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WO2019124603A1 - Iwr-1을 유효성분으로 함유하는 켈로이드 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Iwr-1을 유효성분으로 함유하는 켈로이드 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2019124603A1
WO2019124603A1 PCT/KR2017/015359 KR2017015359W WO2019124603A1 WO 2019124603 A1 WO2019124603 A1 WO 2019124603A1 KR 2017015359 W KR2017015359 W KR 2017015359W WO 2019124603 A1 WO2019124603 A1 WO 2019124603A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
iwr
keloid
preventing
mmp
active ingredient
Prior art date
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Application number
PCT/KR2017/015359
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English (en)
French (fr)
Inventor
윤태진
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gyeongsang National University Hospital
Original Assignee
Gyeongsang National University Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gyeongsang National University Hospital filed Critical Gyeongsang National University Hospital
Priority to PCT/KR2017/015359 priority Critical patent/WO2019124603A1/ko
Publication of WO2019124603A1 publication Critical patent/WO2019124603A1/ko
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Ceased legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/4035—Isoindoles, e.g. phthalimide
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/49—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin

Definitions

  • composition for preventing or treating keloid containing IWR-1 as an active ingredient is provided.
  • Keloid disease is a benign skin fibro-proliferative tumor characterized by excessive accumulation of extracellular matrix proteins leading to an excess of collagen formation. Abnormal skin scar formation can occur after injury in genetically sensitive individuals.
  • Existing therapies include the following: closed dressings, compression therapy, intra-lesion steroid injections, cryosurgery, surgical resection, laser therapy, radiation therapy, canallog (triamcinolone), interferon therapy, bleomycin, 5- Verapamil, imiquimodem cream, and combinations thereof.
  • closed dressings of both silicone and non-silicone based have been used extensively as clinical options for keloids over the past three decades, since all of these methods lead to very limited efficacy, new therapies for keloids It is widely recognized.
  • the present invention provides a composition containing IWR-1 as an active ingredient as a pharmaceutical composition and a cosmetic composition for preventing or treating keloid.
  • the present invention can provide a pharmaceutical composition for preventing or treating keloid containing IWR-1 as an active ingredient.
  • the present invention can provide a cosmetic composition for preventing or improving keloid containing IWR-1 as an active ingredient.
  • IWR-1 inhibits proliferation and migration of keloid fibroblasts without the influence of the TGF-beta signaling system, increases the expression of collagen degrading factor MMP and inhibits collagen synthesis
  • the composition containing the IWR-1 as an active ingredient can be provided as a pharmaceutical composition and a cosmetic composition for preventing or treating fibrosing diseases such as keloid.
  • FIG. 1A shows the chemical structure of IWR-1.
  • Fig. 1B shows the results of confirming the cytotoxicity of IWR-1 in fibroblasts.
  • IWR-1 at a concentration of 0 to 50 ⁇ M was incubated with human normal fibroblasts (NF) (KF) for 24 hours, and LDH activity in the culture medium.
  • FIG. 1C shows the effect of IWR-1 on endogenous Wnt / ⁇ -catenin signal.
  • TOPflash or FOPflash reporter adenovirus was detected overnight (* P ⁇ 0.01) after transfection and treating IWR-1 at a concentration of 0 to 20 [mu] M for 24 hours and then confirming luciferase activity.
  • FIG. 2A shows the results of confirming the cell proliferation effect of IWR-1.
  • human normal skin fibroblasts (NF) and keloid fibroblasts (KF) were treated with 0 to 20 ⁇ M of IWR-
  • FIG. 2B shows the effect of IWR-1 on cell migration by confirming the level of confluence of NF and KF after the production of a scratch wound.
  • FIG. 3 shows the results of confirming the effect of IWR-1 on collagen production.
  • Fig. 3A shows the results of treatment of human normal skin fibroblasts (NF) and keloid fibroblasts (KF) with 20 [mu] M IWR-
  • FIG. 3B is a Western blot analysis showing the expression levels of collagen-1 ⁇ 1 and collagen-1 ⁇ 2 proteins.
  • Collagen type I protein (collagen- 1 ⁇ 1 and collagen-1 ⁇ 2)
  • the right photograph shows the expression level of collagen type I protein at 0, 24 and 48 hours in 20 ⁇ M of IWR-1 treated cells
  • 3C is an ELISA analysis (* P ⁇ 0.01) showing the level of procollagen secreted in the culture medium after culturing the cells for 20 hours at a concentration of 20 ⁇ M for 48 hours,
  • NF or KF The IWR-1 of 20 ⁇ M contained in the collagen gel is the result confirming the excellent shrinkage seven days after the treatment compared to the control as a result of confirming the degree of shrinkage Gel IWR-1 is treated group (* P ⁇ 0.01).
  • FIG. 4A shows the effect of IWR-1 on TGF- ⁇ 1 / Smad signal and myofibroblast differentiation.
  • FIG. 4A shows the results of pretreatment of 20 ⁇ M of IWR-1 in NF and KF for 1 hour, Western blot analysis of Smad phosphorylation and ⁇ -SMA expression levels after stimulation with ng / ml TGF- ⁇ 1 showed that IWR-1 did not affect the phosphorylation of Smad protein induced by TGF- ⁇ 1 , FIG.
  • FIG. 5A shows the effect of MMP (matrix metalloproteinase) production on IGF-1 in normal human fibroblast (NF) and keloid fibroblast (KF) extracts treated with 20 ⁇ M IWR-1 for 48 hours.
  • MMP matrix metalloproteinase
  • FIG. 5B shows the result of RT-PCR analysis of the mRNA levels of MMP-1, MMP-3 and MMP-13, wherein GAPDH was used as an internal control and the expression of MMPs was increased by IWR- 5C was the result of gelatinization analysis of electrophoresis after enriching the cell culture medium.
  • the band of about 90 kDa was predicted as MMP9
  • the low molecular weight band can be predicted by MMP13.
  • the present invention can provide a pharmaceutical composition for preventing or treating keloid containing IWR-1 as an active ingredient.
  • the IWR-1 can inhibit proliferation and migration of fibroblasts.
  • the IWR-1 can inhibit collagen synthesis.
  • the most important feature of fibrosis disease is the increase in collagen synthesis and accumulation.
  • the effect of IWR-1 on collagen synthesis was confirmed by Western blot analysis. As a result, The collagen synthesis effect was significantly reduced in normal and keloid tissues. Also, referring to FIG. 3C, which confirms the amount of procollagen released from fibroblasts, it was confirmed that the release of procollagen was significantly reduced by IWR-1 treatment in both NF and KF, in accordance with the collagen synthesis effect as described above.
  • IWR-1 may be one that increases the production of matrix metalloproteinase (MMP), a collagen degrading factor.
  • MMP matrix metalloproteinase
  • IWR-1 expresses MMP-1, MMP-3, and MMP-13, respectively, as shown in FIG. 5A.
  • MMP-1, MMP-3 and MMP-13 secretion levels were significantly increased in the cell culture medium by IWR-1 treatment.
  • the pharmaceutical composition may contain 0.001 to 50 parts by weight of IWR-1, based on 100 parts by weight of the total amount of the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating keloid containing the IWR-1 as an active ingredient can be administered orally or parenterally in the form of injections, granules, powders, tablets, pills, capsules, suppositories, , Emulsions, drops, and liquid preparations can be used.
  • the pharmaceutical composition for the prevention or treatment of keloids containing IWR-1 as an active ingredient may be formulated with a suitable carrier, excipient, disintegrant, sweetener, coating agent, swelling agent, lubricant , At least one additive selected from the group consisting of lubricants, flavors, antioxidants, buffers, bacteriostats, diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants.
  • carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose, Cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
  • Solid formulations for oral administration may be in the form of tablets, pills, powders, granules, capsules These solid preparations can be prepared by mixing at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, etc., into the composition. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used. Examples of the liquid preparation for oral use include suspensions, solutions, emulsions, syrups and the like, and various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives and the like may be included in addition to water and liquid paraffin which are commonly used simple diluents.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, suppositories, and the like.
  • the suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like.
  • As the suppository base witepsol, macrogol, tween 61, cacao paper, laurin, glycerogelatin and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition may be administered orally, intraarterally, intraperitoneally, intramuscularly, intraarterally, intraperitoneally, intrasternally, transdermally, nasally, inhaled, topically, rectally, ≪ / RTI > can be administered to the subject in a conventional manner.
  • the preferred dosage of the above IWR-1 may vary depending on the condition and body weight of the subject, the type and degree of disease, the drug form, the administration route and the period, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the daily dose may be 0.01 to 200 mg / kg, specifically 0.1 to 200 mg / kg, more specifically 0.1 to 100 mg / kg, though it is not limited thereto.
  • the administration may be performed once a day or divided into several times, and thus the scope of the present invention is not limited thereto.
  • the 'subject' may be a mammal including a human, but is not limited thereto.
  • the present invention can provide a cosmetic composition for preventing or improving keloid containing IWR-1 as an active ingredient.
  • the cosmetic composition may contain, in addition to the active ingredient IWR-1, conventional additives such as stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavors, and carriers.
  • conventional additives such as stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavors, and carriers.
  • the cosmetic composition may be prepared in any form conventionally produced in the art and may be in the form of a solution, suspension, emulsion, paste, gel, cream, lotion, powder, oil, powder foundation, emulsion foundation, Wax foundation, spray, and the like.
  • the present invention is not limited thereto. More specifically, it can be manufactured in the form of a sun cream, a flexible lotion, a convergent lotion, a nutritional lotion, a nutritional cream, a massage cream, an essence, an eye cream, a pack, a spray or a powder.
  • the formulation is a paste, cream or gel
  • an animal oil a vegetable oil, a wax, a paraffin, a starch, a tracer, a cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide
  • a carrier component a carrier component that may be used as a carrier component .
  • lactose When the formulation is a powder or a spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as a carrier component.
  • talc In the case of a spray, in particular, chlorofluorohydrocarbons, propane / Or propellants such as dimethyl ether.
  • a solvent, a solubilizing agent or an emulsifying agent is used as a carrier component, and examples thereof include water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, - butyl glycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or fatty acid esters of sorbitan.
  • a carrier such as water, a liquid diluent such as ethanol or propylene glycol, a suspension such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, a microcrystalline cellulose , Aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracant, etc. may be used.
  • IWR-1 was purchased from Selleckchem (Houston, Tex.). Collagen-1 alpha 1, collagen-1 alpha 2, MMP-1, MMP-3 and alpha-SMA (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Calif.) As primary antibodies; MMP-13 (Abcam, Cambridge, Mass.); (Rhodamine phalloidin) was transformed into Invitrogen (Eugene, St. Louis, Mo.), p-Smad2, Smad2, p-Smad3, Smad3 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) OR).
  • Keloid tissue was collected from patients between 20 and 65 years of age (mean 32.0 ⁇ 15.1 years). Normal fibroblasts (NF) and keloid-induced dermal fibroblasts (KF) were cultured by modification of the previously reported method (Peihua Zhang, et al., 2014).
  • PBS phosphate-buffered saline
  • Fibroblasts were obtained from tissue cultured for one week. The cells were cultured in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) containing 10% fetal calf serum (FBS) and 1% penicillin-streptomycin (Life Technologies Corporation, Grand Island, NY) ; Welgene, Daegu, Korea).
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • FBS fetal calf serum
  • penicillin-streptomycin Life Technologies Corporation, Grand Island, NY
  • Lactate dehydrogenase (LDH) analysis was performed to confirm cytotoxicity.
  • Cells were seeded at a density of 2 ⁇ 10 4 / well on a 24-well culture plate and treated with various concentrations of IWR-1. After 24 hours, the culture medium was collected and LDH activity was determined by a cytotoxicity detection kit (Roche, Indianapolis, IN) .
  • NF or KF was dispensed into 60 mm dishes at the same cell number and treated with various concentrations of IWR-1 after 24 hours.
  • the cells were separated from the culture dish at fixed intervals and the number of cells was counted using a hemocytometer.
  • the TOPflash reporter adenovirus contains three copies of the motif with optimal TCF binding leading to luciferase expression.
  • MOI multiplicity of infection
  • IWR-1 was treated with various concentrations of IWR-1 for 24 hours, scratched with a microwave pet tip to create artificial wounds, and the gap closure was monitored before and after treatment under a phase contrast microscope to determine the percentage of gap closure Respectively.
  • a sample containing the same amount of protein was loaded on SDS-polyacrylamide gel and transferred to a nitrocellulose membrane. After blocking with 5% skim milk, the cells were incubated with the appropriate primary antibody and incubated with secondary antibody conjugated with the corresponding horseradish peroxidase.
  • Cell contraction assay kit (Cell Biolabs Inc., San Diego, Calif.) was used to perform gel shrinkage analysis according to the manufacturer's instructions.
  • M-MLV Molecular Rule Leukemia Virus
  • cDNA was used as a template for amplification, and primers of the following sequences were used: MMP-1, 5'-GATGGGAGGCAAGTTGAAAA and 5'-CCAGGTCCATCAAAAGGAGA; MMP-3, 5'-TGCTTTGTCCTTTGATGCTG and 5'-ATCGATTTTCCTCACGGTTG; MMP-13, 5'-TAAGGAGCATGGCGACTTCT and 5'-GTCTGGCGTTTTTGGATGTT; GAPDH, 5'-GTCAGTGGTGGACCTGACCT and 5'-AGGGGTCTACATGGCAACTG.
  • IWR-1 at a concentration of 20 ⁇ M in serum-free medium was treated with fibroblasts for 48 hours.
  • the supernatant was concentrated and gelatinization was performed with the reported method (Substrate-zymography: A still worthwhile method for gelatinases analysis in biological samples).
  • the gel was washed twice with 2.5% tryptone X-100 solution at room temperature for 30 minutes and then washed in a buffer containing 0.05 M Tris-HCl (pH 7.5), 0.15 M NaCl and 0.01 M CaCl 2 at 37 ° C for 24 hours Lt; / RTI >
  • the gel was then stained with 30% methanol, 10% acetic acid and 0.1% (w / v) Coomassie Brilliant Blue R250 and stained with 30% methanol and 10% acetic acid to clarify the band in the background gel, Activity was visualized.
  • NF normal skin fibroblasts
  • KF keloid fibroblasts
  • IWR-1 may cause some damage to the plasma membrane. Therefore, IWR-1 was further treated to 20 ⁇ M in fibroblasts.
  • IWR-1 was originally developed as a low-molecular inhibitor of Wnt / ⁇ -catenin signaling, confirming that IWR-1 indeed blocks intracellular Wnt / ⁇ -catenin signaling in fibroblasts.
  • TOPflash reporter the most well-known analytical tool for Wnt / ⁇ -catenin signal validation, was used.
  • basal TOPflash activity was found to be a major cause of keloid, with KF being higher than NF.
  • TOPflash reporter was transfected into fibroblasts and then treated with IWR-1.
  • IWR-1 inhibited TOPflash activity in a dose-dependent manner in both NF and KF. From the above results, a potential effect on fibroblast Wnt /? - catenin signal was confirmed.
  • Fibrosis diseases such as keloids increase the proliferation and migration of fibroblasts, thus confirming the effect of IWR-1 on fibroblast proliferation and migration.
  • IWR-1 effectively inhibits collagen production of fibroblasts, thus, in the treatment of fibrosing disease, IWR-1 can be proposed as a potential therapeutic agent.
  • TGF- ⁇ / Smad signal plays an important role in keloid development by promoting fibroblast proliferation and collagen synthesis.
  • IWR-1 IWR-1 on TGF- ⁇ / Smad signal in NF and KF cells.
  • IWR-1 significantly inhibits collagen gel shrinkage, thereby confirming whether IWR-1 can affect the shrinking protein ⁇ -SMA, which plays an important role in muscle differentiation.
  • IWR-1 treatment did not affect ⁇ -SMA expression regardless of TGF- ⁇ stimulation.
  • IWR-1 inhibits myoblast differentiation in stress fiber formation without affecting Smad signal.
  • IWR-1 increased intracellular protein levels of MMP-1, MMP-3 and MMP-13 and similar results showed that MMP-1, MMP-3 and MMP- -13 secretion was significantly increased.
  • RT-PCR was performed to confirm whether IWR-1 can increase the expression of MMP gene.
  • IWR-1 increased mRNA levels of MMP-1, MMP-3 and MMP-13.

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Abstract

본 발명은 IWR-1을 유효성분으로 함유하는 켈로이드 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 IWR-1은 TGF-β 신호전달체계의 영향을 주지 않으면서 켈로이드 섬유아세포의 증식 및 이동을 억제하고, 콜라겐 분해 인자인 MMP의 발현을 증가시키는 동시에 콜라겐 합성을 억제하는 효과를 나타내는 것이 확인됨에 따라, 상기 IWR-1을 유효성분으로 함유하는 조성물은 켈로이드와 같은 섬유증 질병에 대한 예방 또는 치료용 약학조성물 및 화장료 조성물로 제공될 수 있다.

Description

IWR-1을 유효성분으로 함유하는 켈로이드 예방 또는 치료용 조성물
IWR-1을 유효성분으로 함유하는 켈로이드 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
켈로이드(Keloid) 질환은 콜라겐 형성의 과잉으로 이어지는 세포외 매트릭스 단백질의 과도한 축적을 특징으로 하는 양성의 피부 섬유-증식성 종양이다. 비정상적인 피부 흉터 형성은 유전적으로 민감성인 개체에서 손상 후에 발생할 수 있다.
현재, 수술 후 켈로이드의 치료 또는 켈로이드 성장의 예방을 위한 효과적인 단일 치료 처방계획은 확립되어 있지 않다. 기존의 치료적 접근법에는 폐쇄성 드레싱, 압박 요법, 병변내 스테로이드 주사, 냉동 수술(cryosurgery), 외과적 절제, 레이저 치료, 방사선 요법, 케날로그 (트리암시놀론), 인터페론 요법, 블레오마이신, 5-플로우라실, 베라파밀, 이미퀴모드 크림, 및 이들의 조합이 포함된다. 실리콘 및 비-실리콘 기반 둘 다의 폐쇄성 드레싱이 지난 30년 동안 켈로이드에 대한 임상적 선택사항으로서 광범위하게 사용되어 왔지만, 이러한 방법들 모두는 매우 제한된 효능으로 이어지기 때문에, 켈로이드를 위한 새로운 요법이 절실하게 필요하다는 것이 널리 인식되어 있다.
또한, 다양한 형태의 방사선 요법이 켈로이드에 대한 단일 요법으로 시도된 바 있지만, 치료 후 발암의 사례 보고로 인하여 상당한 논쟁의 여지가 남아 있다. 아르곤, CO2, 및 펄스 다이(pulse dye)를 사용한 레이저 요법은 지난 40년 동안 지속적으로 시도된 바 있으나, 그 중 어느 것도 효능이 있는 것으로 입증된 바 없다.
다수의 연구에 따르면, 레이저 요법의 세 가지 형태 모두가 90%까지의 재발률을 가지면서도 효과는 적거나 없는 것으로 나타났다. 냉동요법이 단일 요법으로 사용된 바 있다. 그러나 치료 부위에서의 통증, 및 과다색소침착 또는 색소침착 저하가 이 접근법과 연관된 부작용에 포함된다. 일종의 코르티코스테로이드인 병변 내 트리암시놀론 아세톤 주사가 종종 켈로이드의 치료를 위한 일차적인 요법으로 사용되고 있으나, 역시 실제 보고되는 임상적 효능은 매우 가변적이다. 또한, 주사 통증, 피부 위축, 모세혈관확장증(telangiectasias), 및 색소침착 변성의 부작용이 확인됨에 따라, 보다 안전하고 효과적인 치료 방법에 대한 연구가 필요한 실정이다.
상기 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 IWR-1을 유효성분으로 함유하는 조성물을 켈로이드 예방 또는 치료용 약학조성물 및 화장료조성물로 제공하고자 한다.
본 발명은 IWR-1을 유효성분으로 함유하는 켈로이드 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 IWR-1을 유효성분으로 함유하는 켈로이드 예방 또는 개선용 화장료조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에 따르면, IWR-1은 TGF-β 신호전달체계의 영향 없이 켈로이드 섬유아세포의 증식 및 이동을 억제하고, 콜라겐 분해 인자인 MMP의 발현을 증가시키는 동시에 콜라겐 합성을 억제하는 효과를 나타내는 것이 확인됨에 따라, 상기 IWR-1을 유효성분으로 함유하는 조성물은 켈로이드와 같은 섬유증 질병에 대한 예방 또는 치료용 약학조성물 및 화장료 조성물로 제공될 수 있다.
도 1A는 IWR-1의 화학구조이며, 도 1B는 섬유아세포에서 IWR-1의 세포독성을 확인한 결과로, 0 내지 50 μM 농도의 IWR-1을 사람 정상 피부 섬유아세포(NF) 및 켈로이드 섬유아세포(KF)에 24시간 처리한 후 배양 배지에서 LDH 활성을 확인한 결과이며, 도 1C는 내인성 Wnt/β-카테닌 신호에 미치는 IWR-1의 영향을 확인한 결과로, TOPflash 또는 FOPflash 리포터 아데노바이러스를 하룻밤 동안 형질주입하고 0 내지 20 μM 농도의 IWR-1을 24시간 처리한 후 루시퍼레이즈 활성을 확인한 결과이다(*P < 0.01).
도 2A는 IWR-1의 세포 증식 효과를 확인한 결과로, 사람 정상 피부 섬유아세포(NF) 및 켈로이드 섬유아세포(KF)에 0 내지 20 μM 농도의 IWR-1을 처리하고 세포 수를 계수하여 세포 증식을 확인한 결과, IWR-1의 용량 및 시간의존적으로 세포 증식 억제가 확인된 결과이며, 도 2B는 스크래치 상처 제작 후 NF 및 KF의 합류 수준을 확인하여 세포 이동에 미치는 IWR-1의 효과를 확인한 결과이다(*P < 0.01, Scale bar= 50 μm).
도 3은 콜라겐 생성에 미치는 IWR-1의 영향을 확인한 결과로, 도 3A는 20 μM IWR-1을 48시간 동안 사람 정상 피부 섬유아세포(NF) 및 켈로이드 섬유아세포(KF)에 처리하고 콜라겐 타입 I 단백질(collagen-1α1 및 collagen-1α2)의 발현 수준을 확인한 웨스턴 블롯 분석 결과이며, 도 3B의 왼쪽 사진은 0 내지 20 μM 농도의 IWR-1을 48시간 처리한 세포에서 콜라겐 타입 I 단백질(collagen-1α1 및 collagen-1α2)의 발현 수준을 확인한 웨스턴 블롯 분석 결과이며, 오른쪽 사진은 20 μM의 IWR-1을 처리한 세포에서 0, 24 및 48시간 마다 콜라겐 타입 I 단백질의 발현 수준을 확인한 결과이며, 도 3C는 20 μM의 IWR-1을 48시간 동안 세포에 처리하여 배양한 후 배양배지를 수거하여 배지 내 분비된 프로콜라겐 수준을 확인한 ELISA 분석결과이며(*P < 0.01), 도 3D는 콜라겐 겔 수축분석 결과로, NF 또는 KF가 포함된 콜라겐 겔에 20 μM의 IWR-1을 7일간 처리한 후 겔 수축 정도를 확인한 결과로 대조군과 비교하여 IWR-1이 처리된 군에서 우수한 수축 억제를 확인한 결과이다(*P < 0.01).
도 4는 TGF-β1/Smad 신호 및 근섬유아세포 분화에 미치는 IWR-1 영향을 확인한 결과로, 도 4A는 NF 및 KF에 20 μM의 IWR-1을 1시간 동안 전처리하고 1 및 24시간때에 5 ng/ml TGF-β1로 자극시킨 후 Smad의 인산화 및 α-SMA 발현 수준을 확인한 웨스턴 블롯 분석 결과로, IWR-1은 TGF-β1에 의해 유도되는 Smad 단백질의 인산화에 영향을 미치지 않는 것을 확인한 결과이며, 도 4B는 20 μM IWR-1을 NF 및 KF에 1시간동안 처리하고 5 ng/ml TGF-β1로 48시간 동안 자극시킨 후 로다민이 결합된 팔로이딘 염색(적색)을 수행하여 스트레스 섬유를 확인한 결과로, 핵은 DAPI로 대비염색하였으며, IWR-1 처리에 의해 스트레스 섬유 형성이 감소된 것을 확인한 결과이다(bar = 25 μm).
도 5는 IWR-1의 MMP(matrix metalloproteinase) 생성 효과를 확인한 결과로, 도 5A는 20 μM IWR-1을 48시간 처리한 사람 정상 피부 섬유아세포(NF) 및 켈로이드 섬유아세포(KF) 추출물에서 MMP 수준을 확인한 결과로, 왼쪽 사진은 세포 추출물에서 MMP 수준을 확인한 웨스턴 블롯 분석결과이며, 오른쪽 사진은 동량의 배양 배지를 수집하여 분비된 MMP 농도를 확인한 결과로, 농축된 배양 배지를 이용한 웨스턴 블롯 분석에서 Ponceau S 염색을 통하여 동일한 양의 시료가 로딩되었는 지 확인하였다. 도 5B는 MMP-1,MMP-3 및 MMP-13의 mRNA 수준을 확인한 RT-PCR 분석 결과로, GAPDH를 내부 대조군을 사용하였으며, IWR-1에 의해 MMPs 발현이 증가된 것을 확인한 결과이며, 도 5C는 세포 배양 배지를 농축시킨 후 전기영동을 진행한 젤라틴 자이모그래피 분석 결과로, 이전 보고서[26]에 따르면, 약 90 kDa의 밴드는 MMP9으로 예측되며, 약 70 kDa의 밴드는 MMP2로, 저분자량의 밴드는 MMP13으로 예측될 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 IWR-1을 유효성분으로 함유하는 켈로이드 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.
상기 IWR-1은 섬유아세포의 증식 및 이동을 억제할 수 있다.
보다 상세하게 켈로이드와 같은 섬유증 질병은 섬유아세포의 증식 및 이동이 증가하므로, 섬유아세포의 증식 및 이동에 대한 IWR-1의 영향을 확인한 결과, 도 2A와 같이 IWR-1가 처리된 정상 피부 섬유아세포(NF) 및 켈로이드 섬유아세포(KF)에서 유의적인 세포 증식 약화가 나타났으며, 도 2B에서 확인되는 바와 같이 IWR-1의 용량의존적으로 NF 및 KF 이동이 유의적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
상기 IWR-1은 콜라겐 합성을 억제할 수 있다.
보다 상세하게 켈로이드를 포함하여 섬유증 질병의 가장 주요한 특징은 콜라겐 합성 및 축적이 증가하는 것으로, 콜라겐 합성에 있어서 IWR-1의 영향을 웨스턴 블롯 분석으로 확인한 결과, 도 3A와 같이 IWR-1 처리된 모든 정상 및 켈로이드 조직에서 매우 감소된 콜라겐 합성 효과가 나타났다. 또한, 섬유아세포의 프로콜라겐 방출량을 확인한 도 3C를 참고하면 앞서 확인한 콜라겐 합성 효과와 일치하게 NF 및 KF 모두에서 IWR-1 처리에 의해 프로콜라겐 방출이 유의적으로 감소된 것을 확인할 수 있었다.
또한, IWR-1은 콜라겐 분해 인자인 MMP(matrix metalloproteinase)의 생성을 증가시키는 것일 수 있다.
보다 상세하게 MMP는 콜라겐을 분해시키는 역할을 하므로, NF 및 KF에서 IWR-1의 MMP 생성효과를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과, 도 5A와 같이 IWR-1은 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13의 세포내 단백질 수준을 증가시켰으며, 유사한 결과로 IWR-1 처리에 의해 세포 배양 배지 내로 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13 분비가 매우 증가한 것을 확인할 수 있었다.
상기 약학조성물은 약학조성물 총 100 중량부에 대하여, IWR-1을 0.001 내지 50 중량부로 포함될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 IWR-1을 유효성분으로 함유하는 켈로이드 예방 또는 치료용 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, IWR-1을 유효성분으로 함유하는 켈로이드 예방 또는 치료용 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.
상기 IWR-1의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 IWR-1을 유효성분으로 함유하는 켈로이드 예방 또는 개선용 화장료조성물을 제공할 수 있다.
상기 화장료조성물은 유효성분인 IWR-1 외에 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 썬 크림, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
상기 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜,실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
상기 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해 화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
상기 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<참고예> 시약 및 항체
IWR-1을 Selleckchem (Houston, TX)에서 구입하였다. 1차 항체로 콜라겐-1α1, 콜라겐-1α2, MMP-1, MMP-3 및 α-SMA (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); MMP-13 (Abcam, Cambridge, MA); p-Smad2, Smad2, p-Smad3, Smad3 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) 및 액틴(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 사용하였으며, 로다민 팔로이딘(Rhodamine phalloidin)을 Invitrogen(Eugene, OR)에서 구입하여 사용하였다.
<실험예 1> 세포 배양
정상 사람 피부 및 켈로이드 조직을 서면 동의하 여러 명의 공여자로부터 얻었으며, 본 연구는 충남대학교 의과대학 임상 시험위원회 윤리위원회의 승인을 받아 수행되었다.
켈로이드 조직을 20에서 65세 사이의 환자로부터 수집하였다(평균 32.0 ± 15.1 세). 정상 피부 섬유아세포(NF) 및 켈로이드가 유도된 피부 섬유아세포(KF)를 이전에 보고된 방법(Peihua Zhang, et. al., 2014)을 변형시켜 배양하였다.
간략하게, 피부 조직을 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 인산완충식염수(phosphate-buffered saline; PBS)로 세척한 후 작은 조각으로 절단하고 배양접시에 놓았다.
일주일간 절편 배양된 조직으로부터 섬유아세포를 얻었으며, 상기 세포를 10% 태아소혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Life Technologies Corporation, Grand Island, NY)이 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; Welgene, Daegu, Korea) 배지에서 배양되었다.
모든 실험에서 3 내지 7 페세지 사이의 세포를 사용하였으며, IWR-1 처리 전 섬유아세포를 무혈청 배지에서 하룻밤동안 인큐베이션하였다.
<실험예 2> 세포독성 및 세포 증식 확인
젖산탈수소효소(lactate dehydrogenase; LDH) 분석을 수행하여 세포독성을 확인하였다. 세포를 24웰 배양 플레이트에 2 × 104/well로 분주한 후 다양한 농도의 IWR-1을 처리하고 24시간 후 배양 배지를 수집하고 LDH 활성을 Cytotoxicity detection kit (Roche, Indianapolis, IN)로 확인하였다.
세포 증식은 세포 계수를 통하여 측정되었다.
NF 또는 KF를 동일한 세포수로 60 mm 접시에 분주하고 24시간 후 다양한 농도의 IWR-1을 처리하였다. 정해진 시간마다 세포를 배양접시에서 분리하고 헤모사이토미터(hemocytometer)를 이용하여 세포 수를 계수하였다.
<실험예 3> TOPflash 분석
TOPflash 리포터 아데노바이러스는 루시퍼레이즈 발현을 유도하는 최적의 TCF가 결합된 모티프의 3개의 복사본을 포함한다.
세포를 24-웰 플레이트에 분주하고 60% 합류될 때까지 배양한 후, TOPflash 리포터 아데노바이러스를 1 감염다중도(multiplicity of infection; MOI)로 형질전환시켰다.
하룻밤 인큐베이션 후, IWR-1가 포함된 신선한 배지를 세포에 보충하고 24시간 추가 배양하고 세포 용해버퍼를 이용하여 세포내 추출물을 준비한 후, 루시퍼레이즈 리포터 분서 시스템(Promega, Madison, WI)을 이용하여 루시퍼레이즈 활성을 측정하였으며, 대조군 실험을 위해, TCF 결합 모티프가 포함된 FOPflash 리포터 아데노바이러스를 사용하였다.
<실험예 4> 이동(Migration) 분석
6-웰 플레이트에서 세포가 합류 단층을 형성하도록 성장시켰다.
5 μg/ml 미토마이신 C를 세포에 1시간 동안 전처리한 후 신선한 배지로 교체하였다.
마이크로파이펫 팁으로 긁어내어 인공 상처를 만들고 다양한 농도의 IWR-1을 24시간 동안 처리하였으며, 위상차 현미경하에서 처리 전후를 촬영하여 갭 클로저 (gap closure)를 모니터링하였으며, 하기 계산식으로 갭 클로저의 백분율을 확인하였다.
[(initial area - final area) / initial area] × 100
<실험예 5> 웨스턴 블롯 분석
Proprep solution (Intron, Daejeon, Korea)으로 세포를 용해시키고, BCA Protein Assay Reagent(Pierce, Rockford, IL)를 이용하여 세포 단백질 농도를 정량하였다.
동량의 단백질이 포함된 시료를 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에 로딩한 후 니트로셀룰로스 막에 옮겼다. 5% 탈지유로 블로킹한 후 적절한 1차 항체로 인큐베이션하고 해당하는 홀스래디쉬 퍼옥사이드가 결합된 이차 항체로 인큐베이션하였다.
화학발광 기질(Intron, Daejeon, Korea)을 이용하여 신호를 시각화하였다. 분비된 단백질을 검출을 위해, Protein concentration kit (Elpis Biotech, Daejeon, Korea)를 이용하여 배양 배지를 농축하였다.
<실험예 6> ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 분석
24-웰 플레이트에 1×105/well 밀도로 세포를 분주한 후, 20 μM IWR-1를 48시간 동안 처리한 후 배양 배지를 수집하고 원심분리한 후 ELISA kit (TaKaRa, Shiga, Japan)를 이용하여 프로콜라겐 방출을 확인하였다.
<실험예 7> 콜라겐 겔 수축 분석(Collagen gel contraction assay)
Cell contraction assay kit (Cell Biolabs Inc., San Diego, CA)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 겔 수축 분석을 수행하였다.
간략하게, 5 × 105 세포를 콜라겐 겔과 혼합하고 Transwell permeable supports (3.0 μm polycarbonate membrane) (Corning Incorporated, Corning, NY)와 중합하였다.
콜라겐 중합 후, 각 콜라겐 겔 격자 위에 배지 5 ml을 첨가하였다.
< 실험예 8> 역전사 중합효소 연쇄 반응(Reverse transcription-polymerase chain reaction; RT-PCR)
Easy-blue RNA extraction kit (Intron,Daejeon, Korea)를 이용하여 섬유아세포에서 전체 RNA를 추출하고, 전체 RNA 2 μg을 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(M-MLV) 역전사효소(RTase) (Elpis Biotech, Daejeon, Korea)로 역전사시켰다.
증폭을 위한 주형으로 동량의 cDNA를 사용하였으며, 하기와 같은 서열의 프라이머를 사용하였다: MMP-1, 5′-GATGGGAGGCAAGTTGAAAA 및 5′-CCAGGTCCATCAAAAGGAGA; MMP-3, 5′-TGCTTTGTCCTTTGATGCTG 및 5′-ATCGATTTTCCTCACGGTTG; MMP-13, 5′-TAAGGAGCATGGCGACTTCT 및 5′-GTCTGGCGTTTTTGGATGTT; GAPDH, 5′-GTCAGTGGTGGACCTGACCT 및 5′-AGGGGTCTACATGGCAACTG.
< 실험예 9> 젤라틴 자이모그래피 (Gelatin zymography )
무혈청 배지에서 20 μM 농도의 IWR-1을 48시간 동안 섬유아세포에 처리하였다. 분액을 농축시키고 보고되어진 방법(Substrate-zymography: A still worthwhile method for gelatinases analysis in biological samples)으로 젤라틴 자이모그래피를 수행하였다.
동량의 시료를 끓이거나 변형 없이 젤라틴(1 mg/ml)이 침윤된 10% 폴리아크릴아마이드 겔(Sigma, St. Louis, MO)을 통하여 전기영동하였다.
겔을 2.5% 트립톤 X-100 용액으로 실온에서 30분간 두 번 반복하여 세척한 후 37℃에서 0.05 M Tris-HCl(pH 7.5), 0.15 M NaCl 및 0.01 M CaCl2가 포함된 버퍼에서 24시간 동안 인큐베이트하였다.
그 후, 겔을 30% 메탄올, 10% 아세트산 및 0.1%(w/v) 쿠마시 브릴리언트 블루 R250로 염색하고 30% 메탄올, 10% 아세트산으로 염색을 제거하여 배경 겔에서 대하여 밴드를 명확하게 하여 효소 활성을 시각화하였다.
<실시예 1> IWR-1의 세포 증식 및 이주 효과 확인
섬유아세포 활성에 있어서, 도 1A의 화합물인 IWR-1의 효과를 확인하기 위해, 정상 피부 섬유아세포(NF) 및 켈로이드 섬유아세포(KF)에서 IWR-1의 세포독성을 확인하였다.
그 결과, 도 1B와 같이 IWR-1의 농도를 20 μM 까지 증가시켰을 경우 유의적인 LDH 방출 증가는 확인되지 않았으나, 50 μM 농도로 처리된 경우 NF 및 KF 세포에서 LDH 방출이 유의적으로 증가하였다.
상기 결과로부터 IWR-1은 플라스마 막에 약간의 손상을 가할 수 있으므로, IWR-1은 섬유아세포에 20 μM 까지 처리하여 추가 실험을 수행하였다.
IWR-1은 원래 Wnt/β-카테닌 신호전달에 대한 저분자 억제제로 개발됨에 따라, 실제로 IWR-1가 섬유아세포의 내인성 Wnt/β-카테닌 신호를 정확히 차단하는지 확인하였다. 이를 위해, Wnt/β-카테닌 신호 확인에 가장 잘 알려진 분석도구인 TOPflash 리포터를 사용하였다.
먼저, TOPflash 리포터를 NF 및 KF 세포에 형질도입한 후 Wnt/β-카테닌 신호의 기초 활성을 확인하였다.
예상대로, 기초 TOPflash 활성은 NF 보다 KF가 높게 나타남에 따라, Wnt/β-카테닌 신호는 켈로이드의 주요 원인인 것으로 확인되었다.
다음으로, TOPflash 리포터를 섬유아세포에 형질도입시킨 후, IWR-1을 처리하였다.
그 결과, 도 1C와 같이 IWR-1은 NF 및 KF 모두에서 용량의존적으로 TOPflash 활성을 억제하였으며, 상기 결과로부터 섬유아세포의 Wnt/β-카테닌 신호에 대한 잠재적인 효과가 확인되었다.
켈로이드와 같은 섬유증 질병은 섬유아세포의 증식 및 이동이 증가하므로, 섬유아세포의 증식 및 이동에 대한 IWR-1의 영향을 확인하였다.
그 결과, 도 2A와 같이 IWR-1가 처리된 NF 및 KF 섬유아세포에서 유의적인 세포 증식 약화가 나타났으며, 도 2B에서 확인되는 바와 같이 IWR-1의 용량의존적으로 NF 및 KF 이동이 유의적으로 억제되었다.
<실시예 2> IWR-1의 콜라겐 합성 억제 효과 확인
켈로이드를 포함하여 섬유증 질병의 가장 주요한 특징은 콜라겐 합성 및 축적이 증가하는 것으로, 콜라겐 합성에 있어서 IWR-1의 영향을 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다.
그 결과, 도 3A와 같이 IWR-1 처리된 모든 정상 및 켈로이드 조직에서 매우 감소된 콜라겐 합성 효과가 나타났다.
또한, 콜라겐 합성에 대한 IWR-1의 억제 효과는 도 3B와 같이 용량의존적 및 시간의존적으로 확인되었으나, 예상과 다르게 콜라겐의 mRNA 수준은 IWR-1 처리에도 유의적으로 감소하지 않았다.
다음으로, 섬유아세포의 프로콜라겐 방출량을 확인하였다.
그 결과 도 3C를 참고하면, 앞서 확인한 콜라겐 합성 효과와 일치하게 NF 및 KF 모두에서 IWR-1 처리에 의해 프로콜라겐 방출이 유의적으로 감소한 것이 확인되었다.
마지막으로, 상처 수축으로 잘 확립된 모델[24]을 이용하여 콜라겐 겔 수축 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 3D와 같이 대조군에서는 시간의존적으로 주목할 만한 겔 수축이 발생한 반면, IWR-1이 처리된 NF 및 KF 실험군 모두에서 유의적인 겔 수축 억제효과가 나타났다.
상기 결과들로부터, IWR-1이 섬유아세포의 콜라겐 생산을 효과적으로 억제시키는 것이 확인됨에 따라, 섬유증 질병 치료에 있어서, IWR-1은 잠재적인 치료제로 제안될 수 있다.
< 실시예 3> TGF -β/ Smad 신호 및 근섬유아세포 분화에 대한 IWR -1의 영향 확인
TGF-β/Smad 신호는 섬유아세포 증식 및 콜라겐 합성을 촉진시킴으로써, 켈로이드 발달에 중요한 역할을 한다. 이에 따라, NF 및 KF 세포에서 IWR-1가 TGF-β/Smad 신호에 미치는 영향을 확인하였다.
웨스턴 블롯 분석 결과, 도 4A와 같이 TGF-β 처리 후 1 및 24시간째에서 Smad 2 및 Smad3의 인산화가 유의하게 증가된 것을 확인할 수 있었다.
또한, IWR-1가 전처리는 Smad 2 및 Smad 3의 TGF-β-에 의해 유도된 인산화에 영향을 미치지 않았다.
상기 결과로부터 IWR-1이 섬유아세포의 콜라겐 합성 및 세포 증식에 미치는 영향은 TGF-β/Smad 신호와 관련없는 것을 확인할 수 있었다.
한편, IWR-1이 콜라겐 겔 수축을 현저하게 억제시키는 것이 확인됨에 따라, IWR-1이 근육분화에 중요한 역할을 하는 수축성 단백질 α-SMA에 영향을 미칠 수 있는지를 확인하였다.
그 결과, 도 4A와 같이 NF 보다 KF에서 α-SMA 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었으며, 상기 결과는 근섬유아세포 분화에 대한 KF의 상태를 암시한다. 또한, TGF-β가 24시간 처리된 결과, NF에서 α-SMA 증가가 나타난 반면, KF에서는 확인되지 않았다.
예상과 다르게 IWR-1 처리는 TGF-β 자극과 관계없이 α-SMA의 발현에 영향을 미치지 않았다.
그러나 팔로이딘 염색을 통하여 스트레스 섬유 형성을 확인한 결과, IWR-1은 대조군과 비교하여 스트레스 섬유 형성을 억제하는 것을 확인할 수 있었는데, 도 4B와 같이 TGF-β로 자극시킨 세포에서는 스트레스 섬유 형성이 매우 증가한 반면, IWR-1은 TGF-β에 의해 유도된 스트레스 섬유 형성을 효과적으로 차단하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 IWR-1은 스트레스 섬유 형성에 있어, Smad 신호에 영향을 주지 않으면서 근섬유아세포 분화를 억제하는 것이 확인되었다.
< 실시예 4> MMP (matrix metalloproteinase ) 생성에 미치는 IWR -1의 효과 확인
MMP는 콜라겐을 분해시키는 역할을 하므로, NF 및 KF에서 IWR-1의 MMP 생성효과를 확인하였다.
그 결과, 도 5A와 같이 IWR-1은 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13의 세포내 단백질 수준을 증가시켰으며, 유사한 결과로 IWR-1 처리에 의해 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13 분비가 매우 증가한 것을 확인할 수 있었다.
또한, RT-PCR을 수행하여 IWR-1가 MMP 유전자의 발현을 증가시킬 수 있는지를 확인하였다.
그 결과, 도 5B와 같이 IWR-1은 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13의 mRNA 수준을 증가시켰다.
또한, 도 5C를 참고하면, 젤라틴 자이모그래피 분석을 수행한 결과, 앞서 확인한 MMP 발현 결과와 일치하였으며, 특히, 낮은 분자량으로 MMP 활성을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (6)

  1. IWR-1을 유효성분으로 함유하는 켈로이드 예방 또는 치료용 약학조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 IWR-1은 섬유아세포의 증식 및 이동을 억제하는 것을 특징으로 하는 켈로이드 예방 또는 치료용 약학조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 IWR-1은 콜라겐 합성을 억제하는 것을 특징으로 하는 켈로이드 예방 또는 치료용 약학조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 IWR-1은 콜라겐 분해 인자인 MMP(matrix metalloproteinase)의 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 켈로이드 예방 또는 치료용 약학조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 약학조성물은 약학조성물 총 100 중량부에 대하여, IWR-1을 0.001 내지 50 중량부로 포함하는 것을 특징으로 하는 켈로이드 예방 또는 치료용 약학조성물.
  6. IWR-1을 유효성분으로 함유하는 켈로이드 예방 또는 개선용 화장료조성물.
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