infectious hMPV particles from the cytoplasmic membrane of transfected BHK-T7 cells. Then, the amplification of the recombinant viruses is allowed thanks to the addition in co-culture of LLC-MK2 cells (ATCC CCL-7), permissive to infection.
  • the present invention relates to a method for producing a viral vaccine as defined above, comprising the following steps:
  • step (a) Culture of said cells infected in step (a) for a period of between 2 and 14 days in a suitable medium;
  • the attenuated viral strain used in step (a) will have been obtained in particular by one of the technologies described above.
  • this process may include additional steps, optional and not indicated here. Furthermore, according to a particular implementation, this process could consist exactly of the three successive steps (a), (b) and (c) mentioned above.
  • the infection step (a) will be carried out under appropriate conditions, such as for example under the following conditions:
  • the infection medium may be the OptiPRO TM SFM culture medium (Gibco TM) suitable for the DuckCelt®-T17 cell line and supplemented with 4mM L-Glutamine, 0.1% to 0.5% of Pluronic®, and trypsin from 0.1 pg / ml to 3pg / ml of final volume. Trypsin is supplemented in the middle during infection but also every 2 to 3 days for the duration of viral production;
  • the cell density of the cells will be between 0.5 ⁇ 10 6 and 5 ⁇ 10 6 cells / ml;
  • infection with the attenuated viral strain will be carried out at a multiplicity of infection (MOI) of between 1 and 0.0001.
  • MOI multiplicity of infection
  • Step (b) of culturing the infected cells will be carried out under conditions suitable for normal growth of the cells, well known to those skilled in the art.
  • conditions suitable for normal growth of the cells well known to those skilled in the art.
  • the bioproduction equipment for cells in suspension may be of the TubeSpin® type or a flask of 50 ml to 200 ml on a Kühner type shaking tray incubator, or a 500 ml to 2 liter bioreactor of the miniBioReactor Applikon BioTechnology type, or of the UniVessel type SU Sartorius Stedim Biotech; and the temperature of the culture medium will be between 33 and 37 ° C; the pH between 7 and 7.4; agitation between 100 and 200rpm and the oxygen content between 40 and 60%.
  • the cell culture stage can last from 2 to 14 days, depending on cell growth and the replicative capacities of the virus.
  • the culture step may in particular be carried out for a period of 3 to 12 days, or from 4 to 10 days, or again from 5 to 9 days, or from 6 to 8 days.
  • Stage (c) of harvesting the infectious viral particles will be carried out by any technique well known to those skilled in the art, such as clarification of the production culture medium, followed by purification, concentration and quantification stages of the viral particles .
  • the present invention relates to a viral vaccine capable of being obtained by the method described above.
  • Said viral vaccine consists of infectious viral particles collected in step (c) of the method described.
  • the present invention relates to a viral vaccine obtained by the method described above.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising said viral vaccine, and at least one pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the term “pharmaceutically acceptable vehicle” means vehicles or excipients, that is to say “inactive” compounds, having no therapeutic properties. These vehicles or excipients can be administered to an individual or an animal without risk of significant deleterious effects or unhealthy undesirable effects.
  • compositions may be present in said composition: for example, adjuvants and / or excipients.
  • composition according to the invention comprises at least one effective amount of the viral vaccine.
  • an amount of attenuated viral strain sufficient to trigger an immune reaction in the organism to which it is administered.
  • the present pharmaceutical composition can also be designated as being a vaccine composition.
  • compositions according to the present invention are especially suitable for oral, sublingual, or inhalation administration.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is suitable for administration by inhalation, that is to say by the nasal and / or buccal routes.
  • Inhalation refers to absorption through the respiratory tract. It is in particular a method of absorption of compounds for therapeutic purposes, of certain substances in the form of gases, micro-droplets or powder in suspension.
  • compositions are in the form of powders
  • administration by nebulization when the compositions are in the form of aerosols (suspensions) or in the form of solutions, for example aqueous solutions, pressurized.
  • a nebulizer or a sprayer will then be recommended for administering the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical form of the pharmaceutical composition considered here is therefore advantageously chosen from: a powder, an aqueous suspension of droplets or a solution under pressure.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is suitable for administration by the nasal route, in particular by inhalation.
  • composition can be used as a preventive vaccine, that is to say intended to stimulate a specific immune response before infection of an organism by a pathogenic virus.
  • composition can also be used as a therapeutic vaccine, that is to say intended to stimulate a specific immune response concomitantly with the infection of an organism by said pathogenic virus.
  • the present invention also relates to the viral vaccine as described above, or to the pharmaceutical composition as described, for their use as a medicament, in other words for their therapeutic use.
  • this viral vaccine or this pharmaceutical composition will be used in therapy for the treatment and / or prevention of viral infections.
  • Treatment of viral infections means fighting a virus infection in an organism. The goal is to obtain a decrease in the rate of viral infection (infectious titer) in the body, and preferably to obtain a complete eradication of the virus from the body.
  • treatment also refers to the action of alleviating the symptoms associated with viral infection (respiratory syndrome, kidney failure, fever, etc.).
  • prevention of viral infections designates preventing, or at least reducing the risk of an infection in an organism. Thanks to this preventive action, the cells of said organism become less permissive to viral infection, and are therefore more resistant to infection by said virus. In addition, the organism will advantageously have developed specific immune cells, allowing a specific fight against the aforementioned virus, thus limiting its entry into the cells of the body.
  • the invention relates to the viral vaccine or the pharmaceutical composition as described above, for their use in the prevention of viral infections, in particular infections by pneumovirus, and in particular by human metapneumovirus and / or human respiratory syncytial virus.
  • said viral vaccine or said pharmaceutical composition is used in the prevention of infections by pneumoviruses.
  • said viral vaccine or said pharmaceutical composition is used in the prevention of infections with a human metapneumovirus.
  • said viral vaccine or said pharmaceutical composition is used in the prevention of infections by an orthopneumovirus, in particular by the human respiratory syncytial virus.
  • the invention relates to the viral vaccine or the pharmaceutical composition as described above, for their use in the treatment of viral infections, in particular infections by pneumovirus, and more particularly by human metapneumovirus and / or respiratory virus human syncytial.
  • said viral vaccine or pharmaceutical composition comprising it may be used, in certain cases and under certain conditions, in a therapeutic approach, in individuals already infected with one of these viruses, in particular in adult individuals.
  • the present invention also relates to a method for preventing a viral infection in humans, in particular an infection with pneumoviruses, more particularly with a human metapneumovirus and / or with a human respiratory syncytial virus, comprising administration to individuals susceptible to be infected with such a virus with an effective amount of a viral vaccine as described above, or a pharmaceutical composition comprising it.
  • Said vaccine or said composition for their use in the prevention and / or treatment of viral infections are intended for all types of individuals, both newborns and elderly adults.
  • said vaccine or said composition for their use in the prevention and / or treatment of viral infections are intended for pediatric use, that is to say are intended to be administered to a pediatric population.
  • a pediatric population designates a population of individuals made up of individuals aged less than 18 years, and more specifically young children aged less than 5 years, and infants.
  • viruses of the Pneumoviridae family mainly infect these individuals, who tend to exhibit so-called "naive" immunity, and therefore less strong, than older individuals.
  • kits for implementing the process for preparing a viral vaccine comprising:
  • the immortalized cell line ECACC 09070703;
  • An attenuated viral strain derived from a human metapneumovirus comprising the genomic sequence represented by the sequence SEQ ID NO. 1.
  • Said attenuated viral strain may in particular have been genetically modified, in particular by inactivation of the gene coding for the SH protein and / or of the gene coding for the G protein of said metapneumovirus strain.
  • said attenuated viral strain may have a genomic sequence which comprises at least one exogenous gene.
  • This exogenous gene may in particular be a gene coding for a viral antigen originating from another virus, such as for example all or part of the protein F of the hRSV virus, and / or all or part of the hemagglutinin of the influenza or parainfluenza viruses .
  • said viral strain will in particular be one of the strains presented in the examples of the present application:
  • the viral strain comprising the nucleotide sequence as represented in SEQ ID NO. 2, optionally further comprising at least one exogenous gene; or
  • the viral strain comprising the nucleotide sequence as represented in SEQ ID NO. 3, optionally further comprising at least one exogenous gene.
  • This kit may also include other elements, such as for example culture medium suitable for the growth of the cell line, and / or a manual specifying the ideal conditions for the preparation of the live attenuated viral vaccine.
  • Example 1 Use of the DuckCelt®-T17 Cell Line for the Replication of Wild Viral Strains of Subgroup A1 (C-85473 and CAN99-81), of Subgroup B1 (CAN97-82) and of Subgroup B2 (CAN98-75)
  • DuckCelt®-T17 cells are cultured in OptiPro + L-glutamine 4mM final medium in TubeSpin 50ml in Kuhner shaker at a speed of 175 rpm, at 37 ° C with 5% C02 and 85% hygrometry, and diluted to 1 x 10 6 cells / ml in 10 ml of medium. They were infected at a multiplicity of infection (MOI) of 0.01 by wild viral strains (non-GFP) of the A1 subgroup (C-85473 and CAN99-81), of the B1 subgroup (CAN97-82 ) and of subgroup B2 (CAN98-75) in the presence of trypsin (T6763 Sigma) at
  • MOI multiplicity of infection
  • Viral production is measured by titration of the number of infectious particles per ml in the culture medium (expressed in TCID50 / ml) from samples taken every 2 to 3 days up to 14 days post-infection. The results are presented in Figure 1b.
  • the kinetics of viral replication are stopped when cell death reaches more than 50%, that is to say 8 days post-infection for the viral strain C-85473 and 14 days post infection for the viral strains CAN99-81, CAN97-82 and CAN98 -75.
  • the CAN98-75 virus demonstrates a low viral production from 4 to 9 days post-infection while the CAN99-81 and CAN97-82 viruses are detectable at levels below the initial inoculum or below the detection thresholds up to 14 days post infection.
  • the viral strain C-85473 has a replication capacity on DuckCelt®-T17 cells very significantly greater than that of other hMPV viral strains.
  • the cell death rate observed from 8 days post-infection indicates that the infection capacities of this strain on this cell line are significant.
  • Example 2 Use of the DuckCelt®-T17 cell line for the replication of the wild strain C-85473 WT, which is recombinant because it expresses with the Green Fluorescent Protein (GFP), and of the recombinant viral strains ASH-C-85473 (GFP) and AG- C- 85473 (GFP).
  • the viral strains used in this example have the following genomic sequences:
  • DuckCelt®-T17 cells are maintained in culture in OptiPro + L-glutamine 4mM final medium in 50ml TubeSpin in Kuhner shaker at a speed of 175 rpm, at 37 ° C with 5% CO2 and 85% humidity.
  • the cells are diluted to 1 ⁇ 10 6 cells / ml in 10 ml of culture medium and then are infected with recombinant wild hMPV viruses (C-85473 WT), or deleted from the genomic sequence coding for the SH protein ( ASH-C-85473) or deleted from the genomic sequence coding for protein G (AG-C-85473), at a multiplicity of infection (MOI) of 0.01 in the presence of trypsin (T6763 Sigma) at 0.5pg / ml.
  • the "Mock" cells are cells which have not been infected and constitute the negative control of the experiment.
  • the kinetics of viral replication are stopped when cell death reaches more than 50%, that is to say after 14 days on average.
  • Viral production is measured by titration of the number of infectious particles per ml of culture medium (expressed in TCID50 / ml) from samples taken every 2 to 3 days during the 14 days of kinetics. The results obtained are presented in FIG. 2C.
  • the peak of viral production for the three viral strains is 11 days post infection.
  • the results indicate that the DuckCelt®-T17 line is "permissive", that it can be infected with the recombinant viruses C-85473 and in particular live attenuated viruses ASH-C-85473 and AG-C-85473, and allow the production of viral particles.
  • This example relates to the measurement of the replicative capacities of the recombinant viruses ASH-C-85473 and AG-C-85473 produced on DuckCelt®-T17 cells, in comparison with a recombinant virus C-85473 WT:
  • a cell mat of LLC-MK2 cells and healthy reconstituted human respiratory epithelia MucilAir TM were infected with:
  • RT-qPCR number of copies of viral gene N
  • the results obtained indicate that the attenuated live viruses ASH-C-85473 and AG-C-85473 produced on DuckCelt®-T17 cells are functional and retain their capacity to infect LLC-MK2 cells and in particular the 3D model of reconstituted human pulmonary epithelium (MucilAir TM, Epithelix).
  • Example 4 The recombinant viruses ASH-C-85473 and AG-C-85473 produced on DuckCelt®-T17 cells retain their attenuated character in vivo.
  • mice aged 4 to 6 weeks were infected intranasally with:
  • mice infected with the live attenuated viruses ASH-C-85473 or AG-C- 85473 produced on DuckCelt®-T17 cells show no sign of pathology or mortality, thus demonstrating the attenuation character of these viruses produced on DuckCelt®-T17 cells.
  • Petiot E Proust A, Traversier A, Durous L, Dappozze F, Gras M, Guillard C, Balloul JM, Rosa-Calatrava M. Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt®-T17. Vaccinated. 2018 May 24; 36 (22): 3101 -31 1 1.
  • Herfst S de Graaf M, Schrauwen EJ, Sprong L, Hussain K, van den Hoogen BG, Osterhaus AD, Fouchier RA. Generation of temperature-sensitive human metapneumovirus strains that provide protective immunity in hamsters. J Gen Virol. 2008 Jul; 89 (Pt 7): 1553-62.
  • HMPV human metapneumovirus

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation de la lignée cellulaire immortalisée ECACC 09070703, déposée le 7 juillet 2009 auprès de l'European Collection of Cell Cultures (ECACC, Salisbury, Royaume Uni) sous le numéro 09070703, pour la production d'un vaccin viral constitué parune souche atténuée dérivée d'un metapneumovirus humain. Figure pour l'abrégé : NON

Description

PRODUCTION DE VACCINS VIRAUX SUR UNE LIGNEE CELLULAIRE AVIAIRE
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne l'utilisation d’une lignée cellulaire aviaire immortalisée pour la production d’un virus de type pneumovirus, et de vaccins viraux constitués de souches virales atténuées vivantes.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Les pneumovirus
Les pneumovirus sont des virus responsables d’infections aiguës des voies respiratoires telles que des bronchiolites, des bronchites ou des pneumonies, principalement chez les populations à risques que sont les jeunes enfants de moins de 5 ans, les personnes âgées et les personnes immunodéprimées.
La famille des Pneumoviridae, dont les membres étaient précédemment inclus dans la famille des Paramyxoviridae, comprend des virus enveloppés à ARN simple brin de polarité négative, dont :
le virus respiratoire syncytial humain (hVRS), représentant de la sous-famille des orthopneumovirus, et
le métapneumovirus humain (hMPV), représentant de la sous-famille des metapneumovirus (selon le Rapport du Comité International sur la Taxonomie des Virus (ICTV)).
Il n’y a aujourd’hui aucun vaccin disponible sur le marché, ni traitement spécifique et efficace, contre ces virus hMPV et/ou hVRS.
Le virus hVRS est la cause la plus fréquente d'infections respiratoires des jeunes enfants. Très contagieux, ce virus infecte principalement les nourrissons âgés de moins de deux ans.
Le virus hMPV est également une des causes majeures de bronchiolite pédiatrique, responsable de 5 à 15% des hospitalisations imputables aux infections des voies respiratoires basses aiguës chez les jeunes enfants. L’âge moyen des enfants hospitalisés des suites d’une infection par le hMPV est de 6 à 12 mois, soit plus tard que celle provoquée par le hVRS, qui survient principalement entre 0 et 3 mois.
Ces deux virus sont également les agents étiologiques responsables de 12 à 15% des consultations pour infections des voies respiratoires hautes et basses des enfants non-hospitalisés. En termes de traitement, la ribavirine, non exempt d’effets indésirables, ou encore les immunoglobulines intraveineuses, très onéreuses, peuvent être utilisées ponctuellement pour le traitement de cas graves d’infections par hMPV, tout comme par hVRS.
D’autres types de traitements sont en cours de développement et/ou de caractérisation tels que les peptides inhibiteurs de fusion, les glycosaminoglycanes sulfate, les ARN inhibiteurs et certains immunomodulateurs.
La démarche clinique usuelle et largement privilégiée aujourd’hui consiste à traiter surtout les symptômes de l’infection, en mettant les patients sous assistance respiratoire (administration d’oxygène ou ventilation mécanisée) et en leur administrant des bronchodilatateurs, corticostéroides et/ou antibiotiques pour prévenir et/ou traiter les surinfections bactériennes.
Stratégies de vaccination développées pour la prévention des infections à pneumovirus
En ce qui concerne la vaccination, les principales populations ciblées par le hMPV étant les nourrissons, les jeunes enfants et les personnes âgées, il est crucial de pouvoir disposer de vaccins efficaces et sécuritaires, afin de réduire les atteintes respiratoires sévères qui ont un impact dramatique dans ces tranches d’âge.
La mise au point de vaccins contre des pneumovirus tels que le hMPV et/ou le hVRS représente donc non seulement un enjeu sanitaire majeur, mais également un réel enjeu socio-économique avec l’objectif de (i) réduire les coûts importants des traitements et d’hospitalisations associés à ces infections, et (ii) diminuer l’utilisation d’antibiotiques dans le contexte des surinfections bactériennes, et ainsi limiter l’émergence de résistances.
Différentes stratégies vaccinales ont été développées à ce jour (Mazur et al., 2018).
Par exemple, la société Novavax a développé un candidat vaccin « non vivant à nanoparticule ». Ce vaccin est composé de nanoparticules présentant une protéine F du virus hVRS, modifiée génétiquement afin d’augmenter son immunogénicité. Ce candidat vaccin est à destination des femmes enceintes, il serait ainsi utilisé pour générer une immunisation transitoire de l’enfant à naitre in utero.
La société GSK développe également un vaccin à destination des femmes enceintes pour immuniser le foetus in utero, basé sur des antigènes recombinants dérivés de la protéine F du virus hVRS.
Une autre approche consiste à utiliser des vecteurs viraux non pathogènes, tels que des adénovirus, en leur faisant exprimer des antigènes de pneumovirus. Un candidat vaccin à destination des nouveau-nés, composé d’un adénovirus codant pour 3 antigènes majeurs du pneumovirus (protéines F, N et M2.1 ) est actuellement en cours de développement par la société GSK.
Ces approches vaccinales se basent sur l’injection ou l’expression de protéines recombinantes, sous différentes formes. Or, l’inconvénient de ces approches est la faible immunogénicité inhérente à ces protéines, qui par nature n’induisent que peu de réponse immunitaire. L’ajout d’adjuvants potentiellement nocifs, tels que des sels d’aluminium, doit donc être envisagé dans la plupart des cas.
En conséquence, les approches basées sur l’utilisation de vaccins dits « vivants atténués », constitués de souches virales atténuées, sont à privilégier. En effet, les vaccins vivants atténués présentent de nombreux avantages :
ils peuvent être administrés par voie intra-nasale et mimer la voie d’entrée naturelle des virus sauvages, induisant ainsi une réponse immunitaire assez similaire de celle physiologiquement observée après une infection hMPV et/ou hVRS ;
c’est une stratégie qui n’a jamais été décrite comme étant associée à une réaction inflammatoire exagérée (comme cela peut être observé après administration de vaccins inactivés) ;
cette stratégie vaccinale ne nécessite par l’ajout d’adjuvants, le vaccin vivant atténué étant par nature suffisamment immunogénique pour générer une réaction immunitaire satisfaisante.
Ces approches sont particulièrement intéressantes pour la vaccination des enfants à partir de 6 mois.
Difficultés liées à la préparation de vaccins viraux vivants atténués à une échelle industrielle
Ces vaccins viraux sont produits par une étape de réplication virale sur des cellules hôtes du virus, cultivées in vitro. Le choix de ces cellules est primordial : elles doivent être à la fois :
(i) des cellules hôtes dudit virus, c’est-à-dire permissives vis-à-vis de l’infection par le virus et de la réplication dudit virus, et
(ii) des cellules « industrialisâmes » c’est-à-dire conformes à la réglementation en vigueur pour la production de vaccins à l’échelle industrielle.
Il n’y a à ce jour aucune lignée cellulaire industrielle enregistrée qui présente des capacités de permissivité et de production de candidats vaccins vivants atténués contre les infections à pneumovirus. Des lignées cellulaires de laboratoire, dans leur forme « adhérente » en culture, telles que :
la lignée cellulaire MDCK, une lignée cellulaire canine,
la lignée cellulaire Vero, une lignée de cellules de rein de singe vert africain, couramment utilisée en culture cellulaire pour tester divers virus,
la lignée cellulaire PERC6, une lignée cellulaire d’origine humaine, et
la lignée cellulaire LLC-MK2, une lignée cellulaire issue de cellules de rein de singe rhésus, disponible à l’ATCC sous le numéro CCL-7, et couramment utilisée pour des tests d’infection par divers virus,
ont été utilisées pour le développement expérimental de certains candidats vaccins (voir tableaux 1 à 3) ; toutefois, ces lignées cellulaires adhérentes ne présentaient pas les caractéristiques nécessaires pour être utilisées à une échelle industrielle.
Pour la production des vaccins ayant une réplication de type viral, des lignées cellulaires « industrialisâmes », c’est-à-dire stables (« robustes »), non adhérentes, pouvant être cultivées en absence de sérum (par exemple), et conformes aux exigences règlementaires pour la production de vaccins viraux destinés à être administrés à l’être humain ou aux animaux, ont été établies.
Deux types de lignées cellulaires sont notamment classiquement utilisées :
La lignée cellulaire EB66® développée par VALNEVA est une lignée dérivée de cellules embryonnaires de canard ; elle a déjà permis le développement de plusieurs vaccins viraux.
Les lignées cellulaires AGE1.CR® distribuées par ProBioGen sont issues de plusieurs types cellulaires, issus de gallinacées ou d’humains. En particulier la lignée AGE1.CR.plX® est dérivée de cellules de canard musqué (Jordan et al., 2009). Cette lignée très stable permet la production, à une échelle industrielle, de vecteurs issus de génomes d’alphavirus et de paramyxovirus, ainsi que pour la croissance des poxvirus.
Toutefois, à ce jour, la production des virus hVRS et hMPV n’a pu être réalisée sur ces lignées cellulaires établies, bien connues de l’Homme de l’art.
La présente invention est relative à l’identification d’une lignée cellulaire de canard immortalisée industrialisable permettant la réplication de vecteurs viraux issus des virus hMPV et/ou hVRS, notamment la réplication de vaccins viraux vivants atténués issus d’une souche virale spécifique de hMPV. EXPOSE DE L'INVENTION
A l’heure actuelle, il n’existe pas de vaccins permettant de prévenir les infections par les pneumovirus, responsables d’infections aiguës des voies respiratoires. Ceci est en partie dû au fait que la reproduction de ces virus in vitro est difficile. En particulier, ces virus n’ont pas été décrits comme pouvant se multiplier sur les lignées cellulaires industrialisables connues et bien établies, telles que les lignées EB66® et AGE1.CR®.
La présente invention est relative à l’identification d’une lignée cellulaire « industrialisable », qui permet la réplication de vaccins viraux vivants atténués destinés à prévenir les infections par hMPV et/ou hVRS.
Plus spécifiquement, la présente invention concerne l’utilisation de la lignée cellulaire immortalisée ECACC 09070703, déposée auprès de l’European Collection of Cell Cultures (ECACC, Salisbury, Royaume Uni) sous le numéro 09070703 le 7 juillet 2009, pour la production d’un vaccin viral constitué par une souche atténuée dérivée d’un metapneumovirus humain.
Ledit vaccin viral pourra notamment être une souche atténuée dérivée d’un metapneumovirus humain comprenant la séquence génomique représentée par la séquence SEQ ID NO. 1.
Selon une mise en oeuvre particulière, ledit vaccin viral est une souche virale atténuée qui a été modifiée génétiquement par introduction d’au moins un gène exogène, notamment un gène codant pour un antigène issu du virus hVRS, telle que la protéine de fusion F par exemple.
La présente invention est également relative à un procédé de production d’un vaccin viral constitué par une souche atténuée dérivée d’un metapneumovirus humain, comprenant les étapes suivantes :
a) Infection de cellules en culture de la lignée déposée auprès de l’ECACC sous le numéro d’accès 09070703, par une souche virale atténuée dérivée d’un metapneumovirus humain ;
b) Culture desdites cellules infectées à l’étape (a) pendant une durée comprise entre 2 et 14 jours, dans un milieu adapté ;
c) Récolte du vaccin viral constitué des particules virales infectieuses de ladite souche virale atténuée produites pendant l’étape (b).
La présente invention concerne également un vaccin viral tel qu’obtenu par le procédé décrit ci-dessus, ainsi qu’une composition pharmaceutique comprenant ledit vaccin viral, et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Selon un autre aspect, la présente invention est relative audit vaccin viral ou à ladite composition pharmaceutique, pour leur utilisation en tant que médicament.
Plus spécifiquement, la présente invention est relative audit vaccin viral ou à ladite composition pharmaceutique, pour leur utilisation dans la prévention ou le traitement des infections virales, notamment des infections par pneumovirus, et plus particulièrement par metapneumovirus humain et/ou virus respiratoire syncytial humain.
La présente invention concerne également un kit pour la mise en oeuvre du procédé de production d’un vaccin viral, comprenant au moins:
La lignée cellulaire immortalisée ECACC 09070703 ; et
- Une souche virale atténuée dérivée d’un metapneumovirus humain comprenant la séquence génomique représentée par la séquence SEQ ID NO. 1 , et en particulier une souche virale atténuée comprenant l’une des séquences génomiques représentées en SEQ ID NO. 2 ou NO.3.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1. Capacité réplicative de la souche virale sauvage C-85473 en cellules DuckCelt®-T17, en comparaison avec les capacités réplicatives des souches sauvages CAN98-75, CAN97-82 et CAN99-81. La cinétique est arrêtée (*) lorsque plus de 50% des cellules sont mortes.
[Fig. 1 a] Suivi de la quantité de cellules en fonction des jours post-infection virale
[Fig. 1 b] Suivi du titre viral (TCID50/ml) en fonction des jours post-infection virale
Figure 2. Capacités réplicatives des virus recombinants sauvage C-85473 WT (GFP) et atténués ASH- C-85473 (GFP) et AG- C-85473 (GFP) en cellules DuckCelt®-T17.
[Fig. 2a] Croissance cellulaire après infection. Les cellules Mock n’ont pas été infectées.
[Fig. 2b] Infectivité des virus recombinants C-85473 WT (GFP), ASH- C-85473 (GFP) et AG- C-85473 (GFP). Le pourcentage de cellules infectées est évalué par cytométrie de flux (détection de l’expression de GFP exprimée par ces virus recombinants) pendant les 14 jours de la cinétique virale.
[Fig. 2c] Réplication virale des virus recombinants C-85473 WT (GFP), ASH- C-
85473 (GFP) et AG- C-85473 (GFP). La production virale est mesurée par titration du nombre de particules infectieuses par ml de milieu de culture (exprimé en TCID50/ml) à partir d’échantillons prélevés tous les 2 à 3 jours pendant les 14 jours de cinétique. Figure 3. Capacités réplicatives en cellules LLC-MK2 et en modèle 3D d’épithélium respiratoire humain reconstitué et cultivé à l’interface air-liquide (MucilAir™) des virus recombinants ASH- C-85473 (GFP) et AG- C-85473 (GFP) produits en cellules DuckCelt®-T17.
[Fig. 3a] Un tapis cellulaire de cellules LLC-MK2 (à gauche) et des épithéliums respiratoires humains reconstitués sains MucilAir™ (à droite) ont été infectés par le virus hMPV recombinant ASH-C-85473 à des MOI (multiplicité d’infection) de 0.01 et de 0.1 , respectivement. Les photos ont été prises après 3, 5, 7, 12 et 17 jours post-infection pour l’épithélium respiratoire.
[Fig. 3b] Un tapis cellulaire de cellules LLC-MK2 (à gauche) et des épithéliums respiratoires humains reconstitués sains MucilAir™ (à droite) ont été infectés par le virus hMPV recombinant AG-C-85473 à des MOI (multiplicité d’infection) de 0.1 et de 0.65, respectivement. Les photos ont été prises après 3, 5, 7, 12 et 17 jours post-infection pour l’épithélium respiratoire.
[Fig. 3c] La sécrétion virale au pôle apical des épithéliums infectés a été évaluée par RT-qPCR (nombre de copies du gène viral N) à partir de lavages en surface apicale réalisés aux jours 5, 7, 12 et 17 post-infection. La réplication virale des virus recombinants atténués ASH- C-85473 et AG- C-85473 a été comparée à celle d’un virus recombinant C-85473 sauvage produit en cellules DuckCelt®-T17. Le seuil de détection par RT-qPCR est à 10 copies de gène viral N.
[Fig. 3d] La réplication virale au sein des épithéliums infectés a été évaluée par RT-qPCR (nombre de copies du gène viral N) à partir de lysats d’épithélium au 17eme jour post-infection. La réplication virale des virus recombinants atténués ASH- C-85473 et AG- C-85473 a été comparée à celle d’un virus recombinant WT C-85473 sauvage produit en cellules DuckCelt®-T17. Le seuil de détection par
RT-qPCR est à 101 copies de gène viral N.
Figure 4. Les virus recombinants ASH- C-85473 (GFP) et AG- C-85473 (GFP) produits sur cellules DuckCelt®-T17 conservent leur caractère d’atténuation in vivo.
[Fig. 4] Des souris BALB/c de 4 à 6 semaines ont été infectées par voie intranasale avec 5x105 TCID50 des candidats vaccinaux ASH-C-85473 ou AG-C-
85473 produits sur cellules DuckCelt®-T17, ou du milieu de culture (mock) comme contrôle. Un suivi quotidien du poids et de la mortalité des souris infectées a été effectué pendant 9 jours après infection et comparé aux souris non infectées (mock). DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention concerne l’utilisation de la lignée cellulaire immortalisée ECACC 09070703, déposée le 7 juillet 2009 auprès de l’European Collection of Cell Cultures (ECACC, Salisbury, Royaume Uni) sous le numéro 09070703, pour la production d’un vaccin viral constitué par une souche virale atténuée dérivée d’un metapneumovirus humain.
Lignée cellulaire de l’ECACC N° 09070703
Ainsi, la présente invention concerne une nouvelle utilisation de la lignée cellulaire DuckCelt®-T17, déposée auprès de l’European Collection of Cell Cultures (ECACC) sous le numéro d’accès 09070703, et préalablement décrite dans la littérature, notamment dans les demandes internationales WO 2007/077256, WO 2009/004016 et WO 2012/001075.
Ces demandes sont relatives à la préparation de lignées cellulaires aviaires immortalisées, et à leur utilisation pour la reproduction de virus.
Le terme « lignée cellulaire immortalisée » désigne des cellules capables de croître en culture in vitro pendant au moins 35 repiquages (dilution des cellules dans un nouveau milieu de culture), sans perdre leurs caractéristiques fonctionnelles.
Brièvement, les lignées cellulaires décrites dans WO 2012/001075, déposées auprès de l’ECACC sous les numéros 09070701 , 09070702 et 09070703 sont issues de cellules embryonnaires de canard ( cairina moschata), et ont été immortalisées par introduction des séquences nucléotidiques suivantes :
- la séquence nucléotidique de la région E1A issue du génome d’un adénovirus, codant pour les ARN 12S et 13S ; et
- le gène codant pour la transcriptase reverse télomérase de canard (dTERT).
La destination principale de ces lignées cellulaires est leur utilisation pour la réplication de virus, tels que des poxvirus, adénovirus, rétrovirus, virus de l’herpès et virus influenza.
Récemment, Petiot et ses collaborateurs (Petiot et al., 2018) ont mis en évidence le fait que la lignée cellulaire aviaire DuckCelt®-T17, déposée auprès de l’ECACC sous le numéro 09070703, pouvait être avantageusement utilisée pour la production de particules infectieuses de virus Influenza de différentes origines (humaine, aviaire, porcine).
Souches virales atténuées de metapneumovirus humain D’importantes recherches ont lieu actuellement dans le but de produire un vaccin viral permettant de prévenir et/ou traiter les infections par metapneumorvirus et/ou virus respiratoire syncytial humain.
En particulier, des souches virales atténuées dérivées de virus metapneumovirus humain ont été préparées et proposées comme vaccins.
L’analyse génétique de souches cliniques du hMPV a permis de définir deux groupes majeurs (génotypes A et B) et quatre sous-groupes « mineurs » (A1 , A2, B1 et B2), basés principalement sur la variabilité de séquence des glycoprotéines de surface d’attachement (G) et de fusion (F). Il a ensuite été montré que ces groupes pouvaient encore être sous-divisés en sous-lignées telles que A2a, A2b et A2c (Huck et al., 2006 ; Nidaira et al. , 2012).
Parmi les souches virales largement étudiées, on peut citer la souche NL 00-1 , appartenant au génotype A1 ; la souche CAN 97-83 appartenant au génotype A2 ; et la souche CAN 98-75, appartenant au génotype B2.
Dans la présente demande, les termes « un virus » et « une souche virale » sont utilisés indifféremment pour désigner une souche virale particulière, telle qu’identifiée précédemment.
Au sens de l’invention, on entend par « souche dérivée » une souche virale recombinante obtenue par l’introduction de modifications génétiques dans le génome d’une souche virale dite « souche d’origine ». La souche d’origine est avantageusement une souche sauvage, par exemple un isolat clinique.
La virulence d’une souche virale correspond au degré de rapidité de multiplication d'un virus dans un organisme donné, donc à sa vitesse d'envahissement. Par « atténuer la virulence », on entend donc diminuer la vitesse d’envahissement d’un virus dans un organisme.
Cette atténuation peut prendre la forme d’une diminution des capacités de réplication de la souche virale, d’une diminution de sa capacité d’infection des cellules cibles, ou encore d’une diminution de la pathologie induite par l’infection virale de l’organisme.
Des souches virales sont considérées comme étant atténuées in vitro lorsque celles- ci présentent une capacité réplicative diminuée par rapport au virus sauvage (WT), et/ou lorsque ces souches virales entraînent la formation de foyers infectieux, notamment de syncytia (cellules adjacentes fusionnant suite à l’infection virale), plus restreints. In vivo, les souches virales atténuées se répliquent à un titre maximal plus faible et/ou induisent une pathologie moins sévère (en termes de perte de poids ou de profil inflammatoire ou d’atteintes histo-pathologiques) que la souche virale sauvage.
Ainsi, par « souche virale atténuée » on entend, au sens de l’invention, un virus recombinant dont la virulence est diminuée par rapport à celle de la souche virale d’origine, c’est-à-dire inférieure à celle de la souche virale d’origine.
Pour mesurer la virulence d’une souche virale, des tests in vitro, ex vivo ou in vivo peuvent être réalisés, comme par exemple des tests de capacité réplicative in vitro (mesurée par titration virale TCID50/ml ou quantification de génome viral par PCR quantitative), le suivi par observation microscopique de l’évolution des effets cytopathiques in vitro et ex vivo (en modèle 3D d’épithélium respiratoire humain reconstitué et cultivé à l’interface air-liquide par exemple), ou le suivi des signes cliniques de la pathologie et la mesure de titres viraux pulmonaires dans un modèle d’infection in vivo.
Les tableaux 1 , 2 et 3 ci-dessous listent les différentes approches en cours de développement pour obtenir des vaccins vivants atténués à partir de souches virales sauvages de hMPV.
Tableau 1. Liste des candidats vaccins vivants atténués sur la base d’une souche de virus hMPV présentant une ou des mutations, développés ou en cours de développement
Figure imgf000011_0001
Le symbole V indique que les cellules utilisées sont susceptibles / permissives à l’infection virale par ladite souche virale. Les abréviations suivantes sont utilisées pour les modèles d’études in vivo : M pour Mouse ; H pour hamster; CR pour Cotton Rat ; CM pour Cynomolgus Macaque; AGM pour African Green Monkey; Ch pour Chimpanzé; Rh pour Singe Rhésus; et SCID pour Severe Combinée! ImmunoDeficiency.
Les abréviations « aa » désignent des acides aminés, « aa172 » désignant l’acide aminé en position 172 dans la séquence protéique.
Les mutations ponctuelles sont représentées selon la nomenclature connue de l’Homme du métier.
Tableau 2. Liste des candidats vaccins vivants atténués développés ou en développement, comprenant une souche de virus hMPV présentant une délétion complète d’au moins un gène
Figure imgf000012_0001
Toutes les souches virales atténuées développées et décrites dans ce tableau 2 sont dérivées de la souche sauvage CAN97-83 du sous-groupe A2.
Les abréviations suivantes sont utilisées :
D : délétion totale du gène. 0 = pas d’atténuation ou d’avantage réplicatif. Tableau 3. Liste des candidats vaccins vivants atténués développés ou en développement, basés sur une souche de virus hMPV chimérique
Figure imgf000013_0001
Les abréviations suivantes sont utilisées :
TM = domaine transmembranaire ; PIV = Virus Parainfluenza; SeV = Virus Sendai.
D’autres souches atténuées dérivées de hMPV ont été décrites dans les demandes ou brevets résumés ci-dessous.
La demande internationale WO 2005/014626 est relative à plusieurs souches de virus hMPV, désignées par les dénominations suivantes : CAN 97-83, CAN 98-75 and HMPV 00-1. Cette demande décrit une souche de virus hMPV recombinante, désignée CAN 97-83, modifiée génétiquement pour atténuer sa virulence. Les modifications proposées concernent notamment la délétion totale des gènes codant pour les protéines G et/ou SH.
Le brevet US 8,841 ,433 décrit encore d’autres souches de hMPV isolées et leur utilisation pour la préparation de vaccins. Dans la demande de brevet FR1856801 , des souches atténuées dérivées de la souche clinique C-85473 de metapneumovirus humain, comprenant la séquence génomique représentée par la séquence SEQ ID NO. 1 , ont été décrites et proposées comme candidats vaccins. Ces souches atténuées comprennent une ou plusieurs modifications génétiques de ladite séquence SEQ ID NO.1 , notamment l’inactivation du gène codant pour la protéine SH et/ou du gène codant pour la protéine G de ladite souche de metapneumovirus.
Toutes ces souches virales atténuées dérivées de metapneumovirus humain sont des vaccins candidats qui sont susceptibles d’être développés de manière industrielle pour produire, à grande échelle, des vaccins destinés à être administrés à de nombreux patients, dans un but préventif et/ou thérapeutique.
Toutefois, pour atteindre cet objectif, il est nécessaire d’identifier un support cellulaire qui permettra aux souches virales atténuées identifiées d’être répliquées à une échelle industrielle.
Les essais réalisés sur des lignées cellulaires industrielles, telles que les lignées
EB66® et AGE1.CR.plX®, n’ont pas permis d’obtenir une réplication suffisante de différentes souches virales dérivées de métapneumovirus humain.
La présente invention vise à répondre à ce besoin, en ayant identifié une lignée cellulaire immortalisée, présentant des caractéristiques fonctionnelles convenant à une production de virus à l’échelle industrielle, pour la réplication de telles souches atténuées dérivées de metapneumovirus humain.
Selon une mise en oeuvre de l’invention, ladite souche atténuée a été modifiée génétiquement par inactivation du gène codant pour la protéine SH et/ou du gène codant pour la protéine G du metapneumovirus.
Les modifications génétiques désignent, au sens de l’invention, toutes les modifications d’une séquence nucléotidique originale telles que la délétion d’un ou plusieurs nucléotides, l’ajout d’un ou plusieurs nucléotides, et le remplacement d’un ou plusieurs nucléotides. Ces modifications comprennent notamment toutes les modifications permettant de décaler le cadre de lecture génétique, ou d’introduire un codon stop au milieu d’une séquence codante.
Parmi les modifications génétiques destinées à atténuer la virulence d’une souche virale, on connaît notamment les modifications génétiques permettant d’inactiver voire de supprimer un ou plusieurs gènes codant pour des protéines non essentielles pour la croissance du virus en culture. Au sens de l’invention, l’inactivation d’un gène désigne le fait que ce gène est modifié de telle sorte que le produit du gène n’est plus exprimé, ou exprimé sous une forme non active, ou exprimé en une quantité si faible que l’activité de cette protéine est inexistante. Cette inactivation d’un gène peut être effectuée par toutes les techniques bien connues de l’Homme du métier. En particulier, l’inactivation d’un gène peut être obtenue par l’introduction d’une mutation ponctuelle dans le gène, par la délétion partielle ou totale des séquences codantes du gène, ou encore par modification du promoteur du gène. Ces différentes modifications génétiques seront effectuées selon l’une quelconque des techniques de biologie moléculaire bien connues de l’Homme du métier.
Par exemple, des souches virales atténuées de metapneumovirus humains ont été obtenues par délétion des gènes codant pour les protéines accessoires SH, G et/ou M2-2 (voir tableau 2).
La protéine SH est une protéine membranaire de type II, dont les fonctions ne sont pas encore complètement caractérisées. Dans le cas du virus hVRS, la délétion du gène codant pour la protéine SH génère un virus recombinant capable de se reproduire in vitro, et dont la virulence est atténuée dans le tractus respiratoire supérieur des souris, mais non dans la partie inférieure dudit tractus (Bukreyev et al., 1997). Dans le cas du virus hMPV, les fonctions de la protéine SH sont encore en cours d’évaluation.
La protéine G est également une protéine membranaire de type II, son extrémité C- terminale étant à l’extérieur de la cellule. Cette protéine est non essentielle pour l’assemblage des constituants viraux, et pour la réplication in vitro. Pour le virus hVRS, il a été montré que la délétion du gène codant cette protéine atténuait la virulence de la souche lors de l’infection de tractus respiratoires de souris (Teng et al., 2001 ). Pour le virus hMPV, les fonctions de la protéine G sont encore en cours d’évaluation.
Selon une mise en oeuvre de l’invention, la souche virale atténuée est caractérisée en ce que les modifications génétiques comprennent l’inactivation des deux gènes codant pour la protéine G et la protéine SH.
Selon une autre mise en oeuvre particulière, l’inactivation des deux gènes correspond à la délétion complète de l’un ou de l’autre ou des deux gènes codant pour les protéines G et SH.
Selon une mise en oeuvre de l’invention, ladite souche atténuée a été modifiée génétiquement par introduction d’au moins un gène exogène.
Ce gène exogène pourra en particulier être un gène codant pour un antigène viral.
Au sens de l’invention, on entend par « antigène viral » un élément protéique ou d’une autre nature, exprimé par un virus, que le système immunologique d’un individu reconnaît comme étranger et qui provoque une réponse immunitaire chez ledit individu, notamment la production d’anticorps spécifiques.
Les antigènes viraux pourront en particulier être sélectionnés parmi les antigènes exprimés par au moins un virus influenza, ou par au moins un virus de la famille des pneumovirus, tel que le virus hVRS, ou par au moins un virus de la famille des Paramyxoviridae, tel que le virus parainfluenza.
Plus particulièrement, ledit antigène viral pourra être choisi parmi tout ou partie de la protéine F du virus hVRS, et tout ou partie de l’hémagglutinine des virus influenza ou parainfluenza. Selon une autre mise en oeuvre, ledit antigène viral est la protéine F du virus hVRS, dans sa conformation stabilisée de pré-fusion telle que décrite dans l’article (Krarup A ét al. 2015).
Une telle souche virale atténuée comprenant de plus un antigène viral exogène permettra, lors de son administration à un patient, de générer une réponse immunitaire multiple, à la fois contre l’antigène viral exogène exprimé et contre le virus hMPV. Une telle souche permettant d’obtenir une réponse immunitaire combinée contre plusieurs virus, à la suite d’une seule administration, est très avantageuse.
Souche virale de hMPV C-85473
Selon une mise en oeuvre préférée de l’invention, ladite souche atténuée est dérivée d’un metapneumovirus humain comprenant la séquence génomique représentée par la séquence SEQ ID NO. 1.
Préférentiellement, ladite souche atténuée est dérivée d’une souche virale de metapneumovirus humain, dénommée C-85473, qui a été isolée à partir d’un échantillon de patient au Canada. Cette souche appartient au sous-groupe A1 des metapneumovirus.
La séquence génomique complète de cette souche virale C-85473, comprenant 13394 nucléotides, a été divulguée pour la première fois dans la demande de brevet
FR1856801. Elle est ici représentée dans la liste des séquences sous la référence SEQ ID NO. 1.
La souche C-85473 se caractérise par de grandes capacités fusogènes, lui permettant de pénétrer dans les cellules cibles à une haute fréquence et/ou un haut degré d’infection (Dubois et al., 2017). La grande capacité fusogénique de cette souche permet de générer des syncytia, i.e. cellules géantes multinucléées, particulièrement étendus, constitués d’un très grand nombre de noyaux cellulaires.
Selon une mise en oeuvre préférée de l’invention, la souche virale atténuée est dérivée de cette souche C-85473 comprenant la séquence génomique représentée par la séquence SEQ ID NO. 1. Les modifications génétiques introduites dans cette souche C-85473 pour obtenir une souche dite « dérivée de » ont pour objet d’atténuer la virulence de ladite souche d’origine, et non de modifier l’identité de son génome.
En particulier, ces modifications génétiques ne concernent que des gènes codant pour des protéines non essentielles pour la croissance du virus, autrement dites « protéines accessoires », telles que les protéines SH et G.
Avantageusement, dans cette souche modifiée génétiquement afin de devenir « atténuée », la séquence peptidique de la protéine F de la souche rC-85473 d’origine n’est pas modifiée, et présente donc la même séquence peptidique que la souche d’origine.
De manière tout à fait préférée, la souche virale atténuée est choisie parmi :
(i) Une souche virale dérivée de la souche C-85473, modifiée génétiquement par inactivation du gène codant pour la protéine SH ;
(ii) Une souche virale dérivée de la souche C-85473, modifiée génétiquement par inactivation du gène codant pour la protéine G ; et
(iii) Une souche virale dérivée de la souche C-85473, modifiée génétiquement par inactivation du gène codant pour la protéine SH et du gène codant pour la protéine G.
Une souche virale illustrant la mise en oeuvre (i) est en particulier la souche utilisée dans les exemples de la présente demande, comprenant la séquence nucléotidique telle que représentée en SEQ ID NO. 2.
Une souche virale illustrant la mise en oeuvre (ii) est en particulier la souche utilisée dans les exemples de la présente demande, comprenant la séquence nucléotidique telle que représentée en SEQ ID NO. 3.
Selon une mise en oeuvre de l’invention, la séquence nucléotidique de la souche virale C-85473 atténuée pourra être, de plus, modifiée génétiquement par l’introduction d’au moins un gène exogène.
Ainsi, la souche virale C-85473 atténuée présente une séquence génomique qui comprend au moins un gène exogène. Ce gène exogène pourra en particulier être un gène codant pour un antigène viral.
Ledit antigène viral pourra en particulier être sélectionné parmi les antigènes exprimés par au moins un virus influenza, ou par au moins un virus de la famille des Pneumoviridae, tel que le virus hRSV, ou par au moins un virus de la famille des Paramyxoviridae, tel que le virus parainfluenza.
Plus particulièrement, ledit antigène viral pourra être choisi parmi tout ou partie de la protéine F du virus hRSV, et tout ou partie de l’hémagglutinine des virus influenza ou parainfluenza.
Selon une autre mise en oeuvre, ledit antigène viral est la protéine F du virus hVRS, de préférence dans sa conformation stabilisée de pré-fusion telle que décrite dans l’article (Krarup A et al., 2015).
D’autres caractéristiques de ces souches atténuées dérivées de la souche C-85473 comprenant la séquence génomique représentée par la séquence SEQ ID NO. 1 sont présentées dans la demande de brevet FR1856801 et la demande internationale PCT/FR2019/051759.
Origine des souches virales atténuées
Les souches virales atténuées utilisées dans la mise en oeuvre de la présente invention peuvent être issues de diverses origines.
La souche virale atténuée pourra avoir été isolée chez un patient souffrant d’une infection virale par pneumovirus, notamment par un hMPV ou un hVRS. En effet, certaines souches virales infectieuses peuvent présenter un caractère atténué de manière spontanée.
La souche virale atténuée peut également avoir été modifiée génétiquement, à partir d’une souche virale non atténuée.
Selon une première mise en oeuvre, la souche virale atténuée pourra être obtenue par reproduction dudit virus sur des cellules en culture. Des échantillons congelés des particules virales infectieuses ainsi produites pourront notamment être fournis par des laboratoires académiques ou des hôpitaux.
Selon une seconde mise en oeuvre, la souche virale atténuée pourra être obtenue à partir de séquences d’ADN grâce à la technologie de génétique inverse, décrite notamment dans les articles (Biacchesi ét al., 2004) et (Aerts ét al., 2015).
Le principe de cette technologie, qui permet la production de virus hMPV recombinants, repose par exemple sur l’utilisation d’une lignée cellulaire de rein de hamster (BHK-21 ) modifiée pour exprimer constitutivement l’ARN polymérase du bactériophage T7 (cellules BHK-T7 ou BSR-T7/5). Les éléments génomiques sont répartis dans cinq éléments plasmidiques : un plasmide codant l’antigénome du virus hMPV et 4 plasmides « satellite », codant pour les protéines virales de la machinerie de transcription (L, P, N et M2-1 ).
Après co-transfection du plasmide antigénomique hMPV et des quatre plasmides « satellite » dans ces cellules, un brin d’ARN correspondant au brin génomique viral (brin d’ARN négatif), est transcrit par la T7polymérase à partir de son promoteur.
Les quatre protéines impliquées dans la transcription virale du hMPV sont en effet exprimées par les cellules hôtes transfectées pour constituer un complexe RNA- dependant RNA polymerase (RdRP) actif. Cette polymérase virale fonctionnelle transcrit ainsi l’ARN génomique en ARNm viral puis le réplique en de nouvelles molécules d’ARN génomique viral, via la transcription de brins matrice.
La traduction et l’assemblage des protéines virales avec l’ARN génomique permettent ainsi le bourgeonnement de particules infectieuses hMPV à partir de la membrane cytoplasmique des cellules BHK-T7 transfectées. Ensuite, l’amplification des virus recombinants est permise grâce à l’ajout en co-culture de cellules LLC-MK2 (ATCC CCL-7), permissives à l’infection.
Ainsi, à partir des séquences décrites dans la présente demande, et de ces cellules hôtes appropriées, l’Homme du métier est en mesure de créer un virus enveloppé recombinant fonctionnel comprenant l’une de ces séquences.
Procédé de production d’un vaccin viral
Selon un autre aspect, la présente invention concerne un procédé de production d’un vaccin viral tel que défini ci-dessus, comprenant les étapes suivantes :
a) Infection de cellules en culture de la lignée ECACC 09070703 par une souche virale atténuée dérivée d’un metapneumovirus humain ;
b) Culture desdites cellules infectées à l’étape (a) pendant une durée comprise entre 2 et 14 jours dans un milieu adapté ;
c) Récolte du vaccin viral constitué des particules virales infectieuses de ladite souche virale atténuée produites pendant l’étape (b).
La souche virale atténuée utilisée à l’étape (a) aura été obtenue notamment par l’une des technologies décrites ci-dessus.
Il est entendu que ce procédé pourra comprendre des étapes supplémentaires, optionnelles et non indiquées ici. Par ailleurs, selon une mise en oeuvre particulière, ce procédé pourra consister exactement en les trois étapes (a), (b) et (c) successives citées ci-dessus.
L’étape (a) d’infection sera réalisée dans des conditions appropriées, comme par exemple dans les conditions suivantes:
- le milieu d’infection pourra être le milieu de culture OptiPRO™ SFM (Gibco™) adapté à la lignée cellulaire DuckCelt®-T17 et complémenté avec 4mM de L- Glutamine, 0,1 % à 0,5% de Pluronic®, et de trypsine de 0,1 pg/ml à 3pg/ml de volume final. La trypsine est supplémentée au milieu lors de l’infection mais aussi tous les 2 à 3 jours pendant la durée de la production virale ;
- la densité cellulaire des cellules sera comprise entre 0,5x106 et 5x106 cellules/ml ; et
l’infection par la souche virale atténuée sera réalisée à une multiplicité d’infection (MOI) comprise entre 1 et 0,0001.
L’étape (b) de culture des cellules infectées sera effectuée dans les conditions appropriées pour une croissance normale des cellules, bien connues de l’Homme du métier. En particulier :
l’équipement de bioproduction de cellules en suspension pourra être de type TubeSpin® ou une flasque de 50ml à 200 ml sur incubateur à plateau agitant de type Kühner, ou un bioréacteur de 500ml à 2 litres de type miniBioReactor Applikon BioTechnology, ou de type UniVessel SU Sartorius Stedim Biotech ; et la température du milieu de culture sera comprise entre 33 et 37°C ; le pH entre 7 et 7,4 ; l’agitation entre 100 et 200rpm et la teneur en oxygène entre 40 et 60%.
L’étape de culture des cellules pourra durer de 2 à 14 jours, en fonction de la croissance cellulaire et des capacités réplicatives du virus. L’étape de culture pourra en particulier être réalisée pendant une durée de 3 à 12 jours, ou de 4 à 10 jours, ou encore de 5 à 9 jours, ou de 6 à 8 jours.
L’étape (c) de récolte des particules virales infectieuses sera effectuée par toute technique bien connue de l’Homme du métier, telle que la clarification du milieu de culture de production, suivie d’étapes de purification, concentration et quantification des particules virales.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne un vaccin viral susceptible d’être obtenu par le procédé décrit ci-dessus. Ledit vaccin viral est constitué des particules virales infectieuses récoltées à l’étape (c) du procédé décrit. Selon une autre mise en oeuvre, la présente invention concerne un vaccin viral obtenu par le procédé décrit ci-dessus.
Composition pharmaceutique
Selon un autre aspect, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant ledit vaccin viral, et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
On entend au sens de l’invention par « véhicule pharmaceutiquement acceptable » des véhicules ou des excipients, c'est à dire des composés « inactifs », ne présentant pas de propriétés thérapeutiques. Ces véhicules ou excipients peuvent être administrés à un individu ou à un animal sans risque d'effets délétères significatifs ou d’effets indésirables rédhibitoires.
D’autres composés actifs, habituellement utilisés dans les compositions pharmaceutiques, pourront être présents dans ladite composition : par exemple, des adjuvants et/ou des excipients.
Il est entendu que la composition pharmaceutique selon l’invention comprend au moins une quantité efficace du vaccin viral.
Par « quantité efficace », on entend au sens de l’invention une quantité de souche virale atténuée suffisante pour déclencher une réaction immunitaire dans l’organisme auquel elle est administrée.
La présente composition pharmaceutique peut également être désignée comme étant une composition vaccinale.
Les compositions pharmaceutiques selon la présente invention sont notamment adaptées pour une administration orale, sublinguale, ou par inhalation.
Selon une mise en oeuvre particulière, la composition pharmaceutique selon l’invention est adaptée pour une administration par inhalation, c’est-à-dire par les voies nasale et/ou buccale.
L’inhalation désigne l'absorption par les voies respiratoires. C’est en particulier une méthode d'absorption de composés à des fins thérapeutiques, de certaines substances sous forme de gaz, de micro-gouttelettes ou de poudre en suspension.
On distingue deux types d’administration par inhalation :
l'administration par insufflation lorsque les compositions sont sous la forme de poudres, et l'administration par nébulisation lorsque les compositions sont sous la forme d'aérosols (suspensions) ou sous la forme de solutions, par exemple de solutions aqueuses, mises sous pression. L’utilisation d’un nébuliseur ou d’un pulvérisateur sera alors recommandée pour administrer la composition pharmaceutique.
La forme galénique de la composition pharmaceutique considérée ici est donc avantageusement choisie parmi : une poudre, une suspension aqueuse de gouttelettes ou une solution sous pression.
Selon une mise en oeuvre préférée, la composition pharmaceutique selon l’invention est adaptée pour une administration par voie nasale, notamment par inhalation.
Une telle composition pourra être utilisée en tant que vaccin préventif, c’est-à-dire destiné à stimuler une réponse immunitaire spécifique avant l’infection d’un organisme par un virus pathogène.
Une telle composition pourra également être utilisée en tant que vaccin thérapeutique, c’est-à-dire destiné à stimuler une réponse immunitaire spécifique de manière concomitante avec l’infection d’un organisme par ledit virus pathogène.
Utilisation thérapeutique
La présente invention est également relative au vaccin viral tel que décrit ci-dessus, ou à la composition pharmaceutique telle que décrite, pour leur utilisation en tant que médicament, autrement dit pour leur utilisation thérapeutique.
Avantageusement, ce vaccin viral ou cette composition pharmaceutique seront utilisés en thérapie pour le traitement et/ou la prévention d’infections virales.
L’expression « traitement d’infections virales» désigne le fait de combattre une infection par un virus dans un organisme. Le but est d’obtenir une diminution du taux d’infection virale (titre infectieux) dans l’organisme, et de préférence d’obtenir une éradication complète du virus de l’organisme. Le terme « traitement» désigne aussi l’action d’atténuer les symptômes associés à l’infection virale (syndrome respiratoire, défaillance rénale, fièvre, etc...).
L’expression « prévention d’infections virales » désigne le fait d’empêcher, ou du moins de diminuer le risque d’apparition, d’une infection dans un organisme. Grâce à cette action de prévention, les cellules dudit organisme deviennent moins permissives à l’infection virale, et sont ainsi plus résistantes à l’infection par ledit virus. De plus, l’organisme aura avantageusement développé des cellules immunitaires spécifiques, permettant de lutter de manière spécifique contre le virus susmentionné, limitant ainsi son entrée dans les cellules de l’organisme.
Plus spécifiquement, l’invention concerne le vaccin viral ou la composition pharmaceutique tels que décrits ci-dessus, pour leur utilisation dans la prévention des infections virales, notamment des infections par pneumovirus, et notamment par metapneumovirus humain et/ou virus respiratoire syncytial humain.
Selon une première mise en oeuvre, ledit vaccin viral ou ladite composition pharmaceutique est utilisé dans la prévention des infections par des pneumovirus.
Selon une deuxième mise en oeuvre, ledit vaccin viral ou ladite composition pharmaceutique est utilisé dans la prévention des infections par un metapneumovirus humain.
Selon une troisième mise en oeuvre, ledit vaccin viral ou ladite composition pharmaceutique est utilisé dans la prévention des infections par un orthopneumovirus, en particulier par le virus respiratoire syncytial humain.
Selon un autre aspect, l’invention concerne le vaccin viral ou la composition pharmaceutique tels que décrits ci-dessus, pour leur utilisation dans le traitement des infections virales, notamment des infections par pneumovirus, et plus particulièrement par metapneumovirus humain et/ou virus respiratoire syncytial humain.
En effet, ledit vaccin viral ou composition pharmaceutique le comprenant pourront être utilisés, dans certains cas et sous certaines conditions, dans une démarche thérapeutique, chez des individus déjà infectés par l’un de ces virus, notamment chez des individus adultes.
La présente invention concerne également une méthode pour prévenir une infection virale chez l’Homme, notamment une infection par des pneumovirus, plus particulièrement par un metapneumovirus humain et/ou par un virus respiratoire syncytial humain, comprenant l’administration à des individus susceptibles d’être infectés par un tel virus d’une quantité efficace d’un vaccin viral tel que décrit ci-dessus, ou d’une composition pharmaceutique le comprenant.
Ledit vaccin ou ladite composition pour leur utilisation dans la prévention et/ou le traitement d’infections virales sont destinés à tout type d’individus, aussi bien à des nouveau-nés qu’à des individus adultes âgés.
Selon une mise en oeuvre préférée de l’invention, ledit vaccin ou ladite composition pour leur utilisation dans la prévention et/ou le traitement d’infections virales sont destinés à une utilisation pédiatrique, c’est-à-dire sont destinés à être administrés à une population pédiatrique. Au sens de l’invention, une population pédiatrique désigne une population d’individus constituée d’individus âgés de moins de 18 ans, et plus spécifiquement de jeunes enfants âgés de moins de 5 ans, et de nourrissons.
En effet, les virus de la famille des Pneumoviridae infectent principalement ces individus, qui ont tendance à présenter une immunité dite « naïve », et donc moins forte, que des individus plus âgés.
Enfin, la présente demande est également relative à un kit pour la mise en oeuvre du procédé de préparation d’un vaccin viral, comprenant :
La lignée cellulaire immortalisée ECACC 09070703 ; et
- Une souche virale atténuée dérivée d’un metapneumovirus humain comprenant la séquence génomique représentée par la séquence SEQ ID NO. 1.
Ladite souche virale atténuée pourra notamment avoir été modifiée génétiquement, notamment par inactivation du gène codant pour la protéine SH et/ou du gène codant pour la protéine G de ladite souche de metapneumovirus.
De plus, ladite souche virale atténuée pourra présenter une séquence génomique qui comprend au moins un gène exogène. Ce gène exogène pourra en particulier être un gène codant pour un antigène viral issu d’un autre virus, comme par exemple tout ou partie de la protéine F du virus hRSV, et/ou tout ou partie de l’hémagglutinine des virus influenza ou parainfluenza.
Selon un aspect préféré, ladite souche virale sera en particulier l’une des souches présentées dans les exemples de la présente demande :
i) La souche virale comprenant la séquence nucléotidique telle que représentée en SEQ ID NO. 2, optionnellement comprenant de plus au moins un gène exogène ; ou
ii) La souche virale comprenant la séquence nucléotidique telle que représentée en SEQ ID NO. 3, optionnellement comprenant de plus au moins un gène exogène.
Ce kit pourra également inclure d’autres éléments, comme par exemple du milieu de culture adapté pour la croissance de la lignée cellulaire, et/ou un mode d’emploi précisant les conditions idéales pour la préparation du vaccin viral vivant atténué. EXEMPLES
Exemple 1. Utilisation de la lignée cellulaire DuckCelt®-T17 pour la réplication des souches virales sauvages du sous-groupe A1 (C-85473 et CAN99-81 ), du sous-groupe B1 (CAN97-82) et du sous-groupe B2 (CAN98-75)
Les cellules DuckCelt®-T17 sont cultivées en milieu OptiPro + L-glutamine 4mM final en TubeSpin 50ml en agitateur Kuhner à la vitesse de 175 rpm, à 37°C avec 5% C02 et 85% d’hygrométrie, et diluées à 1 x 106 cellules/ml dans 10ml de milieu. Elles ont été infectées à une multiplicité d’infection (MOI) de 0,01 par des souches virales sauvages (non GFP) du sous-groupe A1 (C-85473 et CAN99-81 ), du sous-groupe B1 (CAN97-82) et du sous-groupe B2 (CAN98-75) en présence de trypsine (T6763 Sigma) à
0,5pg/ml.
Les cellules sont comptées en bleu trypan tous les 2 à 3 jours pour évaluer la croissance cellulaire ainsi que la mortalité cellulaire au cours de l’infection virale. Les résultats sont présentés en figure 1a.
La production virale est mesurée par titration du nombre de particules infectieuses par ml dans le milieu de culture (exprimé en TCID50/ml) à partir d’échantillons prélevés tous les 2 à 3 jours jusqu’à 14 jours post-infection. Les résultats sont présentés en figure 1 b.
La cinétique de réplication virale est arrêtée lorsque la mort cellulaire atteint plus de 50%, soit à 8 jours post-infection pour la souche virale C-85473 et à 14 jours post infection pour les souches virales CAN99-81 , CAN97-82 et CAN98-75.
Les résultats montrent que seul le virus C-85473 s’amplifie lors de l’infection des cellules DuckCelt®-T17 avec une augmentation du titre viral de plus de 2 Iog10 en 7 jours. Le virus CAN98-75 démontre une faible production virale de 4 à 9 jours post- infection alors que les virus CAN99-81 et CAN97-82 sont détectables à des niveaux inférieurs à l’inoculum initial ou en dessous des seuils de détection jusqu’à 14 jours post infection.
En conclusion, la souche virale C-85473 présente une capacité de réplication sur cellules DuckCelt®-T17 très significativement supérieure à celles d’autres souches virales hMPV. En particulier, le taux de mort cellulaire observé dès 8 jours post-infection indique que les capacités d’infection de cette souche sur cette lignée cellulaire sont significatives.
Exemple 2. Utilisation de la lignée cellulaire DuckCelt®-T17 pour la réplication de la souche sauvage C-85473 WT, recombinante car exprimant à la Green Fluorescent Protein (GFP), et des souches virales recombinantes ASH- C-85473 (GFP) et AG- C- 85473 (GFP). Les souches virales utilisées dans cet exemple présentent les séquences génomiques suivantes :
La séquence de C-85473 WT - GFP est représentée en SEQ ID NO. 4 ;
La séquence de ASH- C-85473 - GFP est représentée en SEQ ID NO. 5 ;
- La séquence de AG- C-85473 - GFP est représentée en SEQ ID NO. 6.
Les cellules DuckCelt®-T17 sont maintenues en culture en milieu OptiPro + L- glutamine 4mM final en TubeSpin 50ml en agitateur Kuhner à la vitesse de 175 rpm, à 37°C avec 5% C02 et 85% d’hygrométrie.
Avant l’infection, les cellules sont diluées à 1 x 106 cellules/ml dans 10ml de milieu de culture puis sont infectées par les virus recombinants hMPV sauvage (C-85473 WT), ou délété de la séquence génomique codant la protéine SH (ASH-C-85473) ou délété de la séquence génomique codant la protéine G (AG-C-85473), à une multiplicité d’infection (MOI) de 0,01 en présence de trypsine (T6763 Sigma) à 0,5pg/ml. Les cellules « Mock » sont des cellules qui n’ont pas été infectées et constituent le témoin négatif de l’expérimentation.
Les cellules sont comptées en bleu trypan tous les 2 à 3 jours après l’infection pour évaluer la croissance cellulaire au cours de l’infection. Les résultats obtenus sont présentés en figure 2a.
La cinétique de réplication virale est arrêtée lorsque la mort cellulaire atteint plus de 50%, soit après 14 jours en moyenne.
Le pourcentage de cellules infectées est évalué par cytométrie de flux (détection de l’expression de GFP exprimée par les virus recombinants) pendant les 14 jours de la cinétique virale. Les résultats obtenus sont présentés en figure 2b.
La production virale est mesurée par titration du nombre de particules infectieuses par ml de milieu de culture (exprimé en TCID50/ml) à partir d’échantillons prélevés tous les 2 à 3 jours pendant les 14 jours de cinétique. Les résultats obtenus sont présentés en figure 2C.
Les résultats obtenus représentent quatre expériences indépendantes.
Ces résultats montrent que, dans ces conditions de culture et d’infection virale, les cellules DuckCelt®-T17 (i) parviennent à leur concentration maximale à 7 jours après l’infection ; (ii) sont infectées par la souche virale sauvage et les souches virales modifiées ASH-C-85473 et AG-C-85473 à plus de 80%, entre 9 et 11 jours post-infection.
Le pic de production virale pour les trois souches virales se situe à 11 jours post infection. En conclusion, les résultats indiquent que la lignée DuckCelt®-T17 est « permissive », qu’elle peut être infectée par les virus recombinants C-85473 et en particulier des virus vivants atténués ASH- C-85473 et AG- C-85473, et permettre la production de particules virales.
Exemple 3. Caractérisation des particules virales obtenues selon le procédé de culture de l’exemple 2
Cet exemple est relatif à la mesure des capacités réplicatives des virus recombinants ASH- C-85473 et AG- C-85473 produits sur des cellules DuckCelt®-T17, en comparaison à un virus recombinant C-85473 WT :
(i) en cellules épithéliales de reins de singe LLC-MK2 (ATCC-CCL7) et
(ii) en modèle 3D d’épithélium pulmonaire humain reconstitué (MucilAir™,
Epithelix) et cultivé à l’interface air-liquide.
Un tapis cellulaire de cellules LLC-MK2 et des épithéliums respiratoires humains reconstitués sains MucilAir™ ont été infectés par :
- le virus hMPV recombinants ASH-C-85473 à des MOI (multiplicité d’infection) de
0.01 et de 0.1 , respectivement ;
le virus hMPV recombinants AG-C-85473 à des MOI (multiplicité d’infection) de 0.01 et de 0.65, respectivement.
Les photos des cellules infectées prises à 3, 5, 7, 12 et 17 jours post-infection sont présentées en figures 3a (ASH-C-85473) et 3b (AG-C-85473).
A partir de 5 jours d’infection, la réplication virale au sein des épithéliums infectés et la sécrétion virale à leur pôle apical a été évaluée par RT-qPCR (nombre de copies du gène viral N) à partir de lysats d’épithélium et de lavages en surface apicale, respectivement.
Les résultats sont présentés en figures 3c (lavages en surface) et 3D (lysats d’épithélium).
Les résultats obtenus indiquent que les virus vivants atténués ASH- C-85473 et AG- C-85473 produits sur les cellules DuckCelt®-T17 sont fonctionnels et conservent leur capacité d’infecter les cellules LLC-MK2 et en particulier le modèle 3D d’épithélium pulmonaire humain reconstitué (MucilAir™, Epithelix).
Il est à noter que les souches atténuées ASH-C-85473 et AG-C-85473 se répliquent peu, et de manière moins soutenue au cours du temps, dans le modèle d’épithélium humain par rapport à un virus C-85473 sauvage, comme cela est présenté en figure 3d ; alors que leur taux de réplication sur les cellules DuckCelt®-T17 (et accessoirement LLC- MK2) est très satisfaisant.
Ces deux caractéristiques en font d’excellents candidats vaccins, ces souches virales atténuées pouvant être produites aisément in vitro mais ne présentant qu’un risque très modéré lorsque introduites dans un organisme vivant, au regard des résultats obtenus dans ce modèle d’infection humain physiologiquement proche des conditions d’un organisme.
Exemple 4. Les virus recombinants ASH- C-85473 et AG- C-85473 produits sur cellules DuckCelt®-T17 conservent leur caractère atténué in vivo.
Des souris BALB/c de 4 à 6 semaines ont été infectées par voie intranasale avec :
5x105 TCID50 des candidats vaccinaux ASH-C-85473 ou AG-C-85473 produits sur cellules DuckCelt®-T17 et concentrés par ultracentrifugation, ou
du milieu de culture Optimem (mock) comme contrôle (10 souris par groupe).
Un suivi quotidien du poids et de la mortalité des souris a été effectué pendant 9 jours après infection. Les résultats sont présentés en figure 4. Les résultats obtenus indiquent que les souris infectées par les virus vivants atténués ASH-C-85473 ou AG-C- 85473 produits sur cellules DuckCelt®-T17, ne présentent aucun signe de pathologie ni de mortalité, démontrant ainsi le caractère d’atténuation de ces virus produits sur cellules DuckCelt®-T17.
Tableau 4. Récapitulatif des séquences présentées dans le listage de séquence
Figure imgf000028_0001
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Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation de la lignée cellulaire immortalisée ECACC 09070703, déposée le 7 juillet 2009 auprès de l’European Collection of Cell Cultures (ECACC, Salisbury, Royaume Uni) sous le numéro 09070703, pour la production d’un vaccin viral constitué par une souche virale atténuée dérivée d’un metapneumovirus humain.
2. Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que ladite souche atténuée a été modifiée génétiquement par inactivation du gène codant pour la protéine SH et/ou du gène codant pour la protéine G du metapneumovirus.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite souche atténuée a été modifiée génétiquement par introduction d’au moins un gène exogène.
4. Utilisation selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite souche atténuée est dérivée d’un metapneumovirus humain comprenant la séquence génomique représentée par la séquence SEQ ID NO. 1.
5. Procédé de production d’un vaccin viral tel que défini dans les revendications 1 à 4, comprenant les étapes suivantes :
a) Infection de cellules en culture de la lignée ECACC 09070703 par une souche virale atténuée dérivée d’un metapneumovirus humain ;
b) Culture desdites cellules infectées à l’étape (a) pendant une durée comprise entre 2 et 14 jours dans un milieu adapté ;
c) Récolte du vaccin viral constitué des particules virales infectieuses de ladite souche virale atténuée produites pendant l’étape (b).
6. Vaccin viral obtenu par le procédé selon la revendication 5.
7. Composition pharmaceutique comprenant le vaccin viral selon la revendication 6, et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
8. Composition pharmaceutique selon la revendication 7, adaptée pour une administration par voie nasale.
9. Vaccin selon la revendication 6 ou composition selon l’une des revendications 7 ou 8, pour son utilisation thérapeutique.
10. Vaccin selon la revendication 6 ou composition selon l’une des revendications 7 ou 8, pour son utilisation dans la prévention des infections virales, notamment des infections par pneumovirus, et en particulier par metapneumovirus humain et/ou virus respiratoire syncytial humain.
1 1. Vaccin ou composition pour leur utilisation selon l’une des revendications 9 ou 10, caractérisé en ce qu’il/elle est destiné(e) à une utilisation pédiatrique.
12. Kit pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 5, comprenant :
- La lignée cellulaire immortalisée ECACC 09070703 ; et
- Une souche virale atténuée dérivée d’un metapneumovirus humain comprenant la séquence génomique représentée par la séquence SEQ ID NO. 1.
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