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WO2020022483A1 - 腸管上皮細胞の製造方法および腸管上皮細胞 - Google Patents

腸管上皮細胞の製造方法および腸管上皮細胞 Download PDF

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WO2020022483A1
WO2020022483A1 PCT/JP2019/029440 JP2019029440W WO2020022483A1 WO 2020022483 A1 WO2020022483 A1 WO 2020022483A1 JP 2019029440 W JP2019029440 W JP 2019029440W WO 2020022483 A1 WO2020022483 A1 WO 2020022483A1
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cells
expression level
days
intestinal epithelial
inhibitor
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PCT/JP2019/029440
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伸治 美馬
悠貴 今倉
泉 小椋
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Fujifilm Corp
Original Assignee
Fujifilm Corp
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    • C12N2506/03—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from non-embryonic pluripotent stem cells
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing intestinal epithelial cells from pluripotent stem cells, and to intestinal epithelial cells produced from pluripotent stem cells.
  • the small intestine contains many drug metabolizing enzymes and drug transporters, it is very important as an organ involved in the first-pass effect of drugs, like the liver. Therefore, evaluating metabolism and membrane permeability in the small intestine is important for research in the pharmaceutical and food fields.
  • Caco-2 cells derived from human colon cancer are frequently used as a small intestine model system.
  • the expression pattern of drug transporters in Caco-2 cells is different from that of human small intestine.
  • expression and induction of drug metabolizing enzymes are hardly observed in Caco-2 cells, it is difficult to accurately evaluate the pharmacokinetics in the small intestine. Therefore, the use of primary intestinal epithelial cells is desirable for comprehensive evaluation of drug metabolism and membrane permeability in the small intestine, but it is difficult to obtain intestinal epithelial cells from the small intestine of animals, especially humans.
  • Human induced pluripotent stem (iPS) cells were established in 2007 by Yamanaka et al.
  • the human iPS cells are cells having pluripotency and almost infinite proliferative ability, similar to human embryonic stem (ES) cells established by Thomson et al. In 1998.
  • Human iPS cells have less ethical problems than human ES cells and are expected to be a stable cell source for drug development. Therefore, efforts to induce differentiation of intestinal epithelial cells from pluripotent stem cells are in progress.
  • Patent Document 1 discloses that a step of differentiating induced pluripotent stem cells into endodermal cells, a step of differentiating endoderm cells obtained in the above steps into intestinal stem cells, and a step of intestinal stem cells obtained in the above steps
  • a step of differentiating into intestinal epithelial cells which comprises culturing in the presence of one or more compounds selected from the group consisting of a MEK1 inhibitor, a DNA methylation inhibitor and a TGF ⁇ receptor inhibitor and EGF. It is described that the induced pluripotent stem cells are differentiated into intestinal epithelial cells.
  • Patent Document 2 discloses (1) a step of differentiating induced pluripotent stem cells into endodermal cells, (2) a step of differentiating endodermal cells obtained in step (1) into intestinal stem cells, 3) a step of differentiating the intestinal stem cells obtained in the step (2) into intestinal epithelial cells, wherein the cAMP is a cell in the presence of a MEK1 inhibitor, a DNA methylation inhibitor, a TGF ⁇ receptor inhibitor and EGF; It is described that the induced pluripotent stem cells are differentiated into intestinal epithelial cells by a step including culturing under conditions supplied to the intestinal tract.
  • the differentiation induction operation is desirably performed using a large culture vessel or dish.
  • a permeability test is performed using intestinal epithelial cells, it is necessary to form an intestinal epithelial cell layer on a porous membrane attached to a relatively small culture vessel called a cell culture insert.
  • intestinal epithelial cells have similar conditions for inducing differentiation to liver cells.
  • inducing pluripotent stem cells into intestinal epithelial cells some cells differentiate into liver cells There is a concern.
  • the result of the test may be affected. Therefore, there is a need for a method for reducing the number of liver cells contaminating.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, a step of differentiating pluripotent stem cells into intestinal stem cells, and a group consisting of MEK1 inhibitor, DNA methylation inhibitor and TGF ⁇ receptor inhibitor
  • a step of differentiating pluripotent stem cells into intestinal stem cells and a group consisting of MEK1 inhibitor, DNA methylation inhibitor and TGF ⁇ receptor inhibitor
  • MEK1 inhibitor MEK1 inhibitor, DNA methylation inhibitor and TGF ⁇ receptor inhibitor
  • Step 1 of differentiating pluripotent stem cells into intestinal stem cells and step in the presence of EGF and one or more selected from the group consisting of MEK1 inhibitor, DNA methylation inhibitor and TGF ⁇ receptor inhibitor 1.
  • a method for producing intestinal epithelial cells comprising a step 2 of differentiating the intestinal stem cells obtained in 1 into intestinal epithelial cells, wherein during the step 2, the differentiating cells are subjected to one of the following steps: The above method of reseeding more than once.
  • step 2 (A) 15 to 25 days after the initiation of pluripotent stem cell differentiation; (B) at least four days after the start of step 2 and at least five days before the end of step 2; (C) assuming that the length of the entire period of step 2 is 1, when a period of 0.2 to 0.7 elapses after the start of step 2; (D) after the start of step 2, when the relative expression level of the intestine-specific homeobox in the adult intestine is 100 or less, when the expression level of the intestine-specific homeobox is 100; (E) after the start of step 2, when the relative expression level of CDX2 is 150 or less, when the expression level of CDX2 in the adult intestine is 100; or (f) after the start of step 2 When the relative expression level of villin is 100 or less when the expression level of villin in the adult intestine is defined as 100: ⁇ 2> The method according to ⁇ 1>, wherein the differentiating cells are replated once or more at any one of the following times during
  • Step 2 is a step of differentiating the intestinal stem cells obtained in Step 1 into intestinal epithelial cells in the presence of a MEK1 inhibitor, a DNA methylation inhibitor, a TGF ⁇ receptor inhibitor, EGF and a cAMP activator.
  • ⁇ 6> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein step 1 is performed on a culture plate having a surface area of 30 cm 2 or more.
  • ⁇ 7> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein the culture after re-seeding in step 2 is performed on a culture plate having a surface area of 1 well of 3 cm 2 or less.
  • ⁇ 8> Intestinal epithelial cells obtained by the method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>.
  • ⁇ 9> The intestinal epithelial cell according to ⁇ 8>, wherein the expression level of albumin as a liver marker is equal to or less than the expression level of albumin in Caco-2 cells.
  • the present invention it is possible to produce intestinal epithelial cells in which the barrier function is maintained while suppressing differentiation of pluripotent stem cells into liver cells.
  • the intestinal epithelial cells of the present invention maintain the barrier function and suppress liver cell contamination.
  • FIG. 1 shows an outline of the differentiation culture method of Comparative Examples 1-3 and Examples 1-4.
  • FIG. 2 shows the results of measuring the expression level of the small intestine marker over time.
  • the vertical axis shows the relative expression level of the small intestine marker when the expression level in the Adult @ Intestine is set to 100, and the horizontal axis shows the number of days after the initiation of differentiation of pluripotent stem cells.
  • MEK1 Mitogen-activated protein kinase kinase 1
  • TGF ⁇ receptor transforming growth factor ⁇ receptor
  • EGF epidermal growth factor
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • SCF stem cell factor
  • FGF2 fibroblast growth factor 2
  • GSK-3 ⁇ glycogen synthase kinase 3 ⁇
  • cAMP cyclic adenosine monophosphate
  • ROCK Rho-associated coiled-coilforming kinase / Rho binding kinase
  • BMP4 bone morphogenetic protein 4
  • VEGF vascular endothelial cell growth factor
  • FBS fetal bovine serum
  • the method for producing intestinal epithelial cells according to the present invention includes inducing differentiation of pluripotent stem cells into an intestinal epithelial cell lineage. ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the cell which shows the characteristics similar to the intestinal epithelial cell which comprises the intestinal tissue of a living body, ie, the intestinal epithelial cell, is obtained.
  • the method for producing intestinal epithelial cells according to the present invention comprises a step 1 of differentiating pluripotent stem cells into intestinal stem cells, and at least one selected from the group consisting of a MEK1 inhibitor, a DNA methylation inhibitor and a TGF ⁇ receptor inhibitor. And a step 2 in which the intestinal stem cells obtained in the step 1 are differentiated into intestinal epithelial cells in the presence of EGF and EGF.
  • the cells undergoing differentiation are replated at least once at any of the following times.
  • step 2 (A) 15 to 25 days after the initiation of pluripotent stem cell differentiation; (B) at least four days after the start of step 2 and at least five days before the end of step 2; (C) assuming that the length of the entire period of step 2 is 1, when a period of 0.2 to 0.7 elapses after the start of step 2; (D) after the start of step 2, when the relative expression level of the intestine-specific homeobox in the adult intestine is 100 or less, when the expression level of the intestine-specific homeobox is 100; (E) after the start of step 2, when the relative expression level of CDX2 is 150 or less, when the expression level of CDX2 in the adult intestine is 100; or (f) after the start of step 2 And when the relative expression level of villin is 100 or less, where the expression level of villin in the adult intestine is 100.
  • Pluripotent stem cells refer to the ability to differentiate into all cells that constitute the body (pluripotency) and the ability to generate daughter cells with the same differentiation potential as self through cell division (self-renewal capacity). ). Pluripotency can be assessed by transplanting the cells to be evaluated into nude mice and testing for the presence or absence of teratoma formation involving each of the three germ layers (ectoderm, mesoderm, and endoderm). it can.
  • Pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells), embryonic germ cells (EG cells; embryonic germ cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), and the like.
  • the cell is not limited to this as long as the cell also has a replication ability.
  • ES cells or iPS cells are used. More preferably, iPS cells are used.
  • Pluripotent stem cells are preferably mammalian cells (eg, primates such as humans and chimpanzees, rodents such as mice and rats), and particularly preferably human cells. Therefore, in the most preferred embodiment of the present invention, human iPS cells are used as pluripotent stem cells.
  • ES cells can be established by culturing, for example, an early embryo before implantation, an inner cell mass constituting the early embryo, a single blastomere, and the like (Manipulating the Mouse Mouse Embryo A Laboratory, Manual, Second Edition, Cold). Spring Harbor Laboratory Press (1994); Thomson, J. A. et al., Science, 282, 1145-1147 (1998)).
  • an early embryo prepared by nuclear transfer of a somatic cell nucleus may be used (Wilmut et al. (Nature, 385, 810 (1997)), Cibelli et al. (Science, 280, 1256) (1998)), Akira Iriya et al.
  • the fused ES cells obtained by cell fusion of ES cells and somatic cells are also embryonic stem cells used in the method of the present invention. include.
  • ES cells are available from archival institutions or are commercially available.
  • human ES cells can be obtained from Kyoto University Research Institute for Regenerative Medicine (eg, KhES-1, KhES-2 and KhES-3), WiCell Research Institute, ESI BIO, and the like.
  • EG cells can be established by culturing primordial germ cells in the presence of LIF, bFGF, and SCF (Matsui et al., Cell, 70, 841-847 (1992), Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 (23), 13726-13731 (1998), Turnpenny et al., Stem Cells, 21 (5), 598-609, (2003)).
  • iPS cells are cells having pluripotency (pluripotency) and proliferative ability, which are produced by reprogramming somatic cells by introducing a reprogramming factor or the like.
  • the induced pluripotent stem cells exhibit properties close to those of ES cells.
  • the somatic cells used for producing iPS cells are not particularly limited, and may be differentiated somatic cells or undifferentiated stem cells.
  • the origin is not particularly limited, but preferably somatic cells of mammals (eg, primates such as humans and chimpanzees, rodents such as mice and rats), particularly preferably human somatic cells are used.
  • iPS cells can be produced by various methods reported so far. In addition, it is naturally assumed that an iPS cell production method to be developed in the future will be applied.
  • the most basic method for producing iPS cells is a method in which the transcription factors Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and c-Myc are introduced into cells using a virus (TakahashihK, Yamanaka S). : Cell 126 (4), 663-676, 2006; Takahashi, K, et al: Cell 131 (5), 861-72, 2007).
  • human iPS cells there is a report of establishment by introduction of four factors of Oct4, Sox2, Lin28 and Nonog (Yu J, et al: Science 318 (5858), 1917-1920, 2007). Three factors excluding c-Myc (Nakagawa M, et al: Nat. Biotechnol.
  • lentiviruses Yu J, et al: Science 318 (5858), 1917-1920, 2007
  • adenoviruses Stadtfeld M, et al: Science 322 (5903)
  • plasmid Okita K, et al: ciScience 322 (5903), 949-953, 2008
  • transposon vector Wang K, Norrby K, Paca A, et al: Nature 458, 771-775, 2009
  • Yusa K, Rad R Takeda J, et al: Nat Methods 6, 363-369, 2009
  • episode Techniques have been developed in which a malvector (Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, et al: ciScience 324, 797-801,
  • Transformation into iPS cells that is, cells that have undergone reprogramming (reprogramming), express pluripotent stem cell markers (undifferentiated markers) such as Fbxo15, Nanog, Oct / 4, Fgf-4, Esg-1 and Crypt. Can be selected as an index.
  • pluripotent stem cell markers such as Fbxo15, Nanog, Oct / 4, Fgf-4, Esg-1 and Crypt. Can be selected as an index.
  • the selected cells are collected as iPS cells.
  • IPS cells can also be provided from, for example, Kyoto University or RIKEN BioResource Center.
  • “differentiation induction” means acting to differentiate along a specific cell lineage.
  • pluripotent stem cells are induced to differentiate into intestinal epithelial cells.
  • the method for producing intestinal epithelial cells according to the present invention is roughly classified into two stages of induction steps, namely, a step of differentiating pluripotent stem cells into intestinal stem cells (step 1), and converting the obtained intestinal stem cells into intestinal epithelial cells. And a differentiation step (step 2).
  • steps 1 a step of differentiating pluripotent stem cells into intestinal stem cells
  • converting the obtained intestinal stem cells into intestinal epithelial cells converting the obtained intestinal stem cells into intestinal epithelial cells.
  • a differentiation step 2 a differentiation step
  • Step 1 Differentiation into intestinal stem cells
  • the pluripotent stem cells are cultured and differentiated into intestinal stem cells.
  • pluripotent stem cells are cultured under conditions that induce differentiation into intestinal stem cells.
  • Culture conditions are not particularly limited as long as the pluripotent stem cells differentiate into intestinal stem cells.
  • two-stage differentiation induction described below, that is, differentiation of pluripotent stem cells into endoderm cells (steps), such that pluripotent stem cells differentiate into intestinal stem cells via endoderm cells 1-1) and differentiation of endoderm cells into intestinal stem cells (step 1-2).
  • Step 1-1 Differentiation into endodermal cells
  • pluripotent stem cells are cultured and differentiated into endodermal cells.
  • pluripotent stem cells are cultured under conditions that induce differentiation into endoderm.
  • Culture conditions are not particularly limited as long as the pluripotent stem cells differentiate into endoderm cells.
  • the cells are cultured in a medium supplemented with activin A according to a conventional method.
  • the concentration of activin A in the medium is, for example, 10 ng / mL to 200 ng / mL, preferably 20 ng / mL to 150 ng / mL.
  • serum or a serum substitute KnockOut TM Serum Replacement (KSR) or the like
  • KSR KnockOut TM Serum Replacement
  • Serum is not limited to fetal bovine serum, and human serum, sheep serum and the like can also be used.
  • the added amount of serum or serum substitute is, for example, 0.1% (v / v) to 10% (v / v).
  • Wnt / ⁇ -catenin signaling pathway inhibitors eg, hexachlorophen, quercetin, Wnt3a which is a Wnt ligand
  • Wnt3a which is a Wnt ligand
  • This step can also be performed by the method described in WO 2014/165661 or a method analogous thereto.
  • step 1-1 (culturing period) is, for example, 1 day to 10 days, preferably 2 days to 7 days.
  • Step 1-2 Differentiation into Intestinal Stem Cells
  • the endoderm cells obtained in Step 1-1 are cultured and differentiated into intestinal stem cells.
  • endodermal cells are cultured under conditions that induce differentiation into intestinal stem cells.
  • Culture conditions are not particularly limited as long as the endoderm cells differentiate into intestinal stem cells.
  • the culture is performed in the presence of FGF2 or a GSK-3 ⁇ inhibitor.
  • human FGF2 for example, human recombinant FGF2 is used as FGF2.
  • Step 1-2 may be performed after selecting endoderm cells from the cell population obtained through Step 1-1.
  • the endoderm cells may be selected, for example, by a flow cytometer (cell sorter) using a cell surface marker as an index.
  • “In the presence of FGF2” is synonymous with the conditions under which FGF2 was added to the medium. Therefore, in order to culture in the presence of FGF2, a medium to which FGF2 has been added may be used.
  • An example of the concentration of FGF2 added is 100 ng / mL to 500 ⁇ ng / mL.
  • GSK-3 ⁇ inhibitor in the presence of a GSK-3 ⁇ inhibitor, is synonymous with the conditions under which a GSK-3 ⁇ inhibitor was added to a medium. Therefore, in order to perform culture in the presence of a GSK-3 ⁇ inhibitor, a medium supplemented with FGF2 may be used.
  • GSK-3 ⁇ inhibitors include CHIR99021, SB216763, CHIR98014, TWS119, Tideglubib, SB415286, BIO, AZD2858, AZD1080, AR-A014418, TDZD-8, LY2090314, IM-12, Indirukin, and Indirukin, i. it can.
  • concentration of the GSK-3 ⁇ inhibitor in the case of CHIR99021
  • concentration of the GSK-3 ⁇ inhibitor are 1 ⁇ mol / L to 100 ⁇ mol / L, preferably 3 ⁇ mol / L to 30 ⁇ mol / L.
  • the period (culturing period) of step 1-2 is, for example, 2 days to 10 days, preferably 3 days to 7 days. If the culture period is too short, the expected effects (increase in differentiation efficiency, promotion of acquisition of function as intestinal stem cells) cannot be sufficiently obtained. On the other hand, if the culture period is too long, the differentiation efficiency is reduced.
  • intestinal stem cell markers include G protein-coupled receptor 5 (LGR5) containing leucine-rich repeats and ephrin B2 receptor (EphB2).
  • LGR5 G protein-coupled receptor 5
  • EphB2 ephrin B2 receptor
  • Step 2 Differentiation into intestinal epithelial cells>
  • one or more members selected from the group consisting of a MEK1 inhibitor, a DNA methylation inhibitor and a TGF ⁇ receptor inhibitor are used in combination with EGF, and the intestinal stem cells obtained in step 1 are differentiated into intestinal epithelial cells. .
  • One or more selected from the group consisting of MEK1 inhibitors, DNA methylation inhibitors, and TGF ⁇ receptor inhibitors includes one of a MEK1 inhibitor, a DNA methylation inhibitor, and a TGF ⁇ receptor inhibitor ( That is, any one of a MEK1 inhibitor, a DNA methylation inhibitor and a TGF ⁇ receptor inhibitor may be used, or two of the MEK1 inhibitor, the DNA methylation inhibitor and the TGF ⁇ receptor inhibitor (ie, MEK1 inhibitor) A combination of an inhibitor and a DNA methylation inhibitor, a combination of a MEK1 inhibitor and a TGF ⁇ receptor inhibitor, or a combination of a DNA methylation inhibitor or a TGF ⁇ receptor inhibitor), or a MEK1 inhibitor, a DNA methylation inhibitor. And TGF ⁇ receptor inhibitors.
  • Step 2 includes a step of differentiating the intestinal stem cells obtained in Step 1 into intestinal epithelial cells in the presence of a MEK1 inhibitor, a DNA methylation inhibitor, a TGF ⁇ receptor inhibitor, EGF and a cAMP activator. Is particularly preferred.
  • Step 2 may be performed after selecting intestinal stem cells from the cell population obtained through Step 1.
  • Intestinal stem cells may be selected, for example, by a flow cytometer (cell sorter) using a cell surface marker as an index.
  • Step 2 is constituted by one or more cultures (details will be described later).
  • a medium to which EGF and a cAMP activator are added as essential components for example, a medium to which EGF and a cAMP activator are added as essential components, an EGF, a cAMP activator, a DNA methylation inhibitor, a MEK1 inhibitor, and a TGF ⁇ receptor inhibitor , A medium to which EGF is added as an essential component, a medium to which EGF and a ROCK inhibitor are added as essential components, and the like.
  • MEK1 inhibitors examples include PD98059, PD184352, PD184161, PD0325901, U0126, MEKinhibitorI, MEKinhibitorII, MEK1 / 2inhibitorII and SL327.
  • DNA methylation inhibitors examples include 5-aza-2'-deoxycytidine (5-aza-2'dc), 5-azacytidine, RG108, and Zebularine.
  • TGF ⁇ receptor inhibitor is preferably TGF- ⁇ receptor ALK4, ALK5, considering that A8301 used in Examples described later exhibits inhibitory activity on TGF- ⁇ receptor ALK4, ALK5, and ALK7. It is preferable to use one that exhibits inhibitory activity against one or more of ALK7.
  • A8301, SB431542, SB-505124, SB525334, D4476, ALK5inhibitor, LY2157299, LY364947, GW788388, and RepSox satisfy the above conditions.
  • a cAMP activator forskolin, indomethacin, NKH477 (colforsin daropart), cell-derived toxin protein (pertussis toxin, cholera toxin), PACAP-27, PACAP-38, SKF83822 and the like can be used.
  • Forskolin exhibits adenylate cyclase activating action and promotes intracellular cAMP synthesis.
  • Examples of the concentration of MEK1 inhibitor added are 4 ⁇ mol / L to 100 ⁇ mol / L, preferably 10 ⁇ mol / L to 40 ⁇ mol / L.
  • examples of the addition concentration of the DNA methylation inhibitor are 1 ⁇ mol / L to 25 ⁇ mol / L, preferably 2.5 ⁇ mol / L to 10 ⁇ mol / L.
  • concentration of the TGF ⁇ receptor inhibitor is 0.1 ⁇ mol / L to 2.5 ⁇ mol / L, preferably 0.2 ⁇ mol / L to 1 ⁇ mol / L.
  • EGF EGF
  • concentration of EGF is 5 ng / mL to 100 ng / mL, preferably 10 ng / mL to 50 ng / mL.
  • concentration of the cAMP activator added in the case of forskolin
  • concentration of the cAMP activator added are 1 ⁇ mol / L to 200 ⁇ mol / L, preferably 5 ⁇ mol / L to 100 ⁇ mol / L.
  • the concentration of the compound used and the exemplified compound (PD98059) , 5-aza-2'-deoxycytidine, A8301, forskolin) can be determined by those skilled in the art according to the above-mentioned concentration range. Whether the set concentration range is appropriate or not can be confirmed by a preliminary experiment according to Examples described later.
  • the period of step 2 is, for example, 7 days to 40 days, preferably 10 days to 30 days. If the culture period is too short, the expected effects (increase in differentiation efficiency, promotion of acquisition of function as intestinal epithelial cells) cannot be sufficiently obtained. On the other hand, if the culture period is too long, the differentiation efficiency is reduced.
  • the differentiation into intestinal epithelial cells can be determined or evaluated using, for example, the expression of intestinal epithelial cell markers, the incorporation of peptides, or the induction of the expression of drug-metabolizing enzymes via vitamin D receptor as an index.
  • intestinal epithelial cell markers include villin 1 (Villin # 1), CDX2, gut-specific homeobox (ISX), ATP-binding cassette transporter B1 / multidrug-resistant protein 1 (ABCB1 / MDR1), and ATP-binding cassette trans.
  • a cell population consisting only of the target cells (intestinal epithelial cells) or a cell population containing the target cells in a high ratio (high purity)
  • the cell population after culturing may be selected and sorted.
  • any of the following culture steps A to D is performed.
  • ⁇ Culture step A> In the culturing step A, (a-1) culturing in the presence of an EGF and a cAMP activator, followed by (a-2) a MEK1 inhibitor, a DNA methylation inhibitor, a TGF ⁇ receptor inhibitor and Culture in the presence of EGF.
  • the culture period of (a-1) is, for example, 2 days to 10 days, preferably 4 days to 8 days
  • the culture period of (a-2) is, for example, 9 days to 29 days, preferably 7 days to 27 days. Days.
  • the items that are not particularly described the corresponding description described above is cited.
  • ⁇ Culture step B> In the culturing step B, (b-1) culturing in the presence of EGF, followed by (b-2) MEK1 inhibitor, DNA methylation inhibitor, TGF ⁇ receptor inhibitor, EGF and cAMP activation The culture is performed in the presence of the substance. By performing the two-stage culture in this way, effects of promoting differentiation into intestinal epithelial cells, maturation, and gaining functions can be expected.
  • the culture period of (b-1) is, for example, 2 days to 10 days, preferably 4 days to 8 days, and the culture period of (b-2) is, for example, 9 days to 19 days, preferably 7 days to 17 days. Days.
  • the items that are not particularly described the corresponding description described above is cited.
  • culturing (b-2) After culturing (b-2), culturing (culturing (b-3)) in the presence of a MEK1 inhibitor, a DNA methylation inhibitor, a TGF ⁇ receptor inhibitor and EGF may be performed.
  • the period of this culture is, for example, 1 day to 10 days.
  • ⁇ Culture step C> In the culturing step C, (c-1) culturing in the presence of an EGF and a cAMP activator, followed by (c-2) a MEK1 inhibitor, a DNA methylation inhibitor, a TGF ⁇ receptor inhibitor, Culture is performed in the presence of EGF and a cAMP activator.
  • the culture period of (c-1) is, for example, 2 days to 10 days, preferably 4 days to 8 days
  • the culture period of (c-2) is, for example, 9 days to 19 days, preferably 7 days to 17 days. Days.
  • the items that are not particularly described the corresponding description described above is cited.
  • culturing (c-2) After culturing (c-2), culturing in the presence of a MEK1 inhibitor, a DNA methylation inhibitor, a TGF ⁇ receptor inhibitor and EGF (culturing (c-3)) may be performed.
  • the period of this culture is, for example, 1 day to 10 days.
  • ⁇ Culture step D> culturing is performed in the presence of (d-1) a MEK1 inhibitor, a DNA methylation inhibitor, a TGF ⁇ receptor inhibitor, EGF and a cAMP activator.
  • This culturing step is particularly advantageous in that the culturing operation is simple, that it is more effective for differentiation into intestinal epithelial cells, and that a stable effect can be expected because it is a compound.
  • the culture period of (d-1) is, for example, 15 days to 25 days, preferably 17 days to 23 days.
  • the items that are not particularly described compounds usable for each culture, concentration of each compound added, etc.
  • culturing (d-2)) in the presence of a MEK1 inhibitor, a DNA methylation inhibitor, a TGF ⁇ receptor inhibitor and EGF may be performed.
  • the period of this culture is, for example, 1 day to 10 days.
  • step 1 step 1-1, step 1-2, step 2, step a-1, step a-2, step b-1, step b-2, step b-3, In step c-1, step c-2, step c-3, step d-1, and step d-2), subculture (reseeding) may be performed in the middle.
  • cells when the cells become confluent or subconfluent, a part of the cells is collected, transferred to another culture vessel, and the culture is continued. It is preferable to set the cell density low in order to promote differentiation.
  • cells may be seeded at a cell density of about 1 ⁇ 10 4 cells / cm 2 to 1 ⁇ 10 6 cells / cm 2 .
  • the replating medium is preferably a medium containing a ROCK inhibitor.
  • the cells undergoing differentiation are replated at least once at any of the following times.
  • the time is preferably from 21 to 25 days, more preferably from 22 to 24 days, and particularly preferably from 23 days.
  • step B a time point 4 days or more after the start of the step 2 and 5 days or more before the end of the step 2 (preferably 10 days or more after the start of the step 2 and 5 days or more before the end of the step 2) Time, more preferably, 11 days after the start of the step 2 and 5 days or more before the end of the step 2);
  • C Assuming that the length of the entire period of step 2 is 1, after the start of step 2, a period of 0.2 to 0.7 elapses (preferably 0.5 to 0.7).
  • the porous membrane refers to a membrane having a penetrated pore.
  • a polycarbonate film or a polyethylene terephthalate (PET) film having many pores having a pore diameter of about 0.4 to 1.0 ⁇ m can be used.
  • step 1 is preferably performed on a culture plate having a surface area of 30 cm 2 or more. That is, the differentiation induction operation in step 1 is preferably performed using a large-sized culture vessel or dish, whereby the efficiency of the operation can be improved.
  • the culture after reseeding in step 2 is preferably performed on a culture plate having a surface area of 1 well of 3 cm 2 or less (more preferably, on a porous membrane).
  • culturing conditions in each step constituting the present invention may be conditions generally used in culturing animal cells. That is, for example, culture may be performed at 37 ° C. in an environment of 5% CO 2 .
  • Iskov modified Dulbecco's medium IMDM
  • GMBCO Iskov modified Dulbecco's medium
  • Ham F12 medium HamF12
  • D-MEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • Gibco, etc. Glasgow basic medium
  • RPMI1640 medium and the like can be used as a basic medium. Two or more basic media may be used in combination.
  • a basic medium for example, D- It is preferable to use a mixed medium of MEM and ham F12 medium, D-MEM.
  • components that can be added to the medium include bovine serum albumin (BSA), antibiotics, 2-mercaptoethanol, polyvinyl alcohol (PVA), non-essential amino acids (NEAA), insulin, transferrin, and selenium.
  • BSA bovine serum albumin
  • PVA polyvinyl alcohol
  • NEAA non-essential amino acids
  • insulin transferrin, and selenium
  • selenium Typically, cells are two-dimensionally cultured using a culture dish or the like. According to the method of the present invention, intestinal epithelial cells can be obtained from pluripotent stem cells by two-dimensional culture. However, three-dimensional culture using a gel-like culture substrate or a three-dimensional culture plate may be performed.
  • intestinal epithelial cells obtained by the above-described method for producing intestinal epithelial cells according to the present invention.
  • the intestinal epithelial cells of the present invention are preferably cells in which the expression level of albumin as a liver marker is equal to or less than the expression level of albumin in Caco-2 cells.
  • the present invention further relates to the use of intestinal epithelial cells obtained by the method of the present invention.
  • Various assays are provided as a first use.
  • the intestinal epithelial cells of the present invention can be used for a model system of the intestinal tract, particularly the small intestine, and are useful for evaluating pharmacokinetics (absorption, metabolism, etc.) and toxicity in the intestinal tract, particularly the small intestine.
  • the intestinal epithelial cells of the present invention can be used for evaluating the pharmacokinetics and toxicity of a compound.
  • the intestinal epithelial cells of the present invention can be used to test the absorption or membrane permeability of a test substance, drug interaction, induction of drug metabolizing enzymes, induction of drug transporters, toxicity, and the like. That is, the present invention provides a method for evaluating the absorption or membrane permeability of a test substance, drug interaction, induction of a drug metabolizing enzyme, induction of a drug transporter, toxicity, etc., as one of the uses of intestinal epithelial cells ( A first aspect) is provided.
  • a step of preparing a cell layer composed of intestinal epithelial cells obtained by the production method of the present invention (ii) a step of bringing a test substance into contact with the cell layer, and (iii) The step of quantifying the test substance that has passed through the cell layer and evaluating the absorption or membrane permeability of the test substance, drug interaction, induction of drug metabolizing enzymes, induction of drug transporters, or toxicity is performed.
  • the absorbability of the test substance can also be evaluated by the method described below (second embodiment).
  • step (i) typically, intestinal epithelial cells are cultured on a semipermeable membrane (porous membrane) to form a cell layer.
  • a semipermeable membrane porous membrane
  • a cell culture insert for example, Transwell (registered trademark) provided by Corning
  • seeding and culturing cells in the cell culture insert Obtain a cell layer composed of epithelial cells.
  • a cell culture insert is a culture vessel provided with a permeable membrane used for culturing cells, organs or tissues, and is mainly used in combination with a well plate.
  • culturing cells, organs or tissues in the cell culture insert the components contained in the culture medium can spread over the top and bottom surfaces of the organs and tissues, and culturing can be performed under conditions similar to those in a living body.
  • step (ii) is typically performed by adding a test substance to a medium.
  • the timing of addition of the test substance is not particularly limited. Therefore, after starting the culture in the medium containing no test substance, the test substance may be added at a certain point in time, or the culture may be started in advance in the medium containing the test substance.
  • Organic compounds or inorganic compounds having various molecular sizes can be used as the test substance.
  • organic compounds include nucleic acids, peptides, proteins, lipids (simple lipids, complex lipids (phosphoglycerides, sphingolipids, glycosylglycerides, cerebrosides, etc.), prostaglandins, isoprenoids, terpenes, steroids, polyphenols, catechins, vitamins (B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C, A, D, E, etc.)
  • Existing or candidate components such as pharmaceuticals, nutritional foods, food additives, pesticides, cosmetics (cosmetics), etc.
  • test substance it is also possible to use a plant extract, a cell extract, a culture supernatant, etc. as a test substance, by adding two or more test substances at the same time.
  • the interaction between substances, synergism, etc. may be investigated.
  • the test substance may be derived from a natural product or synthetic. In the case of it. The latter also makes it possible to build an efficient assay systems using techniques e.g. combinatorial synthesis.
  • the period for contacting the test substance can be set arbitrarily.
  • the contact period is, for example, 10 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 1 day.
  • the contact may be performed a plurality of times.
  • step (iii) the amount of the test substance that has passed through the cell layer is quantified.
  • a culture vessel equipped with a cell culture insert such as Transwell (registered trademark)
  • the test substance that has passed through the cell culture insert that is, moves into the upper or lower vessel via the cell layer.
  • the test substance thus obtained is subjected to mass spectrometry, liquid chromatography, immunological techniques (for example, fluorescence immunoassay (FIA: fluoroimmunoassay), enzyme immunoassay (EIA: enzyme @ immunoassay), etc.).
  • FFA fluorescence immunoassay
  • EIA enzyme @ immunoassay
  • the absorbance or membrane permeation of the test substance is determined. Determine and evaluate sex, drug interaction, induction of drug metabolizing enzymes, induction of drug transporters, or toxicity.
  • the present invention also provides, as another aspect (second aspect), a method for evaluating the metabolism or absorption of a test substance.
  • this method (I) a step of bringing a test substance into contact with intestinal epithelial cells obtained by the differentiation induction method of the present invention; and (II) metabolism or absorption of the test substance, drug interaction, induction of drug metabolizing enzymes. And the step of measuring / evaluating the induction or toxicity of the drug transporter.
  • the step (I), that is, the contact of the intestinal epithelial cells with the test substance can be carried out in the same manner as in the step (ii). However, it is not essential to form a cell layer in advance.
  • step (I) the metabolism or absorption of the test substance, drug interaction, induction of drug metabolizing enzymes, induction of drug transporters, or toxicity are measured and evaluated (step (II)).
  • step (I) the metabolism or absorption of the test substance, drug interaction, induction of drug metabolizing enzymes, induction of drug transporters, or toxicity are measured and evaluated (step (II)).
  • the metabolism or the like can be measured and evaluated without a substantial time interval, or a certain time (for example, 10 minutes to 5 hours)
  • a certain time for example, 10 minutes to 5 hours
  • the expected metabolite is usually qualitatively or quantitatively measured using the culture solution after the step (I) as a sample.
  • an appropriate method may be selected according to the metabolite. Examples thereof include mass spectrometry, liquid chromatography, and immunological techniques (eg, fluorescence immunoassay (FIA), enzyme immunoassay (EIA)). ) Etc. can be adopted.
  • FFA fluorescence immuno
  • the metabolic amount of the test substance can be evaluated according to the amount of the metabolite.
  • the metabolic efficiency of the test substance may be calculated based on the detection result of the metabolite and the used amount of the test substance (typically, the amount added to the medium).
  • Metabolism of test substances using the expression of drug metabolizing enzymes can also be measured.
  • drug metabolizing enzymes cytochrome P450 (especially CYP3A4), uridine diphosphate-glucuronyltransferase (especially UGT1A8, UGT1A10), and sulfotransferase (especially SULT1A3, etc.) in intestinal epithelial cells
  • cytochrome P450 especially CYP3A4
  • UGT1A8, UGT1A10 uridine diphosphate-glucuronyltransferase
  • sulfotransferase especially SULT1A3, etc.
  • Expression of drug metabolizing enzymes can be assessed at the mRNA or protein level. For example, when an increase in the mRNA level of the drug metabolizing enzyme is recognized, it can be determined that "the test substance has been metabolized”. Similarly, when an increase in the activity of the drug metabolizing enzyme is recognized, it can be determined that “the test
  • the residual amount of the test substance in the culture solution is measured.
  • the test substance is quantified using the culture solution after step (I) as a sample.
  • An appropriate measurement method may be selected according to the test substance. For example, mass spectrometry, liquid chromatography, immunological techniques (for example, fluorescence immunoassay (FIA), enzyme immunoassay (EIA)) and the like can be employed.
  • FFA fluorescence immunoassay
  • EIA enzyme immunoassay
  • the absorption amount or absorption efficiency of the test substance can be determined and evaluated according to the degree of the decrease. The absorption can also be evaluated by measuring the amount of the test substance taken up into the cells.
  • the measurement and evaluation of metabolism and the measurement and evaluation of absorption may be performed simultaneously or in parallel.
  • the cell preparation of the present invention is applicable to treatment of various intestinal diseases.
  • use as a material for regeneration / reconstruction of damaged intestinal epithelial tissue (including dysfunction) is envisaged. That is, contribution to regenerative medicine can be expected.
  • the cell preparation of the present invention can be prepared by, for example, suspending intestinal epithelial cells obtained by the method of the present invention in a physiological saline or buffer (for example, a phosphate buffer), or tertiary cells using intestinal epithelial cells. It can be prepared by preparing an original tissue (organoid or spheroid).
  • 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 10 cells may be contained as a single dose so that a therapeutically effective amount of cells can be administered.
  • the cell content can be appropriately adjusted in consideration of the purpose of use, the target disease, the sex, age, weight, affected part state, cell state, and the like of the application target (recipient).
  • DMSO Dimethyl sulfoxide
  • serum albumin for the protection of cells
  • antibiotics for the purpose of preventing bacterial contamination
  • various components vitamins for the purpose of cell activation, proliferation or differentiation induction, etc.
  • Cytokines growth factors, steroids, etc.
  • other pharmaceutically acceptable components eg, carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspending agents, soothing agents, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological saline, etc. It may be contained in the cell preparation of the present invention.
  • Human iPS cells (FF-1) were seeded on a dish coated with Matrigel (registered trademark) and cultured at 37 ° C. in a CO 2 incubator under 5% O 2 conditions. Passage of human iPS cells (FF-1) was performed at a split ratio of 1: 3 to 1:10 after culturing for 3 to 5 days. The medium was not changed for 48 hours after the passage, and was changed every day thereafter. Human iPS cells (FF-1) were obtained from Cellular Dynamics International.
  • FIG. 1 shows an outline of the differentiation culture methods of Comparative Examples 1 to 3 and Examples 1 to 4.
  • reference numerals and abbreviations indicate the following.
  • Culture condition 1 RPMI 1640 medium containing Activin A and RPMI 1640 medium containing BMP4, VEGF, FGF2 and EGF
  • Comparative Example 1 re-seeding was performed on Day 11. In Comparative Examples 2 and 3, Day 11 and Day 29 were replated. In Examples 1 and 2, Day 11 and Day 17 were replated. In Examples 3 and 4, Day 11 and Day 23 were replated.
  • FF-1 Human iPS cells
  • BMP4 vascular endothelial growth factor
  • FGF2 FGF2
  • EGF EGF
  • Y-27632 Rho-binding kinase inhibitor
  • FF-1 Human iPS cells
  • Y-27632 On the day of reseeding (day 29), Y-27632 was added to a concentration of 10 ⁇ mol / L, and the cells treated in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 60 minutes were detached with actase, and the porous membrane on the cell culture insert ( The surface area was reseeded to 0.33 cm 2 ). Y-27632 was added for one day until the medium was changed the next day. Otherwise, the cells were cultured in the same manner as in Comparative Example 2 to obtain intestinal epithelial cells.
  • FF-1 Human iPS cells
  • the cells were detached and seeded under the same conditions as in Comparative Example 1. Thereafter, the cells were cultured under the same conditions as in Comparative Example 1 for one day (day 11 to day 12) and for five days (day 12 to day 17). The seeds were replated on the upper porous membrane (surface area: 0.33 cm 2 ).
  • Example 2 On the day of reseeding (day 17), Y-27632 was added to a concentration of 10 ⁇ mol / L, and the cells treated in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 60 minutes were detached with actase, and the porous membrane on the cell culture insert ( The surface area was reseeded to 0.33 cm 2 ). Y-27632 was added for one day until the medium was changed the next day. Otherwise, the cells were cultured as in Example 1 to obtain intestinal epithelial cells.
  • FF-1 Human iPS cells
  • FF-1 Human iPS cells
  • the cells were detached and seeded under the same conditions as in Comparative Example 1. Thereafter, under the same conditions as in Comparative Example 1, for 1 day (Days 11 to 12), for 6 days (Days 12 to 18), and similarly to Comparative Example 1, 5-aza-2′dc, PD98059, After adding A8301, and culturing for 5 days (day 18 to day 23), the cells were detached from the culture vessel with actase, and replated on a porous membrane (surface area: 0.33 cm 2 ) on the cell culture insert. .
  • Example 4 On the day of reseeding (day 23), Y-27632 was added to a concentration of 10 ⁇ mol / L, and the cells treated in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 60 minutes were detached with actase, and the porous membrane on the cell culture insert ( The surface area was reseeded to 0.33 cm 2 ). Y-27632 was added for one day until the medium was changed the next day. Otherwise, the cells were cultured as in Example 1 to obtain intestinal epithelial cells.
  • ⁇ Test Example 1> The CYP3A4 activity of the intestinal epithelial cells obtained in Comparative Examples 1-3 and Examples 1-4 was measured from the amount of metabolites of midazolam. After completion of the differentiation induction, the medium was incubated at 37 ° C. in a medium containing 5 ⁇ mol / L midazolam, and after 2 hours, the medium was sampled. Metabolic activity was calculated from the amount of 1-hydroxymidazolam in the medium measured using a liquid chromatography-mass spectrometer (LC-MS / MS). After completion of the metabolic experiment, protein quantification was performed, and the metabolic activity was corrected with the amount of protein. Table 1 shows the results.
  • Example 3 Although the CYP3A4 activity was slightly reduced, it was at a practically acceptable level.
  • TEER transpose electrical resistance
  • TEER was measured using EVOM 2 (registered trademark) Epithelial Volt / Ohm (TEER) Meter (WORLD PRECISION INSTRUMENTS). The operation was in accordance with the manual. Table 2 shows the results. Examples 1 to 4 showed a sufficient barrier function (200 ⁇ ⁇ cm 2 or more) similar to Comparative Example 1, but Comparative Examples 2 and 3 lost the barrier function.
  • RNeasy registered trademark
  • Mini Kit Qiagen
  • cDNA complementary DNA
  • RNA-to-cDNA Kit High capacity RNA-to-cDNA Kit (applied biosystems).
  • the operation followed the attached manual.
  • the real-time reverse transcription polymerase chain reaction (Real-Time RT-PCR) was performed using TaqMan (registered trademark) Gene Expression Master Mix (applied biosystems) with cDNA as a template. The operation was in accordance with the manual.
  • the measurement results were corrected using ribosome 18S as an endogenous control.
  • the expression levels of mRNA were estimated using probes of various genes. Table 3 shows the results.
  • the numerical values in Table 3 indicate the relative expression level when the expression level in the Adult Intestine is 100 for the small intestine marker, and the relative expression level when the expression level in Caco-2 is 100 for the liver marker.

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Abstract

本発明の課題は、多能性幹細胞から、肝臓細胞への分化を抑制しつつ、バリア機能が維持された腸管上皮細胞を製造する方法、並びに肝臓細胞への分化を抑制しつつ、バリア機能が維持された腸管上皮細胞を提供することである。本発明によれば、多能性幹細胞を腸管幹細胞へと分化させる工程１、およびＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤およびＴＧＦβ受容体阻害剤からなる群より選択される一以上とＥＧＦとの存在下において工程１で得られた腸管幹細胞を腸管上皮細胞へと分化させる工程２を含む、腸管上皮細胞の製造方法であって、工程２の途中において、分化中の細胞を、本明細書において定義する所定の時点で一回以上再播種する、上記方法が提供される。

Description

腸管上皮細胞の製造方法および腸管上皮細胞
　本発明は、多能性幹細胞から腸管上皮細胞を製造する方法、並びに多能性幹細胞から製造された腸管上皮細胞に関する。
　小腸には多くの薬物代謝酵素や薬物トランスポーターが存在することから、肝臓と同様、薬物の初回通過効果に関わる臓器として非常に重要である。そのため、小腸における代謝および膜透過性を評価するのは、医薬品、食品分野の研究で重要である。現在、小腸のモデル系としてはヒト結腸癌由来のＣａｃｏ－２細胞が多用されている。しかし、Ｃａｃｏ－２細胞における薬物トランスポーターの発現パターンはヒト小腸とは異なる。また、Ｃａｃｏ－２細胞には薬物代謝酵素の発現および酵素誘導はほとんど認められないことから、正確に小腸での薬物動態を評価することは難しい。したがって、小腸における薬物代謝および膜透過性を総合的に評価するためには初代小腸上皮細胞の利用が望ましいが、動物、特にヒトの小腸から腸管上皮細胞を得ることは難しい。
　ヒト人工多能性幹（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ：ｉＰＳ）細胞は２００７年に山中らによって樹立された。このヒトｉＰＳ細胞は、１９９８年にＴｈｏｍｓｏｎらによって樹立されたヒト胚性幹（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ：ＥＳ）細胞と同様な、多分化能とほぼ無限の増殖能をもつ細胞である。ヒトｉＰＳ細胞はヒトＥＳ細胞に比べ倫理的な問題が少なく、医薬品開発のための安定した細胞供給源として期待される。そこで、多能性幹細胞から腸管上皮細胞を分化誘導する取り組みが進んでいる。
　特許文献１には、人工多能性幹細胞を内胚葉細胞へと分化させる工程と、上記工程で得られた内胚葉細胞を腸管幹細胞へと分化させる工程と、上記工程で得られた腸管幹細胞を腸管上皮細胞へと分化させる工程であって、ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤およびＴＧＦβ受容体阻害剤からなる群より選択される一以上の化合物とＥＧＦの存在下での培養を含む工程によって、人工多能性幹細胞を腸管上皮細胞へ分化誘導することが記載されている。
　特許文献２には、（１）人工多能性幹細胞を内胚葉細胞へと分化させる工程と、（２）工程（１）で得られた内胚葉細胞を腸管幹細胞へと分化させる工程と、（３）工程（２）で得られた腸管幹細胞を腸管上皮細胞へと分化させる工程であって、ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤およびＥＧＦの存在下、且つｃＡＭＰが細胞へ供給される条件下での培養を含む工程によって、人工多能性幹細胞を腸管上皮細胞へ分化誘導することが記載されている。
国際公開第２０１４／１３２９３３号パンフレット 国際公開第２０１７／１５４７９５号パンフレット
　多能性幹細胞から腸管上皮細胞への分化誘導のためには、一般的には、培地交換および試薬の添加を数日～数十日間連続して行う必要がある。操作の効率性の点から、分化誘導操作は大型の培養容器またはディッシュを用いて行うことが望ましい。一方、腸管上皮細胞を用いて透過性試験を実施する場合には、セルカルチャーインサートという比較的小型の培養用容器に装着した多孔膜上に、腸管上皮細胞層を形成する必要がある。
　大型の培養容器またはディッシュにおいて多能性幹細胞を腸管上皮細胞まで分化誘導した後、セルカルチャーインサート上の多孔膜に細胞を再播種すると、腸管上皮細胞層が十分に形成されず、透過性試験に必要なバリア機能が失われるという懸念がある。多能性幹細胞から腸管上皮細胞への分化誘導を、最初からセルカルチャーインサート上の多孔膜上で行えば、腸管上皮細胞層は形成されるが、培養操作の効率が悪い。
　従って、腸管上皮細胞のバリア機能を維持したまま、再播種することが可能な培養方法が求められていた。
　また、腸管上皮細胞は肝臓細胞と分化誘導の条件が類似していることが知られており、多能性幹細胞から腸管上皮細胞へ誘導する過程においては、一部の細胞が肝臓細胞に分化するという懸念がある。腸管上皮細胞に肝臓細胞がコンタミーションすると、試験結果に影響する恐れがあるので、コンタミネーションする肝臓細胞を少なくする方法が求められている。
　本発明は、多能性幹細胞から、肝臓細胞への分化を抑制しつつ、バリア機能が維持された腸管上皮細胞を製造する方法を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、肝臓細胞への分化を抑制しつつ、バリア機能が維持された腸管上皮細胞を提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、多能性幹細胞を腸管幹細胞へと分化させる工程、およびＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤およびＴＧＦβ受容体阻害剤からなる群より選択される一以上とＥＧＦとの存在下において上記の腸管幹細胞を腸管上皮細胞へと分化させる工程によって腸管上皮細胞を製造する際に、腸管上皮細胞へと分化させる工程の途中において、分化中の細胞を、所定の時点で一回以上再播種することによって、上記課題を解決できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
　即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞　多能性幹細胞を腸管幹細胞へと分化させる工程１、およびＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤およびＴＧＦβ受容体阻害剤からなる群より選択される一以上とＥＧＦとの存在下において工程１で得られた腸管幹細胞を腸管上皮細胞へと分化させる工程２を含む、腸管上皮細胞の製造方法であって、工程２の途中において、分化中の細胞を、以下のいずれかの時点で一回以上再播種する、上記方法。
（ａ）多能性幹細胞の分化の開始後、１５日～２５日の時点；
（ｂ）工程２の開始後４日目以降、かつ工程２の終了より５日以上前の時点；
（ｃ）工程２の全体の期間の長さを１としたとき、工程２の開始後、０．２～０．７の長さの期間が経過した時点；
（ｄ）工程２の開始後であって、成人腸における腸特異的ホメオボックスの発現量を１００とした時の、腸特異的ホメオボックスの相対発現量が、３００以下である時点；
（ｅ）工程２の開始後であって、成人腸におけるＣＤＸ２の発現量を１００とした時の、ＣＤＸ２の相対発現量が、１５０以下である時点；または
（ｆ）工程２の開始後であって、成人腸におけるビリンの発現量を１００とした時の、ビリンの相対発現量が、１００以下である時点：
＜２＞　工程２の途中において、分化中の細胞を、以下のいずれかの時点で一回以上再播種する、＜１＞に記載の方法。
（ａ）多能性幹細胞の分化の開始後、２１日～２５日の時点；
（ｂ）工程２の開始後１０日目以降、かつ工程２の終了より５日以上前の時点；
（ｃ）工程２の全体の期間の長さを１としたとき、工程２の開始後の０．５～０．７の長さの期間が経過した時点；
（ｄ）工程２の開始後であって、成人腸における腸特異的ホメオボックスの発現量を１００とした時の、腸特異的ホメオボックスの相対発現量が、３００以下である時点；
（ｅ）工程２の開始後であって、成人腸におけるＣＤＸ２の発現量を１００とした時の、ＣＤＸ２の相対発現量が、１５０以下である時点；または
（ｆ）工程２の開始後であって、成人腸におけるビリンの発現量を１００とした時の、ビリンの相対発現量が、１００以下である時点：
＜３＞　工程２の途中において、分化中の細胞を、一回以上再播種する際における、再播種の培地がＲＯＣＫ阻害剤を含む培地である、＜１＞または＜２＞に記載の方法。
＜４＞　工程２が、ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＥＧＦおよびｃＡＭＰ活性化物質の存在下において工程１で得られた腸管幹細胞を腸管上皮細胞へと分化させる工程を含む、＜１＞から＜３＞のいずれか一に記載の方法。
＜５＞　工程２において、細胞の再播種を多孔膜上に行う、＜１＞から＜４＞のいずれか一に記載の方法。
＜６＞　工程１を、表面積が３０ｃｍ2以上の培養プレート上において行う、＜１＞から＜５＞のいずれか一に記載の方法。
＜７＞　工程２における再播種以降の培養を、１ウエルの表面積が３ｃｍ2以下の培養プレート上において行う、＜１＞から＜６＞のいずれか一に記載の方法。
＜８＞　＜１＞から＜７＞の何れか一に記載の方法で得られる腸管上皮細胞。
＜９＞　肝臓マーカーであるアルブミンの発現量が、Ｃａｃｏ－２細胞におけるアルブミンの発現量と同等以下である、＜８＞に記載の腸管上皮細胞。
　本発明によれば、多能性幹細胞から、肝臓細胞への分化を抑制しつつ、バリア機能が維持された腸管上皮細胞を製造することができる。本発明の腸管上皮細胞は、バリア機能が維持されており、かつ肝臓細胞のコンタミネーションが抑制されている。
図１は、比較例１～３および実施例１～４の分化培養方法の概要を示す。 図２は、小腸マーカーの発現量を経時的に測定した結果を示す。縦軸は、Ａｄｕｌｔ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅにおける発現量を１００としたときの、小腸マーカーの相対発現量を示し、横軸は、多能性幹細胞の分化開始後日数を示す。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
［用語の説明］
ＭＥＫ１：Ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　ｋｉｎａｓｅ　１
ＴＧＦβ受容体：トランスフォーミング増殖因子β受容体
ＥＧＦ：上皮細胞増殖因子
ＬＩＦ：白血病阻害因子
ｂＦＧＦ：塩基性線維芽細胞増殖因子
ＳＣＦ：幹細胞因子
ＦＧＦ２：線維芽細胞増殖因子２
ＧＳＫ－３β：グリコーゲン合成酵素キナーゼ ３β
ｃＡＭＰ：環状アデノシン一リン酸
ＲＯＣＫ：Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌｆｏｒｍｉｎｇｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ
ＢＭＰ４：骨形成タンパク質４
ＶＥＧＦ：血管内皮細胞増殖因子
ＦＢＳ：ウシ胎児血清
［腸管上皮細胞の製造方法］
　本発明による腸管上皮細胞の製造方法は、多能性幹細胞を腸管上皮細胞系譜へ分化誘導することを含む。本発明によれば、生体の腸管組織を構成する腸管上皮細胞と類似の特性を示す細胞、即ち腸管上皮細胞が得られる。
　本発明による腸管上皮細胞の製造方法は、多能性幹細胞を腸管幹細胞へと分化させる工程１、およびＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤およびＴＧＦβ受容体阻害剤からなる群より選択される一以上とＥＧＦとの存在下において工程１で得られた腸管幹細胞を腸管上皮細胞へと分化させる工程２を含む方法である。本発明による腸管上皮細胞の製造方法においては、工程２の途中において、分化中の細胞を、以下のいずれかの時点で一回以上再播種する。
（ａ）多能性幹細胞の分化の開始後、１５日～２５日の時点；
（ｂ）工程２の開始後４日目以降、かつ工程２の終了より５日以上前の時点；
（ｃ）工程２の全体の期間の長さを１としたとき、工程２の開始後、０．２～０．７の長さの期間が経過した時点；
（ｄ）工程２の開始後であって、成人腸における腸特異的ホメオボックスの発現量を１００とした時の、腸特異的ホメオボックスの相対発現量が、３００以下である時点；
（ｅ）工程２の開始後であって、成人腸におけるＣＤＸ２の発現量を１００とした時の、ＣＤＸ２の相対発現量が、１５０以下である時点；または
（ｆ）工程２の開始後であって、成人腸におけるビリンの発現量を１００とした時の、ビリンの相対発現量が、１００以下である時点。
　上記した（ａ）～（ｆ）のいずれかの時点で一回以上再播種することにより、バリア機能を維持したまま、細胞を再播種することが可能になる。これにより、途中までは大型の培養容器またはディッシュで効率的に培養した後、セルカルチャーインサート上の多孔膜に小分けして再播種することが可能になり、培養操作を効率化することができる。
　さらに、上記した（ａ）～（ｆ）のいずれかの時点で一回以上再播種することにより、コンタミネーションする肝臓細胞を大幅に減少することができる。
　「多能性幹細胞」とは、生体を構成するすべての細胞に分化しうる能力（分化多能性）と、細胞分裂を経て自己と同一の分化能を有する娘細胞を生み出す能力（自己複製能）とを併せ持つ細胞をいう。分化多能性は、評価対象の細胞を、ヌードマウスに移植し、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）のそれぞれの細胞を含むテラトーマ形成の有無を試験することにより、評価することができる。
　多能性幹細胞として、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞；ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等を挙げることができるが、分化多能性および自己複製能を併せ持つ細胞である限り、これに限定されない。好ましくはＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を用いる。更に好ましくはｉＰＳ細胞を用いる。多能性幹細胞は、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒトやチンパンジーなどの霊長類、マウスやラットなどのげっ歯類）の細胞、特に好ましくはヒトの細胞である。従って、本発明の最も好ましい態様では、多能性幹細胞として、ヒトｉＰＳ細胞が用いられる。
　ＥＳ細胞は、例えば、着床以前の初期胚、初期胚を構成する内部細胞塊、単一割球等を培養することによって樹立することができる（Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1994）;Thomson，J. A. et al.，Science，282，1145-1147（1998））。初期胚として、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を用いてもよい（Wilmut et al.（Nature，385，810（1997））、Cibelli et al.（Science，280，1256（1998））、入谷明ら（蛋白質核酸酵素，44，892（1999））、Baguisi et al.（Nature Biotechnology，17，456（1999））、Wakayama et al.（Nature，394，369（1998）; Nature Genetics，22，127（1999）; Proc. Natl. Acad. Sci. USA，96，14984（1999））、Rideout III et al.（Nature Genetics，24，109（2000）、Tachibana et al.（Human Embryonic Stem Cells Derived by Somatic Cell Nuclear Transfer, Cell（2013）inpress）。初期座として、単為発生胚を用いてもよい（Kim et al.（Science，315，482-486（2007））、Nakajima et al.（Stem Cells，25，983-985（2007））、Kim et al.（Cell Stem Cell，1，346-352（2007））、Revazova et al.（Cloning Stem Cells，9，432-449（2007））、Revazova et al.（Cloning Stem Cells，10，11-24（2008））。上掲の論文の他、ＥＳ細胞の作製についてはStrelchenko N., et al. Reprod Biomed Online.9: 623-629, 2004；KlimanskayaI., et al. Nature 444: 481-485, 2006；Chung Y., et al. Cell Stem Cell 2: 113-117, 2008；Zhang X., et al Stem Cells 24: 2669-2676, 2006；Wassarman, P.M. et al. Methods in Enzymology, Vol.365, 2003等が参考になる。尚、ＥＳ細胞と体細胞の細胞融合によって得られる融合ＥＳ細胞も、本発明の方法に用いられる胚性幹細胞に含まれる。
　ＥＳ細胞の中には、保存機関から入手可能なもの、或いは市販されているものもある。例えば、ヒトＥＳ細胞については京都大学再生医科学研究所（例えばＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２およびＫｈＥＳ－３）、ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＥＳＩ ＢＩＯなどから入手可能である。
　ＥＧ細胞は、始原生殖細胞を、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦの存在下で培養すること等により樹立することができる（Matsui et al.，Cell，70，841-847（1992）、Shamblott et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，95（23）, 13726-13731（1998）、Turnpenny et al.，Stem Cells，21（5），598-609，（2003））。
　「人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）」とは、初期化因子の導入などにより体細胞をリプログラミングすることによって作製される、多能性（多分化能）と増殖能を有する細胞である。人工多能性幹細胞はＥＳ細胞に近い性質を示す。ｉＰＳ細胞の作製に使用する体細胞は特に限定されず、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。また、その由来も特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒトやチンパンジーなどの霊長類、マウスやラットなどのげっ歯類）の体細胞、特に好ましくはヒトの体細胞を用いる。ｉＰＳ細胞は、これまでに報告された各種方法によって作製することができる。また、今後開発されるｉＰＳ細胞作製法を適用することも当然に想定される。
　ｉＰＳ細胞作製法の最も基本的な手法は、転写因子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃの４因子を、ウイルスを利用して細胞へ導入する方法である（Takahashi K, Yamanaka S: Cell 126 (4), 663-676, 2006; Takahashi, K, et al :Cell 131 (5), 861-72, 2007）。ヒトｉＰＳ細胞についてはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８およびＮｏｎｏｇの４因子の導入による樹立の報告がある（Yu J, et al: Science 318 (5858), 1917-1920, 2007）。ｃ－Ｍｙｃを除く３因子（Nakagawa M, et al: Nat. Biotechnol. 26 (1), 101-106, 2008）、Ｏｃｔ３／４およびＫｌｆ４の２因子（Kim J B, et al: Nature 454 (7204), 646-650, 2008）、或いはＯｃｔ３／４のみ（Kim J B, et al: Cell1 36 (3), 411-419, 2009）の導入によるｉＰＳ細胞の樹立も報告されている。また、遺伝子の発現産物であるタンパク質を細胞に導入する手法（Zhou H, Wu S, Joo JY, et al: Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009; Kim D, Kim CH, Moon JI, et al: Cell Stem Cell 4, 472-476, 2009）も報告されている。一方、ヒストンメチル基転移酵素Ｇ９ａに対する阻害剤ＢＩＸ－０１２９４やヒストン脱アセチル化酵素阻害剤バルプロ酸（ＶＰＡ）或いはＢａｙＫ８６４４等を使用することによって作製効率の向上や導入する因子の低減などが可能であるとの報告もある（Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (7), 795-797, 2008; Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (11), 1269-1275, 2008; Silva J, et al: PLoS. Biol. 6 (10), e 253, 2008）。遺伝子導入法についても検討が進められ、レトロウイルスの他、レンチウイルス（Yu J, et al: Science 318 (5858), 1917-1920, 2007）、アデノウイルス（Stadtfeld M, et al: Science 322 (5903), 945-949, 2008）、プラスミド（Okita K, et al: Science 322 (5903), 949-953, 2008）、トランスポゾンベクター（Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, et al: Nature 458, 766-770, 2009; Kaji K, Norrby K, Paca A, et al: Nature 458, 771-775, 2009; Yusa K, Rad R, Takeda J, et al: Nat Methods 6, 363-369, 2009）、或いはエピソーマルベクター（Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, et al: Science 324, 797-801, 2009）を遺伝子導入に利用した技術が開発されている。
　ｉＰＳ細胞への形質転換、即ち初期化（リプログラミング）が生じた細胞はＦｂｘｏ１５、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ／４、Ｆｇｆ－４、Ｅｓｇ－１およびＣｒｉｐｔ等の多能性幹細胞マーカー（未分化マーカー）の発現などを指標として選択することができる。選択された細胞をｉＰＳ細胞として回収する。
　ｉＰＳ細胞は、例えば、国立大学法人京都大学または独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターから提供を受けることもできる。
　本明細書において「分化誘導」とは、特定の細胞系譜に沿って分化するように働きかけることをいう。本発明では多能性幹細胞を腸管上皮細胞へと分化誘導する。本発明による腸管上皮細胞の製造方法は、大別して２段階の誘導工程、即ち、多能性幹細胞を腸管幹細胞へと分化させる工程（工程１）と、得られた腸管幹細胞を腸管上皮細胞へと分化させる工程（工程２）を含む。以下、各工程の詳細を説明する。
＜工程１：腸管幹細胞への分化＞
　工程１では多能性幹細胞を培養し、腸管幹細胞へと分化させる。換言すれば、腸管幹細胞への分化を誘導する条件下で多能性幹細胞を培養する。多能性幹細胞が腸管幹細胞へ分化する限り、培養条件は特に限定されない。典型的には、多能性幹細胞が内胚葉細胞を介して腸管幹細胞へと分化するように、以下で説明する２段階の分化誘導、即ち、多能性幹細胞の内胚葉細胞への分化（工程１－１）と、内胚葉細胞の腸管幹細胞への分化（工程１－２）を行う。
工程１－１：内胚葉細胞への分化
　この工程では多能性幹細胞を培養し、内胚葉細胞へと分化させる。換言すれば、内胚葉への分化を誘導する条件下で多能性幹細胞を培養する。多能性幹細胞が内胚葉細胞に分化する限り、培養条件は特に限定されない。例えば、常法に従い、アクチビンＡを添加した培地で培養する。この場合、培地中のアクチビンＡの濃度を例えば１０ｎｇ／ｍＬ～２００ ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０ ｎｇ／ｍＬ～１５０ ｎｇ／ｍＬとする。細胞の増殖率や維持等の観点から、培地に血清または血清代替物（ＫｎｏｃｋＯｕｔTMＳｅｒｕｍＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）など）を添加することが好ましい。血清はウシ胎仔血清に限られるものではなく、ヒト血清や羊血清等を用いることもできる。血清または血清代替物の添加量は例えば０．１％（ｖ／ｖ）～１０％（ｖ／ｖ）である。
　Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル経路の阻害剤（例えば、ヘキサクロロフェン、クエルセチン、ＷｎｔリガンドであるＷｎｔ３ａ）を培地に添加し、内胚葉細胞への分化の促進を図ってもよい。
　この工程は、国際公開第２０１４／１６５６６３号パンフレットに記載の方法またはそれに準じた方法で行うこともできる。
　工程１－１の期間（培養期間）は例えば１日間～１０日間、好ましくは２日間～７日間である。
工程１－２：腸管幹細胞への分化
　この工程では、工程１－１で得られた内胚葉細胞を培養し、腸管幹細胞へと分化させる。換言すれば、腸管幹細胞への分化を誘導する条件下で内胚葉細胞を培養する。内胚葉細胞が腸管幹細胞へと分化する限り、培養条件は特に限定されない。好ましくは、ＦＧＦ２の存在下、またはＧＳＫ－３β阻害剤の存在下で培養を行う。ＦＧＦ２としては好ましくはヒトＦＧＦ２（例えばヒト組換えＦＧＦ２）を用いる。
　典型的には、工程１－１を経て得られた細胞集団またはその一部を、選別することなく工程１－２に供する。一方で、工程１－１を経て得られた細胞集団の中から内胚葉細胞を選別した上で工程１－２を実施することにしてもよい。内胚葉細胞の選別は例えば、細胞表面マーカーを指標にしてフローサイトメーター（セルソーター）で行えばよい。
　「ＦＧＦ２の存在下」とは、ＦＧＦ２が培地中に添加された条件と同義である。従って、ＦＧＦ２の存在下での培養を行うためには、ＦＧＦ２が添加された培地を用いればよい。ＦＧＦ２の添加濃度の例を示すと１００ ｎｇ／ｍＬ～５００ ｎｇ／ｍＬである。
　同様に、「ＧＳＫ－３β阻害剤の存在下」とは、ＧＳＫ－３β阻害剤が培地中に添加された条件と同義である。従って、ＧＳＫ－３β阻害剤の存在下での培養を行うためには、ＦＧＦ２が添加された培地を用いればよい。ＧＳＫ－３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ２１６７６３、ＣＨＩＲ９８０１４、ＴＷＳ１１９、Ｔｉｄｅｇｌｕｓｉｂ、ＳＢ４１５２８６、ＢＩＯ、ＡＺＤ２８５８、ＡＺＤ１０８０、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＴＤＺＤ－８、ＬＹ２０９０３１４、ＩＭ－１２、Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ、Ｂｉｋｉｎｉｎ、１－Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅを例示することができる。ＧＳＫ－３β阻害剤の添加濃度の例（ＣＨＩＲ９９０２１の場合）を示すと１μｍｏｌ／Ｌ～１００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは３μｍｏｌ／Ｌ～３０μｍｏｌ／Ｌである。
　工程１－２の期間（培養期間）は例えば２日間～１０日間、好ましくは３日間～７日間である。培養期間が短すぎると、期待される効果（分化効率の上昇、腸管幹細胞としての機能の獲得の促進）が十分に得られない。他方、培養期間が長すぎると、分化効率の低下を引き起こす。
　腸管幹細胞へ分化したことは、例えば、腸管幹細胞マーカーの発現を指標にして判定ないし評価することができる。腸管幹細胞マーカーの例を挙げると、ロイシンリッチリピートを含むＧタンパク質共役受容体５（ＬＧＲ５）、エフリンＢ２受容体（ＥｐｈＢ２）である。
＜工程２：腸管上皮細胞への分化＞
　工程２では、ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤およびＴＧＦβ受容体阻害剤からなる群より選択される一以上とＥＧＦを併用し、工程１で得られた腸管幹細胞を腸管上皮細胞へと分化させる。「ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤およびＴＧＦβ受容体阻害剤からなる群より選択される一以上」としては、ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤およびＴＧＦβ受容体阻害剤のうちの一つ（即ち、ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤またはＴＧＦβ受容体阻害剤の何れか一）でもよいし、ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤およびＴＧＦβ受容体阻害剤のうちの二つ（即ち、ＭＥＫ１阻害剤とＤＮＡメチル化阻害剤の組み合わせ、ＭＥＫ１阻害剤とＴＧＦβ受容体阻害剤の組み合わせ、またはＤＮＡメチル化阻害剤またはＴＧＦβ受容体阻害剤の組み合わせ）でもよいし、ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤およびＴＧＦβ受容体阻害剤の全てでもよい。
　工程２は、ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＥＧＦおよびｃＡＭＰ活性化物質の存在下において工程１で得られた腸管幹細胞を腸管上皮細胞へと分化させる工程を含むことが特に好ましい。
　典型的には、工程１を経て得られた細胞集団またはその一部を、選別することなく工程２に供する。一方で、工程１を経て得られた細胞集団の中から腸管幹細胞を選別した上で工程２を実施することにしてもよい。腸管幹細胞の選別は例えば、細胞表面マーカーを指標にしてフローサイトメーター（セルソーター）で行えばよい。
　工程２は、１または２以上の培養によって構成される（詳細は後述する）。工程２を構成する各培養では、例えば、ＥＧＦおよびｃＡＭＰ活性化物質が必須の成分として添加された培地、ＥＧＦ、ｃＡＭＰ活性化物質、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＭＥＫ１阻害剤、およびＴＧＦβ受容体阻害剤が必須の成分として添加された培地、ＥＧＦが必須の成分として添加された培地、ＥＧＦおよびＲＯＣＫ阻害剤が必須の成分として添加された培地等が用いられる。
　ＭＥＫ１阻害剤として、ＰＤ９８０５９、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ１８４１６１、ＰＤ０３２５９０１、Ｕ０１２６、ＭＥＫｉｎｈｉｂｉｔｏｒＩ、ＭＥＫｉｎｈｉｂｉｔｏｒＩＩ、ＭＥＫ１／２ｉｎｈｉｂｉｔｏｒＩＩ、ＳＬ３２７を挙げることができる。
　ＤＮＡメチル化阻害剤として５－アザ－２’－デオキシシチジン（５－ａｚａ－２’ｄｃ）、５－アザシチジン、ＲＧ１０８、ゼブラリンを挙げることができる。
　ＴＧＦβ受容体阻害剤については、後述の実施例に使用したＡ８３０１がＴＧＦ－β受容体ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７に阻害活性を示すことを考慮すれば、好ましくは、ＴＧＦ－β受容体ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７の一以上に対して阻害活性を示すものを用いるとよい。例えば、Ａ８３０１、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ－５０５１２４、ＳＢ５２５３３４、Ｄ４４７６、ＡＬＫ５ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＬＹ２１５７２９９、ＬＹ３６４９４７、ＧＷ７８８３８８、ＲｅｐＳｏｘが上記条件を満たす。
　ｃＡＭＰ活性化物質としては、フォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）、インドメタシン、ＮＫＨ４７７（コルホルシンダロパート）、細胞由来毒素タンパク質（百日咳毒素、コレラ毒素）、ＰＡＣＡＰ－２７、ＰＡＣＡＰ－３８、ＳＫＦ８３８２２等を用いることができる。フォルスコリンはアデニル酸シクラーゼ活性化作用を示し、細胞内ｃＡＭＰの合成を促進する。
　ＭＥＫ１阻害剤の添加濃度の例（ＰＤ９８０５９の場合）を示すと４μｍｏｌ／Ｌ～１００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１０μｍｏｌ／Ｌ～４０μｍｏｌ／Ｌである。同様にＤＮＡメチル化阻害剤の添加濃度の例（５－アザ－２’－デオキシシチジンの場合）を示すと、１μｍｏｌ／Ｌ～２５μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは２．５μｍｏｌ／Ｌ～１０μｍｏｌ／Ｌであり、ＴＧＦβ受容体阻害剤の添加濃度の例（Ａ８３０１の場合）を示すと０．１μｍｏｌ／Ｌ～２．５μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．２μｍｏｌ／Ｌ～１μｍｏｌ／Ｌである。ＥＧＦの添加濃度の例は、５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬである。また、ｃＡＭＰ活性化物質の添加濃度の例（フォルスコリンの場合）を示すと、１μｍｏｌ／Ｌ～２００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは５μｍｏｌ／Ｌ～１００μｍｏｌ／Ｌである。尚、例示した化合物、即ち、ＰＤ９８０５９、５－アザ－２’－デオキシシチジン、Ａ８３０１およびフォルスコリンとは異なる化合物を使用する場合の添加濃度については、使用する化合物の特性と、例示した化合物（ＰＤ９８０５９、５－アザ－２’－デオキシシチジン、Ａ８３０１、フォルスコリン）の特性の相違（特に活性の相違）を考慮すれば、当業者であれば上記濃度範囲に準じて設定することができる。また、設定した濃度範囲が適切であるか否かは、後述の実施例に準じた予備実験によって確認することができる。
　工程２の期間（培養期間）は例えば７日間～４０日間、好ましくは１０日間～３０日間である。培養期間が短すぎると、期待される効果（分化効率の上昇、腸管上皮細胞としての機能の獲得の促進）が十分に得られない。他方、培養期間が長すぎると、分化効率の低下を引き起こす。
　腸管上皮細胞へ分化したことは、例えば、腸管上皮細胞マーカーの発現やペプチドの取り込み、或いはビタミンＤ受容体を介した薬物代謝酵素の発現誘導を指標にして判定ないし評価することができる。腸管上皮細胞マーカーの例を挙げると、ビリン１（Ｖｉｌｌｉｎ １）、ＣＤＸ２、腸特異的ホメオボックス（ＩＳＸ）、ＡＴＰ結合カセットトランスポーターＢ１／多剤耐性タンパク１（ＡＢＣＢ１／ＭＤＲ１）、ＡＴＰ結合カセットトランスポーターＧ２／乳ガン耐性タンパク（ＡＢＣＧ２／ＢＣＲＰ）、シトクロムＰ４５０３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）、脂肪酸結合タンパク２（ＦＡＢＰ）、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）、ＳＬＣ（ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ）ファミリーメンバー５Ａ１／ナトリウム共役型グルコーストランスポーター１（ＳＬＣ５Ａ１／ＳＧＬＴ１）、ＳＬＣ（ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ）ファミリーメンバー１５Ａ１／ペプチドトランスポーター１（ＳＬＣ１５Ａ１／ＰＥＰＴ１）、ＳＬＣ（ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ）有機アニオントランスポーター２Ｂ１（ＳＬＣＯ２Ｂ１／ＯＡＴＰ２Ｂ１）、スクラーゼ－イソマルターゼ、ウリジン２リン酸－グルクロン酸転移酵素１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）、ウリジン２リン酸－グルクロン酸転移酵素１Ａ４（ＵＧＴ１Ａ４）、カルボキシルエステラーゼ２Ａ１（ＣＥＳ２Ａ１）である。この中でも、ビリン１（Ｖｉｌｌｉｎ １）、ＣＤＸ２、腸特異的ホメオボックス（ＩＳＸ）は特に有効なマーカーである。
　目的の細胞（腸管上皮細胞）のみからなる細胞集団または目的の細胞が高比率（高純度）で含まれた細胞集団を得ようと思えば、目的の細胞に特徴的な細胞表面マーカーを指標にして培養後の細胞集団を選別・分取すればよい。
　好ましくは、工程２として、以下のＡ～Ｄのいずれかの培養工程を行う。
＜培養工程Ａ＞
　培養工程Ａでは、（ａ－１）ＥＧＦおよびｃＡＭＰ活性化物質の存在下での培養と、その後に行われる、（ａ－２）ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤およびＥＧＦの存在下での培養を行う。このように２段階の培養を行えば、腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果が期待できる。（ａ－１）の培養の期間は例えば２日間～１０日間、好ましくは４日間～８日間であり、（ａ－２）の培養の期間は例えば９日間～２９日間、好ましくは７日間～２７日間である。尚、特に説明しない事項（各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等）については、上記の対応する説明が援用される。
＜培養工程Ｂ＞
　培養工程Ｂでは、（ｂ－１）ＥＧＦの存在下での培養と、その後に行われる、（ｂ－２）ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＥＧＦおよびｃＡＭＰ活性化物質の存在下での培養を行う。このように２段階の培養を行えば、腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果が期待できる。（ｂ－１）の培養の期間は例えば２日間～１０日間、好ましくは４日間～８日間であり、（ｂ－２）の培養の期間は例えば９日間～１９日間、好ましくは７日間～１７日間である。尚、特に説明しない事項（各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等）については、上記の対応する説明が援用される。
　（ｂ－２）の培養の後に、ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤およびＥＧＦの存在下での培養（（ｂ－３）の培養）を行うことにしてもよい。この培養の期間は例えば１日間～１０日間とする。この培養を行うと腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果を期待できる。
＜培養工程Ｃ＞
　培養工程Ｃでは、（ｃ－１）ＥＧＦおよびｃＡＭＰ活性化物質の存在下での培養と、その後に行われる、（ｃ－２）ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＥＧＦおよびｃＡＭＰ活性化物質の存在下での培養を行う。このように２段階の培養を行えば、腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果が期待できる。（ｃ－１）の培養の期間は例えば２日間～１０日間、好ましくは４日間～８日間であり、（ｃ－２）の培養の期間は例えば９日間～１９日間、好ましくは７日間～１７日間である。尚、特に説明しない事項（各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等）については、上記の対応する説明が援用される。
　（ｃ－２）の培養の後に、ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤およびＥＧＦの存在下での培養（（ｃ－３）の培養）を行うことにしてもよい。この培養の期間は例えば１日間～１０日間とする。この培養を行うと腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果を期待できる。
＜培養工程Ｄ＞
　培養工程Ｄでは、（ｄ－１）ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＥＧＦおよびｃＡＭＰ活性化物質の存在下での培養を行う。この培養工程は、培養操作が簡便であること、腸管上皮細胞への分化に対してより効果的であること、化合物であるため安定した効果が期待できること等の点で特に有利である。（ｄ－１）の培養の期間は例えば１５日間～２５日間、好ましくは１７日間～２３日間である。尚、特に説明しない事項（各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等）については、上記の対応する説明が援用される。
　（ｄ－１）の培養の後に、ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤およびＥＧＦの存在下での培養（（ｄ－２）の培養）を行うことにしてもよい。この培養の期間は例えば１日間～１０日間とする。この培養を行うと腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果を期待できる。
　本発明を構成し得る各工程（工程１、工程１－１、工程１－２、工程２、工程ａ－１、工程ａ－２、工程ｂ－１、工程ｂ－２、工程ｂ－３、工程ｃ－１、工程ｃ－２、工程ｃ－３、工程ｄ－１、工程ｄ－２）において、途中で継代培養（再播種）を行ってもよい。
　例えばコンフルエントまたはサブコンフルエントになった際に細胞の一部を採取して別の培養容器に移し、培養を継続する。分化を促進するために細胞密度を低く設定することが好ましい。例えば１×１０4個／ｃｍ2～１×１０6個／ｃｍ2程度の細胞密度で細胞を播種するとよい。
　培地交換や継代培養などに伴う、細胞の回収の際には、細胞死を抑制するためにＹ－２７６３２等のＲＯＣＫ阻害剤で予め細胞を処理しておくとよい。従って、工程２の途中において、分化中の細胞を、一回以上再播種する際における、再播種の培地がＲＯＣＫ阻害剤を含む培地であることが好ましい。
　本発明においては、工程２の途中において、分化中の細胞を、以下のいずれかの時点で一回以上再播種する。
（ａ）多能性幹細胞の分化の開始後、１５日～２５日の時点（好ましくは１６日～２４日の時点であり、さらに好ましくは１７日～２３日の時点である。また、別の観点からは、好ましくは２１日～２５日の時点であり、より好ましくは２２日～２４日の時点であり、特に好ましくは２３日の時点である）；
（ｂ）工程２の開始後４日目以降、かつ工程２の終了より５日以上前の時点（好ましくは、工程２の開始後１０日目以降、かつ工程２の終了より５日以上前の時点、より好ましくは、
工程２の開始後１１日目以降、かつ工程２の終了より５日以上前の時点である）；
（ｃ）工程２の全体の期間の長さを１としたとき、工程２の開始後、０．２～０．７の長さの期間が経過した時点（好ましくは０．５～０．７の長さの期間が経過した時点、さらに好ましくは０．６の長さの期間が経過した時点である）；
（ｄ）工程２の開始後であって、成人腸における腸特異的ホメオボックスの発現量を１００とした時の、腸特異的ホメオボックスの相対発現量が、３００以下である時点（好ましくは２５０以下、さらに好ましくは２００以下の時点である）；
（ｅ）工程２の開始後であって、成人腸におけるＣＤＸ２の発現量を１００とした時の、ＣＤＸ２の相対発現量が、１５０以下である時点（好ましくは１３０以下、さらに好ましくは１１０以下の時点である）；または
（ｆ）工程２の開始後であって、成人腸におけるビリンの発現量を１００とした時の、ビリンの相対発現量が、１００以下である時点（好ましくは８５以下、さらに好ましくは７０以下の時点である）；
　工程２においては、細胞の再播種を多孔膜上に行うことが好ましい。細胞の再播種を多孔膜上に行うことにより、得られる小腸上皮細胞を用いて、小腸における薬物代謝および膜透過性をそのまま行うことができる。多孔膜とは、貫通した細孔のある膜をいう。多孔膜としては、例えば、孔径０．４～１．０μｍ程度の細孔を多数有するポリカーボネート膜やポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）膜などを使用することができる。
　本発明においては、工程１は、表面積が３０ｃｍ2以上の培養プレート上において行うことが好ましい。即ち、工程１の分化誘導操作は大型の培養容器またはディッシュを用いて行うことが好ましく、これにより操作の効率性の向上を図ることができる。また、腸管上皮細胞を用いて透過性試験を実施する場合には、セルカルチャーインサートという比較的小型の培養用容器に装着した多孔膜上に、腸管上皮細胞層を形成する必要があることから、工程２における再播種以降の培養を、１ウエルの表面積が３ｃｍ2以下の培養プレート上において（さらに好ましくは多孔膜上において）行うことが好ましい。
　本発明を構成する各工程における、その他の培養条件（培養温度など）は、動物細胞の培養において一般に採用されている条件とすればよい。即ち、例えば３７℃、５％ＣＯ2の環境下で培養すればよい。また、基本培地として、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（ＧＩＢＣＯ社等）、ハムＦ１２培地（ＨａｍＦ１２）（ＳＩＧＭＡ社、Ｇｉｂｃｏ社等）、ダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ－ＭＥＭ）（ナカライテスク株式会社、シグマ社、Ｇｉｂｃｏ社等）、グラスゴー基本培地（Ｇｉｂｃｏ社等）、ＲＰＭＩ１６４０培地等を用いることができる。二種以上の基本培地を併用することにしてもよい。工程（１－２）、工程（２）、工程（２）を構成する培養工程Ａ、培養工程Ｂ、培養工程Ｃ、培養工程Ｄにおいては、上皮細胞の培養に適した基本培地（例えばＤ－ＭＥＭとハムＦ１２培地の混合培地、Ｄ－ＭＥＭ）を用いることが好ましい。培地に添加可能な成分の例としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、抗生物質、２－メルカプトエタノール、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、インスリン、トランスフェリン、セレニウムを挙げることができる。典型的には培養皿などを用いて二次元的に細胞を培養する。本発明の方法によれば、二次元培養によって多能性幹細胞から腸管上皮細胞を得ることが可能となる。但し、ゲル状の培養基材あるいは三次元培養プレートなどを用いた三次元培養を実施することにしてもよい。
［腸管上皮細胞］
　本発明によれば、上記した本発明による腸管上皮細胞の製造方法で得られる腸管上皮細胞が提供される。本発明の腸管上皮細胞は、好ましくは、肝臓マーカーであるアルブミンの発現量が、Ｃａｃｏ－２細胞におけるアルブミンの発現量と同等以下である細胞である。
　本発明はさらに、本発明の方法で得られる腸管上皮細胞の用途に関する。第１の用途として各種アッセイが提供される。本発明の腸管上皮細胞は腸管、特に小腸のモデル系に利用可能であり、腸管、特に小腸での薬物動態（吸収、代謝など）の評価や毒性の評価に有用である。換言すれば、本発明の腸管上皮細胞は、化合物の体内動態の評価や毒性の評価にその利用が図られる。
　具体的には、本発明の腸管上皮細胞を用いて被検物質の吸収性ないし膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、毒性等を試験することができる。即ち、本発明は、腸管上皮細胞の用途の一つとして、被検物質の吸収性ないし膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、毒性等を評価する方法（第１の態様）を提供する。この方法では、（ｉ）本発明の製造方法で得られた腸管上皮細胞で構成された細胞層を用意する工程と、（ｉｉ）上記細胞層に被検物質を接触させる工程と、（ｉｉｉ）上記細胞層を透過した被検物質を定量し、被検物質の吸収性ないし膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、または毒性を評価する工程を行う。尚、被検物質の吸収性については、後述の方法（第２の態様）でも評価することができる。
　工程（ｉ）では、典型的には、半透過性膜（多孔性膜）の上で腸管上皮細胞を培養し、細胞層を形成させる。具体的には、例えば、セルカルチャーインサートを備えた培養容器（例えば、コーニング社が提供するトランスウェル（登録商標））を使用し、セルカルチャーインサート内に細胞を播種して培養することにより、腸管上皮細胞で構成された細胞層を得る。
　セルカルチャーインサートとは、細胞、器官または組織の培養に用いられる透過性メンブレンを備えた培養容器であり、主にウェルプレートと組み合わせて用いられる。セルカルチャーインサートにおいて細胞、器官または組織を培養することにより、培地に含まれる成分が器官や組織の上面および底面にゆきわたらせることができ、生体内に近い条件で培養を行うことができる。
　工程（ｉｉ）での「接触」は、典型的には、培地に被検物質を添加することによって行われる。被検物質の添加のタイミングは特に限定されない。従って、被検物質を含まない培地で培養を開始した後、ある時点で被検物質を添加することにしても、予め被検物質を含む培地で培養を開始することにしてもよい。
　被検物質には様々な分子サイズの有機化合物または無機化合物を用いることができる。有機化合物の例として核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド、ポリフェノール、カテキン、ビタミン（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ９、Ｂ１２、Ｃ、Ａ、Ｄ、Ｅ等）を例示できる。医薬品、栄養食品、食品添加物、農薬、香粧品（化粧品）等の既存成分或いは候補成分も好ましい被検物質の一つである。植物抽出液、細胞抽出液、培養上清などを被検物質として用いてもよい。２種類以上の被検物質を同時に添加することにより、被検物質間の相互作用、相乗作用などを調べることにしてもよい。被検物質は天然物由来であっても、あるいは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なアッセイ系を構築することができる。
　被検物質を接触させる期間は任意に設定可能である。接触期間は例えば１０分間～３日間、好ましくは１時間～１日間である。接触を複数回に分けて行うことにしてもよい。
　工程（ｉｉｉ）では、細胞層を透過した被検物質を定量する。例えば、トランスウェル（登録商標）のようなセルカルチャーインサートを備えた培養容器を使用した場合には、セルカルチャーインサートを透過した被検物質、即ち、細胞層を介して上部もしくは下部容器内に移動した被検物質を、被検物質に応じて、質量分析、液体クロマトグラフィー、免疫学的手法（例えば蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法：ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法：ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）等の測定方法で定量する。定量結果（細胞層を透過した被検物質の量）と被検物質の使用量（典型的には培地への添加量）に基づき、被検物質の吸収性ないし膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、または毒性を判定・評価する。
　本発明は別の態様（第２の態様）として、被検物質の代謝または吸収を評価する方法も提供する。この方法では、（Ｉ）本発明の分化誘導方法で得られた腸管上皮細胞に被検物質を接触させる工程と、（ＩＩ）被検物質の代謝若しくは吸収、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、または毒性を測定・評価する工程を行う。
　工程（Ｉ）、即ち腸管上皮細胞と被検物質の接触は、上記工程（ｉｉ）と同様に実施することができる。但し、予め細胞層を形成させることは必須ではない。
　工程（Ｉ）の後、被検物質の代謝若しくは吸収、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、または毒性を測定・評価する（工程（ＩＩ））。工程（Ｉ）の直後、即ち、被検物質の接触の後、実質的な時間間隔を置かずに代謝等を測定・評価しても、或いは、一定の時間（例えば１０分～５時間）を経過した後に代謝等を測定・評価することにしてもよい。代謝の測定は、例えば、代謝産物の検出によって行うことができる。この場合には、通常、工程（Ｉ）後の培養液をサンプルとして、予想される代謝産物を定性的または定量的に測定する。測定方法は代謝産物に応じて適切なものを選択すればよいが、例えば、質量分析、液体クロマトグラフィー、免疫学的手法（例えば蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法））等を採用可能である。
　典型的には、被検物質の代謝産物が検出されたとき、「被検物質が代謝された」と判定ないし評価する。また、代謝産物の量に応じて被検物質の代謝量を評価することができる。代謝産物の検出結果と、被検物質の使用量（典型的には培地への添加量）に基づき、被検物質の代謝効率を算出することにしてもよい。
　腸管上皮細胞における薬物代謝酵素（シトクロムＰ４５０（特にＣＹＰ３Ａ４）、ウリジン２リン酸－グルクロン酸転移酵素（特にＵＧＴ１Ａ８、ＵＧＴ１Ａ１０）、硫酸転移酵素（特にＳＵＬＴ１Ａ３など））の発現を指標として被検物質の代謝を測定することも可能である。薬物代謝酵素の発現はｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで評価することができる。例えば、薬物代謝酵素のｍＲＮＡレベルに上昇を認めたとき、「被検物質が代謝された」と判定することができる。同様に、薬物代謝酵素の活性に上昇を認めたとき、「被検物質が代謝された」と判定することができる。代謝産物を指標として判定する場合と同様に、薬物代謝酵素の発現量に基づいて定量的な判定・評価を行うことにしてもよい。
　被検物質の吸収を評価するためには、例えば、培養液中の被検物質の残存量を測定する。通常、工程（Ｉ）後の培養液をサンプルとして被検物質を定量する。測定方法は被検物質に応じて適切なものを選択すればよい。例えば、質量分析、液体クロマトグラフィー、免疫学的手法（例えば蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法））等を採用可能である。典型的には、培養液中の被検物質の含有量の低下を認めたとき、「被検物質が吸収された」と判定・評価する。また、低下の程度に応じて被検物質の吸収量ないし吸収効率を判定・評価することができる。尚、細胞内に取り込まれた被検物質の量を測定することによっても、吸収の評価は可能である。
　尚、代謝の測定・評価と吸収の測定・評価を同時にまたは並行して行うことにしてもよい。
　本発明の分化誘導方法で調製した腸管上皮細胞の第２の用途として腸管上皮細胞を含有する細胞製剤が提供される。本発明の細胞製剤は各種腸疾患の治療に適用可能である。特に、障害された（機能不全を含む）腸管上皮組織の再生・再建用の材料としての利用が想定される。即ち、再生医療への貢献を期待できる。本発明の細胞製剤は、例えば、本発明の方法によって得られた腸管上皮細胞を生理食塩水や緩衝液（例えばリン酸系緩衝液）等に懸濁すること、或いは腸管上皮細胞を用いて三次元組織体（オルガノイドやスフェロイド）を作製することによって調製することができる。治療上有効量の細胞を投与できるように、一回投与分の量として例えば１×１０5個～１×１０10個の細胞を含有させるとよい。細胞の含有量は、使用目的、対象疾患、適用対象（レシピエント）の性別、年齢、体重、患部の状態、細胞の状態などを考慮して適宜調整することができる。
　細胞の保護を目的としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）や血清アルブミン等を、細菌の混入を阻止することを目的として抗生物質等を、細胞の活性化、増殖または分化誘導などを目的として各種の成分（ビタミン類、サイトカイン、成長因子、ステロイド等）を本発明の細胞製剤に含有させてもよい。さらに、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を本発明の細胞製剤に含有させてもよい。
　以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
＜ヒトｉＰＳ細胞の培養＞
　ヒトｉＰＳ細胞（ＦＦ－１）はマトリゲル（登録商標）コートしたディッシュ上に播種し、５％　Ｏ2条件下ＣＯ2インキュベーター中３７℃にて培養した。ヒトｉＰＳ細胞（ＦＦ－１）の継代は３～５日培養後、１：３～１：１０のスプリット比で行った。継代後４８時間は培地を交換せず、それ以降は毎日交換した。ヒトｉＰＳ細胞（ＦＦ－１）はセルラー・ダイナミクス・インターナショナルから入手したものである。
＜ヒトｉＰＳ細胞の腸管上皮細胞への分化誘導＞
　比較例１～３、実施例１～４の分化培養方法の概要を図１に示す。
　　図１において、符号および略号は以下を示す。
培養条件１：
Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａを含むＲＰＭＩ １６４０培地およびＢＭＰ４，　ＶＥＧＦ，　ＦＧＦ２，　ＥＧＦを含むＲＰＭＩ １６４０培地
培養条件２：
２％　ＦＢＳ，　１％　Ｇｌｕｔａｍａｘ，　２５０　ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ２を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２
培養条件３：
２％ ＦＢＳ、１％ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ ＮＥＡＡ、２％ Ｂ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１％ Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１００ユニット／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２０ ｎｇ／ｍＬ上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２
培養条件４：
２０ ｎｇ／ｍＬ　ＥＧＦを含むＡｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｔｈｅｒｍｏ　ｆｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
Ｙ：　Ｙ－２７６３２
Ｆ：　Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ
ａ：　５－アザ－２’－デオキシシチジン（５－ａｚａ－２’ｄｃ）
Ｐ：　ＰＤ９８０５９
Ａ：　Ａ８３０１
　比較例１では、Ｄａｙ１１に再播種した。
　比較例２および３では、Ｄａｙ１１およびＤａｙ２９に再播種した。
　実施例１および２では、Ｄａｙ１１およびＤａｙ１７に再播種した。
　実施例３および４では、Ｄａｙ１１およびＤａｙ２３に再播種した。
＜比較例１＞
　ヒトｉＰＳ細胞（ＦＦ－１）を、Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａ存在下での培養およびＢＭＰ４，　ＶＥＧＦ，　ＦＧＦ２，　ＥＧＦ存在下での培養、合計で７日間（０日目～７日目）培養し、さらに、２％ＦＢＳ、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、２５０ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ２を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２で４日間（７日目～１１日目）の培養を行い、腸管幹細胞へ分化誘導した。
　その後、Ｙ－２７６３２（Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤）を１０μｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、ＣＯ2インキュベーター中３７℃にて６０分間処理した細胞をアクターゼにて剥離し、あらかじめマトリゲルにてコートした細胞培養用ウェルプレート（表面積は、５５ｃｍ2）に播種した。
　その後、２％ ＦＢＳ、１％ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ ＮＥＡＡ、２％ Ｂ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１％ Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１００ユニット／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２０ ｎｇ／ｍＬ上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、１０μｍｏｌ／Ｌ Ｙ－２７６３２を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２で１日間（１１日目～１２日目）、２％ ＦＢＳ、１％ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ ＮＥＡＡ、２％ Ｂ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１％ Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１００ユニット／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２０ ｎｇ／ｍＬ上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、３０μｍｏｌ／Ｌ　Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎを含むＡｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２で６日間（１２日目～１８日目）、さらに５μｍｏｌ／Ｌ　５－ａｚａ－２’ｄｃ、２０μｍｏｌ／Ｌ　ＰＤ９８０５９、０．５μｍｏｌ／Ｌ　Ａ８３０１を上記培地に添加して１２日間（１８日目～３０日目）培養し、腸管上皮細胞を得た。
＜比較例２＞
　ヒトｉＰＳ細胞（ＦＦ－１）を、比較例１と同様の条件で１１日間培養し、腸管幹細胞へ分化誘導した。比較例１と同様の条件で細胞を剥離、播種した。
　その後、比較例１と同様の条件で１日間（１１日目～１２日目）、６日間（１２日目～１８日目）、さらに比較例１と同様５－ａｚａ－２’ｄｃ、ＰＤ９８０５９、Ａ８３０１を添加して１１日間（１８日目～２９日目）培養した後、細胞を培養容器からアクターゼで剥離し、セルカルチャーインサート上の多孔膜（表面積は、０．３３ｃｍ2）に再播種した。
　再播種後、２０ ｎｇ／ｍＬ　ＥＧＦを含むＡｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２　で１日間（２９日目～３０日目）、２０ ｎｇ／ｍＬ　ＥＧＦ、３０μｍｏｌ／Ｌ　Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ、５μｍｏｌ／Ｌ　５－ａｚａ－２’ｄｃ、２０μｍｏｌ／Ｌ　ＰＤ９８０５９、０．５μｍｏｌ／Ｌ　Ａ８３０１を含むＡｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２で４日間（３０日目～３４日目）培養し、腸管上皮細胞を得た。
＜比較例３＞
　再播種当日（２９日目）にＹ－２７６３２を１０μｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、ＣＯ2インキュベーター中３７℃にて６０分間処理した細胞をアクターゼで剥離し、セルカルチャーインサート上の多孔膜（表面積は、０．３３ｃｍ2）に再播種した。翌日の培地交換まで１日間Ｙ－２７６３２を添加した。それ以外は比較例２と同様に培養し、腸管上皮細胞を得た。
＜実施例１＞
　ヒトｉＰＳ細胞（ＦＦ－１）を、比較例１と同様の条件で１１日間培養し、腸管幹細胞へ分化誘導した。比較例１と同様の条件で細胞を剥離、播種した。
　その後、比較例１と同様の条件で１日間（１１日目～１２日目）、５日間（１２日目～１７日目）培養した後、細胞を培養容器からアクターゼで剥離し、セルカルチャーインサート上の多孔膜（表面積は、０．３３ｃｍ2）に再播種した。
　再播種後、２０ ｎｇ／ｍＬ　ＥＧＦを含むＡｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２で１日間（１７日目～１８日目）、２０ ｎｇ／ｍＬ　ＥＧＦ、３０μｍｏｌ／Ｌ　Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ、５μｍｏｌ／Ｌ　５－ａｚａ－２’ｄｃ、２０μｍｏｌ／Ｌ　ＰＤ９８０５９、０．５μｍｏｌ／Ｌ　Ａ８３０１を含むＡｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２で１２日間（１８日目～３０日目）培養し、腸管上皮細胞を得た。
＜実施例２＞
　再播種当日（１７日目）にＹ－２７６３２を１０μｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、ＣＯ2インキュベーター中３７℃にて６０分間処理した細胞をアクターゼで剥離し、セルカルチャーインサート上の多孔膜（表面積は、０．３３ｃｍ2）に再播種した。翌日の培地交換まで１日間Ｙ－２７６３２を添加した。それ以外は実施例１と同様に培養し、腸管上皮細胞を得た。
＜実施例３＞
　ヒトｉＰＳ細胞（ＦＦ－１）を、比較例１と同様の条件で１１日間培養し、腸管幹細胞へ分化誘導した。比較例１と同様の条件で細胞を剥離、播種した。
　その後、比較例１と同様の条件で１日間（１１日目～１２日目）、６日間（１２日目～１８日目）、さらに比較例１と同様５－ａｚａ－２’ｄｃ、ＰＤ９８０５９、Ａ８３０１を添加して５日間（１８日目～２３日目）培養した後、細胞を培養容器からアクターゼで剥離し、セルカルチャーインサート上の多孔膜（表面積は、０．３３ｃｍ2）に再播種した。
　再播種後、２０ ｎｇ／ｍＬ　ＥＧＦを含むＡｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２で１日間（２３日目～２４日目）２０ ｎｇ／ｍＬ　ＥＧＦ、３０μｍｏｌ／Ｌ　Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ、５μｍｏｌ／Ｌ　５－ａｚａ－２’ｄｃ、２０μｍｏｌ／Ｌ　ＰＤ９８０５９、０．５μｍｏｌ／Ｌ　Ａ８３０１を含むＡｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２で６日間（２４日目～３０日目）培養し、腸管上皮細胞を得た。
＜実施例４＞
　再播種当日（２３日目）にＹ－２７６３２を１０μｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、ＣＯ2インキュベーター中３７℃にて６０分間処理した細胞をアクターゼで剥離し、セルカルチャーインサート上の多孔膜（表面積は、０．３３ｃｍ2）に再播種した。翌日の培地交換まで１日間Ｙ－２７６３２を添加した。それ以外は実施例１と同様に培養し、腸管上皮細胞を得た。
＜試験例１＞
　比較例１～３および実施例１～４で得た腸管上皮細胞のＣＹＰ３Ａ４活性をミダゾラムの代謝産物の量から測定した。分化誘導終了後、５μｍｏｌ／Ｌミダゾラムを含む培地で３７℃にてインキュベーションし、２時間経過後、培地をサンプリングした。代謝活性は、液体クロマトグラフィー－マススペクトロメーター（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を用いて測定した培地中の１－水酸化ミダゾラムの量より算出した。代謝実験終了後、タンパク定量を行い、代謝活性をタンパク量で補正した。結果を表１に示す。
　比較例１に対し、実施例１、２、４は同等のＣＹＰ３Ａ４活性を示した。実施例３はＣＹＰ３Ａ４活性がわずかに低下したが、実用上は問題ない水準であった。
＜試験例２＞
　それぞれの試験群における再播種日でＴｒａｎｓｗｅｌｌに細胞を播種し、試験終了日まで培養した細胞のバリア機能（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ＴＥＥＲ）を測定した。ＴＥＥＲはＥＶＯＭ2（登録商標）Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　Ｖｏｌｔ／Ｏｈｍ　（ＴＥＥＲ）　Ｍｅｔｅｒ（ＷＯＲＬＤ　ＰＲＥＣＩＳＩＯＮ　ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ）を用いて測定した。操作はマニュアルに従った。結果を表２に示す。
　実施例１～４は、比較例１と同様の十分なバリア機能（２００Ω・ｃｍ２以上）を示したが、比較例２および３ではバリア機能が消失していた。
＜試験例３＞
　試験例２でバリア機能が保たれていた比較例１、実施例１～４の腸管上皮細胞から試験終了日に、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを抽出した。操作は、添付マニュアルに従った。逆転写反応として、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成は、Ｈｉｇｈ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ　Ｋｉｔ（ａｐｐｌｉｅｄ　ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。操作は添付マニュアルに従った。
　リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＲＴ－ＰＣＲ）は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ａｐｐｌｉｅｄ　ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ｃＤＮＡを鋳型にして行った。操作はマニュアルに従った。内在性コントロールとしてリボソームの１８Ｓを用い、測定結果を補正した。種々の遺伝子のプローブを用いてｍＲＮＡの発現量を見積もった。結果を表３に示す。表３における数値は、　小腸マーカーについては、Ａｄｕｌｔ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅにおける発現量を１００としたときの相対発現量を、肝臓マーカーについては、Ｃａｃｏ－２における発現量を１００としたときの相対発現量を示す。
　比較例１、実施例１～４いずれも、小腸マーカーＶｉｌｌｉｎ１、ＣＤＸ２、ＩＳＸの発現が確認された。さらに、実施例１～４では、肝臓マーカーであるＡＬＢ（ａｌｂｕｍｅｎ）、ＡＦＰ（α－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）の発現量が比較例１に比べて低下した。特に実施例３および４では、ＡＬＢおよびＡＦＰの発現量の低下が顕著であった。
＜試験例４＞
　比較例１と同様の条件で、ヒトｉＰＳ細胞（ＦＦ－１）の培養および分化誘導を行った。培養および分化誘導は４群に分けて開始し、Ｄａｙ１１，Ｄａｙ２０，Ｄａｙ２５，Ｄａｙ３０の時点で、１群ずつ試験例３と同様の試験に供し、小腸マーカーＶｉｌｌｉｎ１、ＣＤＸ２、ＩＳＸの発現を調べた。結果を図２に示す。図２における数値は、Ａｄｕｌｔ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅにおける発現量を１００としたときの相対発現量を示す。
　小腸マーカーの発現量がＤａｙ２５から急激に増加する（＝腸管上皮細胞への分化が急激に進む）ことが分かった。試験例２の結果と合わせて考えると、腸管上皮細胞のバリア機能に悪影響を与えないためには、小腸マーカー発現がＤａｙ２５前後の量の時に、再播種操作を行うことが望ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003

Claims (9)

  1. 多能性幹細胞を腸管幹細胞へと分化させる工程１、およびＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤およびＴＧＦβ受容体阻害剤からなる群より選択される一以上とＥＧＦとの存在下において工程１で得られた腸管幹細胞を腸管上皮細胞へと分化させる工程２を含む、腸管上皮細胞の製造方法であって、工程２の途中において、分化中の細胞を、以下のいずれかの時点で一回以上再播種する、前記方法。
    （ａ）多能性幹細胞の分化の開始後、１５日～２５日の時点；
    （ｂ）工程２の開始後４日目以降、かつ工程２の終了より５日以上前の時点；
    （ｃ）工程２の全体の期間の長さを１としたとき、工程２の開始後、０．２～０．７の長さの期間が経過した時点；
    （ｄ）工程２の開始後であって、成人腸における腸特異的ホメオボックスの発現量を１００とした時の、腸特異的ホメオボックスの相対発現量が、３００以下である時点；
    （ｅ）工程２の開始後であって、成人腸におけるＣＤＸ２の発現量を１００とした時の、ＣＤＸ２の相対発現量が、１５０以下である時点；または
    （ｆ）工程２の開始後であって、成人腸におけるビリンの発現量を１００とした時の、ビリンの相対発現量が、１００以下である時点：
  2. 工程２の途中において、分化中の細胞を、以下のいずれかの時点で一回以上再播種する、請求項１に記載の方法。
    （ａ）多能性幹細胞の分化の開始後、２１日～２５日の時点；
    （ｂ）工程２の開始後１０日目以降、かつ工程２の終了より５日以上前の時点；
    （ｃ）工程２の全体の期間の長さを１としたとき、工程２の開始後の０．５～０．７の長さの期間が経過した時点；
    （ｄ）工程２の開始後であって、成人腸における腸特異的ホメオボックスの発現量を１００とした時の、腸特異的ホメオボックスの相対発現量が、３００以下である時点；
    （ｅ）工程２の開始後であって、成人腸におけるＣＤＸ２の発現量を１００とした時の、ＣＤＸ２の相対発現量が、１５０以下である時点；または
    （ｆ）工程２の開始後であって、成人腸におけるビリンの発現量を１００とした時の、ビリンの相対発現量が、１００以下である時点：
  3. 工程２の途中において、分化中の細胞を、一回以上再播種する際における、再播種の培地がＲＯＣＫ阻害剤を含む培地である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 工程２が、ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＥＧＦおよびｃＡＭＰ活性化物質の存在下において工程１で得られた腸管幹細胞を腸管上皮細胞へと分化させる工程を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 工程２において、細胞の再播種を多孔膜上に行う、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 工程１を、表面積が３０ｃｍ2以上の培養プレート上において行う、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 工程２における再播種以降の培養を、１ウエルの表面積が３ｃｍ2以下の培養プレート上において行う、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 請求項１から７の何れか一項に記載の方法で得られる腸管上皮細胞。
  9. 肝臓マーカーであるアルブミンの発現量が、Ｃａｃｏ－２細胞におけるアルブミンの発現量と同等以下である、請求項８に記載の腸管上皮細胞。
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