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WO2019135266A1 - 細胞画像処理装置、細胞画像処理方法および細胞画像処理プログラム - Google Patents

細胞画像処理装置、細胞画像処理方法および細胞画像処理プログラム Download PDF

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WO2019135266A1
WO2019135266A1 PCT/JP2018/000021 JP2018000021W WO2019135266A1 WO 2019135266 A1 WO2019135266 A1 WO 2019135266A1 JP 2018000021 W JP2018000021 W JP 2018000021W WO 2019135266 A1 WO2019135266 A1 WO 2019135266A1
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WO
WIPO (PCT)
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cell
rate
inflow
image
region
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2018/000021
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
朗 松下
良介 村田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Olympus Corp
Original Assignee
Olympus Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Olympus Corp filed Critical Olympus Corp
Priority to PCT/JP2018/000021 priority Critical patent/WO2019135266A1/ja
Publication of WO2019135266A1 publication Critical patent/WO2019135266A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor

Definitions

  • the present invention relates to a culture image processing apparatus, a cell image processing method, and a cell image processing program.
  • the present invention has been made in view of the above-described circumstances, and a cell image processing device, a cell image processing method, and a cell image capable of accurately detecting cell proliferation and accurately managing cell culture.
  • the purpose is to provide a processing program.
  • a plurality of images obtained by capturing cells at time intervals are input, and any two of the input images are processed to obtain the images
  • a cell number change rate calculation unit that calculates a cell number change rate that is a change in the cell number per unit time in the first area of the first area, and any two of the images in the input image
  • a cell inflow rate calculating unit that calculates a cell inflow rate, which is the number of cells inflow per unit time into the second region of the image, and any two of the images in the input image
  • a cell flow rate calculation unit that calculates a cell flow rate, which is the number of cell flows per unit time from within the second region; the cell number change rate calculated by the cell number change rate calculation unit;
  • a proliferation rate calculation unit that calculates a cell proliferation rate per unit time in the third region of the image based on the cell efflux rate calculated by the cell efflux rate calculation unit.
  • any two images of the input images are processed by the cell number change rate calculation unit And the cell number change rate in the first region is calculated.
  • any two images in the input image are processed by the cell inflow rate calculating unit to calculate the cell inflow rate into the second region.
  • any two images in the input image are processed by the cell efflux rate calculation unit to calculate the cell efflux rate from within the second region.
  • the growth rate calculation unit calculates the cell growth rate based on the cell number change rate, the cell inflow rate, and the cell outflow rate. Since the cell proliferation rate can be determined not only in terms of the cell number change rate but also the cell inflow rate and the cell outflow rate in two time-spaced images, the degree of cell proliferation due to cell division is more accurate It can be detected well and the cell culture can be managed precisely.
  • the calculation of the cell number change rate, the cell inflow rate and the cell outflow rate may use the same two images or different images. That is, the time interval between two images for calculating the cell number change rate, the cell inflow rate and the cell outflow rate may be different from each other.
  • the cell number change rate may be calculated for all two adjacent images, and the cell inflow rate and the cell outflow rate may be calculated periodically or aperiodically without calculating for all images. It may be calculated for the two selected images.
  • the first region, the second region, and the third region may be the same or different.
  • the growth rate calculation unit calculates a correction change rate, which is a change rate of the number of cells in the third region, based on the cell number change rate, and the third change rate is calculated based on the cell inflow rate.
  • the corrected inflow rate which is the inflow rate into the area, is calculated
  • the corrected outflow rate which is the outflow rate from the third area, is calculated based on the cell outflow rate, and the corrected inflow rate is calculated from the corrected change rate.
  • the cell proliferation rate may be calculated by subtraction and addition of the corrected outflow rate.
  • a cell mortality rate calculation part which computes a cell death rate which is a death number of the above-mentioned cell per unit time in the 3rd field, and the above-mentioned growth rate calculation part
  • the cell proliferation rate may be calculated by subtracting the corrected inflow rate, adding the corrected outflow rate, and subtracting the cell mortality rate.
  • the cell mortality calculation unit calculates the cell mortality in the third region, and the corrected inflow rate and the cell mortality are subtracted from the corrected change rate. By adding the corrected outflow rate, the cell proliferation rate can be detected more accurately.
  • the cell mortality calculation unit may count the number of cells suspended per unit time in the third region. By doing this, when observing cells that adhere to and grow on the bottom of the culture vessel, the number of cell death is easily calculated by counting the number of suspended cells in the third region. be able to.
  • the cell inflow rate calculation unit counts the number of cells flowing into the second area across the boundary with another area adjacent to the second area per unit time, and
  • the outflow rate calculating unit may count the number of cells flowing out of the second area across the boundary per unit time. In this way, the cell inflow rate and the cell outflow rate can be calculated more accurately by monitoring the boundary between the second region and the other region and counting the number of cells moved across the boundary. Can.
  • the cell inflow rate calculating unit and the cell outflow rate calculating unit may use the image with an interval equal to or less than a time obtained by dividing the length of the cell by the speed of the cell. . In this way, cells located near the boundary in the second region, cells that have entered the second region from the adjacent region, or cells that have moved from the other locations in the second region to near the boundary And the cell inflow rate and the cell outflow rate can be accurately calculated.
  • another aspect of the present invention includes a processor into which a plurality of images acquired by capturing a cell at intervals of time are input, and the processor is any of the input images
  • the two images are processed to calculate a cell number change rate which is a change in the number of cells per unit time in the first region of the images, and any two images in the input image are calculated.
  • Processing to calculate a cell inflow rate which is the number of cells inflow per unit time into the second area of the image, and processing any two of the images in the input image to process the second
  • the cell outflow rate which is the number of cell outflows per unit time from the area, is calculated, and the third area of the image is calculated based on the calculated cell number change rate, the cell inflow rate, and the cell outflow rate. Calculate the cell growth rate per unit time in Providing a cell image processing apparatus.
  • a plurality of images acquired by capturing cells at time intervals are input, and any two of the input images are processed.
  • Calculating a cell number change rate calculating a cell number change rate which is a change in the cell number per unit time in the first region of the image, and processing any two images in the input image
  • Calculating a cell inflow rate which is the number of cells inflow per unit time into the second region of the image, and any two of the images in the input image.
  • Cell flow rate calculation step of processing and calculating a cell flow rate which is the number of cell flows per unit time from within the second region, and the cell number change rate calculated by the cell number change rate calculation step Calculating the cell inflow rate Cell proliferation rate per unit time in the third region of the image based on the cell inflow rate calculated by the cell flow rate and the cell outflow rate calculated by the cell outflow rate calculating step It is a cell image processing method including the calculation step.
  • a plurality of images acquired by capturing cells at time intervals are input, and any two of the input images are processed.
  • Calculating a cell number change rate calculating a cell number change rate which is a change in the cell number per unit time in the first region of the image, and processing any two images in the input image
  • Calculating a cell inflow rate which is the number of cells inflow per unit time into the second region of the image, and any two of the images in the input image.
  • Cell flow rate calculation step of processing and calculating a cell flow rate which is the number of cell flows per unit time from within the second region, and the cell number change rate calculated by the cell number change rate calculation step Calculating the cell inflow rate Cell proliferation rate per unit time in the third region of the image based on the cell inflow rate calculated by the cell flow rate and the cell outflow rate calculated by the cell outflow rate calculating step It is a cell image processing program which makes a computer execute a calculation step.
  • FIG. 1 is an overall configuration diagram showing a cell image processing apparatus according to an embodiment of the present invention. It is a figure explaining the effect
  • a cell image processing apparatus 1, a cell image processing method, and a cell image processing program according to an embodiment of the present invention will be described below with reference to the drawings.
  • a plurality of images P n and P n + 1 acquired by photographing with a time interval opened by an imaging unit 50 such as a microscope are input.
  • the cell image processing device 1 stores the image P n and P n + 1 input from the imaging unit 50 in a memory 2 that sequentially stores the image P n and P n + 1 in association with time information when the image P n and P n + 1 was captured. And a processing unit 3 for processing the captured images P n and P n + 1 .
  • the processing unit 3 processes the images P n and P n + 1 stored in the memory 2 to determine the number of cells per unit time of the number of cells in the first region R1 in the images P n and P n + 1 .
  • Cell number change rate calculation unit 4 that calculates change rates
  • cell inflow rate calculation that calculates the cell inflow rate, which is the number of cell X inflows per unit time into the second region R2 in the images P n and P n + 1
  • Cell flow rate calculation unit 6 that calculates the cell flow rate, which is the number of cell X flows out per unit time from the second region R2 in the image P n and P n + 1 , and the calculated cell number change
  • the proliferation rate calculating unit 7 is provided to calculate the cell proliferation rate in the counting area (third area) R3 from the rate, the cell inflow rate and the cell outflow rate.
  • the cell number change rate calculation unit 4 calculates the number N n of cells in the first region R1 in the two images P n and P n + 1 acquired with a time interval of the first time ⁇ t1. , N n + 1 are respectively counted, and the difference between the cell numbers N n and N n + 1 counted in the respective images P n and P n + 1 is divided by the first time ⁇ t 1 to obtain the cell numbers N n and N n + 1 per unit time.
  • the cell number change rate ⁇ N / ⁇ t which is the change rate of is calculated.
  • Cellular influx rate calculating unit 5 images P n on the basis of the image P n of the two obtained at a just time interval second time .DELTA.t2, to P n + 1, the in P n + 1 Per unit time by counting the inflow number ⁇ N MOVEINn + 1 of cells X entering the two regions R2 across the border from the adjacent region and dividing the counted inflow number ⁇ N MOVEINn + 1 of the cell X by the second time ⁇ t 2
  • the cell inflow rate ⁇ N MOVEIN which is the inflow number ⁇ N MOVEIN of the cells X, is to be calculated.
  • Cells outflow rate calculation part 6 also, as shown in FIG. 3, images P n on the basis of the image P n of the two obtained at a just time interval second time .DELTA.t2, to P n + 1, the in P n + 1
  • P n + 1 By counting the number of outflows ⁇ N MOVEOUTn + 1 of the cells X which exited across the boundary from the two regions R2 to the adjacent region, and dividing the counted number of outflows of the cells X ⁇ N MOVEOUTn + 1 by the second time ⁇ t2,
  • the cell outflow rate ⁇ N MOVEOUT / ⁇ t 2 which is the outflow number ⁇ N MOVEOUT of the cell X is calculated.
  • the second time ⁇ t2 for calculating the inflow of the cell X into the second region R2 and the outflow of the second region R2 preferably satisfies the following conditional expression (1).
  • D is the length of cell X
  • V is the migration rate of cell X.
  • the length D of the cell X and the migration rate V may be set to a reference value at the time of past counting, or may be set to an average value in the second region R2.
  • the threshold value E of the length to determine entry or exit, it is determined that the cell X enters as the threshold E from the boundary between the second region R2 and the adjacent region, and the boundary From the second region R2 to the adjacent region, the cell X may be determined to be withdrawn.
  • the growth rate calculation unit 7 is configured to calculate a cell growth rate ⁇ N BIRTH / ⁇ t, which is the number of cell divisions per unit time in the third region R3 which is a counting region. Specifically, the cell number change rate calculated for the first region R1 is converted to the corrected change rate ⁇ N / ⁇ t for the third region R3, and the cell inflow rate and the cell outflow rate calculated for the second region R2 are calculated as the third
  • the corrected inflow rate ⁇ N MOVEIN / ⁇ t is converted into the corrected inflow rate ⁇ N MOVEIN / ⁇ t and the corrected outflow rate ⁇ N MOVEOUT / ⁇ t for the region R3, and the corrected inflow rate ⁇ N MOVEIN / ⁇ t is subtracted from the corrected change rate ⁇ N / ⁇ t converted by the following equation (2)
  • the cell proliferation rate ⁇ N BIRTH / ⁇ t is calculated by adding the corrected outflow rate ⁇ N MOVEOUT / ⁇ t.
  • Conversion of the cell number change rate calculated for the first region R1 to the corrected change rate ⁇ N / ⁇ t for the third region R3 is, for example, an area ratio of the third region R3 to the first region R1 It is done by multiplying by. Also, conversion to the corrected inflow rate ⁇ N MOVEIN / ⁇ t and the corrected outflow rate ⁇ N MOVEOUT / ⁇ t for the third area R3 of the cell inflow rate ⁇ N MOVEIN / ⁇ t and the cell outflow rate ⁇ N MOVEOUT / ⁇ t calculated for the second area R2 For example, the area ratio between the third region R3 and the second region R2 is multiplied by the cell inflow rate ⁇ N MOVEIN / ⁇ t and the cell outflow rate ⁇ N MOVEOUT / ⁇ t.
  • a cell image processing method using the cell image processing apparatus 1 according to the present embodiment configured as described above will be described below.
  • the start time t1 of the count, the end time t m and the time interval ⁇ t of the counting is set (step S1).
  • the image P n + 1 obtained at time t n + 1 from the time t n has passed by the time interval ⁇ t is the number of cells N n + 1 in the count region R3 is processed in cell number change rate calculating section 4 is counted (number of cells Change rate calculation step S4).
  • the image P n and the image P n + 1 are used, and the number of cells ⁇ N MOVEIN n + 1 having entered into the counting area R1, R2, R3 from outside the counting area R1, R2, R3 and the counting area R1, R2, The number of cells ⁇ N MOVEOUT n + 1 having exited from the inside of R3 out of the counting areas R1, R2 and R3 is calculated (cell inflow rate calculating step S5, cell outflow rate calculating step S6). Then, in the growth rate calculation unit 7, the cell growth rate ⁇ N BIRTH n + 1 / ⁇ t per unit time is calculated by the following equation (growth rate calculation step S7).
  • the cell number change rate ⁇ N / ⁇ t, the cell inflow rate ⁇ N MOVEINn + 1 / ⁇ t, the cell outflow rate ⁇ N MOVEOUTn + 1 / ⁇ t, and the cell proliferation rate ⁇ N BIRTHn + 1 / ⁇ t are all calculated based on the same adjacent image.
  • ⁇ t exists in the denominator. Therefore, all terms can be multiplied by ⁇ t to be equivalently converted to the following conditional expression (4).
  • cell number change rate ⁇ N / ⁇ t cell inflow rate ⁇ N MOVEINn + 1 / ⁇ t
  • cell outflow rate ⁇ N MOVEOUTn + 1 / ⁇ t cell proliferation rate ⁇ N BIRTHn + 1 / ⁇ t are all calculated for the same counting areas R1, R2 and R3. So there is no need for conversion.
  • ⁇ N BIRTH n + 1 (N n + 1 -N n ) - ⁇ N MOVEIN n + 1 + ⁇ N MOVEOUT n + 1 (4)
  • the cell proliferation rate ⁇ N BIRTHn + 1 / ⁇ t corresponds to two images P n and P n + 1 with a time interval ⁇ t. Not only the cell number change rate ⁇ N / ⁇ t but also the cell inflow rate ⁇ N MOVEINn + 1 / ⁇ t and the cell outflow rate ⁇ N MOVEOUTn + 1 / ⁇ t are taken into consideration, so the degree of proliferation of the cell X by cell division is detected more accurately There is an advantage that the cell culture can be managed with high accuracy.
  • the counting area R1,1 is satisfied by satisfying the conditional expression (1).
  • Cells X entering and exiting R2 and R3 can be properly detected. That is, if ⁇ t2 is too short, it is necessary to calculate cell inflow rate ⁇ N MOVEINn + 1 / ⁇ t2 and cell outflow rate ⁇ N MOVEOUTn + 1 / ⁇ t2 for many images P n and P n + 1 one by one, the data amount increases and the load of counting increases.
  • the time ⁇ t1 for calculating the cell number change rate ⁇ N / ⁇ t is set shortest
  • the time ⁇ t2 for calculating the cell inflow rate ⁇ N MOVEINn + 1 / ⁇ t2 and the cell outflow rate ⁇ N MOVEOUTn + 1 / ⁇ t2 is larger than the time ⁇ t1 It is preferable to set to the appropriate time which satisfy
  • the processing unit 3 includes the cell number change rate calculating unit 4, the cell inflow rate calculating unit 5, the cell outflow rate calculating unit 6, and the proliferation rate calculating unit 7. It may be constituted by an electric circuit or may be constituted by one or more processors.
  • the present invention configures the cell number change rate calculation step S4, the cell inflow rate calculation step S5, the cell outflow rate calculation step S6, and the proliferation rate calculation step S7 by a cell image processing program that can be executed by a computer. May be
  • the cell death to calculate the cell mortality rate ⁇ N DEATHn + 1 / ⁇ t which is the death number ⁇ N DEATHn + 1 of the cell X per unit time in the third region R3.
  • the rate calculating unit 8 may be further provided.
  • the growth rate calculation unit 7 may calculate the cell growth rate ⁇ N BIRTHn + 1 / ⁇ t by the following equation (5) (step S11).
  • ⁇ N BIRTHn + 1 / ⁇ t (N n + 1 -N n ) / ⁇ t- ⁇ N MOVEIN n + 1 / ⁇ t + ⁇ N MOVEOUT n + 1 / ⁇ t + ⁇ N DEATH n + 1 / ⁇ t (5)
  • the death number ⁇ N DEATHn + 1 of the cell X counts the number N of cells suspended without being able to adhere to the bottom. It can be detected easily.
  • the time change of the counted cell number N and the calculated proliferating cell number ⁇ N BIRTH is graphically displayed on the display unit 60, instead of or in addition to this, Alternatively, at least one of the death number ⁇ N DEATH of the cell X, the inflow number ⁇ N MOVEIN of the cell X, and the outflow number ⁇ N MOVEOUT of the cell X may be displayed graphically.

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Abstract

細胞画像処理装置（１）は、時間間隔をあけて細胞を撮影することにより取得された複数枚の画像が入力され、いずれか２枚の画像を処理して第１領域内の単位時間当たりの細胞数の変化である細胞数変化率を算出する細胞数変化率算出部（４）と、いずれか２枚の画像を処理して第２領域内への単位時間当たりの細胞の流入数である細胞流入率を算出する細胞流入率算出部（５）と、いずれか２枚の画像を処理して第２領域内からの単位時間当たりの細胞の流出数である細胞流出率を算出する細胞流出率算出部（６）と、算出された細胞数変化率、細胞流入率および細胞流出率に基づいて、各画像の第３領域内における単位時間当たりの細胞増殖率を算出する増殖率算出部（７）とを備える。

Description

細胞画像処理装置、細胞画像処理方法および細胞画像処理プログラム
　本発明は、培養画像処理装置、細胞画像処理方法および細胞画像処理プログラムに関するものである。
　細胞の増殖の経時変化を定量的に観察するために、細胞の画像を解析して細胞の状況変化を表すパラメータを取得する技術が知られている（例えば、特許文献１参照。）。具体的には、画像内の細胞の占める面積の割合であるコンフルエント率に基づいて継代のタイミングを判定している。
　また、コロニーの形成など細胞の凝集と細胞分裂との関係を観察するために、細胞の凝集を表すパラメータとして注目画素と周辺画素の位置関係の統計量を取得する技術が知られている（例えば、特許文献２参照。）。
ＷＯ２０１６／０９８２７１号公報 特開２００９－２２９２７４号公報
　細胞の培養を精度よく管理するには、細胞が増殖しているか否かを精度よく検出する必要がある。しかしながら、特許文献１のようなコンフルエント率や特許文献２のような注目細胞周辺での細胞の凝集などのパラメータを取得しただけでは細胞の増殖を精度よく検出することはできないという不都合がある。
　本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、細胞の増殖を精度よく検出して、細胞の培養を精度よく管理することができる細胞画像処理装置、細胞画像処理方法および細胞画像処理プログラムを提供することを目的としている。
　本発明の一態様は、時間間隔をあけて細胞を撮影することにより取得された複数枚の画像が入力され、入力された前記画像の内のいずれか２枚の前記画像を処理して該画像の第１領域内の単位時間当たりの細胞数の変化である細胞数変化率を算出する細胞数変化率算出部と、入力された前記画像内のいずれか２枚の前記画像を処理して該画像の第２領域内への単位時間当たりの前記細胞の流入数である細胞流入率を算出する細胞流入率算出部と、入力された前記画像内のいずれか２枚の前記画像を処理して前記第２領域内からの単位時間当たりの前記細胞の流出数である細胞流出率を算出する細胞流出率算出部と、前記細胞数変化率算出部により算出された前記細胞数変化率と、前記細胞流入率算出部により算出された前記細胞流入率と、前記細胞流出率算出部により算出された前記細胞流出率とに基づいて、前記画像の第３領域内における単位時間当たりの細胞増殖率を算出する増殖率算出部とを備える細胞画像処理装置である。
　本態様によれば、時間間隔をあけて撮影することにより取得された複数枚の画像が入力されると、入力された画像の内のいずれか２枚の画像が細胞数変化率算出部により処理されて第１領域内の細胞数変化率が算出される。また、入力された画像内のいずれか２枚の画像が細胞流入率算出部により処理されて第２領域内への細胞流入率が算出される。さらに、入力された画像内のいずれか２枚の画像が細胞流出率算出部により処理されて第２領域内からの細胞流出率が算出される。
　そして、増殖率算出部により、細胞数変化率と細胞流入率と細胞流出率とに基づいて細胞増殖率が算出される。
　細胞増殖率が、時間間隔をあけた２枚の画像における細胞数変化率のみならず、細胞流入率および細胞流出率をも考慮して求められるので、細胞分裂による細胞の増殖の度合をより精度よく検出して、細胞培養を精度よく管理することができる。
　ここで、細胞数変化率、細胞流入率および細胞流出率の算出は同じ２枚の画像を用いてもよいし、異なる画像を用いてもよい。すなわち、細胞数変化率、細胞流入率および細胞流出率を算出するための２枚の画像の時間間隔はそれぞれ異なっていてもよい。例えば、細胞数変化率については隣接する全ての２枚の画像について算出してもよいし、細胞流入率および細胞流出率については、全ての画像について算出することなく周期的にあるいは非周期的に選択した２枚の画像について算出することにしてもよい。また、第１領域、第２領域および第３領域は同じであってもよいし異なっていてもよい。
　上記態様においては、前記増殖率算出部が、前記細胞数変化率に基づいて前記第３領域内における細胞数の変化率である補正変化率を算出し、前記細胞流入率に基づいて前記第３領域内への流入率である補正流入率を算出し、前記細胞流出率に基づいて前記第３領域内からの流出率である補正流出率を算出し、前記補正変化率から前記補正流入率を減算し、前記補正流出率を加算して、前記細胞増殖率を算出してもよい。
　このようにすることで、第１領域について算出した細胞数変化率、第２領域について算出した細胞流入率および細胞流出率について、最終的に細胞増殖率を算出する第３領域についての補正変化率、補正流入率および補正流出率に変換してから、細胞増殖率を算出することができる。
　また、上記態様においては、前記第３領域内における単位時間当たりの前記細胞の死亡数である細胞死亡率を算出する細胞死亡率算出部を備え、前記増殖率算出部が、前記補正変化率から前記補正流入率を減算し、前記補正流出率を加算し、かつ前記細胞死亡率を減算して前記細胞増殖率を算出してもよい。
　このようにすることで、細胞が死亡する事象が発生する環境下において、細胞死亡率算出部により第３領域内における細胞死亡率が算出され、補正変化率から補正流入率および細胞死亡率が減算され、補正流出率が加算されることにより、細胞増殖率をより精度よく検出することができる。
　また、上記態様においては、前記細胞死亡率算出部が、前記第３領域内において単位時間当たりに浮遊した細胞数を計数してもよい。
　このようにすることで、培養容器の底面に接着して増殖する細胞を観察している場合に、第３領域内において浮遊した細胞数を計数することにより、容易に細胞の死亡数を算出することができる。
　また、上記態様においては、前記細胞流入率算出部が、単位時間当たりに前記第２領域に隣接する他の領域との境界を横切って前記第２領域に流入する細胞数を計数し、前記細胞流出率算出部が、単位時間当たりに前記境界を横切って前記第２領域から流出する細胞数を計数してもよい。
　このようにすることで、第２領域と他の領域との境界を監視してその境界を横切って移動した細胞数を計数することにより、細胞流入率および細胞流出率をより精度よく算出することができる。
　また、上記態様においては、前記細胞流入率算出部および前記細胞流出率算出部が、前記細胞の長さを前記細胞の速度で除算した時間以下の間隔をあけた、前記画像を用いてもよい。
　このようにすることで、第２領域内の境界近傍に位置する細胞と、隣接する領域から第２領域内に入ってきた細胞あるいは第２領域内の他の場所から境界近傍に移動してきた細胞とを区別することができ、細胞流入率および細胞流出率を精度よく算出することができる。
　また、本発明の他の態様は、時間間隔をあけて細胞を撮影することにより取得された複数枚の画像が入力されるプロセッサを備え、該プロセッサが、入力された前記画像の内のいずれか２枚の前記画像を処理して該画像の第１領域内の単位時間当たりの細胞数の変化である細胞数変化率を算出し、入力された前記画像内のいずれか２枚の前記画像を処理して該画像の第２領域内への単位時間当たりの細胞の流入数である細胞流入率を算出し、入力された前記画像内のいずれか２枚の前記画像を処理して前記第２領域内からの単位時間当たりの前記細胞の流出数である細胞流出率を算出し、算出された前記細胞数変化率、前記細胞流入率および前記細胞流出率に基づいて、前記画像の第３領域内における単位時間当たりの細胞増殖率を算出する細胞画像処理装置を提供する。
　また、本発明の他の態様は、時間間隔をあけて細胞を撮影することにより取得された複数枚の画像が入力され、入力された前記画像の内のいずれか２枚の前記画像を処理して該画像の第１領域内の単位時間当たりの細胞数の変化である細胞数変化率を算出する細胞数変化率算出ステップと、入力された前記画像内のいずれか２枚の前記画像を処理して該画像の第２領域内への単位時間当たりの前記細胞の流入数である細胞流入率を算出する細胞流入率算出ステップと、入力された前記画像内のいずれか２枚の前記画像を処理して前記第２領域内からの単位時間当たりの前記細胞の流出数である細胞流出率を算出する細胞流出率算出ステップと、前記細胞数変化率算出ステップにより算出された前記細胞数変化率と、前記細胞流入率算出ステップにより算出された前記細胞流入率と、前記細胞流出率算出ステップにより算出された前記細胞流出率とに基づいて、前記画像の第３領域内における単位時間当たりの細胞増殖率を算出する増殖率算出ステップとを含む細胞画像処理方法である。
　また、本発明の他の態様は、時間間隔をあけて細胞を撮影することにより取得された複数枚の画像が入力され、入力された前記画像の内のいずれか２枚の前記画像を処理して該画像の第１領域内の単位時間当たりの細胞数の変化である細胞数変化率を算出する細胞数変化率算出ステップと、入力された前記画像内のいずれか２枚の前記画像を処理して該画像の第２領域内への単位時間当たりの前記細胞の流入数である細胞流入率を算出する細胞流入率算出ステップと、入力された前記画像内のいずれか２枚の前記画像を処理して前記第２領域内からの単位時間当たりの前記細胞の流出数である細胞流出率を算出する細胞流出率算出ステップと、前記細胞数変化率算出ステップにより算出された前記細胞数変化率と、前記細胞流入率算出ステップにより算出された前記細胞流入率と、前記細胞流出率算出ステップにより算出された前記細胞流出率とに基づいて、前記画像の第３領域内における単位時間当たりの細胞増殖率を算出する増殖率算出ステップとをコンピュータに実行させる細胞画像処理プログラムである。
　本発明によれば、細胞の増殖を精度よく検出して、細胞の培養を精度よく管理することができるという効果を奏する。
本発明の一実施形態に係る細胞画像処理装置を示す全体構成図である。 図１の細胞画像処理装置における細胞数変化率算出部の作用を説明する図である。 図１の細胞画像処理装置における細胞流入率算出部および細胞流出率算出部の作用を説明する図である。 図１の細胞画像処理装置における増殖率算出部の作用を説明する図である。 図３の細胞流入あるいは細胞流出を判定する閾値の例を説明する図である。 図１の細胞画像処理装置を用いた細胞が像処理方法を説明するフローチャートである。 図１の細胞画像処理装置の変形例による処理を説明する図である。 図７の細胞画像処理装置を示す全体構成図である。 図７の細胞画像処理装置を用いた細胞が像処理方法を説明するフローチャートである。
　本発明の一実施形態に係る細胞画像処理装置１、細胞画像処理方法および細胞画像処理プログラムについて、図面を参照して以下に説明する。
　本実施形態に係る細胞画像処理装置１は、図１に示されるように、顕微鏡等の撮像部５０により時間間隔をあけた撮影により取得された複数枚の画像Ｐｎ，Ｐｎ＋１が入力され、細胞Ｘの増殖率等の情報をモニタ等の表示部６０に向けて出力する装置である。
　細胞画像処理装置１は、撮像部５０から入力されてきた画像Ｐｎ，Ｐｎ＋１をその画像Ｐｎ，Ｐｎ＋１を撮影した時刻情報と対応づけて逐次記憶するメモリ２と、メモリ２に記憶された画像Ｐｎ，Ｐｎ＋１を処理する処理部３とを備えている。
　処理部３は、メモリ２に記憶されている画像Ｐｎ，Ｐｎ＋１を処理して、画像Ｐｎ，Ｐｎ＋１内の第１領域Ｒ１内における細胞数の単位時間当たりの変化率である細胞数変化率を算出する細胞数変化率算出部４と、画像Ｐｎ，Ｐｎ＋１内の第２領域Ｒ２内への単位時間当たりの細胞Ｘの流入数である細胞流入率を算出する細胞流入率算出部５と、画像Ｐｎ，Ｐｎ＋１内の第２領域Ｒ２内からの単位時間当たりの細胞Ｘの流出数である細胞流出率を算出する細胞流出率算出部６と、算出された細胞数変化率、細胞流入率および細胞流出率から計数領域（第３領域）Ｒ３における細胞増殖率を算出する増殖率算出部７とを備えている。
　細胞数変化率算出部４は、図２に示されるように、第１時間Δｔ１だけ時間間隔をあけて取得された２枚の画像Ｐｎ，Ｐｎ＋１内の第１領域Ｒ１における細胞数Ｎｎ，Ｎｎ＋１をそれぞれ計数し、各画像Ｐｎ，Ｐｎ＋１において計数された細胞数Ｎｎ，Ｎｎ＋１の差分を第１時間Δｔ１で除算することにより、単位時間当たりの細胞数Ｎｎ，Ｎｎ＋１の変化率である細胞数変化率ΔＮ／Δｔを算出するようになっている。
　細胞流入率算出部５は、図３に示されるように、第２時間Δｔ２だけ時間間隔をあけて取得された２枚の画像Ｐｎ，Ｐｎ＋１に基づいて画像Ｐｎ，Ｐｎ＋１内の第２領域Ｒ２に、隣接する領域から境界を横切って進入した細胞Ｘの流入数ΔＮＭＯＶＥＩＮｎ＋１を計数し、計数された細胞Ｘの流入数ΔＮＭＯＶＥＩＮｎ＋１を第２時間Δｔ２で除算することにより、単位時間当たりの細胞Ｘの流入数ΔＮＭＯＶＥＩＮである細胞流入率ΔＮＭＯＶＥＩＮ／Δｔ２を算出するようになっている。
　細胞流出率算出部６も、図３に示されるように、第２時間Δｔ２だけ時間間隔をあけて取得された２枚の画像Ｐｎ，Ｐｎ＋１に基づいて画像Ｐｎ，Ｐｎ＋１内の第２領域Ｒ２から隣接する領域に境界を横切って退出した細胞Ｘの流出数ΔＮＭＯＶＥＯＵＴｎ＋１を計数し、計数された細胞Ｘの流出数ΔＮＭＯＶＥＯＵＴｎ＋１を第２時間Δｔ２で除算することにより、単位時間当たりの細胞Ｘの流出数ΔＮＭＯＶＥＯＵＴである細胞流出率ΔＮＭＯＶＥＯＵＴ／Δｔ２を算出するようになっている。
　細胞Ｘの第２領域Ｒ２への流入および第２領域Ｒ２からの流出を算出するための第２時間Δｔ２は、下式の条件式（１）を満たすことが好ましい。
　Δｔ２≦Ｄ／Ｖ　　　（１）
　ここで、Ｄは細胞Ｘの長さ、Ｖは細胞Ｘの遊走速度である。
　細胞Ｘの長さＤおよび遊走速度Ｖとしては過去の計数時の基準値に設定してもよいし、第２領域Ｒ２内の平均値に設定してもよい。また、図５に示されるように、進入または退出を判定する長さの閾値Ｅを用いて、第２領域Ｒ２と隣接領域との境界から閾値Ｅだけ細胞Ｘが入ったら進入と判断し、境界から閾値Ｅだけ細胞Ｘが第２領域Ｒ２から隣接領域へ出たら退出と判断してもよい。
　増殖率算出部７は、図４に示されるように、計数領域である第３領域Ｒ３における単位時間当たりの細胞分裂数である細胞増殖率ΔＮＢＩＲＴＨ／Δｔを算出するようになっている。具体的には、第１領域Ｒ１について算出した細胞数変化率を第３領域Ｒ３についての補正変化率ΔＮ／Δｔに換算し、第２領域Ｒ２について算出した細胞流入率および細胞流出率を第３領域Ｒ３についての補正流入率ΔＮＭＯＶＥＩＮ／Δｔおよび補正流出率ΔＮＭＯＶＥＯＵＴ／Δｔに換算し、下式（２）により換算された補正変化率ΔＮ／Δｔから補正流入率ΔＮＭＯＶＥＩＮ／Δｔを減算し、補正流出率ΔＮＭＯＶＥＯＵＴ／Δｔを加算することにより、細胞増殖率ΔＮＢＩＲＴＨ／Δｔを算出するようになっている。
ΔＮＢＩＲＴＨ／Δｔ＝ΔＮ／Δｔ－ΔＮＭＯＶＥＩＮ／Δｔ＋ΔＮＭＯＶＥＯＵＴ／Δｔ　　　（２）
　第１領域Ｒ１について算出された細胞数変化率の第３領域Ｒ３についての補正変化率ΔＮ／Δｔへの換算は、例えば、第３領域Ｒ３と第１領域Ｒ１との面積比を細胞数変化率に乗算することにより行われるようになっている。
　また、第２領域Ｒ２について算出された細胞流入率ΔＮＭＯＶＥＩＮ／Δｔおよび細胞流出率ΔＮＭＯＶＥＯＵＴ／Δｔの第３領域Ｒ３について補正流入率ΔＮＭＯＶＥＩＮ／Δｔおよび補正流出率ΔＮＭＯＶＥＯＵＴ／Δｔへの換算は、例えば、第３領域Ｒ３と第２領域Ｒ２との面積比を細胞流入率ΔＮＭＯＶＥＩＮ／Δｔおよび細胞流出率ΔＮＭＯＶＥＯＵＴ／Δｔに乗算することにより行われるようになっている。
　このように構成された本実施形態に係る細胞画像処理装置１を用いた細胞画像処理方法について以下に説明する。
　ここでは、本実施形態に係る細胞画像処理方法を、
　Δｔ１＝Δｔ２＝Δｔ、
　第１領域Ｒ１＝第２領域Ｒ２＝第３領域Ｒ３＝計数領域
として説明する。
　まず、図６に示されるように、計数の開始時刻ｔ１、終了時刻ｔｍおよび計数の時間間隔Δｔが設定される（ステップＳ１）。
　次に、カウンタｎ＝１が設定され（ステップＳ２）、時刻ｔｎにおいて取得された画像Ｐｎが細胞数変化率算出部４において処理されて計数領域Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３内の細胞数Ｎｎが計数される（細胞数変化率算出ステップＳ３）。さらに、時刻ｔｎから時間間隔Δｔだけ経過した時刻ｔｎ＋１において取得された画像Ｐｎ＋１が細胞数変化率算出部４において処理されて計数領域Ｒ３内の細胞数Ｎｎ＋１が計数される（細胞数変化率算出ステップＳ４）。
　次いで、画像Ｐｎと画像Ｐｎ＋１が用いられて両者の対比により、計数領域Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３外から計数領域Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３内に進入してきた細胞数ΔＮＭＯＶＥＩＮｎ＋１と計数領域Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３内から計数領域Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３外に退出した細胞数ΔＮＭＯＶＥＯＵＴｎ＋１とが算出される（細胞流入率算出ステップＳ５、細胞流出率算出ステップＳ６）。
　そして、増殖率算出部７において、下式により単位時間当たりの細胞増殖率ΔＮＢＩＲＴＨｎ＋１／Δｔが算出される（増殖率算出ステップＳ７）。
ΔＮＢＩＲＴＨｎ＋１／Δｔ
　＝（Ｎｎ＋１－Ｎｎ）／Δｔ－ΔＮＭＯＶＥＩＮｎ＋１／Δｔ＋ΔＮＭＯＶＥＯＵＴｎ＋１／Δｔ　（３）
　ここで、細胞数変化率ΔＮ／Δｔ、細胞流入率ΔＮＭＯＶＥＩＮｎ＋１／Δｔ、細胞流出率ΔＮＭＯＶＥＯＵＴｎ＋１／Δｔおよび細胞増殖率ΔＮＢＩＲＴＨｎ＋１／Δｔは、全て、同じ隣接画像に基づいて算出しているので、上式（３）の全ての項には分母にΔｔが存在する。したがって、全ての項にΔｔを乗算して、以下の条件式（４）に等価的に変換することができる。また、細胞数変化率ΔＮ／Δｔ、細胞流入率ΔＮＭＯＶＥＩＮｎ＋１／Δｔ、細胞流出率ΔＮＭＯＶＥＯＵＴｎ＋１／Δｔおよび細胞増殖率ΔＮＢＩＲＴＨｎ＋１／Δｔは、全て、同じ計数領域Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３について算出しているので、換算の必要はない。
ΔＮＢＩＲＴＨｎ＋１＝（Ｎｎ＋１－Ｎｎ）－ΔＮＭＯＶＥＩＮｎ＋１＋ΔＮＭＯＶＥＯＵＴｎ＋１　　　　（４）
　計数された細胞数Ｎｎ＋１および算出された増殖細胞数ΔＮＢＩＲＴＨｎ＋１は表示部６０に出力されて、横軸を時間とした時間変化を表すグラフとして表示される（ステップＳ８）。これとともに、カウンタｎがｎ＝ｍか否かが判定され（ステップＳ９）、ｎ＜ｍである場合には、ｎがインクリメントされて細胞数変化率算出ステップＳ３からの工程が繰り返される（ステップＳ１０）。
　このように構成された本実施形態に係る細胞画像処理装置１および細胞画像処理方法によれば、細胞増殖率ΔＮＢＩＲＴＨｎ＋１／Δｔが、時間間隔Δｔをあけた２枚の画像Ｐｎ，Ｐｎ＋１における細胞数変化率ΔＮ／Δｔのみならず、細胞流入率ΔＮＭＯＶＥＩＮｎ＋１／Δｔおよび細胞流出率ΔＮＭＯＶＥＯＵＴｎ＋１／Δｔをも考慮して求められるので、細胞分裂による細胞Ｘの増殖の度合をより精度よく検出して、細胞培養を精度よく管理することができるという利点がある。
　また、本実施形態においては、細胞流入率ΔＮＭＯＶＥＩＮｎ＋１／Δｔ２および細胞流出率ΔＮＭＯＶＥＯＵＴｎ＋１／Δｔ２を算出するための第２時間Δｔ２については、条件式（１）を満足することにより、計数領域Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３に進入する細胞Ｘおよび退出する細胞Ｘを適正に検出することができる。すなわち、Δｔ２が短すぎると多数の画像Ｐｎ，Ｐｎ＋１について逐一細胞流入率ΔＮＭＯＶＥＩＮｎ＋１／Δｔ２および細胞流出率ΔＮＭＯＶＥＯＵＴｎ＋１／Δｔ２を算出する必要があり、データ量が増加して計数の負担が大きくなる一方、Δｔ２が長すぎると細胞Ｘの遊走を捕捉できず、細胞流入率ΔＮＭＯＶＥＩＮｎ＋１／Δｔ２および細胞流出率ΔＮＭＯＶＥＯＵＴｎ＋１／Δｔ２が算出できなくなるが、条件式（１）を満たすことによりそのような不都合はない。
　なお、本実施形態に係る細胞画像処理装置１の説明では、Δｔ１＝Δｔ２＝Δｔ、第１領域Ｒ１＝第２領域Ｒ２＝第３領域Ｒ３＝計数領域として説明したが、異なっていてもよい。この場合、細胞数変化率ΔＮ／Δｔを算出するための時間Δｔ１は最も短く設定し、細胞流入率ΔＮＭＯＶＥＩＮｎ＋１／Δｔ２および細胞流出率ΔＮＭＯＶＥＯＵＴｎ＋１／Δｔ２を算出するための時間Δｔ２は時間Δｔ１より大きく条件式（１）を満たす適正な時間に設定することが好ましい。
　また、本実施形態においては、処理部３が細胞数変化率算出部４、細胞流入率算出部５、細胞流出率算出部６および増殖率算出部７を備えることとした、処理部３は、電気回路によって構成してもよいし、１以上のプロセッサによって構成してもよい。
　プロセッサにより構成する場合、本発明は、細胞数変化率算出ステップＳ４、細胞流入率算出ステップＳ５、細胞流出率算出ステップＳ６および増殖率算出ステップＳ７をコンピュータにより実行可能な細胞画像処理プログラムにより構成してもよい。
　また、本実施形態においては、図７から図９に示されるように、第３領域Ｒ３内における単位時間当たりの細胞Ｘの死亡数ΔＮＤＥＡＴＨｎ＋１である細胞死亡率ΔＮＤＥＡＴＨｎ＋１／Δｔを算出する細胞死亡率算出部８をさらに備えていてもよい。
　この場合には、増殖率算出部７は、下式（５）により細胞増殖率ΔＮＢＩＲＴＨｎ＋１／Δｔを算出すればよい（ステップＳ１１）。
ΔＮＢＩＲＴＨｎ＋１／Δｔ
　＝（Ｎｎ＋１－Ｎｎ）／Δｔ－ΔＮＭＯＶＥＩＮｎ＋１／Δｔ
　　　　　　　＋ΔＮＭＯＶＥＯＵＴｎ＋１／Δｔ＋ΔＮＤＥＡＴＨｎ＋１／Δｔ　（５）
　このようにすることで、細胞Ｘが死亡する事象が発生する環境下においても、細胞分裂による細胞Ｘの増殖の度合をより精度よく検出して、細胞培養を精度よく管理することができるという利点がある。
　ここで、細胞Ｘとして培養容器の底面に接着して増殖する細胞Ｘを観察している場合には、細胞Ｘの死亡数ΔＮＤＥＡＴＨｎ＋１は、底面に接着できずに浮遊した細胞数Ｎを計数することにより容易に検出することができる。
　また、本実施形態においては、表示部６０に、計数された細胞数Ｎおよび算出された増殖細胞数ΔＮＢＩＲＴＨの時間変化をグラフ表示することとしたが、これに代えて、あるいは、これに加えて、細胞Ｘの死亡数ΔＮＤＥＡＴＨ、細胞Ｘの流入数ΔＮＭＯＶＥＩＮおよび細胞Ｘの流出数ΔＮＭＯＶＥＯＵＴの少なくとも１つをグラフ表示することにしてもよい。
　１　細胞画像処理装置
　４　細胞数変化率算出部
　５　細胞流入率算出部
　６　細胞流出率算出部
　７　増殖率算出部
　８　細胞死亡率算出部
　Ｘ　細胞
　Ｎ，Ｎｎ＋１　細胞数
　ΔＮＭＯＶＥＩＮ，ΔＮＭＯＶＥＩＮｎ＋１　流入数
　ΔＮＭＯＶＥＯＵＴ，ΔＮＭＯＶＥＯＵＴｎ＋１　流出数
　Ｒ１　第１領域（計数領域）
　Ｒ２　第２領域（計数領域）
　Ｒ３　第３領域（計数領域）
　Ｓ４　細胞数変化率算出ステップ
　Ｓ５　細胞流入率算出ステップ
　Ｓ６　細胞流出率算出ステップ
　Ｓ７　増殖率算出ステップ

Claims (9)

  1. 　時間間隔をあけて細胞を撮影することにより取得された複数枚の画像が入力され、
    　入力された前記画像の内のいずれか２枚の前記画像を処理して該画像の第１領域内の単位時間当たりの細胞数の変化である細胞数変化率を算出する細胞数変化率算出部と、
    　入力された前記画像内のいずれか２枚の前記画像を処理して該画像の第２領域内への単位時間当たりの前記細胞の流入数である細胞流入率を算出する細胞流入率算出部と、
    　入力された前記画像内のいずれか２枚の前記画像を処理して前記第２領域内からの単位時間当たりの前記細胞の流出数である細胞流出率を算出する細胞流出率算出部と、
    　前記細胞数変化率算出部により算出された前記細胞数変化率と、前記細胞流入率算出部により算出された前記細胞流入率と、前記細胞流出率算出部により算出された前記細胞流出率とに基づいて、前記画像の第３領域内における単位時間当たりの細胞増殖率を算出する増殖率算出部とを備える細胞画像処理装置。
  2. 　前記増殖率算出部が、前記細胞数変化率に基づいて前記第３領域内における細胞数の変化率である補正変化率を算出し、前記細胞流入率に基づいて前記第３領域内への流入率である補正流入率を算出し、前記細胞流出率に基づいて前記第３領域内からの流出率である補正流出率を算出し、前記補正変化率から前記補正流入率を減算し、前記補正流出率を加算して、前記細胞増殖率を算出する請求項１に記載の細胞画像処理装置。
  3. 　前記第３領域内における単位時間当たりの前記細胞の死亡数である細胞死亡率を算出する細胞死亡率算出部を備え、
    　前記増殖率算出部が、前記補正変化率から前記補正流入率を減算し、前記補正流出率を加算し、かつ前記細胞死亡率を減算して前記細胞増殖率を算出する請求項２に記載の細胞画像処理装置。
  4. 　前記細胞死亡率算出部が、前記第３領域内において単位時間当たりに浮遊した細胞数を計数する請求項３に記載の細胞画像処理装置。
  5. 　前記細胞流入率算出部が、単位時間当たりに前記第２領域に隣接する他の領域との境界を横切って前記第２領域に流入する細胞数を計数し、
    　前記細胞流出率算出部が、単位時間当たりに前記境界を横切って前記第２領域から流出する細胞数を計数する請求項１から請求項４のいずれかに記載の細胞画像処理装置。
  6. 　前記細胞流入率算出部および前記細胞流出率算出部が、前記細胞の長さを前記細胞の速度で除算した時間以下の間隔をあけた、前記画像を用いる請求項５に記載の細胞画像処理装置。
  7. 　時間間隔をあけて細胞を撮影することにより取得された複数枚の画像が入力されるプロセッサを備え、
    　該プロセッサが、入力された前記画像の内のいずれか２枚の前記画像を処理して該画像の第１領域内の単位時間当たりの細胞数の変化である細胞数変化率を算出し、入力された前記画像内のいずれか２枚の前記画像を処理して該画像の第２領域内への単位時間当たりの細胞の流入数である細胞流入率を算出し、入力された前記画像内のいずれか２枚の前記画像を処理して前記第２領域内からの単位時間当たりの前記細胞の流出数である細胞流出率を算出し、算出された前記細胞数変化率、前記細胞流入率および前記細胞流出率に基づいて、前記画像の第３領域内における単位時間当たりの細胞増殖率を算出する細胞画像処理装置。
  8. 　時間間隔をあけて細胞を撮影することにより取得された複数枚の画像が入力され、
    　入力された前記画像の内のいずれか２枚の前記画像を処理して該画像の第１領域内の単位時間当たりの細胞数の変化である細胞数変化率を算出する細胞数変化率算出ステップと、
    　入力された前記画像内のいずれか２枚の前記画像を処理して該画像の第２領域内への単位時間当たりの前記細胞の流入数である細胞流入率を算出する細胞流入率算出ステップと、
    　入力された前記画像内のいずれか２枚の前記画像を処理して前記第２領域内からの単位時間当たりの前記細胞の流出数である細胞流出率を算出する細胞流出率算出ステップと、
    　前記細胞数変化率算出ステップにより算出された前記細胞数変化率と、前記細胞流入率算出ステップにより算出された前記細胞流入率と、前記細胞流出率算出ステップにより算出された前記細胞流出率とに基づいて、前記画像の第３領域内における単位時間当たりの細胞増殖率を算出する増殖率算出ステップとを含む細胞画像処理方法。
  9. 　時間間隔をあけて細胞を撮影することにより取得された複数枚の画像が入力され、
    　入力された前記画像の内のいずれか２枚の前記画像を処理して該画像の第１領域内の単位時間当たりの細胞数の変化である細胞数変化率を算出する細胞数変化率算出ステップと、
    　入力された前記画像内のいずれか２枚の前記画像を処理して該画像の第２領域内への単位時間当たりの前記細胞の流入数である細胞流入率を算出する細胞流入率算出ステップと、
    　入力された前記画像内のいずれか２枚の前記画像を処理して前記第２領域内からの単位時間当たりの前記細胞の流出数である細胞流出率を算出する細胞流出率算出ステップと、
    　前記細胞数変化率算出ステップにより算出された前記細胞数変化率と、前記細胞流入率算出ステップにより算出された前記細胞流入率と、前記細胞流出率算出ステップにより算出された前記細胞流出率とに基づいて、前記画像の第３領域内における単位時間当たりの細胞増殖率を算出する増殖率算出ステップとをコンピュータに実行させる細胞画像処理プログラム。
     
     
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