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WO2019208820A1 - 細胞内物質移送システムおよびその利用 - Google Patents

細胞内物質移送システムおよびその利用 Download PDF

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WO2019208820A1
WO2019208820A1 PCT/JP2019/018094 JP2019018094W WO2019208820A1 WO 2019208820 A1 WO2019208820 A1 WO 2019208820A1 JP 2019018094 W JP2019018094 W JP 2019018094W WO 2019208820 A1 WO2019208820 A1 WO 2019208820A1
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WO
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general formula
site
ligand
represented
integer
Prior art date
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PCT/JP2019/018094
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English (en)
French (fr)
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西村　紳一郎
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Hokkaido University NUC
Original Assignee
Hokkaido University NUC
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Publication date
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/14—Peptides being immobilised on, or in, an inorganic carrier

Definitions

  • the present invention relates to an intracellular substance transfer system and use thereof.
  • This application claims the priority of Japanese Patent Application No. 2018-087436 filed on Apr. 27, 2018, the entire description of which is specifically incorporated herein by reference.
  • Non-patent Document 1 an example of a system that can efficiently deliver drugs to target intracellular spaces or specific organelles such as endolysosomes, mitochondria, nuclei, etc., regardless of whether they are small molecules or macromolecules. There are few.
  • Non-Patent Documents 2 to 5 Non-Patent Documents 2 to 5
  • Non-patent Document 6 an attempt has been made to load a drug on various types of particles and take it into cells.
  • Various drug delivery systems have also been devised, and in particular, using the EPR (enhanced permeability and retention) effect that enables targeting, for example, polymer nanoparticles, micellized nanoparticles, magnetic nanoparticles, etc.
  • EPR enhanced permeability and retention
  • Various systems used are known. (For example, see Patent Documents 1 to 4)
  • Non-patent Documents 7 and 8 research is also progressing on how the particles placed in the living body are treated in the living body. It is also known that when particles are placed in a living body, proteins in the living body bind nonspecifically to the particle surface and coat and aggregate the particle surface to which the drug is bound (Non-patent Document 7). It is also known that the binding of serum proteins to the surface increases the particle size and makes endocytosis difficult to occur (Non-patent Document 8).
  • Patent Document 1 Japanese Special Table 2009-534309 Publication
  • Patent Document 2 Japan Special Table 2011-528275 Publication
  • Patent Document 3 Japan Special Table 2015-520194 Publication
  • Patent Document 4 Japan Special Table 2015-520197 Publication
  • Non-Patent Document 1 Shin-Ichiro Nishimura et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 3386-3390
  • Non-Patent Document 2 Sara M. Weis et al., Cancer Cell 15, 359-361
  • Non-Patent Document 3 Andrew R Reynolds et al., Nat. Med. 15, 392-400
  • Non-Patent Document 4 Rebecca E. Bridgewater et al., J. Cell Sci. 125, 3695-3701 (2012)
  • Non-Patent Document 5 Alfredo Erazo-Oliveras et al., Pharmaceuticals 5, 1177-1209 (2012)
  • Non-Patent Document 6 Jinjun Shi et al., Nat. Rev.
  • Non-Patent Document 7 Marco P. Monopoli et al., Nat. Nanotechnol. 7, 779-786 (2012)
  • Non-Patent Document 8 Carl D. Walkey et al., J. Am. Chem. Soc. 134, 2139-2147 (2012) The entire descriptions of Patent Documents 1 to 4 and Non-Patent Documents 1 to 8 are specifically incorporated herein by reference.
  • Ligand is bound to a drug, and this is taken into a cell.
  • the receptor is an integrin, for example, as described in Non-Patent Documents 2 to 5, the incorporated drug is rapidly Since it is recycled to the cell membrane, released to the outside of the cell, and causes side effects, its effectiveness as a method for transferring a drug into cells is suspected.
  • the problem to be solved by the present invention is a means by which a drug incorporated into a cell can be released into a cell without being rapidly recycled outside the cell membrane in the transfer of the drug bound with the ligand into the cell. It is an object of the present invention to provide such means.
  • the present invention uses the above-mentioned means for efficiently transporting a drug into cells, particularly endolysosomes, and delivers a drug such as an active substance (for example, an inhibitor) against an enzyme in the cell membrane, such as a kinase. It aims at providing the means to do.
  • a drug such as an active substance (for example, an inhibitor) against an enzyme in the cell membrane, such as a kinase. It aims at providing the means to do.
  • an object of the present invention is to provide an anticancer agent using such means.
  • the present invention is as follows. [1] (1) nanoparticles, (2) an enzyme inhibitor-containing group represented by the following general formula (A) supported on the surface of the nanoparticles, (3) the following general formula (L1) supported on the surface of the nanoparticles And (4) a complex containing a phospholipid mimetic group represented by the following general formula (B) supported on the surface of the nanoparticle.
  • A an enzyme inhibitor-containing group represented by the following general formula (A) supported on the surface of the nanoparticles
  • L1 the following general formula (L1) supported on the surface of the nanoparticles
  • B a complex containing a phospholipid mimetic group represented by the following general formula (B) supported on the surface of the nanoparticle.
  • n1 is an integer of 2 to 30
  • n2 is an integer of 2 to 30
  • the —S-terminal is a nanoparticle-supporting site
  • R 10 is an enzyme inhibitor-containing site.
  • n1 is an integer of 2 to 30, n2 is an integer of 2 to 30, the -S-terminal is a nanoparticle-supporting site, and R 20 is a cell surface receptor. Including a ligand site with binding properties.
  • n3 is an integer in the range of 2 to 30, and the —S-terminal is the nanoparticle-supporting site.
  • R 10 N—O— in the general formula (A) is represented by the following general formula (A1), (In General Formula (A1), EIH is an enzyme inhibitor site, and the enzyme inhibitor site is a suicide substrate site reactive with the active center of a lysosomal enzyme, or a kinase inhibitor site reactive with a kinase.
  • R 20 N—O— in the general formula (L1) is a complex according to [1] represented by the following general formula (L2).
  • L2 In general formula (L2), LD is a ligand site, and LK is a linker site.
  • R 10 N—O— in the general formula (A) is represented by the following general formula (A2) or (A3),
  • A2 In the general formula (A2), m2 is an integer of 1 to 10
  • EIH is an enzyme inhibitor site, and the enzyme inhibitor site is a suicide substrate site reactive with the active center of a lysosomal enzyme, or a kinase.
  • the molar ratio of the lysosomal enzyme inhibitor or kinase inhibitor represented by the general formula (A) to the phospholipid mimetic represented by the general formula (B) is in the range of 1: 100 to 10: 1, and the general formula (A)
  • the complex according to any one of [1] to [6], wherein the molar ratio of the enzyme inhibitor-containing group represented by the formula (L1) to the ligand-containing group represented by the general formula (L1) is in the range of 10: 1 to 1:10. body.
  • the ligand precursor PL shown is mixed and linked to the crosslinking precursor X on the surface-modified nanoparticles, and the enzyme inhibitor-containing group shown by the following general formula (A) and the following general formula (L1) are shown.
  • the method comprising the step (2) of forming a ligand-containing group to obtain the complex according to any one of [1] to [9].
  • n1 is an integer of 2 to 30, and n2 is an integer of 2 to 30.
  • n3 is an integer in the range of 2 to 30.
  • R 10 is an enzyme inhibitor-containing site.
  • R 20 contains a ligand moiety having binding properties to a cell surface receptor.
  • n1 is an integer of 2 to 30, n2 is an integer of 2 to 30, the —S-terminal is a nanoparticle-supporting site, and R 10 is an enzyme inhibitor-containing site.
  • the enzyme inhibitor precursor Y represented by the general formula (E) is represented by the following general formula (E1), (In General Formula (E1), EIH is an enzyme inhibitor site, and the enzyme inhibitor site is a suicide substrate site reactive with the active center of a lysosomal enzyme, or a kinase inhibitor site reactive with a kinase.
  • LK is a linker site.
  • L6 is a ligand site and LK is a linker site.
  • [14] The production method according to [12], wherein the ligand precursor PL represented by the general formula (L5) is a compound represented by the following general formula (L7) or (L8).
  • the enzyme inhibitor precursor Y represented by the general formula (E) is represented by the following general formula (E2) or (E3).
  • EIH is an enzyme inhibitor site, and the enzyme inhibitor site is a suicide substrate site reactive with the active center of a lysosomal enzyme, or a kinase inhibitor reactive with a kinase.
  • a ligand precursor represented by the general formula (L6) is a ligand site for integrin, somatostatin cancer cell receptor or sugar chain receptor, and LK is a linker site.
  • m1 is an integer of 1 to 10
  • m2 is an integer of 1 to 10
  • LD is a ligand site for an integrin, somatostatin cancer cell receptor or sugar chain receptor.
  • m3 is an integer of 1 to 10
  • LD is a ligand site.
  • the present invention it is possible to provide means capable of inhibiting the drug taken into the cell from being rapidly recycled to the cell membrane during the transfer of the drug bound with the ligand into the cell.
  • an active substance for example, an inhibitor
  • the cells are cancer cells, the cancer cells can be attacked.
  • FIG. 1 shows a MALDI-TOFMS of fluorescent nanoparticles (quantum dots) simultaneously carrying Compound 7 and a sorafenib derivative.
  • FIG. 1 shows a MALDI-TOFMS of fluorescent nanoparticles (quantum dots) simultaneously carrying Compound 7 and a sorafenib derivative.
  • Figure 2 shows the behavior of fluorescent nanoparticles (10 nM) loaded with compound 7 in
  • FIG. 4 shows the antitumor effect (liver cancer cell killing effect) of fluorescent nanoparticles (1 to 100 nM) carrying compound 7 and sorafenib derivative.
  • FIG. 5 shows HPLC (A) and MALDI-TOF MS (B) of the linear type Somatostatin-14 derivative (11).
  • FIG. 6 shows HPLC (A) and MALDI-TOF MS (B) of Somatostatin-14 derivative (12).
  • FIG. 7 shows MALDI-TOF MS of phospholipid-coated fluorescent nanoparticles carrying compound 12, compounds 13 and 12 and 13.
  • FIG. 5 shows HPLC (A) and MALDI-TOF MS (B) of the linear type Somatostatin-14 derivative (11).
  • FIG. 6 shows HPLC (A) and MALDI-TOF MS (B) of Somatostatin
  • FIG. 10 shows the liver cancer cell killing action of fluorescent nanoparticles (100-1 nM QD anchored 13, 12/13) carrying compound 13 and compounds 12 and 13.
  • FIG. 11 shows the liver cancer cell killing effect of Compound 12 and fluorescent nanoparticles (100-1 nM QD anchored 12) carrying Compound 12.
  • FIG. 12 shows MALDI-TOF MS of fluorescent nanoparticles (complex (40) of the present invention).
  • FIG. 13 shows a fluorescence micrograph obtained in Example 6.
  • FIG. 14 shows the measurement results of cell viability obtained in Example 7.
  • FIG. 15 shows the photograph obtained in Reference Example A and the FCS analysis result.
  • the present invention relates to a complex comprising the following (1) to (4).
  • an enzyme inhibitor-containing group represented by the general formula (A) supported on the surface of the nanoparticle (3) a ligand-containing group represented by the general formula (L1) supported on the surface of the nanoparticle, and (4) a phospholipid pseudo-material group represented by the general formula (B) supported on the surface of the nanoparticle.
  • the nanoparticle nanoparticles can be metal nanoparticles or semiconductor nanoparticles.
  • the material of the metal nanoparticle is not particularly limited, but can be gold, platinum, silver, or iron magnetic material.
  • the metal nanoparticle can be gold nanoparticle, platinum nanoparticle, silver nanoparticle, or iron magnetic nanoparticle. It can be a particle.
  • the metal nanoparticles are preferably gold nanoparticles, platinum nanoparticles, and silver nanoparticles from the viewpoint of safety with respect to the living body.
  • the semiconductor nanoparticles can also be quantum dots.
  • a quantum dot is a small lump of about 10 to several nm in which several hundred to several thousand semiconductor atoms are gathered, and is a fluorescent nanoparticle.
  • the wavelength (color) of fluorescence emitted varies depending on the particle diameter.
  • Nanoparticles can have a particle size in the range of 0.1 to 100 nm, preferably in the range of 1 to 50 nm, more preferably in the range of 5 to 20 nm, and still more preferably in the range of 5 to 15 nm.
  • the enzyme inhibitor-containing group represented by the general formula (A), of nanoparticles It is supported on the surface.
  • n1 is an integer of 2 to 30
  • n2 is an integer of 2 to 30
  • the —S-terminal is a nanoparticle-supporting site
  • R 10 is an enzyme inhibitor-containing site.
  • the enzyme inhibitor-containing site can be, but is not limited to, for example, a suicide substrate site that is reactive with the active center of a lysosomal enzyme, or a kinase inhibitory site that is reactive with a kinase.
  • the enzyme inhibitor-containing group represented by the general formula (A) can keep the distance between the enzyme inhibitor-containing group and the nanoparticles in a desired range by selecting n1 and n2 in the formula, As a result, the enzyme inhibitory activity in the cell, for example, lysosomal enzyme inactivating action or kinase inhibiting action can be regulated.
  • n1 is an integer ranging from 2 to 30, preferably 5 to 16, more preferably 4 to 15.
  • n2 is an integer ranging from 2 to 30, preferably 5 to 20, and more preferably 7 to 15.
  • R 10 ⁇ NO— in the general formula (A) includes an imine bond that is a carbon-nitrogen double bond represented by> C ⁇ NO—. Since the enzyme inhibitor-containing group is supported on the nanoparticles via a linker containing an imine bond, the enzyme inhibitor is easily released due to a change in pH in the cell.
  • EIH is an enzyme inhibitor site.
  • the enzyme inhibitor site is a suicide substrate site that is reactive with the active center of a lysosomal enzyme or a kinase inhibitory site that is reactive with a kinase. Release reaction of the enzyme inhibitor EIH due to intracellular pH change in imine binding is shown below.
  • LK is a linker moiety, and the linker moiety is, for example, Can be.
  • m1, m2, m3 and m4 are each independently an integer of 1 to 10.
  • the enzyme inhibitor-containing group represented by the general formula (A1) is selected by selecting m1, m2, m3, and m4 in the linker site (LK1 to LK4) in addition to n1 and n2 in the general formula (A).
  • the distance between the enzyme inhibitor-containing group and the nanoparticles can be maintained in a desired range.
  • the enzyme inhibitory activity in the cell for example, lysosomal enzyme inactivating action or kinase inhibiting action can be regulated.
  • m1, m2, m3 and m4 are independently integers preferably in the range of 1 to 8, more preferably 1 to 6.
  • general formula (A2) m2 is synonymous with m2 in general formula (LK2), and EIH is synonymous with EIH in general formula (A1).
  • m4 is synonymous with m4 in general formula (LK4)
  • EIH is synonymous with EIH in general formula (A1).
  • the suicide substrate site that is reactive with the active center of the lysosomal enzyme which is an example of an enzyme inhibitor-containing site, contains a group (reactive group) that is reactive with the active center of the lysosomal enzyme.
  • a suicide substrate site can include, for example, a sugar residue that can be a substrate for a lysosomal enzyme, and a reactive group for a lysosomal enzyme for enzyme inactivation.
  • the sugar residue can be appropriately selected according to the substrate specificity of the lysosomal enzyme to be inactivated, for example, N-acetyl-D-glucosamine residue, N-acetyl-D-galactosamine residue, galactose residue And at least one sugar residue selected from the group consisting of a group, a glucose residue, a fucose residue, and a mannose residue sialic acid residue.
  • the sugar residue is preferably an N-acetyl-D-glucosamine residue and / or a galactose residue in view of the substrate specificity of the lysosomal enzyme.
  • a plurality of sugar residues may be used in one complex particle, and in that case, a single or a plurality of types of sugar residues may exist in one complex particle. Further, one or more types of sugar residues may exist in one complex particle, and the same or different single or multiple types of sugar residues may exist in different complex particles that coexist. .
  • the reactive group may be any reactive group having reactivity with the reaction center of the enzyme.
  • the reactive group having reactivity with the reaction center of the enzyme include a difluoromethylaryl group and a trifluoromethylaryl group.
  • at least one reactive group selected from the group consisting of: The reactivity with the reaction center of the enzyme may be reversible or irreversible.
  • the enzyme inhibitor site EIH can be, for example, a suicide substrate that is a difluoromethylaryl group represented by the following general formula (E).
  • R is a sugar residue
  • F is a fluorine atom.
  • the enzyme inhibitor-containing group represented by the general formula (A2) in which the enzyme inhibitor site EIH is a suicide substrate site having a trifluoromethylaryl group represented by the general formula (E) is, for example, any of the following formulas Can be a group.
  • R is an N-acetyl-D-glucosamine residue
  • R is a glucose residue
  • R is N-acetyl-D-galactosamine residue. It is a group.
  • a kinase inhibitor site that is reactive with a kinase preferably comprises a group that is reactive with a kinase in the cell membrane.
  • a kinase inhibition site can be, for example, a site represented by the following formula.
  • R 1 is an electron-withdrawing group.
  • the electron withdrawing group include a halogen atom (fluorine, chlorine, bromine or iodine), a nitro group, a cyano group, a tosyl group, an acyl group, and the like.
  • This kinase inhibition site includes the following sorafenib.
  • Kinases are a family of enzymes that catalyze phosphorylation of specific residues in proteins. In general, kinases are divided into three groups. Those that preferentially phosphorylate serine and / or threonine residues, those that preferentially phosphorylate tyrosine residues, and those that phosphorylate both tyrosine and serine / threonine residues. Kinases are considered to be important elements in signal transduction pathways to transmit extracellular signals, including cytokine activation at the receptor, to the nucleus and trigger various biological events.
  • inhibitors for tyrosine kinase activity include gefitinib, erlotinib, cetuximab, panitumumab and the like.
  • Sorafenib is known as a drug that inhibits tyrosine kinase, Raf kinase (a kind of serine / threonine kinase deeply involved in cell proliferation signal).
  • a ligand-containing group represented by formula (L1) is supported on the surface of the nanoparticles ing.
  • n1 is an integer of 2 to 30
  • n2 is an integer of 2 to 30
  • the —S-terminus is a nanoparticle-supporting site
  • R 20 binds to a cell surface receptor. It contains a ligand site that has sex.
  • the ligand-containing group represented by the general formula (L1) can keep the distance between the ligand-containing group and the nanoparticles in a desired range by selecting n1 and n2 in the formula. As a result, the interaction between the cell surface receptor and the ligand of the ligand-containing group can be regulated.
  • n1 is an integer ranging from 2 to 30, preferably 5 to 16, more preferably 4 to 15.
  • n2 is an integer ranging from 2 to 30, preferably 5 to 20, and more preferably 7 to 15.
  • R 20 ⁇ N—O— in the general formula (L1) includes an imine bond that is a carbon-nitrogen double bond represented by> C ⁇ N—. Since the ligand-containing group is supported on the nanoparticle via a linker containing an imine bond, as described later, the ligand is easily released by pH change in the cell.
  • LD is a ligand site.
  • LK is a linker moiety and is synonymous with LK in formula (A1), selected from formulas (LK1) to (LK4), and m1, m2, m3 and m4 in formulas (LK1) to (LK4) It is synonymous.
  • the ligand-containing group represented by the general formula (L2) is selected by selecting m1, m2, m3 and m4 in the linker sites (LK1) to (LK4) in addition to n1 and n2 in the general formula (L1).
  • the distance between the ligand-containing group and the nanoparticles can be kept in a desired range. As a result, the interaction between the cell surface receptor and the ligand of the ligand-containing group can be regulated.
  • m1, m2, m3 and m4 are independently integers preferably in the range of 1 to 8, more preferably 1 to 6.
  • R 20 N—O— in the general formula (L1), more specifically, can be represented by the following general formula (L3) or (L4).
  • L3 m1 is an integer of 1 to 10
  • m2 is an integer of 1 to 10
  • LD is a ligand moiety.
  • the ligand-containing group represented by the general formula (L3) is a ligand-containing group containing a linker site (LK1). See
  • L4 is an integer of 1 to 10
  • LD is a ligand moiety.
  • the ligand-containing group represented by the general formula (L4) is a ligand-containing group containing a linker site (LK3).
  • the composite of the present invention includes a ligand-containing group supported on the surface of the nanoparticle.
  • the ligand is supported on the nanoparticle via a linker containing an imine bond represented by> C ⁇ N—O—.
  • the ligand may be easily discharged out of the cell by the recycling action of the cell membrane, and the drug carried on the nanoparticle is discharged out of the cell together with the ligand by the recycling action of the cell membrane. If so, it may be discharged out of the cell before it affects the cell activity due to its physiological activity.
  • the reaction of cleaving from the nanoparticles of ligand LD due to intracellular pH change in imine binding is shown below.
  • the ligand site may be any site that has a binding property to a cell surface receptor, and the cell surface receptor can be, for example, an integrin, a somatostatin cancer cell receptor, or a sugar chain receptor.
  • Integrin is structurally known to be a heterodimer in which an ⁇ chain and a ⁇ chain are associated at a ratio of 1: 1.
  • the ⁇ chain is a glycoprotein having a molecular weight of about 120 to 180 kDa.
  • Variations in the ⁇ chain and ⁇ chain vary depending on the type of organism, and it is known that there are at least 18 types of ⁇ chains and at least 8 types of ⁇ chains in humans. In the present invention, regardless of the type of integrin (a combination of ⁇ chain and ⁇ chain), for example, it can be human integrin.
  • Human integrins are ⁇ 1 ⁇ 1 , ⁇ 2 ⁇ 1 , ⁇ 3 ⁇ 1 , ⁇ 4 ⁇ 1 , ⁇ 5 ⁇ 1 , ⁇ 6 ⁇ 1 , ⁇ 7 ⁇ 1 , ⁇ 8 ⁇ 1 , ⁇ 9 ⁇ 1 , ⁇ 10 ⁇ 1, ⁇ 11 ⁇ 1, ⁇ v ⁇ 1, ⁇ D ⁇ 2, ⁇ L ⁇ 2, ⁇ M ⁇ 2, ⁇ X ⁇ 2, ⁇ IIb ⁇ 3, ⁇ v ⁇ 3, ⁇ 6 ⁇ 4, It can be at least one integrin selected from the group consisting of ⁇ v ⁇ 5 , ⁇ v ⁇ 6 , ⁇ 4 ⁇ 7 , ⁇ E ⁇ 7 , ⁇ v ⁇ 8 .
  • the ligand for integrin can be, for example, a cell adhesion protein and / or an extracellular matrix molecule. More specifically, the ligand for integrin can be fibronectin. Fibronectin can be a substance comprising at least one of the following amino acid sequences.
  • RGD (Arg-Gly-Asp) sequence, LDV (Leu-Asp-Val) sequence, NGR (Asn-Gly-Asp) / isoDGR (Asp-Gly-Arg) sequence, PRAQI (Pro-Arg-Ala-Gln-Ile) / KLDAPT (Lys-Leu-Asp-Ala-Pro-Thr) sequence (SEQ ID NOs: 1 and 2), AGEGIP (Ala-Gly-Glu-Gly-Ile-Pro) sequence (SEQ ID NO: 3), KNEED (Lys-Asn-Glu-Glu-Asp) sequence (SEQ ID NO: 4), PHSRN (Pro-His-Ser-Arg-Asn) sequence (SEQ ID NO: 5), EDGIHEL (Glu-Asp-Gly-Ile-His-Glu-Leu)) sequence (SEQ ID NO: 6), PRARI (Pro-Arg-Ala-Arg-Ile) /
  • the ligand for integrin can also be laminin or a fragment thereof, collagen or a fragment thereof, or leukocyte or a fragment thereof.
  • the somatostatin receptor is known as a G protein-coupled somatostatin receptor, and is also known to belong to any subtype of SST 1 to SST 5 . In the present invention, it does not depend on the subtype of the somatostatin receptor.
  • the ligand for the somatostatin receptor can be, for example, 14 amino acid type somatostatin (AGCKNFFFWKTFTSC) (SEQ ID NO: 10), 28 amino acid type somatostatin (SANSNPAMAPLERKAGCKNFFFKTFTSC) (SEQ ID NO: 11), octreotide, lanreotide, pasireotide or an analog thereof. .
  • the sugar chain receptor can be a protein having the ability to bind to a sugar chain, and includes, for example, a lectin. It is known that lectins function in the cell membrane and its surroundings, and are active in cancer and inflammatory sites. Examples of lectins include, for example, selectin, Siglec, galectin, mannose 6-phosphate receptor, DC-SIGN, TLR, pattern recognition receptor, asialoglycoprotein receptor, and the like. However, proteins having the ability to bind to sugar chains are not intended to be limited to these, and membrane receptors such as CD44 can also be cited as those that function as sugar chain receptors.
  • the complex of the present invention has a phospholipid mimetic group on the surface, it is a nanosome (non-adsorbable nanoparticle) that has been able to prevent nonspecific protein adsorption.
  • the interaction with the sugar chain receptor can be used (see Reference Example B).
  • the ligand site possessed by the complex of the present invention that functions as a ligand for a sugar chain receptor is, for example, a high mannose type N-glycan containing a mannose end, a hybrid type N-glycan, sialic acid, galactose, fucose, mannose, N- Mixed N-glycans including acetyl-D-glucosamine, N-acetyl-D-galactosamine, glucuronic acid, phosphorylated sugar, sulfated sugar, etc., these monosaccharides (e.g.
  • O-glycans such as sialyl T antigen, sialyl Tn antigen, T antigen, Tn antigen, lactosaminoglycan chain, proteoglycan sugar chain, hyaluronic acid And so on.
  • the ligand sites possessed by the complex of the present invention that functions as a ligand for a sugar chain receptor include, for example, monosaccharide residues, oligosaccharide residues, polysaccharide residues, N-glycans, O-glycans, and N-glycans and O A ligand moiety comprising at least one sugar residue selected from the group consisting of glycans other than glycans;
  • R 20 N—O— in the general formula (L1) is represented by the following general formula (L2).
  • L2 In general formula (L2), LD is a ligand site, and LK is a linker site.
  • the ligand site in L2 is as described above, and the linker site LK includes sugar chains, amino acid sequences (peptides, etc.), hydrocarbon groups (for example, alkylene groups, LK1, LK4, in addition to LK1, LK2, LK3 and LK4 described above).
  • An arylene group a polyethylene glycol (PEG) group, and the like.
  • Examples of the linker moiety LK being an arylene group include the residues described by the following general formula (LR1).
  • Ra represents a sugar residue which is a ligand site LD, and a phenylene group having R is a linker site LK.
  • R can be, for example, a hydrogen atom, a sugar residue or a residue other than a sugar residue, such as an unsubstituted or substituted alkyl (eg, having 1 to 6 carbon atoms).
  • the group containing a ligand site for the sugar chain receptor represented by the general formula (L2) can be, for example, a site containing any functional group represented by the following formula.
  • R in each formula has the same meaning as R in the general formula (LR1).
  • part shown by LR1, LR10, LR11, LR12 has can be a difluoromethyl group and a trifluoromethyl group, for example.
  • R has a difluoromethyl group or a trifluoromethyl group, these sites may have an inhibitory effect on lysosomal enzymes in addition to the function as a ligand site as a sugar chain.
  • the function of the ligand site of the sugar chain in this case is clear from the experimental results shown in Reference Example A, for example.
  • a complex of phospholipid pseudo substance groups present invention represented by the surface supported on the formula of the nanoparticles (B) are phospholipids pseudo represented by the general formula, which is supported on the surface of the nanoparticles (B) Contains substances.
  • n3 is an integer in the range of 2 to 30, and the -S-terminal is the nanoparticle-supported site.
  • n3 is an integer in the range of 2 to 30, preferably 5 to 20, and more preferably 7 to 15.
  • the amount of the enzyme inhibitor-containing group, ligand-containing group, and phospholipid mimetic supported on one nanoparticle is preferably 80% or more of the metal element (reaction point) on the surface of the nanoparticle. It can be determined appropriately in consideration of the function of inhibiting the aggregation of the complex of the present invention and the function of taking it into cells by edesis.
  • the supported amount is more preferably an amount that can cover all reaction points on the surface of the nanoparticles.
  • the ratio of the ligand-containing group, the enzyme inhibitor-containing group, and the phospholipid mimetic is determined by the endocytosis into the cell due to the action of the ligand-containing group, and the ratio of the incorporated enzyme inhibitor. It can be appropriately selected in consideration of the balance of action and the like.
  • the molar ratio of the enzyme inhibitor-containing group represented by the general formula (A) and the phospholipid mimetic represented by the general formula (B) can be, for example, in the range of 1: 100 to 10: 1.
  • the molar ratio of the enzyme inhibitor-containing group represented by (A) and the ligand-containing group represented by the general formula (L1) can be, for example, in the range of 10: 1 to 1:10.
  • the complex of the present invention includes: A material represented by the following general formula (A ′) may be further supported on the surface of the nanoparticle.
  • the substance represented by the general formula (A ′) is derived from the precursor X for crosslinking of the enzyme inhibitor represented by the general formula (A) described later.
  • n1 is an integer of 2 to 30
  • n2 is an integer of 2 to 30
  • the —S-terminal is a nanoparticle-supporting site.
  • the general formula (A ′) can further carry a physiologically active substance such as a sugar chain or an antibody, if desired.
  • the molar ratio of the enzyme inhibitor-containing group represented by the general formula (A) and the substance represented by the general formula (A ′) can be, for example, in the range of 1: 100 to 100: 0, and 10: 100 to It can be in the range of 100: 10.
  • the composite of the present invention can be schematically shown by, for example, the following general formula (10).
  • Residues carried on the nanoparticle NP are represented by the enzyme inhibitor-containing group represented by the general formula (A), the phospholipid mimetic group represented by the general formula (B), and the general formula (L1) from the top.
  • the enzyme inhibitor-containing group represented by the general formula (A), the phospholipid mimetic group represented by the general formula (B), and the ligand-containing group represented by the general formula (L1) are each 1 One or more are supported on the nano-particle NP.
  • the complex that can be schematically shown by the general formula (10) can be schematically described by the following general formula (20) in which R 10 and R 20 are embodied.
  • This complex is shown in Example 1.
  • R 10 is a sorafenib-containing group
  • R 20 is an integrin ligand-containing group
  • NP is a quantum dot QD.
  • at least one or more of sorafenib-containing group, integrin ligand-containing group, and phospholipid mimetic group are supported on the quantum dot QD.
  • the complex that can be schematically shown by the general formula (10) can also be schematically described by the following general formula (30) that embodies R 10 and R 20 .
  • This complex is shown in Example 3.
  • R 10 is a sorafenib-containing group and R 20 is a somatostatin receptor ligand-containing group.
  • NP is a quantum dot QD.
  • at least one or more of sorafenib-containing group, somatostatin receptor ligand-containing group, and phospholipid mimetic group are carried on the quantum dot QD. .
  • the complex that can be schematically shown by the general formula (10) can also be schematically described by the following general formula (40) in which R 10 and R 20 are embodied. This complex is shown in Example 5.
  • R 10 is a sorafenib-containing group
  • R 20 is a sugar chain ligand-containing group
  • NP is a quantum dot QD.
  • the actual complex schematically represented by the general formula (40) has a sorafenib-containing group and a sugar chain ligand-containing group, and a phospholipid pseudo-substance group (indicated by PC), and each group has at least one group. As described above, it is carried on the quantum dot QD.
  • the present invention includes a method for producing the complex of the present invention.
  • a cross-linking precursor X represented by the following general formula (C) and a phospholipid pseudo-substance precursor represented by the following general formula (D) are mixed with colloidal nanoparticles to cross-link the surface of the nanoparticles.
  • the ligand precursor PL represented by (L5) is mixed and linked with the crosslinking precursor X on the surface-modified nanoparticles, and the enzyme inhibitor-containing group represented by the following general formula (A) and the following general formula (L1)
  • the method includes the step (2) of forming the ligand-containing group represented by (2) to obtain the complex of the present invention.
  • n1 is an integer of 2 to 30, and n2 is an integer of 2 to 30.
  • n3 is an integer in the range of 2 to 30.
  • R 10 is an enzyme inhibitor-containing site.
  • R 20 contains a ligand moiety having binding properties to a cell surface receptor.
  • n1 is an integer of 2 to 30
  • n2 is an integer of 2 to 30
  • the —S-terminal is a nanoparticle-supporting site
  • R 10 is an enzyme inhibitor-containing site.
  • n1 is an integer of 2 to 30
  • n2 is an integer of 2 to 30
  • the -S-terminal is a nanoparticle-supporting site
  • R 20 is a cell surface receptor. Including a ligand site with binding properties.
  • a cross-linking precursor X represented by the general formula (C) and a phospholipid pseudo-material precursor represented by the general formula (D) and a colloidal nanoparticle are mixed, and the cross-linking precursor X and the phospholipid are formed on the surface of the nanoparticle. This is a step of obtaining surface-modified nanoparticles by supporting a pseudo substance.
  • the general formula (C) has an enzyme inhibitor-containing group represented by the general formula (A) except that the enzyme inhibitor-containing site R 10 or the ligand-containing site R 20 is not present and the terminal is an SH group. This is the same as the ligand-containing group represented by the formula (L1).
  • n1 is an integer in the range of 2 to 30, preferably 5 to 20, and more preferably 7 to 15.
  • n2 is an integer ranging from 2 to 30, preferably 5 to 20, and more preferably 7 to 15.
  • General formula (D) is the same as the phospholipid pseudo substance group represented by general formula (B) except that the terminal is an SH group.
  • n3 is an integer in the range of 2 to 30, preferably 5 to 20, and more preferably 7 to 15.
  • cross-linking precursor X represented by the general formula (C) and the phospholipid mimetic precursor represented by the general formula (D) are both commercially available, and the reference (T. Ohyanagi, et. al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 12507-12517).
  • the mixing ratio of the crosslinking precursor X represented by the general formula (C), the phospholipid mimetic precursor represented by the general formula (D), and the nanoparticles is determined by the crosslinking precursor X represented by the general formula (C) and the general formula. It can be appropriately determined in consideration of the desired loading amount of the phospholipid pseudo-substance precursor nanoparticle shown in (D).
  • Example 1 The step (1) of Example 1 is shown below for reference.
  • the cross-linking precursor X represented by the general formula (C) shown in the following scheme n1 is 6, n2 is 9, and n3 of the phospholipid mimetic precursor represented by the general formula (D) is 9. .
  • the molar ratio AO / PC of aminooxy linker (AO) to phosphorylcholine linker (PC) is 1/8.
  • AO / PC is 1/16 in the third embodiment.
  • the molar ratio AO / PC is the enzyme inhibitor-containing group represented by the general formula (A) and the ligand-containing group represented by the general formula (L1) and the phospholipid represented by the general formula (B) in the complex of the present invention.
  • the ratio of the pseudo-substance group can be, for example, a molar ratio in the range of 1: 100 to 10: 1, and preferably in the range of 1:10 to 1: 1. It can be a ratio according to.
  • Nanoparticles are the same as described in the composite.
  • colloidal quantum dots QDs (QD: Quantum Dot)
  • QDs QD: Quantum Dot
  • Colloidal quantum dots have a protective group on the surface of luminescent semiconductor nanoparticles having a diameter in the range of, for example, 1 to 20 nm.
  • the colloidal quantum dots shown in the above scheme have a trialkyl phosphate group on the surface.
  • colloidal metal nanoparticles can be used as a raw material.
  • Colloidal quantum dots and colloidal metal nanoparticles are commercially available.
  • the crosslinking precursor X represented by the general formula (C) and the phospholipid pseudo-substance precursor represented by the general formula (D) have a thiol (SH) group as a functional group bonded to the nanoparticle surface of the colloidal nanoparticle.
  • SH thiol
  • the colloidal nanoparticles, the inhibitor crosslinking precursor X, and the phospholipid mimetic precursor are dispersed in, for example, a solvent, and two types of phospholipid mimics are supported on the surface of the nanoparticle.
  • a mixed solvent of hexane and water is used as a solvent, and the reaction is performed at room temperature (for example, 15 to 25 ° C.).
  • the solvent to be used can be appropriately determined according to the type of colloidal nanoparticles, the type of cross-linking precursor X, and the type of phospholipid mimetic precursor.
  • the concentration and reaction time of the colloidal nanoparticles, the cross-linking precursor X, and the phospholipid pseudo-substance precursor in the solvent can be appropriately determined according to the desired surface-modified nanoparticles.
  • a general method for supporting the colloidal nanoparticles is known, and can be carried out, for example, with reference to the methods described in the following references A and B. References A. T. Ohyanagi, et. Al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 12507-12517 (non-patent document 2) B. R. S. Tan, et. Al., ACS Chem. Biol. 2015, 10, 2073-2086 (Non-patent Document 3)
  • Process (2) The surface-modified nanoparticles obtained by mixing the surface-modified nanoparticles obtained in the step (1) with the enzyme inhibitor precursor Y represented by the general formula (E) and the ligand precursor PL represented by the general formula (L5) It is a step of obtaining the complex of the present invention by linking with the above crosslinking precursor X to form an enzyme inhibitor-containing group represented by the general formula (A) and a ligand-containing group represented by the general formula (L1). .
  • the enzyme inhibitor site EIH and the linker site LK in the production method of the present invention are synonymous with the enzyme inhibitor site EIH and the linker site LK in the complex of the present invention, respectively, and the description of the complex can be referred to.
  • the enzyme inhibitor precursor Y represented by the general formula (E) can be, for example, a compound represented by the following general formula (E1).
  • the compound represented by the general formula (E1) is a compound having a so-called ketone linker in which a ketone group is bonded to the linker site LK.
  • the general formula (A ′) bonded in advance to the ketone group of the ketone linker and the surface of the nanoparticle described above. ) Can react with the terminal amino group of the substance represented by (1) to bind the enzyme inhibitor-containing group represented by the general formula (A) to the nanoparticle surface.
  • EIH is an enzyme inhibitor site.
  • the enzyme inhibitor site can be a suicide substrate site that is reactive with the active center of a lysosomal enzyme, or a kinase inhibitory site that is reactive with a kinase.
  • LK is a linker moiety, and the linker moiety can be represented by the following general formulas (LK1) to (LK4).
  • n1, m2, m3 and m4 are each independently an integer of 1 to 10.
  • the ligand precursor PL represented by the general formula (L5) can be, for example, a compound represented by the following general formula (L6).
  • the compound represented by the general formula (L6) is also a compound having a so-called ketone linker in which a ketone group is bonded to the linker site LK, and the general formula (A ′
  • the ligand-containing group represented by the general formula (LA) can be bonded to the nanoparticle surface by the reaction with the terminal amino group of the substance represented by
  • LD is a ligand site, and has the same meaning as LD in general formula (L2).
  • LK is a linker moiety and is synonymous with LK in the general formula (E).
  • the ligand precursor represented by the general formula (L6) is a novel compound, and the present invention includes the ligand precursor represented by the general formula (L6).
  • the ligand precursor PL represented by the general formulas (L5) and (L6) can be, for example, a compound represented by the following general formula (L7) or (L8).
  • L7 m1 is an integer of 1 to 10
  • m2 is an integer of 1 to 10
  • LD is a ligand site.
  • m3 is an integer of 1 to 10
  • LD is a ligand moiety.
  • Examples of the ligand precursor PL represented by the general formula (L8) include compounds represented by the following formulas (L8-1), (L8-2), and (L8-3). However, it is not the intention limited to these.
  • the enzyme inhibitor precursor Y represented by the general formula (E) can be, for example, a compound represented by the following general formula (E2) or (E3).
  • EIH is an enzyme inhibitor site
  • the enzyme inhibitor site is a suicide substrate site reactive with the active center of a lysosomal enzyme, or a kinase inhibitor site reactive with a kinase. It is.
  • m2 is an integer of 1 to 10
  • m4 is an integer of 1 to 10.
  • the enzyme inhibitor precursor Y represented by the general formulas (E), (E1), (E2) and (E3) can be synthesized according to the method described in WO2017 / 131242.
  • the ligand precursor PL represented by the general formulas (L5), (L6), (L7) and (L8) is synthesized by a solid phase synthesis method of a known peptide using a ketone linker-modified lysine derivative and a resin for peptide synthesis. can do.
  • the ketone linker-modified lysine derivative is prepared by a known method (A. Pratesi, et al., Org. Biomol. Chem., 2015, 13, 3988-4001), as specifically described in Example 1 (1).
  • the ⁇ -amino group synthesized with reference to Fmoc protection and the side chain primary amine protected by Boc can be synthesized.
  • Commercially available resins can be used for the peptide synthesis resin, and examples thereof include ChemMatrix (Biotage).
  • Example 1 The step (2) of Example 1 is shown below for reference.
  • the sorafenib derivative 13 is used as the enzyme inhibitor precursor Y, and the ketone linker-modified lysine derivative 7 synthesized in Example 1 is used as the ligand precursor PL.
  • Sorafenib derivative 13 can be synthesized according to the method described in Example 5 of WO2017 / 131242 (compound 32 in the synthesis scheme of paragraph 0134).
  • An enzyme inhibitor-containing group represented by the general formula (A) is prepared by mixing the enzyme-modified precursor precursor Y and the ligand precursor PL with the surface-modified nanoparticles obtained in the step (1) and linking them with the crosslinking precursor X. And a ligand-containing group represented by the general formula (L1) is formed to obtain the complex of the present invention.
  • the enzyme inhibitor precursor Y includes a sorafenib derivative in which R 10 in the general formula (E) is a kinase inhibition site.
  • the enzyme inhibitor-containing group and the ligand-containing group are supported on the nanoparticles via a linker containing an imine bond.
  • the imine bond is a carbon-nitrogen double bond represented by> C ⁇ N—.
  • the terminal ketone groups of the enzyme inhibitor precursor Y and the ligand precursor PL dehydrate and condense with the amino groups of the crosslinking precursor on the surface-modified nanoparticles to form an imine bond.
  • the enzyme inhibitor-containing group and the ligand-containing group can be supported on the nanoparticle surface via an imine bond.
  • step (2) of Example 3 below sorafenib derivative 13 is used as enzyme inhibitor precursor Y, and somatostatin derivative 12 synthesized in Example 3 is used as ligand precursor PL. (Surface-modified nanoparticles are not shown.)
  • the reactions shown in the above two schemes can be performed in AcOH / AcONa buffer at room temperature (for example, 15 to 25 ° C.).
  • the buffer to be used may be appropriately determined according to the type of the surface-modified nanoparticles, the enzyme inhibitor precursor Y represented by the general formula (E), and the ligand precursor PL represented by the general formula (L5). it can.
  • the concentration and reaction time of the surface-modified nanoparticles, the enzyme inhibitor precursor Y represented by the general formula (E) and the ligand precursor PL represented by the general formula (L5) are also appropriately determined according to the desired surface-modified nanoparticles. can do.
  • the enzyme inhibitor precursor Y a compound in which R 10 in the general formula (E) contains a lysosomal enzyme inhibitor site can also be used.
  • the enzyme inhibitor precursor Y containing a lysosomal enzyme inhibitor site include: The compound shown by following formula (7), (15), (20) can be mentioned. However, it is not the intention limited to these.
  • the compounds represented by the formulas (7), (15) and (20) and the enzyme inhibitor precursor Y similar thereto can be prepared from known sugar compounds and known raw material compounds with reference to WO2017 / 131242. it can.
  • the method for condensing the sugar compound and the aryl compound and the method for linking the side chain to the condensed aryl compound are as follows: A. T. Ohyanagi, et. Al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 12507-12517 (Nonpatent literature 2) It can implement with reference to the method as described.
  • the reaction product can be separated and purified by a known method.
  • the substance that did not react with the enzyme inhibitor precursor Y and the ligand precursor PL forms a complex while being supported on the nanoparticle surface as a substance represented by the general formula (A ′).
  • Types of enzyme inhibitor precursor Y and ligand precursor PL, desired loading amount and reaction conditions in a complex of enzyme inhibitor-containing group represented by general formula (A) and ligand-containing group represented by general formula (L1) In consideration of the above, etc., the usage amounts of the enzyme inhibitor precursor Y and the ligand precursor PL in the step (2) are appropriately selected.
  • the present invention includes an anticancer agent containing the complex as an active ingredient.
  • the anticancer agent of the present invention is a pharmaceutical composition for preventing or / and treating cancer (cancer, malignant tumor) containing the above complex as an active ingredient, and optionally further comprises a pharmaceutically acceptable carrier. be able to. Since the complex of the present invention includes nanoparticles as a constituent component, some cancer cells have cancer cells whose efficiency of complex incorporation is orders of magnitude higher than that of normal cells. Furthermore, since the complex of the present invention has a specific ligand-containing group, it easily binds to a cell receptor having a receptor for a ligand site contained in the ligand-containing group on the cell surface and is easily taken into the cell. .
  • the selectivity of cells into which the complex of the present invention is taken up can be increased by selecting a ligand site contained in the ligand-containing group.
  • the complex of the present invention has an uptake efficiency of a highly active cell such as a cancer cell (tumor cell) by orders of magnitude higher than that of a normal cell due to the effects of nanoparticles and a ligand, and has a high selectivity.
  • the cancer targeted by the anticancer agent of the present invention is not particularly limited, and any cancer having a cell surface receptor for a certain ligand may be used, and the complex of the present invention by further having nanoparticles. It is preferable that the uptake efficiency is cancer cells that are orders of magnitude higher than normal cells.
  • Examples of the cancer targeted by the anticancer agent of the present invention include, but are not limited to, breast cancer, prostate cancer, hepatocellular carcinoma, pancreatic cancer, colon cancer, ovarian cancer, renal cancer, lung cancer, and brain tumor. Can do. Breast cancer, hepatocellular carcinoma, pancreatic cancer, and brain tumor are preferable.
  • lysosomal enzymes exist in lysosomes, which are one of the organelles, and play a role in degrading intracellular substrates such as complex carbohydrates and lipids. Lysosomal enzymes include a large number of glycolytic enzymes. As a result, a complex having a lysosomal enzyme inhibitor is selectively taken up by a highly active cell and inactivates a lysosomal enzyme (for example, glycolytic enzyme). Inhibition of lysosomal enzyme activity leads to cell death, so that a drug containing the complex of the present invention as an active ingredient is effective as an anticancer drug.
  • kinases are typical examples of such enzymes and contribute to phosphorylation of various substances.
  • a complex of the invention with a kinase inhibitor is selectively taken up and inactivates the kinase. Since inhibition of kinase activity leads to cell death, a drug containing the complex of the present invention as an active ingredient is effective as an anticancer drug.
  • the anticancer agent of the present invention can be formulated by methods known to those skilled in the art using the complex as an active ingredient.
  • it can be used parenterally in the form of a sterile solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, or an injection of suspension.
  • a pharmacologically acceptable carrier or medium specifically, sterile water or physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspension, surfactant, stabilizer, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative
  • a pharmaceutical preparation by combining with a binder or the like as appropriate and mixing in a unit dosage form generally required for pharmaceutical practice. The amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose within the indicated range can be obtained.
  • a sterile composition for injection can be formulated in accordance with normal pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection.
  • Aqueous solutions for injection include, for example, isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol and sodium chloride.
  • Suitable solubilizers such as Alcohols, specifically ethanol, polyalcohols such as propylene glycol, polyethylene glycol, nonionic surfactants such as polysorbate 80 (TM), HCO-60 may be used in combination.
  • oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent.
  • buffer for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer, a soothing agent, for example, procaine hydrochloride, stabilizer, for example, benzyl alcohol, phenol, antioxidant.
  • the prepared injection solution is usually filled into a suitable ampoule. Liposomes can also be used to encapsulate the drug for cell delivery.
  • Administration is oral or parenteral, preferably parenteral administration. Specific examples include injection, nasal administration, pulmonary administration, and transdermal administration. As an example of the injection form, it can be administered systemically or locally by, for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, or the like.
  • the dose and administration method of the complex of the present invention can be appropriately selected depending on the patient's annual salary, weight, sex, nature or severity of symptoms to be treated, and the like.
  • the dosage of the pharmaceutical composition containing this antibody can be selected, for example, in the range of 0.0001 mg to 1,000 mg per kg of body weight per time. Alternatively, the dose can be selected within the range of 0.01 to 100,000 mg / body per patient, but is not necessarily limited to these values.
  • the dose and administration method vary depending on the patient's age, weight, sex, symptom, and the like, but can be appropriately selected by a person concerned.
  • the present invention includes a method for transferring an enzyme inhibitor to cells.
  • This method comprises the step of preparing the complex of the present invention, and supplying the complex to a cell that is a target of enzyme inhibitor transfer, or a living body containing the cell, so that the enzyme is incorporated into the cell.
  • the enzyme inhibitor is the same as that in the complex of the present invention.
  • the cell targeted for drug transfer can be a cancer cell.
  • cancer cells reference can be made to the description in the anticancer agent.
  • the living body containing the cells to be transferred with the enzyme inhibitor is a mammal. Mammals are all mammals including humans, but may not include humans.
  • Example 1 Method for synthesizing the complex of the present invention which is a fluorescent nanoparticle carrying a sorafenib derivative as an enzyme inhibitor site and a cRGD derivative as a ligand site
  • Method for synthesizing an integrin ligand (compound 7) General formula (L6)
  • a method for synthesizing the integrin ligand (compound 7) corresponding to the ligand precursor will be described below.
  • a novel ketone linker-modified lysine derivative (1) was prepared with reference to (A. Pratesi, et al., Org. Biomol. Chem., 2015, 13, 3988-4001).
  • the primary amine of the chain was synthesized starting from lysine protected by Boc.
  • the carboxylic acid was t-Bu esterified to 2 and then the side chain Boc group was selectively deprotected with TFA to 3.
  • 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl carbodiimide hydrochloride) (EDC) in the presence of compound 3 with 5-Oxohexanoic acid to remove the 4 t-Bu group with TFA to achieve the desired ketone linker-modified lysine Derivative 1 was obtained efficiently.
  • Integrin ligand compound 7 corresponding to the ligand precursor represented by the general formula (L6) and ketone linker-modified sorafenib derivative corresponding to the enzyme inhibitor precursor represented by the general formula (E1) (compound 32 described in WO2017 / 131242) Corresponding [see the synthesis scheme of [Chemical Formula 47]) with references (T. Ohyanagi, et al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 12057-12517 and R. S. Tan, et. Al. , ACS Chem. Biol. 2015, 10, 2073-2086) and presented to fluorescent nanoparticles (quantum dots).
  • TOPO-QDs (1 ⁇ M, 50 ⁇ l / octane) was added with MeOH (50 ⁇ l) and i-PrOH (100 ⁇ l) to precipitate nanoparticles by centrifugation, the solvent was removed, and hexane (50 ⁇ l) was added again to disperse.
  • Example 2 Antitumor effect of the complex of the present invention, which is a fluorescent nanoparticle (quantum dot) carrying a sorafenib derivative as an enzyme inhibitor site and a cRGD derivative as a ligand site (liver cancer cell growth inhibitory effect)
  • a fluorescent nanoparticle quantum dot
  • sorafenib derivative as an enzyme inhibitor site
  • a cRGD derivative as a ligand site
  • the cells were washed 3 times with Opti-MEM, then Lyso Tracker R Green DND-26 (200 ⁇ l, 5 nM / Opti-MEM) was added and incubated at 37 ° C, 5% CO 2 for 30 minutes The lysosome was then stained. Then add Hoechest (2 ⁇ l, 0.1 ng / ⁇ l / Opti-MEM), incubate at 37 ° C in 5% CO 2 atmosphere for an additional 15 minutes to stain the nuclei, and then wash with Opti-MEM 3 times for imaging. (FIGS. 2 and 3). None of the nanoparticles were trapped in endosomes / lysosomes from the early stage of co-culture, and after 24 hours, they were not observed to escape from this compartment and move into the cytoplasm.
  • the receptor-mediated endocytosis of the complex of the present invention which is a fluorescent nanoparticle carrying a sorafenib derivative as an enzyme inhibitor site and a cRGD derivative as a ligand site, shows the antitumor activity of sorafenib.
  • IC 50 33.4 nM ⁇ 6.0 nM.
  • Sorafenib originally has an IC 50 of several to several tens of ⁇ M when administered alone to HepG2 cells (WO2017 / 131242), and by carrying it on nanoparticles with Compound 7, the antitumor effect is about 1000 times (dose is about 1000 minutes) Of 1).
  • Example 3 Method for synthesizing complex of the present invention having fluorescent nanoparticle carrying sorafenib derivative as enzyme inhibitor site and Somatostatin-14 derivative as ligand site (1) Synthesis of Somatostatin-14 derivative Ligand precursor represented by general formula (L6) A method for synthesizing Somatostatin-14 derivative (12) corresponding to the body will be described below.
  • Trityl ChemMatrix resin 0.3 mmol / g, 30 ⁇ mol was used as a solid phase carrier.
  • Amino acid elongation reaction was performed under the conditions of microwave irradiation (40 W, 2450 MHz, 50 ° C) under the conditions of Fmoc amino acid derivative or 5-oxohexanoic acid (120 ⁇ mol, 4 equivalents), 1- [bis (dimethylamino) methyliumyl] -1H-benzotriazole
  • the reaction was performed with a DMF solution of -3-oxide hexafluorophosphate (HBTU, 120 ⁇ mol, 4 equivalents), 1-hydroxybenzotriazole monohydrate (HOBt, 120 ⁇ mol, 4 equivalents), N, N-diisopropylethylamine (DIEA, 180 ⁇ mol, 6 equivalents) for 10 minutes. .
  • the Fmoc group was deprotected by treatment with a 20% piperidine / DMF solution for 3 minutes under conditions of microwave irradiation (40 W, 2450 MHz, 50 ° C.).
  • Peptide synthesis was performed by sequentially repeating these three steps (1) elongation with various Fmoc amino acids, (2) acetylation treatment, and (3) de-Fmocation.
  • TFA 2,2,2-trifluoroacetic acid
  • phenol / H 2 O / thioanisole / 1-dodecanethiol 82.5 / 5/5/5 / 2.5 (v / v / v / v / v).
  • Compound 12 was synthesized using compound 11 with reference to a report (S. A. Mitchell et al., J. Org. Chem. 2001, 66, 2327-2342). Details are shown below.
  • Compound 11 (3.5 ⁇ mol, 6.1 mg) was dissolved in 6 mL H 2 O and adjusted to pH 8.5 using 1 M aqueous ammonia solution. Further, potassium ferricyanide (8.8 ⁇ mol, 2.9 mg, 2.5 equivalents) dissolved in 30 mL H 2 O was separately prepared. Next, the prepared peptide solution was dropped into an aqueous potassium ferricyanide solution and stirred overnight at room temperature, and then adjusted to pH 4.0 with a 1M aqueous acetic acid solution to stop the reaction.
  • Example 4 Anti-tumor effect (inhibition effect on proliferation of hepatoma cells) of fluorescent nanoparticle carrying compound 12 (reference example) and fluorescent nanoparticle carrying compound 12 and 13 (complex of the present invention)
  • Intracellular imaging Human liver cancer cells (obtained from HepG2, P12, ATCC) are 5000 cells / 200 ⁇ l / against a glass substrate well plate coated with polylysine solution (0.001%, 100 ⁇ L / well / Milli Q). Seeded well.
  • the cell growth process up to 24 hours after the addition was observed by fluorescence imaging. The cells were stained with the following method and then observed with a fluorescence microscope.
  • Lyso Tracker (R) Green DND-26 200 ⁇ L, 5 nM / Opti-MEM was added, and the conditions were 37 ° C, 5% CO2 for 30 minutes. Incubate to stain lysosomes. Then add Hoechest 33342 (2 ⁇ L, 0.1 ng / ⁇ L / Opti-MEM), incubate for an additional 15 minutes at 37 ° C in 5% CO 2 atmosphere, stain the nucleus, and then wash with Opti-MEM three times for imaging. Performed (FIGS. 8 and 9).
  • QD anchored 12 1000 to 10 nM, 10 ⁇ L / Milli Q
  • compound 12 1000 to 10 nM, 10 ⁇ L / ml
  • Milli Q was added and a solution prepared to a final concentration of 100-1 nM was added. Wash 3 times with medium 96 hours after the start of culture, add 10 ⁇ l of Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) to 100 ⁇ L of cell culture, and incubate at 37 ° C in 5% CO 2 atmosphere for 1.5 hours
  • the cell viability was measured by measuring the absorbance at 450 nm.
  • Compound 12 (Somatostatin-14) did not show any cell killing effect when immobilized on QD.
  • Example 5 (1) Instead of the synthetic compound 12 of the fluorescent nanoparticle carrying the compound L8-1 (reference example) and the fluorescent nanoparticle carrying the compounds L8-1 and 13 (complex (40) of the present invention), Similar to Example 3 (2), except that the sugar residue-containing compound L8-1 (known compound) corresponding to the ligand precursor represented by the general formula (L6) was used, the compound L8-1 and the general formula A ketone linker-modified sorafenib derivative (13) corresponding to the enzyme inhibitor precursor represented by (E1) was supported on fluorescent nanoparticles to prepare a complex (40) of the present invention.
  • the sugar residue-containing compound L8-1 known compound
  • the compound L8-1 and the general formula A ketone linker-modified sorafenib derivative (13) corresponding to the enzyme inhibitor precursor represented by (E1) was supported on fluorescent nanoparticles to prepare a complex (40) of the present invention.
  • the ketone linker-modified sorafenib derivative (13) is the same compound as the ketone linker-modified sorafenib derivative used in Example 1, and corresponds to compound 32 described in WO2017 / 131242 (see the synthesis scheme of [Chemical Formula 47]).
  • HepG2 cells were suspended in medium supplemented with 10% FBS and plated into wells of 8-well plates (Fisher Scientific) at a seeding density of 5 ⁇ 10 4 cells / well. Cells were allowed to adhere overnight at 37 ° C. in a humidified incubator with 5% CO 2 . It is known that HepG2 cells take up sugar chains as ligands in clathrin-dependent endocytosis.
  • K + depletion treatment humidified incubator with 5% CO 2 in K + removed HEPES buffer (140 mM NaCl, 20 mM HEPES, 1 mM CaCl 2 , 1 mM MgCl 2 , 1 mg / ml D-glucose) K + depletion was performed by preincubating the cells for 1 hour at 37 ° C. Cells were quickly washed with HEPES buffer without K + . After K + depletion treatment, cells were incubated with 10 nM complex (50) in HEPES buffer without K + for 2 hours at 37 ° C.
  • the complex (50) is taken up by HepG2 cells by endocytosis via the binding between the sugar chain ligand and the receptor.
  • the complex (50) is taken up by endocytosis.
  • the uptake of the complex (50) decreases in the presence of GluNAc (the GluNAc is present at the end of the complex (50), and the binding between this part (sugar chain) and the cell receptor is It is inferred that the result is competitive inhibition.)
  • QD anchored 13 1000 ⁇ 10 nM, 10 ⁇ L / Milli Q
  • QD anchored L8-1 / 13 complex of the present invention (40)
  • PC linker phospholipid mimetic group
  • FBS fetal bovine serum
  • FCS Fluorescence Correlation Spectrometry
  • the present invention is useful in the field related to anticancer agents.
  • SEQ ID NOs: 1 to 11 are amino acid sequences of ligands.

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Abstract

本発明は、（１）ナノ粒子、（２）ナノ粒子の表面に担持された下記一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基、（３）ナノ粒子の表面に担持された下記一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基、及び（４）ナノ粒子の表面に担持された下記一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質基を含む複合体、この複合体を有効成分として含有する抗ガン剤に関する。 一般式（Ａ）中、Ｒ１０は酵素阻害剤含有部位、一般式（Ｌ１）中、Ｒ２０は細胞表面受容体に対して結合性を有するリガンド部位を含む。一般式（Ａ）、（Ｌ１）及び（Ｂ）中、－Ｓ－末端がナノ粒子担持部位である。本発明は、リガンドを結合した薬剤の細胞内への移送において、細胞内に取り込まれた薬剤が速やかに細胞膜外にリサイクルされることなしに、細胞内で放出され得る手段、この手段を利用して、細胞膜内の酵素に対する活性物質のような薬剤を送達する手段、及びこの手段を利用した抗ガン剤を提供する。

Description

細胞内物質移送システムおよびその利用
　本発明は、細胞内物質移送システムおよびその利用に関する。
関連出願の相互参照
　本出願は、２０１８年４月２７日出願の日本特願２０１８－０８７４３６号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
　治療効果が期待される医薬品の多くの標的タンパク質は細胞内の核を含む特定のオルガネラあるいは細胞質に分布している。このため、医薬品を作用すべき細胞内の空間に送達できなければ期待された治療効果は得られない。
　実際、薬効を得るためには細胞内に薬効成分が取り込まれる必要があることが示されている(非特許文献１)。しかし、依然として低分子・高分子を問わず、薬剤を効率良く目的の細胞内スペースあるいは、エンドリソソーム、ミトコンドリア、核などの特定のオルガネラに運搬して低濃度で機能させることが可能なシステムの例は少ない。
　細胞表面にはインテグリンなどのレセプターが存在し、このレセプターに対するリガンドを有する薬剤がレセプターに結合し、それによりエンドサイトシスが起こることが知られている。ところが、エンドサイトシス後に、取り込まれた薬剤を有するリガンド－レセプター複合体が速やかに細胞膜にリサイクルされることも報告されている（非特許文献２～５）。
　これに対して、薬剤を様々な種類の粒子に担持して細胞内に取り込ませる試みもなされている（非特許文献６）。種々の薬剤送達システムも考案され、特に、標的指向化を可能とする、ＥＰＲ（enhanced permeability and retention）効果等を利用した、例えば、高分子のナノ粒子、ミセル化ナノ粒子、磁性ナノ粒子などを使った種々のシステムが知られている。（例えば、特許文献１～４参照）
　さらに、生体内に置かれた粒子が、生体内でどのような扱いを受けるかについても研究が進んでいる（非特許文献７および８）。粒子が生体内に置かれると、生体内のタンパク質が粒子表面に非特異的に結合し、薬剤を結合した粒子表面を被覆して凝集することも知られている（非特許文献７）。また、血清タンパク質が表面に結合することで、粒子サイズが増大して、エンドサイトシスが起こりにくくなる場合があることも知られている（非特許文献８）。
特許文献１：日本特表２００９－５３４３０９号公報
特許文献２：日本特表２０１１－５２８２７５号公報
特許文献３：日本特表２０１５－５２０１９４号公報
特許文献４：日本特表２０１５－５２０１９７号公報
非特許文献１：Shin-Ichiro Nishimura et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 3386-3390
非特許文献２：Sara M. Weis et al., Cancer Cell 15, 359-361(2009)
非特許文献３：Andrew R Reynolds et al., Nat. Med. 15, 392-400(2009)
非特許文献４：Rebecca E. Bridgewater et al., J. Cell Sci. 125, 3695-3701(2012)
非特許文献５：Alfredo Erazo-Oliveras et al., Pharmaceuticals 5, 1177-1209 (2012)
非特許文献６：Jinjun Shi et al., Nat.Rev.Cancer 17,20-37(2017)
非特許文献７：Marco P. Monopoli et al., Nat.Nanotechnol. 7, 779-786(2012)
非特許文献８：Carl D. Walkey et al., J.Am.Chem.Soc. 134, 2139-2147(2012)
特許文献１～４及び非特許文献１～８の全記載は、ここに特に開示として援用される。
　薬剤にリガンドを結合し、これを細胞内に取り込ませることが行われているが、受容体が、例えばインテグリンの場合、非特許文献２～５に記載のように、取り込まれた薬剤が速やかに細胞膜にリサイクルされ、再び細胞外に放出され、副作用の原因ともなることから、薬剤の細胞内への移送方法としての有効性が疑われている。
　そこで本発明が解決すべき課題は、リガンドを結合した薬剤の細胞内への移送において、細胞内に取り込まれた薬剤が速やかに細胞膜外にリサイクルされることなしに、細胞内で放出され得る手段を提供することであり、本発明は、このような手段を提供することを目的とする。
　さらに本発明は、薬剤を効率良く細胞内、特にエンドリソソーム、に運搬する上記手段を利用して、細胞膜内の酵素、例えば、キナーゼ等に対する活性物質（例えば、阻害剤）のような薬剤を送達する手段を提供することを目的とする。
　加えて本発明は、このような手段を利用した抗ガン剤を提供することも目的とする。
　本発明は、以下の通りである。
[１]
（１）ナノ粒子、（２）前記ナノ粒子の表面に担持された下記一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基、（３）前記ナノ粒子の表面に担持された下記一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基、及び（４）前記ナノ粒子の表面に担持された下記一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質基を含む複合体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 （一般式（Ａ）中、ｎ１は２～３０の整数であり、ｎ２は２～３０の整数であり、－Ｓ－末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ１０は酵素阻害剤含有部位である。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 （一般式（Ｌ１）中、ｎ１は２～３０の整数であり、ｎ２は２～３０の整数であり、－Ｓ－末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ２０は細胞表面受容体に対して結合性を有するリガンド部位を含む。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 （一般式（Ｂ）中、ｎ３は２～３０の範囲の整数であり、－Ｓ－末端がナノ粒子担持部位である。）
[２]
一般式（Ａ）中のＲ１０＝Ｎ－Ｏ－は下記一般式（Ａ１）で示され、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 （一般式（Ａ１）中、ＥＩＨは、酵素阻害剤部位であり、酵素阻害剤部位は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する自殺基質部位、又はキナーゼと反応性を有するキナーゼ阻害部位であり、ＬＫはリンカー部位である。）
一般式（Ｌ１）中のＲ２０＝Ｎ－Ｏ－は下記一般式（Ｌ２）で示される［１］に記載の複合体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 （一般式（Ｌ２）中、ＬＤはリガンド部位であり、ＬＫはリンカー部位である。）
[３]
一般式（Ａ）中のＲ１０＝Ｎ－Ｏ－は下記一般式（Ａ２）又は（Ａ３）で示され、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 （一般式（Ａ２）中、ｍ２は１～１０の整数であり、ＥＩＨは酵素阻害剤部位であり、酵素阻害剤部位は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する自殺基質部位、又はキナーゼと反応性を有するキナーゼ阻害部位である。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 （一般式（Ａ３）中、ｍ４は１～１０の整数であり、ＥＩＨは一般式（Ａ２）と同義である。）
かつ
一般式（Ｌ１）中のＲ２０＝Ｎ－Ｏ－は下記一般式（Ｌ３）又は（Ｌ４）で示される［１］に記載の複合体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 （一般式（Ｌ３）中、ｍ１は１～１０の整数であり、ｍ２は１～１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
 （一般式（Ｌ４）中、ｍ３は１～１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。）
[４]
前記リガンド部位は、インテグリン、ソマトスタチンガン細胞受容体又は糖鎖受容体に対するリガンド部位である［１］～［３］のいずれかに記載の複合体。
[５]
インテグリンに対するリガンド部位は、細胞接着性タンパク質、細胞外マトリックス分子、フィブロネクチン、ラミニン若しくはその断片、コラーゲン若しくはその断片、又は白血球若しくはその断片を含む、［４］に記載の複合体。
[６]
ソマトスタチンガン細胞受容体に対するリガンド部位は、１４アミノ酸型ソマトスタチン、２８アミノ酸型ソマトスタチン、オクトレオチド、ランレオチド、パシレオチド又はそれらのアナログ体を含む、［４］に記載の複合体。
[７]
一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤又はキナーゼ阻害剤と一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質のモル比率が１：１００～１０：１の範囲であり、一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基と一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基のモル比率が１０：１～１：１０の範囲である、［１］～［６］のいずれかに記載の複合体。
[８]
前記ナノ粒子は、金属ナノ粒子又は半導体ナノ粒子である、［１］～［７］のいずれかに記載の複合体。
[９]
前記ナノ粒子は、粒子径が０．１～１００ｎｍの範囲である［１］～［８］のいずれかに記載の複合体。
[１０]
［１］～［９］のいずれかに記載の複合体を有効成分として含有する抗ガン剤。
[１１]
前記抗ガン剤は、乳癌、前立腺癌、肝細胞癌、膵癌、大腸癌、卵巣癌、腎癌、肺癌、または脳腫瘍に対する抗ガン剤である［１０］に記載の抗ガン剤。
[１２]
［１］～［９］のいずれかに記載の複合体の製造方法であって、
下記一般式（Ｃ）で示される架橋前駆体Ｘ及び下記一般式（Ｄ）で示されるリン脂質疑似物質前駆体とコロイド状ナノ粒子とを混合して、ナノ粒子の表面に架橋前駆体Ｘ及びリン脂質疑似物質を担持した表面修飾ナノ粒子を得る工程（１）、及び
得られた表面修飾ナノ粒子に下記一般式（Ｅ）で示される酵素阻害剤前駆体Ｙ及び下記一般式（Ｌ５）で示されるリガンド前駆体ＰＬを混合して、前記表面修飾ナノ粒子上の架橋前駆体Ｘと連結させて下記一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基及び下記一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基を形成して［１］～［９］のいずれかに記載の複合体を得る工程（２）を含む前記方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
 （一般式（Ｃ）中、ｎ１は２～３０の整数であり、ｎ２は２～３０の整数である。)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
  (一般式（Ｄ）中、ｎ３は２～３０の範囲の整数である。)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
 （一般式（Ｅ）中、Ｒ１０は酵素阻害剤含有部位である。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
 （一般式（Ｌ５）中、Ｒ２０は細胞表面受容体に対して結合性を有するリガンド部位を含む。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
 （一般式（Ａ）中、ｎ１は２～３０の整数であり、ｎ２は２～３０の整数であり、－Ｓ－末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ１０は酵素阻害剤含有部位である。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
 （一般式（Ｌ１）中、ｎ１は２～３０の整数であり、ｎ２は２～３０の整数であり、－Ｓ－末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ２０は細胞表面受容体に対して結合性を有するリガンド部位を含む。）
[１３]
一般式（Ｅ）で示される酵素阻害剤前駆体Ｙは、下記一般式（Ｅ１）で示され、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
  (一般式（Ｅ１）中、ＥＩＨは、酵素阻害剤部位であり、酵素阻害剤部位は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する自殺基質部位、又はキナーゼと反応性を有するキナーゼ阻害部位であり、ＬＫはリンカー部位である。）
一般式（Ｌ５）で示されるリガンド前駆体ＰＬは、下記一般式（Ｌ６）で示される、［１２］に記載の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
 （一般式（Ｌ６）中、ＬＤはリガンド部位であり、ＬＫはリンカー部位である。）
[１４]
一般式（Ｌ５）で示されるリガンド前駆体ＰＬが、下記一般式（Ｌ７）又は（Ｌ８）で示される化合物である［１２］に記載の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
 （一般式（Ｌ７）中、ｍ１は１～１０の整数であり、ｍ２は１～１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
 （一般式（Ｌ８）中、ｍ３は１～１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。）
[１５]
一般式（Ｅ）で示される酵素阻害剤前駆体Ｙは、下記一般式（Ｅ２）又は（Ｅ３）で示される
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
 （一般式（Ｅ２）及び（Ｅ３）中、ＥＩＨは酵素阻害剤部位であり、酵素阻害剤部位は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する自殺基質部位、又はキナーゼと反応性を有するキナーゼ阻害部位であり、ｍ２は１～１０の整数であり、ｍ４は１～１０の整数である。）［１３］又は［１４］に記載の製造方法。
[１６]
一般式（Ｌ６）で示されるリガンド前駆体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
 （一般式（Ｌ６）中、ＬＤはインテグリン、ソマトスタチンガン細胞受容体又は糖鎖受容体に対するリガンド部位であり、ＬＫはリンカー部位である。
 [１７]
下記一般式（Ｌ７）又は（Ｌ８）で示されるリガンド前駆体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
 （一般式（Ｌ７）中、ｍ１は１～１０の整数であり、ｍ２は１～１０の整数であり、ＬＤはインテグリン、ソマトスタチンガン細胞受容体又は糖鎖受容体に対するリガンド部位である。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
 （一般式（Ｌ８）中、ｍ３は１～１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。）
[１８]
［１］～［９］のいずれかに記載の複合体を調製する工程、および
前記複合体を酵素阻害剤移送の対象である細胞、または前記細胞を含む生体に供給して、前記細胞に酵素阻害剤を取り込ませる工程
を含む、酵素阻害剤の細胞への移送方法。
[１９]
酵素阻害剤移送の対象である細胞が、ガン細胞である、［１８］に記載の移送方法。
[２０]
前記細胞を含む生体が哺乳動物（ヒトを含む、又は含まない）である、［１９］に記載の移送方法。
　本発明によれば、リガンドを結合した薬剤の細胞内への移送において、細胞内に取り込まれた薬剤が速やかに細胞膜にリサイクルされることを阻害できる手段を提供することができる。この手段を用いることで、細胞膜内の酵素に対する活性物質（例えば、阻害剤）を送達することができる。さらに、この手段を利用することで、細胞がガン細胞である場合には、ガン細胞を攻撃することもできる。
図１は、化合物7とソラフェニブ誘導体を同時に担持した蛍光性ナノ微粒子（量子ドット）のMALDI-TOFMSを示す。
図２は、化合物7を担持した蛍光性ナノ微粒子（10 nM）の癌細胞内挙動：蛍光性ナノ微粒子の肝癌細胞（HepG2）培養開始後（0.5～24時間）での細胞内動体（Scale bar size=50μm）を示す。
図３は、化合物7とソラフェニブ誘導体を担持した蛍光性ナノ微粒子（10 nM）の癌細胞内挙動：蛍光性ナノ微粒子の肝癌細胞（HepG2）培養開始後（0.5～24時間）での細胞内動体（Scale bar size=50μm）を示す。
図４は、化合物7とソラフェニブ誘導体を担持した蛍光性ナノ微粒子（1～100 nM）の抗腫瘍効果（肝癌細胞殺傷作用）を示す。
図５は、Linear型Somatostatin-14誘導体(11)のHPLC (A) および MALDI-TOF MS (B) を示す。
図６は、Somatostatin-14誘導体(12)のHPLC (A) および MALDI-TOF MS (B) を示す。
図７は、化合物12、化合物13および12と13を担持したリン脂質被覆蛍光性ナノ微粒子のMALDI-TOF MSを示す。
図８は、化合物12を担持した蛍光性ナノ微粒子のガン細胞内挙動：蛍光性ナノ微粒子を培地中に添加後、0.5～24時間での時間変化(Scale bar size＝50μm) を示す。
図９は、化合物12および13を担持した蛍光性ナノ微粒子のガン細胞内挙動：蛍光性ナノ微粒子を培地中に添加後、0.5～24時間での時間変化(Scale bar size＝50μm) を示す。
図１０は、化合物13および化合物12と13を担持した蛍光性ナノ微粒子（100～1 nM QD anchored 13, 12/13）の肝癌細胞殺傷作用を示す。
図１１は、化合物12および化合物12を担持した蛍光性ナノ微粒子（100～1 nM QD anchored 12）の肝癌細胞殺傷作用を示す。
図１２は、蛍光性ナノ微粒子（本発明の複合体（４０））のMALDI-TOF MSを示す。
図１３は、実施例６で得られた蛍光顕微鏡写真を示す。
図１４は、実施例７で得られた細胞生存率の測定結果を示す。
図１５は、参考例Ａで得られた写真及びFCS分析結果を示す。
［複合体］
　本発明は、以下の（１）～（４）を含む複合体に関する。
（１）ナノ粒子、
（２）前記ナノ粒子の表面に担持された一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基、
（３）前記ナノ粒子の表面に担持された一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基、及び
（４）前記ナノ粒子の表面に担持された一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質基。
（１）ナノ粒子
　ナノ粒子は、金属ナノ粒子又は半導体ナノ粒子であることができる。金属ナノ粒子の材質には、特に制限はないが、金、白金、銀、鉄磁性体であることができ、金属ナノ粒子は、金ナノ粒子、白金ナノ粒子、銀ナノ粒子、鉄磁性体ナノ粒子であることができる。特に、金属ナノ粒子は、金ナノ粒子、白金ナノ粒子、銀ナノ粒子が、生体に対する安全性という観点から好ましい。
　半導体ナノ粒子の材質には、特に制限はない。半導体ナノ粒子は、量子ドットであることもできる。量子ドットとは半導体原子が数百個から数千個集まった１０数ｎｍ程度の小さな塊であり、蛍光性ナノ粒子である。粒子径により発光する蛍光の波長（色）が異なる。市販品を利用でき、本発明の複合体のナノ粒子に量子ドットを用いると、蛍光発光性の複合体とすることができ、生体内での動態をモニタリングすることも可能である。
　ナノ粒子は、粒子径が０．１～１００ｎｍの範囲であることができ、好ましくは、１～５０ｎｍの範囲、より好ましくは５～２０ｎｍの範囲、さらに好ましくは５～１５ｎｍの範囲である。
（２）ナノ粒子の表面に担持された一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基
　本発明の複合体においては、一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基が、ナノ粒子の表面に担持されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
 　一般式（Ａ）中、ｎ１は２～３０の整数であり、ｎ２は２～３０の整数であり、－Ｓ－末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ１０は酵素阻害剤含有部位である。酵素阻害剤含有部位は、例えば、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する自殺基質部位、又はキナーゼと反応性を有するキナーゼ阻害部位であることができるが、これらに限定される意図ではない。
　一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基は、式中のｎ１及びｎ２を選択することで、酵素阻害剤含有基とナノ粒子との間の距離を所望の範囲に保つことができ、その結果、細胞内での酵素阻害活性、例えば、リソソーム酵素不活性化作用又はキナーゼ阻害作用を調節することができる。ｎ１は２～３０、好ましくは５～１６、より好ましくは４～１５の範囲の整数である。ｎ２は２～３０、好ましくは５～２０、より好ましくは７～１５の範囲の整数である。
　一般式（Ａ）中のＲ１０＝Ｎ－Ｏ－は、＞Ｃ＝Ｎ－Ｏ－で表される、炭素-窒素二重結合であるイミン結合を含む。酵素阻害剤含有基のナノ粒子への担持は、イミン結合を含むリンカーを介したものであることで、細胞内でのｐＨ変化により酵素阻害剤がリリースされ易くなる。一般式（Ａ）中のＲ１０＝Ｎ－は、例えば、下記一般式（Ａ１）で示すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
 　一般式（Ａ１）中、ＥＩＨは、酵素阻害剤部位である。酵素阻害剤部位は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する自殺基質部位、又はキナーゼと反応性を有するキナーゼ阻害部位である。イミン結合における、細胞内でのｐＨ変化による酵素阻害剤ＥＩＨのリリース反応は以下で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
　ＬＫはリンカー部位であり、リンカー部位は、例えば、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
 であることができる。上記リンカー部位の式中、ｍ１、ｍ２、ｍ３及びｍ４は、独立に１～１０の整数である。
　一般式（Ａ１）で示される酵素阻害剤含有基は、一般式（Ａ）中のｎ１及びｎ２に加えて、リンカー部位（ＬＫ１～ＬＫ４）中のｍ１、ｍ２、ｍ３及びｍ４を選択することで、酵素阻害剤含有基とナノ粒子との間の距離を所望の範囲に保つことができる。その結果、細胞内での酵素阻害活性、例えば、リソソーム酵素不活性化作用又はキナーゼ阻害作用を調節することができる。ｍ１、ｍ２、ｍ３及びｍ４は、独立に、好ましくは１～８、より好ましくは１～６の範囲の整数である。
　一般式（Ａ）中のＲ１０＝Ｎ－Ｏ－は、より具体的には、例えば、下記一般式（Ａ２）又は（Ａ３）で示すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
 　一般式（Ａ２）中、ｍ２は、一般式（ＬＫ２）におけるｍ２と同義であり、ＥＩＨは、一般式（Ａ１）におけるＥＩＨと同義である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
 　一般式（Ａ３）中、ｍ４は、一般式（ＬＫ４）におけるｍ４と同義であり、ＥＩＨは、一般式（Ａ１）におけるＥＩＨと同義である。
　酵素阻害剤含有部位の一例である、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する自殺基質部位は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する基（反応性基）を含む。自殺基質部位は、例えば、リソソーム酵素に対する基質となり得る糖残基、および酵素不活性化のためのリソソーム酵素に対する反応性基を含むことができる。
　糖残基は、不活性化させたいリソソーム酵素の基質特異性に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン残基、Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン残基、ガラクトース残基、グルコース残基、フコース残基、マンノース残基シアル酸残基、から成る群から選ばれる少なくとも1種の糖残基である。
　糖残基としては、リソソーム酵素の基質特異性を考慮するとＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン残基、及び／又はガラクトース残基が好ましい。
　1個の複合体粒子に複数の糖残基を使用してもよく、その場合、１個の複合体粒子に単一又は複数種の糖残基が存在しても良い。また、１個の複合体粒子には単一又は複数種の糖残基が存在し、かつ共存する異なる複合体粒子において、同一又は異なる単一又は複数種の糖残基が存在することもできる。
　反応性基は、酵素の反応中心と反応性を有する反応性基であればよく、酵素の反応中心と反応性を有する反応性基としては、例えば、ジフルオメチルアリール基、及びトリフルオメチルアリール基から成る群から選ばれる少なくとも1種の反応性基であることができる。酵素の反応中心との反応性は、可逆的または非可逆的の何れであっても良い。
　ジフルオメチルアリール基が、酵素の反応中心との反応性を有する反応性基であることは、Biochemistry, 2005, 44, 11669-11675を参照できる。酵素阻害剤部位ＥＩＨは、例えば、下記一般式（Ｅ）で示されるジフルオメチルアリール基である自殺基質であることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
 　式中、Ｒは、糖残基であり、Ｆはフッ素原子である。
　トリフルオメチルアリール基が、酵素の反応中心との反応性を有する反応性基であることは、Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001, 11, 1769-1773を参照できる。
　酵素阻害剤部位ＥＩＨが一般式（Ｅ）で示されるトリフルオメチルアリール基を有する自殺基質部位である一般式（Ａ２）で示される酵素阻害剤含有基は、例えば、下記式で示されるいずれかの基であることができる。式（７’）はＲがＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン残基であり、式（１５’）はＲがグルコース残基であり、式（２０’）はＲがＮ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン残基である。また、下記各式はリンカー（ＬＫ２）（ｍ２＝３）を含む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
　酵素阻害剤部位の一例である、キナーゼと反応性を有するキナーゼ阻害部位は、好ましくは細胞膜のキナーゼと反応性を有する基を含む。そのようなキナーゼ阻害部位は、例えば、下記式で示される部位であることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
 　式中、Ｒ１は電子吸引性基である。電子吸引性基としては、ハロゲン原子(フッ素、塩素、臭素又はヨウ素)、ニトロ基、シアノ基、トシル基、アシル基等を挙げることができる。
　このキナーゼ阻害部位は、下記ソラフェニブを含む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
　さらに、ソラフェニブを含む酵素阻害剤含有部位の具体例としては下記の部位を挙げることができる。下記式（１３’）は、一般式（Ａ１）におけるＬＫがＬＫ４（ｍ４＝４）であり、ピリジン環に結合する下記構造のアミド結合は、ソラフェニブの構造の一部であり、このアミド結合がリンカーＬＫ４と結合する構造を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
　キナーゼは、タンパク質における特定の残基のリン酸化を触媒する酵素のファミリーである。一般的に、キナーゼは、３つのグループに分けられる。優先的にセリンおよび／またはスレオニン残基をリン酸化するもの、優先的にチロシン残基をリン酸化するもの、およびチロシンおよびセリン/スレオニン残基の両方をリン酸化するものである。キナーゼは、受容体におけるサイトカインの活性化を含む細胞外シグナルを核に伝達し、種々の生物学的な事象を引き起こすためのシグナル伝達経路における重要な要素とされる。例えば、チロシンキナーゼ活性に対する阻害剤としては、ゲフィチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ、パニツムマブ等があげられる。ソラフェニブは、チロシンキナーゼの阻害、Ｒａｆキナーゼ（細胞増殖シグナルに深く関与するセリン/スレオニンキナーゼの一種）の阻害する薬物として知られている。
（３）ナノ粒子の表面に担持された一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基
　本発明の複合体においては、一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基が、ナノ粒子の表面に担持されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
 　一般式（Ｌ１）中、ｎ１は２～３０の整数であり、ｎ２は２～３０の整数であり、－Ｓ－末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ２０は細胞表面受容体に対して結合性を有するリガンド部位を含む。
　一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基は、式中のｎ１及びｎ２を選択することで、リガンド含有基とナノ粒子との間の距離を所望の範囲に保つことができる。その結果、細胞表面受容体とリガンド含有基のリガンドとの相互作用を調節することができる。ｎ１は２～３０、好ましくは５～１６、より好ましくは４～１５の範囲の整数である。ｎ２は２～３０、好ましくは５～２０、より好ましくは７～１５の範囲の整数である。
　一般式（Ｌ１）中のＲ２０＝Ｎ－Ｏ－は、＞Ｃ＝Ｎ－で表される、炭素-窒素二重結合であるイミン結合を含む。リガンド含有基のナノ粒子への担持は、イミン結合を含むリンカーを介したものであることで、後述するように、細胞内でのｐＨ変化によりリガンドがリリースされ易くなる。一般式（Ｌ１）中のＲ２０＝Ｎ－は、例えば、下記一般式（Ｌ２）で示すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
　一般式（Ｌ２）中、ＬＤはリガンド部位である。ＬＫはリンカー部位であり、一般式（Ａ１）中のＬＫと同義であり、式（ＬＫ１）～（ＬＫ４）から選ばれ、式（ＬＫ１）～（ＬＫ４）中のｍ１、ｍ２、ｍ３及びｍ４も同義である。一般式（Ｌ２）で示されるリガンド含有基は、一般式（Ｌ１）中のｎ１及びｎ２に加えて、リンカー部位（ＬＫ１）～（ＬＫ４）中のｍ１、ｍ２、ｍ３及びｍ４を選択することで、リガンド含有基とナノ粒子との間の距離を所望の範囲に保つことができる。その結果、細胞表面受容体とリガンド含有基のリガンドとの相互作用を調節することができる。ｍ１、ｍ２、ｍ３及びｍ４は、独立に、好ましくは１～８、より好ましくは１～６の範囲の整数である。
　一般式（Ｌ１）中のＲ２０＝Ｎ－Ｏ－、より具体的には、下記一般式（Ｌ３）又は（Ｌ４）で示すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
 　一般式（Ｌ３）中、ｍ１は１～１０の整数であり、ｍ２は１～１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。一般式（Ｌ３）で示されるリガンド含有基は、リンカー部位（ＬＫ１）を含むリガンド含有基である。
み、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
 　一般式（Ｌ４）中、ｍ３は１～１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。一般式（Ｌ４）で示されるリガンド含有基は、リンカー部位（ＬＫ３）を含むリガンド含有基である。
＜リガンド部位ＬＤ＞
　本発明の複合体は、ナノ粒子の表面に担持されたリガンド含有基を含む。リガンドのナノ粒子への担持は、前述のように＞Ｃ＝Ｎ－Ｏ－で表されるイミン結合を含むリンカーを介したものであることが、複合体が細胞内に取り込まれた後に、細胞内のｐＨの影響でイミン結合が切断され、リガンドから切り離されたナノ粒子及びナノ粒子に担持された薬剤とは、細胞内に滞在しやすくなるので好ましい。リガンドがナノ粒子から切り離されない場合、リガンドは細胞膜のリサイクル作用によって容易に細胞外に排出されてしまうことがあり、ナノ粒子に担持された薬剤が、細胞膜のリサイクル作用によりリガンドと共に細胞外に排出されてしまうと、その生理活性により細胞の活動に影響を与える前に、細胞外に排出されてしまう場合がある。イミン結合における、細胞内でのｐＨ変化によるリガンドＬＤのナノ粒子から切り離し反応は以下で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
　リガンド部位は、細胞表面受容体に対して結合性を有する部位であればよく、細胞表面受容体は、例えば、インテグリン、ソマトスタチンガン細胞受容体及び糖鎖受容体であることができる。
＜インテグリン受容体及びそのリガンド＞
　インテグリンは、構造的には、α鎖及びβ鎖が１：１で会合したヘテロダイマーであることが知られており、α鎖は、分子量が約１２０～１８０ｋＤａの糖タンパク質であり、β鎖は、分子量が役９０～１１０ｋＤａの糖タンパク質である。α鎖及びβ鎖のバリエーションは、生物の種類により異なり、ヒトの場合、α鎖は少なくとも１８種類、β鎖は少なくとも８類あることが知られている。本発明においては、インテグリンの種類（α鎖及びβ鎖の組み合わせ）によらず、例えば、ヒト・インテグリンであることがでる。ヒト・インテグリンは、α１β１、α２β１、α３β１、α４β１、α５β１、α６β１、α７β１、α８β１、α９β１、α１０β１、α１１β１、αｖβ１、αＤβ２、αＬβ２、αＭβ２、αＸβ２、αＩＩｂβ３、αｖβ３、α６β４、αｖβ５、αｖβ６、α４β７、αＥβ７、αｖβ８から成る群から選ばれる少なくとも１種のインテグリンであることができる。
　インテグリンに対するリガンドは、例えば、細胞接着性タンパク質および／または細胞外マトリックス分子であることができる。さらに具体的には、インテグリンに対するリガンドは、フィブロネクチンであることができる。フィブロネクチンは、以下のアミノ酸配列の少なくとも１種を含む物質であることができる。
ＲＧＤ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ）配列、
ＬＤＶ（Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ）配列、
ＮＧＲ（Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ）／ｉｓｏＤＧＲ（Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ）配列、
ＰＲＡＱＩ（Ｐｒｏ－Ａｒｇ―Ａｌａ―Ｇｌｎ－Ｉｌｅ）／ＫＬＤＡＰＴ（Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ）配列（配列番号１及び２）、
ＡＧＥＧＩＰ（Ａｌａ―Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｐｒｏ）配列（配列番号３）、
ＫＮＥＥＤ（Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ）配列（配列番号４）、
ＰＨＳＲＮ（Ｐｒｏ－Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ａｓｎ）配列（配列番号５）、
ＥＤＧＩＨＥＬ（Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｈｉｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ））配列（配列番号６）、
ＰＲＡＲＩ（Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｉｌｅ）／ＩＤＡＰＳ（Ｉｌｅ－Ａｓｐ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ）配列（配列番号７及び８）、
ＲＥＤＶ（Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ）配列（配列番号９）。
　また、インテグリンに対するリガンドは、ラミニン若しくはその断片、コラーゲン若しくはその断片、又は白血球若しくはその断片であることもできる。
＜ソマトスタチン受容体及びそのリガンド＞
　ソマトスタチン受容体は、Ｇタンパク共役ソマトスタチン受容体として知られており、ＳＳＴ１～ＳＳＴ５のいずれかのサブタイプに属することも知られている。本発明においては、ソマトスタチン受容体のサブタイプによらない。
　ソマトスタチン受容体に対するリガンドは、例えば、１４アミノ酸型ソマトスタチン（ＡＧＣＫＮＦＦＷＫＴＦＴＳＣ）（配列番号１０）、２８アミノ酸型ソマトスタチン（ＳＡＮＳＮＰＡＭＡＰＲＥＲＫＡＧＣＫＮＦＦＷＫＴＦＴＳＣ）（配列番号１１）、オクトレオチド、ランレオチド、パシレオチド又はそれらのアナログ体であることができる。
＜糖鎖受容体及びそのリガンド＞
糖鎖受容体としては、糖鎖と結合する能力を有するタンパク質であることができ、例えば、レクチンを挙げることができる。レクチンは細胞膜およびその周囲で機能し、がんや炎症部位では活発に機能していることが知られている。レクチンの例としては、例えば、セレクチン、Siglec（シグレック）、ガレクチン、マンノース６リン酸レセプター、DC-SIGN, TLR、パターン認識レセプター、アシアロ糖タンパク質レセプターなども報告されている。但し、糖鎖と結合する能力を有するタンパク質は、これらに限定される意図ではなく、CD44などの膜レセプターも糖鎖受容体として機能するものとして挙げることができる。一般的に、糖鎖受容体と糖鎖(リガンド)の親和性は弱いため、これまでは積極的に利用することができなかった。しかし、本発明の複合体は、リン脂質疑似物質基を表面に有することから、非特異的タンパク質の吸着を阻止できたナノソーム（非吸着性ナノ微粒子）であるため、ナノ微粒子表明のリガンド部位と糖鎖受容体との相互作用を利用することができることになる（参考例Ｂ参照）。
糖鎖受容体に対するリガンドとして機能する本発明の複合体が有するリガンド部位は、例えば、マンノース末端を含むハイマンノース型N-グリカン、ハイブリッド型N-グリカン、シアル酸、ガラクトース、フコース、マンノース、N-アセチルーD-グルコサミン、N-アセチルーD-ガラクトサミン、グルクロン酸、リン酸化糖、硫酸化糖などを含む混合型N-グリカン、これらの単糖(例えば、シアル酸、ガラクトース、フコース、マンノース、N-アセチルーD-グルコサミン、N-アセチルーD-ガラクトサミン、グルクロン酸など)から構成されるシアリルT抗原、シアリルTn抗原、T抗原、Tn抗原などのO-グリカン、ラクトサミノグリカン鎖、プロテオグリカン糖鎖、ヒアルロン酸などを挙げることができる。糖鎖受容体に対するリガンドとして機能する本発明の複合体が有するリガンド部位は、例えば、単糖残基、オリゴ糖残基、多糖残基、N-グリカン、O-グリカン、並びにN-グリカン及びO-グリカン以外のグリカンから成る群から選ばれる少なくとも1種の糖の残基を含むリガンド部位であることができる。
一般式（Ｌ１）中のＲ２０＝Ｎ－Ｏ－は下記一般式（Ｌ２）で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
 （一般式（Ｌ２）中、ＬＤはリガンド部位であり、ＬＫはリンカー部位である。）
Ｌ２中のリガンド部位は、前述の通りであり、リンカー部位ＬＫは、前述のＬＫ１、ＬＫ２、ＬＫ３及びＬＫ４に加えて、糖鎖、アミノ酸配列（ペプチド等）、炭化水素基（例えば、アルキレン基、アリーレン基など）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基などであることもできる。リンカー部位ＬＫがアリーレン基である例として、以下の一般式(ＬＲ１)で記載された残基を挙げることができる。式中Ｒａはリガンド部位ＬＤである糖残基を示し、Ｒを有するフェニレン基がリンカー部位ＬＫである。Ｒは、例えば、水素原子、糖残基又は糖残基以外の残基、例えば、無置換又は置換アルキル（例えば、炭素数１～６）であることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
上記一般式（Ｌ２）で示される糖鎖受容体に対するリガンド部位を含む基は、例えば、下記式で示されるいずれかの官能基を含む部位であることができる。各式中のＲは一般式（ＬＲ１）のＲと同義である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
ＬＲ１、ＬＲ１０、ＬＲ１１、ＬＲ１２で示されるリガンド部位を含む部位が有するＲは、例えば、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基であることができる。Ｒとしてジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基を有する場合、これらの部位は、糖鎖としてのリガンド部位としての機能に加えて、リソソーム酵素に対する阻害効果を奏する場合がある。この場合の糖鎖のリガンド部位の機能は、例えば、参考例Ａに示す実験結果から明らかである。
（４）ナノ粒子の表面に担持された一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質基
　本発明の複合体は、ナノ粒子の表面に担持された一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質を含む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
 　一般式（Ｂ）中、ｎ３は２～３０の範囲の整数であり、－Ｓ－末端がナノ粒子担持部位である。
　リン脂質疑似物質は、ナノ粒子の表面を修飾し、本発明の複合体が、エンドサイトシスにより細胞内に取り込ませる機能を付与する。この観点からｎ３は２～３０、好ましくは５～２０、より好ましくは７～１５の範囲の整数である。
　１個のナノ粒子に対する酵素阻害剤含有基、リガンド含有基及びリン脂質疑似物質の担持量は、ナノ粒子の表面における金属元素（反応点）の８０％以上あることが好ましい。本発明の複合体同士の凝集抑制やエドサイトシスにより細胞内に取り込ませる機能を考慮して適宜決定することができる。尚、前記担持量は、ナノ粒子の表面の全ての反応点を覆うことができる量であることがより好ましい。
　本発明の複合体において、リガンド含有基、酵素阻害剤含有基とリン脂質疑似物質との比率は、リガンド含有基の作用による細胞内へのエンドサイトシスによる取り込み、及び取り込まれた酵素阻害剤の作用等のバランスを考慮して適宜選択することができる。一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基と一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質のモル比率は、例えば、１：１００～１０：１の範囲であることができ、一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基と一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基のモル比率は、例えば、１０：１～１：１０の範囲であることができる。
　本発明の複合体は、一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基、一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基、及び一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質に加えて、ナノ粒子の表面に下記一般式（Ａ’）で示される物質がさらに担持されたものであることができる。一般式（Ａ’）で示される物質は、後述する一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤の架橋用の前駆体Ｘに由来する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
 　一般式（Ａ’）中、ｎ１は２～３０の整数であり、ｎ２は２～３０の整数であり、－Ｓ－末端がナノ粒子担持部位である。
　尚、一般式（Ａ’）には、さらに、所望により糖鎖や抗体などの生理活性物質を担持させることもできる。
　一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基と一般式（Ａ’）で示される物質のモル比率は、例えば、１：１００～１００：０の範囲であることができ、１０：１００～１００：１０の範囲であることができる。
　本発明の複合体は、例えば、下記一般式（１０）で模式的に示すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
　ナノ粒子ＮＰに担持されている残基は、上から一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基、一般式（Ｂ）で示されるリン脂質擬似物質基、及び一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基である。実際の複合体は、一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基、一般式（Ｂ）で示されるリン脂質擬似物質基、及び一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基は、それぞれ１個以上、ナノ粒子ＮＰに担持されている。
　上記一般式（１０）で模式的に示すことができる複合体は、Ｒ１０及びＲ２０を具体化した下記一般式（２０）で模式的に記載することができる。この複合体は、実施例１に示す。Ｒ１０は、ソラフェニブ含有基であり、Ｒ２０は、インテグリンリガンド含有基である。ＮＰは、量子ドットＱＤである。一般式（２０）で模式的に示される実際の複合体は、ソラフェニブ含有基及びインテグリンリガンド含有基、並びにリン脂質疑似物質基は、それぞれ少なくとも１個以上、量子ドットＱＤに担持されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000071
　上記一般式（１０）で模式的に示すことができる複合体は、Ｒ１０及びＲ２０を具体化した下記一般式（３０）で模式的に記載することもできる。この複合体は、実施例３に示す。Ｒ１０は、ソラフェニブ含有基であり、Ｒ２０は、ソマトスタチン受容体リガンド含有基である。ＮＰは、量子ドットＱＤである。一般式（３０）で模式的に示される実際の複合体は、ソラフェニブ含有基及びソマトスタチン受容体リガンド含有基、並びにリン脂質疑似物質基は、それぞれ少なくとも１個以上、量子ドットＱＤに担持されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
　上記一般式（１０）で模式的に示すことができる複合体は、Ｒ１０及びＲ２０を具体化した下記一般式（４０）で模式的に記載することもできる。この複合体は、実施例５に示す。Ｒ１０は、ソラフェニブ含有基であり、Ｒ２０は、糖鎖リガンド含有基である。ＮＰは、量子ドットＱＤである。一般式（４０）で模式的に示される実際の複合体は、ソラフェニブ含有基及び糖鎖リガンド含有基、並びにリン脂質疑似物質基（ＰＣで示す）を有し、各基は、それぞれ少なくとも１個以上、量子ドットＱＤに担持されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
＜複合体の製造方法＞
　本発明は、上記本発明の複合体の製造方法を包含する。この方法は、下記一般式（Ｃ）で示される架橋前駆体Ｘ及び下記一般式（Ｄ）で示されるリン脂質疑似物質前駆体とコロイド状ナノ粒子とを混合して、ナノ粒子の表面に架橋前駆体Ｘ及びリン脂質疑似物質を担持した表面修飾ナノ粒子を得る工程（１）、及び
得られた表面修飾ナノ粒子に下記一般式（Ｅ）で示される酵素阻害剤前駆体Ｙ及び下記一般式（Ｌ５）で示されるリガンド前駆体ＰＬを混合して、前記表面修飾ナノ粒子上の架橋前駆体Ｘと連結させて下記一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基及び下記一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基を形成して、前記本発明の複合体を得る工程（２）を含む前記方法である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000074
 （一般式（Ｃ）中、ｎ１は２～３０の整数であり、ｎ２は２～３０の整数である。)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000075
  (一般式（Ｄ）中、ｎ３は２～３０の範囲の整数である。)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000076
 （一般式（Ｅ）中、Ｒ１０は酵素阻害剤含有部位である。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000077
 （一般式（Ｌ５）中、Ｒ２０は細胞表面受容体に対して結合性を有するリガンド部位を含む。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000078
 （一般式（Ａ）中、ｎ１は２～３０の整数であり、ｎ２は２～３０の整数であり、－Ｓ－末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ１０は酵素阻害剤含有部位である。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000079
 （一般式（Ｌ１）中、ｎ１は２～３０の整数であり、ｎ２は２～３０の整数であり、－Ｓ－末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ２０は細胞表面受容体に対して結合性を有するリガンド部位を含む。）
工程（１）
　一般式（Ｃ）で示される架橋前駆体Ｘ及び一般式（Ｄ）で示されるリン脂質疑似物質前駆体とコロイド状ナノ粒子とを混合して、ナノ粒子の表面に架橋前駆体Ｘ及びリン脂質疑似物質を担持して表面修飾ナノ粒子を得る工程である。
　一般式（Ｃ）は、酵素阻害剤含有部位Ｒ１０又はリガンド含有部位Ｒ２０を有さず、かつ末端がＳＨ基であること以外は一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基及び一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基と同様である。一般式（Ｃ）中、ｎ１は２～３０、好ましくは５～２０、より好ましくは７～１５の範囲の整数である。ｎ２は２～３０、好ましくは５～２０、より好ましくは７～１５の範囲の整数である。一般式（Ｄ）は、末端がＳＨ基であること以外は一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質基と同様である。一般式（Ｄ）中、ｎ３は２～３０、好ましくは５～２０、より好ましくは７～１５の範囲の整数である。一般式（Ｃ）で示される架橋前駆体Ｘ及び一般式（Ｄ）で示されるリン脂質疑似物質前駆体は、いずれも市販品を入手可能であり、また、参考文献(T. Ohyanagi, et. al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 12507-12517)に記載の方法で調製することもできる。
　一般式（Ｃ）で示される架橋前駆体Ｘ、一般式（Ｄ）で示されるリン脂質疑似物質前駆体及びナノ粒子の混合比率は、一般式（Ｃ）で示される架橋前駆体Ｘ及び一般式（Ｄ）で示されるリン脂質疑似物質前駆体のナノ粒子に対する所望の担持量を考慮して適宜決定することができる。
　下記に実施例１の工程（１）を参考に示す。下記スキーム中に示す一般式（Ｃ）で示される架橋前駆体Ｘはｎ１が６であり、ｎ２が９であり、一般式（Ｄ）で示されるリン脂質疑似物質前駆体のｎ３が９である。実施例１の反応スキームである下記スキームでは、アミノオキシリンカー(AO)とホスホリルコリンリンカー(PC)のモル比AO/PCが1/8である。AO/PCは、実施例３では1/16である。モル比AO/PCは、本発明の複合体における、一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基及び一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基と一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質基との比率が、前述のように、例えば、モル比率が１：１００～１０：１の範囲であることができ、好ましくは１：１０～１：１の範囲であることから、これに準じた比であることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000080
　ナノ粒子は、複合体において説明したものと同様である。上記スキームでは、金属ナノ粒子の原料としてコロイド状の量子ドット（ＱＤｓ（ＱＤ：Ｑｕａｎｔｕｍ　Ｄｏｔ））を用いた。コロイド状量子ドットは、直径の範囲が、例えば、１～２０ｎｍの発光性の半導体ナノ粒子の表面に保護基を有する。上記スキームに示すコロイド状量子ドットは表面にトリアルキルリン酸基を有する。ナノ粒子が金属ナノ粒子の場合も、コロイド状の金属ナノ粒子を原料として用いることができる。コロイド状量子ドット及びコロイド状金属ナノ粒子は市販品を入手可能である。
　一般式（Ｃ）で示される架橋前駆体Ｘ及び一般式（Ｄ）で示されるリン脂質疑似物質前駆体は、コロイド状ナノ粒子のナノ粒子表面に結合する官能基として、チオール（ＳＨ）基を有する。
　コロイド状ナノ粒子と阻害剤架橋前駆体Ｘ及びリン脂質疑似物質前駆体とを、例えば、溶媒中で分散し、ナノ粒子の表面に２種類のリン脂質疑似物質を担持する。上記スキームでは溶媒としてヘキサンと水の混合溶媒を用い、室温（例えば、１５～２５℃）で行う。使用する溶媒は、コロイド状ナノ粒子の種類、架橋前駆体Ｘ及びリン脂質疑似物質前駆体の種類に応じて適宜決定することができる。コロイド状ナノ粒子、架橋前駆体Ｘ及びリン脂質疑似物質前駆体の溶媒中の濃度や反応時間も、所望の表面修飾ナノ粒子に応じて適宜決定することができる。コロイド状ナノ粒子への担持方法の一般的な方法は、公知であり、例えば、以下の参考文献A、Bに記載の方法を参照して実施することができる。
参考文献
A. T. Ohyanagi, et. al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 12507-12517（非特許文献２）
B. R. S.Tan, et. al., ACS Chem. Biol. 2015, 10, 2073-2086（非特許文献３）
工程（２）
　工程（１）で得られた表面修飾ナノ粒子に一般式（Ｅ）で示される酵素阻害剤前駆体Ｙ及び一般式（Ｌ５）で示されるリガンド前駆体ＰＬを混合して、前記表面修飾ナノ粒子上の架橋前駆体Ｘと連結させて一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基及び一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基を形成して、本発明の複合体を得る工程である。
　本発明の製造方法における酵素阻害剤部位ＥＩＨ及びリンカー部位ＬＫは、本発明の複合体における酵素阻害剤部位ＥＩＨ及びリンカー部位ＬＫとそれぞれ同義であり、複合体における説明を参照することができる。
　一般式（Ｅ）で示される酵素阻害剤前駆体Ｙは、例えば、下記一般式（Ｅ１）で示される化合物であることができる。一般式（Ｅ１）で示される化合物は、リンカー部位ＬＫにケトン基が結合した所謂ケトンリンカーを有する化合物であり、ケトンリンカーのケトン基と前述のナノ粒子表面に予め結合された一般式（Ａ’）で示される物質の末端アミノ基とが反応して、ナノ粒子表面に一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基を結合させることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000081
 　一般式（Ｅ１）中、ＥＩＨは、酵素阻害剤部位である。酵素阻害剤部位は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する自殺基質部位、又はキナーゼと反応性を有するキナーゼ阻害部位であることができる。ＬＫはリンカー部位であり、リンカー部位は、下記一般式（ＬＫ１）～（ＬＫ４）で示されることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000082
 　式中、ｍ１，ｍ２、ｍ３及びｍ４は、独立に１～１０の整数である。
　一般式（Ｌ５）で示されるリガンド前駆体ＰＬは、例えば、下記一般式（Ｌ６）で示される化合物であることができる。一般式（Ｌ６）で示される化合物も、リンカー部位ＬＫにケトン基が結合した所謂ケトンリンカーを有する化合物であり、ケトンリンカーのケトン基と前述のナノ粒子表面に予め結合された一般式（Ａ’）で示される物質の末端アミノ基とが反応して、ナノ粒子表面に一般式（ＬＡ）で示されるリガンド含有基を結合させることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000083
 　一般式（Ｌ６）中、ＬＤはリガンド部位であり、一般式（Ｌ２）中のＬＤと同義である。ＬＫはリンカー部位であり、一般式（Ｅ）中のＬＫと同義である。一般式（Ｌ６）で示されるリガンド前駆体は、新規化合物であり、本発明はこの一般式（Ｌ６）で示されるリガンド前駆体も包含する。
　一般式（Ｌ５）及び（Ｌ６）で示されるリガンド前駆体ＰＬは、例えば、下記一般式（Ｌ７）又は（Ｌ８）で示される化合物であることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000084
 　一般式（Ｌ７）中、ｍ１は１～１０の整数であり、ｍ２は１～１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000085
 　一般式（Ｌ８）中、ｍ３は１～１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。
一般式（Ｌ８）で示されるリガンド前駆体ＰＬとしては、例えば、下記式（Ｌ８－１）、（Ｌ８－２）、（Ｌ８－３）で示される化合物を挙げることができる。但し、これらに限定される意図ではない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000086
　式（Ｌ８－１）、（Ｌ８－２）、（Ｌ８－３）で示される化合物及びこれに類するリガンド前駆体ＰＬは、ＷＯ２０１７／１３１２４２Ａ１の実施例１～３のスキーム１、３、５を参照して、公知の糖化合物及び公知の原料化合物から調製することができる。
　一般式（Ｅ）で示される酵素阻害剤前駆体Ｙは、例えば、下記一般式（Ｅ２）又は（Ｅ３）で示される化合物であることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000087
　一般式（Ｅ２）及び（Ｅ３）中、ＥＩＨは酵素阻害剤部位であり、酵素阻害剤部位は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する自殺基質部位、又はキナーゼと反応性を有するキナーゼ阻害部位である。ｍ２は１～１０の整数であり、ｍ４は１～１０の整数である。
　一般式（Ｅ）、（Ｅ１）、（Ｅ２）及び（Ｅ３）で示される酵素阻害剤前駆体ＹはＷＯ２０１７／１３１２４２に記載の方法に従って合成できる。
　一般式（Ｌ５）、（Ｌ６）、（Ｌ７）及び（Ｌ８）で示されるリガンド前駆体ＰＬは、ケトンリンカー修飾リジン誘導体及びペプチド合成用レジンを用いて、既知のペプチドの固相合成法により合成することができる。ケトンリンカー修飾リジン誘導体は、実施例１の（１）で具体的に説明するように、公知の方法（A. Pratesi, et al., Org. Biomol. Chem., 2015, 13, 3988-4001） を参考にして合成したαアミノ基をFmoc保護、側鎖の一級アミンをBocによって保護されたリジンを出発物質として合成することができる。ペプチド合成用レジンは市販品を利用することができ、例えば、ChemMatrix（バイオタージ社）を挙げることができる。
　下記に実施例１の工程（２）を参考に示す。酵素阻害剤前駆体Ｙとしてソラフェニブ誘導体１３を用い、リガンド前駆体ＰＬとして実施例１で合成されたケトンリンカー修飾リジン誘導体７が使用される。ソラフェニブ誘導体１３は、ＷＯ２０１７／１３１２４２の実施例５に記載の方法に従って合成できる（段落０１３４の合成スキーム参照中の化合物３２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000088
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000089
　工程（１）で得られた表面修飾ナノ粒子に酵素阻害剤前駆体Ｙ及びリガンド前駆体ＰＬを混合して、架橋前駆体Ｘと連結させて一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基及び一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基を形成して、本発明の複合体を得る。上記式においては、酵素阻害剤前駆体Ｙは、一般式（Ｅ）におけるＲ１０がキナーゼ阻害部位であるソラフェニブ誘導体を含む。
　前述のように、酵素阻害剤含有基及びリガンド含有基のナノ粒子への担持は、イミン結合を含むリンカーを介したものであることが好ましい。イミン結合は、＞Ｃ＝Ｎ－で表される、炭素-窒素二重結合である。上記スキームから分かるように、酵素阻害剤前駆体Ｙ及びリガンド前駆体ＰＬが有する末端のケトン基は表面修飾ナノ粒子上の架橋前駆体のアミノ基と脱水縮合してイミン結合を形成する。ナノ粒子表面にアミノ基を有する表面修飾基を担持しておくことで、酵素阻害剤含有基及びリガンド含有基を、イミン結合を介してナノ粒子表面に担持することができる。
　下記に実施例３の工程（２）にいては、酵素阻害剤前駆体Ｙとしてソラフェニブ誘導体１３を用い、リガンド前駆体ＰＬとして実施例３で合成されたソマトスタチン誘導体１２が使用される。（表面修飾ナノ粒子は示さず。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000090
　上記2つのスキームに示す反応は、AcOH/AcONa緩衝液中、室温（例えば、１５～２５℃）で行うことができる。使用する緩衝液は、表面修飾ナノ粒子の種類、一般式（Ｅ）で示される酵素阻害剤前駆体Ｙ及び一般式（Ｌ５）で示されるリガンド前駆体ＰＬの種類に応じて適宜決定することができる。表面修飾ナノ粒子、一般式（Ｅ）で示される酵素阻害剤前駆体Ｙ及び一般式（Ｌ５）で示されるリガンド前駆体ＰＬの濃度や反応時間も、所望の表面修飾ナノ粒子に応じて適宜決定することができる。
　酵素阻害剤前駆体Ｙとしては、一般式（Ｅ）におけるＲ１０がリソソーム酵素阻害剤部位を含む化合物を用いることもでき、リソソーム酵素阻害剤部位を含む酵素阻害剤前駆体Ｙとしては、例えば、下記式（７）、（１５）、（２０）で示される化合物を挙げることができる。但し、これらに限定される意図ではない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000091
　式（７）、（１５）、（２０）で示される化合物及びこれに類する酵素阻害剤前駆体Ｙは、ＷＯ２０１７／１３１２４２を参照して、公知の糖化合物及び公知の原料化合物から調製することができる。尚、糖化合物とアリール化合物の縮合方法及び縮合したアリール化合物への側鎖の連結方法は、A. T. Ohyanagi, et. al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 12507-12517（非特許文献２）に記載の方法を参照して実施することができる。反応生成物は、公知の方法で分離精製することができる。
　酵素阻害剤前駆体Ｙ及びリガンド前駆体ＰＬと反応しなかった物質は、一般式（Ａ’）で示される物質としてナノ粒子表面に担持されたままで複合体を形成する。酵素阻害剤前駆体Ｙ及びリガンド前駆体ＰＬの種類や一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基及び一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基の複合体における所望の担持量、反応条件等を考慮して、工程（２）における酵素阻害剤前駆体Ｙ及びリガンド前駆体ＰＬの使用量等を適宜選択する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000092
＜抗ガン剤＞
　本発明は、前記の複合体を有効成分として含有する抗ガン剤を包含する。本発明の抗ガン剤は、前記複合体を有効成分として含有するガン（癌、悪性腫瘍）の予防又は／及び治療用の医薬組成物であり、任意で医薬的に許容される担体をさらに含むことができる。本発明の複合体はナノ粒子を構成成分とするために、ガン細胞の中には、複合体の取込み効率が、正常細胞より桁違いに高いガン細胞がある。さらに本発明の複合体は、特定のリガンド含有基を有するので、細胞表面に、このリガンド含有基に含まれるリガンド部位に対する受容体を有する細胞の受容体と結合し易く、細胞内に取り込まれやすい。本発明の複合体は、リガンド含有基に含まれるリガンド部位を選択することで、本発明の複合体が取り込まれる細胞の選択性を上げることができる。本発明の複合体は、ナノ粒子及びリガンドの効果により、癌細胞（腫瘍細胞）のような高活動状態の細胞に対する取込み効率が、正常細胞より桁違いに高く、選択性も高い。
　本発明の抗ガン剤が対象とする前記ガンとしては、特に制限はないが、ある種のリガンドに対する細胞表面受容体を有するものであればよく、さらにナノ粒子を有することによる本発明の複合体の取込み効率が、正常細胞より桁違いに高いガン細胞であることが好ましい。本発明の抗ガン剤が対象とする前記ガンとしては、制限はないが、例えば、乳癌、前立腺癌、肝細胞癌、膵癌、大腸癌、卵巣癌、腎癌、肺癌、及び脳腫瘍などを挙げることができる。好ましくは、乳癌、肝細胞癌、膵癌、及び脳腫瘍である。
　細胞内小器官のひとつであるリソソームには、数多くのリソソーム酵素が存在し、複合糖質や脂質などの細胞内基質を分解する役割を担っている。リソソーム酵素には、多数の糖鎖分解酵素が含まれる。その結果、高活動状態の細胞に、リソソーム酵素阻害剤を有する複合体が、選択的に取り込まれ、リソソーム酵素（例えば、糖鎖分解酵素）を不活性化する。リソソーム酵素の活性阻害は、細胞を死滅に導くので、本発明の複合体を有効成分とする薬剤は、抗ガン剤として有効である。
　細胞膜内及び膜上には様々な酵素が存在し、キナーゼはそのような酵素の典型例であり、様々な物質のリン酸化に寄与する。キナーゼ阻害剤を有する本発明の複合体が、選択的に取り込まれ、キナーゼを不活性化する。キナーゼの活性阻害は、細胞を死滅に導くので、本発明の複合体を有効成分とする薬剤は、抗ガン剤として有効である。
　本発明の抗ガン剤は、前記複合体を有効成分として、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
　注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ－６０と併用してもよい。
　油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。また、リポソームも細胞送達のために該薬剤をカプセル化するために使用可能である。
　投与は、経口又は非経口であり、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身又は局部的に投与することができる。
　本発明の前記複合体の用量および投与方法は、患者の年齡、体重、性別、治療すべき症状の性質もしくは重篤度等により適宜選択することができる。本抗体を含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり0.0001mgから1,000mgの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、患者あたり0.01～100,000mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の年齢、体重、性別、症状などにより変動するが、当事者であれば適宜選択することが可能である。
　本発明は、酵素阻害剤の細胞への移送方法を包含する。この方法は、前記本発明の複合体を調製する工程、および前記複合体を酵素阻害剤移送の対象である細胞、または前記細胞を含む生体に供給して、前記細胞に酵素阻害剤を取り込ませる工程を含む。酵素阻害剤は、本発明の複合体におけるものと同様である。
　薬剤移送の対象である細胞が、ガン細胞であることができる。ガン細胞は、上記抗ガン剤における説明を参照できる。
　酵素阻害剤移送の対象である細胞を含む生体は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒトを含む全ての哺乳動物であるが、ヒトを含まないこともできる。
　以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。但し、実施例は本発明の例示であって、本発明は実施例に限定される意図ではない。
実施例１
酵素阻害剤部位としてソラフェニブ誘導体、リガンド部位としてｃRGD誘導体を担持した蛍光性ナノ微粒子である本発明の複合体の合成法
（１）インテグリンリガンド（化合物7）の合成法
　一般式（Ｌ６）で示されるリガンド前駆体に相当するインテグリンリガンド（化合物7）の合成法を以下に説明する。
ケトンリンカー修飾リジン誘導体（１）の合成法
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000093
　新規なケトンリンカー修飾リジン誘導体（１）は（A. Pratesi, et al., Org. Biomol. Chem., 2015, 13, 3988-4001）を参考にして作製した、αアミノ基をFmoc保護、側鎖の一級アミンをBocによって保護されたリジンを出発物質として合成した。カルボン酸をt-Buエステル化して２とし、次いで側鎖のBoc基をTFAによって選択的に脱保護して３とした。1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl carbodiimide hydrochloride) (EDC) の存在下で化合物３を5-Oxohexanoic acidと縮合した4のt-Bu基をTFAで除去することで目的とするケトンリンカー修飾リジン誘導体１を効率よく得た。
化合物１の構造データ：1H NMR (600 MHz, DMSO) δ ppm 7.91 (d, 2H), 7.77 (t, 1H), 7.73 (d, 2H), 7.62 (t, 1H), 7.43 (t, 2H), 7.34 (t, 2H), 4.27 (d, 2H), 4.23 (t, 1H), 3.91 (m, 1H), 2.39 (t, 2H), 2.06 (s, 3H), 2.02 (t, 2H), 1.67 (m, 2H), 1.38 (m, 4H), 1.31 (m, 2H), 1.24 (m, 2H); MALDI-TOFMS 480.116 [M+H]+
ケトンリンカー修飾環状RGD誘導体（化合物7）の合成法
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000094
　固相合成法によってケトンリンカー修飾リジン誘導体１と各種Fmocアミノ酸誘導体から合成し樹脂からAcOH/TFE/DCM=5/1/4のカクテルによって切り出された直鎖ペプチド中間体５を既報(G. Thumshirn, et al., Chem. Eur. J., 2003, 9, 2717-2725)を参考にして環化させ化合物６とした後、TFA/H2O/TIS=95/2.5/2.5のカクテルにより処理して全ての保護基を除去し目的とする化合物７を得た。
化合物７の構造データ：1H NMR (600 MHz, DMSO) δ ppm 8.38 (m, 1H), 8.09 (d, 1H), 8.01 (d, 1H), 7.91(d, 1H), 7.77 (t, 1H), 7.58 (m, 1H), 7.49 (m, 1H), 7.1 (m, 4H), 6.9 (d, 2H), 6.6 (d, 2H), 5.29 (t, 1H), 4.58 (m, 1H), 4.34 (q, 1H), 4.15 (m, 1H), 4.01 (dd, 1H), 3.38 (m, 1H), 3.21 (dd, 1H), 3.06 (m, 2H), 2.93 (q, 2H), 2.77 (m, 1H), 2.65 (m, 2H), 2.36 (t, 3H), 2.04 (s, 3H), 2.01 (t, 1H), 1.63 (m, 2H), 1.27 (m, 3H), 1.2 (m, 3H), 1.04 (m, 2H), 0.82 (t, 1H) ; MALDI-TOF MS 731.968 [M+H]+
（２）酵素阻害剤部位としてソラフェニブ誘導体、リガンド部位としてｃRGD誘導体を担持した蛍光性ナノ微粒子である本発明の複合体の合成法
　以下のスキームに一般式（Ｌ６）で示されるリガンド前駆体に相当するインテグリンリガンド化合物7と、一般式（Ｅ１）で示される酵素阻害剤前駆体に相当するソラフェニブ誘導体の両者を担持して、本発明の複合体である蛍光性ナノ微粒子（量子ドット）を作製する方法を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000095
　一般式（Ｌ６）で示されるリガンド前駆体に相当するインテグリンリガンド化合物7と一般式（Ｅ１）で示される酵素阻害剤前駆体に相当するケトンリンカー修飾ソラフェニブ誘導体（ＷＯ２０１７／１３１２４２に記載の化合物32に相当し、[化47]の合成スキーム参照)を参考文献（T. Ohyanagi, et al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 12057-12517およびR. S. Tan, et. al., ACS Chem. Biol. 2015, 10, 2073-2086）に従い、蛍光性ナノ微粒子（量子ドット）に提示した。TOPO-QDs（1μM, 50μl/octane)に対しMeOH (50μl)、i-PrOH (100μl)を加えて遠心によりナノ微粒子を沈殿させ、溶媒を取り除き再びヘキサン(50μl)を加えて分散させた。その後予め脱保護により活性化済みのアミノオキシリンカー (10 mM, 2.5μlまたは5μl/MeOH)、ホスホリルコリンリンカー (100 mM, 8 μl/MeOH)、NaBH4 (1μl, 12 wt % in 14 N NaOH)、およびmilli Q (50μl)を加えて30分間撹拌し配位子交換をして反応性ナノ微粒子前駆体AO/PC SAM-QDs (AO/PC=1/16)およびAO/PC SAM-QDs (AO/PC=1/8)とした。限外濾過(YM 50)により精製した後、化合物7とケトンリンカー修飾ソラフェニブ誘導体との複合化に供した（上記スキーム参照）。図１のMALDI-TOFMSに示すとおり、反応はスムーズに進行し全てのアミノオキシ基がケトンリンカー修飾化合物7あるいはソラフェニブ誘導体により修飾されたことが確認でき、本発明の複合体が得られたことを確認した。
実施例２
酵素阻害剤部位としてソラフェニブ誘導体、リガンド部位としてｃRGD誘導体を担持した蛍光性ナノ微粒子（量子ドット）である本発明の複合体の抗腫瘍効果（肝癌細胞増殖抑制効果）
(a) 細胞内イメージング：ヒト肝癌細胞（HepG2, P8, ATCCより入手）を5000 cell/200μl/wellで播種し、D-MEM High glucose, 10 % fetal bovine serum (FBS)中、37℃, 5% CO2雰囲気化で48時間インキュベートをした後に、化合物7を担持した蛍光性ナノ微粒子[10 nM の化合物7を担持したAO/PC SAM-QDs (AO/PC=1/16)]および化合物7とソラフェニブ誘導体を担持した蛍光性ナノ微粒子[10 nM の化合物7とソラフェニブ誘導体を担持したAO/PC SAM-QDs (AO/PC=1/8)]を添加してその後の24時間までの癌細胞生育過程を観察した。細胞は以下の方法で染色した後に蛍光顕微鏡にて観察した。培地を除去した後、細胞をOpti-MEMで3回洗浄後Lyso Tracker R Green DND-26 (200μl, 5 nM/Opti-MEM)を加えて37℃,5% CO2の条件下で30分インキュベートしてリソソームを染色した。その後Hoechest (2μl, 0.1 ng/μl/Opti-MEM)を加えて37℃,5% CO2雰囲気化でさらに15分間インキュベートして核を染色した後にOpti-MEMで3回洗浄してイメージングを行った（図２と図３）。
　いずれのナノ微粒子も共培養初期の段階からエンドソーム・リソソームにトラップされて24時間後においてもこのコンパートメントから脱出して細胞質内へ移動している様子は観察されなかった。
(b) 酵素阻害剤部位としてソラフェニブ誘導体、リガンド部位としてｃRGD誘導体を担持した蛍光性ナノ微粒子である本発明の複合体の抗腫瘍効果（肝癌細胞殺傷作用）
　Cell viability assayによる死細胞の定量：HepG2細胞（5×104/100μl/well）を37℃、5% CO2雰囲気化で24時間インキュベートした後にそれぞれ90μlの培地に対してQD-化合物7 (10～1000 nM, 10μl/milli Q), QD-化合物7/sorafeniv (10～1000 nM, 10μl/milli Q)および化合物7単独(10～1000 nM, 10μl/MilliQ)を加えて終濃度が1～100 nMとなるように調整した。共培養開始後48時間で培地成分により3回洗浄を行い、細胞培養液に対し10μlのCell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) を加えて37℃、5% CO2雰囲気化で1.5時間インキュベートし、450 nmでの吸光度を測定することで細胞の生存率を定量した。結果を図４に示す。
　図４に示す結果から、酵素阻害剤部位としてソラフェニブ誘導体、リガンド部位としてｃRGD誘導体を担持した蛍光性ナノ微粒子ある本発明の複合体のエンドサイトシス（receptor-mediated endocytosis）がソラフェニブの抗腫瘍活性を大幅に増強することが明らかとなった（IC50=33.4 nM → 6.0 nM）。ソラフェニブは本来HepG2細胞に対する単独投与でのIC50は数～数十μMとされ（ＷＯ２０１７／１３１２４２)、化合物7と共にナノ微粒子へ担持することで抗腫瘍効果は約1000倍（投与量は約1000分の1）に達したことになる。
参考文献
1）ＷＯ２０１７／１３１２４２
2）T. Ohyanagi, et. al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 12507-12517
3）R. S.Tan, et. al., ACS Chem. Biol. 2015, 10, 2073-2086
実施例３
酵素阻害剤部位としてソラフェニブ誘導体、リガンド部位としてSomatostatin-14誘導体を担持した蛍光性ナノ微粒子ある本発明の複合体の合成法
（１）Somatostatin-14誘導体の合成
　一般式（Ｌ６）で示されるリガンド前駆体に相当するSomatostatin-14誘導体(12)の合成法を以下に説明する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000096
(1-1) Linear型Somatostatin-14誘導体 (11) の合成法
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000097
　ペプチド固相合成は、固相担体としてTrityl ChemMatrix樹脂 (0.3 mmol/g, 30μmol)を用いた。カルボキシ末端 (C末端) のFmocアミノ酸誘導体 (Fmoc-Cys(Trt)-OH) の導入は、既報 (W. C. Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, 2000) を参考にして行った。アミノ酸伸長反応は、マイクロ波照射 (40 W、2450 MHz、50℃) の条件下、Fmocアミノ酸誘導体もしくは5-oxohexanoic acid (120μmol, 4当量)、1-[bis(dimethylamino)methyliumyl]-1H-benzotriazole-3-oxide hexafluorophosphate (HBTU, 120μmol, 4当量)、1-hydroxybenzotriazole monohydrate (HOBt, 120μmol, 4当量)、N,N-diisopropylethylamine (DIEA, 180μmol, 6当量) のDMF溶液で10分間反応させ行った。次に、無水酢酸/DIEA/DMF = 10/5/85 (v/v/v) 溶液で室温下1分間処理して未反応のアミノ基のアセチル化を実施した。続いて、マイクロ波照射 (40 W、2450 MHz、50℃) の条件下、20%ピペリジン/ DMF溶液で3分間処理してFmoc基を脱保護した。ペプチドの合成は、これら3工程 (1) 各種Fmocアミノ酸による伸長、(2) アセチル化処理、(3) 脱Fmoc化を順次繰り返して行った。合成したペプチドは、2,2,2-trifluoroacetic acid (TFA)/phenol/H2O/thioanisole/1-dodecanethiol = 82.5/5/5/5/2.5 (v/v/v/v/v) を用いて2時間室温で撹拌し、樹脂から切り出した。反応液を濾過し溶媒を留去した後、得られた残渣にt-ブチルメチルエーテルを加え目的物を沈殿させ、粗結晶を得た。その後、粗生成物を逆相高速液体クロマトグラフィー (HPLC) [A液: 0.1% TFA水溶液、B液: 0.1% TFA/アセトニトリル(ACN)、グラジエントA:B = 75:25 (0 min) → 55:45 (30 min)、 Liner gradient]で精製し、凍結乾燥粉末として化合物11 (22.9 mg, 13.1μmol, 収率44%) を得た。
化合物11: Analytical RP-HPLC: tR = 19.42 min. MALDI-TOF MS: C82H114N18O21S2 [M + H]+calcd (m/z) 1751.7926, found (m/z) 1751.824.
　化合物11のAnalytical RP-HPLC およびMALDI-TOF MS (High Resolution, Positive Mode) は、図５で示す通りである。NMRデータ (1H NMR: 600 MHz (1D), DMSO-d6. 13C NMR: 150 MHz (HSQC), DMSO-d6)は以下の表に示す。 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000098
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000099
(1-2) Somatostatin-14誘導体 (12) の合成法
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000100
　化合物12の合成は、既報 (S. A. Mitchell et al., J. Org. Chem. 2001, 66, 2327-2342) を参考にして、化合物11を用いて行った。詳細を以下に示す。化合物11 (3.5μmol, 6.1 mg) を6 mL H2O に溶解させ、1 M アンモニア水溶液を用いてpH 8.5に調製した。また、フェリシアン化カリウム (8.8μmol, 2.9 mg, 2.5当量) を30 mL H2Oに溶解させたものを別途調製した。次に、調製したペプチド溶液をフェリシアン化カリウム水溶液中に滴下し、一晩室温にて撹拌した後、1M 酢酸水溶液でpH 4.0に調製し、反応を停止させた。その後、溶液を弱塩基型イオン交換樹脂 (DEAE Sephadex) に通し、残存するフェリシアン化カリウムを取り除いた。得られた溶液を凍結乾燥した後、逆相HPLC [A液: 0.1% TFA水溶液、B液: 0.1% TFA/ACN、グラジエントA:B = 75:25 (0 min) → 55:45 (30 min)、 Liner gradient]で精製し、凍結乾燥粉末として化合物12 (2.6 mg, 収率43%) を得た。
化合物12: Analytical RP-HPLC: tR= 17.41 min. MALDI-TOF MS: C82H112N18O21S2[M + H]+ calcd (m/z) 1749.7769, found (m/z) 1749.802.
　化合物12のAnalytical RP-HPLC およびMALDI-TOF MS (High Resolution, Positive Mode) は、図６で示す通りである。NMRデータ (1H NMR: 600 MHz (1D), D2O. 13C NMR: 150 MHz (HSQC), D2O)は以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000101
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000102
（２）化合物12又は化合物13、化合物12および化合物13を担持した蛍光性ナノ微粒子の作製法
　一般式（Ｌ６）で示されるリガンド前駆体に相当するソマトスタチン化合物12と一般式（Ｅ１）で示される酵素阻害剤前駆体に相当するケトンリンカー修飾ソラフェニブ誘導体(13)を蛍光性ナノ微粒子に担持して、本発明の複合体を調製した。ケトンリンカー修飾ソラフェニブ誘導体(13)は、実施例1で使用したケトンリンカー修飾ソラフェニブ誘導体と同一化合物であり、ＷＯ２０１７／１３１２４２に記載の化合物32に相当する([化47]の合成スキーム参照)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000103
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000104
　既報（T. Ohyanagi, et al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 12057-12517）に従い、TOPO-QDs（1 μM, 50 μL/octane)に対しMeOH (50μL)、i-PrOH (100μL)を加えて遠心によりナノ微粒子を沈殿させ、溶媒を取り除き再びヘキサン(50μL)を加えて分散させた。その後、予め酸性条件で脱保護した活性化済みのアミノオキシリンカー (1.25 mM または2.5 mM, 10μL /Milli Q)、ホスホリルコリンリンカー (100 mM, 8μlまたは10μL/MeOH)、NaBH4 (1μl, 12 wt % in 14 N NaOH)、およびmilli Q (31μL)を加えた。30分間撹拌することにより配位子交換を行い、反応性ナノ微粒子AO/PC SAM-QDs (AO/PC=1/32, 1/20, 1/16)および(AO/PC=1/16)を調製した。限外濾過(YM 50)により精製した後、化合物12、化合物13および化合物12と13(比率1:1)とのカップリングを行った(上記スキーム参照)。図７のMALDI-TOF MSに示すとおり、反応はスムーズに進行し全てのアミノオキシ基の化合物12および化合物13との置換反応が確認できた。
実施例４
(1) 化合物12を担持した蛍光性ナノ微粒子（参考例）および化合物12と13を担持した蛍光性ナノ微粒子（本発明の複合体）の抗腫瘍効果（肝ガン細胞増殖抑制効果）
　細胞内イメージング：ヒト肝ガン細胞（HepG2, P12, ATCCより入手）をポリリジン溶液(0.001 %, 100μL/well/Milli Q)によって基盤表面をコートしたガラス基板のウェルプレートに対して5000 cell/200μl/wellで播種した。D-MEM High glucose, 10 % fetal bovine serum (FBS)中、37℃, 5% CO2雰囲気化で48時間インキュベートをした後に、化合物2を担持した蛍光性ナノ微粒子 [10 nM の化合物12担持型AO/PC SAM-QDs (AO/PC=1/20)]および化合物12と13を担持した蛍光性ナノ微粒子[10 nM の化合物12と13担持型AO/PC SAM-QDs (AO/PC=1/16)]を添加した。添加後から24時間までの細胞生育過程を蛍光イメージングにより観察した。細胞は以下の方法で染色した後に蛍光顕微鏡にて観察した。培地を除去した後、細胞をOpti-MEMで3回洗浄後Lyso Tracker(R) Green DND-26 (200μL, 5 nM/Opti-MEM)を加えて37℃, 5% CO2の条件下で30分インキュベートしてリソソームを染色した。その後Hoechest 33342 (2μL, 0.1 ng/μL/Opti-MEM)を加えて37℃, 5% CO2雰囲気化でさらに15分間インキュベートして核を染色した後にOpti-MEMで3回洗浄してイメージングを行った（図８及び９）。
(2) 化合物12を担持した蛍光性ナノ微粒子（参考例）および化合物12と13を担持した蛍光性ナノ微粒子（本発明の複合体）の抗腫瘍効果（肝ガン細胞殺傷作用）
 Cell viability assayによる死細胞の定量：HepG2細胞（5×103 cells/100μL/well）を37℃、5% CO2雰囲気化で24時間インキュベートした後それぞれ90μLの培地に対してQD anchored 13 (1000～10 nM, 10μL/Milli Q), QD anchored 12/13 (1000～10 nM, 10μL/Milli Q)を加えて終濃度が 100 ～1 nMとなるように調製した溶液を添加した。培養開始後48時間で培地により3回洗浄を行い、細胞培養液100μLに対し10μlのCell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) を加えて37℃、5% CO2雰囲気化で3時間インキュベートし450 nmでの吸光度を測定することで細胞の生存率を測定した。(図１０)
　図１０に示す結果から、ソラフェニブとSomatostatin-14を担持したQD anchored 12/13は、Somatostatin-14のみを担持したQD anchored 13に比べて、低濃度での細胞殺傷作用の増強効果が見られた。
　尚、上記と同様の条件で潘種、インキュベートをしたHepG2細胞に対しそれぞれ90μLの培地に対してQD anchored 12 (1000～10 nM, 10μL/Milli Q)および化合物12(1000～10 nM, 10μL/Milli Q)を加えて終濃度が 100 ～1 nMとなるように調製した溶液を添加した。培養開始後96時間で培地により3回洗浄を行い、細胞培養液100μLに対し10μlのCell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) を加えて37℃、5% CO2雰囲気化で1.5時間インキュベートし450 nmでの吸光度を測定することで細胞の生存率を測定した。(図１１)
　化合物12 (Somatostatin-14)は、QDに固定化するだけでは何らの細胞殺傷作用も示さなかった。
実施例５
(1) 化合物Ｌ８－１を担持した蛍光性ナノ微粒子（参考例）および化合物Ｌ８－１と13を担持した蛍光性ナノ微粒子（本発明の複合体（４０））の 合成
化合物12に代えて、一般式（Ｌ６）で示されるリガンド前駆体に相当する糖残基含有化合物Ｌ８－１（公知化合物）を用いたこと以外は、実施例３（２）と同様に、化合物Ｌ８－１と一般式（Ｅ１）で示される酵素阻害剤前駆体に相当するケトンリンカー修飾ソラフェニブ誘導体(13)を蛍光性ナノ微粒子に担持して、本発明の複合体（４０）を調製した。ケトンリンカー修飾ソラフェニブ誘導体(13)は、実施例1で使用したケトンリンカー修飾ソラフェニブ誘導体と同一化合物であり、ＷＯ２０１７／１３１２４２に記載の化合物32に相当する([化47]の合成スキーム参照)。
　既報（T. Ohyanagi, et al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 12057-12517）に従い、TOPO-QDs（1 μM, 50 μL/octane)に対しMeOH (50μL)、i-PrOH (100μL)を加えて遠心によりナノ微粒子を沈殿させ、溶媒を取り除き再びヘキサン(50μL)を加えて分散させた。その後、予め酸性条件で脱保護した活性化済みのアミノオキシリンカー (1.25 mM または2.5 mM, 10μL /Milli Q)、ホスホリルコリンリンカー (100 mM, 8μlまたは10μL/MeOH)、NaBH4 (1μl, 12 wt % in 14 N NaOH)、およびmilli Q (31μL)を加えた。30分間撹拌することにより配位子交換を行い、反応性ナノ微粒子AO/PC SAM-QDs (AO/PC=1/16)を調製した。限外濾過(YM 50)により精製した後、化合物13または化合物Ｌ８－１と13(比率7:1)とのカップリングを行った。化合物13とのカップリングにより化合物13を担持したナノ微粒子(50)を得、化合物Ｌ８－１と13(比率7:1)とのカップリングにより化合物Ｌ８－１と化合物13を担持したナノ微粒子(40)を得得た。
ナノ微粒子(40)については、図１２のMALDI-TOF MSに示すとおり、m/z 907.540に未反応AO由来のシグナルが見られず、反応はスムーズに進行し全てのアミノオキシ基の化合物Ｌ８－１および化合物13との置換反応が確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000105
参考例Ａ
細胞への取り込み確認実験
下記複合体（５０）を用いた。複合体（５０）は、ＷＯ２０１７／１３１２４２Ａ１の実施例１（２）に記載の方法で調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000106
ＨｅｐＧ２細胞を１０％ＦＢＳ添加培地に懸濁し、５×１０４細胞／ウェルの播種密度で８ウェルプレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェルにプレーティングした。細胞を、5％CO2の加湿インキュベーター中、３７℃で一晩接着させた。ＨｅｐＧ２細胞はクラスリン依存性エンドサイトシスにて糖鎖をリガンドとして取り込むことが知られている。異なるエンドサイトシス阻害条件で複合体（５０）と2時間共インキュベートした後の細胞取り込みの画像を、以下のように蛍光顕微鏡により観察した：（a）対照エンドサイトシス実験：10％FBS添加培地中、5％CO2の加湿インキュベーター内で37℃、2時間、10nM 複合体（５０）とインキュベートし、続いてHoechst 33342（2 μl、1 ng / μl / Opti-MEM）で核染色し、かつ60倍レンズを装備したオールインワン蛍光顕微鏡BIOREV BZ-9000シリーズジェネレーションII（キーエンス、大阪、日本）で蛍光画像を撮影した細胞。(b)ＧｌｃＮＡｃを添加したエンドサイトシス実験：5％CO2の加湿インキュベーター中、１０％ＦＢＳおよび１０ｍＭ ＧｌｃＮＡｃを添加した培地中、１０ｎＭ複合体（５０）と共に２時間インキュベートし、その後Hoechst 33342（2 μl、1 ng / μl / Opti-MEM）で核染色した、かつ蛍光画像をオールインワン蛍光顕微鏡によって撮影した細胞。(c)Ｋ＋デプリーション処理：Ｋ＋除去ＨＥＰＥＳ緩衝液（１４０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌのＤ－グルコース）中、5％CO2の加湿インキュベーター内で37℃、1時間、細胞をプレインキュベートすることによってＫ＋のデプリーション（depletion）を行った。細胞をＫ＋を含まないHEPES緩衝液で素早く洗浄した。 Ｋ＋デプリーション処理後、細胞を5％CO2の加湿インキュベーター中、３７℃で２時間、Ｋ＋を含まないＨＥＰＥＳ緩衝液中で１０ｎＭの複合体（５０）と共にインキュベートし、続いてHoechst 33342（2 μl、1 ng / μl / Opti-MEM）で核染色し、および蛍光画像をオールインワン蛍光顕微鏡によって撮影した。各蛍光画像を図１３に示す。
図１３に示す結果から、複合体（５０）が、糖鎖リガンドと受容体との結合を介したエンドサイトシスでＨｅｐＧ２細胞に取り込まれることが分かる。（１）図１３ａでは複合体（５０）がエンドサイトシスで取り込まれること。（２）図１３ｂでは、ＧｌｕＮＡｃ共存下では、複合体（５０）の取り込みが減少する（複合体（５０）の末端にＧｌｕＮＡｃがあり、この部分（糖鎖）と細胞の受容体との結合が競争阻害された結果と推察される。）（３）カリウムを除いた培地で細胞は、エンドサイトシスをできないことが知られている。図１３ｃでは、細胞の表面にのみ微粒子が集積しエンドサイトシスにより細胞内に取り込まれていない結果となった。これらの結果より、ＧｌｕＮＡｃを有する複合体（５０）は、ＧｌｕＮＡｃが糖鎖リガンドとして機能し、その後に、クラスリン依存性エンドサイトシスにてナノ粒子が細胞内に取り込まれることが分かる。
実施例６
抗腫瘍効果（肝ガン細胞増殖抑制効果）
Cell viability assayによる死細胞の定量：HepG2細胞（5×103 cells/100μL/well）を37℃、5% CO2雰囲気化で24時間インキュベートした後それぞれ90μLの培地に対してQD anchored 13 (1000～10 nM, 10μL/Milli Q), QD anchored L8-1/13 （本発明の複合体（４０））(1000～10 nM, 10μL/Milli Q)を加えて終濃度が 100 ～5 nMとなるように調製した溶液を添加した。培養開始後48時間で培地により3回洗浄を行い、細胞培養液100μLに対し10μlのCell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) を加えて37℃、5% CO2雰囲気化で3時間インキュベートし450 nmでの吸光度を測定することで細胞の生存率を測定した。(図１４)
　図１４に示す結果から、ソラフェニブと糖残基としてグルコサミン（ＧｌｕＮＡｃ）を担持したQD anchored L8-1/13は、ソラフェニブのみを担持したQD anchored 13に比べて、低濃度での細胞殺傷作用の増強効果が見られた。それぞれＩＣ５０（ｎＭ）は３４．１及び７．２であった。ソラフェニブの効果が、糖鎖リガンドとの組み合わせで、ＩＣ５０で１／５となる効果が得られた。
参考例Ｂ
本発明のナノ微粒子はリン脂質疑似物質基を表面に有するがＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を表面に有する粒子が知られていることから、リン脂質被覆とＰＥＧ被覆との効果を比較した。図１６に示す写真は、ＰＣリンカー（リン脂質疑似物質基）とＰＥＧリンカーとからなる混合ＳＡＭによって被覆されたナノ粒子（ＱＤ６５５）の１００％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）における挙動を表す。ＰＥＧリンカーのＳＡＭ(Self Assembled Monolayer （自己組織化膜）)によって被覆されたナノ粒子（ＰＥＧ ／ ＰＣ ＝ １００ ／ ０）のみが赤い矢印で示されているように大規模な凝集を形成した。 ＦＣＳ(Fluorescence Correlation Spectrometry （蛍光相関スペクトル）)分析は、１００％ＦＢＳ中のこれらのナノ粒子の蛍光変動を示す。 自己相関曲線は一成分拡散モデルを用いて適合させた。図１５に示す実験結果は、リン脂質被覆により血球の蛋白質による凝集が抑えられる。リガンド導入の効果は、ナノ粒子が細胞と接してはじめて生じる効果である。リン脂質被覆した微粒子は血中で安定に存在できることから、リガンド導入の効果が得られることが予測できる。即ち、本発明におけるリガンド－受容体の結合により得られる効果は、リン脂質被覆において効率的に生じることが分かる。
　本発明は、抗ガン剤に関連する分野において有用である。
　配列番号１～１１は、リガンドのアミノ酸配列である。

Claims (20)

  1. （１）ナノ粒子、（２）前記ナノ粒子の表面に担持された下記一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基、（３）前記ナノ粒子の表面に担持された下記一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基、及び（４）前記ナノ粒子の表面に担持された下記一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質基を含む複合体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （一般式（Ａ）中、ｎ１は２～３０の整数であり、ｎ２は２～３０の整数であり、－Ｓ－末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ１０は酵素阻害剤含有部位である。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （一般式（Ｌ１）中、ｎ１は２～３０の整数であり、ｎ２は２～３０の整数であり、－Ｓ－末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ２０は細胞表面受容体に対して結合性を有するリガンド部位を含む。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （一般式（Ｂ）中、ｎ３は２～３０の範囲の整数であり、－Ｓ－末端がナノ粒子担持部位である。）
  2. 一般式（Ａ）中のＲ１０＝Ｎ－Ｏ－は下記一般式（Ａ１）で示され、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （一般式（Ａ１）中、ＥＩＨは、酵素阻害剤部位であり、酵素阻害剤部位は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する自殺基質部位、又はキナーゼと反応性を有するキナーゼ阻害部位であり、ＬＫはリンカー部位である。）
    一般式（Ｌ１）中のＲ２０＝Ｎ－Ｏ－は下記一般式（Ｌ２）で示される請求項１に記載の複合体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     （一般式（Ｌ２）中、ＬＤはリガンド部位であり、ＬＫはリンカー部位である。）
  3. 一般式（Ａ）中のＲ１０＝Ｎ－Ｏ－は下記一般式（Ａ２）又は（Ａ３）で示され、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     （一般式（Ａ２）中、ｍ２は１～１０の整数であり、ＥＩＨは酵素阻害剤部位であり、酵素阻害剤部位は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する自殺基質部位、又はキナーゼと反応性を有するキナーゼ阻害部位である。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     （一般式（Ａ３）中、ｍ４は１～１０の整数であり、ＥＩＨは一般式（Ａ２）と同義である。）
    かつ
    一般式（Ｌ１）中のＲ２０＝Ｎ－Ｏ－は下記一般式（Ｌ３）又は（Ｌ４）で示される請求項１に記載の複合体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     （一般式（Ｌ３）中、ｍ１は１～１０の整数であり、ｍ２は１～１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     （一般式（Ｌ４）中、ｍ３は１～１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。）
  4. 前記リガンド部位は、インテグリン、ソマトスタチンガン細胞受容体又は糖鎖受容体に対するリガンド部位である請求項１～３のいずれかに記載の複合体。
  5. インテグリンに対するリガンド部位は、細胞接着性タンパク質、細胞外マトリックス分子、フィブロネクチン、ラミニン若しくはその断片、コラーゲン若しくはその断片、又は白血球若しくはその断片を含む、請求項４に記載の複合体。
  6. ソマトスタチンガン細胞受容体に対するリガンド部位は、１４アミノ酸型ソマトスタチン、２８アミノ酸型ソマトスタチン、オクトレオチド、ランレオチド、パシレオチド又はそれらのアナログ体を含む、請求項４に記載の複合体。
  7. 一般式（Ａ）で示されるリソソーム酵素阻害剤又はキナーゼ阻害剤と一般式（Ｂ）で示されるリン脂質疑似物質のモル比率が１：１００～１０：１の範囲であり、一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基と一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基のモル比率が１０：１～１：１０の範囲である、請求項１～６のいずれかに記載の複合体。
  8. 前記ナノ粒子は、金属ナノ粒子又は半導体ナノ粒子である、請求項１～７のいずれかに記載の複合体。
  9. 前記ナノ粒子は、粒子径が０．１～１００ｎｍの範囲である請求項１～８のいずれかに記載の複合体。
  10. 請求項１～９のいずれかに記載の複合体を有効成分として含有する抗ガン剤。
  11. 前記抗ガン剤は、乳癌、前立腺癌、肝細胞癌、膵癌、大腸癌、卵巣癌、腎癌、肺癌、または脳腫瘍に対する抗ガン剤である請求項１０に記載の抗ガン剤。
  12. 請求項１～９のいずれかに記載の複合体の製造方法であって、
    下記一般式（Ｃ）で示される架橋前駆体Ｘ及び下記一般式（Ｄ）で示されるリン脂質疑似物質前駆体とコロイド状ナノ粒子とを混合して、ナノ粒子の表面に架橋前駆体Ｘ及びリン脂質疑似物質を担持した表面修飾ナノ粒子を得る工程（１）、及び
    得られた表面修飾ナノ粒子に下記一般式（Ｅ）で示される酵素阻害剤前駆体Ｙ及び下記一般式（Ｌ５）で示されるリガンド前駆体ＰＬを混合して、前記表面修飾ナノ粒子上の架橋前駆体Ｘと連結させて下記一般式（Ａ）で示される酵素阻害剤含有基及び下記一般式（Ｌ１）で示されるリガンド含有基を形成して請求項１～９のいずれかに記載の複合体を得る工程（２）を含む前記方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     （一般式（Ｃ）中、ｎ１は２～３０の整数であり、ｎ２は２～３０の整数である。)
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
      (一般式（Ｄ）中、ｎ３は２～３０の範囲の整数である。)
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     （一般式（Ｅ）中、Ｒ１０は酵素阻害剤含有部位である。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
     （一般式（Ｌ５）中、Ｒ２０は細胞表面受容体に対して結合性を有するリガンド部位を含む。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
     （一般式（Ａ）中、ｎ１は２～３０の整数であり、ｎ２は２～３０の整数であり、－Ｓ－末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ１０は酵素阻害剤含有部位である。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
     （一般式（Ｌ１）中、ｎ１は２～３０の整数であり、ｎ２は２～３０の整数であり、－Ｓ－末端がナノ粒子担持部位であり、Ｒ２０は細胞表面受容体に対して結合性を有するリガンド部位を含む。）
  13. 一般式（Ｅ）で示される酵素阻害剤前駆体Ｙは、下記一般式（Ｅ１）で示され、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
      (一般式（Ｅ１）中、ＥＩＨは、酵素阻害剤部位であり、酵素阻害剤部位は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する自殺基質部位、又はキナーゼと反応性を有するキナーゼ阻害部位であり、ＬＫはリンカー部位である。）
    一般式（Ｌ５）で示されるリガンド前駆体ＰＬは、下記一般式（Ｌ６）で示される、請求項１２に記載の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
     （一般式（Ｌ６）中、ＬＤはリガンド部位であり、ＬＫはリンカー部位である。）
  14. 一般式（Ｌ５）で示されるリガンド前駆体ＰＬが、下記一般式（Ｌ７）又は（Ｌ８）で示される化合物である請求項１２に記載の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
     （一般式（Ｌ７）中、ｍ１は１～１０の整数であり、ｍ２は１～１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
     （一般式（Ｌ８）中、ｍ３は１～１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。）
  15. 一般式（Ｅ）で示される酵素阻害剤前駆体Ｙは、下記一般式（Ｅ２）又は（Ｅ３）で示される
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
     （一般式（Ｅ２）及び（Ｅ３）中、ＥＩＨは酵素阻害剤部位であり、酵素阻害剤部位は、リソソーム酵素の活性中心と反応性を有する自殺基質部位、又はキナーゼと反応性を有するキナーゼ阻害部位であり、ｍ２は１～１０の整数であり、ｍ４は１～１０の整数である。）請求項１３又は１４に記載の製造方法。
  16. 一般式（Ｌ６）で示されるリガンド前駆体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
     （一般式（Ｌ６）中、ＬＤはインテグリン、ソマトスタチンガン細胞受容体又は糖鎖受容体に対するリガンド部位である。
  17. 下記一般式（Ｌ７）又は（Ｌ８）で示されるリガンド前駆体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
     （一般式（Ｌ７）中、ｍ１は１～１０の整数であり、ｍ２は１～１０の整数であり、ＬＤはインテグリン、ソマトスタチンガン細胞受容体又は糖鎖受容体に対するリガンド部位である。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
     （一般式（Ｌ８）中、ｍ３は１～１０の整数であり、ＬＤはリガンド部位である。）
  18. 請求項１～９のいずれかに記載の複合体を調製する工程、および
    前記複合体を酵素阻害剤移送の対象である細胞、または前記細胞を含む生体に供給して、前記細胞に酵素阻害剤を取り込ませる工程
    を含む、酵素阻害剤の細胞への移送方法。
  19. 酵素阻害剤移送の対象である細胞が、ガン細胞である、請求項１８に記載の移送方法。
  20. 前記細胞を含む生体が哺乳動物（ヒトを含む、又は含まない）である、請求項１９に記載の移送方法。
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