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WO2020148453A1 - Eau électrolysée, procédé d'obtention et utilisations d'une telle eau pour le traitement de désordres liés à la sénescence cellulaire - Google Patents

Eau électrolysée, procédé d'obtention et utilisations d'une telle eau pour le traitement de désordres liés à la sénescence cellulaire Download PDF

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WO2020148453A1
WO2020148453A1 PCT/EP2020/051200 EP2020051200W WO2020148453A1 WO 2020148453 A1 WO2020148453 A1 WO 2020148453A1 EP 2020051200 W EP2020051200 W EP 2020051200W WO 2020148453 A1 WO2020148453 A1 WO 2020148453A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
water
electrolysis
atoms
cells
treatment
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/EP2020/051200
Other languages
English (en)
Inventor
Laurent Pupunat
Anthony Ginter
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
WATERDIAM FRANCE Sas
Original Assignee
WATERDIAM FRANCE Sas
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by WATERDIAM FRANCE Sas filed Critical WATERDIAM FRANCE Sas
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Priority to US17/424,458 priority patent/US20220079977A1/en
Priority to JP2021540897A priority patent/JP2022518218A/ja
Priority to EP20700530.7A priority patent/EP3911608A1/fr
Priority to CN202080009645.5A priority patent/CN113365951A/zh
Priority to AU2020208932A priority patent/AU2020208932A1/en
Priority to EA202191697A priority patent/EA202191697A1/ru
Publication of WO2020148453A1 publication Critical patent/WO2020148453A1/fr
Priority to IL284828A priority patent/IL284828A/en
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Definitions

  • the subject of the invention is the field of the treatment of diseases or disorders linked to cellular senescence, in particular the treatment of cancer or of neurodegenerative diseases.
  • the invention relates more particularly to a process for obtaining an electrolyzed water useful for the treatment of diseases or disorders linked to cell senescence.
  • the invention also relates to the water obtained by this process, its use for the treatment of diseases or disorders linked to cellular senescence by direct application or in the form of compositions, and a suitable device for treating said conditions.
  • the invention also relates to a method of selecting non-senescent cells useful in transplant applications
  • Cellular senescence is generally understood as a definitive arrest of the cell cycle resulting from various causes.
  • the cell cycle arrest mechanism induced by cell senescence is complex and involves interactions between telomere shortening, cell inflammation and stress.
  • Application WO2018215795 will also be cited, which relates to an agent intended to be used for selectively killing one or more senescent cells, said agent being chosen from the following elements: a cardiac glycoside or aglycone, a focal adhesion kinase inhibitor (F AK), an HMG-CoA reductase inhibitor, JF D00244, cyclosporine, tyrphostine AG879, cantharidin, diphenyleneiodonium chloride, rottlerin, 2,3-dimethoxy-1, 4-naphthoquinone, LY-367,265, rotenone, idarubicin, dequalintum chloride, vincristine, nitazoxanide, nitrofurazone, temsirolimus, eltrombopag, adapalene, azacyclonol, enoxacin and raltegravir, and their salts pharmaceutically acceptable.
  • F AK
  • Application US2018256568 will also be cited which relates to a method of treating a disease or a disorder in a target tissue in a subject, in which the symptoms of the disease or of the disorder are caused at least in part. by senescent cells located in or around the target tissue, wherein the target tissue is cancer free, and wherein the senescent cells are defined as cells expressing the p16 protein.
  • the method comprises the administration in or around the target tissue of a series of treatments with a pharmaceutical composition which comprises a senolitic agent which contacts the senescent cells located in or around the target tissue and selectively removes these cells. senescent without affecting, if possible, adjacent non-senescent cells.
  • a pharmaceutical composition which comprises a senolitic agent which contacts the senescent cells located in or around the target tissue and selectively removes these cells. senescent without affecting, if possible, adjacent non-senescent cells.
  • the application describes a whole series of chemical molecules making it possible to treat senescent cells.
  • one of the objects of the invention is the envisaged use of electrolyzed water according to the invention in the treatment of diseases linked to cell senescence, such as in particular cancers or neurodegenerative diseases.
  • the electrolyzed water according to the invention is obtained by the implementation of a three-step process which begins with the use of running or spring water optionally added with a sulphate salt, carbonates or any other compatible salt known to those skilled in the art at a concentration of 0.5 to 2 g / L followed by electrolysis of said water by an electrolysis module comprising at least one boron-doped diamond electrode fixed on a silicon substrate in wherein the boron concentration is between 200 (B 3x10 19 atoms / cm 3) and 2000 ppm (B 3,52x1 ° atoms / cm 3 B), in particular between 200 ppm (B 3x1019 atoms / cm3) and 1500 ppm (2x1020 B atoms / cm3), the said module subjecting the water to a quantity of current during the electrolysis process of less than 500 mAh / L of water, more preferably between 40 and 250 mAh / L of water, even more preferably between 50 and 200 mAh / L, the duration of the electrolysis
  • the electrolysis can be done all at once, continuously, or even cyclically with a number of cycles between 2 and 12 cycles over a period of 24 hours, two consecutive cycles being spaced at least 30 minutes.
  • a subject of the invention is also electrolyzed water obtained by the method described above.
  • a subject of the invention is also a method for increasing the senolitic character of senescent biological cells present in a cellular medium, characterized in that it consists in introducing into the cell medium an electrolyzed water obtained according to the method described above. .
  • This process consists in particular in increasing at least the beta-galactosidase (SA- -Gal) activity associated with senescence by contacting of said cells with the electrolyzed water thus obtained.
  • SA- -Gal beta-galactosidase
  • the inventors have in fact discovered that the electrolyzed water obtained according to the invention had the singular property of significantly increasing this beta-galactosidase (SA- -Gal) activity when senescent cells such as present in particular in fibroblasts were introduced. in contact with said water.
  • the percentage of water contained in the cell medium is strictly greater than 0, and preferably greater than 5%, more preferably still greater than 25%.
  • the senescent cells are maintained in the cell medium in contact with water for a period of more than 1 min.
  • Such an increase in the senolitic character of senescent cells has the major advantage of allowing an induced selection of healthy cells relative to senescent cells by acceleration of the natural process of senescence in a cellular medium or biological tissue, and therefore the accelerated disappearance. said cells for the benefit of healthy cells. This opens up exceptional possibilities for using the water of the invention for prophylactic purposes, to aid in therapeutic treatment, or even for direct therapeutic treatment.
  • a subject of the invention is also a composition comprising an electrolyzed water obtained according to the method described above for use as a medicament in the treatment of disorders linked to senescence.
  • the disorders targeted by the inventive use include diseases linked to senescence and in particular certain cancers or neurodegenerative diseases.
  • composition comprising electrolyzed water according to the invention consists of 95 to 100% electrolyzed water and 0 to 5% of an excipient and / or an emulsifier.
  • composition according to the invention can be in the form of a cream, a gel, a dressing or else a patch. Furthermore, when the composition according to the invention can be exclusively composed of electrolyzed water, the latter can be added to a device containing it such as a reservoir or an infusion bag containing pure electrolyzed water or in the form of liquid composition.
  • Electrolyzed water is obtained by means of an electrolysis module allowing the implementation of the method described above, said module being able to be present in a fixed or mobile manner in a device such as a tank, said tank being able to be used to fill infusion bags on a production line for example.
  • a conventional water distribution circuit preferably at the distribution outlet like a tap, if one considers wanting to prepare a drink from electrolyzed water, the latter then being able to be consumed for the purpose of treating disorders linked to cellular senescence by the oral route.
  • a subject of the invention is also a method for selecting non-senescent cells in a cell extract or a biological tissue comprising several cells by bringing them into contact with an electrolyzed water obtained by carrying out the method according to invention for a period of 1 to 30 minutes.
  • obtaining a cell extract or a healthy tissue free in whole or in large part from senescent cells may find its interest in the use for the treatment of grafts, in particular of skin or liver.
  • FIG.1 shows the efficiency of electrolyzed water according to the invention named WDW on chondrosarcoma-type tumor cell lines in comparison with unelectrolyzed ultra-pure MQW water.
  • FIG.2 shows the superiority of the electrolyzed water obtained according to the process of the invention, on the modification of the SA- -Gal activity, the increase of which is witness to the presence of senescent cells.
  • senescence is a complex process which causes a slow degradation of the functions of the cell at the origin of the aging of organisms. This is a complex biological mechanism, involving the degradation of many genes, especially in senescent cells. Usually the telomeric part of the chromosomes is affected.
  • telomere is a highly repetitive region of DNA present at the end of a chromosome. Each time a rod chromosome of a eukaryote is replicated, during mitosis also called cell division, the enzymatic complex of DNA polymerase is unable to copy the last few nucleotides. Telomeres shorten with age, likely as a result of the repeated inflammation and / or stress that organisms undergo. This results in the appearance within an organism, in which senescent cells are present in large numbers, diseases such as age-related cancer or neurodegenerative diseases.
  • senescent cells stop dividing unlike normal cells in the body, but the fact that these cells no longer divide also has the consequence that the mode of functioning of these cells differs from healthy or normal cells.
  • the loss of competent cells in terms of proliferation can be responsible for a pathology, as is suspected in glaucoma, cataracts, pancreatic diabetes or even osteoarthritis.
  • the inflammation caused by SASP can play a causal role in the onset of diseases; senescent cells with significant inflammatory potential gradually move into the tissue environment where they will somehow 'contaminate' healthy cells nearby which in turn will become senescent as suspected in diseases such as atherosclerosis, cardiovascular disease or even age-related cancers.
  • the present invention relating to a particular electrolyzed water, obtained by a process involving particular electrodes of boron doped diamond fixed to silicon, makes it possible to solve, at least partially, the problems or drawbacks mentioned above.
  • the electrolysis module for implementing the method for preparing electrolyzed water according to the invention comprises at least one, preferably at least two boron-doped diamond electrodes which are fixed on a silicon substrate.
  • each electrode is advantageously between and 10 and 100 cm 2 , preferably 60 and 80, more preferably around 70 cm 2 .
  • the boron doping of the diamond electrode also has its importance on the properties of the water obtained; the boron concentration is between 200 ppm (3x10 19 B atoms / cm 3 ) and 1500 ppm (2x10 20 B atoms / cm 3 ).
  • This boron concentration as well as the nature of the diamond-based electrodes on silicon gives it properties allowing it to operate on a potential between -1 V and -2 V on the cathodic polarization and on + 2V and + 4V on anodic polarization in comparison to a hydrogen reference electrode.
  • the electrolysis module is connected to a power supply module and is open to a flow of water which will pass through it.
  • the electrodes are supplied with direct current by the power supply module which is connected to the electrolysis module providing direct current to the electrode (s).
  • the supply current is set between 1.5A and 7A. If reverse polarity is required, this can be done automatically by the power module.
  • the water can come from different sources but must pass through the electrolysis module because it cannot operate in the absence of water.
  • the electrolysis module can be permanently crossed by water depending on the device in which it is located.
  • An internal measurement system comprising a hydraulic flow sensor is present, interacting with the power supply module and which allows the standby, stopping or starting of the electrolysis module in the absence or presence of water, and therefore activate electrolysis.
  • the water electrolysis module according to the present invention can advantageously operate in automatic mode or can be activated or deactivated on demand, manually or using a remote control system.
  • the water electrolysis module does not necessarily need permanent activation, but can usefully be activated cyclically, that is to say. say at convenient intervals, preferably but not necessarily at regular intervals. It has been found that electrolysis of water at regular intervals allows the water to remain therapeutically active for a long time. Electrolysis cycles can in particular be carried out at a rate of 2 to 12 cycles over a period of 24 hours, two consecutive cycles being spaced at least 30 minutes apart, which makes it possible to obtain water with a therapeutic potential.
  • the process for preparing electrolyzed water according to the invention using the module described above comprises the following steps: a.
  • a conductivity salt is added at a concentration of 0.5 to 2 g / L b.
  • the amount of current delivered during the electrolysis process is between 15 and 500 mAh / L of water, more preferably 40 to 250 mAh / L of water, even more preferably 50 to 200 mAh / L ; the electrolysis time being between 1 and 60 minutes.
  • the method of the invention thus makes it possible to obtain clean water for use in the treatment of diseases or disorders linked to cell senescence.
  • the treatment of diseases or disorders linked to cellular senescence can, without this being limiting, include the treatment of diseases linked to age such as neurodegenerative diseases, skin conditions but also glaucoma, cataracts, pancreatic diabetes, osteoarthritis, atherosclerosis, cardiovascular disease or even age-related cancers.
  • the water obtained according to the method of the invention can also be useful in the case of grafting or transplantation of tissue such as the liver or even an organ or even skin grafting.
  • the water thus obtained can also be used in different forms or compositions or within different devices.
  • the devices used can be selected from a reservoir or else an infusion bag comprising electrolyzed water as described above.
  • the electrolysis module used will then be integrated into an existing water circuit in order to prepare the electrolyzed water; one can very well also imagine the electrolysis module connected to or immersed in a tank. Any water, whether natural, from a source or from a municipal network, can be used in the process for obtaining electrolyzed water according to the invention.
  • the advantage and the flexibility of use of the electrolysis module according to the invention makes it possible to obtain, from an abundant source which is water, a less expensive treatment since it does not require conventional chemicals in the process. treatment of diseases or disorders linked to senescence, while avoiding the side effects of said chemicals.
  • Electrolyzed water obtained by the process according to the invention, can also be present in more conventional compositions that are found for sale in pharmacies or drugstores or even supermarkets, said composition comprising 95 to 100% electrolyzed water and 0 to 5% of an excipient and / or emulsifier.
  • Said composition is for use as a medicament in the treatment of diseases or disorders associated with cellular senescence, more particularly cancers related to age or neurodegenerative diseases.
  • It can be in the form of a cream, a gel, a dressing, a patch, for example when it comes to eliminating senescent cells from the skin and maintaining the skin. healthiest skin possible with a maximum of healthy or non-senescent cells.
  • Another case which can be considered more particularly is that of grafts of skin cells, tissues or even organ such as for example the liver, is the use of electrolyzed water according to the invention in a culture medium. cells, tissue or organ in vitro.
  • This culture medium most often comprises, in addition to the electrolyzed water according to the invention, all the nutrients essential for maintaining its activity such as growth factors, nutrients such as amino acids, salts, and possibly additives. animal serum and other compounds such as sugars or even antibiotics in order to avoid contamination of the culture media, as well as others well known to those skilled in the art of culture media.
  • Another potential galenic form for the composition according to the invention can be an aqueous gel also called a hydrogel.
  • a hydrogel is a gel in which the swelling agent is water electrolyzed according to the process of the invention.
  • the matrix of a hydrogel is generally a network of polymers which are insoluble in water, but are able to swell substantially in the presence of a large amount of water or aqueous solutions.
  • FIG. 1 shows the results obtained during comparative tests between a water according to the WDW invention, obtained according to the implementation of the method according to the invention under a current of 62.5 mAh / L, and a water ultrapure MQW which is obtained with filters from the company Millipore, in the presence of variable concentrations of H202, the two waters being applied to cultures of chondrosarcoma cells of the JJ012 cell line.
  • the cell culture medium is also of the EMEM type obtained by mixing powders (Thermo Fisher, GIBCO # 41500-034, Penicylin Steptomycin (in English) (PenStrep) # 15140122, and 10% Fêtai Bovine Serum (in English) (FBS) ) # 26140079) and sterilized and filtered (0.2 ⁇ m filter) and containing said cells.
  • Senescence-associated b-Gal is an isoform of b-Gal which exhibits optimal activity at pH 6.0 and which is primarily used as a biomarker for senescent cells (K802).
  • the detection is based on the hydrolysis by beta-galactosidase of a non-fluorescent substrate to generate a strongly fluorescent product.
  • the electrolyzed water obtained by implementing the method according to the invention (WDW) is the most effective in terms of increasing cell senescence than other electrolyzed or commercial water and this when the concentration of H202 is of 0 mM corresponding to the control.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé d'obtention d'une eau électrolysée selon les étapes suivantes: - Addition à une eau non traitée de sel de conductivité à la concentration 0.5 à 2 g/L - Electrolyse de l'eau obtenue en i) par un module d'électrolyse comprenant au moins une électrode de diamant dopé au bore fixée sur substrat de silicium dans laquelle la concentration de bore est comprise entre 200 ppm (3x1019 B atomes/cm3) et 1500 ppm (2x1020 B atomes/cm3), la durée d'électrolyse étant comprise entre 1 et 30 minutes. L'invention concerne par ailleurs une eau obtenue selon ce procédé pour le traitement des maladies ou désordres liés à la senescence cellulaire ainsi qu'une composition contenant une telle eau, un procédé d'augmentation du caractère sénolitique de cellules sénescentes et un dispositif de traitement des affections de la peau comportant un réservoir ou une poche de perfusion contenant une eau obtenue selon le procédé inventif.

Description

Description
Titre de l'invention : Eau électrolysée, procédé d’obtention et utilisations d’une telle eau pour le traitement de désordres liés à la sénescence cellulaire
[0001] L’invention a pour objet le domaine du traitement des maladies ou des désordres liés à la sénescence cellulaire, notamment le traitement du cancer ou à des maladies neurodégénératives. L’invention concerne plus particulièrement un procédé d’obtention d’une eau électrolysée utile pour le traitement des maladies ou des désordres liés à la sénescence cellulaire. L’invention concerne également l’eau obtenue par ce procédé, son utilisation pour le traitement des maladies ou des désordres liés à la sénescence cellulaire par application directe ou sous forme de compositions, et un dispositif de traitement des dites affections adapté. L’invention concerne également une méthode de sélection des cellules non sénescentes utiles dans des applications de greffe
[0002] Tel que décrit pour la première fois par Leonard Hayflick en 1961 en étudiant des fibroblastes primaires (WI-38) en culture, les fibroblastes proliféraient pendant un nombre limité de doublements de population avant de rester bloqués irréversiblement dans un plateau d’arrêt de croissance. C’est ce phénomène qu’il appellera la sénescence cellulaire. Ce plateau nommé limite de Hayflick ou plateau de sénescence réplicative est observé pour la plupart des cellules normales (ex. : fibroblastes, cellules endothéliales...).
[0003] La sénescence cellulaire est généralement comprise comme un arrêt définitif du cycle cellulaire découlant de différentes causes. Le mécanisme d'arrêt du cycle cellulaire induit par la sénescence cellulaire est complexe et implique des interactions entre le raccourcissement des télomères, les inflammations et les stress cellulaires.
[0004] En visant la sénescence cellulaire, du fait de son incidence sur des maladies telles que le cancer ou les maladies neurodégénératives liées à l’âge, les chercheurs pensent tenir une piste prometteuse de lutte contre ces maladies alors que l’arsenal thérapeutique classique, qui n’est pas sans effets secondaires, demeure quasi inefficace si l’on considère par exemple la maladie d’Alzheimer.
[0005] On citera la demande US2017198253 qui a pour objet une méthode pour tuer sélectivement des cellules sénescentes et pour traiter des maladies et des troubles associés à la sénescence en administrant un agent sénolytique. Les maladies et les troubles associés à la sénescence pouvant être traités par les procédés utilisant les agents sénolytiques décrits ici comprennent les maladies et les troubles cardiovasculaires associés ou provoqués par une artériosclérose, tels que l'athérosclérose; la fibrose pulmonaire idiopatique; la maladie pulmonaire obstructive chronique; l'arthrose; les maladies et troubles ophtalmiques associés à la sénescence; et les maladies et troubles dermatologiques associés à la sénescence. Les agents sénolytiques sont compris parmi les inhibiteurs MDM2 tels les dérivés de type cis-imidazoline ou encore des inhibiteurs des protéines Bcl-2, Bcl-xL, ou p-Akt.
[0006] On citera aussi la demande WO2018215795 qui concerne un agent destiné à être utilisé pour tuer sélectivement une ou plusieurs cellules sénescentes, ledit agent étant choisi parmi les éléments suivants : un glycoside ou aglycone cardiaque, un inhibiteur de la kinase d'adhésion focale (F AK), un inhibiteur de la HMG-CoA réductase, le JF D00244, la cyclosporine, la tyrphostine AG879, la cantharidine, le chlorure de diphénylèneiodonium, la rottlerine, la 2,3- diméthoxy-1 ,4-naphtoquinone, le LY-367,265, la roténone, l'idarubicine, le chlorure de déqualintum, la vincristine, le nitazoxanide, la nitrofurazone, le temsirolimus, l'eltrombopag, l'adapalène, l'azacyclonol, l'énoxacine et le raltégravir, et leurs sels pharmaceutiquement acceptables. U n autre aspect concerne des composés destinés à être utilisés dans le traitement ou la prévention d'une maladie ou d'un trouble associé à la sénescence, et des procédés associés.
[0007] On citera également la demande US2018256568 qui a pour objet une méthode de traitement d'une maladie ou d'un trouble dans un tissu cible chez un sujet, dans laquelle les symptômes de la maladie ou du trouble sont causés au moins en partie par des cellules sénescentes situées dans ou autour du tissu cible, dans lequel le tissu cible est dépourvu de cancer, et dans lequel les cellules sénescentes sont définies comme des cellules exprimant la protéine p16.
[0008] La méthode comprend l'administration dans ou autour du tissu cible d'une série de traitements avec une composition pharmaceutique qui comprend un agent sénolitique qui entre en contact avec les cellules sénescentes situées dans ou autour du tissu cible et élimine sélectivement ces cellules sénescentes sans affecter si possible les cellules non sénescentes adjacentes. La demande décrit toute une série de molécules chimiques permettant de traiter les cellules sénescentes.
[0009] Bien qu’efficaces, ces solutions n’en présentent pas moins un inconvénient majeur à savoir que ces produits chimiques ne sont pas dénués de toxicité ou d’effets secondaires. Certes ils permettent d’affecter les cellules sénescentes mais on ne peut pas exclure qu’ils affectent aussi les cellules saines ou tissus sains. U n manque de sélectivité lié à l’utilisation des produits chimiques qui peuvent avoir plusieurs cibles protéiques n’est pas sans poser de risque.
[0010] Dans le cas des greffes, que ce soit de peau ou de foie par exemple, l’élimination des cellules sénescentes permettrait, lors de la transplantation ou de la greffe, d’éviter au patient d’avoir, en plus de cellules saines greffées ou transplantées, des cellules sénescentes qui sur le long terme pourraient induire des maladies du fait de leur présence. Cet aspect est aussi un défi de taille à relever. Là encore une sélection des bonnes cellules ou d’un tissu sain exempt de cellules sénescentes via l’utilisation de produits chimiques, pour la greffe ou la transplantation d’un tissu, n’est pas sans poser de problèmes d’effets secondaires ou de toxicité sur les cellules saines ou tissus sains.
[001 1 ] Ainsi il y a un besoin réel de disposer de méthodes ou compositions alternatives permettant sélectivement d’éliminer ou de traiter efficacement les cellules sénescentes et les maladies associées à la présence de ces cellules tout en réduisant les effets secondaires de ces méthodes de traitement ainsi qu’en touchant sélectivement les cellules sénescentes sans, voire très peu, affecter les cellules saines d’un tissu ou d’un organe. [0012] L’un des buts de l’invention est donc de remédier aux inconvénients précités et de répondre aux besoins précités en proposant une eau électrolysée pour le traitement des désordres liés à la sénescence cellulaire.
[0013] Plus particulièrement, un des objets de l’invention est l’utilisation envisagée de l’eau électrolysée selon l’invention dans le traitement de maladies liées à la sénescence cellulaire, comme notamment des cancers ou des maladies neurodégénératives.
[0014] L’eau électrolysée selon l’invention est obtenue par la mise en œuvre d’un procédé en trois étapes qui débute par l’utilisation d’une eau courante ou de source optionnellement additionnée d’un sel de sulfate, de carbonates ou tout autre sel compatible connu de l’homme de métier à la concentration 0.5 à 2g/L suivie d’une électrolyse de ladite eau par un module d’électrolyse comprenant au moins une électrode de diamant dopé au bore fixée sur substrat de silicium dans laquelle la concentration de bore est comprise entre 200 (3x1019 B atomes/cm3) et 2000 ppm (3,52x1 ° B atomes/cm3B), notamment entre 200 ppm (3x1019 B atomes/cm3) et 1500 ppm (2x1020 B atomes/cm3), le dit module soumettant l’eau à une quantité de courant lors du processus d’électrolyse inférieure à 500 mAh/L d’eau, plus préférentiellement comprise entre 40 et 250 mAh/L d’eau, encore plus préférentiellement entre 50 et 200 mAh/L, la durée de l’électrolyse étant comprise entre 1 minute et 60 minutes.
[0015] L’électrolyse peut se faire en une fois, de façon continue, ou encore de façon cyclique avec un nombre de cycles compris entre 2 et 12 cycles sur une période de 24 heures, deux cycles consécutifs étant espacés d’au moins 30 minutes.
[0016] L’invention a également pour objet une eau électrolysée obtenue par le procédé décrit précédemment.
[0017] L’invention a également pour objet un procédé d’augmentation du caractère sénolitique de cellules biologiques sénescentes présentes dans un milieu cellulaire, caractérisé en ce qu’il consiste à introduire dans le milieu cellulaire une eau électrolysée obtenue selon le procédé précédemment décrit. Ce procédé consiste particulièrement à augmenter au moins l’activité bêta- galactosidase (SA- -Gal) associée à la sénescence par mise en contact desdites cellules avec l’eau électrolysée ainsi obtenue. Les inventeurs ont en effet découvert que l’eau électrolysée obtenue selon l’invention avait la propriété singulière d’augmenter de manière significative cette activité bêta- galactosidase (SA- -Gal) lorsque des cellules sénescentes telles que présentes notamment dans des fibroblastes étaient mises en contact de ladite eau.
[0018] Avantageusement selon ce procédé, le pourcentage d’eau contenue dans le milieu cellulaire est strictement supérieur à 0, et de préférence supérieur à 5%, de préférence encore supérieur à 25%.
[0019] Avantageusement encore selon le procédé d’augmentation du caractère sénolitique de l’invention, les cellules sénescentes sont maintenues dans le milieu cellulaire au contact de l’eau pendant une durée supérieure à 1 min.
[0020] Une telle augmentation du caractère sénolitique de cellules sénescentes présente l’intérêt majeur de permettre une sélection induite de cellules saines par rapport aux cellules sénescentes par accélération du processus naturel de sénescence dans un milieu cellulaire ou tissu biologique, et donc la disparition accélérée desdites cellules au profit des cellules saines. Ceci ouvre des possibilités exceptionnelles d’utilisation de l’eau de l’invention à des fins prophylactiques, d’aide au traitement thérapeutique, voire de traitement thérapeutique direct.
[0021] L’invention a aussi également pour objet une composition comprenant une eau électrolysée obtenue selon le procédé décrit précédemment pour utilisation en tant que médicament dans le traitement de désordres liés à la sénescence.
[0022] De préférence, les désordres visés par l’utilisation inventive comporte les maladies liées à la sénescence et notamment certains cancers ou les maladies neurodégénératives.
[0023] La composition comprenant de l’eau électrolysée selon l’invention se compose de 95 à 100 % d’eau électrolysée et de 0 à 5 % d’un excipient et/ou d’un émulsifiant.
[0024] La composition selon l’invention peut se présenter sous forme d’une crème, d’un gel, d’un pansement ou encore d’un patch. [0025] Par ailleurs, lorsque la composition selon l’invention peut être exclusivement composée d’eau électrolysée, celle-ci peut être ajoutée à un dispositif la contenant tel un réservoir ou une poche de perfusion contenant l’eau électrolysée pure ou sous forme de composition liquide.
[0026] L’eau électrolysée est obtenue grâce à un module d’électrolyse permettant la mise en œuvre du procédé précédemment décrit, ledit module pouvant être présent de façon fixe ou mobile dans un dispositif tel un réservoir, le dit réservoir pouvant servir à remplir des poches de perfusion sur une ligne de production par exemple.
[0027] Il peut également être présent dans un circuit de distribution classique d’eau, de préférence en sortie de distribution comme un robinet, si l’on considère vouloir préparer une boisson à partir d’eau électrolysée, celle-ci pouvant alors être consommée dans le but de traiter les désordres liés à la sénescence cellulaire par voie orale.
[0028] L’invention a également pour objet une méthode de sélection des cellules non sénescentes dans un extrait cellulaire ou un tissu biologique comprenant plusieurs cellules par mise en contact de celles-ci avec une eau électrolysée obtenue par la mise en œuvre du procédé selon l’invention pendant une durée de 1 à 30 minutes.
[0029] Ainsi l’obtention d’un extrait cellulaire ou d’un tissu sain exempt en totalité ou en grande partie de cellules sénescentes, obtenu par la mise en œuvre de la méthode de sélection précédemment décrite, peut trouver son intérêt dans l’utilisation pour le traitement des greffes notamment de peau ou de foie.
[0030] Les dessins annexés illustrent l’invention :
[0031] [Fig.1] montre l’efficacité de l’eau électrolysée selon l’invention nommée WDW sur des lignées de cellules tumorales de type chondrosarcome en comparaison avec une eau non électrolysée ultra pure MQW.
[0032] [Fig.2] montre la supériorité de l’eau électrolysée obtenue selon le procédé de l’invention, sur la modification de l’activité SA- -Gal dont l’augmentation est témoin de la présence de cellules sénescentes. [0033] La présente invention va être décrite de façon plus détaillée et à l’aide d’un ou plusieurs exemples qui ne limite nullement l’invention.
[0034] En biologie, la sénescence est un processus complexe qui entraîne une lente dégradation des fonctions de la cellule à l'origine du vieillissement des organismes. Il s’agit d’un mécanisme biologique complexe, impliquant la dégradation de nombreux gènes, plus particulièrement au sein des cellules sénescentes. C’est généralement la partie télomérique des chromosomes qui se trouve affectée.
[0035] Un télomère est une région hautement répétitive d'ADN présente à l'extrémité d'un chromosome. À chaque fois qu'un chromosome en bâtonnet d'un eucaryote est répliqué, lors de la mitose appelée également division cellulaire, le complexe enzymatique de l'ADN polymérase s'avère incapable de copier les derniers nucléotides. Les télomères raccourcissent avec l’âge, vraisemblablement sous l’action d’inflammations et/ou de stress répétés que les organismes subissent. Ceci a pour conséquence de voir apparaître au sein d’un organisme, dont les cellules sénescentes sont présentes en grand nombre, des maladies telles que le cancer lié à l’âge ou à des maladies neurodégénératives.
[0036] L’une des caractéristiques principales des cellules sénescentes est qu’elles cessent de se diviser à l’inverse des cellules normales de l’organisme, mais le fait que ces cellules ne se divisent plus a aussi pour conséquence que le mode de fonctionnement de ces cellules diffère des cellules saines ou normales.
[0037] Elles modifient aussi activement leur environnement en sécrétant des cytokines, des facteurs de croissance ainsi que des protéases de la matrice extracellulaire. Ce phénomène joue un rôle important dans la réponse inflammatoire, dans le remodelage de la formation de la matrice extracellulaire et dans le maintien de l’état sénescent qui va se terminer au cours du temps par une dégénérescence tissulaire.
[0038] Dans certains cas, la perte de cellules compétentes en matière de prolifération peut être responsable d'une pathologie, comme cela est suspecté dans le glaucome, les cataractes, le diabète pancréatique ou encore l'arthrose. [0039] Dans d'autres cas, l'inflammation provoquée par la SASP (Phénotype Sécrétoire Associé à la Sénescence) peut jouer un rôle causal dans l’apparition de maladies; les cellules sénescentes ayant un potentiel inflammatoire important vont peu à peu dans l’environnement tissulaire où elles vont « contaminer » en quelque sorte les cellules saines à proximité qui à leur tour deviendront sénescentes comme cela est suspecté dans le cas de maladies telles que l'athérosclérose, les maladies cardiovasculaires ou encore les cancers liés à l’âge.
[0040] De même dans le cas de greffe ou de transplantation de tissu comme la peau ou le foie, voire d’un organe, la présence de cellules sénescentes ayant un pouvoir inflammatoire important peut limiter l’efficacité du greffon sur un sujet ayant besoin d’une greffe avec un tissu le plus « sain » possible (exempt d’un maximum de cellules sénescentes).
[0041] La présente invention concernant une eau électrolysée particulière, obtenue par un procédé mettant en jeu des électrodes particulières de diamant dopé au bore fixée sur du silicium, permet de solutionner, au moins partiellement, les problématiques ou inconvénients précédemment mentionnés.
[0042] Le module d’électrolyse permettant de mettre en œuvre le procédé de préparation de l’eau électrolysée selon l’invention comprend au moins une, préférablement au moins deux électrodes de diamant dopé au bore qui sont fixées sur un substrat de silicium.
[0043] La surface active, ou de contact, de chaque électrode est avantageusement comprise entre et 10 et 100 cm2, préférentiellement 60 et 80, plus préférentiellement environ 70 cm2.
[0044] Le dopage au bore de l’électrode de diamant a aussi son importance sur les propriétés de l’eau obtenue ; la concentration de bore est comprise entre 200 ppm (3x1019 B atomes/cm3) et 1500 ppm (2x1020 B atomes/cm3).
[0045] Cette concentration en bore ainsi que la nature des électrodes à base de diamant sur silicium lui confère des propriétés lui permettant de fonctionner sur un potentiel compris entre -1 V et -2 V sur la polarisation cathodique et sur +2V et +4V sur polarisation anodique en comparaison à une électrode de référence hydrogène.
[0046] Le module d'électrolyse est connecté à un module d'alimentation électrique et est ouvert à un flux d’eau qui va le traverser. Pour fonctionner correctement et ne pas compromettre les conditions de travail correctes, les électrodes sont alimentées en courant continu par le module d'alimentation qui est connecté au module d'électrolyse fournissant un courant continu à la ou les électrodes. Généralement le courant d’alimentation est fixé entre 1 ,5A et 7A. En cas d'inversion de polarité requise, cette opération peut être effectuée automatiquement par le module d'alimentation.
[0047] L’eau peut provenir de différentes sources mais doit traverser le module d’électrolyse car celui-ci ne peut fonctionner en absence d’eau. Le module d'électrolyse peut être traversé de manière permanente par l'eau en fonction du dispositif dans lequel il se trouve. Un système interne de mesure comprenant un capteur de débit hydraulique est présent, interagissant avec le module d’alimentation et qui permet la mise en veille, l’arrêt ou la mise en marche, du module d’électrolyse en absence ou en présence d’eau, et donc d’activer l’électrolyse.
[0048] Le module d’électrolyse d'eau selon la présente invention peut avantageusement fonctionner en mode automatique ou peut être activé ou désactivé à la demande, manuellement ou à l'aide d'un système de commande à distance.
[0049] Un autre avantage de la présente invention réside dans le fait que le module d’électrolyse d'eau n'a pas nécessairement besoin d'une activation permanente, mais peut être utilement activé de manière cyclique, c'est-à-dire à des intervalles opportuns, de préférence mais pas nécessairement à intervalles réguliers. Il a été constaté que l'électrolyse de l'eau à intervalles réguliers permet à l'eau de rester active thérapeutiquement pendant une longue période. On peut notamment réaliser des cycles d’électrolyse à raison de 2 à 12 cycles sur une période de 24 heures, deux cycles consécutifs étant espacés d’au moins 30 minutes, ce qui permet d’obtenir une eau avec un potentiel thérapeutique. [0050] Le procédé de préparation de l’eau électrolysée selon l’invention à l’aide du module précédemment décrit comporte les étapes suivantes : a. procurer une eau courante ou de source à laquelle optionnellement on additionne un sel de conductivité à une concentration de 0,5 à 2g/L b. réaliser une électrolyse de l’eau ainsi procurée par un dispositif comprenant au moins une électrode de diamant dopé au bore fixée sur substrat de silicium dans laquelle la concentration de bore est comprise entre 200 ppm (3x1019 B atomes/cm3) et 1500 ppm (2x1020 B atomes/cm3).
[0051] Avantageusement, la quantité de courant délivrée lors du processus d’électrolyse est comprise entre 15 et 500 mAh/L d’eau, plus préférentiellement 40 à 250 mAh/L d’eau, encore plus préférentiellement 50 à 200 mAh/L ; la durée d’électrolyse étant comprise entre 1 et 60 minutes.
[0052] Le procédé de l’invention permet ainsi d’obtenir une eau propre à une utilisation dans le traitement des maladies ou des désordres liés à la sénescence cellulaire.
[0053] Tel que mentionné précédemment, le traitement des maladies ou des désordres liés à la sénescence cellulaire peut, sans que cela soit limitatif, comprendre le traitement des maladies liées à l’âge telles les maladies neurodégénératives, les affections de la peau mais encore le glaucome, les cataractes, le diabète pancréatique, l'arthrose, l'athérosclérose, les maladies cardiovasculaires ou encore les cancers liés à l’âge. L’eau obtenue selon le procédé de l’invention peut être aussi utile dans le cas de greffe ou de transplantation de tissu comme le foie voire d’un organe ou encore la greffe de peau.
[0054] L’eau ainsi obtenue peut également être utilisée dans différentes formes ou compositions ou au sein de différents dispositifs.
[0055] Les dispositifs utilisés peuvent être sélectionnés parmi un réservoir ou encore une poche de perfusion comprenant l’eau électrolysée telle que décrite précédemment. Le module d’électrolyse utilisé sera alors intégré à un circuit d’eau existant afin de préparer l’eau électrolysée; on peut très bien imaginer aussi le module d’électrolyse raccordé à ou immergé dans un réservoir. [0056] Toute eau, qu’elle soit naturelle, de source ou de réseau communal, peut être utilisée dans le procédé d’obtention de l’eau électrolysée selon l’invention. L’avantage et la flexibilité d’utilisation du module d’électrolyse selon l’invention permet d’obtenir à partir d’une source abondante qu’est l’eau, un traitement moins onéreux car ne nécessitant pas de produits chimiques classiques dans le traitement des maladies ou désordres liés à la sénescence, tout en évitant les effets secondaires desdits produits chimiques.
[0057] L’eau électrolysée, obtenue par le procédé selon l’invention, peut être aussi présente dans des compositions plus classiques que l’on rencontre à la vente dans les officines ou les parapharmacies voire les grandes surfaces, ladite composition comprenant 95 à 100 % d’eau électrolysée et 0 à 5 % d’un excipient et/ou émulsifiant.
[0058] Ladite composition sert pour utilisation en tant que médicament dans le traitement de maladies ou de désordres liés à la sénescence cellulaire, plus particulièrement les cancers liés à l’âge ou les maladies neurodégénératives.
[0059] Elle peut se présenter sous forme d’une crème, d’un gel, d’un pansement, d’un patch, lorsqu’il s’agit par exemple d’éliminer de la peau les cellules sénescentes et de maintenir la peau la plus saine possible comprenant un maximum de cellules saines ou non sénescentes.
[0060] Un autre cas pouvant être considéré plus particulièrement est celui des greffes de cellules de peau, de tissus voire d’organe comme par exemple le foie, est l’utilisation de l’eau électrolysée selon l’invention dans un milieu de culture de cellules, tissu ou organe in vitro.
[0061] Ce milieu de culture comprend le plus souvent en plus de l’eau électrolysée selon l’invention tous les nutriments indispensables au maintien de son activité comme des facteurs de croissance, des nutriments comme les acides aminés, des sels, des additifs éventuellement du sérum d’animaux et d’autres composés comme des sucres ou encore des antibiotiques afin d’éviter la contamination du milieux de culture ainsi que d’autres bien connus de l’homme de métier du domaine des milieux de cultures. [0062] Une autre forme galénique potentielle pour la composition selon l’invention peut être un gel aqueux aussi appelé hydrogel. Un hydrogel est un gel dans lequel l'agent gonflant est l'eau électrolysée selon le procédé de l’invention. La matrice d'un hydrogel est généralement un réseau de polymères qui sont insolubles dans l'eau, mais sont capables de gonfler substantiellement en présence d'une grande quantité d'eau ou de solutions aqueuses.
[0063] Deux exemples de tests biologiques validant le potentiel de l’eau électrolysée sur les cellules sénescentes en présence de cellules saines ont été réalisés.
[0064] Tels que présentés dans les figures 1 et 2, des essais ont été menés afin de valider le potentiel de l’eau électrolysée selon l’invention.
[0065] La figure 1 représente les résultats obtenus lors d’essais comparatifs entre une eau selon l’invention WDW, obtenue selon la mise en œuvre du procédé selon l’invention sous un courant de 62,5 mAh/L, et une eau ultrapure MQW qui est obtenue avec des filtres de la société Millipore, en présence de concentrations variables de H202, les deux eaux étant appliquées sur des cultures de cellules de chondrosarcome de lignée cellulaire JJ012. Le milieu de culture cellulaire est par ailleurs de type EMEM obtenu par mélange de poudres (Thermo Fisher, GIBCO # 41500-034, Penicylin Steptomycin (en anglais) (PenStrep) # 15140122, and 10% Fêtai Bovine Sérum (en anglais) (FBS) # 26140079) et stérilisées et filtrées (filtre de 0,2 um) et contenant les dites cellules.
[0066] Il est flagrant de constater que la disparition des cellules sénescentes est plus importante en présence d’eau WDW, montrant ainsi qu’elle s’avère un moyen efficace de sélection des cellules non sénescentes par rapport à la présence de cellules sénescentes dans un milieu de culture de cellules comprenant aussi bien des cellules non sénescentes que sénescentes.
[0067] Dans la figure 2, on part du principe que les cellules normales peuvent perdre définitivement leur capacité à proliférer lorsqu'elles sont soumises à un stress, processus appelé sénescence cellulaire. L'activité bêta-galactosidase (SA-b- Gal) associée à la sénescence, détectable à pH 6,0, permet l'identification de cellules sénescentes dans des tissus de culture et de mammifères. L'activité a été mesurée avec le kit BioVision (catalogue n ° K821 -100). La bêta- galactosidase (b-Gal, EC: 3.2.1.23) est une enzyme qui hydrolyse les b- galactosides en monosaccharides. La b-Gal associée à la sénescence (SA-b- Gal) est une isoforme de la b-Gal qui présente l'activité optimale à pH 6,0 et qui est principalement utilisée comme biomarqueur pour les cellules sénescentes (K802). La détection est basée sur l'hydrolyse par la bêta-galactosidase d'un substrat non fluorescent pour générer un produit fortement fluorescent. La fluorescéine produite (3', 6'-dihydroxyspiro [isobenzofurane-1 (3H), 9' - [9H] xanthène] -3-one) peut ensuite être mesurée (substrat-fluorescence Galactose+fluorescéine (Ex/Em=480/530 nm). Le test a été réalisé 36 heures après l’induction de H2O2 sous forme de mesures à 530 nm.
[0068] On en déduit qu’en présence d’eaux différentes avec des taux croissants de
H2O2 :
• eau électrolysée obtenue selon la mise en œuvre du procédé selon l’invention (WDW),
• eau ultra pure obtenue avec des filtres de la société Millipore (MQW),
• eau électrolysée obtenue avec une électrode au Niobium (NBW),
• eau électrolysée avec une électrode simple (REW),
• eau courante (TAPW) et
• eau commercial de la société ASEA dite « redox signaling water » ou ASEA® REDOX.
[0069] En utilisant l'activité de SA- b -Gai comme indication / biomarqueur de la sénescence cellulaire, l’expérience décrite en figure 2 confirme que:
1) L’eau électrolysée obtenue par la mise en œuvre du procédé selon l’invention (WDW) est la plus efficace en terme d’élévation de la sénescence cellulaire que les autres eaux électrolysées ou du commerce et ce lorsque la concentration de H202 est de 0 mM correspondant au contrôle.
2) L’eau électrolysée WDW est plus performante que les autres eaux utilisées et ce pour toutes les concentrations de H202 utilisées. 3) Ceci aussi prouve que les eaux utilisées, bien qu’étant composées principalement de molécules d’eau H20, n’ont pas les mêmes propriétés du fait que pour un même type de cellules mise en culture dans les mêmes conditions, leur impact sur l’activité SA- -Gal n’est pas la même. Ainsi il s’agit donc bien pour WDW d’une eau particulière pouvant être considérée comme un produit obtenu par la mise en œuvre de son procédé d’obtention.
[0070] Les exemples d’images et de dispositifs présentés selon l’invention, ainsi que les différents modes de réalisations mentionnés, ne limitent en rien dans sa portée l’invention telle que revendiquée; ils sont donnés à titre d’éclairage afin de mieux comprendre l’invention.

Claims

Revendications
[Revendication 1] Procédé d’obtention d’une eau électrolysée consistant à électrolyser une eau courante ou de source, comportant optionnellement un sel de conductivité, par exemple du NaCI à la concentration de 0,5 à 2g/L avec un module d’électrolyse comprenant au moins une électrode de diamant dopé au bore fixée sur substrat de silicium dans laquelle la concentration de bore est comprise entre 200 (3x1019 B atomes/cm3) et 2000 ppm (3,52x1020 B atomes/cm3), notamment entre 200 ppm (3x1019 B atomes/cm3) et 1500 ppm (2x1020 B atomes/cm3), ledit module soumettant l’eau à une quantité du courant lors du processus d’électrolyse comprise entre 15 et 500 mAh/L d’eau, plus préférentiellement 40 à 250 mAh/L d’eau, encore plus préférentiellement 50 à 200 mAh/L, la durée d’électrolyse étant comprise entre 1 minute et 60 minutes.
[Revendication 2] Procédé selon la revendication 1 , dans lequel l’électrolyse est réalisée de façon continue ou cyclique, le nombre de cycles étant compris entre 2 et 12 cycles par période de 24 heures, chaque cycle d’électrolyse étant espacé d’un cycle précédent ou suivant d’au moins 30 minutes.
[Revendication 3] Eau obtenue selon le procédé de l’une quelconque des revendications 1 ou 2.
[Revendication 4] Procédé d’augmentation du caractère sénolitique de cellules biologiques sénescentes présentes dans un milieu cellulaire, caractérisé en ce qu’il consiste à introduire dans le milieu cellulaire une eau selon la revendication 3.
[Revendication 5] Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le pourcentage d’eau contenu dans le milieu cellulaire est strictement supérieur à 0, et de préférence supérieur à 5%, de préférence encore supérieur à 25%.
[Revendication 6] Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que les cellules sénescentes sont maintenues dans le milieu cellulaire au contact de l’eau pendant une durée supérieure à 1 min.
[Revendication 7] Utilisation d’une eau selon la revendication 3 pour le traitement des désordres liés à la senescence cellulaire, notamment le traitement du cancer ou des maladies neurodégénératives.
[Revendication 8] Composition comprenant une eau électrolysée selon la revendication 3 pour utilisation en tant que médicament dans le traitement des désordres liés à la senescence cellulaire, notamment le traitement du cancer ou des maladies neurodégéneratives.
[Revendication 9] Composition selon la revendication 8, comprenant 95 à 100 % d’eau electrolysée et 0 à 5 % d’un excipient et/ou émulsifiant.
[Revendication 10] Dispositif de traitement des maladies ou désordres liés à la senescence cellulaire comprenant une poche de perfusion contenant une eau selon la revendication 3 ou une composition selon la revendication 8 ou 9.
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