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WO2020190031A1 - Cgl1 및 cgl2의 발현이 억제된 형질전환 식물 및 이를 이용한 목적 단백질의 생산방법 - Google Patents

Cgl1 및 cgl2의 발현이 억제된 형질전환 식물 및 이를 이용한 목적 단백질의 생산방법 Download PDF

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WO2020190031A1
WO2020190031A1 PCT/KR2020/003721 KR2020003721W WO2020190031A1 WO 2020190031 A1 WO2020190031 A1 WO 2020190031A1 KR 2020003721 W KR2020003721 W KR 2020003721W WO 2020190031 A1 WO2020190031 A1 WO 2020190031A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cgl1
gene
cgl2
target protein
producing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2020/003721
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
박종진
최선미
박에이든영훈
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
G and Flas Life Sciences Ltd
Original Assignee
G and Flas Life Sciences Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by G and Flas Life Sciences Ltd filed Critical G and Flas Life Sciences Ltd
Publication of WO2020190031A1 publication Critical patent/WO2020190031A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]

Definitions

  • the present invention relates to a transgenic plant in which the expression of CGL1 and CGL2 is suppressed, and a method for producing a protein of interest in which the content of mannose bound to the N-sugar chain is increased using the same.
  • the Fc region of an antibody is a form in which various sugar chains are bound, and it is known to affect ADCC (antibody dependent cellular cytotoxicity) efficacy, immunogenicity, stability, etc. depending on the type and content.
  • ADCC antibody dependent cellular cytotoxicity
  • antibody drugs currently being produced are mostly produced in animal cells, but this is a complicated production process, which takes a long time and is expensive.
  • infection from pathogens may occur when antibody drugs are produced from animal cells.
  • transgenic plant capable of controlling the component and/or content of the sugar chain and a study for producing an antibody drug using such a plant.
  • the present inventors produced a transgenic plant in which the expression of CGL1 and CGL2 was suppressed using CRISPR technology in order to develop a transgenic plant capable of controlling the components and/or content of the sugar chain, and the purpose of the transgenic plant
  • the present invention was completed by confirming that the target protein with an increased content of mannose bound to the N-sugar chain can be produced.
  • an aspect of the present invention provides a transgenic plant in which the expression of CGL1 and CGL2 is suppressed.
  • Another aspect of the present invention provides a transgenic plant for producing a target protein by introducing a gene encoding a target protein into the transgenic plant.
  • Another aspect of the invention i) cultivating the transgenic plant; And ii) provides a method for producing a protein of interest comprising the step of recovering the protein of interest from the plant.
  • the guide for coupling complementarily to CGL1 gene RNA, CGL1 gene and a guide that bind complementarily to CGL2 gene RNA and Chris flops associated protein transgenic expression of CGL1 and CGL2 suppressed containing It provides a kit for manufacturing plants.
  • Another aspect of the present invention provides a target protein produced through a transgenic plant for producing the target protein.
  • the transgenic plant according to the present invention can be usefully used in the production of medical proteins such as antibody pharmaceuticals.
  • FIG. 1 is a diagram showing a schematic diagram of the pNGJP0014-NbCGL1sgRNAs recombinant expression vector used in an embodiment of the present invention.
  • 2A is a diagram showing cDNA information of the CGL1 gene and the CGL2 gene.
  • 2B is a diagram showing a target region of a guide RNA for knocking out a CGL1 gene.
  • 2C is a diagram showing a target region of a guide RNA for knocking out a CGL2 gene.
  • FIGS 3a and 3b that the CGL1 and CGL2 gene target region gene target area of the tobacco (Nicotiana benthamiana) knockout diagram confirmed by sequencing the genes.
  • 4A is a diagram showing sequence information of the CGL1 gene target region of cigarettes in which the CGL1 gene is knocked out.
  • 4B is a diagram showing sequence information of the CGL2 gene target region of cigarettes in which the CGL2 gene is knocked out.
  • 5A is a diagram showing the relative amount of N-sugar chains per line of total water-soluble protein (TSP) produced using the transgenic tobacco prepared in an embodiment of the present invention.
  • 5B is a diagram showing the relative amounts of N-sugar chains per line of antibody (GF003) produced using the transgenic tobacco prepared in an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of analyzing the ADCC efficacy of the antibody produced using the transgenic tobacco prepared in an embodiment of the present invention.
  • One aspect of the present invention provides a transgenic plant in which the expression of CGL1 and CGL2 is suppressed.
  • the plant may be a plant cell, a plant tissue, or a plant body.
  • CGL1 refers to an enzyme related to the N-glycosylation process, and is also referred to as N-acetylglucosaminyltransferase I (GnTI).
  • the CGL1 may consist of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 may be encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • CGL2 is a major enzyme involved in the process of N-glycosylation, similarly to CGL1, and is also called N-acetylglucosaminyltransferase II (GnTII).
  • the CGL2 may consist of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 may be encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • CGL1 and CGL2 can be suppressed by knocking out the genes encoding them, respectively. Specifically, expression may be inhibited by any one method selected from the group consisting of total deletion, partial deletion, partial sequence insertion, and nucleic acid substitution of genes encoding the CGL1 and CGL2.
  • any one of the CGL1 and CGL2 may be homozygous knockout, and the other may be heterozygous knockout.
  • the CGL2 when the CGL1 is homozygous knockout, the CGL2 may be heterozygous knockout. In this case, CGL1 is not expressed and CGL2 can be expressed because one gene encoding it is normal.
  • the CGL2 when the CGL1 is heterozygous knockout, the CGL2 may be homozygous knockout. In this case, CGL1 is partially expressed and CGL2 is not. At this time, in the transgenic plant, both CGL1 and CGL2 are not homozygous knockout. Plants cannot survive if all are homozygous knockouts.
  • the plant may have an increased content of mannose bound to the N-sugar chain, and the content of fucose, xylose, or fucose and xylose bound to the N-sugar chain It may be reduced.
  • the plant may be used without limitation, as long as it is a plant that can be transformed, but specifically tobacco, Arabidopsis, corn, rice, soybean, canola, sunflower, alfalfa, sorghum, wheat, cotton, peanut, tomato, potato, lettuce and pepper It may be any one selected from the group consisting of. More specifically, the plant may be tobacco ( Nicotiana benthamiana ), and the present invention may be practiced by selecting an appropriate variety according to the purpose of the transformation method and mass production of protein.
  • another aspect of the present invention provides a transgenic plant for producing a target protein by introducing a gene encoding a target protein into the transgenic plant.
  • the protein of interest may be an antibody or an enzyme.
  • the antibody may be trastuzumab, bevacizumab, and rituximab
  • the enzyme may be ⁇ -glucocerebrosidase.
  • the trastuzumab may include an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 and/or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • the target protein may have an increased content of mannose bound to the N-sugar chain.
  • the protein of interest has a ratio of high mannose-type HexNAc2Hex5 (M5) sugar pattern in the N-sugar chain about 5 times or more, 15 times or more, 25 times or more, 35 times or more, 45 times or more, or 55 times as compared to wild type. It may be more than increased.
  • the target protein may have an increase in the content of mannose bound to the N-sugar chain by 5% to 50%.
  • the target protein may have a reduced content of fucose, xylose, or fucose and xylose bound to the N-sugar chain.
  • the protein of interest has a ratio of plant-specific HexNac4Pent1Hex3 sugar pattern in the N-sugar chain of about 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60 ⁇ or more, 70% or more, It may be reduced by 80% or more or 90% or more.
  • the target protein has a ratio of plant-specific Deoxyhex1HexNAc4Pent1Hex3 sugar pattern in the N-sugar chain of about 5% or more, 15% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% compared to wild type. It may be more or less than 90%.
  • the target protein may have a content of fucose, xylose, or fucose and xylose bound to the N-sugar chain is reduced by 10% to 50%.
  • trastzumab an active ingredient of Herceptin
  • the heavy and light chain amino acid sequences may be composed of amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10, respectively.
  • the transgenic plant according to the present invention can be usefully used in the production of a protein of interest that requires a change in a sugar pattern.
  • Another aspect of the present invention is to prepare a recombinant expression vector comprising i) a guide RNA complementary to the CGL1 gene, a guide RNA complementary to the CGL1 gene and a CGL2 gene, and a gene encoding a CRISPR-associated protein. step; ii) It provides a method of producing a transgenic plant in which the expression of CGL1 and CGL2 is suppressed, comprising the step of transforming plant cells or plant tissues with the recombinant expression vector.
  • the guide RNA includes a sequence specific to the target sequence, and binds all or part of the complementary to the target sequence, so that the CRISPR-associated protein can cleave the target sequence.
  • the guide RNA comprises two RNAs, that is, crRNA (CRISPR RNA) and tracrRNA (trans-activating crRNA) as components of dual RNA (dual RNA); Or a first site comprising a sequence complementary to the target sequence in whole or in part and a second site comprising a sequence interacting with the CRISPR-associated protein, but the CRISPR-associated protein has activity in the target sequence.
  • CRISPR RNA crRNA
  • tracrRNA trans-activating crRNA
  • dual RNA dual RNA
  • the guide RNA may include a sequence capable of complementary binding to the CGL1 gene and/or the CGL2 gene.
  • the guide RNA may include a sequence capable of complementarily binding to a target sequence of the CGL1 gene and/or the CGL2 gene.
  • the guide RNA may be an oligonucleotide comprising 15 to 35 nucleotides capable of complementarily binding to DNA encoding CGL1 and/or CGL2.
  • the guide RNA may be an oligonucleotide comprising 15 to 35, 20 to 25, or 23 nucleotides capable of complementarily binding to the target sequence of the CGL1 gene and/or the CGL2 gene.
  • the guide RNA complementarily binding to the CGL1 gene may include a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • the gene in CGL1 guide RNA that binds complementarily may be represented by "NbCGL1-1", which binds complementarily to the DNA encoding the gene CGL1 to the target gene only CGL1.
  • the guide RNA complementarily binding to the CGL1 gene and the CGL2 gene may include a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6. Further, the guide RNA that binds complementarily to the gene CGL1 and CGL2 gene may be expressed as "NbCGL1-2", which may be coupled to a complementary gene at the same time in CGL1 and CGL2 gene.
  • the guide RNA may include a scaffold sequence that helps CRISPR-associated protein bind.
  • sequence information required for the guide RNA can be obtained from a known database such as Addgene and GenBank of NCBI (National Center for Biotechnology Information).
  • the CRISPR-associated protein is Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cas13d, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb3, Csb2, Csb17 It may be any one selected from the group consisting of Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3 and Csf4, and specifically
  • sequence information of the CRISPR-associated protein or gene can be obtained from a known database such as GenBank of the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
  • the transgenic plant can be produced through a plant transformation method known in the art. Those skilled in the art can select and carry out a known transformation method suitable for a specific plant in consideration of the characteristics of the plant selected as the host. Specifically, a transformation method using Agrobacteria may be used as a transformation method of plants.
  • the "transformation method using Agrobacteria” is a method of transferring foreign genes to plant cells by using Agrobacteria, which is a Gram-negative bacterium of soil that causes tumors in the roots and stems of plants.
  • Agrobacterium Tome Pacific Enschede Agrobacterium tumefaciens
  • Agrobacterium separation tank to Ness Agrobacterium rhizogenes
  • dielectric gene of the T-DNA (transfer DNA) is a plant tumor inducing plasmid (Ti plasmid) it found in Agrobacterium bacteria It is a method using the phenomenon inserted in ).
  • a recombinant expression vector in an embodiment of the present invention comprises a sequence encoding a guide RNA and Chris flops associated proteins that bind complementarily to the guide RNA, CGL1 gene and CGL2 gene binding complementarily to CGL1 gene
  • a method of transforming the plant by infecting the plant with Agrobacteria was used.
  • Another aspect of the present invention provides a method of producing a transformed plant for producing a protein of interest, comprising introducing a gene encoding a target protein into a transformed plant in which the expression of CGL1 and CGL2 is suppressed.
  • the target protein may be various proteins.
  • it may be an antibody and an enzyme, and specifically, may be trastzumab whose activity changes due to a change in sugar pattern.
  • Another aspect of the present invention i) cultivating a transgenic plant for producing the target protein; And ii) provides a method for producing a protein of interest comprising the step of recovering the protein of interest from the plant.
  • the two in CGL1 gene guide expression of CGL1 and CGL2 to the RNA, CGL1 gene and CGL2 gene comprising a guide RNA and Chris flops associated proteins that bind complementarily binding to a complementary inhibitory It provides a kit for producing a transgenic plant.
  • the guide and the guide RNA RNA binding to complementary to the gene CGL1 and CGL2 gene binding complementarily to the CGL1 gene is the same as described above.
  • Another aspect of the present invention provides a target protein produced through a transgenic plant for producing the target protein.
  • Transgenic plants for producing the target protein are the same as described above.
  • the protein of interest may be an antibody or an enzyme.
  • the antibody may be trastuzumab, bevacizumab, and rituximab
  • the enzyme may be ⁇ -glucocerebrosidase.
  • the trastuzumab may include an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 and/or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • Transgenic cigarettes in which the CGL1 gene and the CGL2 gene were knocked out were constructed using a recombinant expression vector containing guide RNA and CRISPR-associated protein.
  • the specific manufacturing method is as follows.
  • the recombinant expression vector has an antibiotic cassette to be selected by kanamycin and hygromycin antibiotics, and was constructed to have a polycistronic tRNA-gRNA cassette synthesized with Cas9.
  • the Cas9 was constructed to be expressed by the Arabidopsis ubiquitin 10 promoter, and the tRNA-gRNA was constructed to be expressed by the Arabidopsis ubiquitin 6 promoter.
  • the SV40 (PKKKRKV (SEQ ID NO: 13)) nuclear transfer signal sequence and the C-terminal Bipartite (KEPAATKKAGQAKKKK (SEQ ID NO: 14)) nuclear transfer signal sequence were added to the N-terminus of the Cas9 open reading frame.
  • the two guide RNA was designed to target the gene CGL1 and CGL2 gene of Nikko tiahna Ventana Mia or (N. benthamiana).
  • FIG. 1 A schematic diagram of the pNGJP0014-NbCGL1sgRNAs recombinant expression vector constructed as described above is shown in FIG. 1.
  • a guide RNA target region was designed to knock out each of the CGL1 gene and CGL2 gene in N. benthamiana .
  • the target regions of the CGL1 gene and CGL2 gene to which the guide RNA binds are as shown in FIGS. 2A to 2C.
  • the sequences complementarily binding to the target region of the guide RNA for knocking out the CGL1 gene and the CGL2 gene are shown in Table 1 below.
  • NbCGL1-1 shall only CGL1 gene targeting
  • NbCGL1-2 will target the gene CGL1 and CGL2 genes (Fig. 2b and Fig. 2c).
  • Agrobacteria containing the recombinant expression vector of Example 1.1 was used. Specifically, seeds of tobacco ( N. benthamiana ) were used, and the tobacco seeds were sterilized with 75% ethanol for 1 minute, and sterilized by immersing in 50% Clorox for 10 minutes. Thereafter, the tobacco seeds were washed 4 times with sterile water, and covered with sterile filter paper to dry the water on the leaf surface. After disinfecting the tobacco seeds, they were placed on a seed sowing medium and grown in a culture chamber at 25°C for 4 weeks. Tobacco leaves grown for a week were cut into 1 cm squares with a knife and placed on a solid medium for transformation (1 MS, 3% sucrose, 2 mg/L 6-BA, 0.2 mg/L NAA, and 1% agar).
  • Agrobacteria containing the recombinant expression vector prepared in Example 1.1 above were used as a transformation medium at pH 5.8 (1 MS, 3% sucrose, 2 mg/L 6-BA (6-benzyl adenine) and 0.2 mg/L NAA ( Naphthaleneacetic acid)) was used to adjust the OD 600 to 0.6 to prepare an Agrobacteria transformation culture.
  • the cut tobacco leaves were immersed in the Agrobacteria transformation culture solution for 10 minutes.
  • the soaked tobacco leaves were washed once with sterile water and then drained with sterile filter paper.
  • the tobacco main leaf was transferred to a solid medium for transformation (1 MS, 3% sucrose, 2 mg/L 6-BA, 0.2 mg/L NAA and 1% agar) with a pH of 5.8 so that the back side of the tobacco leaf was facing up. .
  • the tobacco leaves were mixed with an antibiotic medium of pH 5.8 (1 MS, 3% sucrose, 2 mg/L 6-BA, 0.2 mg/L NAA, 25 mg/L hygromycin, 200 mg/L thymentin, and 1% Baby).
  • an antibiotic medium of pH 5.8
  • the process of transferring to a new solid medium was repeated once every two weeks as described above.
  • Example 2 As shown in Table 2, among 25 individuals, the gene editing efficiency was found to be 25% or more in #3-1, #3-2, and #3-5 individuals. Among them, the T2 generation genotyping and N-sugar chain structure analysis results of #3-2 individuals showing 50% or more gene editing efficiency are shown in Example 2.2. And shown in Example 2.3.
  • RNA target region was amplified from genomic DNA extract using Q5 High-Fidelity DNA Polymerase (NewEngland Biolabs) in a 20 ⁇ l reaction. Thereafter, the PCR product was cloned using the All in One Cloning Kit (Biofact, South Korea), and 15 to 20 cloned clones were individually sequenced for each sample. Showed the confirming the knockout CGL1 GCL2 gene and gene sequence information results in Fig. 4a and 4b, to a line-by-line mutation information of the T2 generation are shown in Table 3 below.
  • the N-sugar chain structure analysis was performed on #3, #5, #10, #13, and #48 individuals selected in Example 2.2.
  • the specific method is as follows.
  • Example 2 After freezing the transformed N. benthamiana obtained in Example 1 with liquid nitrogen, the leaves were crushed in a mortar bowl. A phosphate buffer solution (pH 7.2) of 2 times the volume was added to the powder obtained by grinding and mixed. Thereafter, the mixture was allowed to stand on ice for 10 minutes and centrifuged under conditions of 15,000 ⁇ g , 20 minutes and 4°C to collect the first transparent supernatant. 2 times the volume of phosphate buffer solution (pH 7.2) was additionally added to the remaining powder, and the same procedure as described above was repeated to recover the supernatant, and this was mixed with the first recovered supernatant. Through this, a total soluble protein (TSP) of N. benthamiana was obtained.
  • TSP total soluble protein
  • the obtained TSP was filtered through 0.45 ⁇ m to remove large insoluble particles, and then concentrated under the conditions of 30 kDa, 15,000 ⁇ g , 30 minutes and 4°C.
  • the concentrated TSP was repeatedly treated three times with ultrapure water, and the phosphate buffer solution was replaced with ultrapure water under the conditions of 30 kDa, 15,000 ⁇ g , 30 minutes and 4°C. Then, the amount of protein was measured using the Bradford method.
  • a denaturing solution (0.1% RapiGest SF and 10 mM DTT) was added to the TSP sample (50 ⁇ g) obtained in Example 2.3.1 and reacted at 56° C. for 45 minutes. Thereafter, 20 mM of iodoacetamide was additionally added and reacted for 1 hour in dark conditions (room temperature). Sugar cleavage enzyme (2 ⁇ l, 5 U/ ⁇ l, PNGase A) was added to the reaction solution, followed by reaction at 37°C overnight. Thereafter, the N-sugar chain was extracted using a PGC cartridge (Porous graphitize carbon SPE cartridge) and dried by a vacuum centrifugation method.
  • PGC cartridge Porous graphitize carbon SPE cartridge
  • a fluorescent labeling solution (5 mg 2-aminobenzoic acid, 6 mg sodium cyanoborohydride/100 ⁇ l acetic acid and DMSO) was added to the dried N-sugar chain, followed by reaction at 65° C. for 3 hours.
  • the fluorescently labeled N-sugar chain was extracted using a Cyano SPE cartridge and dried by vacuum centrifugation.
  • the dried anthanilamide (Anthanilamide; A89804-5G, Sigma-Aldrich)) labeled N-sugar chain was dissolved by adding 20 ⁇ L of ultrapure water and analyzed using a mass spectrometer (Ultraflex III TOF/TOF, Bruker Daltonics). At this time, the analysis conditions are as follows.
  • Example 2.4.1 Preparation of a recombinant vector containing a recombinant gene
  • the heavy chain gene of trastuzumab was added by adding Bsa I restriction enzyme from the plasmid containing the heavy chain gene (SEQ ID NO: 11) and light chain gene (SEQ ID NO: 12) synthesized by ordering and requesting from mBiotech. Only SEQ ID NO: 11) and light chain gene (SEQ ID NO: 12) were expressed in plants.
  • Agrobacterium cells (GV3101) were transformed by introducing each recombinant expression vector having the heavy chain gene (SEQ ID NO: 11) and light chain gene (SEQ ID NO: 12) of trastuzumab, and then medium (YEP agar plate) Smeared on and incubated for about 2 days at 28°C. Thereafter, the resulting single colony was inoculated into a liquid medium (YEP broth) and pre-cultured for about 2 days under conditions of 200 rpm at 28°C. The pre-culture was inoculated at a ratio of 0.5% of the amount of the new liquid medium, and cultured at a temperature of 28° C. at 200 rpm until an OD 600 value of 1.2 to 1.8.
  • the transformed Agrobacteria cultured with shaking in Example 2.4.2 was diluted to an OD 600 value of 0.02 by adding a buffer solution for impregnation (10 mM MES, pH 5.6, 10 mM MgSO 4 ).
  • Diluted transgenic Agrobacteria containing heavy and light chains were mixed in a ratio of 1:1, and the tobacco leaves of the individual obtained in Example 1.2 were immersed in this mixture in a vacuum chamber. A vacuum was applied to the vacuum chamber, and after reaching the target pressure, the pressure was released to take out and dry tobacco leaves to obtain transformed plant cells expressing trastzumab.
  • Example 2.5 Isolation and analysis of N-sugar chain from GF003 antibody protein
  • Protein was isolated from the plant cells obtained in Example 2.4.3 in the same manner as in Example 2.3.1, and the N-sugar chain was isolated and analyzed in the same manner as in Example 2.3.2, and the results are shown in FIG. 5B. Done.
  • the structural change of the N- linked sugar chains was remarkably confirmed that the gene appears when sikyeoteul the CGL1 and CGL2 gene expression GF003 the antibody using the knock-out object.
  • the ratio of the high mannose-type HexNAc2Hex5 (M5) sugar pattern in the N-sugar chain of the GF003 antibody was approximately 15 to 56 times higher than that of the wild type.
  • the ratio of plant-specific HexNac4Pent1Hex3 and Deoxyhex1HexNAc4Pent1Hex3 sugar patterns in the N-sugar chain of the GF003 antibody was approximately 40% to 80% and 18% to 90% lower than that of the wild type, respectively.
  • ADCC antibody dependent cellular cytotoxicity
  • SKBR3 cells target cells, target cells, T, ATCC, Cat#. HTB-30
  • a white 96-well-plate was used to prevent interference from other wells that may occur during fluorescence measurement.
  • Jurkat cells effector cells, E
  • RPMI1640 medium containing 10% low IgG FBS.
  • FBS effector cells
  • the medium present in the 96-well-plate was removed, and the total volume of antibodies produced from Jurkat cells and #3, #5, #10, #13 and #48 individuals selected in Example 2.2 was 100 ⁇ l. It was added to SKBR3 cells so that At this time, 1 mg of antibody was added to 1 ml of Jurkat cells having a density of 1.5 ⁇ 10 6 cells/ml in an e-tube, and 200 ⁇ l of each well was added to a 96-well plate. Starting with this, 120 ⁇ l of Jurkat cells were added to the next nine wells, and then sequentially diluted by 60 ⁇ l each in the first 1 ⁇ g/ml well to complete a sample containing 10 different concentrations of antibodies.
  • the luciferase (Luciferase) substrate solution was put at 60 ⁇ l/well using a multi-channel pipette and incubated for 2 minutes in a CO 2 incubator. Thereafter, the degree of fluorescence was measured using a loose ferase assay protocol with a FLUO STAR OMEGA microplate reader. Then, the concentration value of IC 50 was obtained using the GraphPAD PRISM program (Table 5 and FIG. 6).
  • the CGL1 gene and the CGL2 gene have high ADCC efficacy in antibodies produced from knock-out individuals.
  • the antibody extracted from the #13 individual through the IC 50 value of each antibody exhibited about 10 times higher efficacy.
  • the efficacy of the antibodies produced in individuals in which the CGL1 gene and the CGL2 gene were knocked out was improved.

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Abstract

본 발명은 CGL1 및 CGL2의 발현이 억제된 형질전환 식물 및 이를 이용한 N-당사슬에 결합된 만노오스의 함량이 증가된 목적 단백질의 생산방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 CGL1 및 CGL2의 발현이 억제된 형질전환 식물을 이용하여 목적 단백질을 생산할 경우, N-당사슬에 결합된 만노오스의 함량을 증가시킬 수 있으며, 푸코오스 및/또는 자일로오스의 함량을 감소시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 형질전환 식물은 항체 의약품과 같은 의료용 단백질의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

CGL1 및 CGL2의 발현이 억제된 형질전환 식물 및 이를 이용한 목적 단백질의 생산방법
본 발명은 CGL1 및 CGL2의 발현이 억제된 형질전환 식물 및 이를 이용한 N-당사슬에 결합된 만노오스의 함량이 증가된 목적 단백질의 생산방법에 관한 것이다.
항체의 Fc 영역은 여러 가지 당사슬이 결합된 형태로서, 그 종류와 함량에 따라 ADCC(antibody dependent cellular cytotoxicity) 효능, 면역원성, 안정성 등에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 한편, 현재 생산되고 있는 항체 의약품은 대부분 동물세포에서 생산되고 있으나, 이는 생산과정이 복잡하여 긴 시간이 소요되며 비용 또한 비싸다. 또한, 동물세포에서 항체 의약품을 생산할 경우 병원체로부터의 감염이 발생할 수 있다는 단점도 있다.
이와 같은 단점들을 개선하기 위하여, 최근 식물을 이용하여 항체를 생산하기 위한 연구가 진행되고 있다. 식물을 이용한 항체의 생산은 생산 비용 및 시간을 절감할 수 있을 뿐 아니라, 병원체로부터의 감염을 방지할 수 있다.
특히, 항체의 ADCC 효능을 향상시키기 위한 연구로 항체의 당 함량을 조절하는 연구가 진행되고 있다. 이는 당사슬의 성분 및 구조가 치료 효능과 인체 내 체류시간, 약리 활성 및 면역 반응 등에 큰 영향을 미치기 때문이다. 이와 관련하여, 애보트(Abbott) 사의 아달리무맙(adalimumab) 특허(US 2012/0276631 및 WO 2012/149197)에 망간과 갈락토즈를 이용하는 항체의 당사슬 조절할 수 있다는 내용이 개시된 바 있다. 그러나, 아직까지 목표 함량 및 특정 성분이 증가되거나 감소되도록 당사슬이 조절된 항체를 제조하기는 어려운 실정이다.
따라서, 당사슬의 성분 및/또는 함량을 조절할 수 있는 형질전환 식물 및 이러한 식물을 이용하여 항체 의약품을 생산하기 위한 연구가 필요하다.
이에 본 발명자들은 당사슬의 성분 및/또는 함량을 조절할 수 있는 형질전환 식물을 개발하기 위해, 크리스퍼 기술을 이용하여 CGL1 및 CGL2의 발현이 억제된 형질전환 식물을 제조하였으며, 상기 형질전환 식물에 목적 단백질을 암호화하는 특정 유전자를 도입하여 목적 단백질을 생산할 경우, N-당사슬에 결합된 만노오스 함량이 증대된 목적 단백질을 생산할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은, CGL1 및 CGL2의 발현이 억제된 형질전환 식물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 형질전환 식물에 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 도입되어 목적 단백질을 생산하는 목적 단백질 생산용 형질전환 식물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, i) CGL1 유전자에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA, CGL1 유전자 및 CGL2 유전자에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA 및 크리스퍼 연관 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계; ii) 상기 재조합 발현 벡터로 식물 세포 또는 식물 조직을 형질전환시키는 단계를 포함하는 CGL1 및 CGL2의 발현이 억제된 형질전환 식물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, i) 상기 형질전환 식물을 재배하는 단계; 및 ii) 상기 식물로부터 목적 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 생산방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, CGL1 유전자에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA, CGL1 유전자 및 CGL2 유전자에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA 및 크리스퍼 연관 단백질을 포함하는 CGL1 및 CGL2의 발현이 억제된 형질전환 식물 제조용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 목적 단백질 생산용 형질전환 식물을 통해 생산된 목적 단백질을 제공한다.
본 발명에 따른 CGL1 및 CGL2의 발현이 억제된 형질전환 식물을 이용하여 목적 단백질을 생산할 경우, N-당사슬에 결합된 만노오스의 함량을 증가시킬 수 있으며, 푸코오스 및/또는 자일로오스의 함량을 감소시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 형질전환 식물은 항체 의약품과 같은 의료용 단백질의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 사용한 pNGJP0014-NbCGL1sgRNAs 재조합 발현 벡터의 모식도를 나타낸 도면이다.
도 2a는 CGL1 유전자 및 CGL2 유전자의 cDNA 정보를 나타낸 도면이다.
도 2b는 CGL1 유전자를 녹아웃(Knock Out)시키기 위한 가이드 RNA의 표적 영역을 나타낸 도면이다.
도 2c는 CGL2 유전자를 녹아웃시키기 위한 가이드 RNA의 표적 영역을 나타낸 도면이다.
도 3a 및 도 3b는 담배(Nicotiana benthamiana)의 CGL1 유전자 표적 영역 및 CGL2 유전자 표적 영역이 녹아웃 되었는지 유전자 시퀀싱을 통해 확인한 도면이다.
도 4a는 CGL1 유전자가 녹아웃된 담배의 CGL1 유전자 표적영역의 서열 정보를 나타낸 도면이다.
도 4b는 CGL2 유전자가 녹아웃된 담배의 CGL2 유전자 표적영역의 서열 정보를 나타낸 도면이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에서 제조한 형질전환 담배를 이용하여 생산한 총 수용성 단백질(TSP)의 라인별 N-당사슬의 상대량을 나타낸 도면이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에서 제조한 형질전환 담배를 이용하여 생산한 항체(GF003)의 라인별 N-당사슬의 상대량을 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 제조한 형질전환 담배를 이용하여 생산한 항체의 ADCC 효능을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명의 일 측면은, CGL1 및 CGL2의 발현이 억제된 형질전환 식물을 제공한다. 이때, 상기 식물은 식물 세포, 식물 조직 또는 식물체일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어,"CGL1" 이란, N-당사슬화 과정과 관련된 효소로서, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼레이즈 I(GnTI)로도 불린다. 상기 CGL1은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시되는 염기서열에 의해 코딩되는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "CGL2" 란, 상기 CGL1과 마찬가지로 N-당사슬화 과정에 관여하는 주요 효소로, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼레이즈 II(GnTII)로도 불린다. 상기 CGL2는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열은 서열번호 4로 표시되는 염기서열에 의해 코딩되는 것일 수 있다.
상기 CGL1 및 CGL2는 각각 이들을 코딩하는 유전자를 녹아웃(Knock out)시킴으로써 발현이 억제될 수 있다. 구체적으로, 상기 CGL1 및 CGL2를 코딩하는 유전자의 전체 결실, 부분 결실, 일부 서열 삽입 및 핵산 치환으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 발현이 억제될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 CGL1 및 CGL2 중 어느 하나는 동형접합 녹아웃(homozygous knockout)된 것이며, 다른 하나는 이형접합 녹아웃(heterozygous knockout)된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 CGL1이 동형접합 녹아웃된 것일 경우에 상기 CGL2는 이형접합 녹아웃된 것일 수 있다. 이러한 경우, CGL1은 발현되지 않으며 CGL2는 이를 코딩하는 하나의 유전자가 정상이므로 발현될 수 있다. 또한, 상기 CGL1이 이형접합 녹아웃된 것일 경우에 상기 CGL2는 동형접합 녹아웃된 것일 수 있다. 이러한 경우에 CGL1은 일부 발현되며 CGL2는 발현되지 않는다. 이때, 상기 형질전환 식물은 CGL1 및 CGL2 모두가 동형접합 녹아웃된 것은 아니다. 모두 동형접합 녹아웃인 경우 식물은 생존할 수 없다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 식물은 N-당사슬에 결합된 만노오스의 함량이 증가된 것일 수 있으며, N-당사슬에 결합된 푸코오스, 자일로오스, 또는 푸코오스 및 자일로오스의 함량이 감소된 것일 수 있다.
상기 식물은 형질전환될 수 있는 식물이라면 제한없이 사용될 수 있으나, 구체적으로 담배, 애기장대, 옥수수, 벼, 대두, 카놀라, 해바라기, 알팔파, 수수, 밀, 목화, 땅콩, 토마토, 감자, 상추 및 고추로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 식물은 담배(Nicotiana benthamiana)일 수 있으며, 형질전환 방법과 단백질 대량 생산의 목적에 맞게 적절한 품종을 선택하여 본 발명을 실시할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 형질전환 식물에 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 도입되어 목적 단백질을 생산하는 목적 단백질 생산용 형질전환 식물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 목적 단백질은 항체 또는 효소일 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 트라스투주맙(trastuzumab), 베바시주맙(Bevacizumab) 및 리툭시맙(Rituximab)일 수 있으며, 상기 효소는 β-글루코세레브로시다아제(β-glucocerebrosidase)일 수 있다. 이때, 상기 트라스투주맙은 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 목적 단백질은 N-당사슬에 결합된 만노오스의 함량이 증가된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 목적 단백질은 N-당사슬에서 high mannose-type의 HexNAc2Hex5(M5) 당패턴의 비율이 야생형 대비 대략 5배 이상, 15배 이상, 25배 이상, 35배 이상, 45배 이상, 또는 55배 이상 증가된 것일 수 있다.
또한, 상기 목적 단백질은 N-당사슬에 결합된 만노오스의 함량이 5% 내지 50% 증가된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 목적 단백질은 N-당사슬에 결합된 푸코오스, 자일로오스, 또는 푸코오스 및 자일로오스의 함량이 감소된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 목적 단백질은 N-당사슬에서 식물 특이적인 HexNac4Pent1Hex3 당패턴의 비율이 야생형 대비 대략 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60^ 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상 감소된 것일 수 있다.
상기 목적 단백질은 N-당사슬에서 식물 특이적인 Deoxyhex1HexNAc4Pent1Hex3 당패턴의 비율이 야생형 대비 대략 5% 이상, 15% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상 감소된 것일 수 있다.
또한, 상기 목적 단백질은 N-당사슬에 결합된 푸코오스, 자일로오스, 또는 푸코오스 및 자일로오스의 함량이 10% 내지 50% 감소된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 항체의 일 구체예로 허셉틴의 유효성분인 트라스트주맙을 CGL1 및 CGL2의 발현이 억제된 형질전환 담배를 이용하여 생산하였다. 이때, 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열은 각각 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 이때, CGL1 및 CGL2 중 어느 하나는 완전히 녹아웃되고 다른 하나는 이형접합 녹아웃된 식물에서 생산되었을때, 트라스트주맙에서 만노오스의 함량이 증가된 것을 확인하였다. 이렇게 생산된 항체의 경우, 정상 식물에서 생산된 트라스트주맙에 비해 활성이 증가됨을 확인하였다(표 5). 나아가, 본 발명에 따른 CGL1 및 CGL2의 발현이 억제된 형질전환 식물을 이용하여 생산된 목적 단백질의 당패턴이 유효하게 변화하였으며, 상기 식물에서 생산된 목적 단백질의 활성이 바뀐 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 형질전환 식물은 당패턴의 변화를 필요로 하는 목적 단백질의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 i) CGL1 유전자에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA, CGL1 유전자 및 CGL2 유전자에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA 및 크리스퍼 연관 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계; ii) 상기 재조합 발현 벡터로 식물 세포 또는 식물 조직을 형질전환시키는 단계를 포함하는 CGL1 및 CGL2의 발현이 억제된 형질전환 식물을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 가이드 RNA는 표적 서열에 특이적인 서열을 포함하며, 표적 서열과 전부 또는 일부 상보적으로 결합하여 크리스퍼 연관 단백질이 표적 서열을 절단할 수 있다.
통상적으로 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA (trans-activating crRNA)를 구성요소로 포함하는 이중 RNA(dual RNA); 또는 표적 서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하는 제1부위 및 크리스퍼 연관 단백질과 상호작용하는 서열을 포함하는 제2부위를 포함하는 형태를 말하나, 크리스퍼 연관 단백질이 표적 서열에서 활성을 가질 수 있는 형태라면 제한 없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 가이드 RNA는 CGL1 유전자 및/또는 CGL2 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 특히, 상기 가이드 RNA는 CGL1 유전자 및/또는 CGL2 유전자의 표적 서열에 상보적으로 결합할 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 상기 가이드 RNA는 CGL1 및/또는 CGL2를 코딩하는 DNA에 상보적으로 결합 가능한 15개 내지 35개의 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 상기 가이드 RNA는 CGL1 유전자 및/또는 CGL2 유전자의 표적 서열에 상보적으로 결합할 수 있는 15개 내지 35개, 20개 내지 25개, 또는 23개의 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로서, 상기 CGL1 유전자에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA는 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 CGL1 유전자에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA는 "NbCGL1-1" 로 표시될 수 있으며, 이는 CGL1 유전자만을 표적하여 CGL1 유전자를 코딩하는 DNA에 상보적으로 결합한다.
본 발명의 일 구체예로서, 상기 CGL1 유전자 및 CGL2 유전자에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 CGL1 유전자 및 CGL2 유전자에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA는 "NbCGL1-2" 로 표시될 수 있으며, 이는 CGL1 유전자 및 CGL2 유전자에 동시에 상보적으로 결합할 수 있다.
상기 가이드 RNA는 크리스퍼 연관 단백질이 결합되는 것을 돕는 스캐폴드 서열을 포함할 수 있다.
이때, 상기 가이드 RNA에 필요한 서열 정보는 Addgene 및 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있다.
본 발명의 일 구체예로서, 상기 크리스퍼 연관 단백질은 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cas13d, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3 및 Csf4로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 구체적으로 상기 크리스퍼 연관 단백질은 Cas9일 수 있다.
이때, 상기 크리스퍼 연관 단백질 또는 유전자의 서열 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있다.
상기 형질전환 식물은 당업계에 공지된 식물의 형질전환 방법을 통해 제작될 수 있다. 당업자는 숙주로 선택한 식물의 특성을 고려하여 특정 식물에 적절한 공지의 형질전환 방법을 선택하여 실시할 수 있다. 구체적으로, 식물의 형질전환 방법으로 아그로박테리아를 이용한 형질전환 방법을 사용할 수 있다.
상기 "아그로박테리아를 이용한 형질전환 방법" 은 식물의 뿌리와 줄기에 종양을 일으키는 토양의 그람 음성 세균인 아그로박테리아를 이용하여 식물 세포에 외부 유전자를 전달하는 방법이다. 이는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes) 등의 아그로박테리아에서 발견되는 종양 유발 플라스미드(Ti plasmid)의 T-DNA(transfer DNA)가 식물의 유전체(genome)에 삽입되는 현상을 이용한 방법이다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 CGL1 유전자에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA, CGL1 유전자 및 CGL2 유전자에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA 및 크리스퍼 연관 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리아로 식물을 감염시켜 형질전환시키는 방법을 사용하였다.
본 발명의 또 다른 측면은, CGL1 및 CGL2의 발현이 억제된 형질전환 식물에 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하는 단계를 포함하는 목적 단백질 생산용 형질전환된 식물을 제조하는 방법을 제공한다.
형질전환 방법은 상술한 바와 같으며, 목적 단백질은 다양한 단백질일 수 있다. 특히, 항체 및 효소일 수 있으며, 구체적으로 당패턴 변화로 활성이 변화하는 트라스트주맙일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, i) 상기 목적 단백질 생산용 형질전환 식물을 재배하는 단계; 및 ii) 상기 식물로부터 목적 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은, CGL1 유전자에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA, CGL1 유전자 및 CGL2 유전자에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA 및 크리스퍼 연관 단백질을 포함하는 CGL1 및 CGL2의 발현이 억제된 형질전환 식물 제조용 키트를 제공한다. 이때, 상기 CGL1 유전자에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA 및 상기 CGL1 유전자 및 CGL2 유전자에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA는 상술한 바와 동일하다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 목적 단백질 생산용 형질전환 식물을 통해 생산된 목적 단백질을 제공한다.
상기 목적 단백질 생산용 형질전환 식물은 상술한 바와 동일하다.
상기 목적 단백질은 항체 또는 효소일 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 트라스투주맙(trastuzumab), 베바시주맙(Bevacizumab) 및 리툭시맙(Rituximab)일 수 있으며, 상기 효소는 β-글루코세레브로시다아제(β-glucocerebrosidase)일 수 있다. 이때, 상기 트라스투주맙은 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열 및/또는 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. CGL1 및 CGL2의 발현이 억제된 형질전환 담배 제작
가이드 RNA 및 크리스퍼 연관 단백질을 포함하는 재조합 발현 벡터를 이용하여 CGL1 유전자 및 CGL2 유전자가 녹아웃된 형질전환 담배를 제작하였다. 구체적인 제작 방법은 하기와 같다.
실시예 1.1. 재조합 발현 벡터의 제작
상기 재조합 발현 벡터는 카나마이신 및 히그로마이신 항생제에 의해 선별되도록 항생제 카세트를 가지며, Cas9과 합성된 폴리시스트로닉 tRNA-gRNA 카세트를 갖도록 제작하였다. 상기 Cas9를 애기장대 유비퀴틴 10 프로모터에 의해 발현되도록 제작하였으며, 상기 tRNA-gRNA는 애기장대 유비퀴틴 6 프로모터에 의해 발현되도록 제작하였다. Cas9 단백질을 핵으로 전달하기 위해 Cas9 오픈리딩 프레임의 N-말단에 SV40(PKKKRKV(서열번호 13)) 핵이행신호 서열과 C-말단에 Bipartite(KEPAATKKAGQAKKKK(서열번호 14)) 핵이행신호 서열을 추가하였다. 상기 두 개의 가이드 RNA는 니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana)의 CGL1 유전자 및 CGL2 유전자를 표적하도록 디자인하였다. 상기와 같이 제작된 pNGJP0014-NbCGL1sgRNAs 재조합 발현 벡터의 모식도를 도 1에 나타내었다.
이때, N. benthamiana에서 CGL1 유전자 및 CGL2 유전자 각각을 녹아웃시키기 위한 가이드 RNA 표적 영역을 설계하였다. 상기 가이드 RNA가 결합하는 CGL1 유전자 및 CGL2 유전자의 표적 영역은 도 2a 내지 도 2c에 나타낸 바와 같다. 또한, CGL1 유전자 및 CGL2 유전자를 녹아웃시키기 위한 가이드 RNA의 표적 영역에 상보적으로 결합하는 서열은 하기 표 1과 같다.
Figure PCTKR2020003721-appb-T000001
상기 표 1에서, NbCGL1-1은 CGL1 유전자만을 표적으로 하며, NbCGL1-2는 CGL1 유전자 및 CGL2 유전자를 동시에 표적한다(도 2b 및 도 2c).
실시예 1.2. 아그로박테리아를 이용한 형질전환 담배의 제작
CGL1 유전자 및 CGL2 유전자가 녹아웃된 형질전환 담배를 제작하기 위해, 상기 실시예 1.1의 재조합 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리아를 이용하였다. 구체적으로, 담배(N. benthamiana)의 종자를 사용하였으며, 상기 담배 종자를 75% 에탄올로 1분간 소독하고, 50% 크로락스(Clorox)에 10분간 담가 소독하였다. 이후, 상기 담배 종자를 멸균수로 4회 세척하였고, 잎 표면의 물기를 건조시키기 위해 멸균필터페이퍼로 덮어두었다. 상기 담배 종자를 소독한 후 종자파종 배지에 치상해서 4주간 25℃ 온도의 배양실에서 키웠다. 일주일간 키운 담배 본엽을 칼로 사방 1 cm로 잘라 형질전환용 고체배지(1 MS, 3% 수크로오스, 2 ㎎/L 6-BA, 0.2 ㎎/L NAA 및 1% 아가)에 올려두었다.
상기 실시예 1.1에서 제작한 재조합 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리아를 pH 5.8의 형질전환 배지(1 MS, 3% 수크로오스, 2 ㎎/L 6-BA(6-벤질아데닌) 및 0.2 ㎎/L NAA(나프탈렌아세트산))를 이용하여 OD600값을 0.6으로 맞춰 희석하여 아그로박테리아 형질전환 배양액을 준비하였다.
이어서, 상기 잘라둔 담배 본엽을 상기 아그로박테리아 형질전환 배양액에 10분간 담갔다. 담가둔 담배 본엽을 멸균수로 1회 세척한 후 멸균필터페이퍼로 물기를 빼주었다. 상기 담배 본엽의 뒷면이 위로 가게끔 pH 5.8의 형질전환용 고체배지(1 MS, 3% 수크로오스, 2 ㎎/L 6-BA, 0.2 ㎎/L NAA 및 1% 아가)로 옮겨 이틀 동안 암배양하였다. 이후, 상기 담배 본엽을 pH 5.8의 항생제 배지(1 MS, 3% 수크로오스, 2 ㎎/L 6-BA, 0.2 ㎎/L NAA, 25 ㎎/L 히그로마이신, 200 ㎎/L 티멘틴 및 1% 아가)로 옮겼다. 항생제의 효율성을 유지하기 위해, 2주에 한 번씩 상기와 같이 새로운 고체배지로 옮겨주는 과정을 반복하였다.
1달 내지 2달 정도 후, 캘러스(callus)가 형성되고 잎과 줄기들이 나오면, 뿌리를 유도하는 pH 5.8의 배지(1 MS, 3% 수크로오스, 25 ㎎/L 히그로마이신, 200 ㎎/L 티멘틴 및 1% 아가)로 옮겨주었다. 2주 내지 3주 뒤 뿌리가 유도되었을 때, 큰 용기의 토양으로 옮겨주어 4주 뒤에 새로운 개체(종자)를 수득하였다.
실시예 2. 형질전환 담배의 분석
실시예 2.1. NGS(Next-Generation Sequencing) 분석
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 담배의 CGL1 유전자 및 CGL2 유전자를 녹아웃시키고, 목적단백질을 코딩하는 유전자를 도입하여 담배를 형질전환한 후, 항생제 배지에서 선별된 개체로 NGS 분석을 수행하였다. 구체적으로, 표적 영역을 앰플리콘 프라이머를 이용해 1차 PCR을 수행한 후, 생산된 PCR 생성물에 대해 클린업(lean-up)을 수행하였다. 표적 영역에 앰플리콘이 포함된 DNA로 인덱스를 붙여 라이브러리를 제작하였다. 이어서, 2차 PCR을 수행한 후 Bioanalyzer로 QC를 수행하고 시퀀싱하였다. 이때, 상기 녹아웃시킨 담배의 CGL1 유전자 표적 영역 및 CGL2 유전자 표적 영역을 도 3a 및 도 3b에 나타냈으며, 분석 조건은 하기와 같다.
분석장비: 일루미나제품, MiniSeq(SY-420-1001), Miniseq mid output kit(300 cycles, FC-420-1004)
앰플리콘 프라이머:
정방향: 5' TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[locus specific sequence](서열번호 7)
역방향: 5' GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[locus specific sequence](서열번호 8)
하기 표 2에 NGS 분석 결과를 나타냈으며, 유전자 편집 효율(editing efficiency %)로 개체 선별을 수행하였다.
Figure PCTKR2020003721-appb-T000002
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 25개의 개체 중에서 #3-1, #3-2 및 #3-5 개체에서 유전자 편집 효율이 25% 이상으로 나타났다. 그 중, 50% 이상의 유전자 편집 효율을 보인 #3-2 개체에 대한 T2 세대 유전형 분석 및 N-당사슬 구조의 분석 결과를 각각 하기 실시예 2.2. 및 실시예 2.3에 나타내었다.
실시예 2.2. 생어 염기서열 분석(Sanger Sequencing)
상기 실시예 2.1에서 선별한 #3-2 개체에 대한 생어 염기서열 분석을 수행하였다. 구체적으로, 가이드 RNA 표적 영역을 20 ㎕ 반응에서 Q5 High-Fidelity DNA Polymerase(NewEngland Biolabs)를 사용하여 게놈 DNA 추출물로부터 증폭하였다. 이후, PCR 생성물을 All in one Cloning Kit(Biofact, South Korea)를 사용하여 클로닝하고, 클로닝된 15개 내지 20개의 클론을 각각의 샘플에 대해 개별적으로 시퀀싱하였다. 녹아웃된 CGL1 유전자 및 GCL2 유전자 서열 정보를 확인한 결과를 도 4a 및 도 4b에 나타내었고, T2 세대의 라인별 유전자 변이 정보를 하기 표 3에 나타내었다.
하기 표 3에서, 소문자로 표시된 CGL1 유전자 또는 CGL2 유전자의 완전한 녹아웃(동형접합 녹아웃)을 의미하며, 대문자는 헤테로(이형접합 녹아웃)를 의미한다. 또한, CGL1 유전자 또는 CGL2 유전자의 단독을 소문자로 나타낸 것은 단일 녹아웃을 의미한다. 여기서, 삽입(insertion)은 +1로 나타났으며 결실(deletion)은 -4 내지 -29의 다양한 형태로 나타난 것을 확인하였다.
Figure PCTKR2020003721-appb-T000003
실시예 2.3. 당사슬 구조 분석
상기 실시예 2.2에서 선별한 #3, #5, #10, #13 및 #48 개체에 대한 N-당사슬 구조 분석을 수행하였다. 구체적인 방법은 하기와 같다.
실시예 2.3.1. 단백질 분리
상기 실시예 1에서 수득한 형질전환 N. benthamiana를 액체 질소로 얼린 후, 잎을 막자 사발에서 분쇄하였다. 분쇄하여 수득한 분말에 2배 부피의 인산완충용액(pH 7.2)을 첨가하고 혼합하였다. 이후, 얼음에서 10분간 정치하고 15,000×g, 20분 및 4℃의 조건으로 원심분리하여 투명한 상층액을 1차 회수하였다. 잔여 분말에 2배 부피의 인산완충용액(pH 7.2)을 추가로 첨가하고 상술한 방법과 동일한 과정을 반복하여 상층액을 회수한 후, 이를 상기 1차로 회수한 상층액과 혼합하였다. 이를 통해, N. benthamiana의 총 수용성 단백질(Total soluble protein, TSP)을 수득하였다.
수득한 TSP를 0.45 ㎛로 여과하여 큰 불용성 입자들을 제거한 후, 30 kDa, 15,000×g, 30분 및 4℃의 조건으로 농축하였다. 상기 농축한 TSP를 초순수(ultrapure water)로 3회 반복 처리하여 인산완충용액을 30 kDa, 15,000×g, 30분 및 4℃의 조건에서 초순수로 교체하였다. 이후, Bradford 방법을 이용하여 단백질의 양을 측정하였다.
실시예 2.3.2. N-당사슬 분리 및 분석
상기 실시예 2.3.1에서 수득한 TSP 시료(50 ㎍)에 변성 용액(0.1% RapiGest SF 및 10 mM DTT)을 첨가하고 56℃에서 45분간 반응시켰다. 이후, 20 mM의 요오드아세트아미드를 추가로 첨가하여 암조건(상온)에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 반응액에 당 절단 효소(2 ㎕, 5 U/㎕, PNGase A)를 첨가하고 37℃에서 밤새 반응시켰다. 이후, PGC 카트리지(Porous graphitize carbon SPE cartridge)를 사용하여 N-당사슬을 추출하고 진공 원심분리 방법으로 건조시켰다.
건조된 N-당사슬에 10 ㎕의 형광 표지 용액(5 mg 2-아미노벤조산, 6 ㎎ 소듐 시아노보로하이드라이드/100 ㎕ 아세트산 및 DMSO)을 첨가하고 65℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 시아노 카트리지(Cyano SPE cartridge)를 사용하여 형광 표지된 N-당사슬을 추출하고 진공 원심분리 방법으로 건조시켰다. 건조된 안타닐아미드(Anthanilamide; A89804-5G, Sigma-Aldrich)) 표지 N-당사슬을 20 μL의 초순수를 첨가하여 녹이고 질량분석기(Ultraflex III TOF/TOF, Bruker Daltonics)를 이용하여 분석하였다. 이때, 분석 조건은 하기와 같다.
- 인스트루먼트 컨트롤: Flex Control 3.0(Bruker Daltonics)
- 분석 모드: 리플렉션 모드
- 극성: 양극성
- 검출: m/z 100 내지 4,000
- 레이저 반복률: 100 Hz
- 샷(shot) 횟수: 500 shots
- 굴절: On, 500 Da
- 전압(하기 표 4 참조)
Figure PCTKR2020003721-appb-T000004
총 수용성 단백질의 N-당사슬 분석 결과를 도 5a에 나타내었다.
실시예 2.4. 목적 단백질의 생산
실시예 2.4.1. 재조합 유전자를 포함하는 재조합 벡터 제조
mBiotech사에 주문 및 의뢰하여 합성한 트라스투주맙의 중사슬 유전자(서열번호 11)와 경사슬 유전자(서열번호 12)를 포함하는 플라스미드로부터 Bsa I 제한효소를 첨가하여 트라스투주맙의 중사슬 유전자(서열번호 11)와 경사슬 유전자(서열번호 12)만을 식물에 발현시켰다.
실시예 2.4.2. 재조합 벡터로 형질전환된 아그로박테리아 제조
트라스투주맙의 중사슬 유전자(서열번호 11)와 경사슬 유전자(서열번호 12)를 갖는 각각의 재조합 발현벡터를 각각 도입하여 아그로박테리움 세포(GV3101)를 형질전환 시킨 후 배지(YEP agar plate)에 도말하고 28℃ 온도에서 약 2일 간 배양하였다. 그 후, 생성된 단일 콜로니를 액체 배지(YEP broth)에 접종하고 28℃ 온도에서 200 rpm 조건으로 약 2일 간 전배양하였다. 전배양액을 새 액체 배지 양의 0.5% 비율로 접종하고 28℃ 온도에서 200 rpm 조건으로 OD600값이 1.2 내지 1.8이 될 때까지 배양하였다.
실시예 2.4.3. 형질전환된 식물세포를 이용한 재조합 단백질 생산
실시예 2.4.2에서 진탕 배양한 형질전환 아그로박테리아를 함침용 완충용액(10 mM MES, pH 5.6, 10 mM MgSO4)을 첨가하여 OD600값이 0.02가 되도록 희석하였다. 중쇄와 경쇄를 포함하는 희석된 형질전환 아그로박테리아를 1:1 비율로 섞고, 진공 챔버 내에서 이 혼합액에 실시예 1.2에서 수득한 개체의 담배 잎을 담궜다. 진공 챔버에 진공을 걸고 목표 압력에 도달한 후 압력을 풀어주어 담배 잎을 꺼내서 말려, 트라스트주맙을 발현하는 형질전환된 식물 세포를 수득하였다.
실시예 2.5. GF003 항체 단백질에서의 N-당사슬 분리 및 분석
상기 실시예 2.4.3에서 수득한 식물세포로부터 실시예 2.3.1과 동일한 방법으로 단백질을 분리하고, 실시예 2.3.2와 동일한 방법으로 N-당사슬을 분리 및 분석하여 그 결과를 도 5b에 나타내었다.
도 5b에 나타난 바와 같이, CGL1 유전자 및 CGL2 유전자가 녹아웃된 개체를 이용하여 GF003 항체를 발현시켰을 때 N-당사슬의 구조 변화가 현저하게 나타나는 것을 확인하였다. 구체적으로, GF003 항체의 N-당사슬에서 high mannose-type의 HexNAc2Hex5(M5) 당패턴의 비율은 야생형 대비 대략 15배 내지 56배 높게 나타났다. 반면, GF003 항체의 N-당사슬에서 식물 특이적인 HexNac4Pent1Hex3 및 Deoxyhex1HexNAc4Pent1Hex3 당패턴의 비율은 각각 야생형 대비 대략 40% 내지 80% 및 18% 내지 90% 낮게 나타났다. 이러한 양상은 CGL1 유전자 또는 CGL2 유전자 중 하나가 완전한 녹아웃을 나타내고 다른 하나는 헤테로로 나타나는 유전형을 갖는 개체에서 뚜렷하게 확인할 수 있었다. 특히, #13 개체에서 생산된 GF003 항체의 N-당사슬에서 high mannose-type의 HexNAc2Hex5(M5) 당패턴의 비율이 야생형 대비 대략 56배 높게 나타났고, 식물 특이적인 HexNac4Pent1Hex3 및 Deoxyhex1HexNAc4Pent1Hex3 당패턴의 비율은 야생형 대비 각각 대략 80% 및 90% 낮게 나타났다.
또한, CGL1 유전자 및 CGL2 유전자가 녹아웃된 개체를 이용하여 GF003 항체를 발현시켰을 때 N-당사슬에 결합된 만노오스의 함량이 5% 내지 50% 증가하는 것을 확인하였으며, 상기 GF003 항체의 N-당사슬에 결합된 푸코오스 및 자일로오스의 함량이 10% 내지 50% 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 3. 형질전환 담배에서 생산된 트라스트주맙의 ADCC 분석
동물세포를 이용한 ADCC(antibody dependent cellular cytotoxicity) 효능을 분석하기 위해 아래와 같은 실험을 진행하였다. 분석 하루 전 SKBR3 세포(표적세포, target cell, T, ATCC, Cat#. HTB-30)를 10,000 cells/100 ㎕/well로 96-웰-플레이트에 분주하였다, 이때, 흰색의 96-웰-플레이트를 사용하여 형광 측정 시 발생할 수 있는 다른 웰로부터의 간섭을 방지하였다. 이후, Jurkat 세포(효과세포, effector cell, E)를 수확하고 10% low IgG FBS가 포함된 RPMI1640 배지에 재현탁하였다. 이때, FBS는 ADCC 분석에 영향을 줄 수 있으므로 low IgG FBS(Gibco, Cat#. 16250-078)를 사용하였으며, 히그로마이신(hygromycin) 및 G418(Geneticin)은 SKBR3을 사멸시킬 수 있으므로 첨가하지 않았다. 이어서, 효과세포(E) 및 표적세포(T)의 비율이 E:T=15:1이 되도록 Jurkat 세포를 1.5×106 cells/㎖로 10% low IgG FBS가 포함된 RPMI1640 배지에 재현탁하였다. 또한, 각 항체의 최고 농도 1 ㎍/㎖로 하였고, 1/3씩 연속 희석하여 총 10가지의 다른 농도를 갖는 항체를 제작하였다.
이후, 96-웰-플레이트에 존재하는 배지를 제거하고, Jurkat 세포 및 상기 실시예 2.2에서 선별한 #3, #5, #10, #13 및 #48 개체로부터 생산된 항체의 총 부피가 100 ㎕이 되도록 SKBR3 세포에 첨가하였다. 이때, e-튜브에 1.5×106 cells/㎖ 밀도인 Jurkat 세포 1 ㎖에 항체 1 ㎎을 넣고, 96-웰-플레이트에 200 ㎕씩 각 웰 첨가하였다. 이를 시작으로 다음 9개 웰에 120 ㎕의 Jurkat 세포를 넣고 처음 1 ㎍/㎖ 농도의 웰에서 60 ㎕씩 순차적으로 희석하여 총 10가지 농도의 항체가 들어있는 샘플을 완성하였다.
다음 날, 루시페라아제(Luciferase) 기질 용액을 멀티채널 파이펫을 이용하여, 60 ㎕/well로 넣고 CO2 배양기에서 2분 동안 배양하였다. 이후, FLUO STAR OMEGA 마이크로플레이트 리더기로 루스페라아제 분석 프로토콜을 사용하여 형광 정도를 측정하였다. 이어서, GraphPAD PRISM 프로그램을 사용하여 IC50의 농도 값을 수득하였다(표 5 및 도 6).
Figure PCTKR2020003721-appb-T000005
그 결과, CGL1 유전자 및 CGL2 유전자가 녹아웃된 개체로부터 생산된 항체에서 높은 ADCC 효능을 가짐을 확인하였다. 특히, 각 항체의 IC50 값을 통해 #13 개체에서 추출한 항체는 약 10배 이상 높은 효능을 나타냄을 확인하였다. 이를 통해, CGL1 유전자 및 CGL2 유전자가 녹아웃된 개체에서 생산되는 항체의 효능이 향상된 것을 확인하였다.

Claims (23)

  1. CGL1 및 CGL2의 발현이 억제된 형질전환 식물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 CGL1 및 CGL2 중 어느 하나는 동형접합 녹아웃(homozygous knockout)된 것이며, 다른 하나는 이형접합 녹아웃(heterozygous knockout)된 것인, 형질전환 식물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 CGL1은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 형질전환 식물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시되는 염기서열에 의해 코딩되는 것인, 형질전환 식물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 CGL2는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 형질전환 식물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열은 서열번호 4로 표시되는 염기서열에 의해 코딩되는 것인, 형질전환 식물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 식물은 N-당사슬에 결합된 만노오스의 함량이 증가된 것인, 형질전환 식물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 식물은 N-당사슬에 결합된 푸코오스, 자일로오스, 또는 푸코오스 및 자일로오스의 함량이 감소된 것인, 형질전환 식물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 식물은 담배, 애기장대, 옥수수, 벼, 대두, 카놀라, 해바라기, 알팔파, 수수, 밀, 목화, 땅콩, 토마토, 감자, 상추 및 고추로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 형질전환 식물.
  10. 제1항의 형질전환 식물에 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 도입되어 목적 단백질을 생산하는 목적 단백질 생산용 형질전환 식물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 목적 단백질은 항체 또는 효소인 것인, 목적 단백질 생산용 형질전환 식물.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 목적 단백질은 트라스투주맙(trastuzumab), 베바시주맙(Bevacizumab), 리툭시맙(Rituximab) 및 β-글루코세레브로시다아제(β-glucocerebrosidase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 목적 단백질 생산용 형질전환 식물.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 목적 단백질은 N-당사슬에 결합된 만노오스의 함량이 증가된 것인, 목적 단백질 생산용 형질전환 식물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 목적 단백질은 N-당사슬에 결합된 만노오스의 함량이 5% 내지 50% 증가된 것인, 목적 단백질 생산용 형질전환 식물.
  15. 제10항에 있어서,
    상기 목적 단백질은 N-당사슬에 결합된 푸코오스, 자일로오스, 또는 푸코오스 및 자일로오스의 함량이 감소된 것인, 목적 단백질 생산용 형질전환 식물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 목적 단백질은 N-당사슬에 결합된 푸코오스, 자일로오스, 또는 푸코오스 및 자일로오스의 함량이 10% 내지 50% 감소된 것인, 목적 단백질 생산용 형질전환 식물.
  17. i) CGL1 유전자에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA, CGL1 유전자 및 CGL2 유전자에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA 및 크리스퍼 연관 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계; 및
    ii) 상기 재조합 발현 벡터로 식물 세포 또는 식물 조직을 형질전환시키는 단계를 포함하는 CGL1 및 CGL2의 발현이 억제된 형질전환 식물의 제조방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 CGL1 유전자에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA는 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 포함하는 것인, 형질전환 식물의 제조방법.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 CGL1 유전자 및 CGL2 유전자에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열을 포함하는 것인, 형질전환 식물의 제조방법.
  20. 제17항에 있어서,
    상기 크리스퍼 연관 단백질은 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cas13d, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3 및 Csf4로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 형질전환 식물의 제조방법.
  21. i) 제10항의 형질전환 식물을 재배하는 단계; 및
    ii) 상기 식물로부터 목적 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 생산방법.
  22. CGL1 유전자에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA, CGL1 유전자 및 CGL2 유전자에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA 및 크리스퍼 연관 단백질을 포함하는 CGL1 및 CGL2의 발현이 억제된 형질전환 식물 제조용 키트.
  23. 제10항의 목적 단백질 생산용 형질전환 식물을 통해 생산된 목적 단백질로서, N-당사슬에 결합된 만노오스의 함량이 증가되고, N-당사슬에 결합된 푸코오스, 자일로오스, 또는 푸코오스 및 자일로오스의 함량이 감소된 목적 단백질.
PCT/KR2020/003721 2019-03-18 2020-03-18 Cgl1 및 cgl2의 발현이 억제된 형질전환 식물 및 이를 이용한 목적 단백질의 생산방법 Ceased WO2020190031A1 (ko)

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