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WO2020054829A1 - ミトコンドリアのリンパ器官への移植およびそのための組成物 - Google Patents

ミトコンドリアのリンパ器官への移植およびそのための組成物 Download PDF

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WO2020054829A1
WO2020054829A1 PCT/JP2019/036011 JP2019036011W WO2020054829A1 WO 2020054829 A1 WO2020054829 A1 WO 2020054829A1 JP 2019036011 W JP2019036011 W JP 2019036011W WO 2020054829 A1 WO2020054829 A1 WO 2020054829A1
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WO
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cells
mitochondria
mitochondrial
cell
thymus
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PCT/JP2019/036011
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English (en)
French (fr)
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正司 菅沼
原島　秀吉
勇磨 山田
佐々木　大輔
貴史 横田
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Luca Science Inc
Original Assignee
Luca Science Inc
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Publication date
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Priority to US17/275,983 priority patent/US12268714B2/en
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/34—Muscles; Smooth muscle cells; Heart; Cardiac stem cells; Myoblasts; Myocytes; Cardiomyocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders

Definitions

  • the present invention relates to methods for isolating and transplanting mitochondria into lymphoid organs, compositions of cells prepared using the methods described herein, and producing cells described herein. Provide a way to
  • Mitochondrial dysfunction such as impairment of the respiratory chain complex, is an important cause of mitochondrial disease and aging. Decreased mitochondrial function affects cells of many major organs associated with mitochondrial disease and age-related diseases. Furthermore, mitochondrial dysfunction affects the energy metabolism of immunocompetent cells. For example, monocyte macrophages and dendritic cells involved in innate immunity are mainly dependent on anaerobic glycolysis that does not depend on mitochondria. It has also been shown that memory and regulatory T cells rely on oxidative phosphorylation (OXPHOS) via fatty acid oxidation. In addition, age-related decline in T cell function has been reported as a typical sign of so-called immunosenescence.
  • OXPHOS oxidative phosphorylation
  • the present application addresses an unmet need to enhance or improve the function of lymphoid organs, such as the thymus, through the isolation and transfer of mitochondria. Furthermore, the present invention addresses an unmet need for transplantation of isolated mitochondria into both adherent and floating cells.
  • Ndufs4 is a gene encoding a subunit of mitochondrial respiratory chain complex I, and this genetic abnormality results in loss of function of mitochondrial respiratory chain complex I.
  • local administration of mitochondria to the thymus resulted in mitochondria being widely distributed in thymic tissue.
  • the thymus is a key organ involved in the development of acquired immune system cells.
  • T cells are produced in the thymus and mature in the thymus.
  • administration of mitochondria to the thymus is believed to at least partially reduce acquired immune abnormalities, particularly due to T cell abnormalities.
  • the methods of the present invention comprise: (a) purifying mitochondria isolated from the donor cell; (b) a time sufficient to produce isolated mitochondria that express a membrane translocation sequence. Co-culturing the isolated mitochondria with one or more peptides comprising a membrane translocation sequence; and (c) transplanting the isolated mitochondria expressing the membrane translocation sequence into recipient cells. Transplanting exogenous mitochondria into recipient cells.
  • the one or more peptides can include a membrane translocation sequence that is a cell membrane permeable peptide, a mitochondrial fusogenic peptide, or both.
  • one or more peptides is a peptide conjugate.
  • the peptide conjugate comprises a peptide and a lipid.
  • the lipid is attached to the N-terminus of the peptide.
  • the lipid is attached to the C-terminus of the peptide.
  • the lipid allows the peptide to be embedded in the mitochondrial membrane.
  • Some embodiments further include co-culturing the isolated mitochondria with one or more portions.
  • one or more moieties comprises polyethylene glycol.
  • one or more moieties comprises an aptamer.
  • Some embodiments further include activating mitochondria from donor cells prior to isolating mitochondria.
  • mitochondrial activation is performed using a mitochondrial directional carrier (eg, MITO-Porter) that encapsulates the chemical.
  • the chemical agent is coenzyme Q10 (CO-Q-10), resveratrol, nicotinamide riboside, n-acetylcysteine, ⁇ -tocopherol, omega-3 fatty acids, glucosamine, creatine monohydrate Acetyl-l-carnitine, epicatechin, quercetin, an autophagy inducer, and an apoptosis inhibitor.
  • Coenzyme Q10 can be in a reduced form.
  • the donor cells are derived from an organ that can include the thymus, spleen, lymph nodes, heart, lung, pancreas, liver, skin, kidney, blood, muscle, or lymph vessels.
  • the donor cells are selected from the group consisting of fibroblasts, hepatocytes, platelets, myocytes, and inducible pluripotent stem cells (iPSCs).
  • the donor cells include cells that are autologous or allogeneic.
  • the recipient cells are cells from organs including thymus, spleen, lymph nodes, heart, lung, pancreas, liver, skin, kidney, blood, lymph vessels, eyes, nose or ears.
  • the recipient cells are inducible pluripotent stem cells (iPSCs).
  • the recipient cells are from a host having an age-related disease.
  • the recipient cell is an aged host (eg, a host aged 40 or older, a host aged 45 or older, a host aged 50 or older, a host aged 55 or older, a host aged 60 or older, a host aged 65 or older. Above-mentioned hosts, and those 70 years of age or older).
  • the recipient cells are from a host having a mitochondrial disease.
  • the recipient cells consist of thymus, spleen, lymph nodes, heart, lung, pancreas, liver, skin, kidney, blood, bone marrow, synovium, lymphatic vessels, brain, eyes, nose and ears Cells in an organ selected from the group (eg, an intact organ).
  • Some embodiments further include performing the transplantation in vivo.
  • performing the transplantation in vivo comprises a mitochondrial tropic carrier (eg, MITO-Porter).
  • the mitochondrial tropic carrier eg, MITO-Porter
  • the mitochondrial tropic carrier comprises one or more peptides bound to the surface of the mitochondrial tropic carrier (eg, MITO-Porter).
  • the one or more peptides bound to the surface of the mitochondrial tropic carrier are identical to the one or more peptides used to co-culture with the isolated mitochondria. It is.
  • the mitochondrial tropic carrier eg, MITO-Porter
  • the mitochondrial tropic carrier is CO-Q-10, resveratrol, nicotinamide riboside, n-acetylcysteine, ⁇ -tocopherol, omega-3 fatty acids, glucosamine, And at least one chemical agent selected from the group consisting of creatine monohydrate, acetyl-l-carnitine, epicatechin, quercetin, an autophagy inducer, and an apoptosis inhibitor.
  • the transplant is an organ selected from the group consisting of heart, liver, ear, eye, thymus, brain, lung, endothelial cells, lymph nodes, bone marrow, blood, lymph vessels, nose, spleen, and synovium. Made against.
  • the transplant is to an organ selected from the group consisting of thymus, spleen, and bone marrow.
  • the transplant is made to primary lymphoid tissue.
  • the transplant is made to secondary lymphoid tissue.
  • Primary lymphoid tissues include bone marrow and thymus
  • secondary lymphoid tissues include spleen, lymph nodes, and Peyer's patches.
  • implantation is performed using interventional radiology (IVR) -computed tomography (CT).
  • IVR-CT interventional radiology
  • CT computed tomography
  • the IVR-CT is an X-ray CT.
  • the implantation is via intrathymic injection.
  • Some embodiments further include using a post-implant support.
  • the post-implant support includes appropriate physical exercise or prescribed breathing techniques.
  • composition of cells prepared using the methods provided herein.
  • a method for transplanting intact exogenous mitochondria into recipient cells including: (A) Purifying mitochondria isolated from donor cells. (B) co-culturing the isolated mitochondria with one or more peptides comprising a membrane transport sequence for a time sufficient to produce an isolated mitochondria expressing the membrane transport sequence; (C) transplanting the isolated mitochondria expressing the membrane trafficking sequence into recipient cells. [2] The method of the above-mentioned [1], wherein the one or more peptides containing a membrane transport sequence are selected from the group consisting of a cell membrane permeable peptide and a mitochondrial fusogenic peptide.
  • the chemical agent is CO-Q-10, resveratrol, nicotinamide riboside, n-acetylcysteine, ⁇ -tocopherol, omega-3 fatty acid, glucosamine, creatine monohydrate, acetyl-1-carnitine
  • the donor cell is derived from an organ selected from the group consisting of thymus, spleen, lymph node, heart, lung, pancreas, liver, skin, kidney, blood, muscle, and lymphatic vessel
  • the donor cells are selected from the group consisting of fibroblasts, hepatocytes, platelets, muscle cells, and inducible pluripotent stem cells (iPSCs).
  • iPSCs inducible pluripotent stem cells
  • the recipient cell is a cell from an organ selected from the group consisting of thymus, spleen, lymph node, heart, lung, pancreas, liver, skin, kidney, blood, lymphatic vessels, eyes, nose and ears And the method according to any one of the above [1] to [16].
  • the recipient cell is an inducible pluripotent stem cell (iPSC).
  • iPSC inducible pluripotent stem cell
  • the method of the above-mentioned [22], wherein performing the transplantation in vivo comprises a mitochondrial tropic carrier (eg, MITO-Porter).
  • a mitochondrial tropic carrier eg, MITO-Porter
  • the mitochondrial directional carrier for example, MITO-Porter
  • the mitochondrial directional carrier includes one or more peptides bound to the surface of the mitochondrial directional carrier (for example, MITO-Porter).
  • one or more peptides bound to the surface of the mitochondrial tropic carrier eg, MITO-Porter
  • a mitochondrial directional carrier for example, MITO-Porter
  • MITO-Porter is CO-Q-10, resveratrol, nicotinamide riboside, n-acetylcysteine, ⁇ -tocopherol, omega-3 fatty acid, glucosamine, creatine monohydrate
  • [30] The method of any of the above-mentioned [22]-[29], wherein the transplantation is via intrathymic injection.
  • the post-implantation support includes an appropriate physical exercise or a prescribed breathing method.
  • [1A] A pharmaceutical preparation containing mitochondria, which is administered to at least one tissue selected from the group consisting of primary lymph tissue and secondary lymph tissue.
  • [2A] The pharmaceutical preparation of the above-mentioned [1A], wherein the mitochondria are isolated mitochondria.
  • [3A] The pharmaceutical preparation according to the above [1A] or [2A], wherein the mitochondria are treated with a mitochondrial activator.
  • [4A] The pharmaceutical preparation of the above-mentioned [1A], wherein the mitochondria are present in a cell.
  • [5A] The pharmaceutical preparation according to the above [4A], wherein the cells are non-immune cells.
  • [6A] The pharmaceutical preparation according to the above [5A], wherein the cell is a cell selected from the group consisting of a myocardial stem cell and a myocardial progenitor cell.
  • [7A] The pharmaceutical preparation according to the above [4A], wherein the cell is an immune cell subjected to a mitochondrial activation treatment.
  • [8A] The pharmaceutical preparation according to the above [4A] or [7A], wherein the cell is an immune cell having MITO-Porter.
  • [9A] The pharmaceutical preparation according to any one of the above [1A] to [8A], wherein the administration subject has mitochondria having a dysfunction.
  • [10A] Use of mitochondria in the manufacture of a pharmaceutical preparation containing mitochondria, which is administered to at least one tissue selected from the group consisting of primary lymphoid tissue and secondary lymphoid tissue.
  • [11A] The use of the above-mentioned [10A], wherein the mitochondria are isolated mitochondria.
  • [12A] The use of the above-mentioned [10A] or [11A], wherein the mitochondria have been treated with a mitochondrial activator.
  • [13A] The use of the above-mentioned [10A], wherein the mitochondria are present in a cell.
  • [14A] The use of [10A], wherein the cell is a non-immune cell.
  • [15A] The use according to [10A], wherein the cell is a cell selected from the group consisting of cardiomyocyte stem cells and cardiomyocyte precursor cells.
  • [16A] The use according to [10A], wherein the cell is an immune cell that has been subjected to a mitochondrial activation treatment.
  • [17A] The use according to [13A] or [16A], wherein the cell is an immune cell having MITO-Porter.
  • [18A] The use according to any one of [10A] to [17A], wherein the administration subject has mitochondria having a dysfunction.
  • FIG. 1 shows a comparison of the number of cells in the thymus of wild-type (WT), Ndufs4 heterozygous knockout mouse (Het), and Ndufs4 homozygous knockout mouse (Homo).
  • FIG. 2 shows a comparison of the number of cells in the thymus per body weight (BW) of wild-type (WT), Ndufs4 heterozygous knockout mouse (Het), and Ndufs4 homozygous knockout mouse (Homo).
  • BW thymus per body weight
  • FIG. 3 shows a comparison of the number of CD4 / CD8 double negative cells per body weight (BW) of wild type (WT), Ndufs4 heterozygous knockout mouse (Het), and Ndufs4 homozygous knockout mouse (Homo).
  • FIG. 4 shows a comparison of the number of CD4 / CD8 double positive cells per body weight (BW) of wild type (WT), Ndufs4 heterozygous knockout mouse (Het), and Ndufs4 homozygous knockout mouse (Homo).
  • FIG. 4 shows a comparison of the number of CD4 / CD8 double positive cells per body weight (BW) of wild type (WT), Ndufs4 heterozygous knockout mouse (Het), and Ndufs4 homozygous knockout mouse (Homo).
  • FIG. 5 shows a comparison of the total number of mononuclear cells in the spleen of wild-type (WT), Ndufs4 heterozygous knockout mouse (Het), and Ndufs4 homozygous knockout mouse (Homo), and the B cell progenitor (B cell progenitor). A comparison of the percentage of all cells is shown.
  • FIG. 6 shows a scheme for isolating hematopoietic progenitor cells in the bone marrow of a wild-type (WT), Ndufs4 heterozygous knockout mouse (Het), and Ndufs4 homozygous knockout mouse (Homo) and a scheme for a subsequent culture experiment.
  • FIG. 1 shows a comparison of the total number of mononuclear cells in the spleen of wild-type (WT), Ndufs4 heterozygous knockout mouse (Het), and Ndufs4 homozygous knockout mouse (Homo) and a scheme for
  • FIG. 7 shows a comparison of the number of CD45-positive cells after culturing hematopoietic progenitor cells of wild-type (WT), Ndufs4 heterozygous knockout mouse (Het), and Ndufs4 homozygous knockout mouse (Homo).
  • FIG. 8 shows a comparison of the number of Mac1 + bone marrow cells after culturing hematopoietic progenitor cells of wild-type (WT), Ndufs4 heterozygous knockout mouse (Het), and Ndufs4 homozygous knockout mouse (Homo).
  • FIG. 8 shows a comparison of the number of Mac1 + bone marrow cells after culturing hematopoietic progenitor cells of wild-type (WT), Ndufs4 heterozygous knockout mouse (Het), and Ndufs4 homozygous knockout mouse (Homo).
  • FIG. 9 shows a comparison of the number of CD19-positive B cells after culturing hematopoietic progenitor cells of wild-type (WT), Ndufs4 heterozygous knockout mouse (Het), and Ndufs4 homozygous knockout mouse (Homo).
  • FIG. 10 shows a scheme of a transplantation experiment of normal bone marrow mononuclear cells into irradiated wild-type (WT), Ndufs4 heterozygous knockout mouse (Het), and Ndufs4 homozygous knockout mouse (Homo).
  • FIG. 11 shows a comparison of survival curves of wild-type mice that had undergone bone marrow transplantation and mice that did not.
  • FIG. 10 shows a scheme of a transplantation experiment of normal bone marrow mononuclear cells into irradiated wild-type (WT), Ndufs4 heterozygous knockout mouse (Het), and Ndufs4 homozygous knockout mouse (
  • FIG. 12 shows a comparison of survival curves of Ndufs4 homo-knockout mice with and without bone marrow transplantation.
  • FIG. 13 shows the state of engraftment of donor bone marrow in wild-type mice, hetero-knock-out mice, and homo-knock-out mice that have undergone bone marrow transplantation. As a negative control, engraftment of donor bone marrow in homozygous knockout mice without bone marrow transplantation is also shown.
  • FIG. 14 shows the distribution of mitochondria derived from MITO-Cell in the thymus three days after mitochondrial activation-treated CPC (MITO-Cell) was transplanted to the surface of the thymus.
  • FIG. 15 shows the distribution of mitochondria derived from MITO-Cell in the thymus three days after mitochondrial activation-treated CPC (MITO-Cell) was transplanted to the surface of the thymus.
  • FIG. 16 is a diagram illustrating an assay system for detecting mitochondrial movement between cells.
  • FIG. 17 is a fluorescence microscope image of the cells 24 hours after co-culture of a mouse CPC stained with mitochondria red and a mouse CPC stained with mitochondria green at a ratio of 1: 1. The left panel is red, the center panel is green, and the right panel is a superimposed image. In the superimposed images, the cells indicated by arrowheads are yellow, and it has been detected that mitochondrial migration between cells has occurred.
  • FIG. 17 is a fluorescence microscope image of the cells 24 hours after co-culture of a mouse CPC stained with mitochondria red and a mouse CPC stained with mitochondria green at a ratio of 1: 1. The left panel is red, the center panel is green, and the right panel is a superimposed image
  • FIG. 18 is a fluorescence microscope image of the cells after 24 hours of co-culturing H9c2 cells with mitochondria stained green and CPC with mitochondria stained red. A superimposed image of the red and green images is shown in the left panel, and the cells indicated by arrowheads are yellow, indicating that mitochondrial migration between cells has occurred. The right superimposed image is an enlarged view of a square area of the left image.
  • FIG. 19 is a fluorescence microscopic image of the cells 24 hours after co-culture of H9c2 cells stained with mitochondria green and CPC stained with mitochondria red. The left panel is red, the center panel is green, and the right panel is a superimposed image. In the superimposed images, the cells indicated by arrowheads are yellow, and it has been detected that mitochondrial migration between cells has occurred.
  • FIG. 20 is a diagram showing intercellular movement of RES-MITO-Porter from MITO-Cell.
  • FIG. 21 is a diagram showing intercellular movement of RES-MITO-Porter from MITO-Cell.
  • FIG. 22 is a diagram showing mitochondria migrating from wild-type CPC to CPC of Ndufs4 homo-knockout mouse.
  • the present invention provides healthy mitochondria with fewer genetic mutations to restore the function of target immune cells and promote a healthy immune system. Improving the quality and quantity of immune cells such as T cells by transplanting into lymphatic organs such as the thymus. Thus, the improved immune cells can ameliorate mitochondrial and age-related diseases.
  • mitochondria are first isolated.
  • isolated when referring to mitochondria, refers to being removed from the cell.
  • purification refers to improving the degree of purification by further separating at least one or more components mixed in the isolated product.
  • the donor tissue is from a healthy donor.
  • fibroblasts that can be safely cultured in large quantities will be used rather than cells having a high mitochondrial content per cell, such as hepatocytes, platelets, muscle cells, or iPSCs.
  • Fibroblasts can be obtained, for example, by skin biopsy.
  • a tissue biopsy is performed on the donor to extract a sufficient amount of fibroblasts.
  • the tissue biopsy is from a tissue section that is about 4 mm in diameter.
  • the fibroblasts are obtained from a commercial source.
  • commercially available fibroblasts are prepared according to GCP standards.
  • a tissue biopsy is performed on the donor to extract a sufficient amount of mesenchymal stem cells, or myocardial stem cells (or myocardial progenitor cells).
  • the mitochondrial function of fibroblasts is activated prior to isolation.
  • the isolated high quality mitochondria are transplanted into recipient cells with aberrant mitochondrial genes and respiratory chain complex activity.
  • the isolated high quality mitochondria are transplanted into recipient cells having an abnormal mitochondrial gene derived from maternal inheritance.
  • the isolated high quality mitochondria are transplanted into recipient cells having an abnormal mitochondrial gene derived from a nuclear gene.
  • mitochondrial function is achieved by encapsulating CoQ-10 in a mitochondrial tropic carrier (eg, MITO-Porter) and co-culturing it with donor cells (eg, fibroblasts, etc.).
  • a mitochondrial tropic carrier eg, MITO-Porter
  • donor cells eg, fibroblasts, etc.
  • the mitochondrial directional carrier eg, MITO-Porter
  • agents that can activate mitochondria include CO-Q-10, resveratrol, nicotinamide riboside, n-acetylcysteine, ⁇ -tocopherol, omega-3 fatty acids, glucosamine, creatine monohydrate, acetyl- Examples include, but are not limited to, carnitine, epicatechin, quercetin, autophagy inducers, and apoptosis inhibitors.
  • the mitochondrial tropic carrier is a vesicle in which mitochondrial tropic molecules are expressed on the membrane surface.
  • the vesicle is, for example, a liposome composed of a lipid bilayer, and dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) and phosphatidic acid. (PA) and / or sphingomyelin (SM).
  • DOPE dioleoyl phosphatidylethanolamine
  • PA phosphatidic acid.
  • SM sphingomyelin
  • mitochondria-directing molecules include R8 peptide, mitochondrial targeting signal (MTS) peptide (Kong, BW. Et al., Biochimica et et Biophysica Acta 2003, 1625, pp. 98-108) and S2 peptide (Szeto, H). H. et al., Pharm. Res.
  • TPP Lipophilic triphenylphosphonium cation
  • Rhodamine 123 fat-soluble cationic substances
  • Drugs can be introduced into vesicles (eg, liposomes) by chemical methods such as ionic, hydrophobic, and covalent bonds between the lipids constituting the liposomes and the drug. A drug may be enclosed in the lumen.
  • Mitochondrial directional carriers also include DQAsome (Weissig, V. et al., J. Control. Release 2001, 75, pp. 401-408) and MITO-Porter (Yamada, Y. et al., Biochim Biophys. Acta. 2008, 1778, pp.
  • DF-MITO-Porter Yamada, Y. et al., Mol. Ther. 2011, 19, pp. 1449-1456
  • modified DF-modified with S2 peptide examples include mitochondria-directed liposomes such as MITO-Porter (Kawamura, E. @et. Al., Mitochondrion 2013, 13, pp. 610-614).
  • the R8 peptide and the S2 peptide are peptides having mitochondrial tropism and cell membrane permeability.
  • high quality mitochondria can be isolated from intracellularly by using digitonin to increase the permeability of mitochondrial-containing cells.
  • the membrane transport function is added to the surface of the outer mitochondrial membrane by co-culturing the isolated mitochondria and a peptide having two membrane transport sequences.
  • the two peptides are peptides that include a membrane trafficking sequence, such as a cell membrane permeable peptide and a mitochondrial fusogenic peptide.
  • the peptide is a peptide conjugate.
  • Peptide conjugates can include peptides and lipids. Lipids may be attached to the N-terminus of the peptide, the C-terminus of the peptide, or both. In some aspects, lipids allow peptides to be embedded in mitochondrial membranes.
  • the method further comprises co-culturing the isolated mitochondria with one or more portions.
  • one or more moieties comprises polyethylene glycol.
  • one or more moieties comprises an aptamer.
  • mitochondrial transplantation is performed using trehalose buffer.
  • Mitochondrial dysfunction is an important cause of mitochondrial disease, immune disorders and aging. Many of the major organs are affected by impaired mitochondrial function. In addition, mitochondrial dysfunction causes imbalances in both innate and acquired immunity, and may play an important role in mitochondrial disease and aging.
  • early thymic progenitor cells differentiate from hematopoietic stem cells and proliferate (up to 1 million fold) and differentiate, eg, reconstitute the T cell receptor (TCR) gene, select T cells that recognize TCR-recognizing autologous MHC ( Positive selection), removal of T cells recognizing self antigens (negative selection) results in the development of mature CD4 and CD8 expressing T cells.
  • Thymic epithelial cells TEC of the medulla and cortical thymic stroma assist in the differentiation of thymic T cells. In normal organ tissue, the epithelial cells adhere and arrange in sheets, while the TEC has a sponge-like structure.
  • Early thymic progenitor cells proliferate, differentiate, mature, and migrate from the thymus, moving from the cortex to the medulla between TECs present in a three-dimensional structure.
  • Cysteine S-nitrosylation with post-translational modification using nitric oxide a redox-related protein modification
  • the thymus is highly mitochondrial-dependent, similar to brain, heart, lung, liver, and kidney It turned out to be an organ.
  • reduced mitochondrial function of TECs and T cells is associated with abnormalities in the T cell maturation process in the thymus, and T cell subsets such as reduced CD8 + and CD4 + cells, reduced CD4 + na ⁇ ⁇ ve T cells, and increased memory T cells.
  • thymic lymphocytes are most numerous during puberty (around the age of teens), have a peak thymus weight of 30 to 40 g, then rapidly regress, and are almost depleted by the age of 70.
  • ROS reactive oxygen species
  • isolated mitochondria are prepared and a membrane trafficking signal is added. The mitochondria with increased membrane permeability are then transported to cells.
  • highly purified isolated mitochondria are prepared and a high membrane trafficking signal is added. Mitochondria with high membrane trafficking signals are then transported to cells.
  • mitochondria can be optionally activated in donor cells before or after mitochondrial isolation.
  • the process of activating mitochondria is referred to as “mitochondrial activation process”.
  • Various methods for activating mitochondria can be used, including, but not limited to, using a mitochondria-directed carrier (eg, MITO-Porter) encapsulating a chemical.
  • the chemical agent can be any agent that can activate mitochondria.
  • drugs include CO-Q-10, resveratrol, nicotinamide riboside, n-acetylcysteine, ⁇ -tocopherol, omega-3 fatty acids, glucosamine, creatine monohydrate, acetyl-carnitine, epicatechin, quercetin , An autophagy inducer, or an apoptosis inhibitor.
  • the agent can be an electron donor for any one or more or all of mitochondrial respiratory chain complexes I, III, and IV.
  • the agent may be a substrate for any one or more or all of mitochondrial respiratory chain complexes I, III, and IV.
  • the agent can be a biocompatible antioxidant.
  • the agent can be resveratrol.
  • mitochondria can be isolated from donor cells.
  • the donor cells are derived from an organ such as spleen, lymph node, heart, lung, pancreas, liver, skin, kidney, blood, muscle, and lymphatic vessels.
  • the donor cells are selected from the group consisting of fibroblasts, hepatocytes, platelets, muscle cells, and iPSCs.
  • Autologous transplantation or allogeneic transplantation may be used for the donor cells, and autologous transplantation or allogeneic transplantation can be appropriately selected according to the characteristics of the abnormal mitochondrial function in the recipient cells.
  • the recipient cells are derived from organs such as thymus, spleen, lymph nodes, heart, lung, pancreas, liver, skin, kidney, blood, lymph vessels, eyes, nose and ears.
  • the recipient cells are inducible pluripotent stem cells (iPSCs).
  • TEC adherent thymic epithelial cells
  • floating thymic lymphocytes adherent thymic epithelial cells
  • the recipient cells are adherent TECs, floating thymic lymphocytes, or both.
  • the recipient cells are adherent cells from a sold organ, such as cardiomyocytes of the heart, hepatocytes of the liver, and neurons of the brain.
  • Transplantation of mitochondria from donor cells to recipient cells can help improve the function of recipient cells, including but not limited to mitochondrial function.
  • the recipient cell is a mitochondria that has a normal function or requires improved mitochondria.
  • the recipient cells are derived from a host having an age-related disease. In other embodiments, the recipient cells are from a host having a mitochondrial disease.
  • the recipient cells can be in an intact organ.
  • the recipient cells can be derived from organs such as the thymus, spleen, lymph node, heart, lung, pancreas, liver, skin, kidney, blood, lymphatic vessels, eyes, nose and ears, and the cells can be found in the organ.
  • the improvement in mitochondrial function in recipient cells after mitochondrial transplantation can be proportional to the number of normally functioning or high quality donor mitochondria that are taken up by the recipient cells.
  • the recipient cells take up the donor mitochondria by macropinocytosis.
  • a peptide having a cell membrane trafficking sequence is added to the donor mitochondria to improve mitochondrial uptake by macropinocytosis.
  • co-culture of MELAS cybrid cells with mitochondria to which a high membrane trafficking signal has been added enables rapid and long-term uptake of mitochondria.
  • exogenous mitochondrial uptake can enhance endogenous mitochondrial function.
  • the mitochondria can express one or more membrane trafficking sequences that target one or more recipient cell types.
  • mitochondria can express a mixture of two or more different membrane trafficking peptides that target epithelial cells such as TECs and floating thymic lymphocytes.
  • Mitochondria are also transmitted by somatic cell nuclear transfer.
  • Mitochondrial transplantation is intended mainly for the activation of endogenous mitochondrial function, and mitochondrial local transplantation reduces the risk of alloantigenicity.
  • transplantation of intact autograft mitochondria into recipient cells is not immunogenic.
  • transfer of the intact allograft mitochondria to the recipient cells is not immunogenic.
  • Oxidylcholine can damage cells.
  • intact may mean that there is no or little damage to the cell without damaging it.
  • intact may mean maintaining physiologically normal function.
  • intact may mean that mitochondria maintain the outer and inner membrane.
  • intact may mean that mitochondria (the inner membrane) have a membrane potential.
  • intact may mean that the mitochondria are intact.
  • Mitochondria are contained intracellularly. Therefore, mitochondrial transplantation can also be achieved by transplanting cells. According to this example, mitochondria resulted in wide distribution in the thymus even after cell transplantation. According to this example, it was shown that mitochondria move between cells without staying inside the cells. Therefore, transplanting cells containing healthy mitochondria (eg, healthy mitochondria with few genetic mutations) has advantages equivalent to mitochondrial transplantation.
  • healthy mitochondria eg, healthy mitochondria with few genetic mutations
  • cells can be activated before being administered.
  • the present invention may include, but is not limited to, the use of a mitochondrial-directed carrier (eg, MITO-Porter) encapsulating a chemical to activate mitochondria.
  • a method can be used.
  • the chemical agent can be any agent that can activate mitochondria.
  • drugs include CO-Q-10, resveratrol, nicotinamide riboside, n-acetylcysteine, ⁇ -tocopherol, omega-3 fatty acids, glucosamine, creatine monohydrate, acetyl-carnitine, epicatechin, quercetin , An autophagy inducer, or an apoptosis inhibitor.
  • the cells administered are organs or tissues such as thymus, spleen, lymph nodes, heart, lung, pancreas, liver, skin, kidney, blood, lymphatic vessels, eyes, nose and ears Can be derived from
  • the cells administered can be tissue stem cells.
  • the cells administered can be cardiomyocyte stem or progenitor cells.
  • adherent thymic epithelial cells (TEC) and floating thymic lymphocytes can be transplanted: adherent thymic epithelial cells (TEC) and floating thymic lymphocytes.
  • the cells administered are adherent TECs, floating thymic lymphocytes, or both.
  • the cells administered can be cells such as cardiac myocytes of the heart, hepatocytes of the liver, and neurons of the brain, for example, adherent cells from sold organs.
  • the cells to be administered may be autologous or allogeneic to the individual to whom they are administered.
  • the cells to be administered can be cells that can supply mitochondria to cells in the tissue to be administered. Such cells may be co-cultured with cells in the tissue to be administered and the cells to be administered, and assayed to determine whether the cells in the tissue to be administered supply mitochondria to cells in the tissue to be administered. You can check. Cells that can supply mitochondria to cells in the tissue to be administered by co-culture can be used as cells to be administered in the present invention. Whether mitochondria can be supplied can be confirmed by labeling mitochondria contained in cells to be administered. Mitochondrial labeling can be done with fluorescent labels. As the fluorescent label, various labels capable of fluorescently labeling mitochondria can be used. Prior to the assay, the administered cells may have been subjected to a mitochondrial activation treatment.
  • the cells administered can be cardiac myocyte stem cells or cardiac progenitor cells.
  • mitochondria can move between cells. Therefore, it is not necessary that the cells themselves survive in the transplanted organ.
  • cells administered to primary and secondary lymphoid tissue can be, for example, non-immune cells.
  • Non-immune cells include mature and immature immune cells (eg, developing immune cells).
  • the cells administered to the primary and secondary lymphoid tissues can be, for example, also non-hematopoietic stem cells, non-hematopoietic progenitor cells, non-lymphoid acute common progenitor cells, non-NK cells / Non-T cell progenitor cells, non-myelocytic common progenitor cells, non-granulocyte-macrophage progenitor cells, or non-macrophage / dendritic cell progenitor cells, possible.
  • mitochondrial or cells can be injected directly into thymic tissue (eg, stroma) of a subject (or patient).
  • mitochondrial or cell transplantation can be performed in vivo according to the methods described herein.
  • in vivo transplantation comprises transplantation with a mitochondrial tropic carrier (eg, MITO-Porter), transplantation of mitochondria with a mitochondrial tropic carrier, or transplantation of cells containing a mitochondrial tropic carrier.
  • a mitochondrial tropic carrier eg, MITO-Porter
  • a mitochondrial tropic carrier can include one or more peptides bound to the surface of a mitochondrial tropic carrier (eg, MITO-Porter).
  • the transplant of mitochondria or cells is an organ selected from the group consisting of heart, liver, ear, eye, thymus, brain, lung, endothelial cells, lymph nodes, bone marrow, blood, spleen, kidney, lymphatic vessels, nose and synovium Or it can be done to the organization.
  • the mitochondrial or cell transplant can be performed on an organ or tissue selected from the group consisting of thymus, spleen, and bone marrow.
  • the mitochondrial or cell transplant is selected from the group consisting of these organs or tissues, preferably any of the primary and secondary lymphoid tissues; for example, thymus, spleen and bone marrow Injection into an organ or tissue; eg, the thymus).
  • the mitochondrial tropic carrier (eg, MITO-Porter) also includes CO-Q-10, resveratrol, nicotinamide riboside, n-acetylcysteine, ⁇ -tocopherol, omega-3 fatty acids, glucosamine, It can include chemicals such as, but not limited to, creatine monohydrate, acetyl-carnitine, epicatechin, quercetin, autophagy inducers, and apoptosis inhibitors.
  • IVR International radiology
  • CT International radiology
  • X-ray CT X-ray CT
  • direct injection into the thymus can be performed using IVR-CT.
  • direct injection into the thymus can be performed using X-ray CT.
  • thymus atrophy can be reduced and T cell differentiation and maturation can be promoted in the thymus by transplantation of intact mitochondria or cells.
  • T cell expansion by mitochondrial or cell transplantation can correct qualitative and quantitative abnormalities of T cells in peripheral blood. This may also have a rejuvenating effect on immune aging due to thymus atrophy.
  • restoration of the function of autoimmune T cells may lead to improvement of the condition (restoration of tolerance) by modulation of local innate and acquired immunity.
  • scheduled rehabilitation is performed early after transplantation, depending on the condition, to promote improved organ function.
  • aerobic exercise is performed to significantly increase mitochondrial uptake and improve recipient cell function.
  • Measurement of T cell function can be performed using a method known in the art.
  • mitochondrial function can be measured in peripheral blood T cells.
  • Mitochondrial preparation or cell preparation of the present invention the heart, liver, ear, eye, thymus, brain, lung, endothelial cell, lymph node, bone marrow, blood, spleen, kidney, lymph vessel, nose and An organ or tissue selected from the group consisting of synovium (preferably, any tissue of primary lymphatic tissue and secondary lymphoid tissue; for example, an organ or tissue selected from the group consisting of thymus, spleen, and bone marrow; , Thymus) for use in a pharmaceutical formulation comprising mitochondria.
  • synovium preferably, any tissue of primary lymphatic tissue and secondary lymphoid tissue; for example, an organ or tissue selected from the group consisting of thymus, spleen, and bone marrow; , Thymus
  • the pharmaceutical preparation of the present invention is obtained from the heart, liver, ear, eye, thymus, brain, lung, endothelial cells, lymph nodes, bone marrow, blood, spleen, kidney, lymphatic vessels, nose and synovium.
  • Organ or tissue selected from the group consisting of preferably, any one of primary lymphoid tissue and secondary lymphoid tissue, for example, an organ or tissue selected from the group consisting of thymus, spleen, and bone marrow; for example, thymus
  • a pharmaceutical formulation comprising cells for administration to a cell.
  • the cells to be administered are mitochondria or cells subjected to mitochondrial activation treatment
  • the organ or tissue to be administered is heart, liver, ear, eye, thymus, brain, lung, endothelial cells
  • An organ or tissue selected from the group consisting of lymph nodes, bone marrow, blood, spleen, kidney, lymph vessels, nose and synovium preferably, any tissue of primary lymph tissue and secondary lymph tissue, for example, thymus
  • An organ or tissue selected from the group consisting of spleen and bone marrow preferably, any tissue of primary lymph tissue and secondary lymph tissue, for example, thymus , An organ or tissue selected from the group consisting of spleen and bone marrow;
  • the administered cells are cardiac stem cells or cardiac progenitor cells
  • the administered organ or tissue is heart, liver, ear, eye, thymus, brain, lung, endothelial cells, lymph nodes, bone marrow.
  • an organ or tissue selected from the group consisting of blood, spleen, kidney, lymphatic vessels, nose and synovium preferably, any of primary lymphoid tissue and secondary lymphoid tissue, such as thymus, spleen and bone marrow
  • the cells administered are mitochondria that have been subjected to mitochondrial activation treatment or myocardial stem cells or myocardial progenitor cells
  • the administered organ or tissue is a heart, liver, ear, eye, thymus, brain
  • the pharmaceutical preparation of the present invention can be used for improving thymic function in a patient having a mitochondrial dysfunction.
  • the pharmaceutical formulation of the present invention may be administered intrathymic.
  • the pharmaceutical preparation of the present invention can be used for treating thymic atrophy in patients having mitochondrial dysfunction.
  • the pharmaceutical formulation of the present invention may be administered intrathymic.
  • the pharmaceutical preparation of the present invention can be used for improving bone marrow function in patients having dysfunction of mitochondria.
  • the pharmaceutical formulation of the invention may be administered intramedullary.
  • the pharmaceutical preparation of the present invention can be used to improve immune function in patients having mitochondrial dysfunction.
  • the pharmaceutical preparation of the present invention is preferably administered to any of primary lymphoid tissue and secondary lymphoid tissue, for example, an organ or tissue selected from the group consisting of thymus, spleen and bone marrow. It can be administered locally.
  • the pharmaceutical preparation of the present invention can be used for treating a patient having a dysfunction in mitochondria.
  • the pharmaceutical formulation of the present invention comprises a group consisting of heart, liver, ear, eye, thymus, brain, lung, endothelial cells, lymph nodes, bone marrow, blood, spleen, kidney, lymphatic vessels, nose and synovium.
  • an organ or tissue selected from the group preferably, any of primary lymphatic tissue and secondary lymphoid tissue, for example, an organ or tissue selected from the group consisting of thymus, spleen, and bone marrow; for example, thymus
  • an organ or tissue selected from the group preferably, any of primary lymphatic tissue and secondary lymphoid tissue, for example, an organ or tissue selected from the group consisting of thymus, spleen, and bone marrow; for example, thymus
  • the pharmaceutical preparation of the present invention may contain mitochondria or cells and excipients.
  • the excipient is, for example, a pharmaceutically acceptable excipient.
  • Pharmaceutically acceptable excipients include, but are not limited to, pH adjusters, salts, surfactants, preservatives, stabilizers, and isotonic agents.
  • mitochondria or cells in the manufacture of a pharmaceutical formulation of the invention.
  • the subject or patient can be a mammal, including, for example, primates, such as humans, and companion animals, such as dogs and cats.
  • patient refers to a subject having a disease or pathological condition.
  • the subject to which the mitochondria or cells of the present invention are administered can be a subject having an abnormal mitochondrial function, for example, a patient with mitochondrial disease.
  • a patient with a mitochondrial disease can be a patient with an abnormality in the mitochondrial genome or a patient with an abnormality in the nuclear genome.
  • the patient with mitochondrial disease can be a patient with hereditary mitochondrial disease or a patient with acquired mitochondrial disease.
  • the subject to whom the mitochondria or cells of the present invention are administered can be a subject having abnormal mitochondrial function and having atrophied thymus. Thymus atrophy can be determined by comparison to the normal thymus of an individual of the same age as the subject.
  • the subject to which the mitochondria or cells of the present invention are administered may be a subject having an abnormality in mitochondrial function and having an abnormality in immune function. Abnormal mitochondrial function can be determined, for example, by comparing the mitochondrial membrane potential with the mitochondrial membrane potential of a healthy subject.
  • Example 1 Detailed analysis of the phenotype of the Ndufs4 gene knockout mouse
  • the Ndufs4 gene is present on an autosomal chromosome in humans and is an 18 kDa accessory subunit of respiratory chain complex I (NADH: ubiquinone oxidoreductase) of the inner mitochondrial membrane. (NADH: ubiquinone oxidoreductase core subunit S4). Mutations in the Ndufs4 gene are associated with a deficiency of mitochondrial respiratory chain complex I, which is autosomal recessive. This complex I deficiency is considered to be the most frequent enzyme defect of oxidative phosphorylation damage in mitochondria. In the present example, it was found that the thymus was significantly atrophied in the Ndufs4 knockout mouse compared to the wild type or heterozygous.
  • Ndufs4 knockout mice (The Jackson Laboratory, Stock No .: 027058) are as described in Kruse SE et al., Cell Metabolism., 7 (4): 312-320, 2008. The results of the analysis of the blood components were as shown in Table 1.
  • Ndufs4 knockout mice showed a statistically significant decrease in lymphocytes and B cells.
  • the thymus was isolated from each of the wild type, heterozygous mouse, and Ndufs4 knockout mouse, and the number of thymocytes in the thymus was counted. As a result, as shown in FIG. 1, the number of thymocytes was significantly reduced in the Ndufs4 homozygous knockout mouse compared to the wild type and heterozygous mice. In addition, as shown in FIG. 2, the number of thymocytes per body weight (BW) was significantly reduced in the Ndufs4 homozygous knockout mouse compared to the wild type or heterozygous.
  • BW body weight
  • the number of CD4 / CD8 double negative T cells and the number of CD4 / CD8 double positive T cells from thymocytes were counted by flow cytometry.
  • the number of CD4 / CD8 double negative cells per body weight tended to decrease in Ndufs4 knockout mice compared to wild type and heterozygous cells.
  • the number of CD4 / CD8 double positive T cells per body weight was statistically significantly reduced in Ndufs4 knockout mice as compared to wild type and heterozygous cells.
  • the thymus is atrophied, and the number of thymocytes and the number of CD4 / CD8 double positive T cells per body weight are statistically significantly reduced as compared with the wild type or heterozygous.
  • I was A greater reduction in the number of thymocytes and the number of CD4 / CD8 double positive T cells per body weight than in the CD4 / CD8 double negative T cells was associated with abnormalities in mitochondrial function in the thymus with respect to T cell development in the thymus. Indicates that is involved.
  • Ndufs4 heterozygous mice were bred to each other, and spleens of wild-type, heterozygous and Ndufs4 knockout mice (3 weeks old, female) obtained as litters were excised, and B cell progenitor cells collected in the spleen were AA4 1 and analyzed by flow cytometry based on the expression of CD45R and B220.
  • FIG. 5 shows that in the Ndufs4 knockout mouse, the total number of mononuclear cells was significantly reduced and the proportion of B cell progenitor cells was also decreased in the wild-type and heterozygous mice.
  • Hematopoietic progenitor cells were isolated from the bone marrow of Ndufs4 knockout mice, and their proliferative ability and differentiation ability were verified.
  • Ndufs4 heterozygous mice were bred to each other, and bone marrow was collected from wild-type, heterozygous and Ndufs4 knockout mice (4 weeks old) obtained as litters.
  • Lineage marker (Mac1, Gr1, B220, CD3, TER119) positive cells were removed using magnetic beads. Thereafter, 1 ⁇ 10 4 obtained cells were co-cultured with MS5 mouse stromal cells. The culture period was one week. As a result, as shown in FIG.
  • the number of CD45 + cells contained in the cell population after culture was significantly reduced in Ndufs4 knockout mice as compared to wild type and heterozygous.
  • the proportion of Mac1 + bone marrow cells contained in the cell population after culture tended to increase in Ndufs4 knockout mice compared to wild type and heterozygous cells.
  • the proportion of CD19 + B cells was significantly reduced in Ndufs4 knockout mice compared to wild type and heterozygous.
  • Ndufs4 knockout mouse (CD45.2 +) (5 weeks old) was used as a recipient, and 950 rad of whole body irradiation was performed to obtain 2 ⁇ 10 7 of 6 to 7 weeks old CD45.1 + mice.
  • Cells were injected with bone marrow mononuclear cells and the survival of mice was assessed.
  • the overall survival rate (OS) was improved in the Ndufs4 knockout mice transplanted with bone marrow mononuclear cells, as compared with no transplantation (no irradiation, no transplantation).
  • OS overall survival rate
  • the survival time was statistically significantly increased in Ndufs4 knockout mice transplanted with bone marrow mononuclear cells as compared with no transplantation (no irradiation, no transplantation). This is a result suggesting that the Ndufs4 homozygous knockout mouse has abnormal bone marrow cells.
  • the engraftment of the donor cells was not different between the wild type and the hetero knockout mouse.
  • Example 2 Transplantation of healthy mitochondria into the thymus of Ndufs4 knockout mice
  • an experiment was conducted to transplant healthy mitochondria into the thymus of Ndufs4 knockout mice.
  • CPC Mouse cardiac stem cells
  • a RES-mitochondrial tropic carrier eg, MITO-Porter
  • MITO-Porter is a mitochondrial troposome encapsulating resveratrol, wherein the liposomes are 1,2-dioleyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine (DOPE) and These liposomes are composed of sphingomyelin (SM) at a molar ratio of 9: 2, and have a mitochondrial tropism due to the further introduction of Stearyl @ S2 having a lipid amount of 10%.
  • DOPE 1,2-dioleyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine
  • resveratrol is delivered to mitochondria and mitochondria are enhanced in cells transfected with RES-MITO-Porter (eg, CPC transplanted in a rat model of doxorubicin-induced cardiomyopathy). Improves cell viability, while MITO-Cell (referred to as MA-Cell in WO2018 / 092839) improves cell viability even more than CPC).
  • MITO-Cell was stained using MITO Tracker deep red (manufactured by Thermo fisher Scientific). As a result, mitochondria in MITO-Cell were stained. After staining, MITO-Cell (1.0 ⁇ 10 6 cells) was injected into the thoracic surface (one location) of the left thymus of Ndufs4 knockout mice. Three days after transplantation, the thymus was excised, a tissue section was prepared according to a conventional method, the nucleus was stained with Hoechst 33342, and then observed with a confocal laser scanning microscope (CLMS). As a result, as shown in FIGS. 14 and 15, mitochondria derived from MITO-Cell stained with MITO Tracker deep red were spread across the administration site in the thymus tissue. This indicated that mitochondria contained in the transplanted cells were widely distributed in thymic tissue by injection into the thymus.
  • MITO Tracker deep red manufactured by Thermo fisher Scientific
  • Example 3 Mitochondrial migration between cells This example demonstrates that mitochondria migrate between cells. For example, it demonstrates that mitochondria are supplied from CPC to Ndufs4 cells.
  • a cell population stained with mitochondria was co-cultured, and the presence or absence of cells stained in two colors after culture was confirmed.
  • cells stained in two colors were shown to contain mitochondria from two or more cells, that is, mitochondria migrated from one cell to another. Is shown.
  • mitochondria contained in one cell population and mitochondria contained in the other cell population were dyed separately so that mitochondria derived from different cells could be distinguished. More specifically, the mitochondria of one cell population are stained to emit green fluorescence using Mito Tracker Green, and the mitochondria of the other cell population are emitted red fluorescence using Mito Tracker Deep Red. Stained. Thereafter, the two cell populations were co-cultured in one culture. In this experimental system, if mitochondria move between cells, red mitochondria and green mitochondria coexist in one cell, and red and mitochondria in one cell. It will emit both green fluorescence or yellow fluorescence.
  • FIG. 17 The results of co-culturing mouse CPC (red) and mouse CPC (green) and observing them by CLSM 24 hours later are shown in FIG.
  • FIG. 17 shows that cells showing yellow fluorescence were observed (see white arrowheads). This indicated that mitochondria were migrating between CPCs.
  • 18 and 19 show the results obtained by co-culturing H9c2 cells (green), which are rat heart striated muscle cells, and CPC (red), and observing them by CLSM 24 hours later.
  • FIGS. 18 and 19 in some cells, cells showing yellow fluorescence were observed (see white arrowheads). From observation of the cells during co-culture, it was found that mitochondria move between cells.
  • mitochondria migrated more from CPC to H9c2 than from H9c2 to CPC.
  • the number of cells emitting red fluorescence was maintained, the number of cells emitting green fluorescence decreased and the number of cells emitting yellow fluorescence increased. This suggests that mitochondria are likely to migrate from stem cells to mature cells.
  • RES-MITO-Porter was stained green with nitrobenzoxadiazole. The stained RES-MITO-Porter was used to stain orange using MITO @ traker @ orange, and shown in blue in the figure. Furthermore, mitochondria in H9c2 cells were stained red using MITO Tracker deep red. The obtained MITO-Cell was recovered from the culture dish, washed, seeded on a medium, and co-cultured with H9c2 cells. Cells were observed using CLMS after a designated time after the start of co-culture. As a result, the movement of RES-MITO-Porter in MITO-Cell between cells was observed. The results were as shown in FIGS. As shown in FIGS. 20 and 21, after 1.5 hours, RES-MITO-Porter began to move between cells, and after 3 hours and 24 hours, it was observed that the RES-MITO-Porter spread widely to the cells.
  • CPCs (green) isolated from Ndufs4 knockout mice and CPCs (red) isolated from wild-type mice were co-cultured, and mitochondrial migration between cells was observed. Then, as shown in FIG. 22, the presence of mitochondria emitting red fluorescence was confirmed in the cytoplasm of CPC isolated from Ndufs4 knockout mice (see lower right panel). This result indicates that mitochondria migrated from the wild type mouse CPC to the Ndufs4 knockout mouse CPC.
  • Ndufs4 knockout mice are knockouts of a gene encoding an 18 kDa accessory subunit of mitochondrial respiratory chain complex I, and have abnormal mitochondrial function.
  • the phenotype of Ndufs4 knockout mice was particularly strong in immune cells and had more atrophy than the wild type.
  • Such an abnormality is not limited to Ndufs4 knockout mice, but is also an abnormality commonly observed in other model animals having abnormal mitochondrial function (Pint M, et al., Cell Death & Differ ., 2017, 24 (2) 288-99) and Dai Y, et al., Mitochondrion., 2013, 13 (4): 282-291).
  • mitochondrial dysfunction is also caused by aging (Zhang R, et al., BMC Genomics., 2017, 18 (1): 890), but aging can cause thymus atrophy. Also known. In particular, the size of the thymus peaks around the teens and rapidly atrophies and almost disappears by the age of 70 (Lynch HE et al. Trends Immunol. 2009, 30 (7): 366-73).
  • Thymus atrophy can be caused by overproduction of reactive oxygen species in thymic stromal cells (Doulias PT et al., Sci Signal., 2013, 6 (256): rs1), cells that are highly dependent on mitochondria (Griffith AV et al., Cell Rep., 2015, 12 (7): 1071-9). It is also known that thymic atrophy due to aging causes immunological abnormalities (Taub DD and Longo DL, mmImmunol Rev., 2005, 205: 72-93). Thus, abnormalities in mitochondrial function are associated with abnormalities in the thymus and the immune system.
  • MSC mesenchymal stem cells
  • mitochondria having a healthy respiratory chain complex are supplied to the thymus by local injection of mitochondria having a healthy respiratory chain complex into the thymus of an individual having abnormal mitochondrial function.
  • An approach is provided. Restoration of mitochondrial function in the thymus is thought to induce restoration of hypothymic function, improved thymic atrophy, and improved immune abnormalities. Therefore, it is considered that the thymus supplied with mitochondria having a healthy respiratory chain complex is rescued from reduced function or abnormal function, and the present invention relates to individuals with abnormal mitochondrial function (for example, patients with mitochondrial disease Or individuals over the age of 60).
  • the present invention provides a technique for supplying activated mitochondrion to the thymus, and may be useful in treating individuals with abnormal mitochondrial function (eg, patients with mitochondrial disease or individuals over the age of 60).

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Abstract

本明細書では、インタクトなミトコンドリアのリンパ器官（一次リンパ組織または二次リンパ組織）への単離および移植のための方法、本明細書に記載の方法を用いて調製された細胞の組成物、および本明細書に記載の細胞を製造するための方法が提供される。特に、本明細書では、ドナー細胞からインタクトなミトコンドリアを単離する方法が提供される。ミトコンドリアをレシピエント細胞に移植する方法も本明細書で提供される。いくつかの局面において、この方法はインビボで行うことができる。さらに、本発明の方法を用いて調製された細胞を含む細胞の組成物が提供される。

Description

ミトコンドリアのリンパ器官への移植およびそのための組成物
Ｉ．発明の分野
　本発明は、ミトコンドリアのリンパ器官への単離および移植のための方法、本明細書に記載の方法を用いて調製された細胞の組成物、および本明細書に記載の細胞を製造するための方法を提供する。
ＩＩ．発明の背景
　ミトコンドリア機能障害、例えば、呼吸鎖複合体の障害は、ミトコンドリア疾患および加齢の重要な原因である。ミトコンドリア機能の低下は、ミトコンドリア疾患および加齢関連疾患に関連する多くの主要臓器の細胞に影響を及ぼす。さらに、ミトコンドリアの機能不全は免疫担当細胞のエネルギー代謝に影響を及ぼす。たとえば、自然免疫にかかわる単球系マクロファージや樹状細胞は、エネルギーはおもにミトコンドリアに依存しない嫌気的解糖に依存している。また、メモリーＴ細胞と制御性Ｔ細胞は、脂肪酸酸化を介して酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）に依存することも示されている。さらに、加齢に伴うＴ細胞機能の低下は、いわゆる免疫老化の典型的な徴候として報告されている。
ＩＩＩ．発明の概要
　本出願は、ミトコンドリアの単離および移入を介して、胸腺のようなリンパ器官の機能を増強または改善する未達成のニーズに取り組む。さらに、本発明は、接着細胞および浮遊細胞の両方への単離ミトコンドリアの移植についての満たされていないニーズに取り組む。
　本発明によれば、Ｎｄｕｆｓ４ノックアウトマウスにおいて胸腺の萎縮および獲得免疫系細胞の減少が確認された。Ｎｄｕｆｓ４は、ミトコンドリアの呼吸鎖複合体Ｉのサブユニットをコードする遺伝子であり、この遺伝子異常は、ミトコンドリアの呼吸鎖複合体Ｉの機能の喪失をもたらす。これに対して、ミトコンドリアを胸腺に局所投与したところ、ミトコンドリアは胸腺組織に広く分布する結果をもたらした。胸腺は、獲得免疫系細胞の発達に関わる重要器官である。特にＴ細胞は、胸腺で生み出され、胸腺で成熟する。従って、胸腺に対するミトコンドリアの投与は、特にＴ細胞の異常に起因する獲得免疫異常を少なくとも部分的に軽減すると考えられる。
　いくつかの態様において、本発明の方法は、（ａ）ドナー細胞から単離されたミトコンドリアを精製する工程；（ｂ）膜転移配列を発現する単離されたミトコンドリアを生成するのに十分な時間、膜転移配列を含む１以上のペプチドと単離されたミトコンドリアを共培養する工程；および（ｃ）膜転移配列を発現する単離されたミトコンドリアをレシピエント細胞に移植する工程を含む、インタクトな外因性ミトコンドリアをレシピエント細胞に移植する工程を含む。いくつかの態様において、１つまたは複数のペプチドは、細胞膜透過性ペプチド、ミトコンドリア膜融合性ペプチド、または両方である膜転移配列を含むことができる。
　いくつかの態様において、１または複数のペプチドは、ペプチド複合体である。いくつかの態様において、ペプチド複合体は、ペプチドおよび脂質を含む。いくつかの態様において、脂質は、ペプチドのＮ末端に結合している。いくつかの態様において、脂質は、ペプチドのＣ末端に結合している。いくつかの態様において、脂質は、ペプチドをミトコンドリア膜に埋め込むことを可能にする。
　いくつかの態様は、さらに、単離されたミトコンドリアを１以上の部分と共培養することを含む。ある態様において、１または複数の部分は、ポリエチレングリコールを含む。ある態様において、１または複数の部分は、アプタマーを含む。
　いくつかの実施形態は、さらに、ミトコンドリアを単離する前に、ドナー細胞からのミトコンドリアを活性化することを含む。いくつかの実施形態において、ミトコンドリアの活性化は、化学物質を封入したミトコンドリア指向性キャリア（例えば、ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ）を用いて行われる。或る実施態様では、化学剤は、コエンザイムＱ１０（ＣＯ－Ｑ－１０）、レスベラトロール、ニコチンアミドリボシド、ｎ－アセチルシステイン、α－トコフェロール、オメガ－３脂肪酸、グルコサミン、クレアチン一水和物、アセチル－ｌ－カルニチン、エピカテキン、ケルセチン、オートファジー誘導剤、およびアポトーシス阻害剤からなる群より選択される。コエンザイムＱ１０は、還元型であり得る。
　いくつかの態様において、ドナー細胞は、胸腺、脾臓、リンパ節、心臓、肺、膵臓、肝臓、皮膚、腎臓、血液、筋肉、またはリンパ管を含むことができる臓器に由来する。いくつかの態様において、ドナー細胞は、線維芽細胞、肝細胞、血小板、筋細胞、および誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からなる群より選択される。いくつかの態様において、ドナー細胞は、自家または同種異系である細胞を含む。
　いくつかの実施態様では、レシピエント細胞は、胸腺、脾臓、リンパ節、心臓、肺、膵臓、肝臓、皮膚、腎臓、血液、リンパ管、眼、鼻または耳を含む器官由来の細胞である。いくつかの態様において、レシピエント細胞は、誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。いくつかの態様において、レシピエント細胞は、加齢関連疾患を有する宿主由来である。いくつかの態様において、レシピエント細胞は、加齢した宿主（例えば、４０歳以上の宿主、４５歳以上の宿主、５０歳以上の宿主、５５歳以上の宿主、６０歳以上の宿主、６５歳以上の宿主、および７０歳以上の宿主）由来である。いくつかの態様において、レシピエント細胞は、ミトコンドリア疾患を有する宿主由来である。いくつかの実施態様では、レシピエント細胞は、胸腺、脾臓、リンパ節、心臓、肺、膵臓、肝臓、皮膚、腎臓、血液、骨髄、滑膜、リンパ管、脳、眼、鼻および耳からなる群より選択される臓器（例えば、インタクトな臓器）中の細胞である。
　いくつかの実施形態は、さらに、インビボで移植を実施することを含む。いくつかの態様において、インビボで移植を実施することは、ミトコンドリア指向性キャリア（例えば、ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ）を含む。いくつかの態様において、ミトコンドリア指向性キャリア（例えば、ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ）は、ミトコンドリア指向性キャリア（例えば、ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ）の表面に結合した１または複数のペプチドを含む。いくつかの態様において、ミトコンドリア指向性キャリア（例えば、ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ）の表面に結合した１または複数のペプチドは、単離されたミトコンドリアと共培養するために使用される１または複数のペプチドと同一である。いくつかの態様において、ミトコンドリア指向性キャリア（例えば、ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ）は、ＣＯ－Ｑ－１０、レスベラトロール、ニコチンアミドリボシド、ｎ－アセチルシステイン、α－トコフェロール、オメガ－３脂肪酸、グルコサミン、クレアチン一水和物、アセチル－ｌ－カルニチン、エピカテキン、ケルセチン、オートファジー誘導剤、およびアポトーシス阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つの化学剤を含む。
　いくつかの態様において、移植は、心臓、肝臓、耳、眼、胸腺、脳、肺、内皮細胞、リンパ節、骨髄、血液、リンパ管、鼻、脾臓および滑膜からなる群より選択される臓器に対してなされる。いくつかの態様において、移植は、胸腺、脾臓および骨髄からなる群より選択される臓器に対してなされる。いくつかの態様において、移植は、一次リンパ組織に対してなされる。いくつかの態様において移植は、二次リンパ組織に対してなされる。一次リンパ組織としては、骨髄および胸腺が挙げられ、二次リンパ組織としては、脾臓、リンパ節、およびパイエル板が挙げられる。
　いくつかの態様において、移植は、インターベンショナルラジオロジー（ＩＶＲ）‐コンピュータ断層撮影（ＣＴ）を用いて行われる。具体的な実施形態では、ＩＶＲ－ＣＴはＸ線ＣＴである。
　いくつかの態様において、移植は、胸腺内注射を介する。
　いくつかの実施形態は、移植後サポートを使用することをさらに含む。
　いくつかの実施形態において、移植後サポートは、適切な身体運動、または規定された呼吸方法を含む。
　一態様では、本明細書で提供される方法を用いて調製された細胞の組成物が提供される。
　別の態様では、本明細書に記載の方法のいずれか一つを用いて調製された細胞を製造する方法が提供される。
　本発明ではまた、以下の発明が提供され得る。
［１］インタクトな外因性ミトコンドリアをレシピエント細胞に移植する方法であって、以下を含む。
（ａ）ドナー細胞から単離したミトコンドリアを精製すること。
（ｂ）単離されたミトコンドリアを、膜輸送配列を発現する単離されたミトコンドリアを生成するのに十分な時間、膜輸送配列を含む１以上のペプチドと共培養すること；
（ｃ）膜輸送配列を発現している単離ミトコンドリアをレシピエント細胞に移植すること。
［２］膜輸送配列を含む１以上のペプチドが、細胞膜透過性ペプチドおよびミトコンドリア膜融合性ペプチドからなる群より選択される、上記［１］に記載の方法。
［３］１以上のペプチドがペプチド複合体である、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］ペプチド複合体が、ペプチドおよび脂質を含む、上記［３］に記載の方法。
［５］脂質がペプチドのＮ末端に結合している、上記［４］に記載の方法。
［６］脂質がペプチドのＣ末端に結合している、上記［４］に記載の方法。
［７］脂質が、ペプチドをミトコンドリア膜に埋め込むことを可能にする、上記［４］～［６］のいずれか記載の方法。
［８］単離ミトコンドリアを１以上の部分と共培養することをさらに含む、上記［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］１以上の部分がポリエチレングリコールを含む、上記［８］に記載の方法。
［１０］１以上の部分がアプタマーを含む、上記［８］に記載の方法。
［１１］さらに、前記ミトコンドリアを単離する前に、前記ドナー細胞からの前記ミトコンドリアを活性化することを含む、上記［１］～［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］ミトコンドリアを活性化する工程が、化学物質を封入したミトコンドリア指向性キャリア（例えば、ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ）を用いて行われる、上記［１１］に記載の方法。
［１３］前記化学剤が、ＣＯ－Ｑ－１０、レスベラトロール、ニコチンアミドリボシド、ｎ－アセチルシステイン、α－トコフェロール、オメガ－３脂肪酸、グルコサミン、クレアチン一水和物、アセチル－ｌ－カルニチン、エピカテキン、ケルセチン、オートファジー誘導剤、およびアポトーシス阻害剤からなる群より選択される、上記［１２］に記載の方法。
［１４］ドナー細胞が、胸腺、脾臓、リンパ節、心臓、肺、膵臓、肝臓、皮膚、腎臓、血液、筋肉、およびリンパ管からなる群より選択される器官に由来する、上記［１］～［１３］のいずれか記載の方法。
［１５］ドナー細胞が、線維芽細胞、肝細胞、血小板、筋細胞、および誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からなる群より選択される、上記［１］～［１４］のいずれか記載の方法。
［１６］ドナー細胞が自家発生または同種異系である細胞を含む、上記［１］～［１５］のいずれか記載の方法。
［１７］レシピエント細胞が、胸腺、脾臓、リンパ節、心臓、肺、膵臓、肝臓、皮膚、腎臓、血液、リンパ管、眼、鼻および耳からなる群より選択される器官からの細胞である、上記［１］～［１６］のいずれか記載の方法。
［１８］レシピエント細胞が誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、上記［１］～［１７］のいずれか記載の方法。
［１９］レシピエント細胞が、加齢関連疾患を有する宿主由来である、上記［１］～［１８］のいずれか記載の方法。
［２０］レシピエント細胞が、ミトコンドリア疾患を有する宿主由来である、上記［１］～［１９］のいずれか記載の方法。
［２１］レシピエント細胞が、胸腺、脾臓、リンパ節、心臓、肺、膵臓、肝臓、皮膚、腎臓、血液、骨髄、滑膜、脳、リンパ管、眼、鼻および耳からなる群より選択されるインタクトな臓器にある、上記［１］～［２０］のいずれか記載の方法。
［２２］上記［１］～［２１］のいずれかに記載の方法であって、更に、前記移植をインビボで行う工程を包含する方法。
［２３］インビボで移植を実施することが、ミトコンドリア指向性キャリア（例えば、ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ）を含む、上記［２２］記載の方法。
［２４］前記ミトコンドリア指向性キャリア（例えば、ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ）が、前記ミトコンドリア指向性キャリア（例えば、ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ）の表面に結合した１以上のペプチドを含む、上記［２３］に記載の方法。
［２５］上記［２４］に記載の方法であって、前記ミトコンドリア指向性キャリア（例えば、ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ）の前記表面に結合した１以上のペプチドが、前記単離されたミトコンドリアと共培養するために使用される１以上のペプチドと同一であることを特徴とする方法。
［２６］ミトコンドリア指向性キャリア（例えば、ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ）が、ＣＯ－Ｑ－１０、レスベラトロール、ニコチンアミドリボシド、ｎ－アセチルシステイン、α－トコフェロール、オメガ－３脂肪酸、グルコサミン、クレアチン一水和物、アセチル－カルニチン、エピカテキン、ケルセチン、オートファジー誘導剤、およびアポトーシス阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つの化学物質を含む、上記［２３］～［２５］のいずれか記載の方法。
［２７］上記［２２］～［２６］のいずれかにおいて、移植は、心臓、肝臓、耳、眼、胸腺、脳、肺、内皮細胞、リンパ節、骨髄、血液、腎臓、リンパ管、鼻、脾臓、および滑膜からなる群より選択される臓器に行われる、方法。
［２８］移植が、インターベンショナルラジオロジー（ＩＶＲ）－コンピュータ断層撮影（ＣＴ）を用いて行われる、上記［２２］～［２７］のいずれか記載の方法。
［２９］上記［２８］に記載の方法であって、前記ＩＶＲ－ＣＴはＸ線ＣＴであることを特徴とする方法。
［３０］移植が、胸腺内注射を介する、上記［２２］～［２９］のいずれか記載の方法。
［３１］移植後サポートを行うことをさらに含む、上記［１］～［３０］のいずれか記載の方法。
［３２］上記［３１］に記載の方法において、前記移植後支持体は、適切な身体運動、または規定の呼吸方法を含むものである。
［３３］上記［１］～［３２］のいずれかに記載の方法を用いて調製された細胞の組成物。
［３４］上記［１］～［３３］のいずれかに記載の方法を用いて調製された細胞の製造方法。
　本発明によればまた、以下の発明が提供される。
［１Ａ］一次リンパ組織および二次リンパ組織からなる群から選択される少なくとも１つの組織に投与される、ミトコンドリアを含む医薬製剤。
［２Ａ］ミトコンドリアが、単離されたミトコンドリアである、上記［１Ａ］に記載の医薬製剤。
［３Ａ］ミトコンドリアが、ミトコンドリア活性化剤処理されたものである、上記［１Ａ］または［２Ａ］に記載の医薬製剤。
［４Ａ］ミトコンドリアが、細胞内に存在する形態である、上記［１Ａ］に記載の医薬製剤。
［５Ａ］上記［４Ａ］に記載の医薬製剤であって、細胞が、非免疫細胞である、医薬製剤。
［６Ａ］上記［５Ａ］に記載の医薬製剤であって、細胞が、心筋幹細胞および心筋前駆細胞からなる群から選択される細胞である、医薬製剤。
［７Ａ］上記［４Ａ］に記載の医薬製剤であって、細胞が、ミトコンドリア活性化処理がなされた免疫細胞である、医薬製剤。
［８Ａ］上記［４Ａ］または［７Ａ］に記載の医薬製剤であって、細胞が、ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを有する免疫細胞である、医薬製剤。
［９Ａ］投与対象が、機能異常を有するミトコンドリアを有する、上記［１Ａ］～［８Ａ］のいずれか一項に記載の医薬製剤。
［１０Ａ］一次リンパ組織および二次リンパ組織からなる群から選択される少なくとも１つの組織に投与される、ミトコンドリアを含む医薬製剤の製造における、ミトコンドリアの使用。
［１１Ａ］ミトコンドリアが、単離されたミトコンドリアである、上記［１０Ａ］に記載の使用。
［１２Ａ］ミトコンドリアが、ミトコンドリア活性化剤処理されたものである、上記［１０Ａ］または［１１Ａ］に記載の使用。
［１３Ａ］ミトコンドリアが、細胞内に存在する形態である、上記［１０Ａ］に記載の使用。
［１４Ａ］上記［１０Ａ］に記載の使用であって、細胞が、非免疫細胞である、使用。
［１５Ａ］上記［１０Ａ］に記載の使用であって、細胞が、心筋幹細胞および心筋前駆細胞からなる群から選択される細胞である、使用。
［１６Ａ］上記［１０Ａ］に記載の使用であって、細胞が、ミトコンドリア活性化処理がなされた免疫細胞である、使用。
［１７Ａ］上記［１３Ａ］または［１６Ａ］に記載の使用であって、細胞が、ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを有する免疫細胞である、使用。
［１８Ａ］投与対象が、機能異常を有するミトコンドリアを有する、上記［１０Ａ］～［１７Ａ］のいずれか一項に記載の使用。
図１は、野生型（ＷＴ）、Ｎｄｕｆｓ４ヘテロノックアウトマウス（Ｈｅｔ）、およびＮｄｕｆｓ４ホモノックアウトマウス（Ｈｏｍｏ）の胸腺中の細胞数の比較を示す。 図２は、野生型（ＷＴ）、Ｎｄｕｆｓ４ヘテロノックアウトマウス（Ｈｅｔ）、およびＮｄｕｆｓ４ホモノックアウトマウス（Ｈｏｍｏ）の体重（ＢＷ）あたりの胸腺中の細胞数の比較を示す。 図３は、野生型（ＷＴ）、Ｎｄｕｆｓ４ヘテロノックアウトマウス（Ｈｅｔ）、およびＮｄｕｆｓ４ホモノックアウトマウス（Ｈｏｍｏ）の体重（ＢＷ）あたりのＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞の数の比較を示す。 図４は、野生型（ＷＴ）、Ｎｄｕｆｓ４ヘテロノックアウトマウス（Ｈｅｔ）、およびＮｄｕｆｓ４ホモノックアウトマウス（Ｈｏｍｏ）の体重（ＢＷ）あたりのＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブ細胞の数の比較を示す。 図５は、野生型（ＷＴ）、Ｎｄｕｆｓ４ヘテロノックアウトマウス（Ｈｅｔ）、およびＮｄｕｆｓ４ホモノックアウトマウス（Ｈｏｍｏ）の脾臓中の全単核球数の比較およびＢ細胞の前駆細胞（Ｂ細胞プロジェニター）の全細胞にしめる割合の比較を示す。 図６は、野生型（ＷＴ）、Ｎｄｕｆｓ４ヘテロノックアウトマウス（Ｈｅｔ）、およびＮｄｕｆｓ４ホモノックアウトマウス（Ｈｏｍｏ）の骨髄中の造血前駆細胞の単離スキームとその後の培養実験のスキームを示す。 図７は、野生型（ＷＴ）、Ｎｄｕｆｓ４ヘテロノックアウトマウス（Ｈｅｔ）、およびＮｄｕｆｓ４ホモノックアウトマウス（Ｈｏｍｏ）の造血前駆細胞を培養した後のＣＤ４５陽性細胞の数の比較を示す。 図８は、野生型（ＷＴ）、Ｎｄｕｆｓ４ヘテロノックアウトマウス（Ｈｅｔ）、およびＮｄｕｆｓ４ホモノックアウトマウス（Ｈｏｍｏ）の造血前駆細胞を培養した後のＭａｃ１＋骨髄細胞の数の比較を示す。 図９は、野生型（ＷＴ）、Ｎｄｕｆｓ４ヘテロノックアウトマウス（Ｈｅｔ）、およびＮｄｕｆｓ４ホモノックアウトマウス（Ｈｏｍｏ）の造血前駆細胞を培養した後のＣＤ１９陽性Ｂ細胞の数の比較を示す。 図１０は、放射性照射した野生型（ＷＴ）、Ｎｄｕｆｓ４ヘテロノックアウトマウス（Ｈｅｔ）、およびＮｄｕｆｓ４ホモノックアウトマウス（Ｈｏｍｏ）に対する正常な骨髄単核球の移植実験のスキームを示す。 図１１は、骨髄移植を行った野生型マウスと行わなかったマウスの生存曲線の比較を示す。 図１２は、骨髄移植を行ったＮｄｕｆｓ４ホモノックアウトマウスと行わなかったＮｄｕｆｓ４ホモノックアウトマウスの生存曲線の比較を示す。 図１３は、骨髄移植を行った野生型マウス、ヘテロノックアウトマウス、ホモノックアウトマウスにおけるドナー骨髄の生着の様子を示す。陰性対照として、骨髄移植をしなかったホモノックアウトマウスにおけるドナー骨髄の生着も示される。 図１４は、ミトコンドリア活性化処理したＣＰＣ（ＭＩＴＯ－Ｃｅｌｌ）を胸腺の表面に移植して３日後の胸腺におけるＭＩＴＯ－Ｃｅｌｌ由来のミトコンドリアの分布を示す。 図１５は、ミトコンドリア活性化処理したＣＰＣ（ＭＩＴＯ－Ｃｅｌｌ）を胸腺の表面に移植して３日後の胸腺におけるＭＩＴＯ－Ｃｅｌｌ由来のミトコンドリアの分布を示す。 図１６は、細胞間でのミトコンドリアの移動を検出するアッセイ系を説明する図である。 図１７は、ミトコンドリアを赤く染めたマウスＣＰＣとミトコンドリアを緑に染めたマウスＣＰＣとを１：１の比率で共培養して２４時間後の細胞の蛍光顕微鏡画像である。左パネルが赤、中央パネルが緑、右パネルが重ね合わせ像である。重ね合わせ像において矢尻で示される細胞は黄色であり、細胞間でのミトコンドリアの移動が生じたことが検出されている。 図１８は、ミトコンドリアを緑に染めたＨ９ｃ２細胞とミトコンドリアを赤く染めたＣＰＣとを共培養して２４時間後の細胞の蛍光顕微鏡画像である。左パネルにおいて赤と緑の画像の重ね合わせ像が示されており、矢尻で示される細胞は黄色であり、細胞間でのミトコンドリアの移動が生じたことが検出されている。右の重ね合わせ像は、左の画像の四角い領域の拡大図である。 図１９は、ミトコンドリアを緑に染めたＨ９ｃ２細胞とミトコンドリアを赤く染めたＣＰＣとを共培養して２４時間後の細胞の蛍光顕微鏡画像である。左パネルが赤、中央パネルが緑、右パネルが重ね合わせ像である。重ね合わせ像において矢尻で示される細胞は黄色であり、細胞間でのミトコンドリアの移動が生じたことが検出されている。下は別の視野である。 図２０は、ＭＩＴＯ－ＣｅｌｌからのＲＥＳ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒの細胞間移動を示す図である。 図２１は、ＭＩＴＯ－ＣｅｌｌからのＲＥＳ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒの細胞間移動を示す図である。 図２２は、野生型のＣＰＣからＮｄｕｆｓ４ホモノックアウトマウスのＣＰＣにミトコンドリアが移動することを示す図である。
発明の詳細な説明
ＩＶ．発明の詳細な説明
　本明細書中に提供されるように、本発明は、標的免疫細胞の機能を回復し、健康な免疫系を促進するために、より少ない遺伝子突然変異を有する健康なミトコンドリアを胸腺などのリンパ器官に移植することによる、Ｔ細胞などの免疫細胞の質および量の改善に関する。従って、改良された免疫細胞は、ミトコンドリアおよび加齢関連疾患を改善することができる。
４．１　高度に精製されたミトコンドリアの調製
　本明細書に開示されるように、高品質で高純度の単離ミトコンドリアの調製は、ドナー組織から細胞を抽出し、それらを大量に培養することによって行うことができる。本明細書に提供される方法は、統合ミトコンドリア移植（ＩＭｉＴ）を可能にする。いくつかの態様において、ミトコンドリアは、最初に単離される。単離ミトコンドリアは、ミトコンドリア内膜において膜電位を有することが望ましい。本明細書では、「単離」とは、ミトコンドリアに関して述べる場合には、細胞内から取り出されることをいう。本明細書では、「精製」とは、単離されたものに混入する少なくとも１以上の成分をさらに分離することによって、精製度を向上させることをいう。
　まず、ドナー組織から細胞を抽出し、大量に培養する。ある態様において、ドナー組織は、健康なドナーに由来する。ある態様において、大量に安全に培養することができる線維芽細胞は、肝細胞、血小板、筋細胞、またはｉＰＳＣのような細胞当たりの高いミトコンドリア含有量を有する細胞よりむしろ使用されるであろう。線維芽細胞は、例えば、皮膚生検によって得ることができる。従って、いくつかの態様において、組織生検がドナーに対して行われ、十分な量の線維芽細胞が抽出される。特定の実施態様において、組織生検は、直径約４ｍｍである組織切片に由来する。他の実施態様において、線維芽細胞は市販の供給源から得られる。具体的な実施態様において、市販の線維芽細胞は、ＧＣＰ基準に従って調製される。いくつかの態様において、組織生検がドナーに対して行われ、十分な量の間葉系幹細胞、または心筋幹細胞（または心筋前駆細胞）が抽出される。
　本明細書中に開示されるように、単離前のミトコンドリアの活性化は、より高品質のミトコンドリアを生じ得る。従って、いくつかの態様において、線維芽細胞のミトコンドリア機能は、単離に先立って活性化される。特定の態様において、単離された高品質のミトコンドリアを、異常なミトコンドリア遺伝子および呼吸鎖複合体活性を有するレシピエント細胞に移植する。なおさらなる態様において、単離された高品質のミトコンドリアは、母性遺伝に由来する異常なミトコンドリア遺伝子を有するレシピエント細胞に移植される。さらなる態様において、単離された高品質のミトコンドリアは、核遺伝子に由来する異常なミトコンドリア遺伝子を有するレシピエント細胞に移植される。
　当業者であれば、ミトコンドリアを活性化する方法を理解するであろう。ミトコンドリアを活性化する方法は、例えば、ＷＯ２０１８／０９２８３９に開示された方法を用いることができる。また、例えば、いくつかの実施形態において、ミトコンドリア機能は、ミトコンドリア指向性キャリア（例えば、ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ）中にＣｏＱ－１０をカプセル化し、それをドナー細胞（例えば、線維芽細胞等）と共培養することによって活性化することができる。いくつかの実施形態において、ミトコンドリア指向性キャリア（例えば、ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ）は、異なる化学剤をカプセル化することができる。ミトコンドリアを活性化し得る他の薬剤としては、ＣＯ－Ｑ－１０、レスベラトロール、ニコチンアミドリボシド、ｎ－アセチルシステイン、α－トコフェロール、オメガ－３脂肪酸、グルコサミン、クレアチン一水和物、アセチル－カルニチン、エピカテキン、ケルセチン、オートファジー誘導剤、およびアポトーシス阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。
　ミトコンドリア指向性キャリアは、ミトコンドリア指向性分子を膜表面に表出させた小胞であり、小胞は、例えば、脂質二重膜からなるリポソームであり、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）とホスファチジン酸（ＰＡ）および／またはスフィンゴミエリン（ＳＭ）とを構成成分とするリポソームであり得る。ミトコンドリア指向性分子としては、例えば、Ｒ８ペプチド、ミトコンドリア標的化シグナル（ＭＴＳ）ペプチド（Ｋｏｎｇ，ＢＷ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　２００３，１６２５，ｐｐ．９８－１０８）およびＳ２ペプチド（Ｓｚｅｔｏ，Ｈ．Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．　２０１１，２８，ｐｐ．２６６９－２６７９）などのポリペプチド；並びにＬｉｐｏｐｈｉｌｉｃ　ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ　ｃａｔｉｏｎ（ＴＰＰ）およびＲｈｏｄａｍｉｎｅ　１２３などの脂溶性カチオン物質が挙げられる。小胞（例えば、リポソーム）内への薬剤の導入は、リポソームを構成する脂質と薬剤とのイオン結合、疎水結合、および共有結合等の化学的方法によって導入してもよく、常法によりリポソームの内腔に薬剤を封入してもよい。ミトコンドリア指向性キャリアとしてはまた、ＤＱＡｓｏｍｅ（Ｗｅｉｓｓｉｇ，Ｖ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ　２００１，７５，ｐｐ．４０１－４０８）、ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ（Ｙａｍａｄａ，Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ．　２００８，１７７８，ｐｐ．４２３－４３２）、ＤＦ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ（Ｙａｍａｄａ，Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．　２０１１，１９，ｐｐ．１４４９－１４５６）、Ｓ２ペプチドで修飾された改変型ＤＦ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ（Ｋａｗａｍｕｒａ，Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ　２０１３，１３，ｐｐ．６１０－６１４）などのミトコンドリア指向性リポソームを挙げることができる。なお、Ｒ８ペプチドおよびＳ２ペプチドは、ミトコンドリア指向性を有すると共に、細胞膜透過性を有するペプチドである。
　いくつかの態様において、高品質のミトコンドリアは、ジギトニンを用いてミトコンドリアを含む細胞の膜透過性を高めることによって細胞内から単離することができる。
　さらなる態様において、膜輸送機能は、単離されたミトコンドリアおよび２つの膜輸送配列を有するペプチドを共培養することによって、ミトコンドリアの外膜の表面に付加される。ある実施態様では、２つのペプチドは、細胞膜透過性ペプチドおよびミトコンドリア膜融合性ペプチドなどの膜輸送配列を含むペプチドである。
　他の態様において、ペプチドはペプチド結合体である。ペプチドコンジュゲートは、ペプチドおよび脂質を含むことができる。脂質は、ペプチドのＮ末端、ペプチドのＣ末端、またはその両方に結合し得る。ある局面において、脂質は、ペプチドをミトコンドリア膜に埋め込むことを可能にする。
　従って、いくつかの態様において、方法は、さらに、単離されたミトコンドリアを１以上の部分と共培養することを含む。ある態様において、１または複数の部分は、ポリエチレングリコールを含む。他の態様において、１つまたは複数の部分は、アプタマーを含む。
　いくつかの態様において、ミトコンドリアの移植は、トレハロース緩衝液を用いて行われる。
４．２．１　分離または単離したミトコンドリアの移植
　ミトコンドリア機能障害は、ミトコンドリア疾患、免疫異常および加齢の重要な原因である。主要な臓器の多くは、ミトコンドリア機能の障害によって影響を受ける。さらに、ミトコンドリア機能障害は自然免疫と獲得免疫の両方に不均衡を生じさせ、ミトコンドリア疾患と加齢に重要な役割を果たすことがある。
　エネルギー代謝異常は免疫担当細胞において報告されている。自然免疫に関与する単球系マクロファージと樹状細胞は、エネルギーをミトコンドリアに依存しない嫌気的解糖に依存している。獲得免疫に関与するエフェクターＴ細胞は、ミトコンドリアの酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）も利用する。記憶Ｔ細胞と制御性Ｔ細胞は、脂肪酸の酸化によってＯＸＰＯＳに依存している。このように、ミトコンドリア機能障害を有する免疫担当細胞は、特にＴ細胞活性の低下により、獲得免疫の低下を引き起こすと予想される。実際、加齢に伴うＴ細胞機能の低下は、いわゆる免疫老化の典型的な徴候として報告されている。
　胸腺では、初期の胸腺前駆細胞が造血幹細胞から分化し、増殖（１００万倍まで）と分化、例えばＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子の再構築、ＴＣＲ認識自己ＭＨＣを発現するＴ細胞の選択（ポジティブセレクション）、自己抗原を認識するＴ細胞の除去（ネガティブセレクション）によって、成熟したＣＤ４およびＣＤ８発現Ｔ細胞へと成長する。髄質と皮質の胸腺ストローマの胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）は、胸腺のＴ細胞の分化を助ける。正常な臓器組織では、上皮細胞は密着し、シート状に配列し、一方ＴＥＣはスポンジ様構造を有する。初期の胸腺前駆細胞は、三次元構造に存在するＴＥＣの間で皮質から髄質に移動しながら、増殖、分化、成熟し、そして胸腺から移動する。
　酸化還元関連蛋白質修飾の一酸化窒素を用いた翻訳後修飾を受けたシステインＳ－ニトロシル化がマウス組織で研究され、胸腺は脳、心臓、肺、肝臓、腎臓に類似した高度にミトコンドリア依存性の臓器であることが明らかになった。したがって、ＴＥＣおよびＴ細胞のミトコンドリア機能の低下は、胸腺におけるＴ細胞成熟過程の異常、およびＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋細胞の減少、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞の減少、およびメモリーＴ細胞の増加のようなＴ細胞サブセットの変化を引き起こす可能性があり、また、増殖期におけるＴ細胞上のレセプターの異常発現の可能性もあり、これは胸腺萎縮において認められた加齢免疫系と類似し、免疫寛容の減弱につながる可能性がある。さらに、胸腺のリンパ球は思春期（１０代前後）に最も多く、胸腺のピーク重量が３０～４０ｇで、その後急速に退縮し、７０歳までにはほぼ枯渇することが知られている。
　胸腺の皮質ストローマ細胞における活性酸素種（ＲＯＳ）の過剰産生は、胸腺萎縮に関与している。胸腺ストローマ細胞のミトコンドリア機能の低下によるＡＴＰ産生能の低下、およびＲＯＳの過剰産生は、胸腺萎縮の主な原因である可能性がある。実際、ミトコンドリアの二本鎖ＤＮＡを一時的に切断したモデル動物では、成長の初期段階から胸腺の退化が観察されている。胸腺萎縮は、変異（ｍｔＤＮＡ）複製酵素ＤＮＡポリメラーゼ‐γ（ＰＯＬＧ）を有するマウスでも観察される。
　したがって、遺伝子変異の少ない健康なミトコンドリアを胸腺に移植することにより、ＴＥＣおよびＴ細胞のミトコンドリア機能を支持することは、胸腺機能を回復し、胸腺萎縮を遅延させる新規なアプローチである。Ｔ細胞の質および量の改善は、健康な免疫系を導き、ミトコンドリアおよび加齢関連疾患に対する改善効果が期待される。
　いくつかの態様において、単離ミトコンドリアが調製され、膜輸送シグナルが付加される。このようにして、膜透過性を高められたミトコンドリアは、次に細胞に輸送される。いくつかの態様において、高度に精製された単離ミトコンドリアが調製され、高膜輸送シグナルが付加される。膜輸送シグナルの高いミトコンドリアは、次に細胞に輸送される。
　本明細書に開示されるように、ある態様では、ミトコンドリアは、ミトコンドリアを単離する前に、または単離した後で、任意に、ドナー細胞内において活性化され得る。本明細書では、ミトコンドリアを活性化する処理を、「ミトコンドリア活性化処理」という。ミトコンドリアを活性化するために、化学物質を封入したミトコンドリア指向性キャリア（例えば、ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ）を使用することを含むが、これに限定されない様々な方法を用いることができる。化学剤は、ミトコンドリアを活性化することができる任意の剤であり得る。例えば、薬剤は、ＣＯ－Ｑ－１０、レスベラトロール、ニコチンアミドリボシド、ｎ－アセチルシステイン、α－トコフェロール、オメガ－３脂肪酸、グルコサミン、クレアチン一水和物、アセチル－カルニチン、エピカテキン、ケルセチン、オートファジー誘導剤、またはアポトーシス阻害剤であり得る。いくつかの態様では、薬剤は、ミトコンドリア呼吸鎖複合体I、III、およびIVのいずれか１以上、または全てに対する電子供与体であり得る。いくつかの態様では、薬剤はミトコンドリア呼吸鎖複合体I、III、およびIVのいずれか１以上、または全てに対する基質であり得る。いくつかの態様では、薬剤は、生体適合性の抗酸化剤であり得る。いくつかの態様では、薬剤はレスベラトロールであり得る。
　本明細書に開示されるように、ミトコンドリアはドナー細胞から単離することができる。いくつかの態様において、ドナー細胞は、脾臓、リンパ節、心臓、肺、膵臓、肝臓、皮膚、腎臓、血液、筋肉、およびリンパ管などの臓器に由来する。具体的な実施形態では、ドナー細胞は、線維芽細胞、肝細胞、血小板、筋細胞、およびｉＰＳＣからなる群より選択される。ドナー細胞は自家移植でも同種異系移植でもよいが、レシピエント細胞におけるミトコンドリア機能の異常の特性に応じて自家移植か同種異系移植かを適宜選択することができる。
　いくつかの実施態様では、レシピエント細胞は、胸腺、脾臓、リンパ節、心臓、肺、膵臓、肝臓、皮膚、腎臓、血液、リンパ管、眼、鼻および耳などの器官に由来する。具体的な実施形態では、レシピエント細胞は誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。
　特定の実施形態では、２つのタイプの細胞を移植することができる：接着性胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）および浮遊性胸腺リンパ球。具体的な実施形態では、レシピエント細胞は、接着性ＴＥＣ、浮遊性胸腺リンパ球、またはその両方である。他の態様において、レシピエント細胞は、心臓の心筋細胞、肝臓の肝細胞、および脳のニューロンなどの販売された臓器由来の接着細胞である。
　ドナー細胞からレシピエント細胞へのミトコンドリアの移植は、ミトコンドリア機能を含むがこれに限定されないレシピエント細胞の機能の改善を助けることができる。従って、いくつかの態様において、レシピエント細胞は、正常な機能を有するミトコンドリアまたは改良されたミトコンドリアを必要とする細胞である。従って、いくつかの態様において、レシピエント細胞は、加齢関連疾患を有する宿主に由来する。他の態様において、レシピエント細胞は、ミトコンドリア疾患を有する宿主由来である。
　ある態様において、レシピエント細胞は、インタクトな臓器内にあり得る。例えば、レシピエント細胞は、胸腺、脾臓、リンパ節、心臓、肺、膵臓、肝臓、皮膚、腎臓、血液、リンパ管、眼、鼻および耳などの臓器に由来することができ、細胞は臓器内にあり得る。
　ミトコンドリア移植後のレシピエント細胞におけるミトコンドリア機能の改善は、レシピエント細胞に取り込まれる正常な機能を有するドナーミトコンドリアまたは高品質ドナーミトコンドリアの数に比例し得る。ある態様において、レシピエント細胞は、マクロピノサイトーシスによってドナーミトコンドリアを取り込む。特定の態様において、細胞膜輸送配列を有するペプチドを、ドナーミトコンドリアに添加して、マクロピノサイトーシスによるミトコンドリア取り込みを改善する。例えば、ＭＥＬＡＳサイブリッド細胞(MELAS cybrid cell)を、高い膜輸送シグナルを付加したミトコンドリアと共培養することにより、ミトコンドリアの迅速かつ長期的な取り込みを可能にすることができる。さらなる態様において、外因性ミトコンドリアの取り込みは、内因性ミトコンドリアの機能を増強することができる。
　最適な細胞膜輸送配列は、対象の細胞型によって異なる。いくつかの態様において、ミトコンドリアは、１つまたは複数のレシピエント細胞型を標的とする１つまたは複数の膜輸送配列を発現することができる。例えば、ミトコンドリアは、ＴＥＣｓなどの上皮細胞および浮遊性胸腺リンパ球を標的とする２つ以上の異なる膜輸送ペプチドの混合物を発現することができる。
　ミトコンドリアは体細胞核移植によっても伝達される。しかしながら、体細胞核移植を用いた移植後の核とミトコンドリア間の一貫した協調性の欠如に起因する異種抗原性のため、免疫拒絶のリスクがある。ミトコンドリア移植は、内因性ミトコンドリア機能の活性化を主目的とし、ミトコンドリアを局所移植するため、同種異系抗原性のリスクが低下する。従って、いくつかの態様において、インタクトな自家移植片ミトコンドリアのレシピエント細胞への移植は、免疫原性ではない。他の態様において、インタクトな同種異系移植片ミトコンドリアのレシピエント細胞への移入は、免疫原性ではない。
　損傷したミトコンドリアは、細胞に障害を与えうる。従って、本明細書では、「インタクト」とは、細胞に障害を与えない程度に損傷がないか、または少ないことを意味し得る。本明細書では、「インタクト」とは、生理学的に正常な機能を維持していることを意味し得る。本明細書では、「インタクト」とは、ミトコンドリアが外膜および内膜を維持していることを意味し得る。本明細書では、「インタクト」とは、ミトコンドリア（の内膜）が膜電位を有することを意味し得る。本明細書では、「インタクト」とは、ミトコンドリアが傷を有しないことを意味し得る。
４．２．２　単離した細胞の移植
　ミトコンドリアは、細胞内に含まれる。従って、ミトコンドリアの移植は、細胞を移植することによっても達成される。本実施例によれば、ミトコンドリアは、細胞移植によっても胸腺に広く分布する結果となった。本実施例によれば、ミトコンドリアは、細胞内に留まること無く、細胞間を移動することが示された。従って、健康なミトコンドリア（例えば、遺伝子変異の少ない健康なミトコンドリア）を含む細胞を移植することは、ミトコンドリアを移植することと同等の利点を有する。
　本明細書に開示されるように、細胞は、投与される前に活性化され得る。本発明は、ミトコンドリアを活性化するために、化学物質を封入したミトコンドリア指向性キャリア（例えば、ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ）を使用することを含み得るが、これに限定されない様々なミトコンドリアの活性化のための方法を用いることができる。化学剤は、ミトコンドリアを活性化することができる任意の剤であり得る。例えば、薬剤は、ＣＯ－Ｑ－１０、レスベラトロール、ニコチンアミドリボシド、ｎ－アセチルシステイン、α－トコフェロール、オメガ－３脂肪酸、グルコサミン、クレアチン一水和物、アセチル－カルニチン、エピカテキン、ケルセチン、オートファジー誘導剤、またはアポトーシス阻害剤であり得る。
　本明細書に開示されるように、投与される細胞は、胸腺、脾臓、リンパ節、心臓、肺、膵臓、肝臓、皮膚、腎臓、血液、リンパ管、眼、鼻および耳などの臓器または組織に由来し得る。いくつかの態様では、投与される細胞は、組織幹細胞であり得る。ある態様では、投与される細胞は、心筋幹細胞または心筋前駆細胞であり得る。特定の実施形態では、２つのタイプの細胞のいずれかを移植することができる：接着性胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）および浮遊性胸腺リンパ球。具体的な実施形態では、投与される細胞は、接着性ＴＥＣ、浮遊性胸腺リンパ球、またはその両方である。他の態様において、投与される細胞は、心臓の心筋細胞、肝臓の肝細胞、および脳のニューロンなどの細胞、例えば、販売された臓器由来の接着細胞であり得る。投与される細胞は、投与される個体に対して自家でも同種異系でもよい。
　本明細書に開示されるように、投与される細胞は、投与される組織中の細胞に対してミトコンドリアを供給できる細胞であり得る。そのような細胞は、投与される組織中の細胞と投与される細胞とを共培養して、投与される細胞から投与される組織中の細胞にミトコンドリアを供給するか否かを確認するアッセイによって確認することができる。共培養によって、投与される組織中の細胞に対して、ミトコンドリアを供給できる細胞は、本発明で投与される細胞として用いることができる。ミトコンドリアを供給できるか否かは、投与される細胞に含まれるミトコンドリアを標識することにより確認することができる。ミトコンドリアの標識は、蛍光標識によりなされ得る。蛍光標識としては、ミトコンドリアを蛍光標識できる各種標識を用いることができる。アッセイの前に、投与される細胞は、ミトコンドリア活性化処理に供されていてもよい。いくつかの対象では、投与される細胞は、心筋幹細胞または心筋前駆細胞であり得る。
　本発明によれば、ミトコンドリアは、細胞間を移動することができる。従って、細胞そのものが移植された臓器で生着することは必要ではないと考えられる。従って、ある態様では、一次リンパ組織および二次リンパ組織に投与される細胞は、例えば、非免疫細胞であり得る。非免疫細胞としては、成熟した免疫細胞および未熟な免疫細胞（例えば、発生中の免疫細胞）が挙げられる。ある態様では、一次リンパ組織および二次リンパ組織に投与される細胞は、例えばまた、非造血幹細胞であり得、非造血前駆細胞であり得、非リンパ急性共通前駆細胞であり得、非ＮＫ細胞／非Ｔ細胞前駆細胞であり得、非骨髄球性共通前駆細胞、非顆粒球・マクロファージ系前駆細胞であり得、または、非マクロファージ・樹状細胞前駆細胞であり得、非肥満細胞前駆細胞であり得る。
４．３　移植の方法と部位
　造血幹細胞は、胸腺に直接安全に注入され、分化してＴ細胞になることが報告されている。ある態様において、ミトコンドリアまたは細胞は、対象（または患者）の胸腺組織（例えば、ストローマ）に直接注入され得る。
　従って、いくつかの態様において、ミトコンドリアのまたは細胞移植は、本明細書に記載の方法に従ってインビボで行うことができる。いくつかの態様において、インビボ移植は、ミトコンドリア指向性キャリア（例えば、ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ）による移植、ミトコンドリア指向性キャリアを含むミトコンドリアの移植、またはミトコンドリア指向性キャリアを含む細胞の移植を含む。ミトコンドリア指向性キャリア（例えば、ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ）は、ミトコンドリア指向性キャリア（例えば、ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ）の表面に結合した１以上のペプチドを含むことができる。
　ミトコンドリアまたは細胞の移植は、心臓、肝臓、耳、眼、胸腺、脳、肺、内皮細胞、リンパ節、骨髄、血液、脾臓、腎臓、リンパ管、鼻および滑膜からなる群より選択される臓器または組織に対して行うことができる。特定の態様では、ミトコンドリアまたは細胞の移植は、胸腺、脾臓、および骨髄からなる群より選択される臓器または組織に対して行うことができる。これらの態様では、ミトコンドリアまたは細胞の移植は、これらの臓器または組織（好ましくは、一次リンパ組織、および二次リンパ組織のいずれかの組織；例えば、胸腺、脾臓および骨髄からなる群より選択される臓器または組織；例えば、胸腺）内への注射によって行うことができる。
　特定の局面において、ミトコンドリア指向性キャリア（例えば、ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ）はまた、ＣＯ－Ｑ－１０、レスベラトロール、ニコチンアミドリボシド、ｎ－アセチルシステイン、α－トコフェロール、オメガ－３脂肪酸、グルコサミン、クレアチン一水和物、アセチル－カルニチン、エピカテキン、ケルセチン、オートファジーインデューサー、およびアポトーシス阻害剤などの化学物質を含むことができるが、これらに限定されない。
　Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎａｌ　ｒａｄｉｏｌｏｇｙ（ＩＶＲ）‐ｃｏｍｐｕｔｅｄ　ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＣＴ）は放射線診断技術の治療的応用であり、ＣＴガイド下で穿刺針またはカテーテルを体内に挿入して治療を支援する。特に、Ｘ線ＣＴは空間分解能、コントラスト分解能だけでなく時間分解能も向上し、ＣＴ観察下でのリアルタイム穿刺が可能となった。以上より、摘出ミトコンドリアまたは細胞の胸腺内注入を複数回行うためには、Ｘ線ＣＴ等のＩＶＲ－ＣＴの使用が考えられる。ある態様において、胸腺への直接注射は、ＩＶＲ－ＣＴを用いて行うことができる。具体的な実施形態では、胸腺への直接注入は、Ｘ線ＣＴを用いて行うことができる。
　いくつかの実施形態において、胸腺の萎縮を軽減することができ、Ｔ細胞の分化および成熟は、インタクトなミトコンドリアまたは細胞の移植によって胸腺内で促進することができる。ある態様において、ミトコンドリアまたは細胞の移植によるＴ細胞の増加は、末梢血中のＴ細胞の質的および量的な異常を補正することができる。これはまた、胸腺の萎縮による免疫老化に対する若返り効果をもたらすかもしれない。
　更なる態様において、自己免疫Ｔ細胞の機能回復は、局所的な自然および獲得免疫の調節によって病態の改善（免疫寛容の回復）を導き得る。
４．４　移植後
　いくつかの具体例において、移植臓器機能の改善を促進するために、病態に従って、移植後早期から予定されたリハビリテーションが行われる。具体的な実施形態では、有酸素運動を実施して、ミトコンドリアの取り込みを有意に増加させ、レシピエント細胞の機能を改善する。
　Ｔ細胞機能の測定は、当技術分野で公知の方法を用いて行うことができる。例えば、いくつかの態様において、ミトコンドリア機能は、末梢血Ｔ細胞において測定することができる。
４．５　本発明のミトコンドリア製剤または細胞製剤
　本発明によれば、心臓、肝臓、耳、眼、胸腺、脳、肺、内皮細胞、リンパ節、骨髄、血液、脾臓、腎臓、リンパ管、鼻および滑膜からなる群より選択される臓器または組織（好ましくは、一次リンパ組織、および二次リンパ組織のいずれかの組織；例えば、胸腺、脾臓および骨髄からなる群より選択される臓器または組織；例えば、胸腺）に投与するための、ミトコンドリアを含む医薬製剤が提供される。本発明によればまた、本発明の医薬製剤は、心臓、肝臓、耳、眼、胸腺、脳、肺、内皮細胞、リンパ節、骨髄、血液、脾臓、腎臓、リンパ管、鼻および滑膜からなる群より選択される臓器または組織（好ましくは、一次リンパ組織、および二次リンパ組織のいずれかの組織、例えば、胸腺、脾臓および骨髄からなる群より選択される臓器または組織；例えば、胸腺）に投与するための、細胞を含む医薬製剤が提供される。
　いくつかの態様では、投与される細胞は、ミトコンドリア活性化処理がなされたミトコンドリアまたは細胞であり、投与される臓器または組織は、心臓、肝臓、耳、眼、胸腺、脳、肺、内皮細胞、リンパ節、骨髄、血液、脾臓、腎臓、リンパ管、鼻および滑膜からなる群より選択される臓器または組織（好ましくは、一次リンパ組織、および二次リンパ組織のいずれかの組織、例えば、胸腺、脾臓および骨髄からなる群より選択される臓器または組織；例えば、胸腺）であり得る。
　いくつかの態様では、投与される細胞は、心筋幹細胞または心筋前駆細胞であり、投与される臓器または組織は、心臓、肝臓、耳、眼、胸腺、脳、肺、内皮細胞、リンパ節、骨髄、血液、脾臓、腎臓、リンパ管、鼻および滑膜からなる群より選択される臓器または組織（好ましくは、一次リンパ組織、および二次リンパ組織のいずれかの組織、例えば、胸腺、脾臓および骨髄からなる群より選択される臓器または組織；例えば、胸腺）であり得る。
　いくつかの態様では、投与される細胞は、ミトコンドリア活性化処理がなされたミトコンドリアまたは心筋幹細胞若しくは心筋前駆細胞であり、投与される臓器または組織は、心臓、肝臓、耳、眼、胸腺、脳、肺、内皮細胞、リンパ節、骨髄、血液、脾臓、腎臓、リンパ管、鼻および滑膜からなる群より選択される臓器または組織（好ましくは、一次リンパ組織、および二次リンパ組織のいずれかの組織、例えば、胸腺、脾臓および骨髄からなる群より選択される臓器または組織；例えば、胸腺）であり得る。
　本発明の医薬製剤は、ミトコンドリアに機能異常を有する患者において、胸腺機能を向上させることに用いられ得る。この態様においては、本発明の医薬製剤は、胸腺内投与され得る。
　本発明の医薬製剤は、ミトコンドリアに機能異常を有する患者において、胸腺萎縮を処置することに用いることができる。この態様においては、本発明の医薬製剤は、胸腺内投与され得る。
　本発明に医薬製剤は、ミトコンドリアに機能異常を有する患者において、骨髄機能を向上させることに用いられ得る。この態様においては、本発明に医薬製剤は、骨髄内投与され得る。
　本発明の医薬製剤は、ミトコンドリアに機能異常を有する患者において、免疫機能を向上させることに用いられ得る。この態様においては、本発明の医薬製剤は、好ましくは、一次リンパ組織、および二次リンパ組織のいずれかの組織、例えば、胸腺、脾臓および骨髄からなる群より選択される臓器または組織に対して局所投与され得る。
　本発明の医薬製剤は、ミトコンドリアに機能異常を有する患者を処置することに用いることができる。この態様においては、本発明の医薬製剤は、心臓、肝臓、耳、眼、胸腺、脳、肺、内皮細胞、リンパ節、骨髄、血液、脾臓、腎臓、リンパ管、鼻および滑膜からなる群より選択される臓器または組織（好ましくは、一次リンパ組織、および二次リンパ組織のいずれかの組織、例えば、胸腺、脾臓および骨髄からなる群より選択される臓器または組織；例えば、胸腺）に対して局所投与され得る。
　本発明の医薬製剤は、ミトコンドリアまたは細胞と賦形剤とを含んでいてもよい。賦形剤は、例えば、薬学的に許容される賦形剤である。薬学的に許容される賦形剤としては、特に限定されないが例えば、ｐＨ調整剤、塩、界面活性剤、防腐剤、安定化剤、および等張化剤が挙げられる。
　ある側面では、本発明の医薬製剤の製造におけるミトコンドリアまたは細胞の使用が提供される。
４．６　本発明のミトコンドリアまたは細胞を投与する対象
　本明細書では、対象または患者は、哺乳動物であり得、例えば、ヒトなどの霊長類、犬およびネコなどの愛玩動物が挙げられる。本明細書では、「患者」とは、疾患または病的な状態を有する対象を意味する。本発明によれば、本発明のミトコンドリアまたは細胞を投与する対象は、ミトコンドリア機能に異常を有する対象、例えば、ミトコンドリア病の患者であり得る。ミトコンドリア病の患者は、ミトコンドリアのゲノムに異常を有する患者、または核ゲノムに異常を有する患者であり得る。ミトコンドリア病の患者は、遺伝性のミトコンドリア病の患者、または後天的なミトコンドリア病の患者であり得る。本発明によれば、本発明のミトコンドリアまたは細胞を投与する対象は、ミトコンドリア機能に異常を有し、かつ、萎縮した胸腺を有する対象であり得る。胸腺の萎縮は、対象と同じ年齢の個体が有する通常の胸腺と比較することにより決定され得る。本発明によれば、本発明のミトコンドリアまたは細胞を投与する対象は、ミトコンドリア機能に異常を有し、かつ、免疫機能に異常を有する対象であり得る。ミトコンドリア機能の異常は、たとえば、ミトコンドリアの膜電位を健常者のミトコンドリアの膜電位と比較することにより決定され得る。
実施例１：Ｎｄｕｆｓ４遺伝子ノックアウトマウスの表現型の詳細の解析
　Ｎｄｕｆｓ４遺伝子は、ヒトにおいて、常染色体に存在し、ミトコンドリア内膜の呼吸鎖複合体Ｉ（ＮＡＤＨ：ユビキノンオキシドレダクターゼ）の１８ｋＤａのアクセサリーサブユニット（ＮＡＤＨ：ユビキノンオキシドレダクターゼ　コアサブユニット　Ｓ４）をコードする。Ｎｄｕｆｓ４遺伝子の変異は、常染色体劣性であるミトコンドリアの呼吸鎖複合体Ｉの欠乏に関係している。この複合体Ｉの欠乏は、ミトコンドリアにおける酸化的リン酸化傷害の最も頻度の高い酵素欠陥であるとされる。本実施例では、Ｎｄｕｆｓ４ノックアウトマウスにおいて、胸腺が野生型やヘテロよりも有意に萎縮していることを見出した。
　野生型、ヘテロおよびＮｄｕｆｓ４ノックアウトマウス（それぞれ４週齢、ｎ＝１４～１６）の末梢血をそれぞれ回収し、血液成分を分析した。Ｎｄｕｆｓ４ノックアウトマウス（The Jackson Laboratory, Stock No.: 027058）は、Kruse SE et al., Cell Metabolism., 7(4):312-320, 2008に記載の通りである。血液成分の分析の結果は、表１に示される通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
　表１に示されるように、Ｎｄｕｆｓ４ノックアウトマウスにおいては、全血球細胞数の減少が認められた。表１に示されるように、Ｎｄｕｆｓ４ノックアウトマウスでは、リンパ球、およびＢ細胞の統計学的に有意な減少が認められた。
　野生型、ヘテロマウス、およびＮｄｕｆｓ４ノックアウトマウスからそれぞれ胸腺を摘出し、胸腺中の胸腺細胞の数を計数した。その結果、図１に示されるように、Ｎｄｕｆｓ４ホモノックアウトマウスでは、野生型やヘテロよりも胸腺細胞数が有意に減少していた。また、図２に示されるように、体重（ＢＷ）あたりの胸腺細胞数においても、Ｎｄｕｆｓ４ホモノックアウトマウスでは、野生型やヘテロよりも有意に減少していた。さらには、胸腺細胞からＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブＴ細胞の数、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞の数をフローサイトメトリで計数した。その結果、図３に示されるように体重あたりのＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞の細胞数においては、野生型やヘテロよりも、Ｎｄｕｆｓ４ノックアウトマウスにおいて減少の傾向が認められた。また、図４に示されるように、体重あたりのＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞の細胞数においては、野生型やヘテロよりも、Ｎｄｕｆｓ４ノックアウトマウスにおいて統計学的に有意に減少していた。このように、Ｎｄｕｆｓ４ノックアウトマウスにおいては、胸腺が萎縮しており、胸腺細胞数および体重あたりのＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞の細胞数において、野生型やヘテロよりも統計学的に有意に減少していた。胸腺細胞数および体重あたりのＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞の細胞数において、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブＴ細胞よりも、減少の程度が大きいことは、胸腺におけるＴ細胞の発達に関して胸腺におけるミトコンドリア機能の異常が関与していることを示す。
　Ｎｄｕｆｓ４ヘテロマウス同士を交配し、同腹産仔として得られた、野生型、ヘテロおよびＮｄｕｆｓ４ノックアウトマウス（３週齢、雌）の脾臓をそれぞれ摘出し、脾臓に集まってきたＢ細胞の前駆細胞をＡＡ４．１とＣＤ４５ＲとＢ２２０の発現に基づくフローサイトメトリにより分析した。その結果、図５に示されるように、野生型およびヘテロに対して、Ｎｄｕｆｓ４ノックアウトマウスにおいては、全単核球数が有意に低下していた上に、Ｂ細胞の前駆細胞の割合も低下していた。
　Ｎｄｕｆｓ４ノックアウトマウスの骨髄から造血前駆細胞を単離し、その増殖能および分化能を検証した。図６に示されるように、Ｎｄｕｆｓ４ヘテロマウス同士を交配し、同腹産仔として得られた、野生型、ヘテロおよびＮｄｕｆｓ４ノックアウトマウス（４週齢）から骨髄を採取した。磁気ビーズを用いて、リニエージマーカー（Ｍａｃ１，Ｇｒ１，Ｂ２２０，ＣＤ３，ＴＥＲ１１９）陽性の細胞を除去した。その後、ＭＳ５マウスストローマ細胞と共に、１×１０４細胞の得られた細胞を共培養した。培養期間は１週間であった。その結果、図７に示されるように、培養後の細胞集団に含まれるＣＤ４５＋細胞の数が、野生型およびヘテロに比べて、Ｎｄｕｆｓ４ノックアウトマウスにおいて有意に減少していた。また、図８に示されるように、培養後の細胞集団に含まれるＭａｃ１＋骨髄細胞の割合において、野生型およびヘテロに比べて、Ｎｄｕｆｓ４ノックアウトマウスにおいて増加傾向が認められた。さらに、図９に示されるように、ＣＤ１９＋Ｂ細胞の割合において、野生型およびヘテロに比べて、Ｎｄｕｆｓ４ノックアウトマウスにおいて有意に減少していた。
　図１０に示されるように、Ｎｄｕｆｓ４ノックアウトマウス（ＣＤ４５．２＋）（５週齢）をレシピエントとして、９５０ｒａｄの放射線を全身照射し、ＣＤ４５．１＋である６～７週齢マウスの２×１０７細胞の骨髄単核球を投与し、マウスの生存期間を評価した。その結果、図１１に示されるように、移植無し（放射線照射無し、移植無し）と比較して、骨髄単核球を移植したＮｄｕｆｓ４ノックアウトマウスでは、全生存率（ＯＳ）が改善した。また、図１２に示されるように生存期間に関して、移植無し（放射線照射無し、移植無し）と比較して、骨髄単核球を移植したＮｄｕｆｓ４ノックアウトマウスでは、統計学的に有意に増大した。このことは、Ｎｄｕｆｓ４ホモノックアウトマウスにおいては、骨髄細胞の異常が生じていることを示唆する結果である。また、図１３に示されるようにドナー細胞の生着は、野生型とヘテロノックアウトマウスとで相違しなかった。
実施例２：Ｎｄｕｆｓ４ノックアウトマウスの胸腺に対する健常ミトコンドリアの移植
　本実施例では、Ｎｄｕｆｓ４ノックアウトマウスの胸腺に対して、健常なミトコンドリアを移植する実験を行った。
　健常ミトコンドリアのソースとして、マウス心臓内幹細胞（ＣＰＣ）を用いた。ＣＰＣをＤＭＥＭ－Ｆ１２培地で３７℃で２４時間培養した。ＷＯ２０１８／０９２８３９に開示された手順によって作製したＲＥＳ－ミトコンドリア指向性キャリア（例えば、ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ）を添加して、２時間インキュベートし、ＲＥＳ－ミトコンドリア指向性キャリア（例えば、ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ）をＣＰＣに導入した。得られた細胞をＭＩＴＯ－Ｃｅｌｌという。ＲＥＳ－ミトコンドリア指向性キャリア（例えば、ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ）は、レスベラトロールを内包したミトコンドリア指向性リポソームであり、リポソームは、１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）の９：２のモル比で構成され、脂質量の１０％のＳｔｅａｒｙｌ　Ｓ２がさらに導入されたことにより、ミトコンドリア指向性を有するリポソームである。ＲＥＳ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒが導入された細胞では、レスベラトロールがミトコンドリアに送達され、ミトコンドリアが強化されていることが、ＷＯ２０１８／０９２８３９において示されている（例えば、ドキソルビシン誘発心筋症ラットモデル移植したＣＰＣは細胞生存率を改善するが、ＭＩＴＯ－Ｃｅｌｌ（ＷＯ２０１８／０９２８３９においてはＭＡ－Ｃｅｌｌと呼ばれている）はＣＰＣよりもさらに大きく細胞生存率を改善する）。
　ＭＩＴＯ－ＣｅｌｌをＭＩＴＯ　Ｔｒａｃｋｅｒ　ｄｅｅｐ　ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ　ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて染色した。これにより、ＭＩＴＯ－Ｃｅｌｌ中のミトコンドリアが染色された。染色後にＭＩＴＯ－Ｃｅｌｌ（１．０×１０６細胞）をＮｄｕｆｓ４ノックアウトマウスの左側胸腺の胸側表面（１箇所）に注射した。移植３日後に胸腺を摘出し、常法に従って組織切片を作製して、核をＨｏｅｃｈｓｔ　３３３４２で染色し、その後、共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＭＳ）で観察した。その結果、図１４および１５に示されるように、ＭＩＴＯ　Ｔｒａｃｋｅｒ　ｄｅｅｐ　ｒｅｄにより染色されたＭＩＴＯ－Ｃｅｌｌ由来のミトコンドリアは、胸腺組織において、投与箇所を超えて広がって分布していた。このことから、移植した細胞に含まれていたミトコンドリアは、胸腺への注射によって胸腺組織に広く分布したことが示された。
実施例３：細胞間のミトコンドリアの移動
　本実施例では、ミトコンドリアが細胞間で移動することを実証する。例えば、ＣＰＣからＮｄｕｆｓ４の細胞に対してミトコンドリアが供給されることを実証する。
　本実施例においては、ミトコンドリアを染め分けた細胞集団を共培養して、培養後に２色に染まった細胞の有無を確認する。この実験系においては、２色に染まった細胞には、２つ以上の細胞から供給されたミトコンドリアが含まれていることが示され、すなわち、ミトコンドリアがある細胞から別の細胞に移動したことが示される。
　より具体的には、図１６に示されるように、異なる細胞に由来するミトコンドリアを区別できるように、一方の細胞集団に含まれるミトコンドリアと他方の細胞集団に含まれるミトコンドリアを染め分けた。より具体的には、一方の細胞集団のミトコンドリアをＭｉｔｏ　ｔｒａｃｋｅｒ　Ｇｒｅｅｎを用いて緑色の蛍光を発するように染色し、他方の細胞集団のミトコンドリアをＭｉｔｏ　ｔｒａｃｋｅｒ　Ｄｅｅｐ　Ｒｅｄを用いて赤色の蛍光を発するように染色した。その後、２つの細胞集団を１つの培養液中で共培養した。この実験系では、もし、ミトコンドリアが細胞間で移動したならば、１つの細胞中で、赤く染色されたミトコンドリアと緑で染色されたミトコンドリアが共在することとなり、１つの細胞中で、赤および緑の両方の蛍光を発するか、または黄色の蛍光を発することとなる。
　マウスＣＰＣ（赤）とマウスＣＰＣ（緑）とを共培養して、２４時間後にＣＬＳＭにより観察した結果を図１７に示す。図１７に示されるように、一部の細胞において、黄色の蛍光を示す細胞が認められた（白の矢尻参照）。このことから、ＣＰＣ間においてミトコンドリアの移動が行われていることが示された。また、ラット心臓横紋筋細胞であるＨ９ｃ２細胞（緑）とＣＰＣ（赤）とを共培養して、２４時間後にＣＬＳＭにより観察した結果を図１８および１９に示す。図１８および１９に示されるように、一部の細胞において、黄色の蛍光を示す細胞が認められた（白の矢尻参照）。共培養中の細胞の観察から、ミトコンドリアが細胞間を移動することを見出した。また、ミトコンドリアの移動は、Ｈ９ｃ２からＣＰＣよりも、ＣＰＣからＨ９ｃ２への移動の方が多かった。また、その結果、赤い蛍光を発する細胞の数は維持された一方で、緑の蛍光を発する細胞の数が減少し、黄色の蛍光を発する細胞の数が増加した。このことは、ミトコンドリアは、幹細胞から成熟細胞に向けて移動しやすいことを示唆する。
　さらには、ＭＩＴＯ－ＣｅｌｌからのＨ９ｃ２細胞へのミトコンドリアの移動についても確認した。ＲＥＳ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒをニトロベンゾオキサジアゾールを用いて緑に染色した。染色されたＲＥＳ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを用いて、ＭＩＴＯ　ｔｒａｋｅｒ　ｏｒａｎｇｅを用いてオレンジに染色し、図では青で示した。さらに、Ｈ９ｃ２細胞内のミトコンドリアをＭＩＴＯ　Ｔｒａｃｋｅｒ　ｄｅｅｐ　ｒｅｄを用いて赤く染色した。得られたＭＩＴＯ－Ｃｅｌｌを培養皿から回収し、洗浄して培地に播種し、Ｈ９ｃ２細胞と共培養した。共培養開始後指定された時間後にＣＬＭＳを用いて細胞を観察した。これにより、ＭＩＴＯ－Ｃｅｌｌ中のＲＥＳ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒの細胞間の移動を観察した。結果は、図２０および２１に示される通りであった。図２０および２１に示されるように、１．５時間後にはＲＥＳ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒが細胞間を移動し始め、３時間後、２４時間後と細胞に広範に伝播する様子が観察された。
　Ｎｄｕｆｓ４ノックアウトマウスから単離したＣＰＣ（緑）と野生型マウスから単離したＣＰＣ（赤）を共培養して、細胞間のミトコンドリアの移動を観察した。すると、図２２に示されるように、Ｎｄｕｆｓ４ノックアウトマウスから単離したＣＰＣの細胞質において、赤い蛍光を発するミトコンドリアの存在が確認された（最右下パネル参照）。この結果は、野生型マウスのＣＰＣから、Ｎｄｕｆｓ４ノックアウトマウスのＣＰＣへとミトコンドリアが移動したことを示す結果である。
　Ｎｄｕｆｓ４ノックアウトマウスは、ミトコンドリアの呼吸鎖複合体Ｉの１８ｋＤａのアクセサリーサブユニットをコードする遺伝子のノックアウトであり、ミトコンドリア機能に異常を有する。Ｎｄｕｆｓ４ノックアウトマウスの表現型は、免疫細胞に特に強く認められ、野生型よりも萎縮した胸腺を有した。このような異常は、Ｎｄｕｆｓ４ノックアウトマウスに限って認められる異常ではなく、他のミトコンドリア機能に異常のあるモデル動物においても共通して認められる異常である（Pint M, et al., Cell Death & Differ., 2017, 24(2) 288-99）およびDai Y, et al., Mitochondrion., 2013, 13(4):282-291）。ミトコンドリア機能の異常は、加齢によっても生じることが知られているが（Zhang R, et al., BMC Genomics., 2017, 18(1):890）、加齢により胸腺の萎縮が生じることもまた知られている。特に胸腺のサイズは、１０代前後がピークであり、その後急速に萎縮して７０歳までにほぼ消失する（Lynch HE et al., Trends Immunol., 2009, 30(7):366-73）。胸腺の萎縮は、ミトコンドリアへの依存度が高い細胞である胸腺間質細胞（Doulias PT et al., Sci Signal., 2013, 6(256):rs1）における活性酸素の過剰産生によって生じ得る（Griffith AV et al., Cell Rep., 2015, 12(7):1071-9）。また、加齢による胸腺萎縮においても免疫異常が生じることが知られている（Taub DD and Longo DL, Immunol Rev., 2005, 205:72-93）。このように、ミトコンドリア機能の異常と胸腺の異常および免疫系の異常との間には関連がある。
　また、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の尾静脈投与において、胸腺の萎縮と胸腺リンパ球の異常が改善するとの報告がある（Jung WS et al., Cell Biol Int., 2014, 38(10):1106-17）。また、ミトコンドリアの呼吸鎖複合体Ｉ機能に障害を有するＭＳＣの培養液は、細胞外顆粒によるミトコンドリア移動を媒介するが、胸腺萎縮と胸腺リンパ球の異常の改善が認められないとの報告がある（Morrison T et al., Am J Respir Crit Care Med., 2017, 196(10):1275-1286）。
　Ｎｄｕｆｓ４ノックアウトマウスの胸腺に対して野生型のＣＰＣを投与したところ、野生型ＣＰＣに含まれる健常ミトコンドリアは、胸腺組織に広く分布した。培養実験によれば、ミトコンドリアは、細胞間を移動することができ、特に野生型細胞からＮｄｕｆｓ４ノックアウトマウスの細胞に対して移動する能力を有していた。また、ミトコンドリアは必ずしも細胞内に限局せず、細胞間を頻繁に移動した。このことから、本発明によれば、健常な呼吸鎖複合体を有するミトコンドリアを胸腺に移植することによって、胸腺中にミトコンドリアを広く分布させることができると考えられる。この実験結果は、健常な呼吸鎖複合体を有するミトコンドリアを、ミトコンドリア機能の低下を有する組織に移植することによって、組織中で、当該健常な呼吸鎖複合体を有するミトコンドリアが組織に広く分布することを示したものである。これにより、本発明によれば、健常な呼吸鎖複合体を有するミトコンドリアを、ミトコンドリア機能に異常のある個体の胸腺に局所注射することによって、胸腺に健常な呼吸鎖複合体を有するミトコンドリアを供給する手法が提供される。
　胸腺におけるミトコンドリア機能の回復は、胸腺機能の低下の回復、胸腺の萎縮の改善、および免疫異常の改善を誘導すると考えられる。従って、健常な呼吸鎖複合体を有するミトコンドリアが供給された胸腺では、その機能低下や機能異常がレスキューされると考えられ、本発明は、ミトコンドリア機能に異常のある個体（例えば、ミトコンドリア病の患者または６０歳以上の個体）の処置において有用であり得る。
　特に、活性化したミトコンドリアが供給された胸腺では、その機能低下や機能異常がより強くレスキューされると考えられる（ＷＯ２０１８／０９２８３９）。従って、本発明では、活性化したミトコンドリアを胸腺に供給する手法が提供され、ミトコンドリア機能に異常のある個体（例えば、ミトコンドリア病の患者または６０歳以上の個体）の処置において有用であり得る。

Claims (10)

  1. 　その必要のある対象において、一次リンパ組織または二次リンパ組織からなる群より選択される臓器または組織に対して局所投与される、ミトコンドリアを含む医薬製剤。
  2. 　ミトコンドリアが、単離されたミトコンドリアである、請求項１に記載の医薬製剤。
  3. 　ミトコンドリアが、ミトコンドリア活性化剤処理されたものである、請求項１または２のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  4. 　ミトコンドリアが、細胞内に存在する形態である、請求項１に記載の医薬製剤。
  5. 　請求項４に記載の医薬製剤であって、細胞が、非免疫細胞である、医薬製剤。
  6. 　請求項５に記載の医薬製剤であって、細胞が、心筋幹細胞および心筋前駆細胞からなる群から選択される細胞である、医薬製剤。
  7. 　請求項４に記載の医薬製剤であって、細胞が、ミトコンドリア活性化処理がなされた免疫細胞である、医薬製剤。
  8. 　請求項４または７に記載の医薬製剤であって、細胞が、ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒを有する免疫細胞である、医薬製剤。
  9. 　投与対象が、機能異常を有するミトコンドリアを有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の医薬製剤。
  10. 　その必要のある対象において、一次リンパ組織または二次リンパ組織からなる群より選択される臓器または組織に対して局所投与される、ミトコンドリアを含む医薬製剤の製造における、ミトコンドリアの使用。
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