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WO2019208688A1 - 生体移植用細胞シート及びその製造方法 - Google Patents

生体移植用細胞シート及びその製造方法 Download PDF

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WO2019208688A1
WO2019208688A1 PCT/JP2019/017594 JP2019017594W WO2019208688A1 WO 2019208688 A1 WO2019208688 A1 WO 2019208688A1 JP 2019017594 W JP2019017594 W JP 2019017594W WO 2019208688 A1 WO2019208688 A1 WO 2019208688A1
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WO
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cells
cell
msc
cell sheet
average
Prior art date
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PCT/JP2019/017594
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French (fr)
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貴子 千見寺
峯子 藤宮
悠城 齋藤
正子 中野
直人 小成
美穂 大谷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sapporo Medical University
Original Assignee
Sapporo Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to US17/049,867 priority patent/US12090251B2/en
Priority to JP2020515557A priority patent/JP7353652B2/ja
Priority to KR1020207033876A priority patent/KR102723986B1/ko
Priority to EP19793215.5A priority patent/EP3786280A4/en
Priority to CN201980027720.8A priority patent/CN112004922A/zh
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    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C12N2533/40—Polyhydroxyacids, e.g. polymers of glycolic or lactic acid (PGA, PLA, PLGA); Bioresorbable polymers

Definitions

  • the present invention relates to a cell sheet for use in living transplantation and a method for producing the same.
  • Mesenchymal stem cells are stem cells having pluripotency and self-renewal ability and differentiate into cells belonging to the mesenchymal system such as osteoblasts, chondrocytes, adipocytes, and muscle cells. In addition, neurons and hepatocytes have the ability to differentiate beyond germ layers. MSC is also known to have a paracrine effect and cell adhesion interaction due to humoral factors produced by itself. Based on these actions, MSCs are considered to exhibit the ability to repair and regenerate target tissues and cells and immune control ability such as anti-inflammation, and as a result, show therapeutic effects on various diseases.
  • MSC is easy to isolate and proliferate, has a strong proliferative capacity, can secure the number of cells that can be transplanted in a short period of time, can be autotransplanted without immune rejection, has few ethical problems, and has low immunogenicity Therefore, allotransplantation is realistic without requiring pretreatment, and therefore, as an ideal material for cell transplantation, application to treatment for various diseases is being studied.
  • kidney disease particularly chronic kidney disease.
  • Chronic kidney disease refers to a condition in which one or both of renal impairment typified by proteinuria and decreased renal function using glomerular filtration rate as an indicator has been sustained for 3 months or more.
  • One person is affected.
  • the symptoms of chronic kidney disease progress to end-stage renal failure, the effects of drug treatment cannot be expected, and many patients are forced to undergo dialysis.
  • artificial dialysis is a symptomatic treatment, patients suffering from chronic renal failure must continue to receive artificial dialysis throughout their lives, and the physical and economic burden on the patient is great. Furthermore, the increase in dialysis medical expenses has become a problem of concern in the medical economy.
  • the present inventors have confirmed that the MSC of a patient, for example, a diabetic patient, is an abnormal MSC.
  • the disease treatment effect is lost or the therapeutic effect is reduced compared to normal MSC, and the extract from the mammalian fetal appendage is said abnormal.
  • MSC can be activated to recover the therapeutic effect, and that autologous transplantation treatment using such activated MSC can be performed, and extracts from mammalian fetal appendages as active ingredients
  • An activator for the abnormal MSC contained was invented and a patent application was filed (Patent Document 1). This activator is particularly important in that it enables autologous transplantation of MSC even for patients in a stage where treatment is required.
  • An object of the present invention is to provide a new cell sheet for transplantation containing MSC having a high therapeutic effect.
  • the present inventors have found that a cell sheet of MSC having a high disease treatment effect can be produced by culturing MSC so as to have a specific low cell density on a specific culture carrier. Completed the invention.
  • a cell sheet for living transplantation having MSC having an average cell density of 3.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less on the surface thereof.
  • the cell sheet according to (1) further comprising a biocompatible support.
  • the support is a cell culture carrier having a three-dimensional structure composed of fibers.
  • the cell culture carrier has an opening formed on a contact surface with cells by fibers having an average fiber diameter of nanometer to micrometer unit.
  • the cell sheet according to (4), wherein the average diameter of the openings is 500 nm to 1000 ⁇ m.
  • (11) The cell sheet according to any one of (1) to (10), wherein the MSC is derived from bone marrow or adipose tissue.
  • (12) The cell sheet according to any one of (1) to (11), wherein the MSC is an MSC separated from a subject having a disease.
  • a method for producing a cell sheet for living transplantation comprising a step of preparing a cell sheet of 0.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less.
  • the cell culture carrier has an opening formed on a contact surface with a cell by a fiber having an average fiber diameter of nanometer to micrometer unit.
  • the average diameter of the openings is 500 nm to 1000 ⁇ m.
  • the cell culture carrier is a cell culture carrier containing nanofibers made of a biodegradable polymer.
  • the MSC is derived from bone marrow or adipose tissue.
  • the MSC is MSC isolated from a subject having a disease.
  • a cell sheet having a high therapeutic effect can be produced, and the number of MSC cells required in MSC transplantation therapy can be greatly reduced as compared with the conventional case.
  • FIG. 6 is a diagram showing the result of cluster analysis of a gene expression profile of -MSC). It is a graph which shows transition of the serum creatinine of the diabetic nephropathy rat after anticancer agent treatment which administered Vehicle or transplanted the cell sheet. It is a graph which shows transition of the survival rate to 11 weeks after the transplantation of the diabetic nephropathy rat which administered the vehicle or transplanted the cell sheet after the anticancer agent treatment.
  • the thick line shows the average value of each group, and the thin line shows the 95% CI (confidence interval) of each group.
  • a glomerulus is shown.
  • Tubules are shown.
  • the first aspect of the present invention is a cell sheet for living body transplanting having an MSC having an average cell density of 3.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less on its surface (hereinafter simply referred to as a cell sheet). About.
  • the cell sheet has MSC (MSC population) having an average cell density of 3.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less on the surface thereof.
  • the average cell density of the MSC is an arithmetic average value of the number of cells of the MSC per unit area of the cell sheet.
  • the number of MSCs confirmed by observing the surface of the cell sheet with a microscope or the like is counted, and the total number is counted as a cell. It can be calculated by dividing by the area of the entire sheet, or by observing the surface of the cell sheet with a microscope or the like and counting the number of MSCs per unit area.
  • the average cell density of MSCs existing on the cell sheet surface may be 3.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less, for example, 0.1 ⁇ 10 3 cells / cm 2 to 3.0 ⁇ 10. 4 cells / cm 2 , 0.1 ⁇ 10 3 cells / cm 2 to 2.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , 0.1 ⁇ 10 3 cells / cm 2 to 1.5 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , 0.1 ⁇ 10 3 cells / cm 2 to 1.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , 0.1 ⁇ 10 3 cells / cm 2 to 0.5 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , 0.3 ⁇ 10 3 Cells / cm 2 to 3.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , 0.5 ⁇ 10 3 cells / cm 2 to 3.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , 1.0 ⁇ 10 3 cells / cm 2 to 3 0.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , 3.0 ⁇ 10 3 cells / cm 2 to 3.0 ⁇ 10 ⁇ 10
  • the average cell density of MSC on the cell sheet surface is preferably 0.5 ⁇ 10 3 to 3.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , more preferably 0.5 ⁇ 10 3 to 2.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 . cm 2 , still more preferably 2.0 ⁇ 10 3 cells / cm 2 to 2.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , still more preferably 2.0 ⁇ 10 3 cells / cm 2 to 1.8 ⁇ 10 4 cells / Cm 2 , still more preferably 3.0 ⁇ 10 3 cells / cm 2 to 1.6 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , more preferably 3.0 ⁇ 10 3 cells / cm 2 to 1.0 ⁇ 10 4 Cells / cm 2 , particularly preferably 3.0 ⁇ 10 3 cells / cm 2 to 8.0 ⁇ 10 3 cells / cm 2 .
  • the average cell density can also be expressed by the occupancy (confluence) of MSC on the cell sheet surface.
  • Confluent or 100% confluent is a state in which the cell sheet surface is completely covered with MSC, and the MSCs are in close contact with each other.
  • the relative cell density relative to this is% confluent, and can be calculated by dividing the total area occupied by the MSCs on the cell sheet surface by the area of the entire sheet.
  • an average cell density of 2.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 corresponds to 60% confluence.
  • an average cell density of 1.0 ⁇ 10 3 to 2.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 is 10 to 60% confluent, 1.0 ⁇ 10 3 cells / cm 2 to 1.6 ⁇ 10 4 cells / cm 2.
  • cm 2 is 10-50% confluent
  • 1.0 ⁇ 10 3 cells / cm 2 to 1.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 is 10-40% confluent
  • 1.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 corresponds to 20-40% confluence
  • 3.0 ⁇ 10 3 cells / cm 2 to 8.0 ⁇ 10 3 cells / cm 2 correspond to 20-35% confluence.
  • the cell sheet of the present invention having MSC having an average cell density of 2.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less on the surface thereof is expressed as a cell sheet having MSC having a cell density of 60% or less on the surface thereof. You can also.
  • the cell sheet of the present invention has an MSC having a cell density of 10-60% confluent, 10-50% confluent, 10-40% confluent, 20-40% confluent, 20-35% confluent on its surface. Have.
  • the cell sheet may contain cells other than the MSC as long as it has MSC having an average cell density of 3.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less on its surface.
  • the cells other than the MSC may be cells derived from a tissue that is a source of MSC separation, or may be a cell added with the expectation of a preferable effect in combination with the MSC.
  • the latter cells are, for example, vascular endothelial cells, fibroblasts, epithelial cells, etc., and are appropriately selected according to the disease to be treated and the site to be transplanted.
  • One example of the cell sheet of the present invention is a sheet in which MSCs adhere to each other via an extracellular matrix produced by MSC itself or an extracellular matrix added to a medium during culture.
  • the cell sheet of the present invention is a cell sheet further including a biocompatible support.
  • the cell sheet may be a combination of an MSC and a support bonded to each other via an extracellular matrix, or an MSC cell body in which the MSC adheres to the surface of the sheet-shaped support.
  • the support and the MSC may be integrated, for example, partially or entirely embedded in a depression or opening on the surface of the support.
  • the cell sheet “having MSC on its surface” in the present invention includes one in which a part or the whole of the MSC cell body is buried in a recess or an opening in the surface of the support, as one aspect thereof.
  • the cell sheet of the present invention is in a state in which MSCs are adhered to each other via an extracellular matrix or integrated with a support, and MSC is simply seeded thereon for cell culture. A distinction is only made from culture carriers.
  • the support included in the cell sheet of the present invention may be in the form of a sheet composed of a biocompatible material, and the shape and size thereof can be used as long as they can be easily handled during subsequent transplantation into the living body. There is no restriction on the sheath thickness.
  • biocompatible materials include polymer compounds such as polyfluorinated ethylene and polystyrene, inorganic compounds such as silica, biodegradable polymers, and the like, with biodegradable polymers being preferred.
  • biodegradable polymers include the above-mentioned copolymers such as polyglycolic acid, polylactic acid, polyethylene glycol, polycaprolactone, polydioxanone, and other lactic acid-glycolic acid copolymers for synthetic polymer materials; ⁇ -phosphorus for inorganic materials
  • natural polymer materials include collagen, gelatin, alginic acid, hyaluronic acid, agarose, chitosan, fibrin, fibroin, chitin, cellulose, and silk.
  • a preferred example of the support contained in the cell sheet of the present invention is a sheet-like cell culture carrier having a three-dimensional structure made of fibers.
  • a sheet-like three-dimensional culture carrier composed of fibers having an average fiber diameter of nanometer (nm) to micrometer ( ⁇ m) units is preferable.
  • a cell culture carrier or a culture carrier is a carrier used as a scaffold to which cells adhere, used in cell culture.
  • the “average fiber diameter” is an arithmetic operation of the fiber diameter measured as a length in a direction perpendicular to the fiber length direction when the culture support is observed from the cell adhesion surface side, typically from above. Mean value.
  • the average in this specification means a number average.
  • a three-dimensional culture carrier comprising fibers having an average fiber diameter of nanometer (nm) to micrometer ( ⁇ m) units, and having an opening formed on a surface in contact with cells by the fiber
  • the “opening” refers to a depression formed on the contact surface of the carrier with the cells, which is formed by the fiber.
  • the average diameter of the opening means the average value of the diameter of the figure with the outline of the fiber, which is recognized when the culture carrier is observed from above when the fibers are in contact with each other.
  • the figure diameter is the arithmetic mean of the diagonal length from each vertex when the figure is a polygon, the diameter when the figure is circular, and the diameter when the figure is an ellipse or similar shape. Corresponds to the major axis.
  • the average diameter of the opening means an average flow hole diameter obtained by a method prescribed in ASTM-F316, which is obtained by using, for example, a porometer (manufactured by Coulter, Inc.). It can be measured by the mean flow point method.
  • the average fiber diameter of the fibers constituting the three-dimensional culture carrier can be in the range of nm to ⁇ m, preferably 10 nm to 500 ⁇ m, more preferably 10 nm to 300 ⁇ m.
  • the average fiber diameter is, for example, in the range of 10 nm to 1 ⁇ m, 100 nm to 1 ⁇ m, 500 nm to 1 ⁇ m, 1 ⁇ m to 10 ⁇ m, 1 ⁇ m to 100 ⁇ m, 1 ⁇ m to 300 ⁇ m, or 1 ⁇ m to 500 ⁇ m, preferably 10 nm to 1 ⁇ m. It may be in the range of 1 ⁇ m to 10 ⁇ m or 10 ⁇ m to 300 ⁇ m. In the present invention, fibers generally called nanofibers can also be used.
  • the average diameter of the opening may be 500 nm to 1000 ⁇ m, preferably 700 nm to 600 ⁇ m, more preferably 900 nm to 400 ⁇ m.
  • the average diameter of the openings is in the range of, for example, 500 nm to 100 ⁇ m, 5 ⁇ m to 100 ⁇ m, 10 ⁇ m to 100 ⁇ m, 20 ⁇ m to 100 ⁇ m, 100 ⁇ m to 200 ⁇ m, 100 ⁇ m to 400 ⁇ m, or 100 ⁇ m to 600 ⁇ m, preferably 500 nm. It suffices to be in the range of 100 ⁇ m or 100 ⁇ m to 400 ⁇ m.
  • the three-dimensional culture carrier has a porosity of 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 75% or more, and particularly preferably 80% or more.
  • the average area of the openings of the three-dimensional culture carrier is 0.1 to 100 ⁇ m 2 , preferably 0.2 to 60 ⁇ m 2 , more preferably 0.5 to 30 ⁇ m 2 .
  • the opening area corresponds to the hole area.
  • the three-dimensional culture carrier has a structure in which fibers are three-dimensionally integrated, that is, fibers are stacked in a three-dimensional direction, and the arrangement of the fibers may or may not be regular. It may or may not be bonded.
  • the three-dimensional culture carrier is not particularly limited as long as it has a three-dimensional structure composed of fibers on the cell adhesion surface, and has a part that does not adhere to cells, typically a base member under the three-dimensional structure composed of fibers. It may be.
  • the base member may be any structure as long as it can support the three-dimensional structure, and may be, for example, a nonwoven fabric, a knitted fabric, a woven fabric, a porous scaffold material, or the like.
  • the three-dimensional culture carrier used as a support may be in the form of a sheet composed of a biocompatible material, as long as it can be easily handled during cell culture and subsequent transplantation into the living body.
  • size, and thickness For example, the thing of the form which cannot be used for biological transplantation, such as what was shape
  • the cell adhesion surface in the three-dimensional culture carrier may be a portion having a three-dimensional structure whose main part is a fiber.
  • the culture carrier is observed from the cell adhesion surface side, typically from above. In this case, 50% or more of the area of the culture carrier may be occupied by a portion having a three-dimensional structure composed of fibers. Therefore, the three-dimensional culture carrier has a part of the cell adhesion surface that is not a “three-dimensional structure composed of fibers”, for example, a flat film-like part that does not have a three-dimensional structure, and the area of the part on the adhesion surface Can be included within a range of less than 50%, preferably less than 40%, and more preferably less than 30%.
  • Examples of the three-dimensional culture carrier usable in the present invention include VECELL (registered trademark) (polytetrafluoroethylene, average fiber diameter: ⁇ 1 ⁇ m, average pore area: 1 to 20 ⁇ m 2 , manufactured by Bethel Co., Ltd.
  • the cell sheet of the present invention can be locally administered to a living body by transplanting to a site where a disease is occurring in a living body, a site that may be generated or a site causing a disease, or the vicinity thereof.
  • Diseases in which cell transplantation therapy using MSC is effective such as diabetes and its complications, cerebrovascular disease, brain degenerative disease, demyelinating disease, functional seizure disease, dementia disease, peripheral nerve disease, cardiovascular disease , Autoimmune disease, liver / bile duct / pancreatic disease, stomach / duodenal disease, small intestine / colon disease, thyroid disease, blood / hematopoietic disease, lung disease, acute kidney injury and chronic kidney disease, eye disease, skin disease, muscle / Bone diseases, trauma and GVHD (graft versus host disease) can be treated and / or prevented.
  • diseases in which cell transplantation therapy using MSC such as diabetes and its complications, cerebrovascular disease, brain degenerative disease, demyelinating disease, functional seizure disease
  • diseases that can be treated and / or prevented by local administration of cell sheets include type 1 diabetes and type 2 diabetes and their complications such as diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, diabetic Neuropathy, diabetic gangrene, etc .; cerebrovascular diseases such as stroke (cerebral infarction and cerebral hemorrhage), Parkinson's disease, Huntington's disease, basal ganglia degeneration, multisystem atrophy, spinocerebellar degeneration, amyotrophic lateral sclerosis Degenerative diseases such as multiple sclerosis, acute disseminated encephalomyelitis, optic neuromyelitis; functional seizure diseases such as epilepsy and cerebral palsy; vascular dementia, Alzheimer's disease, small Levy Dementia such as somatic dementia, frontotemporal dementia, diabetic dementia; Guillain-Barre syndrome, peripheral neuropathy, facial paralysis, trigeminal neuralgia, dysuria, erectile dysfunction, autonomic ataxia Peripheral
  • the disease to which the cell sheet of the present invention is applied is preferably diabetic nephropathy, acute kidney injury, chronic kidney disease, diabetic retinopathy, diabetic neuropathy, diabetic gangrene, Alzheimer's disease, diabetic dementia Rheumatoid arthritis, polymyositis and wounds.
  • Treatment and / or prevention as used herein includes all medically acceptable types of therapeutic and / or prophylactic interventions intended to cure, temporarily ameliorate, prevent, etc. a disease or condition. . That is, treatment and / or prevention of a disease or symptom is medically acceptable for various purposes, including delaying or stopping the progression of the disease or symptom, regression or disappearance of a lesion, prevention of onset or prevention of recurrence, etc. Includes intervention.
  • an effective amount of the cell sheet of the present invention is locally administered to a subject.
  • “effective amount” means an amount effective for treating and / or preventing a disease. Such an effective amount is appropriately adjusted according to the type of disease, the organ or tissue administered locally, the severity of symptoms, the patient and other medical factors.
  • the effective amount of the cell sheet is from 10 2 cells to 10 9 cells, preferably from 10 4 cells to 10 6 cells per kg body weight of the individual administered in terms of the number of MSCs contained in the sheet. is there.
  • the average cell density for use in the treatment of kidney disease is 1.0 ⁇ 10 3 cells / cm 2 to 3.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , preferably 2.0 ⁇ 10 3 cells / cm 2 to 3.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , more preferably 2.0 ⁇ 10 3 cells / cm 2 to 2.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , more preferably 2.0 ⁇ 10 3 cells / cm 2 to 1.8 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , still more preferably 3.0 ⁇ 10 3 cells / cm 2 to 1.6 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , even more preferable 3.0 ⁇ 10 3 cells / cm 2 to 1.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , particularly preferably 3.0 ⁇ 10 3 cells / cm 2 to 8.0 ⁇ 10 3 cells / cm 2 .
  • the cell sheet is transplanted so as to be applied to the kidney, preferably under the fiber coat of the kidney, and at that time, it is preferable to keep the detached gerotor fascia and fat layer of the kidney away from the renal parenchyma as much as possible.
  • transplanting the cell sheet into the kidney of a kidney disease patient it is possible to suppress or prevent the progression of kidney disease and symptoms associated therewith, and further improve this.
  • end stage renal failure for example, in severe chronic kidney disease, the progression of renal damage can be suppressed and the mortality rate can be reduced.
  • Another preferred embodiment of the cell sheet of the present invention has an average cell density of 0.5 ⁇ 10 3 cells / cm 2 to 1.5 ⁇ 10 4 cells / cm 2 for use in the treatment of brain injury or neurodegenerative diseases.
  • 1.0 ⁇ 10 3 cells / cm 2 to 1.5 ⁇ 10 4 cells / cm 2 more preferably 1.8 ⁇ 10 3 cells / cm 2 to 0.5 ⁇ 10 4 cells / cm.
  • transplanting the cell sheet into the brain of a patient with brain injury or neurodegenerative disease it is possible to suppress or prevent progression of brain injury, neurodegenerative disease and symptoms associated therewith, and further improve this.
  • cognitive function can be improved by transplanting a cell sheet to a degenerative site of a neurodegenerative disease.
  • the cell sheet of the present invention unlike a cell sheet containing conventional MSC, has a significantly low average cell density of MSC. As shown in Examples described later, the present inventors significantly increased the therapeutic effect of individual MSCs by culturing MSCs at a low cell density on a cell culture carrier having a three-dimensional structure composed of fibers. I found out that Surprisingly, although the cell sheet containing MSC cultured at low density has a significantly smaller number of cells than the cell sheet containing conventional MSC, the therapeutic effect as a whole sheet is higher than that of the conventional cell sheet. .
  • the present invention also provides a method for treating and / or preventing a disease in which cell transplantation therapy using MSC is effective, comprising locally administering an effective amount of the cell sheet of the present invention to a subject in need thereof. It is included as an embodiment. The meaning of each term in this embodiment is as described above.
  • the cell sheet of the present invention comprises an MSC, for example, an MSC separated from a subject having a disease, on a cell culture carrier having a three-dimensional structure composed of fibers, of 3.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 or less. It can be produced by a method including a step of seeding with the number of cells and a step of culturing MSC to prepare a cell sheet having an average cell density of 3.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less. This manufacturing method is another aspect of the present invention.
  • Subject means any animal having MSC, preferably a mammal individual, for example, a human, a primate such as a chimpanzee, a rodent such as a mouse, rat, guinea pig, hamster, cow, goat, It is an individual such as an cloven-hoofed eye such as sheep or pig, an odd-hoofed eye such as a horse, a rabbit, a dog, or a cat, and more preferably a human individual.
  • a mammal individual for example, a human, a primate such as a chimpanzee, a rodent such as a mouse, rat, guinea pig, hamster, cow, goat, It is an individual such as an cloven-hoofed eye such as sheep or pig, an odd-hoofed eye such as a horse, a rabbit, a dog, or a cat, and more preferably a human individual.
  • the MSC used for producing the cell sheet may be an MSC separated from a healthy subject or an MSC separated from a subject having a disease.
  • MSCs used in the present invention are pluripotent such as induced pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic stem cells (ES cells), embryonic tumor cells (EC cells), embryonic germ stem cells (EG cells), etc. It may be obtained by inducing differentiation from sex stem cells.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • ES cells embryonic stem cells
  • EC cells embryonic tumor cells
  • EG cells embryonic germ stem cells
  • Patent Document 1 it is known that MSCs of subjects having certain diseases and aging subjects have a lower therapeutic effect than MSCs of healthy subjects. Even if transplanted as it is, a high therapeutic effect cannot be expected.
  • the therapeutic effect of individual MSCs can be enhanced by low-density culture on a three-dimensional culture carrier, cells having high therapeutic effect even when MSC having such a low therapeutic effect is used as a raw material. Sheets can be manufactured.
  • a disease affecting a subject having MSC having a low therapeutic effect is a chronic disease, and an example thereof is described in Patent Document 1 as a disease in which MSC becomes abnormal.
  • MSCs are preferably collected from individuals of the same or related species as the cells to which the cells are administered, considering the safety in subsequent cell transplantation therapy.
  • cells collected from a human who is preferably the same species, more preferably cells collected from the same human individual receiving administration, that is, autologous MSC are used.
  • MSC used for the production of the cell sheet in the present invention can be collected by a general method from a sample of the target bone marrow fluid, adipose tissue, fetal appendage tissue, dental pulp and the like.
  • MSC can be separated by a known technique such as density gradient centrifugation or bone marrow seeding.
  • the MSC is a bone marrow or adipose tissue derived MSC.
  • the production method of the present invention includes a step of seeding MSC at a cell number of 3.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 or less on a cell culture carrier having a three-dimensional structure composed of fibers.
  • a sheet-shaped cell culture carrier having a three-dimensional structure made of the above-mentioned fibers is placed in a normal cell culture vessel, a medium is added, the cell culture carrier is immersed, and the number of cells is adjusted thereon. This can be done by sowing MSCs.
  • the bottom of the cell culture vessel may be of a size that allows the three-dimensional culture carrier to be placed in an expanded state, but when the three-dimensional culture carrier is placed in an expanded state, It is preferable that there are few uncovered parts.
  • the bottom surface of the cell culture container has the same shape as the three-dimensional culture carrier or a shape inscribed by the three-dimensional culture carrier.
  • the number of MSC cells to be seeded is appropriately adjusted according to the average cell density of the produced cell sheet.
  • the number of MSC cells to be seeded may be in the range of 10 times to 1/10 times the average cell density of the produced cell sheet, and preferably in the range of 10 times to 1 time.
  • the number of MSC cells to be seeded is 3.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 to 3.0 ⁇ 10 3 cells / cm 2 .
  • the number of MSC cells to be seeded is 2.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 to 2.0 ⁇ 10 3 cells /
  • the number of MSC cells to be seeded is 1.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 to 1.0 ⁇ .
  • the number of MSC cells to be seeded is 5.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 ⁇
  • the number of MSC cells to be seeded is 1.0 ⁇ 10 4 cells.
  • the number of MSC cells to be seeded is 0.5 ⁇ 10 4 cells / cm 2 to 0.5 ⁇ 10 2 cells / cm 2 .
  • the number of seeded cells is a numerical value per area of the three-dimensional culture carrier, and the actual number of seeded cells is a value calculated by dividing the bottom area of the cell culture container by the area of the three-dimensional culture carrier. Calculated by multiplication.
  • a medium usually used for MSC culture for example, ⁇ -MEM, DMEM or the like can be used.
  • These media may contain various components necessary for MSC growth, such as serum components.
  • the production method of the present invention includes a step of culturing MSC on a culture carrier having a three-dimensional structure made of fibers to prepare a cell sheet having an average cell density of 3.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less.
  • the culture of MSC on a three-dimensional culture carrier is performed for 24 hours to 144 hours, preferably 24 hours to 96 hours, more preferably 48 to 96 hours.
  • the culture temperature and gas concentration in the culture step may be within the range of the temperature and gas concentration normally used for MSC culture, and the temperature is, for example, 25 ° C. to 37 ° C., preferably 30 ° C. to 37 ° C., more preferably 37 ° C.
  • the oxygen concentration is, for example, 2% to 30%, preferably 2% to 20%. It is possible to prepare a cell sheet having a target average cell density by adjusting the number of cells to be seeded on a culture carrier within the above range, and by adjusting culture conditions such as culture time and temperature as necessary. it can.
  • the cell sheet produced by the above method may be used in a state in which the three-dimensional culture carrier is included as a support, or may be used after being peeled off from the three-dimensional culture carrier, Or after peeling off from a three-dimensional culture support
  • the culture carrier capable of peeling the cell sheet include poly (N-isopropylacrylamide) and other fibers whose surface is coated with a polymer whose molecular structure is changed by stimulation of temperature, pH, light, etc. 3 Mention may be made of cell culture carriers having a dimensional structure.
  • the culture carrier does not need to be in the form of a sheet.
  • the shape of the three-dimensional culture carrier is not limited as long as cells can come into contact with a three-dimensional structure composed of fibers during culture.
  • the three-dimensional culture carrier may have an insert-like shape installed and used in a cell culture container, or a three-dimensional structure made of fibers is integrally formed on the inner surface of the cell culture container, for example, the bottom surface of a well. It may be a molded shape.
  • MSC on the cell sheet may be maintained in an undifferentiated state or may be differentiated into desired cells.
  • Maintenance of MSCs in an undifferentiated state may be achieved by using a medium suitable for maintaining the undifferentiated state, such as HyClone AdvanceSTEM Messenchymal Cell Expansion Kit (Thermo Fisher Scientific), MesenCult (trademark) MSC Basal MediumLST (STEMChL) It can be carried out by culturing MSC using (trademark) Media (DV Biologics), MSC medium kit (MSCGM BulletKit, Lonza) or the like.
  • MSC differentiation can be performed by a generally known method such as culture in a differentiation-inducing medium to which a factor having an action of inducing differentiation into a desired cell is added.
  • Bone Morphogenetic Proteins (BMP) 4, BMP2 and the like are used as differentiation inducers for differentiation into osteoblasts, and dexamethasone, 3-isobutyl-1-methylxanthine, insulin and the like are used for differentiation into adipocytes.
  • a medium containing an activator comprising an extract from a mammalian fetal appendage as an active ingredient It is preferable to culture MSC using
  • an “extract from a mammalian fetal appendage” that can be used in the present invention is International Patent Publication No. WO2015 / 137419, which is hereby incorporated by reference in its entirety. It is an extract described in US Patent Application Publication No. US2017 / 0071984 which is a corresponding US application. This extract can be used as is for fetal appendages, preferably umbilical cord tissue, placenta tissue or egg membrane, delivered from a mother as a postpartum after delivery of a mammal, preferably a human fetus, or removed from the mother by caesarean section.
  • fetal appendages preferably umbilical cord tissue, placenta tissue or egg membrane
  • the extract is an extract prepared by cutting or crushing and immersing it in an extraction medium such as distilled water, physiological saline, phosphate buffered physiological saline, or a medium usually used in cell culture.
  • an extraction medium such as distilled water, physiological saline, phosphate buffered physiological saline, or a medium usually used in cell culture.
  • the extract does not contain cells having proliferation ability derived from a mammal which is a donor.
  • Specific extraction operations and conditions may follow the operations and conditions described in Patent Document 1.
  • an extract from a mammalian fetal appendage is a treatment commonly used by those skilled in the art when preparing a physiologically active substance from a fetal appendage, typically a placenta, such as an acid or enzyme. It can be prepared by subjecting the fetal appendage to a treatment such as hydrolysis used.
  • extracts include placenta preparation “Mersmon”, a human placental acid hydrolyzate sold by Mersmon Pharmaceutical Co., Ltd., human placenta preparation “Laenneck”, etc., sold from Japan Biopharmaceutical Co., Ltd.
  • Various commercial products called formulations and placenta extracts are commercial products called formulations and placenta extracts.
  • activator containing an extract from a mammalian fetal appendage refers to an agent for increasing the therapeutic effect of MSC, containing the aforementioned extract as an active ingredient.
  • activator refers to an agent for increasing the therapeutic effect of MSC, containing the aforementioned extract as an active ingredient.
  • activator refers to an agent for increasing the therapeutic effect of MSC, containing the aforementioned extract as an active ingredient.
  • the concentration of the activator in the medium used for the culture may be 0.01 ⁇ g / mL to 500 ⁇ g / mL as the final concentration in terms of protein, but is preferably 0.02 ⁇ g / mL to 300 ⁇ g / mL, more preferably 0. 0.04 ⁇ g / mL to 100 ⁇ g / mL, and in certain embodiments may be 0.05 ⁇ g / mL to 10 ⁇ g / mL.
  • MSC culture MSC derived from bone marrow collected at the time of artificial joint replacement in patients with osteoarthritis of the hip joint, MSC culture medium (15% FBS, 1% penicillin, 1% streptomycin) containing no activator DMEM containing 4500 mg / L glucose and L-glutamine).
  • VECELL 6well (registered trademark) (Bethel Co., Ltd.), which is a cell culture carrier having a three-dimensional structure composed of fibers, respectively, 8 ⁇ 10 4 cells / well, Cellbed 24well (registered trademark) (Nippon Vilene) Co., Ltd.) 2 ⁇ 10 4 cells / well, 3D-insert PS-200 12 well and 3D-insert PS-400 12 well (3DBiotek) seeded with 3.8 ⁇ 10 4 cells / well, and culture of comparative example Cell culture substrate A (average fiber diameter 0.1 to 0.5 ⁇ m, porosity 70% or less, average pore area 0.2 ⁇ m 2 , 24 well) seeded with 2 ⁇ 10 4 cells / well for activation The cells were cultured at 37 ° C.
  • the base material A is a base material that has a three-dimensional structure composed of fibers in a part thereof, but a flat film-like portion not having the three-dimensional structure occupies about 50% of the cell adhesion surface.
  • Corning (registered trademark) Costar (registered trademark) cell culture 6 well plate (Thermo Fisher Science, Inc.), which is a flat two-dimensional cell culture carrier, was cultured in MSC culture medium containing no activating agent 6 ⁇ OA-MSC 6 ⁇ . 10 4 cells / well were seeded and cultured in the presence of 100 ⁇ g / mL activator. This culture was repeated once more to prepare passage 2 control OA-MSC.
  • Example 1 Preparation of Cell Sheet OA-MSC was cultured in MSC culture medium (DMEM containing 15% FBS, 1% penicillin, 1% streptomycin, 4500 mg / L glucose and L-glutamine) without an activating agent.
  • MSC culture medium DMEM containing 15% FBS, 1% penicillin, 1% streptomycin, 4500 mg / L glucose and L-glutamine
  • Cells are collected, and a cell culture substrate B of 2.5 cm ⁇ 2.5 cm is placed in a two-dimensional culture carrier (Corning® Costar® cell culture 6-well plate, Thermo Fisher Science), and 8 ⁇ 10 8 4 cell MSCs were seeded, 2 mL of MSC culture medium containing 1 ⁇ g / mL activator was added, and cultured at 37 ° C. for 72 hours to prepare a passage 1 OA-MSC sheet.
  • MSC culture medium DMEM containing 15% FBS, 1% penicillin, 1% streptomycin, 4500 mg / L glucose
  • MSC sheets prepared by this method contain approximately 8,500 cells / cm 2 MSC.
  • Cell culture substrate B is disclosed in International Publication WO2016 / 068266 pamphlet and Liu L, Kamei K et al. Biomaterials 124 (2017) 47-54 is a three-dimensional culture carrier containing nanofibers made of polyglycolic acid on a base member made of polyglycolic acid produced by the method described in 47-54.
  • Example 2 MSC Gene Expression Analysis MSCs prepared in Reference Example 1 and Example 1 were collected, and total RNA was extracted using Tri Reagent (Molecular Research Center, Inc). Clone DNA was synthesized by reverse transcription reaction, and the bases shown in Table 1 for OCT4, Nanog, SOX2, DNMT1, TERT, IL-6, IDO, TSG-6, p16ink4a , p21, p53, ⁇ -SMA and 18sRNA Real-time PCR was performed using a primer set consisting of sequences. (F) in the table means a forward primer, and (R) means a reverse primer.
  • a ⁇ CT value was calculated based on the control OA-MSC cultured in the presence of 100 ⁇ g / mL activator on a two-dimensional culture carrier using 18sRNA as a housekeeping gene, and the gene expression profile was analyzed. Turned into.
  • OA-MSC (VECELL_0.1) cultured in the presence of 0.1 ⁇ g / mL activator on Preset VECELL, cultured in the presence of 0.1, 1 or 10 ⁇ g / mL activator on Cellbed OA-MSC (3D.insert200_0.1), 3D- cultured in the presence of 0.1 ⁇ g / mL activator on OA-MSC (CellBed_0.1, CellBed_1, CellBed_10, respectively), 3D-insert PS-200 OA-MSC (3D.
  • the results of the control OA-MSC (2D_100) cultured below are shown in FIG.
  • OCT4, SOX2, Nanog, DNMT1, IDO, TSG6, IL-6, and TERT are all markers that increase expression in MSC with high therapeutic effect, and P53 and ⁇ -SMA are suppressed in expression in MSC with high therapeutic effect. It is a marker.
  • p16ink4a is a positive marker of the therapeutic effect which has high correlation with OCT4, SOX2, Nanog, IDO and TSG6 found by the present inventors. From these results, it was considered that OA-MSC cultured on any three-dimensional culture carrier had a higher therapeutic effect than OS-MSC cultured on the two-dimensional culture carrier.
  • A_1 and A_0.1 show gene expression profiles similar to 2D_100, and the therapeutic effect of OA-MSC cultured on substrate A is the same as that of OA-MSC cultured on a normal two-dimensional culture carrier. It was estimated that it was about.
  • Rituximab (Chugai Pharmaceutical) 5 mg / animal was administered to the 14-month-old male OLETF rat (Hoshino test animal) developing diabetic nephropathy once daily for 4 days.
  • OLETF rat Hoshino test animal
  • the gerotor fascia, fat layer and fibrous capsule were carefully incised and removed from the renal surface so as not to damage the adrenal glands and pulled to the hilar region.
  • One MSC sheet of 2.5 cm ⁇ 2.5 cm and one MSC sheet cut into 1/3 were attached so as to wrap the entire kidney. Similarly, an MSC sheet was attached to the other kidney.
  • Blood was collected from the rats at the time of MSC sheet transplantation, 3 weeks and 6 weeks after transplantation, and serum creatinine was measured using an enzymatic method (SRL).
  • serum creatinine increased with time
  • MSC sheet group no increase in serum creatinine value was observed.
  • FIG. 3 shows a Kaplan-Meier curve representing the survival rate up to 11 weeks after transplantation.
  • the MSC sheet group showed a higher survival rate than the Vehicle group.
  • kidney tissue sections excised from animals 11 weeks after transplantation were prepared, and PAS-stained specimens were observed with an optical microscope and an electron microscope.
  • Vehicle group almost all glomeruli were cured, and abnormal mesangial cells and podocytes were observed (FIG. 4, upper left, FIG. 5).
  • tubules inflammatory cell infiltration into the tubulointerstitium, abnormalities of the tubular epithelial cells, dropping of the tubular epithelium, thickening of the basement membrane, etc. were observed (FIG. 4, lower left, FIGS. 6, 7).
  • MSC sheet group normal glomeruli remained (upper right of FIG. 4), and mesangial cells and podocytes were normalized (FIG.
  • the rat used in this study is a model animal that develops severe chronic kidney disease to a certain degree by further inducing acute kidney injury by anticancer drug treatment in addition to diabetic nephropathy. He had very severe end-stage renal disease corresponding to the 4th stage (renal failure stage). It was confirmed that the cell sheet of the present invention exhibits an excellent therapeutic effect even for such serious diseases.
  • Example 4 Renal Disease Treatment Effect of Cell Sheet (Diabetic Nephropathy)
  • Rats subjected to a sham operation in which only the dorsal skin and fascia were incised were assigned to the Sham group.
  • Blood was collected from rats at the time of MSC sheet transplantation, 4 weeks and 11 weeks after transplantation, and serum creatinine was measured using an enzyme method (SRL), and urea nitrogen (BUN) was measured using a UV method (SRL).
  • SRL enzyme method
  • BUN urea nitrogen
  • Example 5 Renal disease therapeutic effect of cell sheet (diabetic nephropathy) OA-MSCs were cultured in MSC culture medium (DMEM containing 10% FBS, 1% penicillin, 1% streptomycin, 4500 mg / L glucose and L-glutamine) without an activating agent. The cells were collected, and 1 ⁇ 0.8 cm Neobale Nano (Gunze Inc.) was placed in a two-dimensional culture carrier (Thermo Scientific TM Nunc TM Lab-Tek TM, 8 well, Thermo Fisher Science) 4 ⁇ 10 Passage number 1 OA-MSC sheets were prepared by seeding 3- cell MSCs, adding 200 ⁇ L of MSC medium containing no activator, and culturing at 37 ° C. for 24 hours. MSC sheets prepared by this method contain MSCs of 4781 cells / cm 2 (average value of average cell density of 3923 to 5884 cells / cm 2 of each prepared sheet).
  • MSC culture medium DMEM containing 10% FBS, 1% pen
  • KK-Ay mice In both kidneys of 16-week-old male KK-Ay mice developing diabetic nephropathy, the gerotor fascia, fat layer and fibrous capsule were carefully incised so as not to damage the adrenal glands and peeled off the kidney surface.
  • Urine from mice was collected before and at 4 weeks after transplantation of MSC sheets, albumin in urine using immunoturbidimetric method (Oriental Yeast Industry Co., Ltd.), and urine using enzyme method (Oriental Yeast Industry Co., Ltd.). Creatinine was measured.
  • FIG. 13 shows the difference in the urinary albumin / creatinine ratio before the MSC sheet transplantation and at 4 weeks after the MSC sheet transplantation.
  • the urinary albumin / creatinine ratio increased in the untreated group, but rather tended to decrease in the MSC sheet group.
  • the cell sheet used in this example has an average cell density lower than that of the cell sheet prepared in Example 1, it has excellent treatment for diabetic nephropathy in the same manner as the cell sheet prepared in Example 1. It was confirmed to show an effect.
  • Example 6 Renal disease therapeutic effect of cell sheet (acute kidney injury due to ischemia reperfusion) 1) Preparation of cell sheet according to the method of Example 1, MSCs having the number of cells shown in Table 2 were seeded on a substrate B of 2.5 cm ⁇ 2.5 cm and cultured in an MSC culture medium containing no activator. Thus, cell sheets having MSCs having different average cell densities were prepared.
  • MSCs on the cell sheets A to G were stained with DAPI (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole) and observed with a microscope (FIG. 14).
  • DAPI 4- ′, 6-diamidino-2-phenylindole
  • FIG. 14 When% confluence on each cell sheet was measured when the cell density when culturing MSC on the same culture carrier until reaching confluence was 100%, sheets A to C were 90% to 70% confluence, D to F was 60% to 10% confluence and G was less than 10% confluence.
  • FIG. 16 shows the relationship between the survival days of each rat up to the 10th day after transplantation and the average cell density of the cell sheet, and a Kaplan-Meier curve showing the survival rate for each group (high, medium, low) of the average cell density. 17 shows. All rats transplanted with sheets D to F having a medium average cell density survived until the 10th day after transplantation, but half of the mice transplanted with sheets A to C having a high average cell density, and average cells All mice transplanted with low density sheet G died by day 10.
  • the above results of sheets A to C having a large absolute number of MSCs are presumed to be due to the low therapeutic effect of individual MSCs.
  • the above result of the sheet G which is estimated to have the highest therapeutic effect of each MSC, is presumed to be due to a lack of the absolute number of cells required for exerting the therapeutic effect.
  • FIG. 18 shows Kaplan-Meier curves representing the survival rate of the group with Sham-renal capsule treatment and the group without Sham-renal capsule treatment up to 10 days after transplantation.
  • the group with the Sham-renal capsule treatment had a lower rate of decrease in survival than the group without the Sham-renal capsule treatment, so that the gerotor fascia, fat layer and fiber capsule were removed from the kidney surface and away from the renal parenchyma, It was confirmed that the effects of acute kidney injury were alleviated.
  • Example 7 Alzheimer's Disease Treatment Effect of Cell Sheet 1 Preparation of cell sheet According to the method of Example 6 1), MSCs having the number of cells shown in Table 3 were seeded on a substrate B of 2.5 cm ⁇ 2.5 cm, and MSC culture containing no activator was performed. Cell sheets having MSCs with different average cell densities were prepared by culturing in a medium.
  • a novel object recognition test was conducted 3 weeks after transplantation.
  • the contents of the novel object recognition test are as follows. On day 0, mice were placed in a blank box for 5 minutes and allowed to adapt to the environment. On the first day, the mouse was placed in a box containing two identical objects for 5 minutes (Familiarization), and after 1 hour, one substance was changed to a novel object, and each time to search for a novel object or existing object was measured in 5 minutes. .
  • the ratio of the search time of a novel object to the total search time of two objects (Preference index; new / (new + existing object search time) ⁇ 100%) was calculated, and 50% or more was regarded as good cognitive function. The position of the object was set at the same position throughout the test.
  • FIG. 19 shows the result of plotting the preference index divided into two groups according to the average cell density of the transplanted sheet.
  • the preference index was high and the cognitive function was good. Therefore, the cell sheet of the present invention also shows a therapeutic effect against Alzheimer's disease. It was confirmed.
  • TM Liberase
  • Cell pellets collected from 1 g of fat were seeded on a 15 cm dish, cultured for 4 days in DMEM medium containing 10% FBS and 1% PS, and after changing the medium, adherent cells (mouse adipose tissue-derived MSCs) were recovered. .
  • FIG. 20 shows microscopic observation images obtained by DAPI staining of MSC on each cell sheet.

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Abstract

本発明は、平均細胞密度が３．０×１０４細胞／ｃｍ２以下の間葉系幹細胞をその表面に有する生体移植用細胞シートに関する。また本発明は、ファイバーからなる３次元構造を有する細胞培養担体上に間葉系幹細胞を３．０×１０５細胞／ｃｍ２以下の細胞数で播種する工程、及び間葉系幹細胞を培養して平均細胞密度が３．０×１０４細胞／ｃｍ２以下の細胞シートを調製する工程を含む、生体移植用細胞シートの製造方法に関する。

Description

生体移植用細胞シート及びその製造方法
　本発明は、生体移植に用いるための細胞シート及びその製造方法に関する。
　間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ、以下ＭＳＣともいう）は、多分化能及び自己複製能を有する幹細胞であり、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、筋細胞といった間葉系に属する細胞に分化するだけでなく、神経細胞や肝細胞等にも胚葉を超えて分化する能力を有する。またＭＳＣは、自身が産生する液性因子によるパラクライン効果及び細胞接着相互作用も有することが知られている。ＭＳＣは、これらの作用に基づいて、標的組織や細胞の修復・再生能、及び抗炎症等の免疫制御能を発揮し、その結果、様々な疾患への治療効果を示すと考えられている。
　ＭＳＣは、単離培養が容易かつ増殖力が旺盛で、短期間で移植可能な細胞数を確保できること、免疫拒絶のない自家移植が可能であること、倫理的問題も少ないこと、低免疫原性により前処置を要せず同種移植が現実的であること等から、理想的な細胞移植療法の材料として、多様な疾患に対する治療への応用の検討が進められている。
　ＭＳＣを用いた細胞移植療法の適用が期待される疾患の一つが腎臓病、特に慢性腎臓病である。慢性腎臓病は、蛋白尿に代表される腎障害、及び糸球体濾過量を指標とした腎機能低下のいずれか又は両方が３か月以上持続している状態をいい、日本において成人の８人に１人が罹患している。慢性腎臓病の症状が進行して末期腎不全に至ると、薬剤治療の効果は見込めず、多くの患者は人工透析を余儀なくされる。人工透析は対症療法であることから、慢性腎不全に陥った患者は生涯にわたって人工透析を受け続ける必要があり、患者に与える身体的及び経済的な負担は大きい。さらに透析医療費の増大は、医療経済上、懸念すべき問題となっている。
　本発明者らは、ＭＳＣを用いた細胞移植療法を確立する過程において、患者例えば糖尿病患者のＭＳＣが異常なＭＳＣであること、具体的には前述のような多様な能力を失った又はこれらの能力が正常なＭＳＣと比べて低減した結果として、疾患治療効果を失った又は治療効果が正常なＭＳＣと比べて低減したＭＳＣであること、哺乳動物の胎児付属物からの抽出物が前記異常なＭＳＣを賦活化して治療効果を回復させることができること、及びかかる賦活化されたＭＳＣを用いた自家移植治療が可能となること等を見出し、哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する異常なＭＳＣに対する賦活化剤を発明し、特許出願した（特許文献１）。この賦活化剤は、特に、治療が必要となった段階の患者に対してもＭＳＣの自家移植を可能とする点において、重要な意義を有する。
　一方、細胞移植療法において、使用するＭＳＣの量を減らすため、必要とされる部位にＭＳＣを集中させることができる局所適用可能な製剤形態の検討が進められている。腎臓病に対するＭＳＣを用いた細胞移植療法としては、ＭＳＣを含む細胞シート組成物を腎臓に適用することで腎臓病を治療するアプローチが報告されている（特許文献２）。この細胞シート組成物は刺激応答性培養基材上にＭＳＣを播種して培養した後、剥離刺激により細胞を剥離することで調製される。
国際公開ＷＯ２０１５／１３７４１９号パンフレット 特開２０１７－１３２７４４号公報
　本発明は、治療効果の高いＭＳＣを含む新たな生体移植用細胞シートを提供することを目的とする。
　本発明者らは、特定の培養担体上で特定の低細胞密度となるようにＭＳＣを培養することで、高い疾患治療効果を有するＭＳＣの細胞シートを製造することができることを見出し、下記の各発明を完成させた。
（１）平均細胞密度が３．０×１０４細胞／ｃｍ２以下のＭＳＣをその表面に有する、生体移植用細胞シート。
（２）さらに生体適合性の支持体を含む、（１）に記載の細胞シート。
（３）支持体がファイバーからなる３次元構造を有する細胞培養担体である、（２）に記載の細胞シート。
（４）細胞培養担体が、ナノメートル～マイクロメートル単位の平均繊維径を有するファイバーによって細胞との接触面上に形成された開口部を有する、（３）に記載の細胞シート。
（５）開口部の平均径が５００ｎｍ～１０００μｍである、（４）に記載の細胞シート。
（６）支持体が、生分解性ポリマーからなるナノファイバーを含有してなる細胞培養担体である、（２）から（５）のいずれか一項に記載の細胞シート。
（７）腎臓病の治療に用いるための、平均細胞密度が１．０×１０３細胞／ｃｍ２～３．０×１０４細胞／ｃｍ２のＭＳＣをその表面に有する、（１）から（６）のいずれか一項に記載の細胞シート。
（８）腎臓の線維被膜下に適用するための、（７）に記載の細胞シート。
（９）脳損傷又は神経変性疾患の治療に用いるための、平均密度が０．５×１０３細胞／ｃｍ２～１．５×１０４細胞／ｃｍ２のＭＳＣをその表面に有する、（１）から（６）のいずれか一項に記載の細胞シート。
（１０）脳の損傷部位、変性部位又はそれらの近傍に適用するための、（９）に記載の細胞シート。
（１１）ＭＳＣが骨髄又は脂肪組織由来のＭＳＣである、（１）から（１０）のいずれか一項に記載の細胞シート。
（１２）ＭＳＣが疾患を有する対象から分離されたＭＳＣである、（１）から（１１）のいずれか一項に記載の細胞シート。
（１３）ファイバーからなる３次元構造を有する細胞培養担体上に、ＭＳＣを３．０×１０５細胞／ｃｍ２以下の細胞数で播種する工程、及び
　ＭＳＣを培養して、平均細胞密度が３．０×１０４細胞／ｃｍ２以下の細胞シートを調製する工程
を含む、生体移植用細胞シートの製造方法。
（１４）細胞培養担体が、ナノメートル～マイクロメートル単位の平均繊維径を有するファイバーによって細胞との接触面上に形成された開口部を有する、（１３）に記載の製造方法。
（１５）開口部の平均径が５００ｎｍ～１０００μｍである、（１４）に記載の製造方法。
（１６）細胞培養担体が、生分解性ポリマーからなるナノファイバーを含有してなる細胞培養担体である、（１３）から（１５）のいずれか一項に記載の製造方法。
（１７）ＭＳＣが骨髄又は脂肪組織由来のＭＳＣである、（１３）から（１６）のいずれか一項に記載の製造方法。
（１８）ＭＳＣが疾患を有する対象から分離されたＭＳＣである、（１３）から（１７）のいずれか一項に記載の製造方法。
　本発明によれば、治療効果が高い細胞シートを製造することができ、かつＭＳＣの移植療法において必要とされるＭＳＣの細胞数を従来よりも大幅に減らすことができる。また、従来腎移植以外の根治療法がなく、生涯を通じて人工透析を余儀なくされていた末期腎不全に至った慢性腎臓病をも治療することが可能となる。
ファイバーからなる３次元構造を有する細胞培養担体（以下、３次元培養担体ともいう）又は比較例の細胞培養担体上で、賦活化剤の存在下で培養した変形性股関節症患者ＭＳＣ（以下、ＯＡ－ＭＳＣという）の遺伝子発現プロファイルをクラスター解析した結果を示す図である。 Ｖｅｈｉｃｌｅを投与した又は細胞シートを移植した、抗がん剤処置後の糖尿病性腎症ラットの血清クレアチニンの推移を示すグラフである。 Ｖｅｈｉｃｌｅを投与した又は細胞シートを移植した、抗がん剤処置後の糖尿病性腎症ラットの移植後１１週までの生存率の推移を示すグラフである。太線は各群の平均値を、細線は各群の９５％ＣＩ（信頼区間）を示す。 Ｖｅｈｉｃｌｅを投与した又は細胞シートを移植した、抗がん剤処置後の糖尿病性腎症ラットの腎臓組織切片の光学顕微鏡観察画像である。上段に糸球体、下段に尿細管／間質が示される。 Ｖｅｈｉｃｌｅを投与した、抗がん剤処置後の糖尿病性腎症ラットの腎臓組織切片の電子顕微鏡観察画像である。糸球体が示される。 Ｖｅｈｉｃｌｅを投与した、抗がん剤処置後の糖尿病性腎症ラットの腎臓組織切片の電子顕微鏡観察画像である。尿細管が示される。 Ｖｅｈｉｃｌｅを投与した、抗がん剤処置後の糖尿病性腎症ラットの腎臓組織切片の電子顕微鏡観察画像である。尿細管が示される。 細胞シートを移植した、抗がん剤処置後の糖尿病性腎症ラットの腎臓組織切片の電子顕微鏡観察画像である。糸球体が示される。 細胞シートを移植した、抗がん剤処置後の糖尿病性腎症ラットの腎臓組織切片の電子顕微鏡観察画像である。尿細管が示される。 Ｖｅｈｉｃｌｅを投与した、抗がん剤処置後の糖尿病性腎症ラットの腎臓組織切片の光学顕微鏡観察画像である。腎表層部が示される。 細胞シートを移植した、抗がん剤処置後の糖尿病性腎症ラットの腎臓組織切片の光学顕微鏡観察画像である。腎表層部が示される。 細胞シートを移植した、糖尿病性腎症ラットの血清クレアチニン及び尿素窒素の推移を示すグラフである。 細胞シートを移植した、糖尿病性腎症マウスの尿中アルブミン／クレアチニン比を示すグラフである。 平均細胞密度が異なる細胞シート上のＭＳＣをＤＡＰＩ（４′，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）染色した顕微鏡観察画像である。 細胞シートＢ、Ｇ及びＨ上のＭＳＣにおけるＯＣＴ４、Ｎａｎｏｇ、ｐ１６ｉｎｋ４ａ及びＴＥＲＴのそれぞれの遺伝子の相対的発現量を、細胞シートＢ上のＭＳＣのそれと比較して表したグラフである。 平均細胞密度が異なる細胞シートを移植した急性腎障害ラットの、移植後１０日目までの生存日数と細胞シートの平均細胞密度との関係を示す図である。 平均細胞密度が異なる細胞シートを移植した急性腎障害ラットの、移植後１０日目までの生存率平均値の推移を示すグラフである。ラットは、移植したシートの平均細胞密度に応じて３群に分けた。 腎被膜処置を行った又は行わない急性腎障害ラットの、移植後１０日目までの生存率平均値の推移を示すグラフである。 平均細胞密度が異なる細胞シートを移植したアルツハイマー病モデルマウスの、新奇物体認識試験の結果を示すグラフである。マウスは、移植したシートの平均細胞密度に応じて２群に分けた。 平均細胞密度が異なる細胞シート上の脂肪組織由来ＭＳＣをＤＡＰＩ染色した顕微鏡観察画像である。 マウス脂肪組織由来ＭＳＣの細胞シートを移植した急性腎障害ラットの、移植から２４時間後の血中尿素窒素を示すグラフである。
生体移植用細胞シート
　本発明の第１の態様は、平均細胞密度が３．０×１０４細胞／ｃｍ２以下のＭＳＣをその表面に有する生体移植用細胞シート（以下、単に細胞シートと表す）に関する。
　細胞シートは、その表面に平均細胞密度が３．０×１０４細胞／ｃｍ２以下のＭＳＣ（ＭＳＣ集団）を有する。ＭＳＣの平均細胞密度とは、細胞シート単位面積あたりのＭＳＣの細胞数の算術平均値であり、細胞シートの表面を顕微鏡等で観察して確認されるＭＳＣの数をカウントし、合計数を細胞シート全体の面積で除算することにより、又は細胞シートの表面を顕微鏡等で観察して単位面積あたりのＭＳＣの数をカウントすることにより、算出することができる。
　本発明において、細胞シート表面上に存在するＭＳＣの平均細胞密度は３．０×１０４細胞／ｃｍ２以下であればよく、例えば０．１×１０３細胞／ｃｍ２～３．０×１０４細胞／ｃｍ２、０．１×１０３細胞／ｃｍ２～２．０×１０４細胞／ｃｍ２、０．１×１０３細胞／ｃｍ２～１．５×１０４細胞／ｃｍ２、０．１×１０３細胞／ｃｍ２～１．０×１０４細胞／ｃｍ２、０．１×１０３細胞／ｃｍ２～０．５×１０４細胞／ｃｍ２、０．３×１０３細胞／ｃｍ２～３．０×１０４細胞／ｃｍ２、０．５×１０３細胞／ｃｍ２～３．０×１０４細胞／ｃｍ２、１．０×１０３細胞／ｃｍ２～３．０×１０４細胞／ｃｍ２、３．０×１０３細胞／ｃｍ２～３．０×１０４細胞／ｃｍ２、６．０×１０３細胞／ｃｍ２～３．０×１０４細胞／ｃｍ２、１．０×１０４細胞／ｃｍ２～３．０×１０４細胞／ｃｍ２、０．３×１０３細胞／ｃｍ２～２．０×１０４細胞／ｃｍ２、０．５×１０３細胞／ｃｍ２～２．０×１０４細胞／ｃｍ２、１．０×１０３細胞／ｃｍ２～２．０×１０４細胞／ｃｍ２、３．０×１０３細胞／ｃｍ２～２．０×１０４細胞／ｃｍ２、６．０×１０３細胞／ｃｍ２～２．０×１０４細胞／ｃｍ２等に適宜設定することができる。細胞シート表面上のＭＳＣの平均細胞密度は、好ましくは０．５×１０３～３．０×１０４細胞／ｃｍ２、より好ましくは０．５×１０３～２．０×１０４細胞／ｃｍ２、なおより好ましくは２．０×１０３細胞／ｃｍ２～２．０×１０４細胞／ｃｍ２、さらに好ましくは２．０×１０３細胞／ｃｍ２～１．８×１０４細胞／ｃｍ２、なおさらに好ましくは３．０×１０３細胞／ｃｍ２～１．６×１０４細胞／ｃｍ２、いっそう好ましくは３．０×１０３細胞／ｃｍ２～１．０×１０４細胞／ｃｍ２、特に好ましくは３．０×１０３細胞／ｃｍ２～８．０×１０３細胞／ｃｍ２である。
　平均細胞密度は、細胞シート表面におけるＭＳＣの占有率（コンフルエンシー）で表すこともできる。コンフルエント又は１００％コンフルエントは、細胞シート表面がＭＳＣで完全に覆われた状態であり、ＭＳＣは密集して互いに接触した状態にある。これに対する相対的細胞密度が％コンフルエントであり、細胞シート表面上のＭＳＣが占める面積の合計値をシート全体の面積で除算することにより算出することができる。
　ヒトの骨髄由来ＭＳＣの場合、平均細胞密度２．０×１０４細胞／ｃｍ２は、６０％コンフルエントに相当する。同様に、平均細胞密度１．０×１０３～２．０×１０４細胞／ｃｍ２は１０～６０％コンフルエントに、１．０×１０３細胞／ｃｍ２～１．６×１０４細胞／ｃｍ２は１０～５０％コンフルエントに、１．０×１０３細胞／ｃｍ２～１．０×１０４細胞／ｃｍ２は１０～４０％コンフルエントに、３．０×１０３細胞／ｃｍ２～１．０×１０４細胞／ｃｍ２は２０～４０％コンフルエントに、３．０×１０３細胞／ｃｍ２～８．０×１０３細胞／ｃｍ２は２０～３５％コンフルエントに相当する。
　したがって、平均細胞密度が２．０×１０４細胞／ｃｍ２以下のＭＳＣをその表面に有する本発明の細胞シートは、細胞密度が６０％コンフルエント以下のＭＳＣをその表面に有する細胞シートと表すこともできる。好ましい実施形態において、本発明の細胞シートは、細胞密度が１０～６０％コンフルエント、１０～５０％コンフルエント、１０～４０％コンフルエント、２０～４０％コンフルエント、２０～３５％コンフルエントであるＭＳＣをその表面に有する。
　細胞シートは、平均細胞密度が３．０×１０４細胞／ｃｍ２以下のＭＳＣをその表面に有するものであるかぎり、ＭＳＣ以外の細胞を含んでもよい。ＭＳＣ以外の細胞は、ＭＳＣの分離源である組織に由来する細胞であってもよく、またＭＳＣとの併用による好ましい効果を期待して添加された細胞であってもよい。後者の細胞は、例えば血管内皮細胞、線維芽細胞、上皮系細胞等であり、治療対象の疾患や移植が予定される部位に応じて、適宜選択される。
　本発明の細胞シートの１つの例は、ＭＳＣ自身が産生する細胞外マトリクス又は培養時に培地に添加された細胞外マトリクスを介してＭＳＣが互いに接着してなるシートである。
　本発明の細胞シートの別の例は、さらに生体適合性の支持体を含む細胞シートである。この例において、細胞シートは、細胞外マトリクスを介して互いに接着したＭＳＣと支持体とを組み合わせたものであってもよく、又はシート状の支持体の表面にＭＳＣが接着する、ＭＳＣ細胞体の一部分若しくは全体が支持体の表面にあるくぼみ若しくは開口部に埋まる等して、支持体とＭＳＣとが一体化したものであってもよい。本発明における「ＭＳＣをその表面に有する」細胞シートには、ＭＳＣ細胞体の一部分又は全体が支持体の表面にある凹み又は開口部に埋まる等の状態にあるものも、その一態様として包含される。このように、本発明の細胞シートは、ＭＳＣが細胞外マトリックスを介して互いに接着した状態又は支持体と一体化した状態にあるものであり、細胞培養のためにその上にＭＳＣが単に播種されたに過ぎない培養担体とは区別される。
　本発明の細胞シートに含まれる支持体は、生体適合性材料から構成されるシート状のものであればよく、その後の生体内への移植の際に取扱が容易であるかぎり、その形、大きさや厚みに制限はない。生体適合性材料の例としては、ポリフッ化エチレン、ポリスチレン等のポリマー化合物、シリカ等の無機化合物、生分解性ポリマー等を挙げることができ、生分解性ポリマーが好ましい。生分解性ポリマーとしては、例えば合成高分子材料ではポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリエチレングリコール、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、その他乳酸－グリコール酸共重合体等の上記の共重合体；無機材料ではβ－りん酸三カルシウム、炭酸カルシウム等；天然高分子材料ではコラーゲン、ゼラチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、アガロース、キトサン、フィブリン、フィブロイン、キチン、セルロース、シルク等が挙げられる。
　本発明の細胞シートに含まれる支持体の好ましい例は、ファイバーからなる３次元構造を有する、シート状の細胞培養担体である。特に、ナノメートル（ｎｍ）～マイクロメートル（μｍ）単位の平均繊維径を有するファイバーからなるシート状の３次元培養担体が好ましい。細胞培養担体又は培養担体は、細胞培養の際に用いられる、細胞が接着する足場となる担体である。また「平均繊維径」は、培養担体を細胞接着面の側から、典型的には上から観察したときにファイバーの長さ方向に対して直交する方向における長さとして測定されるファイバー径の算術平均値をいう。なお、特に指定がないかぎり、本明細書における平均とは数平均を意味する。また、ナノメートル（ｎｍ）～マイクロメートル（μｍ）単位の平均繊維径を有するファイバーからなる３次元培養担体であって、当該ファイバーによって細胞と接触する面上に形成された開口部を有するものも、本発明において好ましい支持体の例である。ここで「開口部」は、上記ファイバーにより形成される、担体の細胞との接触面上に存在するくぼみをいう。
　開口部の平均径は、ファイバー同士が接している場合は、培養担体を上から観察したときに認められる、ファイバーを輪郭とした図形の径の平均値をいう。図形の径とは、図形が多角形の場合は各頂点からの対角線の長さの算術平均値に、図形が円形の場合はその直径に、図形が楕円形又はそれに類似した形状の場合はその長径に相当する。
　また、ファイバー同士が接していない場合、開口部の平均径は、ＡＳＴＭ－Ｆ３１６に規定されている方法により得られる平均流量孔径をいい、これは、例えばポロメーター（コールター社製等）を用いてミーンフローポイント法により測定することができる。
　３次元培養担体を構成するファイバーの平均繊維径は、ｎｍ～μｍ単位の範囲内に、好ましくは１０ｎｍ～５００μｍ、より好ましくは１０ｎｍ～３００μｍの範囲内にあり得る。特定の実施形態において、平均繊維径は、例えば１０ｎｍ～１μｍ、１００ｎｍ～１μｍ、５００ｎｍ～１μｍ、１μｍ～１０μｍ、１μｍ～１００μｍ、１μｍ～３００μｍ、又は１μｍ～５００μｍの範囲内に、好ましくは１０ｎｍ～１μｍ、１μｍ～１０μｍ又は１０μｍ～３００μｍのいずれかの範囲内にあればよい。本発明においては、一般にナノファイバーと呼ばれるファイバーを用いることもできる。
　細胞との接着面上に開口部を有する３次元培養担体において、開口部の平均径は、５００ｎｍ～１０００μｍであればよく、好ましくは７００ｎｍ～６００μｍ、より好ましくは９００ｎｍ～４００μｍの範囲内にあり得る。特定の実施形態において、開口部の平均径は、例えば５００ｎｍ～１００μｍ、５μｍ～１００μｍ、１０μｍ～１００μｍ、２０μｍ～１００μｍ、１００μｍ～２００μｍ、１００μｍ～４００μｍ、又は１００μｍ～６００μｍの範囲内に、好ましくは５００ｎｍ～１００μｍ又は１００μｍ～４００μｍの範囲内にあればよい。
　特定の実施形態において、３次元培養担体は、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、特に好ましくは８０％以上の空隙率を有する。
　別の実施形態において、３次元培養担体の開口部の平均面積は、０．１～１００μｍ２、好ましくは０．２～６０μｍ２、より好ましくは０．５～３０μｍ２である。開口部が孔である場合、開口部面積は孔面積に相当する。
　３次元培養担体は、ファイバーが３次元的に集積した、すなわちファイバーが３次元方向に積み重なった構造を持つものであり、ファイバーの配置が規則的であってもなくてもよく、またファイバー同士が結合していても結合していなくてもよい。
　３次元培養担体は、細胞接着面にファイバーからなる３次元構造を有するものであればよく、細胞と接着しない部分、典型的にはファイバーからなる３次元構造の下にベースとなる部材を有していてもよい。ベース部材は、前記３次元構造を支持できるものであれば、どのような構造体であってもよく、例えば、不織布、編物、織物、多孔質足場材料等であり得る。また支持体としても用いられる３次元培養担体は、生体適合性材料から構成されるシート状のものであればよく、細胞培養やその後の生体内への移植の際に取扱が容易であるかぎり、その形、大きさや厚みに制限はないが、例えば細胞培養用容器と一体的に成形されているもの等の生体移植に用いることができない形態のものを含まない。
　３次元培養担体における細胞接着面は、その主たる部分がファイバーからなる３次元構造を有する部分であればよく、具体的には、培養担体を細胞接着面の側から、典型的には上から観察したときの培養担体の面積の５０％以上がファイバーからなる３次元構造を有する部分で占められていればよい。したがって、３次元培養担体は、細胞接着面の一部に「ファイバーからなる３次元構造」ではない部分、例えば３次元構造を持たない平坦な膜状の部分等を、接着面における当該部分の面積が５０％に満たない範囲で、好ましくは４０％に満たない範囲で、さらに好ましくは３０％に満たない範囲で含むことができる。
　本発明において利用可能な３次元培養担体の例としては、ベセル株式会社のＶＥＣＥＬＬ（登録商標）（ポリテトラフルオロエチレン、平均繊維径：＜１μｍ、平均孔面積：１～２０μｍ２、開口部の平均径：２０～１００μｍ、空隙率：８０～９０％）、日本バイリーン株式会社のＣｅｌｌｂｅｄ（登録商標）（高純度シリカファイバー、平均繊維径：１μｍ、平均流量孔径：７～８μｍ、空隙率：＞９５％）、３Ｄ　Ｂｉｏｔｅｋの３Ｄ　Ｉｎｓｅｒｔ－ＰＳシリーズ（ポリスチレンファイバー、平均繊維径：ＰＳ－２００は～１５０μｍ、ＰＳ－４００は～３００μｍ、開口部の平均径：ＰＳ－２００は２００μｍ、ＰＳ－４００は４００μｍ）、国際公開ＷＯ２０１４／１９６５４９号パンフレットに記載された細胞培養基材、国際公開ＷＯ２０１６／０６８２６６号パンフレット及びこれに対応する米国出願である米国特許出願公開ＵＳ２０１７／３１９７４７号公報に記載された細胞培養基材（生分解性ポリマー、平均繊維径５０ｎｍ～５μｍ）、Ｌｉｕ　Ｌ，Ｋａｍｅｉ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　１２４（２０１７）　４７－５４に記載された細胞培養基材（ポリグリコール酸、平均繊維径：３４５±９１ｎｍ、平均孔面積：０．６８±０．０２μｍ２、平均孔面積から算出される開口部の平均径：０．９３μｍ（（０．６８μｍ２／π）１／２）×２））、ネオベール及びネオベールナノ（ポリグリコール酸、グンゼ株式会社）といった市販の組織補強材等を挙げることができる。上記の各文献は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
　本発明の細胞シートは、生体内で疾患が生じている部位、生じるおそれがある部位若しくは疾患の原因となる部位、又はそれらの近傍に移植することにより生体に局所投与することができ、これによりＭＳＣを用いた細胞移植療法が有効な疾患、例えば糖尿病及びその合併症、脳血管疾患、脳変性疾患、脱髄性疾患、機能性発作性疾患、認知症性疾患、末梢神経疾患、心血管疾患、自己免疫疾患、肝・胆道・膵疾患、胃・十二指腸疾患、小腸・大腸疾患、甲状腺疾患、血液・造血器疾患、肺疾患、急性腎障害及び慢性腎臓病、眼疾患、皮膚疾患、筋・骨疾患、外傷及びＧＶＨＤ（移植片対宿主病）を治療及び／又は予防することができる。細胞シートの局所投与により治療及び／又は予防することができる疾患としては、具体的に、１型糖尿病及び２型糖尿病並びにこれらの合併症、例えば、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性壊疽など；脳卒中（脳梗塞及び脳出血）などの脳血管疾患、パーキンソン病、ハンチントン病、大脳基底核変性症、多系統萎縮症、脊髄小脳変性症、筋委縮性側索硬化症などの脳変性疾患；多発性硬化症、急性散在性脳脊髄炎、視神経脊髄炎などの脱髄性疾患；てんかんや脳性麻痺などの機能性発作性疾患；血管性認知症、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、糖尿病性認知症などの認知症性疾患；ギランバレー症候群、末梢神経障害、顔面神経麻痺、三叉神経痛、排尿障害、勃起障害、自律神経失調症などの末梢神経疾患；心筋梗塞、狭心症、閉塞性動脈硬化症、心筋症などの心血管疾患；関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、混合性結合組織病、リウマチ性多発筋痛症、好酸球増多症、ベーチェット病、サルコイドーシス、Ｓｔｉｌｌ病、脊椎関節炎、川崎病等の自己免疫疾患；急・慢性肝炎、肝硬変、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、急・慢性膵炎、自己免疫性膵炎などの肝・胆道・膵疾患；急性・慢性胃炎、胃・十二指腸潰瘍などの胃・十二指腸疾患；クローン病、潰瘍性大腸炎、虚血性大腸炎、過敏性腸症候群などの小腸・大腸疾患；バセドー病、急性・慢性甲状腺炎などの甲状腺疾患；自己免疫性溶血性貧血、真性多血症、特発性血小板減少性紫斑病などの血液・造血器疾患；慢性閉塞性肺疾患、間質性肺炎、肺線維症、塵肺、気管支喘息、好酸球性肺炎、ＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）などの肺疾患；体液量減少や虚血に伴う急性腎障害、ＡＮＣＡ関連腎炎、顕微鏡的多発血管炎、多発血管炎性肉芽種症、好酸球性多発血管炎性肉芽種症、悪性高血圧、クリオグロブリン血症、感染後糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、急性間質性腎炎、薬剤性腎障害、骨髄腫腎、痛風腎、横紋筋融解症、急性尿細管壊死などの急性腎障害；膜性腎症、膜性増殖性糸球体腎炎、微小変化型ネフローゼ症候群、巣状糸球体硬化症、ループス腎炎、アミロイド―シス、腎硬化症、紫斑病性腎炎、ＩｇＧ４関連腎疾患、シェーグレン症候群、強皮症腎、慢性間質性腎炎、多発性嚢胞腎などの慢性腎臓病；黄班変性症、視神経炎、ブドウ膜炎などの眼疾患；アトピー性皮膚炎、水泡性疾患、Ｓｔｅｖｅｎｓ－Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群などの皮膚疾患；重症筋無力症、筋ジストロフィー、変形性股関節症、大腿骨頭壊死、骨粗鬆症、手根管症候群などの筋・骨疾患；脊髄損傷、脳挫傷などの外傷；褥瘡等の創傷、口腔内潰瘍、ＧＶＨＤ（移植片対宿主病）、縫合不全、臓器の損傷を挙げることができる。本発明の細胞シートが適応される疾患は、好適には、糖尿病性腎症、急性腎障害、慢性腎臓病、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性壊疽、アルツハイマー病、糖尿病性認知症、関節リウマチ、多発性筋炎及び創傷である。
　本明細書において用いられる治療及び／又は予防は、疾患又は症状の治癒、一時的寛解、予防等を目的とする医学的に許容される全てのタイプの治療的及び／又は予防的介入を包含する。すなわち、疾患又は症状の治療及び／又は予防は、疾患又は症状の進行の遅延又は停止、病変の退縮又は消失、発症の予防又は再発の防止等を含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
　本発明の細胞シートは、その有効量が対象に局所投与される。ここで「有効量」とは、疾患を治療及び／又は予防するのに効果的な量を意味する。かかる有効量は疾患の種類、局所投与される臓器又は組織、症状の重症度、患者その他の医学的要因によって適宜調節される。好ましい実施形態において、細胞シートの有効量は、シートに含まれるＭＳＣの数に換算して、投与される個体の体重１ｋｇあたり１０２細胞～１０９細胞、好ましくは１０４細胞～１０６細胞である。
　本発明の細胞シートの好ましい態様の１つは、腎臓病の治療に用いるための、平均細胞密度が１．０×１０３細胞／ｃｍ２～３．０×１０４細胞／ｃｍ２、好ましくは２．０×１０３細胞／ｃｍ２～３．０×１０４細胞／ｃｍ２、より好ましくは２．０×１０３細胞／ｃｍ２～２．０×１０４細胞／ｃｍ２、さらに好ましくは２．０×１０３細胞／ｃｍ２～１．８×１０４細胞／ｃｍ２、なおさらに好ましくは３．０×１０３細胞／ｃｍ２～１．６×１０４細胞／ｃｍ２、いっそう好ましくは３．０×１０３細胞／ｃｍ２～１．０×１０４細胞／ｃｍ２、特に好ましくは３．０×１０３細胞／ｃｍ２～８．０×１０３細胞／ｃｍ２のＭＳＣをその表面に有する細胞シートである。本態様において、細胞シートは、腎臓、好ましくは腎臓の繊維被膜下に貼付するように移植され、その際、剥離した腎臓のゲロータ筋膜及び脂肪層を腎実質からなるべく遠ざけることが好ましい。細胞シートを腎臓病患者の腎臓に移植することで、腎臓病及びこれに伴う症状の進行を抑制又は防止すること、さらにはこれを改善することができる。例えば重度の慢性腎臓病の、特に末期腎不全に達した腎臓の繊維被膜下に細胞シートを移植することで、腎障害の進行を抑制し、死亡率を低減することができる。
　本発明の細胞シートの好ましい別の態様は、脳損傷又は神経変性疾患の治療に用いるための、平均細胞密度が０．５×１０３細胞／ｃｍ２～１．５×１０４細胞／ｃｍ２の、好ましくは１．０×１０３細胞／ｃｍ２～１．５×１０４細胞／ｃｍ２の、より好ましくは１．８×１０３細胞／ｃｍ２～０．５×１０４細胞／ｃｍ２のＭＳＣをその表面に有する細胞シートである。本態様において、細胞シートは脳の損傷部位、変性部位又はその近傍に貼付するように移植される。細胞シートを脳損傷又は神経変性疾患の患者の脳に移植することで、脳損傷、神経変性疾患及びこれらに伴う症状の進行を抑制又は防止すること、さらにはこれを改善することができる。例えば神経変性疾患の変性部位に細胞シートを移植することで、認知機能を改善することができる。
　本発明の細胞シートは、従来のＭＳＣを含む細胞シートと異なり、ＭＳＣの平均細胞密度が大幅に低い。後述の実施例において示されるように、本発明者らは、ファイバーからなる３次元構造を有する細胞培養担体上でＭＳＣを低細胞密度で培養することにより、個々のＭＳＣの治療効果が顕著に高められることを見出した。意外なことに、低密度培養されたＭＳＣを含む細胞シートは、従来のＭＳＣを含む細胞シートよりも細胞数が大幅に少ないにもかかわらず、シート全体としての治療効果は従来の細胞シートより高い。
　本発明はまた、有効量の本発明の細胞シートをその必要がある対象に局所投与することを含む、ＭＳＣを用いた細胞移植療法が有効な疾患を治療及び／又は予防する方法も、別の態様として包含する。本態様における各用語の意味は、上で説明したとおりである。
細胞シートの製造方法
　本発明の細胞シートは、ファイバーからなる３次元構造を有する細胞培養担体上にＭＳＣ、例えば疾患を有する対象から分離されたＭＳＣを３．０×１０５細胞／ｃｍ２以下の細胞数で播種する工程、及びＭＳＣを培養して、平均細胞密度が３．０×１０４細胞／ｃｍ２以下の細胞シートを調製する工程を含む方法によって製造することができる。この製造方法は、本発明の別の態様である。
　用語「対象」及び「疾患を有する対象から分離されたＭＳＣ」は、いずれも特許文献１である国際公開ＷＯ２０１５／１３７４１９号パンフレット及びこれに対応する米国出願である米国特許出願公開ＵＳ２０１７／００７１９８４号公報に記載された各用語と同じ意味をもつものとして解釈される。これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるが、これらの文献及び本明細書における各用語の意味の概略を以下に示す。
　「対象」とは、ＭＳＣを有する任意の動物を意味し、好ましくは哺乳動物の個体、例えば、ヒト、チンパンジー等の霊長類、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等の齧歯類、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等の偶蹄目、ウマ等の奇蹄目、ウサギ、イヌ、ネコ等の個体であり、さらに好ましくはヒトの個体である。
　本発明において細胞シートの製造に使用されるＭＳＣは、健常な対象から分離されたＭＳＣであっても、疾患を有する対象から分離されたＭＳＣであってもよい。また、本発明において使用されるＭＳＣは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）等の多能性幹細胞から分化誘導して得られたものであってもよい。
　特許文献１にも記載があるように、ある種の疾患を有する対象及び老化した対象のＭＳＣは、健常者のＭＳＣと比べて治療効果が低いことが知られており、これらの対象に自己ＭＳＣをそのまま移植しても高い治療効果は期待できない。一方、本発明の製造方法においては３次元培養担体上での低密度培養により個々のＭＳＣの治療効果を高めることができるため、そのような治療効果が低いＭＳＣを原料としても治療効果の高い細胞シートを製造することができる。治療効果が低いＭＳＣを有する対象が罹患している疾患は慢性疾患であり、その例は特許文献１にＭＳＣが異常化する疾患として記載されている。
　ＭＳＣは、その後の細胞移植療法における安全性を考慮した場合、細胞を投与する個体と同種又は近縁種の個体から採取するのが好ましい。例えば、ヒトの個体に細胞移植を行う場合、好ましくは同種であるヒトから採取された細胞が、より好ましくは投与を受ける同一のヒト個体から採取された細胞、すなわち自己ＭＳＣが用いられる。
　本発明において細胞シートの製造に使用されるＭＳＣは、対象の骨髄液、脂肪組織、胎児付属組織、歯髄等の試料から、一般的な方法で採取することができる。例えば、試料として骨髄液を用いる場合、密度勾配遠心法、骨髄播種法等の公知の手法により、ＭＳＣを分離することが可能である。本発明の好ましい実施形態の一つにおいて、ＭＳＣは、骨髄又は脂肪組織由来のＭＳＣである。
　本発明の製造方法は、ファイバーからなる３次元構造を有する細胞培養担体上にＭＳＣを３．０×１０５細胞／ｃｍ２以下の細胞数で播種する工程を含む。本工程は、通常の細胞培養用の容器内に前述のファイバーからなる３次元構造を有するシート状の細胞培養担体を置き、培地を加えて細胞培養担体を浸漬させ、その上に細胞数を調節したＭＳＣを播種することにより、行うことができる。
　細胞培養用容器の底面は、３次元培養担体を広げた状態で配置することができる程度の大きさであればよいが、３次元培養担体を広げた状態で置いたときに３次元培養担体で覆われない部分が少ないことが好ましい。特定の実施形態において、細胞培養用容器の底面は、３次元培養担体と同形状であるか、又は３次元培養担体が内接する形状である。
　播種されるＭＳＣの細胞数は、製造される細胞シートの平均細胞密度に応じて適宜調節される。典型的には、播種されるＭＳＣの細胞数は製造される細胞シート平均細胞密度の１０倍量から１／１０倍量の範囲であればよく、１０倍量から１倍量の範囲が好ましい。例えば平均細胞密度が３．０×１０４細胞／ｃｍ２の細胞シートを調製する場合、播種されるＭＳＣの細胞数は３．０×１０５細胞／ｃｍ２～３．０×１０３細胞／ｃｍ２である。また平均細胞密度が２．０×１０４細胞／ｃｍ２の細胞シートを調製する場合、播種されるＭＳＣの細胞数は２．０×１０５細胞／ｃｍ２～２．０×１０３細胞／ｃｍ２であり、平均細胞密度が１．０×１０４細胞／ｃｍ２の細胞シートを調製する場合、播種されるＭＳＣの細胞数は１．０×１０５細胞／ｃｍ２～１．０×１０３細胞／ｃｍ２であり、平均細胞密度が５．０×１０３細胞／ｃｍ２の細胞シートを調製する場合、播種されるＭＳＣの細胞数は５．０×１０４細胞／ｃｍ２～５．０×１０２細胞／ｃｍ２であり、平均細胞密度が１．０×１０３細胞／ｃｍ２の細胞シートを調製する場合、播種されるＭＳＣの細胞数は１．０×１０４細胞／ｃｍ２～１．０×１０２細胞／ｃｍ２であり、平均細胞密度が０．５×１０３細胞／ｃｍ２の細胞シートを調製する場合、播種されるＭＳＣの細胞数は０．５×１０４細胞／ｃｍ２～０．５×１０２細胞／ｃｍ２である。
　なお、上記の播種細胞数は３次元培養担体の面積あたりの数値であり、実際の播種細胞数は、細胞培養用容器の底面積を３次元培養担体の面積で除算して算出される値を乗算することで算出される。
　培地は、ＭＳＣの培養に通常用いられる培地、例えばα－ＭＥＭ、ＤＭＥＭ等を利用することができる。これら培地は、ＭＳＣの増殖に必要な各種成分、例えば血清成分等を含有していてもよい。
　本発明の製造方法は、ファイバーからなる３次元構造を有する培養担体上でＭＳＣを培養して、平均細胞密度が３．０×１０４細胞／ｃｍ２以下の細胞シートを調製する工程を含む。
　３次元培養担体上でのＭＳＣの培養は、２４時間～１４４時間、好ましくは２４時間～９６時間、より好ましくは４８～９６時間行われる。培養工程における培養温度及びガス濃度は、ＭＳＣの培養に通常用いる温度及びガス濃度の範囲内であればよく、温度は例えば２５℃～３７℃、好ましくは３０℃～３７℃、より好ましくは３７℃であり、酸素濃度は例えば２％～３０％、好ましくは２％～２０％である。培養担体に播種される細胞数を上記の範囲で調節すること、及び培養時間や温度等の培養条件を必要に応じて調節することで、目的の平均細胞密度を有する細胞シートを調製することができる。
　上記の方法で製造される細胞シートは、３次元培養担体を支持体として含んだままの態様で使用してもよく、３次元培養担体から剥離可能な場合には剥がして使用してもよく、又は３次元培養担体から剥がした後に、必要に応じて別の支持体と組み合わせて使用してもよい。細胞シートを剥離することが可能な培養担体としては、例えばポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）その他の、温度、ｐＨ、光等の刺激によって分子構造が変化する高分子で表面を被覆したファイバーからなる３次元構造を有する細胞培養担体を挙げることができる。
　細胞シートが支持体を含まない場合、すなわちＭＳＣが互いに接着してなる細胞シートの場合、培養担体はシート状である必要はない。この場合、３次元培養担体は、培養時に細胞がファイバーからなる３次元構造に接触できるものであるかぎり形状に制限はない。３次元培養担体は、細胞培養容器内に設置されて使用されるインサート状の形状であってもよく、あるいは細胞培養容器の内面、例えばウェルの底面等にファイバーからなる３次元構造が一体的に成形された形状であってもよい。
　細胞シート上のＭＳＣは、未分化な状態で維持してもよく、あるいは所望の細胞に分化させてもよい。ＭＳＣの未分化状態での維持は、未分化状態の維持に好適な培地、例えばＨｙＣｌｏｎｅ　ＡｄｖａｎｃｅＳＴＥＭ　Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）ＭＳＣ　Ｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｓｔｒｏｍａｌ　Ｃｅｌｌｕｔｉｏｎｓ（商標）Ｍｅｄｉａ（ＤＶ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、ＭＳＣ専用培地キット（ＭＳＣＧＭ　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ、Ｌｏｎｚａ）等を用いて、ＭＳＣを培養することにより行うことができる。また、ＭＳＣの分化は、所望の細胞への分化誘導作用を持つ因子を加えた分化誘導培地中での培養等の一般に知られる方法で行うことができる。例えば、骨芽細胞への分化においてはＢｏｎｅ　Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＢＭＰ）４、ＢＭＰ２等が、脂肪細胞への分化においてはデキサメタゾン、３－イソブチル－１－メチルキサンチン、インスリン等が分化誘導因子として用いられる。
製造方法における賦活化剤の利用
　調製される細胞シートの治療効果をより高めるために、本発明の製造方法において、哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分とする賦活化剤を含む培地を用いてＭＳＣの培養を行うことが好ましい。
　本発明において利用可能な「哺乳動物の胎児付属物からの抽出物」の1つの例は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる特許文献１である国際公開ＷＯ２０１５／１３７４１９号パンフレット及びこれに対応する米国出願である米国特許出願公開ＵＳ２０１７／００７１９８４号公報に記載された抽出物である。この抽出物は、哺乳動物、好ましくはヒトの胎児娩出後に後産として母体から娩出されるか又は帝王切開により母体から摘出された胎児付属物、好ましくは臍帯組織、胎盤組織又は卵膜を、そのまま又は切断若しくは破砕して、蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、細胞培養において通常用いられる培地等の抽出媒体中に浸漬する等して調製される抽出物である。抽出物は、特に、ドナーである哺乳動物由来の増殖能を有する細胞を含まないものであることが好ましい。具体的な抽出操作及び条件は、特許文献１に記載された操作及び条件に従えばよい。
　また、「哺乳動物の胎児付属物からの抽出物」の別の例は、胎児付属物、典型的には胎盤から生理活性物質を調製する際に当業者が通常用いる処理、例えば酸や酵素を用いた加水分解等の処理を胎児付属物に施すことによって調製されるものであり得る。かかる抽出物の例は、メルスモン製薬株式会社から販売されているヒト胎盤酸加水分解物である胎盤製剤「メルスモン」、株式会社日本生物製剤から販売されているヒト胎盤製剤「ラエンネック」その他の市販胎盤製剤及びプラセンタエキスと呼ばれる様々な市販品である。
　本発明における「哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する賦活化剤」とは、前述の抽出物を有効成分として含有する、ＭＳＣの治療効果を増大させるための剤をいい、以下これを「賦活化剤」と表す。
　培養に用いる培地中の賦活化剤の濃度は、タンパク質換算の最終濃度で０．０１μｇ／ｍＬ～５００μｇ／ｍＬであれば足りるが、好ましくは０．０２μｇ／ｍＬ～３００μｇ／ｍＬ、より好ましくは０．０４μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬであり、特定の実施形態においては０．０５μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬであり得る。
　以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
参考例１　３次元培養担体上、賦活化剤存在下でのＭＳＣ培養
１）賦活化剤の調製
　特許文献１の記載にしたがって、ヒト胎盤組織から賦活化剤を調製した。簡潔には、細切したヒト胎盤組織を湿重量５０ｇに対して、１００ｍＬの割合で無血清培地（ａｌｐｈａ－ＭＥＭ）に入れ、４℃で７２時間、振とうした。遠心分離により上清を回収し、胎盤組織抽出物である賦活化剤を得た。
２）ＭＳＣの培養
　変形性股関節症患者の人工関節置換術時に採取した骨髄由来のＭＳＣ（ＯＡ－ＭＳＣ）を、賦活化剤を含まないＭＳＣ培養培地（１５％ＦＢＳ、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン、４５００ｍｇ／Ｌグルコース及びＬ－グルタミンを含有するＤＭＥＭ）で培養を行った。細胞を回収して、それぞれファイバーからなる３次元構造を有する細胞培養担体であるＰｒｅｓｅｔ　ＶＥＣＥＬＬ　６ｗｅｌｌ（登録商標）（ベセル株式会社）に８×１０４細胞／ｗｅｌｌ、Ｃｅｌｌｂｅｄ　２４ｗｅｌｌ（登録商標）（日本バイリーン株式会社）に２×１０４細胞／ｗｅｌｌ、３Ｄ－ｉｎｓｅｒｔ　ＰＳ－２００　１２ｗｅｌｌ及び３Ｄ－ｉｎｓｅｒｔ　ＰＳ－４００　１２ｗｅｌｌ（３ＤＢｉｏｔｅｋ社）に３．８×１０４細胞／ｗｅｌｌを播種し、また比較例の培養担体である細胞培養基材Ａ（平均繊維径０．１～０．５μｍ、空隙率７０％以下、平均孔面積０．２μｍ２、２４ｗｅｌｌ）に２×１０４細胞／ｗｅｌｌを播種し、賦活化剤を含まないＭＳＣ培養培地を用いて３７℃で７２時間培養した。基材Ａは、その一部にファイバーからなる３次元構造を有するが、３次元構造を持たない平坦な膜状の部分が細胞接着面の約５０％を占める基材である。培地を除去した後、タンパク質換算で１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ若しくは０．１μｇ／ｍＬの上記賦活化剤を含む又は賦活化剤を含まないＭＳＣ培養培地を、それぞれＰｒｅｓｅｔ　ＶＥＣＥＬＬ　６ｗｅｌｌに２ｍＬ、Ｃｅｌｌｂｅｄ　２４ｗｅｌｌ及び基材Ａに０．６ｍＬ、３Ｄ－ｉｎｓｅｒｔ　ＰＳ－２００　１２ｗｅｌｌ及び３Ｄ－ｉｎｓｅｒｔ　ＰＳ－４００　１２ｗｅｌｌに１ｍＬを加えて３７℃で４日間培養を行った。この培養を１～３回行った後、細胞を回収して、継代数１～３のＯＡ－ＭＳＣを調製した。
　さらに、平板状の２次元細胞培養担体であるＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）細胞培養　６ｗｅｌｌプレート（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社）に賦活化剤を含まないＭＳＣ培養培地で培養したＯＡ－ＭＳＣ　６×１０４細胞／ｗｅｌｌを播種し、１００μｇ／ｍＬの賦活化剤の存在下で培養を行った。この培養をさらに１回繰り返すことで、継代数２の対照のＯＡ－ＭＳＣを調製した。
実施例１　細胞シートの調製
　賦活化剤を含まないＭＳＣ培養培地（１５％ＦＢＳ、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン、４５００ｍｇ／Ｌグルコース及びＬ－グルタミンを含有するＤＭＥＭ）でＯＡ－ＭＳＣを培養した。細胞を回収し、２次元培養担体（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）細胞培養　６ｗｅｌｌプレート、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社）に２．５ｃｍ×２．５ｃｍの細胞培養基材Ｂを入れ、８×１０４細胞のＭＳＣを播種し、１μｇ／ｍＬの賦活化剤を含むＭＳＣ培養培地２ｍＬを加えて、３７℃で７２時間培養を行うことで、継代数１のＯＡ－ＭＳＣのシートを調製した。この方法で調製されたＭＳＣシートは、おおよそ８，５００細胞／ｃｍ２のＭＳＣを含む。なお細胞培養基材Ｂは、国際公開ＷＯ２０１６／０６８２６６号パンフレット及びＬｉｕ　Ｌ，Ｋａｍｅｉ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　１２４（２０１７）　４７－５４に記載の方法で製造される、ポリグリコール酸からなるベース部材上にポリグリコール酸からなるナノファイバーを含有する３次元培養担体である。
実施例２　ＭＳＣの遺伝子発現解析
　参考例１及び実施例１で調製したＭＳＣを回収し、Ｔｒｉ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。逆転写反応によりｃｌｏｎｅ　ＤＮＡを合成し、ＯＣＴ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ２、ＤＮＭＴ１、ＴＥＲＴ、ＩＬ－６、ＩＤＯ、ＴＳＧ－６、ｐ１６ｉｎｋ４ａ、ｐ２１、ｐ５３、α－ＳＭＡ及び１８ｓＲＮＡについて、表１に示した塩基配列からなるプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。
表中の（Ｆ）はフォワードプライマーを、（Ｒ）はリバースプライマーを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　１８ｓＲＮＡをハウスキーピング遺伝子として、２次元培養担体上で１００μｇ／ｍＬの賦活化剤の存在下で培養した対照のＯＡ－ＭＳＣをもとにΔΔＣＴ値を算出し、遺伝子発現プロファイルを解析して、クラスター化した。Ｐｒｅｓｅｔ　ＶＥＣＥＬＬ上で０．１μｇ／ｍＬの賦活化剤の存在下で培養したＯＡ－ＭＳＣ（ＶＥＣＥＬＬ＿０．１）、Ｃｅｌｌｂｅｄ上で０．１、１又は１０μｇ／ｍＬの賦活化剤の存在下で培養したＯＡ－ＭＳＣ（それぞれＣｅｌｌＢｅｄ＿０．１、ＣｅｌｌＢｅｄ＿１、ＣｅｌｌＢｅｄ＿１０）、３Ｄ－ｉｎｓｅｒｔ　ＰＳ－２００上で０．１μｇ／ｍＬの賦活化剤の存在下で培養したＯＡ－ＭＳＣ（３Ｄ．ｉｎｓｅｒｔ２００＿０．１）、３Ｄ－ｉｎｓｅｒｔ　ＰＳ－４００上で１０μｇ／ｍＬの賦活化剤の存在下で培養したＯＡ－ＭＳＣ（３Ｄ．ｉｎｓｅｒｔ４００＿１０）、基材Ａ上で０．１μｇ／ｍＬの賦活化剤の存在下で培養したＯＡ－ＭＳＣ（Ａ＿０．１）、基材Ａ上で１μｇ／ｍＬの賦活化剤の存在下で培養したＯＡ－ＭＳＣ（Ａ＿１）、基材Ｂ上で０．１μｇ／ｍＬの賦活化剤の存在下で培養したＯＡ－ＭＳＣ（Ｂ＿０．１）、及び２次元培養担体上で１００μｇ／ｍＬの賦活化剤の存在下で培養した対照のＯＡ－ＭＳＣ（２Ｄ＿１００）の結果を図１に示す。
　２Ｄ＿１００と比較して、３次元培養担体上で賦活化剤存在下で培養されたＯＡ－ＭＳＣはいずれも、幹細胞性に関与する遺伝子とされるＤＮＭＴ１、Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ２及びＯＣＴ４、免疫制御・抗炎症機能に関与する遺伝子とされるＩＤＯ、ＴＳＧ６及びＩＬ－６、テロメアーゼ活性に関与する遺伝子とされるＴＥＲＴの発現量が増加しており、細胞老化に関与する遺伝子とされるＰ５３、細胞骨格に関与する遺伝子とされるα－ＳＭＡの発現量が減少していることが確認された。ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ＤＮＭＴ１、ＩＤＯ、ＴＳＧ６、ＩＬ－６及びＴＥＲＴはいずれも治療効果が高いＭＳＣにおいて発現が亢進するマーカーであり、Ｐ５３及びα－ＳＭＡは治療効果が高いＭＳＣにおいて発現が抑制されるマーカーである。またｐ１６ｉｎｋ４ａは、本発明者らが見出した、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ＩＤＯ及びＴＳＧ６と高い相関を示す治療効果の正のマーカーである。これらの結果から、いずれの３次元培養担体上で培養したＯＡ－ＭＳＣも、２次元培養担体上で培養したＯＳ－ＭＳＣよりも治療効果が高いと考えられた。一方、Ａ＿１及びＡ＿０．１は２Ｄ＿１００と類似した遺伝子発現プロファイルを示しており、基材Ａ上で培養したＯＡ－ＭＳＣの治療効果は、通常の２次元培養担体上で培養したＯＡ－ＭＳＣと同程度であると推測された。
実施例３　細胞シートの腎臓病治療効果（急性腎障害を併発した糖尿病性腎症）
　糖尿病性腎症を発症している１４月齢の雄性ＯＬＥＴＦラット（星野試験動物）に、リツキシマブ（中外製薬）５ｍｇ／匹を１日１回４日間、尾静脈投与した。リツキシマブ初回投与から１０～１４日後、リツキシマブを投与したラットの腎臓に実施例１のＭＳＣシートを移植した（ＭＳＣシート群、ｎ＝６）。リツキシマブ投与のみをＶｅｈｉｃｌｅとした（Ｖｅｈｉｃｌｅ群、ｎ＝７）。イソフルラン吸入麻酔下、側臥位のラットの最下位肋骨下より皮切を入れ、筋層を切開して一方の腎臓を体外に引き出した。ゲロータ筋膜、脂肪層及び線維被膜を、副腎を損傷しないように慎重に切開して腎表面から剥がし、腎門部に引き寄せた。２．５ｃｍ×２．５ｃｍのＭＳＣシート１枚及び１／３に切った同ＭＳＣシート１枚を、腎臓の全体を包むように貼付した。他方の腎臓にも同様にＭＳＣシートを貼付した。ＭＳＣシート移植日、移植後３週及び６週時にラットから血液を採取し、酵素法（ＳＲＬ）を用いて血清クレアチニンを測定した。
　移植後１１週間生存していた動物（Ｖｅｈｉｃｌｅ群、ＭＳＣシート群ともｎ＝２）の血清クレアチニンの推移を図２に示す。Ｖｅｈｉｃｌｅ群では血清クレアチニンの経時的な上昇が認められたのに対し、ＭＳＣシート群では血清クレアチニン値の上昇は認められなかった。この６週間の腎機能維持は、ヒトでは５年間の透析開始遅延に相当し、ＭＳＣシートの高い治療効果を示している。また、移植後１１週までの生存率を表すカプランマイヤー曲線を図３に示す。ＭＳＣシート群は、Ｖｅｈｉｃｌｅ群と比べて高い生存率を示した。
　さらに、移植後１１週の動物から摘出した腎臓の組織切片を作成し、ＰＡＳ染色標本の光学顕微鏡観察、及び電子顕微鏡観察を行った。Ｖｅｈｉｃｌｅ群ではほとんどの糸球体に硬化を認め、メサンギウム細胞及びポドサイトの異常が観察された（図４左上、図５）。また尿細管においては尿細管間質の炎症細胞浸潤、尿細管上皮細胞の異常、尿細管上皮の脱落、基底膜の肥厚等が認められた（図４左下、図６、図７）。一方、ＭＳＣシート群では、正常な糸球体が残存し（図４右上）、メサンギウム細胞及びポドサイトが正常化していた（図８）。また尿細管上皮細胞の再生像（図４右下の矢印）、微絨毛が明瞭な近位尿細管上皮、尿細管間質の炎症細胞の減少（図９）が認められる等、治癒を示す組織学的所見が確認された。さらに、ＭＳＣシート群では、腎表面に新たな被膜状構造の形成、その外側に多数の毛細血管の再生が確認された（図１０、図１１）。
　本試験で用いたラットは、糖尿病性腎症に加えて抗がん剤処置によりさらに急性腎障害を誘導することで程度の揃った重篤な慢性腎臓病を発症するモデル動物であり、腎症第４期（腎不全期）に相当する非常に重篤な末期腎障害を呈していた。本発明の細胞シートは、このような重篤な疾患に対しても優れた治療効果を示すことが確認された。
実施例４　細胞シートの腎臓病治療効果（糖尿病性腎症）
　糖尿病性腎症を発症している１４月齢の雄性ＯＬＥＴＦラット腎臓に、実施例１で調製した細胞シートを、実施例３と同様にして腎線維被膜下に移植した（ｎ＝２／群）。背部皮膚及び筋膜を切開したのみの偽手術を施したラットをＳｈａｍ群とした。ＭＳＣシート移植日、移植後４週及び１１週時にラットから血液を採取し、酵素法（ＳＲＬ）を用いて血清クレアチニンを、ＵＶ法（ＳＲＬ）を用いて尿素窒素（ＢＵＮ）を測定した。
　血清クレアチニン及びＢＵＮの推移を図１２に示す。Ｓｈａｍ群では血清クレアチニン及びＢＵＮの経時的な上昇が認められたのに対し、ＭＳＣシート群では認められなかった。本発明のシートは、急性腎障害を伴わない糖尿病性腎症においても優れた治療効果を示すことが確認された。
実施例５　細胞シートの腎臓病治療効果（糖尿病性腎症）
　賦活化剤を含まないＭＳＣ培養培地（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン、４５００ｍｇ／Ｌグルコース及びＬ－グルタミンを含有するＤＭＥＭ）で、ＯＡ－ＭＳＣを培養した。細胞を回収し、２次元培養担体（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）　Ｎｕｎｃ（商標）　Ｌａｂ－ＴｅｋＴＭ、８ｗｅｌｌ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社）に、１×０．８ｃｍのネオベールナノ（グンゼ株式会社）を入れ、４×１０３細胞のＭＳＣを播種し、賦活化剤を含まない２００μＬのＭＳＣ培地を加えて、３７℃で２４時間培養を行うことで、継代数１のＯＡ－ＭＳＣシートを調製した。この方法で調製されたＭＳＣシートは、４７８１細胞／ｃｍ２（調製した各シートの平均細胞密度３９２３～５８８４細胞／ｃｍ２の平均値）のＭＳＣを含む。
　糖尿病性腎症を発症している１６週齢の雄性ＫＫ－Ａｙマウスの両腎に、ゲロータ筋膜、脂肪層及び線維皮膜を、副腎を損傷しないように慎重に切開して腎表面から剥がし、上記で作製したＭＳＣシートを腎臓の全体を包むように貼付し、移植した（ｎ＝１２）。コントロールとして、未処置の糖尿病性腎症を発症している同週齢のＫＫ－Ａｙ（ｎ＝９）を用意した。ＭＳＣシート移植前及び移植後４週時にマウスの尿を採取し、免疫比濁法(オリエンタル酵母工業株式会社)を用いて尿中アルブミンを、酵素法(オリエンタル酵母工業株式会社)を用いて尿中クレアチニンを測定した。
　ＭＳＣシート移植前とＭＳＣシート移植後４週時との尿中アルブミン／クレアチニン比の差を図１３に示す。尿中アルブミン／クレアチニン比は、未処置群では増加したが、ＭＳＣシート群ではむしろ減少する傾向が認められた。本実施例において使用した細胞シートは実施例１で調製した細胞シートよりも平均細胞密度が低いにもかかわらず、実施例１で調製した細胞シートと同様に、糖尿病性腎症への優れた治療効果を示すことが確認された。
実施例６　細胞シートの腎臓病治療効果（虚血再灌流による急性腎障害）
１）細胞シートの調製
　実施例１の方法に準じて、表２に示す細胞数のＭＳＣを２．５ｃｍ×２．５ｃｍの基材Ｂに播種し、賦活化剤を含まないＭＳＣ培養培地で培養することで、異なる平均細胞密度のＭＳＣを有する細胞シートを調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　細胞シートＡ～Ｇ上のＭＳＣをＤＡＰＩ（４′，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）染色し、顕微鏡観察を行った（図１４）。ＭＳＣを同培養担体上でコンフルエンスに達するまで培養したときの細胞密度を１００％としたときの各細胞シート上の％コンフルエンスを測定したところ、シートＡ～Ｃが９０％～７０％コンフルエンス、Ｄ～Ｆが６０％～１０％コンフルエンス、Ｇが１０％未満コンフルエンスであった。
２）遺伝子発現解析
　実施例２と同様にして、細胞シートＢ、Ｇ及びＨのＭＳＣにおけるＯＣＴ４、Ｎａｎｏｇ、ｐ１６ｉｎｋ４ａ及びＴＥＲＴの発現量をリアルタイムＰＣＲによって測定した（図１５）。平均細胞密度が低くなるほど全ての遺伝子の発現量が多く、平均細胞密度の低い細胞シート上の個々のＭＳＣの治療効果は、平均細胞密度の高い細胞シート上の個々のＭＳＣよりも高いと推定された。
３）虚血再灌流による急性腎障害モデルラットへの移植試験
　麻酔下の５週齢の雄性ＳＤラットに腹部正中切開を行った。まず右腎を同定し、右腎動脈を血管用クランプで遮断した。遮断後すぐに上記１）で調製した細胞シートＡ～Ｇのそれぞれを、実施例３と同様にして腎線維被膜下に移植した。６０分間の遮断の後、血管用クランプを開き、遮断を解除した。左腎についても、上記同様に左腎動脈を遮断し、細胞シートを移植し、６０分間遮断の後、遮断を解除した（ｎ＝１又は２／群）。また、細胞シートを移植せずに、ゲロータ筋膜、脂肪層及び線維被膜を腎表面から剥がして腎門部に引き寄せた群（Ｓｈａｍ－腎被膜処理あり）と、引き寄せた後に元に戻した群（Ｓｈａｍ－腎被膜処理なし）を用意した。
　移植後１０日目までの各ラットの生存日数と細胞シートの平均細胞密度との関係を図１６に、平均細胞密度のグループ（高、中、低）毎の生存率を表すカプランマイヤー曲線を図１７に示す。平均細胞密度が中程度であるシートＤ～Ｆを移植したラットは、すべて移植後１０日目まで生存したが、平均細胞密度が高いシートＡ～Ｃを移植したマウスのうちの半数、及び平均細胞密度が低いシートＧを移植したマウスは、いずれも１０日目までに死亡した。ＭＳＣの絶対数が多いシートＡ～Ｃの上記結果は、個々のＭＳＣの治療効果が低いためと推察される。また、個々のＭＳＣの治療効果が最も高いと推定されるシートＧの上記結果は、治療効果の発揮に必要とされる細胞の絶対数が不足しているためと推察される。
　また、移植後１０日目までのＳｈａｍ－腎被膜処理あり群及びＳｈａｍ－腎被膜処理なし群の生存率を表すカプランマイヤー曲線を図１８に示す。Ｓｈａｍ－腎被膜処理あり群はＳｈａｍ－腎被膜処理なし群よりも生存率の低下速度が小さかったことから、ゲロータ筋膜、脂肪層及び線維被膜を腎表面から剥がして腎実質から遠ざけることにより、急性腎障害の影響が緩和されることが確認された。
実施例７　細胞シートのアルツハイマー病治療効果
１）細胞シートの調製
　実施例６の１）の方法に準じて、表３に示す細胞数のＭＳＣを２．５ｃｍ×２．５ｃｍの基材Ｂに播種し、賦活化剤を含まないＭＳＣ培養培地で培養することで、異なる平均細胞密度のＭＳＣを有する細胞シートを調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
２）アルツハイマー病モデルマウスへの移植試験
　１５月齢の雄性ＡＰＰ／ＰＳ１マウス（チャールズリバー）を、イソフルラン吸入麻酔下、ｂｒｅｇｍａ　ｌｅｖｅｌからｌａｍｂｄａ　ｌｅｖｅｌまで８ｍｍ×５ｍｍの大きさの開窓部ができるように開頭した。８ｍｍ×５ｍｍの大きさに切った細胞シートを開窓部からそれぞれ１枚脳表面に貼り付け、５分間静置した後、頭蓋骨を戻して縫合した。
　移植後３週目に、新奇物体認識試験を行った。新奇物体認識試験の内容は次の通りである。０日目に何も入っていないボックスにマウスを５分間入れ、環境になじませた。１日目に２つの同じ物体を入れたボックスにマウスを５分間入れ（Ｆａｍｉｌｉａｒｉｚａｔｉｏｎ）、１時間後に１つの物質を新奇物体に変え、５分間に新奇物体又は既存物を探索する各時間を測定した。２つの物体の総探索時間に対する新奇物体の探索時間の割合（Ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｉｎｄｅｘ；新奇／（新奇＋既存物体探索時間）×１００％）を算出し、５０％以上を認知機能良好とした。物体の位置は試験を通じて同じ位置に設置した。
　移植したシートの平均細胞密度に応じて２群に分けてＰｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｉｎｄｅｘをプロットした結果を図１９に示す。１．５０×１０４細胞／ｃｍ２以下のシートを移植したマウスでは、Ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｉｎｄｅｘは高く、認知機能は良好であったことから、本発明の細胞シートはアルツハイマー病に対しても治療効果を示すことが確認された。
実施例８　マウス脂肪組織由来ＭＳＣを用いた細胞シートの腎臓病に対する効果
１）細胞シートの調製
　Ｃ５７ＢＬ／６（雄、１０週齢）の精巣上体周囲脂肪を採取し、細かく切り刻んだ後、０．４ＰＺ　ｕｎｉｔｓ／ｍＬのリベラーゼ（商標）を含むＰＢＳを脂肪１ｇあたり１ｍＬ加え、３７℃で２時間静置した。１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を５ｍＬ加えて懸濁後、３００ｇ×５分遠心分離して上清を除去した。脂肪１ｇから回収した細胞ペレットを１５ｃｍ　ｄｉｓｈ　１枚に播種し、１０％ＦＢＳ、１％ＰＳを含むＤＭＥＭ培地で４日間培養し、培地を交換後、接着細胞（マウス脂肪組織由来ＭＳＣ）を回収した。
　６×１０４／ｃｍ２、３×１０４／ｃｍ２、４×１０３／ｃｍ２のマウス脂肪組織由来ＭＳＣをそれぞれ１×０．８ｃｍのネオベールナノ（グンゼ株式会社）に播種し、賦活化剤を含まないＭＳＣ培養培地２ｍＬを加え、３７℃で２４時間培養を行うことで、培養後の最終細胞密度（平均値±標準誤差、ＤＡＰＩ染色細胞数）が４５４８０±４９５３／ｃｍ２、２７５４１±５４７５／ｃｍ２、３８００±９０８／ｃｍ２の、継代数１の細胞シートを作成した。各細胞シート上のＭＳＣをＤＡＰＩ染色した顕微鏡観察画像を図２０に示す。
２）虚血再灌流による急性腎障害モデルマウスへの移植試験
　麻酔下の１０－１１週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ６マウスの右側後背部に切開をいれ、右腎臓を露出させた。右側腎動静脈を結紮し、右腎臓動脈静脈を切除し、右腎を摘出した。出血が無いことを確認し、腎臓を体内の元の位置に戻し、皮膚を閉創した。次に、左側後背部に切開をいれ、左腎臓を露出させ、左腎動静脈を非侵襲性血管用クリップで血流を遮断した。２２分間遮断の間、ゲロータ筋膜、脂肪層及び線維皮膜を、副腎を損傷しないように慎重に切開して腎表面から剥がし、腎門部に引き寄せた。４５４８０細胞／ｃｍ２の細胞シート（ｎ＝４）、２７５４１細胞／ｃｍ２の細胞シート（ｎ＝４）又は３８００細胞／ｃｍ２の細胞シート（ｎ＝３）を腎臓の全体を包むように貼付し、左腎の虚血開始２２分後にクリップを外して血液を再灌流させた。コントロールとして、細胞シートを移植せずに右腎摘出後、左腎を２２分間虚血し再灌流させた群（Ｓｈａｍ群：ｎ＝３）、及び未処置の正常マウス（ｎ＝４）を用意した。
　細胞シート貼付から２４時間後にマウスから血液を採取し、ＵＶ法（ＳＲＬ）を用いて尿素窒素（ＢＵＮ）を測定した。結果を図２１に示す。高細胞密度（４５４８０細胞／ｃｍ２）の細胞シートを移植した群のＢＵＮはＳｈａｍ群と同程度であり、急性腎障害の進行が認められたのに対し、中細胞密度又は低細胞密度（２７５４１細胞／ｃｍ２、３８００細胞／ｃｍ２）の細胞シートを移植した群のＢＵＮは正常マウスと同程度であった。以上から、マウス脂肪組織由来ＭＳＣを用いた本発明の細胞シートは、ヒト骨髄由来ＭＳＣを用いた本発明の細胞シートと同様に、急性腎障害の進行を抑制する効果を示すことが確認された。

Claims (18)

  1. 　平均細胞密度が３．０×１０４細胞／ｃｍ２以下の間葉系幹細胞をその表面に有する、生体移植用細胞シート。
  2. 　さらに生体適合性の支持体を含む、請求項１に記載の細胞シート。
  3. 　支持体がファイバーからなる３次元構造を有する細胞培養担体である、請求項２に記載の細胞シート。
  4. 　細胞培養担体が、ナノメートル～マイクロメートル単位の平均繊維径を有するファイバーによって細胞との接触面上に形成された開口部を有する、請求項３に記載の細胞シート。
  5. 　開口部の平均径が５００ｎｍ～１０００μｍである、請求項４に記載の細胞シート。
  6. 　支持体が、生分解性ポリマーからなるナノファイバーを含有してなる細胞培養担体である、請求項２から５のいずれか一項に記載の細胞シート。
  7. 　腎臓病の治療に用いるための、平均細胞密度が１．０×１０３細胞／ｃｍ２～３．０×１０４細胞／ｃｍ２の間葉系幹細胞をその表面に有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の細胞シート。
  8. 　腎臓の線維被膜下に適用するための、請求項７に記載の細胞シート。
  9. 　脳損傷又は神経変性疾患の治療に用いるための、平均密度が０．５×１０３細胞／ｃｍ２～１．５×１０４細胞／ｃｍ２の間葉系幹細胞をその表面に有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の細胞シート。
  10. 　脳の損傷部位、変性部位又はそれらの近傍に適用するための、請求項９に記載の細胞シート。
  11. 　間葉系幹細胞が骨髄又は脂肪組織由来の間葉系幹細胞である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の細胞シート。
  12. 　間葉系幹細胞が疾患を有する対象から分離された間葉系幹細胞である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の細胞シート。
  13. 　ファイバーからなる３次元構造を有する細胞培養担体上に、間葉系幹細胞を３．０×１０５細胞／ｃｍ２以下の細胞数で播種する工程、及び
    　間葉系幹細胞を培養して、平均細胞密度が３．０×１０４細胞／ｃｍ２以下の細胞シートを調製する工程
    を含む、生体移植用細胞シートの製造方法。
  14. 　細胞培養担体が、ナノメートル～マイクロメートル単位の平均繊維径を有するファイバーによって細胞との接触面上に形成された開口部を有する、請求項１３に記載の製造方法。
  15. 　開口部の平均径が５００ｎｍ～１０００μｍである、請求項１４に記載の製造方法。
  16. 　細胞培養担体が、生分解性ポリマーからなるナノファイバーを含有してなる細胞培養担体である、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の製造方法。
  17. 　間葉系幹細胞が骨髄又は脂肪組織由来の間葉系幹細胞である、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の製造方法。
  18. 　間葉系幹細胞が疾患を有する対象から分離された間葉系幹細胞である、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の製造方法。

     
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