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WO2020059365A1 - 三次元培養法、三次元培養構造体、および三次元培養構造体の製造方法 - Google Patents

三次元培養法、三次元培養構造体、および三次元培養構造体の製造方法 Download PDF

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WO2020059365A1
WO2020059365A1 PCT/JP2019/031657 JP2019031657W WO2020059365A1 WO 2020059365 A1 WO2020059365 A1 WO 2020059365A1 JP 2019031657 W JP2019031657 W JP 2019031657W WO 2020059365 A1 WO2020059365 A1 WO 2020059365A1
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WO
WIPO (PCT)
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dimensional culture
culture method
solid surface
cells
droplet
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2019/031657
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English (en)
French (fr)
Inventor
登喜生 田口
芝井　康博
光晃 杉根
勲 竹林
優子 杉本
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sharp Corp
Tottori Institute of Industrial Technology
Original Assignee
Sharp Corp
Tottori Institute of Industrial Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to US17/051,461 priority patent/US20210363482A1/en
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/01—Drops
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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    • C12M25/06—Plates; Walls; Drawers; Multilayer plates
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2525/00—Culture process characterised by gravity, e.g. microgravity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2535/00—Supports or coatings for cell culture characterised by topography

Definitions

  • the present invention relates to a three-dimensional cell culture method (hereinafter, referred to as “three-dimensional culture method”), a structure used for three-dimensional culture (including a container), and a method for producing a three-dimensional culture structure.
  • a three-dimensional cell culture method (hereinafter, referred to as a “three-dimensional culture method”) has attracted attention as a technology indispensable for drug discovery and regenerative medicine (eg, Patent Documents 1 to 4, Non-Patent Documents 1 to 4). 3).
  • the three-dimensional culture method is a method of culturing cells in vitro, in which cells are three-dimensionally interacting with each other, and can obtain spheroids that well reflect the properties of cells in vivo.
  • spheroids obtained by the three-dimensional culture method can express the properties and functions of the living tissue from which the cultured cells are derived, in a manner closer to the living body, than the cells obtained by the two-dimensional culture method .
  • tissue reproducibility such a property possessed by spheroids
  • a protein produced by gene expression in a cell functions physiologically in a form similar to a living body, and the tissue reproducibility is high. .
  • a culture method using a surface having a fine uneven structure is described in Patent Literatures 1 to 3 and Non-Patent Literature 1, for example.
  • a cell suspension containing cells and a medium here, a culture solution or a liquid medium
  • a cell suspension is prepared.
  • the culture is performed in a state where the part is adhered to the bottom of the container in the liquid.
  • the culture methods described in Patent Literatures 1 to 3 and Non-Patent Literature 1 are referred to as “microadhesive three-dimensional culture method”.
  • the above-described conventional three-dimensional culture method has room for improvement in workability or mass productivity. Further, development of a three-dimensional culture method capable of obtaining spheroids with further improved tissue reproducibility has been desired.
  • the fine uneven structure on the bottom acts as a cell scaffold. If the interaction between the concave and convex structure on the bottom surface and the cells is stronger than the interaction between the cells, the cells cannot grow sufficiently in the thickness direction, and the growth in the in-plane direction becomes dominant. May not be able to adequately reproduce a simple tissue structure.
  • contact and adhesion between cells are repeated while the cells randomly migrate in the in-plane direction, and spheroids are formed with cell division, so the number of cells constituting the spheroids is reduced. However, there is a problem that the reproducibility of the shape and size of the spheroid is low.
  • the hanging drop method has the advantage that the number of cells is easy to control because the culture is performed in droplets, and the shape and size of the spheroids are highly reproducible. However, since there is no surface serving as a scaffold for cells in the droplet, viability may not be maintained in cell types highly dependent on scaffold. In addition, the hanging drop method has a problem that the workability is low because the surface on which the droplets are attached faces downward (orients in the direction of gravity).
  • tissue reproducibility of spheroids obtained by any of the three-dimensional culture methods described above is higher than the tissue reproducibility of spheroids obtained by two-dimensional culture (planar culture method), further improvement is required. ing.
  • an embodiment of the present invention provides a three-dimensional culture method that is superior in workability or mass productivity and / or can obtain spheroids with high tissue reproducibility, compared to the conventional three-dimensional culture method. With the goal. Further, another embodiment of the present invention aims to provide a three-dimensional culture structure suitably used for such a three-dimensional culture method and / or a method for producing the three-dimensional culture structure.
  • a step of preparing a cell suspension containing cells and a medium a step of preparing a solid surface having a plurality of convex portions having a height of 10 nm or more and 1 mm or less, and forming the cell suspension on the solid surface.
  • a three-dimensional culture method comprising: attaching a droplet; and culturing the cells in the droplet with the direction of gravity acting on the droplet facing the solid surface.
  • Item 14 The three-dimensional culture method according to Item 13, further comprising a step of sucking a part of the medium from the droplet before applying the medium.
  • the three-dimensional culture structure is provided as a part of the container.
  • ⁇ Spheroids cultured using the three-dimensional culture method according to any one of items 1 to 14 can be provided together with a three-dimensional culture structure (for example, a container).
  • a three-dimensional culture method which is superior in workability or mass productivity and / or can obtain spheroids having high tissue reproducibility as compared with the conventional three-dimensional culture method.
  • a three-dimensional culture structure suitably used in such a three-dimensional culture method.
  • a three-dimensional culture structure for example, a container having spheroids on the surface with higher tissue reproducibility than before.
  • FIG. 5 is a schematic cross-sectional view of a synthetic polymer film 34A having a moth-eye structure on a surface used in a three-dimensional culture method according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a schematic cross-sectional view of a synthetic polymer film 34B having a moth-eye structure on a surface used in a three-dimensional culture method according to an embodiment of the present invention.
  • An optical microscope image (left) as a result of drop culture of a human liver cancer-derived cell line HepG2 and an optical microscope image (right) as a result of planar culture.
  • a droplet 16D of a cell suspension containing cells 12C and a medium 14M is attached to a solid surface 10S,
  • the cells 12C are cultured in the droplet 16D with the direction of gravity acting on 16D directed toward the solid surface 10S.
  • the drop culture method the cells 12C are cultured in the droplets 16D. Therefore, similarly to the hanging drop method, the number of cells can be easily controlled, and the shape and shape of the spheroids can be improved. The advantage of high reproducibility of the size is obtained.
  • the solid surface 10S acts as a scaffold. Survivability can be maintained. Further, since it is not necessary to turn the surface 10S to which the droplet 16D is attached downward (orient it in the direction of gravity), the workability is higher than that of the hanging drop method.
  • the solid surface 10S has a plurality of protrusions 10Sp that can act as a scaffold.
  • the droplet 16D is in contact with the atmospheric gas (for example, air) except for the portion that contacts the solid surface 10S, and forms a closed culture space.
  • FIG. 1 shows that the bottom surface of the droplet 16D contacts the tip of the projection 10Sp and the droplet 16D exists only above the tip of the projection 10Sp, the droplet 16D May partly intrude between the adjacent protrusions 10Sp.
  • the volume of the droplet 16D is, for example, 10 ⁇ L or more and 50 ⁇ L or less.
  • the solid surface 10S on which stable droplets 16D can be formed and cells can be efficiently cultured is a solid surface having a plurality of convex portions 10Sp having a height of 10 nm or more and 1 mm or less, as shown in the experimental results later.
  • Patent Document 1 registered as Patent No. 4507845
  • three-dimensional culture can be performed by using a solid surface having a plurality of convex portions having a height of 10 nm or more and 1 mm or less.
  • the microadhesive three-dimensional culture method using the fine uneven structure on the bottom surface cannot sufficiently reproduce the three-dimensional tissue structure, or the reproducibility of the shape and size of the spheroid is low. There is.
  • the above-mentioned disadvantages of the microadhesive three-dimensional culture method can be solved.
  • the cells 12C collect under the action of gravity in the three-dimensionally closed droplet 16D so as to deposit on the bottom surface in contact with the solid surface 10S. Therefore, there is a certain amount of cells interacting with the plurality of projections 10Sp of the solid surface 10S, and there are cells interacting only between the cells on the fixed amount.
  • spheroids that proliferate appropriately in the thickness direction and have high reproducibility of three-dimensional tissue structure can be obtained.
  • a three-dimensional culture method (drop culture method) according to an embodiment of the present invention will be described with reference to an experimental example using a solid surface 10S having a moth-eye structure.
  • a solid surface having a moth-eye structure which one of the present applicants has developed as an antireflection film or a synthetic polymer film having bactericidal properties, is suitably used for the drop culture method.
  • Patent Documents 5 to 8 antireflection film
  • Patent Document 9 synthetic polymer film having bactericidal properties
  • a synthetic polymer film having a moth-eye structure on the surface (for example, formed by curing a photocurable resin) can be produced with high mass productivity. And the like, and a thermosetting resin film formed by curing a thermosetting resin).
  • the following experimental examples are examples using a photocurable resin film having a moth-eye structure formed on the surface by the above-described method, and have the features described in the above items 2 to 9.
  • the size and height of a plurality of protrusions and the distance between adjacent protrusions (pitch when regularly arranged) are not limited to these. Conceivable.
  • the material forming the moth-eye structure may be either an organic material or an inorganic material.
  • the synthetic polymer films 34A and 34B are examples of a three-dimensional culture structure according to an embodiment of the present invention.
  • FIGS. 2A and 2B are schematic cross-sectional views of the synthetic polymer films 34A and 34B, respectively.
  • the synthetic polymer films 34A and 34B exemplified here are formed on the base films 42A and 42B, respectively, but are not limited thereto.
  • the synthetic polymer films 34A and 34B can be formed directly on the surface of any object.
  • the film 50A shown in FIG. 2A has a base film 42A and a synthetic polymer film 34A formed on the base film 42A.
  • the synthetic polymer film 34A has a plurality of protrusions 34Ap on the surface, and the plurality of protrusions 34Ap form a moth-eye structure.
  • 2-dimensional size D p of the convex portion 34Ap is in the range of 10nm or more 500nm or less.
  • the “two-dimensional size” of the convex portion 34Ap refers to the area circle equivalent diameter of the convex portion 34Ap when viewed from the surface normal.
  • the two-dimensional size of the protrusion 34Ap corresponds to the diameter of the bottom surface of the cone.
  • a typical distance D int between adjacent protrusions 34Ap is 10 nm or more and 1000 nm or less.
  • the protrusions 34Ap 2-dimensional size D p is equal to the distance between adjacent D int.
  • Typical height D h of the convex portion 34Ap is 10nm or more 500nm or less.
  • the thickness t s of the synthetic polymer film 34A be greater than the height D h of the convex portion 34Ap.
  • the synthetic polymer film 34A shown in FIG. 2A has the same moth-eye structure as the antireflection films described in Patent Documents 5 to 8. In order to exhibit the anti-reflection function, it is preferable that the surface does not have a flat portion and the protrusions 34Ap are densely arranged.
  • the convex portion 34Ap has a shape in which a cross-sectional area (a cross section parallel to a plane orthogonal to the incident light, for example, a cross section parallel to the plane of the base film 42A) increases from the air side to the base film 42A side, for example, It is preferably conical.
  • the protrusions 34Ap are arranged randomly, preferably randomly, without regularity.
  • these features are not necessary.
  • the protrusions 34Ap do not need to be densely arranged, and may be arranged regularly.
  • the upper and lower limits of D p , D int , and D h may exceed the wavelength range of visible light because it is not necessary to prevent reflection of visible light.
  • the film 50B shown in FIG. 2B has a base film 42B and a synthetic polymer film 34B formed on the base film 42B.
  • the synthetic polymer film 34B has a plurality of protrusions 34Bp on the surface, and the plurality of protrusions 34Bp form a moth-eye structure.
  • the structure of the convex portion 34Bp of the synthetic polymer film 34B of the film 50B is different from the structure of the convex portion 34Ap of the synthetic polymer film 34A of the film 50A.
  • the description of the features common to the film 50A may be omitted.
  • 2-dimensional size D p of protrusions 34Bp is in the range of 10nm or more 500nm or less.
  • a typical distance D int between adjacent protrusions 34Bp is not less than 10 nm and not more than 1000 nm, and D p ⁇ D int . That is, in the synthetic polymer film 34B, a flat portion exists between the adjacent convex portions 34Bp.
  • Protrusions 34Bp has a cylindrical shape having a conical portion on the air side, typical height D h of the convex portion 34Bp is 10nm or more 500nm or less.
  • the protrusions 34Bp may be arranged regularly or irregularly. When the protrusions 34Bp are regularly arranged, D int also represents the period of the arrangement. This is, of course, the same for the synthetic polymer film 34A.
  • the “moth-eye structure” is configured by a convex portion having a shape having an increased cross-sectional area (a cross section parallel to the film surface), like the convex portion 34Ap of the synthetic polymer film 34A shown in FIG. 2A.
  • a portion having a constant cross-sectional area (cross-section parallel to the film surface) like the convex portion 34Bp of the synthetic polymer film 34B shown in FIG. 2B.
  • nano-surface structures composed of protrusions The tip of the projection need not necessarily be conical.
  • the plurality of protrusions of the solid surface illustrated in the examples have a substantially conical tip, but the shape of the plurality of protrusions is not limited to this.
  • a shape that is thinner at the tip of the protrusion is preferable from the viewpoint of mold release properties.
  • the tip does not need to be sharp.
  • the height of the convex portion exceeds 500 nm, there are disadvantages such that the releasability is reduced or the production of the mold takes time.
  • the surfaces of the synthetic polymer films 34A and 34B may be treated as necessary.
  • a water- and oil-repellent agent or a surface treatment agent may be applied to adjust the surface tension (the contact angle of the drop).
  • a thin polymer film is formed on the surfaces of the synthetic polymer films 34A and 34B.
  • the surfaces of the synthetic polymer films 34A and 34B may be modified using plasma or the like. For example, lipophilicity can be imparted to the surfaces of the synthetic polymer films 34A and 34B by plasma treatment.
  • a mold for forming a moth-eye structure as illustrated in FIGS. 2A and 2B on the surface (hereinafter, referred to as a “moth-eye mold”) has an inverted moth-eye structure obtained by inverting the moth-eye structure. If the anodized porous alumina layer having the inverted moth-eye structure is used as it is as a mold, the moth-eye structure can be manufactured at low cost. In particular, when a cylindrical moth-eye mold is used, a moth-eye structure can be efficiently manufactured by a roll-to-roll method. Such moth-eye molds can be manufactured by the methods described in Patent Documents 5 to 8.
  • the method of manufacturing the moth-eye mold is not limited to the above method.
  • a known lithography method such as interference exposure lithography or electron beam lithography, or a known method of forming a nanostructure such as a method of irradiating a glassy carbon substrate with an oxygen ion beam to form a structure can be used.
  • the effect of the interaction between the solid surface and the cells (or the effect of the solid surface as a scaffold) on spheroid formation differs depending on the cell type, so there are many points that cannot be understood without waiting for future research. From the experimental results described above, the solid surface having the characteristics described in the above items 2 to 9 is suitably used for the drop culture method.
  • an acid generated due to a polymerization initiator may be eluted into water attached to the surface.
  • a polymerization initiator for example, ethanone, 1- [9-ethyl-6- (2-methylbenzoyl) -9H-carbazol-3-yl]-, 1- (O-acetyloxime ), 2-hydroxy-1- ⁇ 4- [4- (2-hydroxy-2-methyl-propionyl) -benzyl] phenyl ⁇ -2-methyl-propan-1-one, and 1- [4- (2- One or more polymerization initiators selected from the group consisting of hydroxyethoxy) -phenyl] -2-hydroxy-2-methyl-1-propan-1-one may be used. Specific examples include IRGACURE OXE02 (BASF), Omnirad 127 (IGM Resins), and Omnirad 2959 (IGM Resins).
  • the synthetic polymer membrane described in the above patent application is preferably used.
  • FIG. 3A shows images of the results obtained by drop culture of human hepatoma-derived cell line HepG2 (left) and the results of planar culture (right) observed using an inverted phase contrast microscope.
  • FIG. 3B shows an image obtained by observing a spheroid of HepG2 obtained by the drop culture method with an electron microscope.
  • the left side of FIG. 3B is a top view image
  • the right side of FIG. 3B is a side view image.
  • a human liver cancer-derived cell line HepG2 cell was cultured in a culture medium (cell culture medium) obtained by adding a final concentration of 10% fetal bovine serum (FBS) to Dulbecco's modified Eagle medium (D-MEM), which is a general culture condition.
  • a maintenance culture was carried out in an adhesive cell culture dish (eg, MS-11600 manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) under atmospheric conditions of a temperature of 37 ° C., a carbon dioxide concentration of 5%, and a relative humidity of 95%.
  • the HepG2 cells that had been subjected to the maintenance culture were detached from the culture dish using a trypsin solution, which is a general cell detachment solution, and the cell density in a state where the cells were suspended was measured using a fully automatic cell counter (cell counter). ), And a cell suspension was prepared in the above medium so as to be 1 ⁇ 10 5 cells / mL. 25 ⁇ L of the cell suspension was weighed and attached to the surface of a photocurable resin film having a moth-eye structure on the surface so as to form droplets. The optimum number of droplets was 6 to 9 if the droplets were on a nano-projection film stuck on a 35 mm ⁇ dish.
  • the droplets (25 ⁇ L) were cultured under the same atmospheric conditions as above (temperature 37 ° C., carbon dioxide concentration 5%, relative humidity 95%) for 3 days.
  • the droplets maintained their shape even under these atmospheric conditions, and even when half or all of the culture solution was exchanged to adjust the osmotic pressure in the medium.
  • FIG. 3A As shown on the left of FIG. 3A, when drop culture was performed on the surface having a moth-eye structure, a three-dimensional spheroid having a substantially circular outer periphery was formed. The formation of three-dimensional spheroids can also be confirmed from the electron microscope image of FIG. 3B.
  • FIG. 3A shows the result of general planar culture. No spheroid formation was observed on the right of FIG. 3A.
  • a general planar culture was performed as follows.
  • a culture dish for example, MS-3096 or MS-11350 manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd., which is selected according to the test volume
  • a general cell adhesion surface coat hydrophilic coat or the like.
  • the cell suspension was seeded in an appropriate amount (100 ⁇ L for a 96-well plate, 2 mL for a 35 mm dish), and cultured so that the cells could grow in a plane.
  • FIG. 3C shows the results obtained by determining the number of surviving cells of the hepatoma cell line HepG2 in the drop culture. Here, it was quantified by measuring adenosine triphosphate (ATP), which is known to have the same energy as living cells of the same cell line.
  • 3D in FIG. 3C shows the result of the drop culture method, and 2D shows the result of the general planar culture method.
  • the number of surviving cells by the drop culture method is almost the same as the number of viable cells by the flat culture method.
  • the cell viability is smaller than that in the planar culture method. If 70% to 80% of the cell viability is obtained by the planar culture method, the cells can be efficiently collected. It is said to be alive.
  • the cell viability depends on the cell density, it can be seen that at a typical seeding density of 1 ⁇ 10 5 cells / mL, the cell viability in the drop culture method is almost the same as that in the planar culture method. Was.
  • FIG. 3D shows the results of evaluating the tissue reproducibility (or “gene expression”) of HepG2 spheroids obtained by the drop culture method.
  • 3D in FIG. 3D shows the result of the drop culture method, and 2D shows the result of the general planar culture method.
  • CYP activity cytochrome P450
  • the enzyme activity in the cells was measured using a P450-Glo TM Luciferin-IPA kit (promega) according to the instructions.
  • P450-Glo TM Luciferin-IPA kit Promega
  • HepG2 cells were cultured in a plane so as to have the same number of cells as the droplets, and P450 activity was measured by the same method. Since it is expected that the cell growth rate differs between the planar culture and the drop culture, it is necessary to calculate a correction value of the enzyme activity per cell. Therefore, in order to measure the number of viable cells when drop culture or planar culture was performed under the same conditions as when measuring the P450 enzyme activity, ATP was quantified using a Cell Titer Glo R kit (Promega).
  • RLU values were measured according to the instructions.
  • the P450 enzyme activity when the plate culture or the drop culture was performed was divided by the ATP value, and the relative P450 enzyme activity value of the HepG2 cells in the drop culture when the enzyme activity value was set to 1 per cell in the plate culture was obtained and the graph was obtained. The result is shown in FIG. 3D.
  • spheroids having high tissue reproducibility can be formed by forming droplets (drops) on the solid surface and culturing.
  • FIG. 4A, 4B, 4C, and 4D show the results of drop culture of various cells (left) and the results of planar culture (right).
  • FIG. 4A shows an optical microscope image (left) as a result of drop culture of human embryonic kidney epithelial cells HEK293, and an optical microscope image (right) of a planar culture
  • FIG. 4B shows mouse preadipocyte 3T3-L1. An optical microscope image (left) of the result of the drop culture and an optical microscope image (right) of the result of the planar culture are shown.
  • FIG. 4C shows an optical microscope image (left) of the result of drop culture of the mouse mesenchymal stem cell C3H10t1 / 2. ) And an optical microscope image (right) of the result of the planar culture.
  • FIG. 4D shows an optical microscope image of the result of drop culture of the mouse myoblast C2C12 (left) and an optical microscope image of the result of planar culture (right). ).
  • spheroid formation was confirmed by the drop culture method, but no spheroid was formed by the planar culture.
  • the drop culture method is suitably used for culture of a wide variety of cell types.
  • [Synthetic polymer membrane] A sample film having a structure similar to that of the film 50A shown in FIG. 2A was produced using ultraviolet curable resins having different compositions.
  • the raw materials used for the ultraviolet curable resin forming the synthetic polymer film 34A of each sample film are shown in Table 1, and the compositions of the ultraviolet curable resins A, B and C are shown in Table 2.
  • Resins A, B and C were each mixed with a fluorine-based water and oil repellent (water repellent additive).
  • a porous alumina layer produced by the method described in Patent Documents 5 to 8 and Japanese Patent Application No. 2018-041073 was used as a mold for forming a moth-eye structure on the surface.
  • a flat "mold” non-alkali glass (EAGLE XG manufactured by CORNING) having a thickness of 0.7 mm was used as a mold for forming a moth-eye structure on the surface.
  • the contact angle was measured as a parameter characterizing the surface of ⁇ and synthetic polymer membranes (solid surface in the drop culture method).
  • Table 3 shows the contact angle of the mold surface.
  • the contact angle of the solid surface with the cell suspension affects the area of contact between the solid surface and the cells (also referred to as the “bottom area of the droplet”) and the shape of the droplet. Although depending on the cell type, the shape and the like of the obtained spheroid change depending on the contact angle. It is preferable to adjust the contact angle according to the cell type.
  • ⁇ contact angle
  • r radius of a droplet
  • h Drop height
  • a droplet of 10 ⁇ L to 70 ⁇ L was used in consideration of 1 ⁇ L and the volume of the droplet used in the drop culture method.
  • a droplet of 10 ⁇ L to 70 ⁇ L was used in consideration of the volume of the droplet used in the drop culture method.
  • the contact angle changes depending on time. Therefore, the contact angles were measured 1 second and 10 seconds after the droplets were deposited.
  • the contact angle for characterizing a solid surface refers to a static contact angle 10 seconds after a droplet adheres to the solid surface.
  • No liquid deposition means that the contact angle is 140 ° or more.
  • droplets of 10 ⁇ L to 70 ⁇ L were used as in the measurement of the contact angle.
  • the sliding angle refers to an inclination angle at which the surface on which the droplet is attached is inclined from the horizontal direction, and the droplet starts to slide downward.
  • DD-MEM LowLGlucose 1.0 g / L Glucose
  • 10% FBS 10% FBS was used as the medium.
  • the effect of the type and concentration of the medium on the contact angle and the sliding angle was within the range of variation.
  • the effect on the contact angle by adding cells to the medium was also within the range of variation.
  • Table 4 shows the mold (type of release treatment) and resin composition used for producing the synthetic polymer films (Comparative Examples 1 to 12 and Examples 1 to 12) used in the experiment, and the surface of each synthetic polymer film.
  • the result of measuring the contact angle with water is shown.
  • the contact angle was measured using 1 ⁇ L of pure water.
  • the results obtained by measuring the contact angles at 1 second and 10 seconds after the droplet was deposited on the surface and the difference ( ⁇ ) obtained by subtracting the contact angle at 1 second from the contact angle at 10 seconds are shown.
  • a synthetic polymer film produced using a mold treated with a release treatment agent having a higher concentration has a higher water repellency.
  • the moth-eye surface has a larger contact angle and higher water repellency (lotus effect).
  • the moth-eye surfaces of Examples 1, 2, and 3 show that even when the droplet formed on the needle tip is brought into contact with the moth-eye surface when measuring the contact angle, the droplet does not adhere to the moth-eye surface and remains on the needle tip. Therefore, the contact angle could not be measured. When the contact angle exceeded approximately 140 °, such a phenomenon that the droplet did not adhere to the target surface occurred.
  • Table 5 Table 7, Table 9 and Table 11 show the results of measuring the contact angle with water and the contact angle with the culture medium while changing the amount of droplets (volume of droplets).
  • Table 5 (Comparative Examples 1-1 to 12-1, Examples 1-1 to 12-1) shows the results using 10 ⁇ L droplets
  • Table 7 (Comparative Examples 1-2 to 12-2, Examples) 1-2 to 12-2) show the results using 30 ⁇ L droplets
  • Table 9 (Comparative Examples 1-3 to 12-3, Examples 1-3 to 12-3) use 50 ⁇ L droplets.
  • Table 11 (Comparative Examples 1-4 to 12-4, Examples 1-4 to 12-4) shows the results using 70 ⁇ L droplets.
  • the contact angle of the moth-eye surface is larger than that of the flat surface, and the water repellency is higher for both water and the culture medium.
  • the shape of the droplet is flattened and the contact angle tends to decrease under the influence of gravity.
  • a synthetic polymer film prepared using a mold treated with a release agent having a higher concentration tends to have higher water repellency.
  • the tendency of the sliding angle to decrease under the influence of gravity as the volume of the droplet increases is observed for water and culture medium.
  • the sliding angle is larger on the moth-eye surface than on the flat surface, and is considered to be due to the action of the fine projections of the moth-eye surface. That is, it is understood that the moth-eye surface can maintain a high sliding angle while having high water repellency.
  • Table 6 (Comparative Examples 1-1 to 12-1 and Examples 1-1 to 12-1) and Table 8 (Comparative Example 1) show the results of three-dimensional culture performed using the surface of each synthetic polymer membrane. 2 to 12-2, Examples 1-2 to 12-2), Table 10 (Comparative Examples 1-3 to 12-3, Examples 1-3 to 12-3), Table 12 (Comparative Examples 1-4 to 12) 12-4 and Examples 1-4 to 12-4).
  • FIG. 5A level 1
  • FIG. 5B level 2
  • FIG. 5C level 3
  • FIG. 5D level 4
  • FIG. 5E level 5
  • Tables 6, 8, 10 and 12 those in which spheroids of level 3 or more were formed were evaluated as ⁇ (good), those in which spheroids of level 2 or 1 were obtained were evaluated as ⁇ (acceptable), and no spheroids were observed.
  • Example 10-4 shows Example 10-4
  • FIG. 5B shows Example 10-3 on the left
  • Example 11-4 on the center shows Example 10-1 on the right
  • Example 9-2 on the left of FIG. 5C
  • Example on the right Example 8-4
  • FIG. 5D shows Example 6-2
  • FIG. 5E shows the optical microscope image of the spheroid of Example 3-2 and the right shows the contact angle of the medium (after 10 seconds) and the right of Example 3-2.
  • a change in the contact angle ( ⁇ indicates a minus).
  • ⁇ The workability of medium exchange was evaluated by the contact angle. ⁇ (excellent) when the contact angle was 110 ° or more, ⁇ (good) when 90 ° or more and less than 110 °, and ⁇ (good) when less than 90 °. However, when the height of the droplets was less than 1 mm, the workability of replacing the medium was reduced. Since the drop culture method has high viability, the culture period may be long (more than several days) depending on the cell type. Then, the medium in the droplet is reduced by evaporation. In addition, waste products in the droplets increase. For this reason, it is preferable to perform a step of applying a medium to the droplets and a step of sucking a part of the medium from the droplets before applying the medium.
  • the height of the droplet is preferably 1 mm or more.
  • the handling property was evaluated by the sliding angle, which indicates that the droplets were easily held stably on the solid surface during the operation.
  • Droplets on a solid surface may move (slip or roll) as the solid surface tilts or vibrates. In order to prevent this, it is necessary to maintain a state in which the solid surface is not tilted or vibrated during the culture, so that the workability is reduced. For example, by setting the sliding angle of the solid surface with respect to the medium to 45 ° or more, the droplet can be relatively stably held on the solid surface.
  • the handleability was evaluated as ⁇ (excellent) when the sliding angle was 90 ° or more, ⁇ (good) when 45 ° or more and less than 90 °, ⁇ (acceptable) when 10 ° or more and less than 45 °, and ⁇ (impossible) when less than 10 °. .
  • Example 11-4 center in FIG. 5B
  • Example 10-1 right in FIG. 5B
  • Example 8-4 right in FIG. 5C
  • the difference ⁇ in the contact angle is small. It is recognized that spheroids in a better state tend to be obtained. This is because the smaller the change in the contact angle in 10 seconds after the deposition, the easier it is to maintain the shape of the droplet during the culture period (the more difficult it becomes to flatten), and as a result, the effect of cell accumulation due to the shape of the droplet is reduced. , It is thought that more was obtained.
  • the volume of the droplet is preferably 10 ⁇ L or more and 50 ⁇ L or less (see Tables 6, 8, and 10; in particular, Examples 1 to 6).
  • Seeding density of cells contained in the droplets for example, a 10 3 cells / mL or more 10 7 cells / mL or less.
  • One of the advantages of the drop culture method is that the number of cells contained in a droplet can be accurately controlled. The number of cells is typically in the above range, but can be adjusted appropriately depending on the cell type, the volume of the droplets, and the like.
  • the sliding angle of the droplet is preferably 45 ° or more, more preferably 90 ° or more.
  • the sliding angle may be evaluated by a value 20 seconds after the landing.
  • a three-dimensional culture method that is superior in workability or mass productivity and / or can obtain a spheroid with high tissue reproducibility compared to the conventional three-dimensional culture method Is provided.
  • a three-dimensional culture structure having a solid surface having a plurality of protrusions having a height of 10 nm or more and 1 mm or less is suitable for a drop culture method.
  • a synthetic polymer film having a surface having a moth-eye structure exemplified in the examples is suitable for a drop culture method.
  • Used for Such a three-dimensional culture structure is obtained, for example, by attaching the above-mentioned synthetic polymer film to the inner bottom surface of a petri dish. That is, the three-dimensional culture structure can be provided as a container such as a petri dish.
  • a three-dimensional culture structure for example, a container
  • a three-dimensional culture structure having spheroids on the surface with higher tissue reproducibility than before can be produced.
  • Such a three-dimensional culture structure having spheroids on its surface is suitably used for research and development of drug discovery and regenerative medicine.
  • the three-dimensional cell culture method according to the embodiment of the present invention can be widely used for drug discovery, regenerative medicine and the like.

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Abstract

三次元培養法は、細胞（１２Ｃ）と培地（１４Ｍ）とを含む細胞懸濁液を用意する工程と、高さが１０ｎｍ以上１ｍｍ以下の複数の凸部（１０Ｓｐ）を有する固体表面（１０Ｓ）を用意する工程と、固体表面（１０Ｓ）上に、細胞懸濁液の液滴（１６Ｄ）を付着させる工程と、液滴（１６Ｄ）に作用する重力の方向が固体表面（１０Ｓ）に向かう状態で、細胞（１２Ｃ）を液滴（１６Ｄ）中で培養する工程とを包含する。

Description

三次元培養法、三次元培養構造体、および三次元培養構造体の製造方法
　本発明は、三次元細胞培養法（以下、「三次元培養法」という。）、三次元培養に用いられる構造体（容器を含む）、および三次元培養構造体の製造方法に関する。
　近年、創薬や再生医療に欠かせない技術として、三次元細胞培養法（以下、「三次元培養法」という。）が注目されている（例えば、特許文献１～４、非特許文献１～３）。
　三次元培養法は、in vitroで、細胞を三次元的に相互作用させながら、培養する方法であり、in vivoにおける細胞の性質を良く反映したスフェロイドを得ることができる。このように、三次元培養法によって得られたスフェロイドは、二次元培養法によって得られた細胞よりも、培養された細胞が由来する生体組織の性質や機能を、生体に近い態様で発現し得る。本明細書において、スフェロイドが有するこのような性質を「組織再現性」といい、細胞内の遺伝子発現により生成されたタンパク質が生体に近い形で生理的に機能するほど、組織再現性が高いという。
　三次元培養法として、微細な凹凸構造を有する表面を利用する培養法が、例えば、特許文献１～３および非特許文献１に記載されている。これらに記載の培養法は、底面に微細な凹凸構造を有する容器に、細胞と培地（ここでは、培養液、液体培地のことをいう。）とを含む細胞懸濁液を注ぎ、細胞の一部が液体中で容器の底面に接着した状態で培養される。以下、本明細書において、特許文献１～３および非特許文献１等に記載の培養方法を「微接着三次元培養法」という。
　また、液滴内で細胞を培養するハンギングドロップ法が、例えば、特許文献４、非特許文献２、３に記載されている。
特開２００５－１６８４９４号公報 国際公開第２００７／０９７１２０号 国際公開第２０１７／１２６５８９号 国際公開第２００７／１１４３５１号 特許第４２６５７２９号公報 特開２００９－１６６５０２号公報 国際公開第２０１１／１２５４８６号 国際公開第２０１３／１８３５７６号 国際公開第２０１５／１６３０１８号
Yoshii Y, Furukawa T, Aoyama H, Adachi N,Zhang MR, Wakizaka H, Fujibayashi Y, Saga T,"Regorafenib as a potential adjuvantchemotherapy agent in disseminated small colon cancer: Drug selection outcome of anovel screening system using nanoimprinting 3-dimensional culture with HCT116-RFP cells", Int. J. Oncol., 2016 Apr;48(4):1477-84. Singla DK and Sobel BE, Biochem Biophys Res Commun. 2005 335(3):637-42 Foty, R., "A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids". JoVE., 51, 2720 (2011).
　しかしながら、本発明者の検討によると、上記の従来の三次元培養法は、作業性または量産性に改善の余地が残されている。また、組織再現性をさらに向上させたスフェロイドを得ることができる三次元培養法の開発が望まれている。
　底面の微細な凹凸構造を利用する微接着三次元培養法においては、底面の微細な凹凸構造は、細胞の足場として作用する。底面の凹凸構造と細胞との相互作用が、細胞間の相互作用よりも強いと、細胞が厚さ方向に十分に増殖できず、面内方向の増殖が支配的となり、その結果、三次元的な組織構造を十分に再現できないことがある。また、微接着三次元培養法においては、細胞が面内方向にランダムに遊走する間に細胞同士の接触と接着を繰り返し、細胞分裂を伴いながらスフェロイドを形成するので、スフェロイドを構成する細胞の数にばらつきが大きく、スフェロイドの形状やサイズの再現性が低いという問題もある。
　ハンギングドロップ法は、液滴中で培養を行うので、細胞数の制御が容易であり、スフェロイドの形状やサイズの再現性が高いという利点を有している。しかしながら、液滴中に細胞の足場となる表面がないので、足場依存性の高い細胞種においては生存性を維持できないことがある。また、ハンギングドロップ法は、液滴を付着させた表面を下に向ける（重力方向に向ける）ので、作業性が低いという問題もある。
　また、上記のいずれかの三次元培養法によって得られるスフェロイドの組織再現性は、二次元培養法（平面培養法）によって得られたスフェロイドの組織再現性よりも高いものの、一層の向上が求められている。
　そこで、本発明の実施形態は、従来の三次元培養法よりも、作業性または量産性に優れた、および／または、組織再現性の高いスフェロイドを得ることができる三次元培養法を提供することを目的とする。また、本発明の他の実施形態は、そのような三次元培養法に好適に用いられる三次元培養構造体および／または三次元培養構造体の製造方法を提供することを目的とする。
　本発明の実施形態によると、以下の項目に記載の解決手段が提供される。
　［項目１］
　細胞と培地とを含む細胞懸濁液を用意する工程と、高さが１０ｎｍ以上１ｍｍ以下の複数の凸部を有する固体表面を用意する工程と、前記固体表面上に、前記細胞懸濁液の液滴を付着させる工程と、前記液滴に作用する重力の方向が前記固体表面に向かう状態で、前記細胞を前記液滴中で培養する工程とを包含する、三次元培養法。
　［項目２］
　前記固体表面の法線方向から見たとき、前記複数の凸部の２次元的な大きさは１０ｎｍ以上５００ｎｍ以下の範囲内にある、項目１に記載の三次元培養法。
　［項目３］
　前記複数の凸部の高さは、１０ｎｍ以上５００ｎｍ以下である、項目１または２に記載の三次元培養法。
　［項目４］
　前記複数の凸部の隣接間距離は、１０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下である、項目１から３のいずれかに記載の三次元培養法。前記複数の凸部の隣接間距離は、５００ｎｍ以下であってもよい。
　［項目５］
　前記複数の凸部は略円錐形の先端部分を有する、項目１から４のいずれかに記載の三次元培養法。
　［項目６］
　前記固体表面の前記細胞懸濁液に対する接触角が１７°以上である、項目１から５のいずれかに記載の三次元培養法。なお、少なくとも着滴から１０秒後において前記固体表面の前記細胞懸濁液に対する接触角が１７°以上であればよい。
　［項目７］
　前記固体表面の前記細胞懸濁液に対する接触角が９０°以上である、項目１から６のいずれかに記載の三次元培養法。なお、少なくとも着滴から１０秒後において前記固体表面の前記細胞懸濁液に対する接触角が９０°以上であればよい。
　［項目８］
　前記固体表面の前記細胞懸濁液に対する滑落角は４５°以上である、項目１から７のいずれかに記載の三次元培養法。滑落角は着滴から２０秒後の値で評価すればよい。
　［項目９］
　前記固体表面は、合成高分子から形成されている、項目１から８のいずれかに記載の三次元培養法。
　［項目１０］
　前記液滴の体積は１０μＬ以上５０μＬ以下である、項目１から９のいずれかに記載の三次元培養法。
　適当な形状の液滴の形成および操作性等の観点から、上記の範囲が好ましい。
　［項目１１］
　前記液滴に含まれる前記細胞の播種密度は１０３細胞／ｍＬ以上１０７細胞／ｍＬ以下である、項目１から１０のいずれかに記載の三次元培養法。
　［項目１２］
　前記液滴の高さは１ｍｍ以上である、項目１から１１のいずれかに記載の三次元培養法。
　［項目１３］
　前記細胞を前記液滴中で培養している間に、前記液滴に前記培地を付与する工程をさらに包含する、項目１から１２のいずれかに記載の三次元培養法。
　［項目１４］
　前記培地を付与する前に、前記液滴から前記培地の一部を吸い取る工程をさらに包含する、項目１３に記載の三次元培養法。
　本発明の他の実施形態によると、以下の項目に記載の解決手段も提供される。
　［項目１５］
　項目１から１４のいずれかに記載の三次元培養法に用いられる固体表面を有する、三次元培養構造体。
　三次元培養構造体は、容器の一部として提供される。
　［項目１６］
　前記固体表面を有する三次元培養構造体を用意し、項目１から１４のいずれかに記載の三次元培養法を用いて培養されたスフェロイドを前記固体表面に有する三次元培養構造体を製造する方法。
　項目１から１４のいずれかに記載の三次元培養法を用いて培養されたスフェロイドは三次元培養構造体（例えば容器）とともに提供され得る。
　本発明の実施形態によると、従来の三次元培養法よりも、作業性または量産性に優れた、および／または、組織再現性の高いスフェロイドを得ることができる三次元培養法が提供される。また、本発明の他の実施形態によると、そのような三次元培養法に好適に用いられる三次元培養構造体が提供される。本発明のさらに他の実施形態によると、従来よりも組織再現性の高いスフェロイドを表面に有する三次元培養構造体（例えば容器）が提供される。
本発明の実施形態による三次元培養法における培養状態を模式的に示す図である。 本発明の実施形態による三次元培養法に用いられるモスアイ構造を表面に有する合成高分子膜３４Ａの模式的な断面図である。 本発明の実施形態による三次元培養法に用いられるモスアイ構造を表面に有する合成高分子膜３４Ｂの模式的な断面図である。 ヒト肝がん由来細胞株ＨｅｐＧ２をドロップ培養した結果の光学顕微鏡像（左）と、平面培養した結果の光学顕微鏡像（右）である。 ドロップ培養法で得られたＨｅｐＧ２のスフェロイドを電子顕微鏡の上面像（左）と、側面像（右）である。 ドロップ培養中の肝がん細胞株ＨｅｐＧ２の細胞生存数を求めた結果を示すグラフである。 ドロップ培養法で得られた肝がん細胞ＨｅｐＧ２スフェロイドのＣＹＰ活性を評価した結果を示すグラフである。 ヒト胎児腎臓上皮細胞ＨＥＫ２９３をドロップ培養した結果の光学顕微鏡像（左）と、平面培養した結果の光学顕微鏡像（右）である。 マウス脂肪前駆細胞３Ｔ３－Ｌ１をドロップ培養した結果の光学顕微鏡像（左）と、平面培養した結果の光学顕微鏡像（右）である。 マウス間葉系幹細胞Ｃ３Ｈ１０ｔ１／２をドロップ培養した結果の光学顕微鏡像（左）と、平面培養した結果の光学顕微鏡像（右）である。 マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２をドロップ培養した結果の光学顕微鏡像（左）と、平面培養した結果の光学顕微鏡像（右）である。 ドロップ培養法で得られたスフェロイド（レベル１）の光学顕微鏡像である。 ドロップ培養法で得られたスフェロイド（レベル２）の光学顕微鏡像である。 ドロップ培養法で得られたスフェロイド（レベル３）の光学顕微鏡像である。 ドロップ培養法で得られたスフェロイド（レベル４）の光学顕微鏡像である。 ドロップ培養法で得られたスフェロイド（レベル５）の光学顕微鏡像である。
　以下、本発明の実施形態による三次元培養法、三次元培養構造体、および三次元培養構造体の製造方法を説明する。
　本発明の実施形態による三次元培養法は、図１に模式的に示す様に、固体表面１０Ｓ上に、細胞１２Ｃと培地１４Ｍとを含む細胞懸濁液の液滴１６Ｄを付着させ、液滴１６Ｄに作用する重力の方向が固体表面１０Ｓに向かう状態で、細胞１２Ｃを液滴１６Ｄ中で培養する方法である。この三次元培養法（以下、「ドロップ培養法」という。）では、液滴１６Ｄ中で細胞１２Ｃを培養するので、ハンギングドロップ法と同様に、細胞数の制御が容易であり、スフェロイドの形状やサイズの再現性が高いという利点が得られる。さらに、液滴１６Ｄに作用する重力の方向が固体表面１０Ｓに向かう状態で培養が行われるので、固体表面１０Ｓが足場として作用するので、足場依存性の高い細胞種であっても、比較的高い生存性を維持できる。また、液滴１６Ｄを付着させた表面１０Ｓを下に向ける（重力方向に向ける）必要がないので、ハンギングドロップ法よりも作業性が高い。固体表面１０Ｓは足場として作用し得る複数の凸部１０Ｓｐを有する。
　液滴１６Ｄは、固体表面１０Ｓと接触する部分以外は雰囲気ガス（例えば空気）と接触しており、閉じられた培養空間を形成する。なお、図１では、液滴１６Ｄの底面が凸部１０Ｓｐの先端に接触し、液滴１６Ｄは凸部１０Ｓｐの先端よりも上側にのみ存在しているように図示しているが、液滴１６Ｄの底部の一部が隣接する凸部１０Ｓｐの間に浸入していてもよい。液滴１６Ｄの体積は、例えば１０μＬ以上５０μＬ以下である。
　安定した液滴１６Ｄを形成し、かつ、効率よく細胞を培養できる固体表面１０Ｓは、後に実験結果を示す様に、高さが１０ｎｍ以上１ｍｍ以下の複数の凸部１０Ｓｐを有する固体表面である。高さが１０ｎｍ以上１ｍｍ以下の複数の凸部を有する固体表面を利用することによって、三次元培養できることは、例えば特許文献１（特許第４５０７８４５号として登録）にも記載されている。しかしながら、上述した様に、底面の微細な凹凸構造を利用する微接着三次元培養法では、三次元的な組織構造を十分に再現できない、あるいは、スフェロイドの形状やサイズの再現性が低いという問題がある。
　ドロップ培養法では、液滴１６Ｄ中の細胞を培養するので、微接着三次元培養法の上記の欠点を解消することができる。細胞１２Ｃは、三次元的に閉ざされた液滴１６Ｄの中で、重力の作用を受けて、固体表面１０Ｓと接触する底面上に堆積するように集まる。したがって、固体表面１０Ｓの複数の凸部１０Ｓｐと相互作用する細胞が一定量存在するとともに、その上に細胞同士間だけで相互作用する細胞が存在する。その結果、微接着三次元培養とは異なり、厚さ方向にも適度に増殖し、三次元的な組織構造の再現性が高いスフェロイドが得られると考えられる。
　以下では、モスアイ構造を有する固体表面１０Ｓを用いた実験例を示して、本発明の実施形態による三次元培養法（ドロップ培養法）を説明する。本出願人の内の一方が、反射防止膜または殺菌性を有する合成高分子膜として開発してきた、モスアイ構造を有する固体表面は、ドロップ培養法に好適に用いられる。参考のために、特許文献５～８（反射防止膜）、特許文献９（殺菌性を有する合成高分子膜）の開示内容を本明細書に援用する。
　特許文献５～９に記載されているように、陽極酸化ポーラスアルミナ層を利用すると、高い量産性で、モスアイ構造を表面に有する合成高分子膜（例えば、光硬化性樹脂を硬化させることによって形成された光硬化樹脂膜や、熱硬化性樹脂を硬化させることによって形成された熱硬化樹脂膜等）を製造することができる。以下に示す実験例は、上述の方法で形成されたモスアイ構造を表面に有する光硬化樹脂膜を用いた例であり、上記の項目２～９に記載の特徴を備えている。ただし、特許文献１に記載されているように、複数の凸部の大きさ、高さや、隣接凸部間の距離（規則的に配列されている場合はピッチ）は、これらに限られないと考えられる。なお、モスアイ構造を形成する材料は、有機材料、無機材料のいずれであってもよい。
　図２Ａおよび図２Ｂを参照して、ドロップ培養法に用いられるモスアイ構造を表面に有する合成高分子膜３４Ａおよび３４Ｂの構造を説明する。合成高分子膜３４Ａおよび３４Ｂは、本発明の実施形態による三次元培養構造の例である。
　図２Ａおよび図２Ｂは、合成高分子膜３４Ａおよび３４Ｂの模式的な断面図をそれぞれ示す。ここで例示する合成高分子膜３４Ａおよび３４Ｂは、いずれもベースフィルム４２Ａおよび４２Ｂ上にそれぞれ形成されているが、もちろんこれに限られない。合成高分子膜３４Ａおよび３４Ｂは、任意の物体の表面に直接形成され得る。
　図２Ａに示すフィルム５０Ａは、ベースフィルム４２Ａと、ベースフィルム４２Ａ上に形成された合成高分子膜３４Ａとを有している。合成高分子膜３４Ａは、表面に複数の凸部３４Ａｐを有しており、複数の凸部３４Ａｐは、モスアイ構造を構成している。合成高分子膜３４Ａの法線方向から見たとき、凸部３４Ａｐの２次元的な大きさＤｐは１０ｎｍ以上５００ｎｍ以下の範囲内にある。ここで、凸部３４Ａｐの「２次元的な大きさ」とは、表面の法線から見たときの凸部３４Ａｐの面積円相当径を指す。例えば、凸部３４Ａｐが円錐形の場合、凸部３４Ａｐの２次元的な大きさは、円錐の底面の直径に相当する。また、凸部３４Ａｐの典型的な隣接間距離Ｄｉｎｔは１０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下である。図２Ａに例示するように、凸部３４Ａｐが密に配列されており、隣接する凸部３４Ａｐ間に間隙が存在しない（例えば、円錐の底面が部分的に重なる）場合には、凸部３４Ａｐの２次元的な大きさＤｐは隣接間距離Ｄｉｎｔと等しい。凸部３４Ａｐの典型的な高さＤｈは、１０ｎｍ以上５００ｎｍ以下である。合成高分子膜３４Ａの厚さｔｓに特に制限はなく、凸部３４Ａｐの高さＤｈより大きければよい。
　図２Ａに示した合成高分子膜３４Ａは、特許文献５～８に記載されている反射防止膜と同様のモスアイ構造を有している。反射防止機能を発現させるためには、表面に平坦な部分がなく、凸部３４Ａｐが密に配列されていることが好ましい。また、凸部３４Ａｐは、空気側からベースフィルム４２Ａ側に向かって、断面積（入射光線に直交する面に平行な断面、例えばベースフィルム４２Ａの面に平行な断面）が増加する形状、例えば、円錐形であることが好ましい。また、光の干渉を抑制するために、凸部３４Ａｐを規則性がないように、好ましくはランダムに、配列することが好ましい。しかしながら、合成高分子膜３４Ａをドロップ培養に用いる場合には、これらの特徴は必要ではない。例えば、凸部３４Ａｐは密に配列される必要はなく、また、規則的に配列されてもよい。Ｄｐ、Ｄｉｎｔ、Ｄｈの上限値および下限値も、可視光の反射を防止する必要がないので、可視光の波長範囲を超えてもよい。
　図２Ｂに示すフィルム５０Ｂは、ベースフィルム４２Ｂと、ベースフィルム４２Ｂ上に形成された合成高分子膜３４Ｂとを有している。合成高分子膜３４Ｂは、表面に複数の凸部３４Ｂｐを有しており、複数の凸部３４Ｂｐは、モスアイ構造を構成している。フィルム５０Ｂは、合成高分子膜３４Ｂが有する凸部３４Ｂｐの構造が、フィルム５０Ａの合成高分子膜３４Ａが有する凸部３４Ａｐの構造と異なっている。フィルム５０Ａと共通の特徴については説明を省略することがある。
　合成高分子膜３４Ｂの法線方向から見たとき、凸部３４Ｂｐの２次元的な大きさＤｐは１０ｎｍ以上５００ｎｍ以下の範囲内にある。また、凸部３４Ｂｐの典型的な隣接間距離Ｄｉｎｔは１０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であり、かつ、Ｄｐ＜Ｄｉｎｔである。すなわち、合成高分子膜３４Ｂでは、隣接する凸部３４Ｂｐの間に平坦部が存在する。凸部３４Ｂｐは、空気側に円錐形の部分を有する円柱状であり、凸部３４Ｂｐの典型的な高さＤｈは、１０ｎｍ以上５００ｎｍ以下である。また、凸部３４Ｂｐは、規則的に配列されていてもよいし、不規則に配列されていてもよい。凸部３４Ｂｐが規則的に配列されている場合、Ｄｉｎｔは配列の周期をも表すことになる。このことは、当然ながら、合成高分子膜３４Ａについても同じである。
　なお、本明細書において、「モスアイ構造」は、図２Ａに示した合成高分子膜３４Ａの凸部３４Ａｐの様に、断面積（膜面に平行な断面）が増加する形状の凸部で構成される、優れた反射防止機能を有するナノ表面構造だけなく、図２Ｂに示した合成高分子膜３４Ｂの凸部３４Ｂｐの様に、断面積（膜面に平行な断面）が一定の部分を有する凸部で構成されるナノ表面構造を包含する。凸部の先端は、円錐形である必要は必ずしもない。
　実施例で例示した固体表面が有する複数の凸部は、略円錐形の先端部を有するが、複数の凸部の形状はこれに限られない。ただし、型を用いて複数の凸部を形成する場合には、離型性の観点から、凸部の先端ほど細い（型の凹部の底に近いほど細い）形状が好ましい。先端が尖っている必要はない。また、凸部の高さ（型の凹部の深さ）が５００ｎｍを超えると、離型性が低下する、あるいは、型の製造に時間がかかるなどの不利益がある。
　合成高分子膜３４Ａおよび３４Ｂの表面は、必要に応じて、処理されていてもよい。例えば、表面張力（ドロップの接触角）を調整するために、撥水撥油剤や表面処理剤を付与してもよい。撥水撥油剤や表面処理剤の種類によっては、合成高分子膜３４Ａおよび３４Ｂの表面に薄い高分子膜が形成される。また、合成高分子膜３４Ａおよび３４Ｂの表面をプラズマなどを用いて改質してもよい。例えば、プラズマ処理によって、合成高分子膜３４Ａおよび３４Ｂの表面に親油性を付与することができる。
　図２Ａおよび図２Ｂに例示したようなモスアイ構造を表面に形成するための型（以下、「モスアイ用型」という。）は、モスアイ構造を反転させた、反転されたモスアイ構造を有する。反転されたモスアイ構造を有する陽極酸化ポーラスアルミナ層をそのまま型として利用すると、モスアイ構造を安価に製造することができる。特に、円筒状のモスアイ用型を用いると、ロール・ツー・ロール方式によりモスアイ構造を効率良く製造することができる。このようなモスアイ用型は、特許文献５～８に記載されている方法で製造することができる。
　なお、モスアイ用型の製造方法は、上記の方法に限定されない。例えば、干渉露光リソグラフィーや電子線リソグラフィーなどの各種リソグラフィー法、または、グラッシーカーボン基板に酸素イオンビームを照射して構造を形成する方法など、公知のナノ構造を形成する方法を用いることができる。
　固体表面と細胞との相互作用（あるいは、固体表面の足場としての作用）がスフェロイド形成に与える影響については、細胞種によっても異なるので、今後の研究を待たないとわからない点も多いが、少なくともこれまでの実験結果から、上記の項目２～９に記載の特徴を有する固体表面がドロップ培養法に好適に用いられる。
　後に示す実験例では、特願２０１８－０４１０７３号（出願日２０１８年３月７日）およびこれに基づく米国出願１６／２９３，９０３に記載の合成高分子膜を用いた。参考のために、上記特許出願の開示内容のすべてを本明細書に援用する。なお、上記特許出願に記載されている合成高分子膜は、表面に付着した液滴のｐＨが変化しないという特徴を有している。具体的には、合成高分子膜の表面に２００μＬの水を滴下後、５分後の水溶液のｐＨが６．５以上７．５以下であり得る。光硬化性樹脂を用いて作製された合成高分子膜は、重合開始剤に起因して生成される酸が、表面に付着した水に溶出されることがある。これを防止するためには、重合開始剤として、例えば、エタノン，１－［９－エチル－６－（２－メチルベンゾイル）－９Ｈ－カルバゾール－３－イル］－，１－（Ｏ－アセチルオキシム）、２－ヒドロキシ－１－｛４－［４－（２－ヒドロキシ－２－メチル－プロピオニル）－ベンジル］フェニル｝－２－メチル－プロパン－１－オン、および１－［４－（２－ヒドロキシエトキシ）－フェニル］－２－ヒドロキシ－２－メチル－１－プロパン－１－オンからなる群から選択される１以上の重合開始剤を用いればよい。具体的には、ＩＲＧＡＣＵＲＥ　ＯＸＥ０２（ＢＡＳＦ社）、Ｏｍｎｉｒａｄ　１２７（ＩＧＭ　Ｒｅｓｉｎｓ社）、Ｏｍｎｉｒａｄ　２９５９（ＩＧＭ　Ｒｅｓｉｎｓ社）を例示することができる。
　固体表面に付着した液滴のｐＨの変化が大き過ぎると、細胞の成長速度が低下する、あるいは、スフェロイドの形態が一定しない、スフェロイドの組織再現性が低下するなどのおそれがある。このような観点からも上記特許出願に記載の合成高分子膜は好適に用いられる。
　図３Ａに、ヒト肝がん由来細胞株ＨｅｐＧ２をドロップ培養した結果（左）と、平面培養した結果（右）の倒立型位相差顕微鏡を用いて観察した像を示す。また、図３Ｂに、ドロップ培養法で得られたＨｅｐＧ２のスフェロイドを電子顕微鏡で観察した像を示す。図３Ｂの左は上面像であり、図３Ｂの右は側面像である。
　ドロップ培養は、以下の方法で行った。
　まず、ヒト肝がん由来細胞株ＨｅｐＧ２細胞を、一般的な培養条件であるダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ－ＭＥＭ）に最終濃度１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加した培地（細胞培養液）を用いて、温度３７℃、二酸化炭素濃度５％、相対湿度９５％の大気条件で、接着細胞培養用シャーレ（例えば、住友ベークライト株式会社製ＭＳ－１１６００）で維持培養を行った。
　次に、この維持培養を行っていたＨｅｐＧ２細胞を、一般的な細胞剥離液であるトリプシン溶液を用いて培養皿より剥離し、細胞が浮遊した状態における細胞密度を全自動細胞計測機（セルカウンター）で計測し、上記培地に１×１０５細胞／ｍＬになるように、細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液２５μＬを計量し、モスアイ構造を表面に有する光硬化樹脂膜の表面に液滴を形成するように付着させた。液滴は、３５ｍｍφディッシュ上に貼られたナノ突起フィルム上であれば、６～９個が最適であった。この液滴（２５μＬ）を上記と同じ大気条件（温度３７℃、二酸化炭素濃度５％、相対湿度９５％）で３日間培養した。液滴はこの大気条件においても、また培地中の浸透圧を調整するために培養液をその半量または全量を交換しても、その形状を維持していた。
　図３Ａの左に示したように、モスアイ構造を有する表面上でドロップ培養を行うと、概ね円形の外周を持ち、且つ、立体的なスフェロイドが形成された。立体的なスフェロイドが形成されていることは、図３Ｂの電子顕微鏡像からも確認できる。
　一方、図３Ａの右は、一般的な平面培養による結果を示している。図３Ａの右には、スフェロイドの形成は認められなかった。なお、一般的な平面培養は、ここでは、以下のようにして行った。
　一般的な細胞接着表面コート（親水性コート等）を施した培養用シャーレ（例えば、住友ベークライト株式会社製ＭＳ－３０９６又はＭＳ－１１３５０など、試験のための容量に合わせて選択する）に調製された細胞懸濁液を適量（９６穴プレートでは１００μＬ、３５ｍｍディッシュでは２ｍＬ）播種し、細胞が平面状に生育出来るよう培養を行った。
　図３Ｃにドロップ培養中の肝がん細胞株ＨｅｐＧ２の細胞生存数を求めた結果を示す。ここでは、同一細胞株の生細胞が同量持つエネルギーであることが知られているアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を測定することで定量した。図３Ｃ中の３Ｄがドロップ培養法、２Ｄは、一般的な平面培養法の結果を示す。
　図３Ｃから分かるように、ドロップ培養法による細胞生存数は、平面培養法による細胞生存数に対し、ほぼ同程度ある。従来の三次元培養法（例えば特許文献１）では、細胞生存数は、平面培養法よりも減少し、平面培養法による細胞生存数の７０％～８０％が得られれば、高効率に細胞が生存していると言われている。細胞生存数は、細胞密度にも依存するが、典型的な１×１０５細胞／ｍＬという播種密度においては、ドロップ培養法においては平面培養法とほぼ同等の細胞生存率が得られることが分かった。
　図３Ｄに、ドロップ培養法で得られた肝がん細胞ＨｅｐＧ２スフェロイドの組織再現性（または「遺伝子発現性」）を評価した結果を示す。図３Ｄ中の３Ｄがドロップ培養法、２Ｄは、一般的な平面培養法の結果を示す。
　ＨｅｐＧ２細胞においては、平面培養では肝細胞の機能はほとんど維持しないが、三次元培養を行うことで極性に従った細胞の配位が可能となり、特徴的な肝機能の１つである薬剤代謝酵素チトクロームＰ４５０の活性（以下、「ＣＹＰ活性」と略すことがある。）を回復させることが知られており、培養されたスフェロイドの組織再現性を評価する指標の１つとして用いられている。そこで、以下のようにして、Ｐ４５０活性を測定することによって、ドロップ培養法で得られた肝細胞スフェロイドの組織再現性を評価した。
　ドロップ培養法で得られたスフェロイドを用いて、Ｐ４５０－ＧｌｏＴＭＬｕｃｉｆｅｒｉｎ－ＩＰＡキット（プロメガ社製）を用い、インストラクションに従って細胞中の酵素活性を測定した。このとき、比較対象として、ＨｅｐＧ２細胞を液滴と同細胞数になるように平面培養を行い、同じ方法でＰ４５０活性の測定を行った。平面培養とドロップ培養においては、その細胞生育速度が異なることが予想されたため、細胞当たりの酵素活性の補正値を算出する必要がある。そのため、Ｐ４５０酵素活性の測定時と同条件で、ドロップ培養または平面培養を行った際の生細胞数を測定するため、ＡＴＰの定量を、Ｃｅｌｌ　Ｔｉｔｅｒ　ＧｌｏＲ　キット（プロメガ社製）を用いて行い、インストラクションに従ってＲＬＵ値を測定した。平面培養あるいはドロップ培養を行った際のＰ４５０酵素活性をＡＴＰ値で除し、平面培養の細胞あたり酵素活性値を１とした際のドロップ培養中のＨｅｐＧ２細胞の相対Ｐ４５０酵素活性値を求めグラフにしたものを図３Ｄに示した。
　図３Ｄから分かるように、ドロップ培養法で形成したＨｅｐＧ２スフェロイドでは、ＣＹＰ活性が３日間の培養で約１０倍に上昇しており、形成されたスフェロイドが高い組織再現性を有していると考えられる。
　上記のことから、固体表面上に液滴（ドロップ）を形成して培養を行うことによって、高い組織再現性を有するスフェロイドを形成できることがわかった。
　図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄに、種々の細胞をドロップ培養した結果（左）を平面培養した結果（右）と併せ示す。図４Ａは、ヒト胎児腎臓上皮細胞ＨＥＫ２９３をドロップ培養した結果の光学顕微鏡像（左）と、平面培養した結果の光学顕微鏡像（右）を示し、図４Ｂは、マウス脂肪前駆細胞３Ｔ３－Ｌ１をドロップ培養した結果の光学顕微鏡像（左）と、平面培養した結果の光学顕微鏡像（右）を示し、図４Ｃは、マウス間葉系幹細胞Ｃ３Ｈ１０ｔ１／２をドロップ培養した結果の光学顕微鏡像（左）と、平面培養した結果の光学顕微鏡像（右）を示し、図４Ｄは、マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２をドロップ培養した結果の光学顕微鏡像（左）と、平面培養した結果の光学顕微鏡像（右）を示す。
　図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄの結果から理解されるように、ドロップ培養法によると、スフェロイドの形成が確認されたのに対し、平面培養では、いずれもスフェロイドは形成されなかった。このことから理解されるように、ドロップ培養法は、幅広い細胞種の培養に好適に用いられる。
　次に、ドロップ培養法に好適に用いられる固体表面を検討した結果を説明する。
　［合成高分子膜］
　組成の異なる紫外線硬化性樹脂を用いて、図２Ａに示したフィルム５０Ａと同様の構造を有する試料フィルムを作製した。各試料フィルムの合成高分子膜３４Ａを形成する紫外線硬化性樹脂に使用した原材料を表１に示し、紫外線硬化性樹脂Ａ、ＢおよびＣの組成を表２に示す。樹脂Ａ、ＢおよびＣは、それぞれ、フッ素系の撥水撥油剤（撥水添加剤）を混合した。
　また、モスアイ構造を表面に形成する型は、上記特許文献５～８、上記特願２０１８－０４１０７３号に記載の方法で作製したポーラスアルミナ層を用いた。平坦な「型」としては、厚さが０．７ｍｍの無アルカリガラス（ＣＯＲＮＩＮＧ社製　ＥＡＧＬＥ　ＸＧ）を用いた。
　また、合成高分子膜３４Ａを形成する際に、各型に表３に示す離型処理を行った。フッ素系離型剤ＵＤ５０９（ダイキン工業株式会社製、ＯＰＴＯＯＬ　ＵＤ５０９、変性パーフルオロポリエーテル）の濃度を変えた３種類の処理を行った。
　型および合成高分子膜の表面（ドロップ培養法における固体表面）を特徴付けるパラメータとして、接触角を測定した。表３に型の表面の接触角を示す。固体表面の細胞懸濁液に対する接触角は、固体表面と細胞とが接触する面積（「液滴の底面積」ともいう。）および液滴の形状に影響を与える。細胞種にも依存するが、接触角によって、得られるスフェロイドの形状等が変わる。細胞種に応じて接触角を調整することが好ましい。
　接触角（静的接触角）の測定は、一般的な、θ／２法（ｈａｌｆ－ａｎｇｌｅ　Ｍｅｔｈｏｄ：（θ／２＝ａｒｃｔａｎ（ｈ／ｒ）、θ：接触角、ｒ：液滴の半径、ｈ：液滴の高さ））で行った。純水を用いた接触角の測定には、１μＬおよびドロップ培養法に用いられる液滴の体積を考慮し、１０μＬから７０μＬの液滴を用いた。培地を用いた接触角の測定には、ドロップ培養法に用いられる液滴の体積を考慮し、１０μＬから７０μＬの液滴を用いた。接触角は、時間に依存して変化する。したがって、液滴を付着させてから１秒後と、１０秒後の接触角を測定した。固体表面を特徴付けるための接触角は、液滴が固体表面に付着してから１０秒後の静的接触角をいうことにする。なお、「着滴せず」は接触角が１４０°以上であることを意味する。また、滑落角の測定には、接触角の測定と同様に、１０μＬから７０μＬの液滴を用いた。滑落角とは、液滴が付着した表面を水平方向から傾斜させ、液滴が下方に滑り始めた傾斜角をいう。
　培地としては、Ｄ－ＭＥＭ（Ｌｏｗ　Ｇｌｕｃｏｓｅ　１．０ｇ／Ｌ　Ｇｌｕｃｏｓｅ）／１０％ＦＢＳを用いた。なお、培地の種類、濃度による接触角および滑落角への影響はばらつきの範囲内であった。また、培地に細胞を加えることによる接触角への影響もばらつきの範囲内であった。
　表４に実験に用いた合成高分子膜（比較例１～１２、実施例１～１２）の作製に用いた型（離型処理の種類）および樹脂組成と、各合成高分子膜の表面の水に対する接触角を測定した結果を示す。接触角は、１μＬの純水を用いて測定した。液滴を表面に付着させてから１秒後および１０秒後の接触角と、１０秒後の接触角から１秒後の接触角を引いた差（Δ）を測定した結果を示す。
　表４から分かるように、多少のばらつきはあるものの、濃度の高い離型処理剤で処理した型を用いて作製した合成高分子膜程、撥水性が高い。また、平坦な表面とモスアイ構造を有する表面（以下、モスアイ表面という。）とを比較すると、モスアイ表面の方が接触角が大きく、撥水性が高い（ロータス効果）。実施例１、２、３のモスアイ表面は、接触角を測定する際に針先に形成された液滴をモスアイ表面に接触させても、液滴がモスアイ表面に付着せず、針先に残ったため、接触角を測定できなかった。接触角が概ね１４０°を超えると、このように液滴が、対象の表面に付着しないという現象が起こった。
　また、接触角の時間変化（Δ）を見ると、実施例１０、１１を除き、いずれも接触角の時間変化は小さく、安定している。実施例１０、１１の接触角の時間変化が大きかった理由については、離型剤の濃度が低く、モスアイ表面に撥水撥油剤が均一かつ十分に引き寄せられなかったためと考えられる。硬化性樹脂に含まれる撥水撥油剤は、型の離型処理によってモスアイ表面に引き寄せられるからである。
　表５、表７、表９、表１１に、液滴量（液滴の体積）を変えて、水に対する接触角と、培地に対する接触角とを測定した結果を示す。表５（比較例１－１～１２－１、実施例１－１～１２－１）は１０μＬの液滴を用いた結果を示し、表７（比較例１－２～１２－２、実施例１－２～１２－２）は３０μＬの液滴を用いた結果を示し、表９（比較例１－３～１２－３、実施例１－３～１２－３）は５０μＬの液滴を用いた結果を示し、表１１（比較例１－４～１２－４、実施例１－４～１２－４）は７０μＬの液滴を用いた結果を示している。
　接触角は、水および培地のいずれについても、モスアイ表面の方が平坦な表面よりも大きく、撥水性が高い。液滴の体積が大きくなるにつれて、重力の影響を受けて、液滴の形状が扁平になり、接触角が小さくなる傾向が、水および培地について認められる。また、ばらつきはあるものの、濃度の高い離型処理剤で処理した型を用いて作製した合成高分子膜程、撥水性が高い傾向が認められる。
　滑落角も、液滴の体積が大きくなるにつれて、重力の影響を受けて、小さくなる傾向が、水および培地について認められる。滑落角は、モスアイ表面の方が平坦な表面よりも大きく、モスアイ表面が有する微細な凸部の作用によると考えられる。すなわち、モスアイ表面は、高い撥水性を有しつつ、高い滑落角を維持できることが分かる。
　それぞれの合成高分子膜の表面を用いて三次元培養を行った結果を表６（比較例１－１～１２－１、実施例１－１～１２－１）、表８（比較例１－２～１２－２、実施例１－２～１２－２）、表１０（比較例１－３～１２－３、実施例１－３～１２－３）、表１２（比較例１－４～１２－４、実施例１－４～１２－４）に示す。
　スフェロイド化の評価は、光学顕微鏡による形態の観察によった。スフェロイド化のレベルを５段階で評価し、レベルの数字が大きい方がスフェロイド化の状態が良い状態（高密度集積）であると判定した。光学顕微鏡による形態観察結果の例を図５Ａ（レベル１）、図５Ｂ（レベル２）、図５Ｃ（レベル３）、図５Ｄ（レベル４）、図５Ｅ（レベル５）に示す。表６、８、１０および１２においては、レベル３以上のスフェロイドが形成されたものを○（良）、レベル２または１のスフェロイドが得られたものを△（可）とし、スフェロイドが認められなかったものを×（不可）とした。図５Ａは実施例１０－４、図５Ｂの左は実施例１０－３、中央は実施例１１－４、右は実施例１０－１、図５Ｃの左は実施例９－２、右は実施例８－４、図５Ｄは実施例６－２、図５Ｅの左は実施例３－２、右は実施例１－１のスフェロイドの光学顕微鏡像と、培地の接触角（１０秒後）および、接触角の変化（▼はマイナスを示す）を示している。
　培地交換の作業性は、接触角で評価した。接触角が１１０°以上を◎（優）、９０°以上１１０°未満を○（良）、９０°未満を△（可）とした。ただし、液滴の高さが１ｍｍを下回ると、培地交換の作業性が低下するので、×（不可）とした。ドロップ培養法は、生存性が高いので、細胞種によっては培養期間が長い（数日を超える）場合もある。そうすると、液滴中の培地が蒸発によって減少する。また、液滴中の老廃物が増加する。そのため、液滴に培地を付与する工程や、さらに、培地を付与する前に液滴から培地の一部を吸い取る工程を行うことが好ましい。このような培地を交換する操作をディスペンサ―を用いて効率よく行うためには、液滴の高さは１ｍｍ以上であることが好ましい。θ／２法で求められる接触角は、液滴の形状を円の一部と仮定して求められる（θ／２＝ａｒｃｔａｎ（ｈ／ｒ）、θ：接触角、ｒ：液滴の半径、ｈ：液滴の高さ）。この関係から、例えば、液滴の体積が７０μＬのとき、接触角が１７°のとき、高さｈが１ｍｍとなる（５０μＬのときは２０°、３０μＬのときは２６°、１０μＬのときは４４°で、それぞれ高さｈが１ｍｍとなる）。したがって、１０秒後の培地の接触角が１４．５°と１７°未満の実施例１０－４だけを×と判定した。
　ハンドリング性は、作業中に液滴が固体表面に安定に保持され易さを滑落角で評価した。固体表面上の液滴は、固体表面が傾斜する、あるいは、振動すると、移動する（滑るまたは転がる）ことがある。これを防止するためには、培養中に、固体表面を傾斜させない、あるいは、振動させない状態を維持する必要が生じるので、作業性が低下する。例えば、固体表面の培地に対する滑落角を４５°以上とすることによって、液滴を固体表面上に比較的安定に保持することができる。ハンドリング性は、滑落角が９０°以上を◎（優）、４５°以上９０°未満を○（良）、１０°以上４５°未満を△（可）、１０°未満を×（不可）とした。
　表６、８、１０、１２におけるスフェロイド化の評価結果をみると、平坦な表面を用いた比較例では、いずれもスフェロイドの形成が認められなかったのに対し、モスアイ表面を用いた、すべての実施例でスフェロイドの形成が認められたことがわかる。また、実施例においては、図５Ａ～図Ｅからも分かるように、接触角が大きいほど、良い状態のスフェロイドが得られる傾向が認められる。これは、接触角が大きいほど、液滴の形状が球に近く、液滴の底面で細胞が高密度に集積させるためと考えられる。接触角は、少なくとも１７°以上であることが好ましく、９０°以上であることがさらに好ましい。接触角は着滴から１０秒後の値が上記の条件を満足すればよい。
　また、実施例１１－４（図５Ｂ中央）および実施例１０－１（図５Ｂ右）と、実施例８－４（図５Ｃ右）とを比較すると分かるように、接触角の差Δが小さい方が、良い状態のスフェロイドが得られる傾向が認められる。これは、着滴後１０秒間での接触角変化量が小さいほど、培養期間中の液滴の形状が維持されやすく（扁平になり難く）、その結果、液滴の形状による細胞の集積効果が、より多く得られたと考えられる。
　液滴の形成および操作性等の観点から、液滴の体積は１０μＬ以上５０μＬ以下であることが好ましい（表６、８、１０参照、特に実施例１～６）。
　液滴に含まれる細胞の播種密度は、例えば、１０３細胞／ｍＬ以上１０７細胞／ｍＬ以下である。液滴に含まれる細胞の数を正確に制御できる点がドロップ培養法の利点の１つである。細胞の数は、典型的に上記の範囲であるが、細胞種や液滴の体積等に応じて、適宜調整され得る。
　上述したように、ハンドリング性の観点から、液滴の滑落角は４５°以上であることが好ましく、９０°以上であることがさらに好ましい。滑落角は着滴から２０秒後の値で評価すればよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
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Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　上述したように、本発明の実施形態によると、従来の三次元培養法よりも、作業性または量産性に優れた、および／または、組織再現性の高いスフェロイドを得ることができる三次元培養法が提供される。
　実施例で例示したモスアイ構造を有する表面を備える合成高分子膜の様に、高さが１０ｎｍ以上１ｍｍ以下の複数の凸部を有する固体表面を備える三次元培養構造体は、ドロップ培養法に好適に用いられる。そのような三次元培養構造体は、例えば、シャーレの内側底面に、上記の合成高分子膜を貼り付けることによって得られる。すなわち、三次元培養構造体は、例えばシャーレ等の容器として提供され得る。
　また、そのような三次元培養構造（例えば容器）を用いてドロップ培養を行うことによって、従来よりも組織再現性の高いスフェロイドを表面に有する三次元培養構造（例えば容器）を製造することができる。このようなスフェロイドを表面に有する三次元培養構造は、創薬や再生医療の研究開発に好適に用いられる。
　本発明の実施形態による三次元細胞培養法は、創薬や再生医療等に広く用いられ得る。
　１０Ｓ　　固体表面
　１０Ｓｐ　凸部
　１２Ｃ　　細胞
　１４Ｍ　　培地
　１６Ｄ　　液滴

Claims (16)

  1. 　細胞と培地とを含む細胞懸濁液を用意する工程と、
    　高さが１０ｎｍ以上１ｍｍ以下の複数の凸部を有する固体表面を用意する工程と、
    　前記固体表面上に、前記細胞懸濁液の液滴を付着させる工程と、
    　前記液滴に作用する重力の方向が前記固体表面に向かう状態で、前記細胞を前記液滴中で培養する工程と
    を包含する、三次元培養法。
  2. 　前記固体表面の法線方向から見たとき、前記複数の凸部の２次元的な大きさは１０ｎｍ以上５００ｎｍ以下の範囲内にある、請求項１に記載の三次元培養法。
  3. 　前記複数の凸部の高さは、１０ｎｍ以上５００ｎｍ以下である、請求項１または２に記載の三次元培養法。
  4. 　前記複数の凸部の隣接間距離は、１０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下である、請求項１から３のいずれかに記載の三次元培養法。
  5. 　前記複数の凸部は略円錐形の先端部分を有する、請求項１から４のいずれかに記載の三次元培養法。
  6. 　前記固体表面の前記細胞懸濁液に対する接触角が１７°以上である、請求項１から５のいずれかに記載の三次元培養法。
  7. 　前記固体表面の前記細胞懸濁液に対する接触角が９０°以上である、請求項１から６のいずれかに記載の三次元培養法。
  8. 　前記固体表面の前記細胞懸濁液に対する滑落角は４５°以上である、請求項１から７のいずれかに記載の三次元培養法。
  9. 　前記固体表面は、合成高分子から形成されている、請求項１から８のいずれかに記載の三次元培養法。
  10. 　前記液滴の体積は１０μＬ以上５０μＬ以下である、請求項１から９のいずれかに記載の三次元培養法。
  11. 　前記液滴に含まれる前記細胞の播種密度は１０３細胞／ｍＬ以上１０７細胞／ｍＬ以下である、請求項１から１０のいずれかに記載の三次元培養法。
  12. 　前記液滴の高さは１ｍｍ以上である、請求項１から１１のいずれかに記載の三次元培養法。
  13. 　前記細胞を前記液滴中で培養している間に、前記液滴に前記培地を付与する工程をさらに包含する、請求項１から１２のいずれかに記載の三次元培養法。
  14. 　前記培地を付与する前に、前記液滴から前記培地の一部を吸い取る工程をさらに包含する、請求項１３に記載の三次元培養法。
  15. 　請求項１から１４のいずれかに記載の三次元培養法に用いられる固体表面を有する、三次元培養構造体。
  16. 　前記固体表面を有する三次元培養構造体を用意し、請求項１から１４のいずれかに記載の三次元培養法を用いて培養されたスフェロイドを前記固体表面に有する三次元培養構造体を製造する方法。
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