WO2020170321A1

WO2020170321A1 - 生体高分子結晶化装置

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Publication number: WO2020170321A1
Application number: PCT/JP2019/005996
Authority: WO
Inventors: 広明田仲; 浩治伊中; 斌厳; 幸子高橋
Original assignee: Confocal Science Inc
Current assignee: Confocal Science Inc
Priority date: 2019-02-19
Filing date: 2019-02-19
Publication date: 2020-08-27
Anticipated expiration: 2021-08-19

Abstract

本発明の生体高分子結晶化装置は、内部に生体高分子を含む溶液が充填された第１の管状部材と、内部に沈澱剤が供給される第２の管状部材と、生体高分子を通過させずに沈澱剤を通過させる透析膜とを備える。第２の管状部材は、第１の管状部材における内部において開口が形成された端面を有する。沈澱剤は、第１の管状部材における内部において、第２の管状部材における内部から開口及び透析膜を通過して、生体高分子を含む溶液に添加される。この生体高分子結晶化装置は、第１の管状部材における内部に嵌入された弾性体と、沈澱剤が充填された内部に第２の管状部材を収容することで、第２の管状部材における内部に沈澱剤を供給するリザーバとをさらに備える。透析膜は、開口を塞ぐように端面に当接し、かつ、第２の管状部材における外周面と弾性体の内周面とに当接した状態において固定されている。

Description

生体高分子結晶化装置

　本発明は、タンパク質等の生体高分子を結晶化させるための結晶化装置に関するものである。

　新規医薬品開発の一法として、疾病に関連するタンパク質等の生体高分子に高い親和性で結合する阻害薬物を考案し、これを新規に合成する方法が知られている。この際に、対象となる疾病関連タンパク質等の生体高分子や、それと阻害薬物が結合した複合体の高精度の３次元構造座標データが、阻害薬物の考案や改良にとって有益な情報になる。このような生体高分子の構造データに基づく新規医薬品開発は、SBDD（Structure Based Drug Discovery/Design）と呼ばれ、製薬企業にとっての必須の技術に成りつつある。

　ところで、上記タンパク質の３次元構造座標データを、Ｘ線回析や中性子線回析等によって構造解析するにあたっては、高品質な上記タンパク質等の生体高分子の結晶を得る必要が有る（下記特許文献１）。そこで、近年においては、タンパク質等の生体高分子の溶液に沈澱剤を添加させて溶液の溶解度を低下させ、上記生体高分子を結晶化させる必要性が高まっており、その一つとして透析法が一部で採用されている。

　例えば、図９（ａ）は、上記透析法に用いられる従来のハンプトンリサーチ社製の透析ボタン容器を示すもので、この透析ボタン容器２０は、中央部に上面に開口するチャンバー２１が形成されるとともに、下部外周にＯリングの嵌合溝２２が形成されたものである。

　この透析ボタン容器２０を用いて、例えばタンパク質を結晶化させるには、先ず上記チャンバー２１に上記タンパク質の試料溶液Ｌ_１を充填し、表面張力で幾分ドーム型に持ち上がった当該溶液Ｌ_１上からタンパク質を透過させない透析膜２３を被せてＯリング２４によって固定する。

　そして、この透析ボタン容器２０は、これを図９（ｂ）に示すように沈澱剤Ｌ_２が充填された容器２５内に載置して、上記透析膜２３を通過する沈澱剤Ｌ_２によって溶液の溶解度を低下させることにより、チャンバー２１内のタンパク質を結晶化させるものである。

　ところが、上記透析ボタン容器２０を用いた透析法においては、試料となるタンパク質を多量に用意することが難しく、特に疾病に関連するタンパク質等の生体高分子は、一般に調製が困難であることから、数μＬ～数十μＬといった微量な試料を取り扱う必要が有る。また、透析膜２３のセット時に、上記溶液と透析膜２３との間に泡が介在し易く、よって当該作業に熟練を要するという問題点があった。加えて、チャンバー２１に数μＬといった少量の試料を充填する際に、貴重な当該試料の損失も生じ易いという問題点もあった。

　さらに、容器２５内に透析ボタン容器２０を配置する際に、沈澱剤Ｌ_２との間に急激に浸透圧差が生じることによりチャンバー２１内に気泡が発生し易く、これを回避するための結晶化条件を設定することも容易では無いという問題点もあった。

特表２００２－５２６７４５号公報

　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、タンパク質等の生体高分子を透析法によって結晶化させるに際して、沈澱剤から生体高分子溶液側に急激に浸透圧差が生じることが無く、しかも貴重な試料溶液の損失も回避することができて作業性に優れる生体高分子結晶化装置を提供することを課題とするものである。

　上記課題を解決するため、本発明の第１の側面では、内部に生体高分子を含む溶液が充填された第１の管状部材と、内部に沈澱剤が供給される第２の管状部材と、前記生体高分子を通過させずに前記沈澱剤を通過させる透析膜とを備え、前記第２の管状部材は、前記第１の管状部材における内部において開口が形成された端面を有しており、前記沈澱剤は、前記第１の管状部材における内部において、前記第２の管状部材における内部から前記開口及び前記透析膜を通過して前記生体高分子を含む溶液に添加される生体高分子結晶化装置であって、前記第１の管状部材における内部に嵌入された弾性体と、前記沈澱剤が充填された内部に前記第２の管状部材を収容することで、前記第２の管状部材における内部に前記沈澱剤を供給するリザーバとをさらに備え、前記透析膜は、前記開口を塞ぐように前記端面に当接し、かつ、前記第２の管状部材における外周面と前記弾性体の内周面とに当接した状態において固定されていることを特徴とするものである。
　前記した本発明において、前記第１の管状部材における内部に挿入された導入管をさらに備えることができる。

　また、本発明の第２の側面では、生体高分子を含む溶液が充填される透明な第１の管状部材と、この第１の管状部材の一端部を塞ぐ封止部材と、上記第１の管状部材の他端部にシール部材を介して挿入される第２の管状部材と、この第２の管状部材の上記第１の管状部材内に位置する一端開口を塞ぐ透析膜と、内部に上記第１および第２の管状部材が収納されるとともに上記沈澱剤溶液が充填されて上記第２の管状部材内に当該沈澱剤溶液を供給するリザーバとを備えてなり、上記シール部材は、外径寸法が上記第１の管状部材の内径寸法よりも大きく形成されることにより上記第１の管状部材の上記他端部に密に嵌入されるとともに、内径寸法が上記第２の管状部材の外径よりも小さく形成されることにより上記第２の管状部材が密に嵌入される筒状の弾性体からなり、上記透過膜は、沈澱剤を透過させるとともに上記生体高分子を透過させない素材からなり、その外周部が上記第２の管状部材の外周面と上記シール部材の内周面との間に挟持されていることを特徴とするものである。
　この発明において、上記密閉容器は、ガラスまたは石英からなっていてもよい。

　本発明の第１の側面では、第２の筒状部材における端面（開口が形成された端面）に透析膜が当接した状態を弾性体により維持することで、上記開口から第２の筒状部材における外部に流出した沈澱剤が「多方向に」拡散する過程で透析膜を通過するのではなく、第２の筒状部材における内部に充填された沈澱剤が「上記開口を通過する方向に」流れる過程で透析膜を通過することになる。このため、第２の筒状部材における内部に充填された沈澱剤が透析膜を通過する面積を小さく維持し、短時間で多量の沈澱剤が透析膜を通過することを抑制することができる。よって、急激な浸透圧差の発生を抑制することができる。
　したがって、本発明では、急激な浸透圧差の発生を抑制するために、第２の筒状部材における内部に供給する沈澱剤の濃度や流量などを調整する必要がなくなる。このため、内部に沈澱剤が充填されたリザーバに第２の管状部材を収容し、第２の管状部材における内部に自然に沈澱剤が供給される状態を維持することができる。よって、複雑な操作を必要とせずに、生体高分子を含む溶液に沈澱剤を添加することができる。

　本発明の第２の側面では、一端部が塞がれて内部に生体高分子を含む溶液が充填される透明な第１の管状部材と、この第１の管状部材の他端部にシール部材を介して挿入されて沈澱剤溶液が供給される第２の管状部材との２重管構造とし、第２の管状部材の上記第１の管状部材内に位置する一端開口に透析膜を固定しているために、上記第１の管状部材内に透析膜を介して沈澱剤溶液が拡散する流路を確保することができ、よって急激な浸透圧差が加わることを回避することができる。
　加えて、上記第１の管状部材内に生体高分子の溶液を充填する際には、上記第１の管状部材よりも細径のポリイミドチューブ等を利用して、容易に上記溶液を第１の管状部材内に注入することができるために、貴重な生体高分子の溶液を損失したり、あるいは気泡が混入したりすることも回避することが可能になる。

本発明の一実施形態における要部を示す縦断面図である。本発明の一実施形態の全体を示す縦断面図である。図１の第１及び第２の管状部材を組み立てた状態を示す縦断面図である。図４の第１及び第２の管状部材を容器内において保存する状態を示す縦断面図である。第２の管状部材内に沈澱剤溶液を充填する状態を示す縦断面図である。図５の第１の管状部材内に生体高分子の溶液を充填する状態を示す縦断面図である。図６の生体高分子の溶液を充填後に第１の管状部材の一端部を封止した状態を示す縦断面図である。本発明の実施例の結果を示す顕微鏡写真である。（ａ）は透析法に用いられる従来の透析ボタン容器を示す正面図であり、（ｂ）は上記透析ボタン容器を沈澱剤が充填された容器内に載置して内部のタンパク質を結晶化させる状態を示す一部断面視した正面図である。

　図１及び図２は、本発明に係る生体高分子結晶化装置の一実施例を示すもので、図中符号１が生体高分子を含む溶液Ｌ_１が充填される第１の管状部材である。
　この第１の管状部材は、透明なガラス管からなるもので、本実施形態においては外径が2.5mm、内径が1.9mm、長さが18mmに形成されている。そして、この第１の管状部材１の一端部１ａには、円筒状のシリコンチューブ２を介して透明なガラス管からなる導入管３が挿入されている。

　ここで、シリコンチューブ２は、外径寸法が第１の管状部材１の内径寸法よりも大きく形成されることにより第１の管状部材１の一端部１ａに密に嵌入されるとともに、内径寸法が導入管３の外径よりも小さい形成されることにより導入管３が密に嵌入されている。

　ちなみに、本実施形態においては、シリコンチューブ２は、外径が2.0mm、内径が1.0mm、長さが5mmに形成され、導入管３は、外径が1.2mm、内径が0.7mm、長さが8mmに形成されている。そして、この導入管３の端部は、内部に生体高分子を含む溶液Ｌ_１が充填された後に、無毒性の粘土４（封止部材）によって塞がれている。

　また、第１の管状部材１の他端部１ｂには、円筒状のシリコンチューブ（シール部材、弾性体）５を介して透明なガラス管からなる第２の管状部材６が挿入されている。この第２の管状部材６は、後述するように内部に沈澱剤溶液Ｌ_２が供給されるもので、第１の管状部材１の外方に延出する端部６ａが開口されている。

　そして、このシリコンチューブ５も、外径寸法が第１の管状部材１の内径寸法よりも大きく形成されることにより第１の管状部材１の他端部１ｂに密に嵌入されるとともに、内径寸法が第２の管状部材６の外径よりも小さい形成されることにより第２の管状部材６が密に嵌入されている。

　本実施形態においては、シリコンチューブ５は、外径が2.0mm、内径が1.0mm、長さが5mmに形成され、第２の管状部材６は、外径が1.2mm、内径が0.5mm、長さが10mmに形成されている。

　そして、この第２の管状部材６における第１の管状部材１内の一端開口が、透析膜７によって塞がれている。この透析膜７は、分画分子量が2,000～100,000Daの範囲であって、かつ上記沈澱剤を透過させるとともに上記生体高分子を透過させない素材によって袋状に形成されたもので、その外周部が第２の管状部材６の外周面とシリコンチューブ５の内周面との間に挟持されている。

　ここで、上記透析膜７としては、キュプラアンモニュウムレーヨン(ＣＲ)や鹸化セルロース(ＳＣＡ)等の再生セルロース膜(ＲＣ)、ヘモファン膜、ＰＣ膜、ビタミンＥコーテング膜等の表面改質再生セルロース膜、セルロースジアセテート(ＣＤＡ)やセルローストリアセテート(ＣＴＡ)等のセルロースアセテート(ＣＡ)、ポリアクリロニトリール(ＰＡＮ)、ポリメチルメタクリレート(ＰＭＭＡ)、エチレンビニルアルコール共重合体(ＥＶＡＬ)、ポリスルホン(ＰＳ)、ポアミド(ＰＡ)、ポリエステル系ポリマーアロイ(ＰＥＰＡ)等の合成高分子系膜を用いることができる。

　そして、生体高分子結晶化装置は、第１及び第２の管状部材１、６が、図２に示すような、内部に沈澱剤溶液Ｌ_２が充填されて第２の管状部材６内に当該沈澱剤溶液Ｌ_２を供給するリザーバ８内に配置されることにより、第１の管状部材１内における生体高分子の結晶化に用いられるものである。

　次に、図３～図７に基づいて、上記第１及び第２の管状部材１、６の組み立て、並びに上記結晶化を行うための手順について説明する。
　先ず、図３に示すように、第１の管状部材１の他端部１ｂに、シリコンチューブ５を1mm程度押し込む。次いで、第２の管状部材６の一端開口に透析膜７を配して、これらをシリコンチューブ５内に差し込んだ後に、当該シリコンチューブ５と共に第１の管状部材１内に押し込む。

　他方、第１の管状部材１の一端部１ａにおいても、同様にシリコンチューブ２を1mm程度押し込み、次いで導入管３をシリコンチューブ２内に差し込んだ後に、当該シリコンチューブ２と共に第１の管状部材１内に押し込む。

　このようにして、組み立てられた第１、第２の管状部材１、６および導入管３を、図４に示すように、例えば純水Ｌ_３を充填したリザーバ８内において保存しておく。

　そして、上記構成からなる生体高分子結晶化装置によって、タンパク質等の生体高分子の結晶化を行うには、先ず図５に示すように、上記第１、第２の管状部材１、６および導入管３を図４に示した保存用のリザーバ８から採りだし、第２の管状部材６の開口端部から、内部にポリイミドチューブ（外径0.38mm、内径0.30mm）をマイクロピペットチップに繋げた充填治具１０を挿入する。そして、この充填治具１０から沈澱剤溶液を供給して第２の管状部材６内を上記沈澱剤溶液Ｌ_２によって満たす。

　ここで、沈澱剤としては、タンパク質を変性させることなく凝縮させることができる塩あるいは高分子であればよく、一般的には塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコールなどを用いることができる。

　次いで、図６に示すように、導入管３の開口端部から、内部にポリイミドチューブ（外径0.62mm、内径0.50mm）をマイクロピペットチップに繋げた充填治具１１を挿入し、この充填治具１１から生体高分子の溶液Ｌ_１を第１の管状部材１内に供給して充填した後に、図７に示すように、導入管３の開口端部を無毒性の粘土４によって封止する。

　そして、これら第１、第２の管状部材１、６および導入管３を、図２に示すように、沈澱剤溶液Ｌ_２が充填されたリザーバ８内に収納することにより、結晶化を開始させる。

　以上説明したように、上記構成からなる生体高分子結晶化装置においては、一端部１ａが封止部材４によって塞がれて内部に生体高分子を含む溶液Ｌ_１が充填される透明な第１の管状部材１と、この第１の管状部材１の他端部１ｂにシリコンチューブ５を介して挿入されて沈澱剤溶液Ｌ_２が供給される第２の管状部材６との２重管構造とし、第２の管状部材６の第１の管状部材１内に位置する一端開口に透析膜７を固定しているために、第１の管状部材１内に透析膜７を介して沈澱剤溶液Ｌ_２が拡散する流路を確保することができ、よって急激な浸透圧差が加わることを回避することができる。

　加えて、第１の管状部材１内に生体高分子の溶液Ｌ_１を充填する際には、第１の管状部材１よりも細径のポリイミドチューブ等を利用して、容易に上記溶液Ｌ_１を第１の管状部材１内に注入することができるために、貴重な生体高分子の溶液を損失したり、あるいは気泡が混入したりすることも回避することもできる。

　なお、上記実施形態においては、第１の管状部材１の一端部１ａを塞ぐ封止部材として、無毒性の粘土４を用いた場合についてのみ説明したが、本発明はこれに限定されるものでは無く、上記第１の管状部材１の一端部１ａを気密的に封じることが可能である限りにおいて、様々な封止部材を用いることができる。

　また、ガラス製の導入管３の端部をマイクロバーナで溶融したり、あるいは当該導入管３を弾力性を有する素材で形成して、端部を圧密処理したりして封止部材とすることも可能である。さらに、第１の管状部材１の一端部１ａに、上述したシリコンチューブ２および導入管３を設けることなく、直接第１の管状部材１の端部を上記無害性の粘土４等によって封止するようにしてもよい。

　また、第１及び第２の管状部材１、６の素材としては、本実施形態において示したガラスの他、石英も好適に用いることができ、例えばポリカーボネートのような透明な合成樹脂を用いることも可能である。

　上記実施形態に示した生体高分子結晶化装置を用いてタンパク質の結晶化実験を行った。
　本実験においては、タンパク質試料溶液（生体高分子溶液Ｌ_１）として、25 mg/ml lysozyme, 5% PEG 4000,0.3 M NaCl, 50 mM acetate buffer pH 4.5を用いるとともに、初期の沈澱剤溶液Ｌ_２として、5% PEG 4000,0.5M NaCl, 50 mM acetate buffer pH 4.5 の組成の溶液を用いた。

　そして、第１の管状部材１内に上記タンパク質試料溶液Ｌ_１を充填し、上記沈澱剤溶液Ｌ_２を満たしたリザーバ８内に横置きで静置して結晶化を開始した。

　次いで、実験開始から１２日後に、上記第１の管状部材１等を、5% PEG 4000, 0.7 M NaCl, 50 mM acetate buffer pH 4.5 の組成からなる沈澱剤溶液Ｌ_２を満たしたリザーバ８中に移し、同様に横置きで静置して結晶を生成させた。

　この結果、実験開始から１４日後に、図８（ａ）に示すように結晶が生成し、実験開始から１ヶ月後に、図８（ｂ）に示すように、成長中の結晶が約450μmになった。

　１　第１の管状部材
　４　無毒性の粘土（封止部材）
　５　シリコンチューブ（シール部材、弾性体）
　６　第２の管状部材
　７　透析膜
　８　リザーバ
　Ｌ_１　生体高分子溶液
　Ｌ_２　沈澱剤溶液

Claims

　内部に生体高分子を含む溶液が充填された第１の管状部材と、
　内部に沈澱剤が供給される第２の管状部材と、
　前記生体高分子を通過させずに前記沈澱剤を通過させる透析膜とを備え、
　前記第２の管状部材は、前記第１の管状部材における内部において開口が形成された端面を有しており、
　前記沈澱剤は、前記第１の管状部材における内部において、前記第２の管状部材における内部から前記開口及び前記透析膜を通過して前記生体高分子を含む溶液に添加される生体高分子結晶化装置であって、
　前記第１の管状部材における内部に嵌入された弾性体と、
前記沈澱剤が充填された内部に前記第２の管状部材を収容することで、前記第２の管状部材における内部に前記沈澱剤を供給するリザーバとをさらに備え、
前記透析膜は、前記開口を塞ぐように前記端面に当接し、かつ、前記第２の管状部材における外周面と前記弾性体の内周面とに当接した状態において固定されていることを特徴とする生体高分子結晶化装置。
　前記第１の管状部材における内部に挿入された導入管をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の生体高分子結晶化装置。
　生体高分子を含む溶液が充填される透明な第１の管状部材と、この第１の管状部材の一端部を塞ぐ封止部材と、上記第１の管状部材の他端部にシール部材を介して挿入される第２の管状部材と、この第２の管状部材の上記第１の管状部材内に位置する一端開口を塞ぐ透析膜と、内部に上記第１および第２の管状部材が収納されるとともに上記沈澱剤溶液が充填されて上記第２の管状部材内に当該沈澱剤溶液を供給するリザーバとを備えてなり、
　上記シール部材は、外径寸法が上記第１の管状部材の内径寸法よりも大きく形成されることにより上記第１の管状部材の上記他端部に密に嵌入されるとともに、内径寸法が上記第２の管状部材の外径よりも小さく形成されることにより上記第２の管状部材が密に嵌入される筒状の弾性体からなり、
　上記透過膜は、沈澱剤を透過させるとともに上記生体高分子を透過させない素材からなり、その外周部が上記第２の管状部材の外周面と上記シール部材の内周面との間に挟持されていることを特徴とする生体高分子結晶化装置。
　上記密閉容器は、ガラスまたは石英からなることを特徴とする請求項３に記載の生体高分子結晶化装置。