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WO2020166980A2 - 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치, 추출 방법 및 유체 유동 칩 - Google Patents

타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치, 추출 방법 및 유체 유동 칩 Download PDF

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WO2020166980A2
WO2020166980A2 PCT/KR2020/001989 KR2020001989W WO2020166980A2 WO 2020166980 A2 WO2020166980 A2 WO 2020166980A2 KR 2020001989 W KR2020001989 W KR 2020001989W WO 2020166980 A2 WO2020166980 A2 WO 2020166980A2
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WO
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solution
chamber
magnetic
elution
extraction
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French (fr)
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신세현
이호윤
나원휘
박찬희
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Korea University Research and Business Foundation
Original Assignee
Korea University Research and Business Foundation
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    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Definitions

  • the present invention relates to an extraction device, an extraction method, and a fluid flow chip for extracting a target material, and more particularly, to extract a target material such as nucleic acid without using a centrifugation method or applying high-speed centrifugation. It relates to a possible extraction device, extraction method and fluid flow chip.
  • the spin column method of nucleic acid extraction is a process of sequentially flowing a sample and buffers for nucleic acid extraction into a column including a porous membrane made of silica. Includes.
  • the spin column method is a method in which nucleic acids are bound to a porous membrane, followed by washing, and then concentrated to a desired concentration and extracted.
  • 1 is a diagram showing an example of a column disclosed in Korean Patent Registration No. 10-1495631
  • FIG. 2 is a diagram illustrating a process of extracting a nucleic acid through a spin column method.
  • the washing process may be performed multiple times or using various washing solutions depending on the type of nucleic acid or the body fluid from which the nucleic acid is extracted, or a subsequent nucleic acid processing process.
  • a drying process is performed so that the washing liquid remaining in the porous membrane is completely removed, and even in this case, a centrifugal separation process is generally performed through a centrifuge.
  • an elution buffer is injected into the column, and then centrifuged again through a centrifuge, so that the nucleic acid bound to the porous membrane can be extracted together with the elution solution.
  • Such a centrifugal separation process makes it difficult to separate nucleic acids through a series of processes in a single chip because, in each process, a column must be passed through a centrifuge and then removed again in each process to extract nucleic acids.
  • the present invention has been devised to solve the above problems, an extraction device capable of extracting a target material such as nucleic acid without using a centrifugation method or applying high-speed centrifugation, an extraction method, and a fluid Its purpose is to provide a floating chip.
  • the object is, according to the present invention, in an extraction device for extracting a target material, an extraction kit, a porous membrane installed inside the extraction kit to which the target material is bound, and passing through the porous membrane in the extraction kit And an elution solution that elutes the target material from the porous membrane, a magnetic solution that has a magnetic property and is not mixed with the elution solution because of a different polarity from the elution solution, and the elution solution and the magnetic that sequentially pass through the porous membrane
  • the magnetic force applying unit may apply a magnetic force to the side of the collection chamber so that the magnetic solution is aggregated on the wall surface inside the collection chamber to expose the eluted solution at the bottom.
  • the elution solution may be a polar solution
  • the magnetic solution may be a non-polar solution
  • the elution solution may include polar distilled water or an elution buffer for nucleic acid extraction
  • the magnetic solution may include non-polar mineral oil or silicone oil in which magnetic particles are dispersed.
  • a flow force applying unit for applying a flow force for passing the elution solution and the magnetic solution through the porous membrane to the extraction kit may be further included.
  • the extraction kit includes an inlet through which the elution solution and the magnetic solution are injected into the extraction kit, and an outlet through which the elution solution passing through the porous membrane is discharged;
  • the flow force application unit may include a pressure pump that applies a positive pressure into the extraction kit through the inlet or provides a negative pressure into the extraction kit through the outlet.
  • the object is, in accordance with another embodiment of the present invention, in an extraction method for extracting a target material by an extraction device, providing an extraction kit having a porous membrane installed therein, and the target material in the porous membrane Binding, and eluting the target material while an elution solution for eluting the target material passes through the porous membrane, and a magnetic solution having a magnetic property and a polarity different from that of the elution solution passes through the porous membrane, The elution solution remaining in the sclera is pushed out, and the elution solution and the magnetic solution sequentially passing through the porous membrane are collected in a collection chamber, and in the collection chamber, the elution solution and the magnetic solution have different polarities.
  • Stacking accordingly, and recovering the elution solution from the collection chamber When recovering the elution solution, a target material characterized in that the elution solution in the collection chamber is recovered in a state where the magnetic solution is physically separated from the elution solution by applying a magnetic force from the outside of the collection chamber. It is also achieved by an extraction method for extraction.
  • a magnetic force is applied to a side surface of the collection chamber so that the magnetic solution aggregates on a wall surface inside the collection chamber to expose the elution solution upward;
  • the elution solution exposed to the upper portion of the collection chamber may be recovered.
  • the elution solution may be a polar solution
  • the magnetic solution may be a non-polar solution
  • the elution solution may include polar distilled water or an elution buffer for nucleic acid extraction
  • the magnetic solution may include non-polar mineral oil or silicone oil in which magnetic particles are dispersed.
  • the extraction kit includes an inlet through which the elution solution and the magnetic solution are injected into the extraction kit, and an outlet through which the elution solution passing through the porous membrane is discharged;
  • the flow force for flowing the elution solution and the magnetic solution may be applied as a positive pressure into the extraction kit through the inlet or may be applied as a negative pressure into the extraction kit through the outlet.
  • the object is, according to another embodiment of the present invention, in a fluid flow chip for extracting a target material, a chip body, and a sample formed in the chip body to store a sample solution containing the target material A chamber, an elution chamber formed inside the chip body to store an elution solution for elution of the target material, and an elution chamber formed inside the chip body to have magnetic properties and have a different polarity from the elution solution so that the elution solution does not mix.
  • a chamber selection valve selectively connecting one of the chamber and the magnetic chamber to an inlet of the extraction chamber, and a collection chamber formed in the chip body and connected to an outlet of the extraction chamber;
  • the chamber selection valve sequentially connects the extraction chamber to the elution container and the magnetic container so that the elution solution and the magnetic solution in the elution chamber and the magnetic chamber flow by a flow force from the outside,
  • the porous membrane is introduced through the inlet and sequentially passes through the porous membrane, and when the magnetic solution passes through the porous membrane, the elution solution remaining in the porous membrane is pushed out and collected into the collection chamber through the outlet,
  • the elution solution and the magnetic solution are stacked according to different polarities in the collection chamber;
  • the magnetic force applied from the outside to the collection chamber may be applied to the side of the collection chamber so that the magnetic solution aggregates on the wall surface inside the collection chamber to expose the elution solution at the bottom.
  • the chip body includes a lower body in which the sample chamber, the elution chamber, the magnetic chamber, the extraction chamber, and the collection chamber are formed, and an upper cover coupled to an upper portion of the lower body;
  • a flow channel for connecting the sample chamber, the elution chamber, and the magnetic chamber to an inlet of the extraction chamber is formed in the lower body;
  • the end of the flow channel and the inlet of the extraction chamber are opened to the upper part of the chip body, and the chamber selection valve coupled to the lower body through the upper cover is respectively provided in the sample chamber, the elution chamber, and the magnetic chamber. Any one of the ends of the connected flow channels may be selectively connected to the inlet of the extraction chamber.
  • At least one washing chamber formed in the lower body to receive a washing solution
  • a waste solution chamber formed in the lower body to store the sample solution and the washing solution passed through the extraction chamber
  • the upper cover and a discharge selection valve coupled to the lower body through the outlet and selectively connecting the outlet of the extraction chamber to one of the collection chamber and the waste solution chamber;
  • the cleaning solution in the cleaning chamber may clean the porous membrane after the target material in the sample solution is bound to the porous membrane while passing through the extraction chamber of the sample solution.
  • the chip body further includes a negative pressure inlet connected to the collection chamber and the waste solution chamber, through which negative pressure from the outside for fluid flow is introduced;
  • the negative pressure inlet may apply negative pressure for flow to the outlet of the collection chamber through the collection chamber or the waste solution chamber according to the selection of the discharge selection valve.
  • the elution solution may be a polar solution
  • the magnetic solution may be a non-polar solution
  • the elution solution may include polar distilled water or an elution buffer for nucleic acid extraction
  • the magnetic solution may include non-polar mineral oil or silicone oil in which magnetic particles are dispersed.
  • the porous membrane is any one of a silica membrane, an ion exchange resin, a silica mesh, a packing tube packed with silica beads, and a membrane having a functional group capable of specific binding to the target material formed on the surface.
  • the target material contains any one of cells including CTC (Circulating Tumor Cell), extracellular vesicles including exosome, and protein
  • the porous membrane is an ion exchange resin
  • the target A functional group capable of specific binding to a substance may include any one of the films formed on the surface.
  • the target material may include any one of a nucleic acid including DNA and RNA, a cell including a circulating tumor cell (CTC), an extracellular vesicles including an exosome, and a protein.
  • a nucleic acid including DNA and RNA
  • a cell including a circulating tumor cell (CTC)
  • CTC circulating tumor cell
  • extracellular vesicles including an exosome
  • a protein e.g., a protein
  • an extraction device an extraction method, and a fluid flow chip capable of extracting a target material such as nucleic acid without using a centrifugation method or applying high-speed centrifugation. I can.
  • FIG. 2 is a diagram showing a process of extracting a nucleic acid through a spin column method
  • FIG. 3 is a view showing the configuration of an extraction device for extracting a target material according to the present invention
  • FIG. 5 is a view for explaining an extraction method for extracting a target material according to the present invention.
  • FIG. 6 is a view for explaining a process of recovering the elution solution from the elution solution and the magnetic solution collected in the collection chamber in the extraction device for extracting the target material according to the present invention
  • FIG. 7 is a perspective view of a fluid flow chip for extracting a target material according to the present invention.
  • FIG. 8 is an exploded perspective view of the fluid flow chip shown in FIG. 7,
  • Figure 9 (a) is a plan view of the fluid flow chip shown in Figure 7,
  • FIG. 9B is a plan view of the lower body of the fluid flow chip shown in FIG. 8,
  • FIG. 10 is a cross-sectional view taken along line X-X of FIG. 8,
  • 11 to 14 are views for explaining a process of extracting a target material using a fluid flow chip according to the present invention.
  • 16 is a diagram showing an experiment result of monitoring a mutant gene through blood analysis of a patient in an actual clinical trial using the fluid flow chip according to the present invention.
  • the extraction apparatus 100 includes an extraction kit 110, a porous membrane 120, an elution solution 130, and a magnetic solution 140.
  • the extraction apparatus 100 according to the present invention may include a collection chamber 200 (refer to FIG. 6) and a flow force application unit 150.
  • the extraction kit 110 has a cylindrical shape in which the inlet 111 and the outlet 112 are formed, and in the present invention, it is assumed that it has a cylindrical shape. Then, the elution solution 130 and the magnetic solution 140 are introduced through the inlet 111, and the eluted solution 130 and the magnetic solution 140 passed through the porous membrane 120 through the outlet 112 are discharged. do. In the present invention, it is assumed that the inner diameter of the outlet 112 is narrowed.
  • the porous membrane 120 is installed inside the extraction kit 110, and a target material (TS, see FIG. 4) is bound to the porous membrane 120.
  • a target material (TS, see FIG. 4)
  • the binding process of the target material TS may include a known method, for example, a binding step, a washing step, and a drying step, and binding through the extraction method according to the present invention or the fluid flow chip 300 to be described later. As possible, a detailed description thereof will be provided later.
  • the target material (TS) to which the extraction device 100 according to the present invention is applied is a nucleic acid including DNA and RNA, a cell including a circulating tumor cell (CTC), and an extracellular vesicle including an exosome.
  • CTC circulating tumor cell
  • Extracellular vesicle including an exosome.
  • Extracellular vesicles may contain any of the proteins.
  • the porous membrane 120 when the target material (TS) is a nucleic acid, the porous membrane 120 includes a silica membrane, an ion exchange resin, a silica mesh, a packing tube packed with silica beads, and a functional group capable of specific binding to the target material (TS). It may include any one of the films formed on.
  • the target substance (TS) contains any one of cells including CTC (Circulating Tumor Cell), extracellular vesicles including exosomes, and proteins
  • the porous membrane 120 It may include any one of an ion exchange resin or a membrane in which a functional group capable of specific binding to the target material TS is formed on the surface. This can be applied to various types of membrane structures in which the target material TS is attached or specifically bound to the porous membrane 120.
  • the elution solution 130 is stacked on the porous membrane 120 in the extraction kit 110. And, when the elution solution 130 passes through the porous membrane 120, the target material (TS) bound to the porous membrane 120 is dissolved in the elution solution 130 or dispersed in the elution solution 130 to elute. It is possible to be separated from the porous membrane 120 together with the solution 130.
  • TS target material
  • the magnetic solution 140 has a polarity different from that of the elution solution 130 and is maintained in a state not mixed with the elution solution 130 when injected into the extraction kit 110.
  • the magnetic solution 140 is provided to have magnetism.
  • magnetic particles are dispersed in a solution having a polarity different from that of the elution solution 130 so that the entire solution has a magnetic shape.
  • the magnetic solution 140 is stacked on the elution solution 130 in the extraction kit 110, as shown in FIG. 3, that is, the porous membrane 120, the elution solution 130, and the magnetic solution Maintaining the form in which 140 is stacked, the elution solution 130 passes through the porous membrane 120 and then the magnetic solution 140 passes through the porous membrane 120.
  • the elution solution 130 is a polar solution such as distilled water
  • the magnetic solution 140 is a non-polar solution such as oil
  • the elution solution 130 may include polar distilled water or an elution buffer for nucleic acid extraction.
  • the elution buffer for nucleic acid extraction is a commercial buffer solution applied to extract nucleic acids, for example, 10 mM Tris-Cl, 0.1 M EDTA, 20 ⁇ g/ml pancreatic RNase A, pH 8.0 mixed solution of 0.5% SDS is applied.
  • the magnetic solution 140 may be non-polar mineral oil or silicone oil in which magnetic particles are dispersed.
  • the flow force applied by the flow force applying unit 150 may include pressure such as positive or negative pressure, centrifugal force, gravity, or inertial force.
  • the flow force application unit 150 applies a positive pressure into the extraction kit 110 through the inlet 111 of the extraction kit 110 or provides a negative pressure into the extraction kit 110 through the outlet 112
  • a pressure pump may be included, and a compressor, a syringe pump, a tube peristaltic pump, and the like may be applied as a configuration of the pressure pump.
  • centrifugal force when compared with the prior art using centrifugal force, it is possible to easily separate even at a smaller rotational speed, that is, a pressure of 12,000 G or less, as described above.
  • the flow resistance of the porous membrane 120 to the eluted solution 103 is small, so that the remaining eluted solution can pass through the porous membrane 120 even with the force of gravity, but not all Even if 130 remains in the porous membrane 120, a target using the elution solution 130 by pushing the remaining elution solution 130 using a magnetic solution 140 that can penetrate into the porous membrane 120 only by gravity The extraction of the substance TS becomes possible.
  • the inertial force generated by repeatedly moving and stopping in the direction of gravity in a state in which the elution solution 130 and the magnetic solution 140 are stacked on the porous membrane 120 is used. Extraction of the target material TS using the elution solution 130 is possible.
  • the elution solution 130 and the magnetic solution 140 sequentially passing through the porous membrane 120 in the extraction kit 110 are collected in the collection chamber 200 connected to the outlet 112 of the extraction kit 110.
  • the elution solution 130 and the magnetic solution 140 are collected in a stacked state according to different polarities. Then, the process of recovering the elution solution 130 from the collection chamber by using the magnetism of the magnetic solution 140 is performed, and a detailed description thereof is provided with reference to FIGS. 5 and 6 as the target material TS according to the present invention. It will be described through the extraction method for extracting.
  • an extraction kit 110 with a porous membrane 120 installed therein is prepared. Then, the target material TS is bound to the porous membrane 120 of the extraction kit 110.
  • a sample solution containing the target material TS is injected into the extraction kit 110 in which the porous membrane 120 is installed (S40).
  • the target material TS in the sample solution is bound to the porous membrane 120 while the sample solution passes through the porous membrane 120 ( S41).
  • the washing solution is injected into the extraction kit 110 (S42), and when a flow force is applied, the washing solution passes through the porous membrane 120 to clean the interior of the porous membrane 120 (S43).
  • the drying process is performed after completion of the washing step, binding of only the target material TS is completed in the porous membrane 120.
  • the elution solution 130 and the magnetic solution 140 are injected into the extraction kit 110 (S45, S46).
  • the injection of the magnetic solution 140 after injection of the elution solution 130 is illustrated as an example, but when the elution solution 130 is distilled water of polarity and the magnetic solution 140 is non-polar oil, the injection sequence Regardless, as shown in FIG. 3, an elution solution 130 and a magnetic solution 140 are sequentially stacked on the porous membrane 120.
  • the elution solution 130 After the injection of the elution solution 130 and the magnetic solution 140 is completed, when a flow force is applied to the extraction kit 110 (S47), as described above, the elution solution 130 first becomes the porous membrane 120 After passing through, the remaining target material (TS) together with the elution solution 130 is pushed out of the porous membrane 120 so that the remaining target material TS is completely removed with the elution solution 130.
  • the extraction becomes possible.
  • the method of applying the flow force to the extraction kit 110 is as described above, and a detailed description thereof will be omitted.
  • the collection chamber 200 It is collected in (S48).
  • the elution solution 130 and the magnetic solution 140 are collected in a stacked state, as shown in FIG. 6A according to different polarities.
  • the magnetic force application unit 160 applies a magnetic force from the outside of the collection chamber 200 (S49) to dissolve the magnetic solution 140 into the elution solution 130
  • the eluted solution 130 is recovered in a state physically separated from (S50).
  • the magnetic force applying unit 160 has a permanent magnet shape as an example, but it is also possible to use an electromagnet.
  • the magnetic force application unit 160 applies a magnetic force to the side of the collection chamber 200 so that the magnetic solution 140 is aggregated to the side of the collection chamber 200.
  • the pipette tip 170 is immediately immersed in the elution solution 130 without passing through the magnetic solution 140, as shown in (d) of FIG. 6,
  • the elution solution 130 can be recovered.
  • the target material TS is extracted from the elution solution 130.
  • the elution solution 130 and the magnetic solution 140 are injected into the extraction kit 110 and the elution solution 130 and the magnetic solution 140 are not mixed and are stacked on the porous membrane 120 It is an example that the flow force is applied to the furnace.
  • the elution solution 130 first flows into the extraction kit 110 to pass through the porous membrane 120 and elute. It goes without saying that the solution 130 may be first collected in the collection chamber 200 and then collected in the collection chamber 200 by passing the magnetic solution 140 through the porous membrane 120 in the same manner.
  • the fluid flow chip 300 for extracting a target material according to the present invention will be described in detail with reference to FIGS. 7 to 14.
  • the fluid flow chip 300 according to the present invention is an example in which the above-described extraction device is implemented in a chip form, and the extraction kit 110 is implemented as an extraction chamber 350 in the fluid flow chip 300.
  • the flow force applying unit 150 in the above-described embodiment will be described as an example consisting of the negative pressure pump 151 and the pressure gauge 152 shown in Figs. 11 to 14, the porous membrane 120 Reference numbers are used identically.
  • the fluid flow chip 300 includes a chip body 310, a sample chamber 321, an elution chamber 323, a magnetic chamber 324, and an extraction chamber 350. ), a porous membrane 120, a chamber selection valve 330, and a collection chamber 325.
  • the chip body 310 is made of a transparent or translucent plastic material, for example. In the present invention, as shown in FIG. 8, it is assumed to include a lower body 311 and an upper cover 312. A sample chamber 321, an elution chamber 323, a magnetic chamber 324, an extraction chamber 350, and a collection chamber 325 are formed in the lower body 311, and a flow channel 371 for connecting these chambers Are formed.
  • the upper cover 312 is coupled to the upper portion of the lower body 311, blocks all or part of the above-described chambers, has a structure in which a stopper for opening and closing each chamber is coupled, and a chamber selection valve 330 and will be described later.
  • the discharge selection valve 340 is coupled to the lower body 311 through the upper cover 312.
  • the sample chamber 321 is formed inside the lower body 311 of the chip body 310, and a sample solution containing a target material is stored.
  • the elution chamber 323 and the magnetic chamber 324 are similarly formed in the lower body 311 of the chip body 310 to store the elution solution and the magnetic solution, respectively.
  • the elution solution and the magnetic solution correspond to the above-described extraction device 100, and detailed descriptions thereof will be omitted.
  • the extraction chamber 350 is formed inside the lower chamber of the chip body 310 and corresponds to the extraction kit 110 of the extraction apparatus 100 described above. That is, inside the extraction chamber 350, as shown in FIGS. 7 and 10, a porous membrane 120 to which a target material is bound is installed.
  • the collection chamber 325 is formed inside the lower body 311 of the chip body 310 and is connected to the outlet 352 (not shown) of the extraction chamber 350.
  • the chamber selection valve 330 is installed in the chip body 310, and one of the sample chamber 321, the elution chamber 323, and the magnetic chamber 324 is connected to the inlet 351 of the extraction chamber 350. Connect selectively.
  • the chamber selection valve 330 is coupled to the lower body 311 through the upper cover 312, as shown in FIG. 8.
  • the sample chamber 321, the elution chamber 323, and the magnetic chamber 324 are respectively provided in the lower body 311 in the inlet 351 of the extraction chamber 350.
  • a flow channel 371 for connecting with is formed.
  • the end of the flow channel 371 has an open state to the upper surface of the lower body 311, as shown in (b) of FIG. 9, similarly, the inlet 351 of the extraction chamber 350 ) It is also in a state that is open to the upper portion of the lower body 311.
  • the chamber selection valve 330 is coupled to the upper surface of the lower body 311 through the upper cover 312 and is connected to the sample chamber 321, the elution chamber 323, and the magnetic chamber 324, respectively. Any one of the ends of 371 is selectively connected to the inlet 351 of the extraction chamber 350.
  • the chamber selection valve 330 includes a gasket 311 made of silicon, a chamber switching valve 332, and a first fixing jig 333 for fixing them. do.
  • the gasket 311 communication holes communicating with the end of each flow channel 371 and the inlet 351 of the extraction chamber 350 are formed, and the extraction chamber 350 according to the rotation of the chamber switching valve 332 Any one of the inlet 351 of the flow channel 371 is in communication with each other.
  • the fluid flow chip 300 may include at least one washing chamber 322a, 322b, and 322c, a waste solution chamber 326, and a discharge selection valve 340.
  • the washing chambers 322a, 322b, and 322c are formed in the lower body 311 to accommodate the washing solution.
  • each washing chamber (322a, 322b, 322c) is accommodated in each washing solution having a different concentration of ethanol, the three washing chambers (322a, 322b, 322c) sequentially in the order of the washing solution having a low concentration of ethanol. For example, it is provided to clean the porous membrane 120.
  • the waste solution chamber 326 is formed in the lower body 311 and passed through the extraction chamber 350, and waste solutions such as a sample solution and a washing solution are stored.
  • the discharge selection valve 340 is coupled to the lower body 311 through the upper cover 312, and the discharge port 352 of the extraction chamber 350 is provided with any one of the collection chamber 325 and the waste solution chamber 326. Selectively connect with one. As shown in FIG. 8, it is assumed that the discharge selection valve 340 includes a discharge switching valve 342 and a second fixing jig 343.
  • a negative pressure inlet 360 connected to the collection chamber 325 and the waste solution chamber 326 is formed in the chip body 310.
  • a negative pressure pump 151 is connected to the negative pressure inlet to apply negative pressure for fluid flow. That is, the negative pressure inlet 360 has a negative pressure for the flow of the fluid to the outlet 352 of the collection chamber 325 through the collection chamber 325 or the waste solution chamber 326 according to the selection of the discharge selection valve 340. It is approved, a detailed description thereof will be described later.
  • the sample solution accommodated in the sample chamber 321 is transferred to the extraction chamber 350.
  • the binding step that is injected is performed.
  • the discharge selection valve 340 is switched so that the negative pressure pump 151 is connected through the discharge port 352 side of the extraction chamber 350 and the waste solution chamber 326 as shown in FIG. 11. .
  • the sample solution in the sample chamber 321 is bound into the extraction chamber 350 through the chamber selection valve 330 by the negative pressure applied to the outlet 352 of the extraction chamber 350.
  • the lines indicated in bold color in FIGS. 11 to 14 indicate lines connected by the discharge selection valve 340 and the chamber selection valve 330.
  • the discharge selection valve 340 is switched so that the negative pressure pump 151 is connected through the discharge port 352 side of the extraction chamber 350 and the waste solution chamber 326 as shown in FIG. 12. .
  • the cleaning solution in the cleaning chambers 322a, 322b, 322c is injected into the extraction chamber 350 through the chamber selection valve 330 by the negative pressure applied to the outlet 352 of the extraction chamber 350 .
  • a washing process is performed, and the cleaning solution that has passed through the porous membrane 120 is discharged to the waste solution chamber 326 through the discharge port 352 and the discharge selection valve 340.
  • 11 to 14 show examples in which one washing chamber 322a, 322b, and 322c is applied, but as described above, three washing solutions sequentially flow from the three washing chambers 322a, 322b, and 322c. As a matter of course, it may be provided to clean the porous membrane 120.
  • the drying step may be performed, and after the drying step is completed, the chamber selection valve 330 is switched to connect the extraction chamber 350 and the elution chamber 323 to the elution chamber.
  • the eluted solution in the 323 flows into the extraction chamber 350.
  • the discharge selection valve 340 is switched so that the negative pressure pump 151 is connected through the outlet 352 side of the extraction chamber 350 and the collection chamber 325.
  • the elution solution in the elution chamber 323 is injected into the extraction chamber 350 through the chamber selection valve 330 by the negative pressure applied to the outlet 352 of the extraction chamber 350, and the porous membrane 120 After passing through, it is collected into the collection chamber 325.
  • the chamber selection valve 330 is switched so that the extraction chamber 350 and the magnetic chamber 324 are connected, as shown in FIG. 14, so that the magnetic solution in the magnetic chamber 324 is inside the extraction chamber 350. It is injected into the porous membrane 120 and the remaining elution solution is pushed out and collected into the collection chamber 325 together with the elution solution.
  • the discharge selection valve 340 is switched so that the negative pressure pump 151 is connected through the outlet 352 side of the extraction chamber 350 and the collection chamber 325.
  • the magnetic solution in the magnetic chamber 324 flows into the extraction chamber 350 through the chamber selection valve 330 due to the negative pressure applied to the outlet 352 of the extraction chamber 350, and the porous membrane 120 After passing through, it is collected in the collection chamber 325.
  • FIG. 15 is a diagram for explaining an experiment result using a fluid flow chip according to the present invention.
  • a cfDNA standard sample was used to test whether a very small proportion of mutant genes could be extracted.
  • a commercially available centrifugation method, QIA amp was used for the comparative experiment.
  • the cfDNA standard sample used in the experiment was a Horizon product.
  • the sample volume was 500 ⁇ l, and an experiment was conducted to extract ctDNA of PIK3CA E545K, EGFR L858R, KRAS G12D, and NRAS Q61K from a total of 4 sample sets (0%, 0.1%, 1%, 5%).
  • PIBEX is an experimental result of the fluid flow chip according to the present invention.
  • 16 is a diagram showing an experiment result of monitoring a mutant gene through blood analysis of a patient in an actual clinical trial using the fluid flow chip according to the present invention.
  • PIK3CA H1047R mutation was monitored using 500 ⁇ l of plasma from round bottoms of HER-2 breast cancer.
  • FIG. 16B As cancer metastasis to the liver progresses, as shown in FIG. 16B, it can be seen that the mutant gene in the blood increases.
  • the tumor metastasized to the liver can be confirmed through an MRI image as shown in FIG. 16A.
  • extraction device 110 extraction kit
  • elution chamber 324 magnetic chamber
  • chamber selection valve 331 gasket
  • chamber switching valve 333 first fixing jig
  • discharge selection valve 342 discharge switching valve
  • the method according to the present invention can extract a target material such as nucleic acid without using a centrifugal separation method or applying high-speed centrifugation, so it will be usefully utilized in various industrial fields in which a target material such as nucleic acid is utilized. I can.

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Abstract

본 발명은 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치, 추출 방법 및 유체 유동 칩에 관한 것이다. 본 발명에 따른 추출 장치에서는 추출 키트 내의 다공막에 타겟 물질이 바인딩 된 상태에서, 용출 용액과 자성 용액이 순차적으로 통과할 때, 다공막에 잔존하는 용출 용액을 극성의 차이로 자성 용액이 밀어내며, 수집 챔버에 수집된다. 그리고, 수집 챔버 내에서도 상이한 극성에 의해 용출 용액과 자성 용액이 적층된 상태를 유지하는데, 수집 챔버 내의 자성 용액이 자력 인가부의 자력에 의해 용출 용액으로부터 물리적으로 분리된 상태에서, 수집 챔버 내의 용출 용액이 회수 가능하게 된다. 이에 따라, 용출 용액이 자성 용액과 함께 수집 챔버에 수집된 후, 자력에 의해 수집 챔버 내의 자성 용액을 용출 용액으로부터 물리적으로 분리된 상태에서 용출 용액의 회수가 가능하게 된다.

Description

타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치, 추출 방법 및 유체 유동 칩
본 발명은 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치, 추출 방법 및 유체 유동 칩에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 원심 분리 방식을 이용하지 않거나 고속의 원심 분리를 적용하지 않으면서도 핵산과 같은 타겟 물질을 추출할 수 있는 추출 장치, 추출 방법 및 유체 유동 칩에 관한 것이다.
의료 분야에 있어서 맞춤 의학을 구현하기 위한 효율적 진단 및 치료방법이 활발하게 개발되고 있는데, 핵산과 같은 타겟 물질의 추출 및 정제 과정은 생명공학, 분자 생물학, 생화학, 진단 검사 의학 등의 검사에서 핵심이 되는 과정이다.
근래에 비침습적인 액체생체검사가 높은 검출 정확도와 조기 발견 표지자로서의 가능성이 입증되어 기존의 조직생검의 실질적인 대안으로 주목받고 있는 가운데, 혈액 또는 기타 체액으로부터 cfDNA(cell free DNA), 엑소좀, CTC (Circulating Tumor Cell) 등의 분리 및 정제 기술의 수요가 늘어나고 있다.
신속하고 정확한 진단을 위한 대표적인 타겟 물질의 전처리 방법의 일 예로 스핀 컬럼(Spin column) 방식의 핵산 추출 과정은, 실리카 재질의 다공막을 포함하는 컬럼에 샘플과 핵산 추출을 위한 버퍼들을 순차적으로 흘려주는 과정을 포함한다. 결과적으로 스핀 컬럼 방식은 핵산을 다공막에 결합시킨 후 세척(Washing) 과정을 거쳐 핵산을 원하는 농도로 농축시켜 추출하는 방법이다. 도 1은 한국등록특허 제10-1495631호에 개시된 컬럼의 예를 도시한 도면이고, 도 2는 스핀 컬럼 방식을 통해 핵산을 추출하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 2를 참조하여 설명하면, 핵산을 포함하는 샘플을 컬럼에 투입한 후, 원심 분리기에서 원심 분리 과정을 거치게 되면, 샘플 내의 핵산이 다공막에 바인딩(Binding)된다. 그런 다음, 세척 용액을 컬럼에 주입하고 다시 원심 분리기를 통해 원심 분리 과정을 거치게 되면, 다공막에 잔존하는 불순물들이 제거된다. 여기서, 세척 과정은 핵산이나 핵산이 추출된 체액의 유형, 또는 이후의 핵산 처리 과정에 따라 다양한 세척 용액이 사용되거나 복수회 수행될 수 있다.
세척 과정이 완료되면, 다공막에 잔존하는 세척액이 완전히 제거되도록 건조(Drying) 과정을 거치게 되는데, 이 경우에도 일반적으로 원심 분리기를 통한 원심 분리 과정을 거치게 된다.
건조 과정이 완료되면 용출 용액(Elution buffer)을 컬럼에 주입한 후, 다시 원심 분리기를 통해 원심 분리 과정을 거치게 되면, 다공막에 바인딩되어 있던 핵산이 용출 용액과 함께 추출 가능하게 된다.
상기와 같이, 스핀 컬럼 방식을 이용한 핵산 추출의 경우, 대부분의 과정에서 원심 분리 과정을 거쳐야 하는데, 근래에 바인딩 과정이나 세척 과정에서는 음압을 이용하는 방안이 제안되고 있으나, 건조 과정이나 용출 과정, 특히 용출 과정에서 컬럼에 12,000G 이상이 인가되어야 하므로, 이를 음압으로 대체하기는 어려운 실정이다.
이와 같은 원심 분리 과정은 핵산을 추출하는데 있어, 각각의 과정에서 컬럼을 원심 분리기에 거치하고 다시 빼내는 과정을 거쳐야 하기 때문에, 하나의 칩에서 일련의 과정을 통해 핵산을 분리하는 것을 어렵게 하고 있다.
또한, 원심 분리기를 배치할 수 없는 현장 진단에서는 스핀 컬럼 방식을 적용하기 어려울 뿐만 아니라, 현장에서 추출한 샘플을 원심 분리기가 마련된 장소로 이동하는 과정에서 교차 오염의 우려가 있는 문제점이 있다.
또한, 일련의 과정이 사용자가 일일이 수작업으로 수행하여야 하기 때문에, 사용자의 숙련도에 따라 핵산 추출량이나 순도의 반복 정확성에 영향을 받게 된다.
이에, 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해소하기 위해 안출된 것으로서, 원심 분리 방식을 이용하지 않거나 고속의 원심 분리를 적용하지 않으면서도 핵산과 같은 타겟 물질을 추출할 수 있는 추출 장치, 추출 방법 및 유체 유동 칩을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기 목적은 본 발명에 따라, 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치에 있어서, 추출 키트와, 상기 추출 키트의 내부에 설치되어 상기 타겟 물질이 바인딩되는 다공막과, 상기 추출 키트 내에서 상기 다공막을 통과하면서 상기 다공막으로부터 상기 타겟 물질을 용출하는 용출 용액과, 자성을 가지며, 상기 용출 용액과 상이한 극성을 가져 상기 용출 용액과 섞이지 않은 자성 용액과, 상기 다공막을 순차적으로 통과하는 상기 용출 용액 및 상기 자성 용역이 적층된 상태로 수집되는 수집 챔버와, 상기 수집 챔버로 자력을 인가하기 위한 자력 인가부를 포함하고; 상기 자성 용액이 상기 다공막을 통과할 때 상기 용출 용액과의 상이한 극성에 의해 상기 다공막에 잔존하는 상기 용출 용액을 밀어내며; 상기 수집 챔버 내의 상기 자성 용액이 상기 자력 인가부의 자력에 의해 상기 용출 용액으로부터 물리적으로 분리된 상태에서, 상기 수집 챔버 내의 상기 용출 용액이 회수 가능한 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치에 의해서 달성된다.
여기서, 상기 자력 인가부는 상기 자성 용액이 상기 수집 챔버 내부의 벽면으로 뭉쳐 하부의 상기 용출 용액이 상부로 노출되도록 상기 수집 챔버의 측면으로 자력을 인가할 수 있다.
또한, 상기 용출 용액은 극성 용액이고, 상기 자성 용액은 무극성 용액일 수 있다.
그리고, 상기 타겟 물질이 핵산인 경우, 상기 용출 용액은 극성의 증류수 또는 핵산 추출용 용출 버퍼를 포함하고, 상기 자성 용액은 자성 입자가 분산된 무극성의 미네랄 오일 또는 실리콘 오일을 포함할 수 있다.
그리고, 상기 용출 용액과 상기 자성 용액이 상기 다공막을 통과하기 위한 유동력을 상기 추출 키트에 인가하는 유동력 인가부를 더 포함할 수 있다.
그리고, 상기 추출 키트는 상기 용출 용액과 상기 자성 용액이 상기 추출 키트에 주입되는 유입구와, 상기 다공막을 통과한 상기 용출 용액이 배출되는 배출구를 포함하며; 상기 유동력 인가부는 상기 유입구를 통해 상기 추출 키트 내부로 양압을 인가하거나 상기 배출구를 통해 상기 추출 키트 내부로 음압을 제공하는 압력 펌프를 포함할 수 있다.
한편, 상기 목적은 본 발명의 다른 실시 형태에 따라, 추출 장치가 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 방법에 있어서, 내부에 다공막이 설치된 추출 키트를 마련하는 단계와, 상기 다공막에 상기 타겟 물질이 바인딩되는 단계와, 상기 타겟 물질의 용출을 위한 용출 용액이 상기 다공막을 통과하면서 상기 타켓 물질을 용출하는 단계와, 자성을 가지며 상기 용출 용액과 상이한 극성을 갖는 자성 용액이 상기 다공막을 통과하면서 상기 다공막에 잔존하는 상기 용출 용액을 밀어내는 단계와, 상기 다공막을 순차적으로 통과한 상기 용출 용액과 상기 자성 용액이 수집 챔버에 수집되고, 상기 수집 챔버 내에서 상기 용출 용액과 상기 자성 용액은 상이한 극성에 따라 적층되는 단계와, 상기 수집 챔버로부터 상기 용출 용액을 회수하는 단계를 포함하며; 상기 용출 용액을 회수할 때, 상기 수집 챔버의 외부로부터 자력을 인가하여 상기 자성 용액이 상기 용출 용액으로부터 물리적으로 분리된 상태에서, 상기 수집 챔버 내의 상기 용출 용액이 회수되는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 방법에 의해서도 달성된다.
여기서, 상기 용출 용액을 회수할 때, 상기 수집 챔버의 측면으로 자력이 인가되어 상기 자성 용액이 상기 수집 챔버 내부의 벽면에 뭉쳐 상기 용출 용액이 상부로 노출되고; 상기 수집 챔버의 내부에서 상부로 노출된 상기 용출 용액을 회수할 수 있다.
또한, 상기 용출 용액은 극성 용액이고, 상기 자성 용액은 무극성 용액일 수 있다.
그리고, 상기 타겟 물질이 핵산인 경우, 상기 용출 용액은 극성의 증류수 또는 핵산 추출용 용출 버퍼를 포함하고, 상기 자성 용액은 자성 입자가 분산된 무극성의 미네랄 오일 또는 실리콘 오일을 포함할 수 있다.
그리고, 상기 추출 키트는 상기 용출 용액과 상기 자성 용액이 상기 추출 키트에 주입되는 유입구와, 상기 다공막을 통과한 상기 용출 용액이 배출되는 배출구를 포함하며; 상기 용출 용액과 상기 자성 용액을 유동시키기 위한 유동력은 상기 유입구를 통해 상기 추출 키트 내부로 양압으로 인가되거나, 상기 배출구를 통해 상기 추출 키트 내부로 음압으로 인가될 수 있다.
한편, 상기 목적은 본 발명의 또 다른 실시 형태에 따라, 타겟 물질을 추출하기 위한 유체 유동 칩에 있어서, 칩 본체와, 상기 칩 본체 내부에 형성되어 상기 타겟 물질이 포함된 샘플 용액이 저장되는 샘플 챔버와, 상기 칩 본체 내부에 형성되어 상기 타겟 물질의 용출을 위한 용출 용액이 저장되는 용출 챔버와, 상기 칩 본체 내부에 형성되어 자성을 가지며 상기 용출 용액과 상이한 극성을 가져 상기 용출 용액과 섞이지 않는 자성 용액이 저장된 자성 챔버와, 상기 칩 본체 내부에 형성되는 추출 챔버와, 상기 추출 챔버의 내부에 설치되어 상기 타겟 물질이 바인딩되는 다공막과, 상기 칩 본체에 설치되어, 상기 샘플 챔버, 상기 용출 챔버 및 상기 자성 챔버 중 어느 하나를 상기 추출 챔버의 유입구와 선택적으로 연결하는 챔버 선택 밸브와, 상기 칩 본체 내부에 형성되고, 상기 추출 챔버의 배출구와 연결되는 수집 챔버를 포함하고; 상기 챔버 선택 밸브가 상기 추출 챔버를 상기 용출 용기와 상기 자성 용기에 순차적으로 연결시켜 외부로부터의 유동력에 의해 상기 용출 챔버 및 상기 자성 챔버 내의 상기 용출 용액 및 상기 자성 용액이 유동하여 상기 추출 챔버의 상기 유입구를 통해 상기 다공막을 유입되어 상기 다공막을 순차적으로 통과하고, 상기 자성 용액이 상기 다공막을 통과할 때 상기 다공막에 잔존하는 상기 용출 용액을 밀어내어 상기 배출구를 통해 상기 수집 챔버로 수집되되, 상기 수집 챔버 내에서 상기 용출 용액과 상기 자성 용액이 상이한 극성에 따라 적층되며; 외부로부터의 상기 수집 챔버로 자력이 인가되어 상기 자성 용액이 상기 용출 용액으로부터 물리적으로 분리된 상태에서 상기 수집 챔버 내의 상기 용출 용액이 회수될 수 있다.
여기서, 외부로부터 상기 수집 챔버로 인가되는 자력은 상기 자성 용액이 상기 수집 챔버 내부의 벽면으로 뭉쳐 하부의 상기 용출 용액이 상부로 노출되도록 상기 수집 챔버의 측면으로 인가될 수 있다.
그리고, 상기 칩 본체는 상기 샘플 챔버, 상기 용출 챔버, 상기 자성 챔버, 상기 추출 챔버 및 상기 수집 챔버가 형성되는 하부 본체와, 상기 하부 본체의 상부에 결합되는 상부 커버를 포함하고; 상기 하부 본체에는 상기 샘플 챔버, 상기 용출 챔버 및 상기 자성 챔버를 상기 추출 챔버의 유입구와 연결하기 위한 유동 채널이 형성되고; 상기 유동 채널의 말단과 상기 추출 챔버의 상기 유입구는 상기 칩 본체의 상부로 개방되고, 상기 상부 커버를 통해 하부 본체에 결합되는 상기 챔버 선택 밸브가 상기 샘플 챔버, 상기 용출 챔버 및 상기 자성 챔버에 각각 연결된 상기 유동 채널의 말단 중 어느 하나를 선택적으로 상기 추출 챔버의 상기 유입구와 연결시킬 수 있다.
그리고, 상기 하부 본체에 형성되어 세척 용액이 수용되는 적어도 하나의 세척 챔버와, 상기 하부 본체에 형성되어 상기 추출 챔버를 통과한 상기 샘플 용액과 상기 세척 용액을 저장하는 폐용액 챔버와, 상기 상부 커버를 통해 상기 하부 본체에 결합되고, 상기 추출 챔버의 상기 배출구를 상기 수집 챔버와 상기 폐용액 챔버 중 어느 하나와 선택적으로 연결하는 배출 선택 밸브를 더 포함하며; 상기 세척 챔버 내의 상기 세척 용액은 상기 샘플 용액의 상기 추출 챔버를 통과하면서 상기 샘플 용액 내의 상기 타겟 물질이 상기 다공막에 바인딩된 후 상기 다공막을 세척할 수 있다.
또한, 상기 칩 본체는 상기 수집 챔버 및 상기 폐용액 챔버와 연결되고, 유체의 유동을 위한 외부로부터의 음압이 유입되는 음압 유입구를 더 포함하며; 상기 음압 유입구는 상기 배출 선택 밸브의 선택에 따라 상기 수집 챔버 또는 폐용액 챔버를 통해 상기 수집 챔버의 상기 배출구로 유동을 위한 음압을 인가할 수 있다.
그리고, 상기 용출 용액은 극성 용액이고, 상기 자성 용액은 무극성 용액일 수 있다.
그리고, 상기 타겟 물질이 핵산인 경우, 상기 용출 용액은 극성의 증류수 또는 핵산 추출용 용출 버퍼를 포함하고, 상기 자성 용액은 자성 입자가 분산된 무극성의 미네랄 오일 또는 실리콘 오일을 포함할 수 있다.
그리고, 상기 타겟 물질이 핵산인 경우, 상기 다공막은 실리카 막, 이온 교환수지, 실리카 메쉬, 실리카 비드가 패킹된 패킹 튜브, 상기 타겟 물질과 특이적 결합이 가능한 작용기가 표면에 형성된 막 중 어느 하나를 포함하며; 상기 타겟 물질이 CTC(Circulating Tumor Cell)를 포함하는 세포, 엑소좀(Exosome)를 포함하는 세포외 소포체(Extracellular vesicles), 단백질 중 어느 하나를 포함하는 경우, 상기 다공막은 이온 교환수지, 상기 타겟 물질과 특이적 결합이 가능한 작용기가 표면에 형성된 막 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
그리고, 상기 타겟 물질은 DNA 및 RNA를 포함하는 핵산, CTC(Circulating Tumor Cell)를 포함하는 세포, 엑소좀(Exosome)를 포함하는 세포외 소포체(Extracellular vesicles), 단백질 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
상기와 같은 구성에 따라, 본 발명에 따르면, 원심 분리 방식을 이용하지 않거나 고속의 원심 분리를 적용하지 않으면서도 핵산과 같은 타겟 물질을 추출할 수 있는 추출 장치, 추출 방법 및 유체 유동 칩을 제공할 수 있다.
도 1은 한국등록특허 제10-1495631호에 개시된 컬럼의 예를 도시한 도면이고,
도 2는 스핀 컬럼 방식을 통해 핵산을 추출하는 과정을 나타낸 도면이고,
도 3은 본 발명에 따른 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치의 구성을 나타낸 도면이고,
도 4는 본 발명에 따른 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치의 작동 원리를 설명하기 위한 도면이고,
도 5는 본 발명에 따른 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 방법을 설명하기 위한 도면이고,
도 6은 본 발명에 따른 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치에서 수집 챔버에 수집된 용출 용액 및 자성 용액에서 용출 용액을 회수하는 과정을 설명하기 위한 도면이고,
도 7은 본 발명의 따른 타겟 물질을 추출하기 위한 유체 유동 칩의 사시도이고,
도 8은 도 7에 도시된 유체 유동 칩의 분해 사시도이고,
도 9의 (a)는 도 7에 도시된 유체 유동 칩의 평면도이고,
도 9의 (b)는 도 8에 도시된 유체 유동 칩의 하부 본체의 평면도이고,
도 10은 도 8의 X-X 선에 따른 단면도이고,
도 11 내지 도 14는 본 발명에 따른 유체 유동 칩을 이용한 타겟 물질의 추출 과정을 설명하기 위한 도면이고,
도 15는 본 발명에 따른 유체 유동 칩을 이용한 실험 결과를 설명하기 위한 도면이고,
도 16은 본 발명에 따른 유체 유동 칩을 활용하여 실제 임상에서 환자의 혈액 분석을 통해 돌연변이 유전자를 모니터링하는 실험 결과를 나타낸 도면이다.
이하에서는 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 실시예들을 상세히 설명한다.
도 3은 본 발명에 따른 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치(100)의 구성을 나타낸 도면이다. 도 3을 참조하여 설명하면, 본 발명에 따른 추출 장치(100)는 추출 키트(110), 다공막(120), 용출 용액(130) 및 자성 용액(140)을 포함한다. 또한, 본 발명에 따른 추출 장치(100)는 수집 챔버(200, 도 6 참조) 및 유동력 인가부(150)를 포함할 수 있다.
추출 키트(110)는 유입구(111) 및 배출구(112)가 형성된 통 형상을 가지며, 본 발명에서는 원통 형상을 갖는 것을 예로 한다. 그리고, 유입구(111)를 통해 용출 용액(130) 및 자성 용액(140)이 유입되며, 배출구(112)를 통해 다공막(120)을 통과한 용출 용액(130) 및 자성 용액(140)이 배출된다. 본 발명에서는 배출구(112) 측의 내경이 좁아지는 형태를 갖는 것을 예로 한다.
다공막(120)은 추출 키트(110)의 내부에 설치되는데, 다공막(120)에는 타겟 물질(TS, 도 4 참조)이 바인딩된다. 여기서, 타겟 물질(TS)의 바인딩 과정은 기 공지된 방법, 예컨대 바인딩 단계, 세척 단계, 및 건조 단계를 포함할 수 있으며, 후술할 본 발명에 따른 추출 방법이나 유체 유동 칩(300)을 통해 바인딩될 수 있는 바, 이에 대한 상세한 설명은 후술한다.
여기서, 본 발명에 따른 추출 장치(100)가 적용되는 타겟 물질(TS)은 DNA 및 RNA를 포함하는 핵산, CTC(Circulating Tumor Cell)를 포함하는 세포, 엑소좀(Exosome)를 포함하는 세포외 소포체(Extracellular vesicles), 단백질 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
또한, 타겟 물질(TS)이 핵산인 경우, 다공막(120)은 실리카 막, 이온 교환수지, 실리카 메쉬, 실리카 비드가 패킹된 패킹 튜브, 타겟 물질(TS)과 특이적 결합이 가능한 작용기가 표면에 형성된 막 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 또한, 타겟 물질(TS)이 CTC(Circulating Tumor Cell)를 포함하는 세포, 엑소좀(Exosome)를 포함하는 세포외 소포체(Extracellular vesicles), 단백질 중 어느 하나를 포함하는 경우, 다공막(120)은 이온 교환수지, 타겟 물질(TS)과 특이적 결합이 가능한 작용기가 표면에 형성된 막 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 이는 타겟 물질(TS)이 부착되거나 특이적으로 결합되어 다공막(120)에 바인딩될 수 있는 다양한 형태의 막 구조가 적용될 수 있다.
용출 용액(130)은 추출 키트(110) 내에서 다공막(120) 위에 적층된다. 그리고, 용출 용액(130)이 다공막(120)을 통과할 때, 다공막(120)에 바인딩된 타겟 물질(TS)이 용출 용액(130)에 용해되거나 용출 용액(130) 내부로 분산되어 용출 용액(130)과 함께 다공막(120)으로부터 이탈이 가능하게 된다.
자성 용액(140)은 용출 용액(130)과 상이한 극성을 가져, 추출 키트(110) 내에 주입될 때 용출 용액(130)과 섞이지 않는 상태로 유지된다. 그리고, 자성 용액(140)은 자성을 갖도록 마련된다. 예컨대, 자성 용액은 용출 용액(130)과 상이한 극성을 가지는 용액 내에 자성 입자가 분산되어 용액 전체가 자성을 갖는 형태를 갖게 된다.
여기서, 자성 용액(140)은, 도 3에 도시된 바와 같이, 추출 키트(110) 내에서 용출 용액(130) 위에 적층되는데, 즉, 다공막(120), 용출 용액(130), 그리고 자성 용액(140)이 적층되는 형태를 유지하여 용출 용액(130)이 다공막(120)을 통과한 다음 자성 용액(140)이 다공막(120)을 통과하게 된다.
본 발명에서는 용출 용액(130)이 증류수와 같은 극성 용액이고, 자성 용액(140)이 기름과 같은 무극성 용액인 것을 예로 한다. 일 예로, 타겟 물질(TS)이 핵산인 경우, 용출 용액(130)은 극성의 증류수 또는 핵산 추출용 용출 버퍼가 적용될 수 있다. 여기서, 핵산 추출용 용출 버퍼는 핵산을 추출하는데 적용되는 상용의 버퍼 용액으로, 일 예로 10 mM Tris-Cl, 0.1 M EDTA, 20 μg/ml pancreatic RNase A, 0.5% SDS의 pH 8.0 혼합 용액이 적용될 수 있다. 이 때, 자성 용액(140)은 자성 입자가 분산된 무극성의 미네랄 오일 또는 실리콘 오일이 적용될 수 있다.
상기와 같은 구성에 따라, 용출 용액(130)과 자성 용액(140)이 다공막(120)을 통과하기 위한 유동력이 유동력 인가부(150)를 통해 추출 키트(110)에 인가되면, 도 4의 (a)에 도시된 바와 같이, 용출 용액(130)이 먼저 다공막(120)을 통과하면서 다공막(120) 내의 타겟 물질(TS)과 함께 다공막(120) 반대측으로 유동하게 된다.
그런데, 용출 용액(130)이 다공막(120)을 모두 통과하면서 타겟 물질(TS)의 대부분을 다공막(120)으로부터 이탈시키기 위해 종래의 원심 분리 방식이 12,000G를 인가하였으나, 본 발명에 따른 추출 장치(100)에서는 용출 용액(130) 통과 다음에 자성 용액(140)이 다공막(120)을 통과하면서, 도 4의 (b)에 도시된 바와 같이, 다공막(120) 내의 잔존하는 용출 용액(130)을 밀어내어 용출 용액(130)와 타겟 물질(TS)이 완전하게 다공막(120)으로부터 이탈 가능하게 된다. 이에 따라, 원심 분리기를 이용하지 않거나, 원심력을 이용하더라도 12,000G 이하의 압력에서도 용출 용액(130)을 이용한 타겟 물질(TS)의 추출이 가능하게 된다.
본 발명에서는 유동력 인가부(150)에 의해 인가되는 유동력이 양압 또는 음압과 같은 압력, 원심력, 중력, 또는 관성력을 포함할 수 있다. 예컨대, 유동력 인가부(150)는 추출 키트(110)의 유입구(111)를 통해 추출 키트(110) 내부로 양압을 인가하거나 배출구(112)를 통해 추출 키트(110) 내부로 음압을 제공하는 압력 펌프를 포함할 수 있으며, 압력 펌프의 구성으로 컴프레셔, 시린지 펌프, 튜브 연동식 펌프 등이 적용될 수 있다.
또한, 원심력의 경우, 원심력을 이용하는 종래기술과 대비할 때, 보다 작은 회전 속도, 즉 상기와 같이, 12,000G 이하의 압력에서도 용이하게 분리가 가능하게 된다.
중력을 유동력으로 사용하는 경우, 다공막(120)의 용출 용액(103)에 대한 유동 저항이 작아서 중력의 힘으로도 다공막(120)을 통과할 수 있으나, 전부 통과하지 못하는 잔여의 용출 용액(130)이 다공막(120) 내에 잔존하더라도 중력만으로 다공막(120) 내부로 침투가 가능한 자성 용액(140)을 사용하여 잔존하는 용출 용액(130)을 밀어내어 용출 용액(130)을 이용한 타겟 물질(TS)의 추출이 가능하게 된다.
또한, 관성력을 유동력으로 사용하는 경우, 다공막(120) 상부에 용출 용액(130)과 자성 용액(140)을 적층시킨 상태에서 중력방향으로 빠르게 이동 및 정지를 반복하여 발생하는 관성력을 이용하여 용출 용액(130)을 이용한 타겟 물질(TS)의 추출이 가능하게 된다.
한편, 추출 키트(110) 내의 다공막(120)을 순차적으로 통과한 용출 용액(130) 및 자성 용액(140)은 추출 키트(110)의 배출구(112)와 연결된 수집 챔버(200)에 수집되는데, 도 6에 도시된 바와 같이, 상호 상이한 극성에 따라 용출 용액(130)과 자성 용액(140)이 적층된 상태로 수집된다. 그리고, 자성 용액(140)의 자성을 이용하여 수집 챔버로부터 용출 용액(130)을 회수하는 과정을 거치게 되는데, 이에 대한 상세한 설명은 도 5 및 도 6을 참조하여 본 발명에 따른 타겟 물질(TS)을 추출하기 위한 추출 방법을 통해 설명한다.
먼저, 도 3에 도시된 바와 같이, 내부에 다공막(120)이 설치된 추출 키트(110)를 준비한다. 그리고, 추출 키트(110)의 다공막(120)에 타겟 물질(TS)이 바인딩된다. 도 5를 참조하여 보다 구체적으로 설명하면, 내부에 다공막(120)이 설치된 추출 키트(110)에 타겟 물질(TS)을 포함하는 포함된 샘플 용액을 주입한다(S40).
그런 다음, 샘플 용액의 유동을 위한 유동력이 추출 키트(110)에 인가되면, 샘플 용액이 다공막(120)을 통과하면서 샘플 용액 내의 타겟 물질(TS)이 다공막(120)에 바인딩된다(S41). 그런 다음, 추출 키트(110) 내부에 세척 용액을 주입하고(S42), 유동력이 인가되면 세척 용액이 다공막(120)을 통과하면서 다공막(120) 내부를 세척하게 된다(S43). 그리고, 세척 단계의 완료 후 건조 과정을 거치게 되면, 다공막(120) 내부에 타겟 물질(TS) 만의 바인딩이 완료된다.
그런 다음, 추출 키트(110)에 용출 용액(130)과 자성 용액(140)을 주입한다(S45,S46). 도 5에서는 용출 용액(130) 주입 후에 자성 용액(140)을 주입하는 것을 예로 하여 나타내고 있으나, 용출 용액(130)이 극성의 증류수이고, 자성 용액(140)이 비극성의 오일인 경우에는 그 주입 순서와 무관하게, 도 3에 도시된 바와 같이, 다공막(120) 위에 용출 용액(130)과 자성 용액(140)이 순차적으로 적층된다.
용출 용액(130)과 자성 용액(140)의 주입이 완료된 후, 추출 키트(110)에 유동력을 인가하게 되면(S47), 상술한 바와 같이, 용출 용액(130)이 먼저 다공막(120)을 통과하고, 잔존하는 타겟 물질(TS)을 용출 용액(130)과 함께 자성 용액(140)이 다공막(120) 외부로 밀어내어 잔존하는 타겟 물질(TS)이 용출 용액(130)과 함께 완전하게 추출이 가능하게 된다. 여기서, 추출 키트(110)에 유동력을 인가하는 방법은 상술한 바와 같은 바, 그 상세한 설명은 생략한다.
그리고, 자성 용액(140)의 일부 또는 전부가 다공막(120)을 통과하면, 용출 용액(130)과 자성 용액(140)은 도 6의 (a)에 도시된 바와 같이, 수집 챔버(200)에 수집된다(S48). 이 때, 수집 챔버(200) 내에서는 상호 상이한 극성에 따라 용출 용액(130)과 자성 용액(140)이, 도 6의 (a)에 도시된 바와 같이, 적층된 상태로 수집된다.
도 6의 (a)에 도시된 바와 같은 상태에서, 파이펫 팁(170)을 이용하여 하부의 용출 용액(130)을 회수하는 경우, 회수하는 과정에서 자성 용액(140)의 일부가 함께 회수되어 순도를 저하시킬 수 있고, 순도 향상을 위해 자성 용액(140)이 회수되기 전에 회수를 멈추게 되면 타겟 물질(TS)의 회수 효율이 저하되는 문제가 있다.
이에, 본 발명에서는 도 6의 (b)에 도시된 바와 같이, 수집 챔버(200)의 외부에서 자력 인가부(160)가 자력을 인가하여(S49) 자성 용액(140)을 용출 용액(130)으로부터 물리적으로 분리시킨 상태에서 용출 용액(130)을 회수하게 된다(S50). 본 발명에서는 자력 인가부(160)가 영구 자석 형태를 갖는 것을 예로 하고 있으나, 전자석을 이용하는 것도 가능하다.
그리고, 도 6의 (b)에서는 자력 인가부(160)가 자성 용액(140)이 수집 챔버(200)의 측면으로 뭉치도록 수집 챔버(200)의 측면으로 자력을 인가하는 것을 예로 하며, 이를 통해 도 6의 (c)에 도시된 바와 같이, 파이펫 팁(170)이 자성 용액(140)을 거치지 않고 바로 용출 용액(130)에 담긴 상태로, 도 6의 (d)에 도시된 바와 같이, 용출 용액(130)의 회수가 가능하게 된다. 그리고, 용출 용액(130)이 회수된 후, 용출 용액(130)으로부터 타겟 물질(TS)을 추출하게 된다.
전술한 실시예에서는 용출 용액(130)과 자성 용액(140)이 추출 키트(110) 내에 주입되고 용출 용액(130)과 자성 용액(140)이 섞이지 않은 상태에서 다공막(120) 위에 적층된 상태로 유동력이 인가되는 것을 예로 하고 있다. 이외에도, 용출 용액(130)과 자성 용액(140)의 추출 키트(110) 내에서의 적층 과정 없이, 용출 용액(130)을 먼저 추출 키트(110) 내로 유동시켜 다공막(120)을 통과시키고 용출 용액(130)을 먼저 수집 챔버(200)로 수집한 후, 동일한 방법으로 자성 용액(140)을 다공막(120)을 통과시켜 수집 챔버(200)로 수집되도록 마련될 수 있음은 물론이다.
이하에서는 도 7 내지 도 14를 참조하여 본 발명에 따른 타겟 물질을 추출하기 위한 유체 유동 칩(300)에 대해 상세히 설명한다. 본 발명에 따른 유체 유동 칩(300)은 상술한 추출 장치가 칩 형태로 구현된 예로서, 추출 키트(110)가 유체 유동 칩(300) 내에 추출 챔버(350)로 구현된 것을 예로 한다. 또한, 전술한 실시예에서의 유동력 인가부(150)는 도 11 내지 도 14에 도시된 음압 펌프(151) 및 압력 게이지(152)로 구성되는 것을 예로 하여 설명하며, 다공막(120)의 참조번호는 동일하게 사용한다.
도 7 내지 도 10을 참조하여 설명하면, 본 발명에 따른 유체 유동 칩(300)은 칩 본체(310), 샘플 챔버(321), 용출 챔버(323), 자성 챔버(324), 추출 챔버(350), 다공막(120), 챔버 선택 밸브(330) 및 수집 챔버(325)를 포함한다.
칩 본체(310)는 투명 또는 반투명한 플라스틱 재질로 마련되는 것을 예로 하는데, 본 발명에서는 도 8에 도시된 바와 같이, 하부 본체(311) 및 상부 커버(312)를 포함하는 것을 예로 한다. 하부 본체(311)에는 샘플 챔버(321), 용출 챔버(323), 자성 챔버(324), 추출 챔버(350) 및 수집 챔버(325)가 형성되고, 이러한 챔버들을 연결하기 위한 유동 채널(371)들이 형성된다.
상부 커버(312)는 하부 본체(311)의 상부에 결합되는데, 상술한 챔버들의 전체 또는 일부분을 차단하며, 각 챔버를 개폐하기 위한 마개가 결합되는 구조를 가지며, 챔버 선택 밸브(330) 및 후술할 배출 선택 밸브(340)가 상부 커버(312)를 통해 하부 본체(311)에 결합된다.
샘플 챔버(321)는 칩 본체(310)의 하부 본체(311) 내부에 형성되며, 타겟 물질이 포함된 샘플 용액이 저장된다. 그리고, 용출 챔버(323) 및 자성 챔버(324)는 마찬가지로 칩 본체(310)의 하부 본체(311) 내부에 형성되어 각각 용출 용액 및 자성 용액이 저장된다. 여기서, 용출 용액과 자성 용액은 상술한 추출 장치(100)에 대응하는 바, 그 상세한 설명은 생략한다.
추출 챔버(350)는 칩 본체(310)의 하부 챔버 내부에 형성되는데, 상술한 추출 장치(100)의 추출 키트(110)에 대응한다. 즉, 추출 챔버(350) 내부에는, 도 7 및 도 10에 도시된 바와 같이, 타겟 물질이 바인딩되는 다공막(120)이 설치된다. 그리고, 수집 챔버(325)는 칩 본체(310)의 하부 본체(311) 내부에 형성되는데, 추출 챔버(350)의 배출구(352)(미도시)와 연결된다.
한편, 챔버 선택 밸브(330)는 칩 본체(310)에 설치되는데, 샘플 챔버(321), 용출 챔버(323) 및 자성 챔버(324) 중 어느 하나를 추출 챔버(350)의 유입구(351)와 선택적으로 연결시킨다. 본 발명에서는 챔버 선택 밸브(330)가, 도 8에 도시된 바와 같이, 상부 커버(312)를 통해 하부 본체(311)에 결합되는 것을 예로 한다.
도 8 및 도 9의 (b)를 참조하여 설명하면, 하부 본체(311)에는 샘플 챔버(321), 용출 챔버(323) 및 자성 챔버(324)를 각각 추출 챔버(350)의 유입구(351)와 연결시키기 위한 유동 채널(371)이 형성된다. 이 때, 유동 채널(371)의 말단은, 도 9의 (b)에 도시된 바와 같이, 하부 본체(311)의 상부 표면으로 개방된 상태를 가지며, 마찬가지로, 추출 챔버(350)의 유입구(351) 또한 하부 본체(311)의 상부로 개방된 상태가 된다. 이 때, 챔버 선택 밸브(330)는 상부 커버(312)를 통해 하부 본체(311)의 상부 표면에 결합되어 샘플 챔버(321), 용출 챔버(323) 및 자성 챔버(324)에 각각 연결된 유동 채널(371)의 말단 중 어느 하나를 선택적으로 추출 챔버(350)의 유입구(351)와 연결시키게 된다.
본 발명에서는 챔버 선택 밸브(330)가, 도 8에 도시된 바와 같이, 실리콘 재질의 개스킷(311), 챔버 스위칭 밸브(332), 그리고 이들을 고정하는 제1 고정 지그(333)를 포함하는 것을 예로 한다. 여기서, 개스킷(311)에는 각 유동 채널(371)의 말단과 추출 챔버(350)의 유입구(351)와 연통되는 연통홀들이 형성되며, 챔버 스위칭 밸브(332)의 회전에 따라 추출 챔버(350)의 유입구(351)와 각 유동 채널(371) 중 어느 하나가 연통되는 구조를 갖게 된다.
한편, 본 발명에 따른 유체 유동 칩(300)은 적어도 하나의 세척 챔버(322a,322b,322c), 폐용액 챔버(326) 및 배출 선택 밸브(340)를 포함할 수 있다. 세척 챔버(322a,322b,322c)는 하부 본체(311)에 형성되어 세척 용액이 수용되는데, 본 발명에서는 3개의 세척 챔버(322a,322b,322c)가 형성되는 것을 예로 한다. 그리고, 각각의 세척 챔버(322a,322b,322c)에는 에탄올의 농도가 상이한 세척 용액이 각각 수용되는데, 3개의 세척 챔버(322a,322b,322c)에서 에탄올의 농도가 낮은 세척 용액의 순으로 순차적으로 다공막(120)을 세척하도록 마련되는 것을 예로 한다.
폐용액 챔버(326)는 하부 본체(311)에 형성되어 추출 챔버(350)를 통과한, 샘플 용액 및 세척 용액과 같은 폐용액이 저장된다. 여기서, 배출 선택 밸브(340)는 상부 커버(312)를 통해 하부 본체(311)에 결합되는데, 추출 챔버(350)의 배출구(352)를 수집 챔버(325)와 폐용액 챔버(326) 중 어느 하나와 선택적으로 연결시킨다. 도 8에 도시된 바와 같이, 배출 선택 밸브(340)는 배출 스위칭 밸브(342)와 제2 고정 지그(343)로 구성되는 것을 예로 한다.
또한, 칩 본체(310)에는 수집 챔버(325) 및 폐용액 챔버(326)와 연결되는 음압 유입구(360)가 형성된다. 음압 유입부에는 음압 펌프(151)가 연결되어 유체의 유동을 위한 음압을 인가하게 된다. 즉, 음압 유입구(360)는 배출 선택 밸브(340)의 선택에 따라 수집 챔버(325) 또는 폐용액 챔버(326)를 통해 수집 챔버(325)의 배출구(352)로 유체의 유동을 위한 음압이 인가되는데, 이에 대한 상세한 설명은 후술한다.
상기와 같은 구성에 따라, 본 발명에 따른 유체 유동 칩(300)을 이용하여 타겟 물질을 추출하는 과정을, 도 11 내지 14를 참조하여 상세히 설명한다.
먼저, 도 11에 도시된 바와 같이, 챔버 선택 밸브(330)가 추출 챔버(350)를 샘플 챔버(321)에 연결시킨 상태에서, 샘플 챔버(321)에 수용된 샘플 용액이 추출 챔버(350)에 주입되는 바인딩 단계가 수행된다.
바인딩 단계에서, 배출 선택 밸브(340)는, 도 11에 도시된 바와 같이, 추출 챔버(350)의 배출구(352) 측과 폐용액 챔버(326)를 통해 음압 펌프(151)가 연결되도록 스위칭된다. 이를 통해, 추출 챔버(350)의 배출구(352) 측으로 인가되는 음압에 의해 샘플 챔버(321) 내의 샘플 용액이 챔버 선택 밸브(330)를 통해 추출 챔버(350) 내부로 바인딩된다. 여기서, 도 11 내지 도 14에서 굵은색으로 표시된 라인이 배출 선택 밸브(340) 및 챔버 선택 밸브(330)에 의해 연결되는 라인을 나타내고 있다.
그런 다음, 도 12에 도시된 바와 같이, 챔버 선택 밸브(330)가 추출 챔버(350)를 세척 챔버(322a,322b,322c)에 연결시킨 상태에서, 세척 챔버(322a,322b,322c)에 수용된 세척 용액이 추출 챔버(350)에 주입되는 세척 단계가 수행된다.
세척 단계에서, 배출 선택 밸브(340)는, 도 12에 도시된 바와 같이, 추출 챔버(350)의 배출구(352) 측과 폐용액 챔버(326)를 통해 음압 펌프(151)가 연결되도록 스위칭된다. 이를 통해, 추출 챔버(350)의 배출구(352) 측으로 인가되는 음압에 의해 세척 챔버(322a,322b,322c) 내의 세척 용액이 챔버 선택 밸브(330)를 통해 추출 챔버(350) 내부로 주입된 후, 다공막(120)을 통과하면서 세척 과정을 거치게 되고, 다공막(120)을 통과한 세척 용액은 배출구(352), 배출 선택 밸브(340)를 거쳐 폐용액 챔버(326)로 배출된다.
도 11 내지 도 14에서는 하나의 세척 챔버(322a,322b,322c)가 적용된 예를 나타내고 있으나, 상술한 바와 같이, 3개의 세척 챔버(322a,322b,322c)로부터 3가지의 세척 용액이 순차적으로 유동하여 다공막(120)을 세척하도록 마련될 수 있음은 물론이다.
그리고, 상술한 바와 같이 세척 단계의 수행 후, 건조 단계가 진행될 수 있으며, 건조 단계의 완료 후, 챔버 선택 밸브(330)가 추출 챔버(350)와 용출 챔버(323)가 연결되도록 스위칭되어 용출 챔버(323) 내의 용출 용액이 추출 챔버(350) 내부로 유입된다.
이 때, 도 13에 도시된 바와 같이, 배출 선택 밸브(340)는 추출 챔버(350)의 배출구(352) 측과 수집 챔버(325)를 통해 음압 펌프(151)가 연결되도록 스위칭된다. 이를 통해, 추출 챔버(350)의 배출구(352) 측으로 인가되는 음압에 의해 용출 챔버(323) 내의 용출 용액이 챔버 선택 밸브(330)를 통해 추출 챔버(350) 내부로 주입되어 다공막(120)을 통과한 후, 수집 챔버(325)로 수집된다.
그런 다음, 챔버 선택 밸브(330)가, 도 14에 도시된 바와 같이, 추출 챔버(350)와 자성 챔버(324)가 연결되도록 스위칭되어 자성 챔버(324) 내의 자성 용액이 추출 챔버(350) 내부로 주입되어 다공막(120)을 통과하면서 잔존하는 용출 용액을 밀어내어 용출 용액과 함께 수집 챔버(325)로 수집된다.
이 때, 도 14에 도시된 바와 같이, 배출 선택 밸브(340)는 추출 챔버(350)의 배출구(352) 측과 수집 챔버(325)를 통해 음압 펌프(151)가 연결되도록 스위칭되어 된다. 이를 통해, 추출 챔버(350)의 배출구(352) 측으로 인가되는 음압에 의해 자성 챔버(324) 내의 자성 용액이 챔버 선택 밸브(330)를 통해 추출 챔버(350)로 유동하고, 다공막(120)을 통과한 후 수집 챔버(325)로 수집된다.
그런 다음, 도 6에 도시된 바와 같이, 수집 챔버(325)의 외부에서 자력을 인가하여 자성 용액을 용출 용액으로부터 물리적으로 분리시킨 후, 용출 용액을 회수하는 과정을 거침으로써, 용출 용액으로부터 타겟 물질의 추출이 가능하게 된다.
도 15는 본 발명에 따른 유체 유동 칩을 이용한 실험 결과를 설명하기 위한 도면이다. 도 15를 참조하여 설명하면, 실험에는 cfDNA standard 샘플을 사용하여 매우 적은 비율이 돌연변이 유전자 추출이 가능한지 여부를 실험하였다. 비교 실험을 위해 상용화된 원심분리방법인 QIA amp가 사용되었다. 그리고, 실험에 사용된 cfDNA standard 샘플은 Horizon 제품이 사용되었다. 샘플 용량은 500㎕이고, 총 4개의 샘플 세트(0%, 0.1%, 1%, 5%)에서 PIK3CA E545K, EGFR L858R, KRAS G12D, NRAS Q61K의 ctDNA를 추출하는 실험이 진행되었다. 도 15에서 PIBEX가 본 발명에 따른 유체 유동 칩의 실험 결과이다.
도 15에 도시된 바와 같이, ctDNA 추출량이 기존의 원심 분리 방법이 적용된 QIA amp와 거의 동일함을 확인할 수 있으며, 돌연변이가 0.1%~6%의 매우 적은 비율임에도 불구하고 ctDNA 추출이 가능함을 확인하였다.
도 16은 본 발명에 따른 유체 유동 칩을 활용하여 실제 임상에서 환자의 혈액 분석을 통해 돌연변이 유전자를 모니터링하는 실험 결과를 나타낸 도면이다. HER-2 타입의 유방암 환저의 혈장 500㎕를 활용하여 PIK3CA H1047R 돌연변이를 모니터링하였다.
간으로의 암 전이가 진행됨에 따라, 도 16의 (b)에 도시된 바와 같이, 혈액 속의 돌연변이 유전자가 증가되는 것을 확인할 수 있다. 간으로의 전이된 종양은 도 16의 (a)에 도시된 바와 같이 MRI 이미지를 통해 확인할 수 있다.
비록 본 발명의 몇몇 실시예들이 도시되고 설명되었지만, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 당업자라면 본 발명의 원칙이나 정신에서 벗어나지 않으면서 본 실시예를 변형할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 발명의 범위는 첨부된 청구항과 그 균등물에 의해 정해질 것이다.
[부호의 설명]
100 : 추출 장치 110 : 추출 키트
111 : 유입구 112 : 배출구
120 : 다공막 130 : 용출 용액
140 : 자성 용액 150 : 유동력 인가부
151 : 음압 펌프 152 : 압력 게이지
300 : 유체 유동 칩 310 : 칩 본체
311 : 하부 본체 312 : 상부 커버
321 : 샘플 챔버 322a,322b,322c : 세척 챔버
323 : 용출 챔버 324 : 자성 챔버
325 : 수집 챔버 326 : 폐용액 챔버
330 : 챔버 선택 밸브 331 : 개스킷
332 : 챔버 스위칭 밸브 333 : 제1 고정 지그
340 : 배출 선택 밸브 342 : 배출 스위칭 밸브
343 : 제2 고정 지그 350 : 추출 챔버
351 : 유입구 352 : 배출구
360 : 음압 유입구 371 : 유동 채널
본 발명에 따른 방법은 원심 분리 방식을 이용하지 않거나 고속의 원심 분리를 적용하지 않으면서도 핵산과 같은 타겟 물질을 추출할 수 있는바, 핵산과 같은 타겟 물질이 활용되는 다양한 산업분야에서 유용하게 활용될 수 있다.

Claims (20)

  1. 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치에 있어서,
    추출 키트와,
    상기 추출 키트의 내부에 설치되어 상기 타겟 물질이 바인딩되는 다공막과,
    상기 추출 키트 내에서 상기 다공막을 통과하면서 상기 다공막으로부터 상기 타겟 물질을 용출하는 용출 용액과,
    자성을 가지며, 상기 용출 용액과 상이한 극성을 가져 상기 용출 용액과 섞이지 않은 자성 용액과,
    상기 다공막을 순차적으로 통과하는 상기 용출 용액 및 상기 자성 용역이 적층된 상태로 수집되는 수집 챔버와,
    상기 수집 챔버로 자력을 인가하기 위한 자력 인가부를 포함하고;
    상기 자성 용액이 상기 다공막을 통과할 때 상기 용출 용액과의 상이한 극성에 의해 상기 다공막에 잔존하는 상기 용출 용액을 밀어내며;
    상기 수집 챔버 내의 상기 자성 용액이 상기 자력 인가부의 자력에 의해 상기 용출 용액으로부터 물리적으로 분리된 상태에서, 상기 수집 챔버 내의 상기 용출 용액이 회수 가능한 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 자력 인가부는 상기 자성 용액이 상기 수집 챔버 내부의 벽면으로 뭉쳐 하부의 상기 용출 용액이 상부로 노출되도록 상기 수집 챔버의 측면으로 자력을 인가하는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 용출 용액은 극성 용액이고, 상기 자성 용액은 무극성 용액인 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 타겟 물질이 핵산인 경우, 상기 용출 용액은 극성의 증류수 또는 핵산 추출용 용출 버퍼를 포함하고, 상기 자성 용액은 자성 입자가 분산된 무극성의 미네랄 오일 또는 실리콘 오일을 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 용출 용액과 상기 자성 용액이 상기 다공막을 통과하기 위한 유동력을 상기 추출 키트에 인가하는 유동력 인가부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 추출 키트는
    상기 용출 용액과 상기 자성 용액이 상기 추출 키트에 주입되는 유입구와,
    상기 다공막을 통과한 상기 용출 용액이 배출되는 배출구를 포함하며;
    상기 유동력 인가부는 상기 유입구를 통해 상기 추출 키트 내부로 양압을 인가하거나 상기 배출구를 통해 상기 추출 키트 내부로 음압을 제공하는 압력 펌프를 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치.
  7. 추출 장치가 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 방법에 있어서,
    내부에 다공막이 설치된 추출 키트를 마련하는 단계와,
    상기 다공막에 상기 타겟 물질이 바인딩되는 단계와,
    상기 타겟 물질의 용출을 위한 용출 용액이 상기 다공막을 통과하면서 상기 타켓 물질을 용출하는 단계와,
    자성을 가지며 상기 용출 용액과 상이한 극성을 갖는 자성 용액이 상기 다공막을 통과하면서 상기 다공막에 잔존하는 상기 용출 용액을 밀어내는 단계와,
    상기 다공막을 순차적으로 통과한 상기 용출 용액과 상기 자성 용액이 수집 챔버에 수집되고, 상기 수집 챔버 내에서 상기 용출 용액과 상기 자성 용액은 상이한 극성에 따라 적층되는 단계와,
    상기 수집 챔버로부터 상기 용출 용액을 회수하는 단계를 포함하며;
    상기 용출 용액을 회수할 때, 상기 수집 챔버의 외부로부터 자력을 인가하여 상기 자성 용액이 상기 용출 용액으로부터 물리적으로 분리된 상태에서, 상기 수집 챔버 내의 상기 용출 용액이 회수되는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 용출 용액을 회수할 때,
    상기 수집 챔버의 측면으로 자력이 인가되어 상기 자성 용액이 상기 수집 챔버 내부의 벽면에 뭉쳐 상기 용출 용액이 상부로 노출되고;
    상기 수집 챔버의 내부에서 상부로 노출된 상기 용출 용액을 회수하는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 용출 용액은 극성 용액이고, 상기 자성 용액은 무극성 용액인 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 타겟 물질이 핵산인 경우, 상기 용출 용액은 극성의 증류수 또는 핵산 추출용 용출 버퍼를 포함하고, 상기 자성 용액은 자성 입자가 분산된 무극성의 미네랄 오일 또는 실리콘 오일을 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 방법.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 추출 키트는 상기 용출 용액과 상기 자성 용액이 상기 추출 키트에 주입되는 유입구와, 상기 다공막을 통과한 상기 용출 용액이 배출되는 배출구를 포함하며;
    상기 용출 용액과 상기 자성 용액을 유동시키기 위한 유동력은 상기 유입구를 통해 상기 추출 키트 내부로 양압으로 인가되거나, 상기 배출구를 통해 상기 추출 키트 내부로 음압으로 인가되는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 방법.
  12. 타겟 물질을 추출하기 위한 유체 유동 칩에 있어서,
    칩 본체와,
    상기 칩 본체 내부에 형성되어 상기 타겟 물질이 포함된 샘플 용액이 저장되는 샘플 챔버와,
    상기 칩 본체 내부에 형성되어 상기 타겟 물질의 용출을 위한 용출 용액이 저장되는 용출 챔버와,
    상기 칩 본체 내부에 형성되어 자성을 가지며 상기 용출 용액과 상이한 극성을 가져 상기 용출 용액과 섞이지 않는 자성 용액이 저장된 자성 챔버와,
    상기 칩 본체 내부에 형성되는 추출 챔버와,
    상기 추출 챔버의 내부에 설치되어 상기 타겟 물질이 바인딩되는 다공막과,
    상기 칩 본체에 설치되어, 상기 샘플 챔버, 상기 용출 챔버 및 상기 자성 챔버 중 어느 하나를 상기 추출 챔버의 유입구와 선택적으로 연결하는 챔버 선택 밸브와,
    상기 칩 본체 내부에 형성되고, 상기 추출 챔버의 배출구와 연결되는 수집 챔버를 포함하고;
    상기 챔버 선택 밸브가 상기 추출 챔버를 상기 용출 용기와 상기 자성 용기에 순차적으로 연결시켜 외부로부터의 유동력에 의해 상기 용출 챔버 및 상기 자성 챔버 내의 상기 용출 용액 및 상기 자성 용액이 유동하여 상기 추출 챔버의 상기 유입구를 통해 상기 다공막을 유입되어 상기 다공막을 순차적으로 통과하고, 상기 자성 용액이 상기 다공막을 통과할 때 상기 다공막에 잔존하는 상기 용출 용액을 밀어내어 상기 배출구를 통해 상기 수집 챔버로 수집되되, 상기 수집 챔버 내에서 상기 용출 용액과 상기 자성 용액이 상이한 극성에 따라 적층되며;
    외부로부터의 상기 수집 챔버로 자력이 인가되어 상기 자성 용액이 상기 용출 용액으로부터 물리적으로 분리된 상태에서 상기 수집 챔버 내의 상기 용출 용액이 회수되는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 유체 유동 칩.
  13. 제12항에 있어서,
    외부로부터 상기 수집 챔버로 인가되는 자력은 상기 자성 용액이 상기 수집 챔버 내부의 벽면으로 뭉쳐 하부의 상기 용출 용액이 상부로 노출되도록 상기 수집 챔버의 측면으로 인가되는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 유체 유동 칩.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 칩 본체는
    상기 샘플 챔버, 상기 용출 챔버, 상기 자성 챔버, 상기 추출 챔버 및 상기 수집 챔버가 형성되는 하부 본체와,
    상기 하부 본체의 상부에 결합되는 상부 커버를 포함하고;
    상기 하부 본체에는 상기 샘플 챔버, 상기 용출 챔버 및 상기 자성 챔버를 상기 추출 챔버의 유입구와 연결하기 위한 유동 채널이 형성되고;
    상기 유동 채널의 말단과 상기 추출 챔버의 상기 유입구는 상기 칩 본체의 상부로 개방되고, 상기 상부 커버를 통해 하부 본체에 결합되는 상기 챔버 선택 밸브가 상기 샘플 챔버, 상기 용출 챔버 및 상기 자성 챔버에 각각 연결된 상기 유동 채널의 말단 중 어느 하나를 선택적으로 상기 추출 챔버의 상기 유입구와 연결시키는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 유체 유동 칩.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 하부 본체에 형성되어 세척 용액이 수용되는 적어도 하나의 세척 챔버와,
    상기 하부 본체에 형성되어 상기 추출 챔버를 통과한 상기 샘플 용액과 상기 세척 용액을 저장하는 폐용액 챔버와,
    상기 상부 커버를 통해 상기 하부 본체에 결합되고, 상기 추출 챔버의 상기 배출구를 상기 수집 챔버와 상기 폐용액 챔버 중 어느 하나와 선택적으로 연결하는 배출 선택 밸브를 더 포함하며;
    상기 세척 챔버 내의 상기 세척 용액은 상기 샘플 용액의 상기 추출 챔버를 통과하면서 상기 샘플 용액 내의 상기 타겟 물질이 상기 다공막에 바인딩된 후 상기 다공막을 세척하는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 유체 유동 칩.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 칩 본체는 상기 수집 챔버 및 상기 폐용액 챔버와 연결되고, 유체의 유동을 위한 외부로부터의 음압이 유입되는 음압 유입구를 더 포함하며;
    상기 음압 유입구는 상기 배출 선택 밸브의 선택에 따라 상기 수집 챔버 또는 폐용액 챔버를 통해 상기 수집 챔버의 상기 배출구로 유동을 위한 음압을 인가하는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 유체 유동 칩.
  17. 제12항에 있어서,
    상기 용출 용액은 극성 용액이고, 상기 자성 용액은 무극성 용액인 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 유체 유동 칩.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 타겟 물질이 핵산인 경우, 상기 용출 용액은 극성의 증류수 또는 핵산 추출용 용출 버퍼를 포함하고, 상기 자성 용액은 자성 입자가 분산된 무극성의 미네랄 오일 또는 실리콘 오일을 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기
  19. 제12항에 있어서,
    상기 타겟 물질이 핵산인 경우, 상기 다공막은 실리카 막, 이온 교환수지, 실리카 메쉬, 실리카 비드가 패킹된 패킹 튜브, 상기 타겟 물질과 특이적 결합이 가능한 작용기가 표면에 형성된 막 중 어느 하나를 포함하며;
    상기 타겟 물질이 CTC(Circulating Tumor Cell)를 포함하는 세포, 엑소좀(Exosome)를 포함하는 세포외 소포체(Extracellular vesicles), 단백질 중 어느 하나를 포함하는 경우, 상기 다공막은 이온 교환수지, 상기 타겟 물질과 특이적 결합이 가능한 작용기가 표면에 형성된 막 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 유체 유동 칩.
  20. 제12항에 있어서,
    상기 타겟 물질은 DNA 및 RNA를 포함하는 핵산, CTC(Circulating Tumor Cell)를 포함하는 세포, 엑소좀(Exosome)를 포함하는 세포외 소포체(Extracellular vesicles), 단백질 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 유체 유동 칩.
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